WO2026018901A1 - リグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法 - Google Patents

リグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法

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WO2026018901A1
WO2026018901A1 PCT/JP2025/025604 JP2025025604W WO2026018901A1 WO 2026018901 A1 WO2026018901 A1 WO 2026018901A1 JP 2025025604 W JP2025025604 W JP 2025025604W WO 2026018901 A1 WO2026018901 A1 WO 2026018901A1
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WO
WIPO (PCT)
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fermentation
lignocellulosic biomass
saccharification
fermentation process
antifoaming agent
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PCT/JP2025/025604
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English (en)
French (fr)
Inventor
梢栄 牟田口
昌史 和才
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Eneos Corp
Original Assignee
Eneos Corp
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass.
  • the technology for producing sugar from non-edible lignocellulosic biomass is extremely beneficial for creating a recycling-oriented society, as it can be used as a fermentation substrate for microorganisms to produce fuels such as alcohol that can serve as an alternative to gasoline, and it also prevents competition with food.
  • Enzymatic saccharification which involves hydrolysis using saccharifying enzymes such as cellulolytic enzymes or microorganisms that produce these saccharifying enzymes, is known as a method for producing monosaccharides, oligosaccharides, and other sugars that can be used as fermentation substrates from the polysaccharides in lignocellulosic biomass.
  • methods of producing ethanol from lignocellulose using enzymatic saccharification include multiple parallel fermentation, semi-parallel multiple fermentation, and sequential saccharification and fermentation.
  • multiple parallel fermentation also known as simultaneous saccharification and fermentation
  • the saccharification enzymes are coexisted with ethanol-fermenting microorganisms, and enzymatic saccharification and ethanol fermentation occur simultaneously.
  • semi-parallel multiple fermentation for example, lignocellulosic biomass and saccharification enzymes are added to one reactor and an enzymatic saccharification reaction is carried out, and then ethanol-fermentation microorganisms are added to the same reactor and an enzymatic saccharification reaction and ethanol fermentation occur.
  • sequential saccharification and fermentation for example, lignocellulosic biomass and saccharification enzymes are first added to a reactor and saccharification is carried out, and the resulting saccharified solution is then transferred to another reactor, where ethanol-fermentation microorganisms are added and ethanol fermentation occurs.
  • the reaction tank contains sugars such as oligosaccharides, which makes the culture liquid in the fermenter highly viscous. Additionally, ethanol-fermenting microorganisms such as yeast synthesize carbon dioxide gas along with ethanol from the sugars in the fermenter, creating an environment in which foaming is likely to occur.
  • the foaming here can cause problems such as the fermentation liquid leaking from the fermenter, poor transfer due to foam getting into the pump, a decrease in the effective capacity of the fermenter due to an increase in foam, a decrease in ethanol productivity due to pH control becoming difficult as the upper layer of the culture liquid is covered by foam, and the saccharification enzymes being inactivated when the foam bursts, which are undesirable.
  • Patent Document 1 describes an ethanol production method comprising: a first fermentation step in which yeast capable of xylose assimilation is cultured by fed-batch culture while a saccharified solution derived from lignocellulosic biomass is added to a fermenter; and a second fermentation step in which, when the added saccharified solution reaches a certain amount, the addition of the saccharified solution is stopped and fermentation is carried out by batch culture.
  • the rate at which the saccharified solution is fed to the yeast in the first fermentation step is adjusted based on the sugar consumption rate of the yeast, and the sugar consumption rate of the yeast is equal to or greater than the maximum sugar consumption rate at which glucose and xylose do not remain in the culture solution, but is equal to or less than the maximum sugar consumption rate of the yeast.
  • Patent Document 1 mentions waste paper, along with softwood and hardwood, as lignocellulosic biomass, but does not provide any specific examples.
  • Patent Document 2 describes a method for enhancing yeast growth for the production of biological products, which comprises culturing at least one yeast in a growth medium containing a nutritional composition comprising corn steep liquor and at least one antifoaming agent (a) or at least one surfactant (b), or any combination thereof, to obtain a grown yeast culture.
  • Patent Document 3 describes a foam control agent suitable for bioethanol fermentation processing, which contains a polyglycerol ether having a specific structure.
  • Patent No. 6097869 Special table 2018-537075 publication Special Publication No. 2023-522839
  • Patent Documents 1 to 3 do not specifically mention the use of waste paper or the like as lignocellulosic biomass.
  • lignocellulosic biomass used in the fermentation liquor include waste paper.
  • the present invention provides a method for improving the defoaming effect of a fermentation liquor when using lignocellulosic biomass (e.g., recycled paper pulp or unbleached pulp).
  • lignocellulosic biomass e.g., recycled paper pulp or unbleached pulp.
  • the present invention encompasses the following [1] to [10].
  • a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass comprising: Multiple parallel fermentation processes, semi-parallel multiple fermentation processes, or sequential fermentation processes;
  • the parallel multiple fermentation step includes a step of adding an antifoaming agent to a fermentation liquid containing lignocellulosic biomass, a saccharifying enzyme, and a yeast;
  • the semi-parallel multiple fermentation process or the sequential fermentation process includes a step of adding an antifoaming agent to a saccharified solution containing lignocellulosic biomass and a saccharifying enzyme and/or a fermentation solution containing the saccharified solution and yeast,
  • the antifoaming agent comprises a nonionic surfactant.
  • [2] The method for producing ethanol according to [1], wherein the lignocellulosic biomass is at least one selected from recycled paper pulp and unbleached pulp. [3] The method according to [1] or [2], comprising adding the antifoaming agent continuously or intermittently. [4] The method for producing ethanol according to any one of [1] to [3], wherein the waste paper is selected from the group consisting of paper cups, paper containers, and miscellaneous paper. [5] The method for producing ethanol according to any one of [1] to [4], wherein the antifoaming agent contains a polyoxyalkylene ether type nonionic surfactant.
  • [6] The method for producing ethanol according to any one of [1] to [5], wherein the specific gravity of the defoaming agent at 25°C is 0.95 to 1.00.
  • [7] The method for producing ethanol according to any one of [1] to [6], wherein the cloud point of the defoaming agent is 10°C or lower in a 10% by mass aqueous solution of the defoaming agent.
  • [8] [1] to [7], wherein the mass ratio of the total amount of antifoaming agent to the total amount of lignocellulosic biomass (total amount of antifoaming agent:total amount of lignocellulosic biomass) in the entire culture is 1:100 to 1:10,000.
  • a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass which comprises a multiple parallel fermentation process, a semi-parallel multiple fermentation process, or a sequential fermentation process.
  • the multiple parallel fermentation process comprises a step of adding an antifoaming agent to a fermentation liquor containing lignocellulosic biomass, a saccharifying enzyme, and yeast.
  • the semi-parallel multiple fermentation process or the sequential fermentation process comprises a step of adding an antifoaming agent to a saccharification liquor containing lignocellulosic biomass and a saccharifying enzyme, and/or a fermentation liquor containing the saccharification liquor and yeast.
  • the antifoaming agent contains a nonionic surfactant, the antifoaming effect of the fermentation liquor can be improved.
  • the method for producing ethanol from lignocellulosic biomass of the present invention comprises a multiple parallel fermentation process, a semi-parallel multiple fermentation process, or a sequential fermentation process.
  • the multiple parallel fermentation process comprises a step of adding an antifoaming agent to a fermentation liquid (preferably a saccharification fermentation liquid) comprising lignocellulosic biomass, saccharification enzymes, and yeast.
  • the semi-parallel multiple fermentation process or the sequential fermentation process comprises a step of adding an antifoaming agent to a saccharification liquid comprising lignocellulosic biomass and saccharification enzymes and/or a fermentation liquid comprising the saccharification liquid and yeast.
  • the antifoaming agent comprises a nonionic surfactant.
  • the lignocellulosic biomass is at least one selected from recycled paper pulp and unbleached pulp.
  • a saccharification solution containing lignocellulosic biomass and a saccharifying enzyme, and/or a fermentation solution containing the saccharification solution and yeast refers to the saccharification solution, the fermentation solution, or a combination of the saccharification solution and the fermentation solution.
  • the method for producing ethanol from lignocellulosic biomass of the present invention includes multiple parallel fermentation, semi-parallel multiple fermentation, or sequential fermentation.
  • the multiple parallel fermentation comprises adding an antifoaming agent to a fermentation liquor containing lignocellulosic biomass, a saccharifying enzyme, and yeast.
  • the semi-parallel multiple fermentation or sequential fermentation comprises adding an antifoaming agent containing a nonionic surfactant to a saccharification liquor containing lignocellulosic biomass and a saccharifying enzyme and/or a fermentation liquor containing the saccharification liquor and yeast.
  • the lignocellulosic biomass is preferably at least one selected from the group consisting of recycled paper pulp and unbleached pulp.
  • the "fermentation liquor containing lignocellulosic biomass, saccharifying enzymes, and yeast" of the present invention includes not only the fermentation liquor produced by fermentation using lignocellulosic biomass, saccharifying enzymes, and yeast, but also the culture liquor before fermentation (e.g., a culture liquor containing lignocellulosic biomass, saccharifying enzymes, and yeast in a multiple parallel fermentation process, and a culture liquor containing yeast and a saccharified liquid obtained by mixing lignocellulosic biomass with saccharifying enzymes and performing a saccharification reaction).
  • the "saccharified liquid containing lignocellulosic biomass and saccharifying enzymes" of the present invention includes not only the saccharified liquid obtained by mixing lignocellulosic biomass with saccharifying enzymes and performing a saccharification reaction, but also the mixed liquid before the saccharification reaction (e.g., a mixed liquid containing lignocellulosic biomass and saccharifying enzymes before the saccharification reaction in the saccharification process of a semi-parallel multiple fermentation process or a sequential fermentation process).
  • the method for producing ethanol from lignocellulosic biomass of the present invention may include at least one of the following steps: if the method includes a multiple parallel fermentation step, the method includes adding an antifoaming agent containing a nonionic surfactant to a fermentation liquor containing lignocellulosic biomass, a saccharifying enzyme, and yeast in the multiple parallel fermentation step; and if the method includes a semi-parallel multiple fermentation step or a sequential fermentation step, the method includes adding an antifoaming agent containing a nonionic surfactant to a saccharification liquor containing lignocellulosic biomass and a saccharifying enzyme, and/or a fermentation liquor containing the saccharification liquor and yeast in the semi-parallel multiple fermentation step or the sequential fermentation step.
  • Parallel multiple fermentation process Semi-parallel fermentation process, or sequential saccharification and fermentation process
  • (2) solid-liquid separation process (3) ethanol concentration process (4) solid removal process
  • the term "parallel fermentation process” generally refers to a process in which saccharification of a raw material and ethanol production by fermentation proceed simultaneously.
  • the parallel fermentation process is a process in which saccharification (also referred to as enzymatic saccharification) and ethanol fermentation are simultaneously carried out in the presence of an ethanol-fermenting microorganism together with a saccharifying enzyme, for example, a process in which saccharification and ethanol fermentation are simultaneously carried out using a fermentation broth containing lignocellulosic biomass, a saccharifying enzyme, and yeast.
  • lignocellulosic biomass, saccharifying enzymes, and yeast are first supplied to a reaction vessel.
  • the lignocellulosic biomass, saccharifying enzymes, and yeast may be premixed and supplied to the reaction vessel, or each may be supplied separately.
  • the lignocellulosic biomass is saccharified by the saccharifying enzymes, and the resulting sugars are converted to ethanol by fermentation with yeast.
  • a semi-parallel multiple fermentation process generally refers to a process in which ethanol production by fermentation is carried out simultaneously after saccharification of a feedstock has partially progressed.
  • the semi-parallel multiple fermentation process involves mixing lignocellulosic biomass with a saccharifying enzyme to perform a saccharification reaction to obtain a saccharified solution (also referred to as a saccharification process), and then mixing the resulting saccharified solution with an ethanol-fermenting microorganism (preferably yeast) to perform a saccharification reaction and ethanol fermentation using the resulting fermentation solution (also referred to as a saccharification and fermentation process).
  • a saccharified solution also referred to as a saccharification process
  • an ethanol-fermenting microorganism preferably yeast
  • the reaction vessel for the saccharification step and the reaction vessel for the saccharification and fermentation step may be the same or different.
  • the reaction vessel for the saccharification step and the reaction vessel for the saccharification and fermentation step are the same.
  • the reaction vessel for the saccharification step and the reaction vessel for the saccharification and fermentation step are different.
  • lignocellulosic biomass and saccharification enzymes are first supplied to a reactor.
  • the lignocellulosic biomass is first saccharified by the saccharification enzymes (saccharification process). Yeast is then added to the same reactor, where enzymatic saccharification and ethanol fermentation are carried out. The sugars produced are then converted to ethanol by fermentation with the yeast (saccharification and fermentation process).
  • the sequential saccharification and fermentation process generally refers to a process in which saccharification of a feedstock and ethanol production by fermentation are carried out in a stepwise manner.
  • the sequential saccharification and fermentation process is a process in which lignocellulosic biomass is mixed with a saccharifying enzyme and saccharified to obtain a saccharified solution (also referred to as a saccharification process), and then the obtained saccharified solution is mixed with an ethanol-fermenting microorganism (preferably yeast) to obtain a fermentation solution, and ethanol fermentation is carried out using the obtained fermentation solution (also referred to as a fermentation process).
  • the reaction vessel for carrying out the saccharification process and the reaction vessel for carrying out the fermentation process are separate, and the saccharified solution obtained in the saccharification process is transferred to a reaction vessel separate from the reaction vessel for the saccharification process.
  • lignocellulosic biomass and a saccharifying enzyme are first supplied to a reactor.
  • the lignocellulosic biomass is saccharified by the saccharifying enzyme (saccharification process).
  • saccharifying process saccharifying enzyme
  • the resulting saccharified solution is then transferred to another reactor, where yeast is added and the resulting sugars are converted to ethanol by fermentation with the yeast (fermentation process).
  • the lignocellulosic biomass is not particularly limited, but may include pulp or a non-pulp lignocellulose-containing raw material.
  • the lignocellulosic biomass produces more foam than conventional fermentation.
  • Conventional fermentation includes, for example, fermentation using bleached hardwood kraft pulp (LBKP).
  • LLKP bleached hardwood kraft pulp
  • Lignocellulosic biomass may be used singly or in combination with two or more types.
  • “more foam than conventional fermentation” refers to a higher foam height than conventional fermentation when cultured using approximately the same amount of fermentation broth.
  • the yeast cell count reaches 10 8 cells/mL or more, and then 5% by mass of pulp is added.
  • the foam height is compared 30 minutes later.
  • the foam height is less than 1 cm, while in fermentation using waste paper pulp, the foam height is 3-4 cm or more.
  • Examples of pulp as lignocellulosic biomass that foams more than with conventional fermentation include waste paper pulp and unbleached pulp, with waste paper pulp being preferred.
  • waste paper in the waste paper pulp include water-resistant waste paper such as paper cups, sealed postcards, cartons, and wraps; ordinary printed waste paper such as catalogs (e.g., colored wood-free paper), paper containers, and shredded paper (e.g., shredded office paper); special printed waste paper such as carbonless paper and foil-stamped paper containers; and waste paper containing a high content of lignin such as magazines. Water-resistant waste paper and ordinary printed waste paper are preferred, and paper cups and paper containers are even more preferred.
  • the unbleached pulp includes chemical pulp and mechanical pulp. More specifically, examples include chemical pulps such as hardwood kraft pulp (e.g., unbleached kraft pulp, oxygen-bleached unbleached kraft pulp), softwood kraft pulp (e.g., unbleached kraft pulp, oxygen-bleached unbleached kraft pulp), sulfite pulp, and soda pulp, as well as semi-chemical pulp, chemical-ground wood pulp, and pulp derived from waste wood.
  • hardwood kraft pulp e.g., unbleached kraft pulp, oxygen-bleached unbleached kraft pulp
  • softwood kraft pulp e.g., unbleached kraft pulp, oxygen-bleached unbleached kraft pulp
  • soda pulp e.g., as well as semi-chemical pulp, chemical-ground wood pulp, and pulp derived from waste wood.
  • Preferred examples include hardwood unbleached kraft pulp, hardwood oxygen-bleached unbleached kraft pulp, softwood unbleached kraft pulp, softwood oxygen-bleached unbleached kraft pulp, sulfite pulp, and soda pulp.
  • the unbleached pulp is pulp that has not been bleached.
  • Bleaching methods include, but are not limited to, chlorine bleaching and hydrogen peroxide bleaching.
  • lignocellulosic biomass other than pulp examples include waste paper, pulp sludge, sludge, sewage sludge, and food waste, with waste paper being preferred.
  • waste paper examples include waste paper, pulp sludge, sludge, sewage sludge, and food waste, with waste paper being preferred.
  • the types of waste paper are as described above. These biomasses can be used alone or in combination.
  • the biomass may be a dry solid, a wet solid, or a slurry.
  • Lignocellulosic raw materials other than the above-mentioned pulp are preferably used after pretreatment (delignification treatment, etc.).
  • the concentration of lignocellulosic biomass in the fermentation liquid in the reaction tank is preferably 5 to 30% by mass, and more preferably 10 to 20% by mass.
  • a lignocellulosic biomass concentration of 5% by mass or more is advantageous in avoiding the problem of the final product having an excessively low concentration, resulting in high costs for ethanol concentration.
  • a lignocellulosic biomass concentration of 30% by mass or less is advantageous in avoiding the problem of increased productivity due to the difficulty of stirring the raw material as the concentration increases.
  • the saccharifying enzyme is not particularly limited as long as it is a cellulose- or hemicellulose-degrading enzyme.
  • the cellulose-degrading enzyme include enzymes collectively known as cellulases, which have cellobiohydrolase activity, endoglucanase activity, beta-glucosidase activity, etc.
  • Each cellulose-degrading enzyme may be added in an appropriate amount, but many commercially available cellulose-degrading enzyme preparations have the above-mentioned various cellulase activities as well as hemicellulase activity, so commercially available cellulose-degrading enzyme preparations may also be used.
  • cellulolytic enzyme preparations include those derived from the genera Trichoderma, Acremonium, Aspergillus, Phanerochaete, Trametes, Humicola, Bacillus, and Irpex.
  • Commercially available cellulolytic enzyme preparations include, but are not limited to, Cellulosin AL8 (manufactured by HI Corporation), Cellic CTec2 (manufactured by Novozymes), Cellulase Y-NC (manufactured by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.), and Meicelase (manufactured by Meiji Seika Pharma), all of which are trade names.
  • the saccharifying enzymes used can be used alone or in combination, taking into consideration the properties of the cellulolytic enzyme preparation.
  • the HPLC measurement conditions are as follows. Column: Shodex SUGAR SP0810 (Showa Denko K.K.) Mobile phase: ultrapure water flow rate: 0.8mL/min Temperature: 80°C According to one embodiment of the present invention, the amount of saccharifying enzyme added to the fermentation liquid in the reaction tank is not particularly limited, but is preferably 50 to 500 U/L, and more preferably 100 to 300 U/L.
  • the ratio of the amount of saccharification enzyme input to the lignocellulosic biomass in the fermentation liquid in the reaction tank in the saccharification process is preferably 500 to 5,000 U/kg, and more preferably 1,000 to 3,000 U/kg.
  • the ratio of the amount of saccharification enzyme input to the lignocellulosic biomass in the fermentation liquid in the reaction tank in the saccharification process of the semi-parallel saccharification process or the saccharification process of the sequential saccharification and fermentation process is the same as above.
  • yeast The yeast is not particularly limited, but is preferably capable of fermenting sugars (hexose, pentose).
  • yeast include Saccharomyces yeast such as Saccharomyces cerevisiae, Scheffersomyces yeast such as Scheffersomyces stipitis (modified from Pichia stipitis), Candida yeast such as Candida shihatae, and Pachysolen yeast such as Pachysolen tannophilus.
  • Saccharomyces yeast such as Saccharomyces cerevisiae
  • Scheffersomyces yeast such as Scheffersomyces stipitis (modified from Pichia stipitis)
  • Candida yeast such as Candida shihatae
  • Pachysolen yeast such as Pachysolen tannophilus.
  • Saccharomyces yeast such as Saccharomyces cerevisiae
  • Saccharomyces cerevisiae is even more preferred.
  • Yeasts produced using genetic engineering techniques can also be used.
  • yeast produced using genetic engineering techniques any yeast capable of simultaneously fermenting hexose and pentose can be used without particular limitation.
  • Preferred examples of yeast produced using genetic engineering techniques include yeast with improved ability to produce ethanol from xylose, more preferably yeast into which a gene encoding xylose reductase, a gene encoding xylulose phosphorylase, a gene encoding xylitol dehydrogenase, a gene encoding transaldolase, a gene encoding transketolase, and a gene encoding alcohol dehydrogenase have been introduced in an expressible manner, and even more preferably the yeast described in WO 2016/060171.
  • the genes may be endogenous genes of the yeast.
  • the defoaming agent of the present invention is not particularly limited as long as it has a defoaming effect and/or foam suppressing effect on a fermentation broth (including a culture broth before fermentation) used for cell growth and/or fermentation.
  • a defoaming agent containing a nonionic surfactant preferably, a defoaming agent containing a nonionic surfactant as a main component, hereinafter also referred to as a nonionic surfactant-based defoaming agent
  • the defoaming agent of the present invention may be referred to as a defoaming agent composition.
  • the content of the nonionic surfactant in the defoaming agent is 80 to 100% by mass, preferably 90 to 100% by mass, and more preferably 95 to 100% by mass.
  • nonionic surfactants are preferably polyether-type, with polyoxyalkylene ether-type being more preferred.
  • Commercially available polyether-type nonionic surfactants include Adeka Corporation's trade names "ADEKA NOL LG-109,” “ADEKA NOL LG-126,” “ADEKA NOL LG-294,” “ADEKA NOL LG-295S,” and “ADEKA NOL LG-299” (each a registered trademark); San Nopco's trade name "NOPTAMU 300EZ”; Kao Corporation's trade name "Antifoam No.
  • Nonionic surfactants include Kao Corporation's trade name "FERMOL 1000.”
  • Commercially available polyoxyalkylene ether nonionic surfactants include those manufactured by Adeka Corporation under the trade names "ADEKA NOL LG-109,” “ADEKA NOL LG-126,” “ADEKA NOL LG-294,” and “ADEKA NOL LG-299” (each a registered trademark), and those manufactured by San Nopco under the trade name "NOPTAMU 300EZ.”
  • the antifoaming agent of the present invention is not particularly limited as long as it has an antifoaming effect and/or foam suppressing effect on the fermentation broth used for cell growth and/or fermentation, but is preferably a polyether-type antifoaming agent, and more preferably a polyoxyalkylene ether-type antifoaming agent.
  • the specific gravity of the defoaming agent of the present invention at 25°C (ratio of the density of the defoaming agent to the density of water) is 0.90 to 1.05. If it is smaller than the specific gravity of the fermentation liquor (approximately 1.00 to 1.016), the defoaming agent will be more likely to exist on the liquid surface. Therefore, from the perspective of being highly effective against bubbles on the liquid surface, the specific gravity is preferably 0.93 to 1.01, more preferably 0.95 to 1.00, and even more preferably 0.95 to 0.99.
  • the specific gravity of the defoaming agent at 25°C can be measured by methods known in the art, such as the hydrometer method, pycnometer method, oscillating density meter method, and balance method described in JIS K0061:2001 "Methods for measuring density and specific gravity of chemical products," and the specific gravity of the fermentation liquor can be measured by the hydrometer method.
  • the cloud point of the defoaming agent of the present invention may be, for example, 25°C or below when a 10% by weight aqueous solution of the defoaming agent is prepared.
  • the cloud point is preferably 15°C or below, more preferably 5°C or below.
  • the lower limit of the cloud point is not particularly limited, but a value below the measurement limit or above 0°C is preferred.
  • the cloud point of the defoaming agent can be measured by a method known in the art.
  • a known method for measuring cloud point involves, for example, preparing an aqueous solution containing 1 or 10% by weight of the defoaming agent in ion-exchanged water, or an aqueous solution containing 10% by weight of the defoaming agent in a 25% by weight aqueous solution of diethylene glycol monobutyl ether, heating the aqueous solution, and visually measuring the temperature at which the aqueous solution begins to become cloudy. For example, if the temperature at which clouding begins to occur is below 20°C, the measurement result using ion-exchanged water (10% by weight aqueous solution) is used as the cloud point.
  • the measurement result using a 25% by weight aqueous solution of diethylene glycol monobutyl ether or a 1% by weight aqueous solution of ion-exchanged water is used as the cloud point.
  • measurement results for ion-exchanged water since water freezes at temperatures below 0°C and the cloud point cannot be measured (measurement limit), if the water is cloudy at 0°C, the cloud point is considered to be below 0°C (below the measurement limit).
  • the viscosity (mPa ⁇ s) of the defoaming agent of the present invention at 25°C is 100 to 1,000, and from the viewpoint of workability, is preferably 150 to 700, and more preferably 200 to 300.
  • the viscosity of the defoaming agent is measured according to a method known in the art, for example, JIS K5101-6-2:2004.
  • the solubility (g/100 mL) of the antifoaming agent of the present invention in water at 25°C is either insoluble or almost completely soluble in water, and includes substances that fall under the categories of "slightly soluble,” “very slightly soluble,” and “almost completely insoluble” described in the 18th Edition of the Japanese Pharmacopoeia.
  • the antifoaming agent of the present invention has a solubility in water of, for example, about 5 g/100 mL or less at 25°C.
  • the solubility is preferably 1 g/100 mL or less, more preferably 0.1 g/100 mL or less, and even more preferably 0.01 g/100 mL or less.
  • the solubility in water is no particular lower limit to the solubility in water, but 0.001 g/100 mL or more is preferred.
  • the pH of the fermentation liquid in the reaction tank during the parallel fermentation process is not particularly limited, but is preferably maintained in the range of 3 to 10, and more preferably in the range of 4 to 8.
  • the pH of the fermentation liquid in the reaction tank during the saccharification and fermentation process of the semi-parallel simultaneous fermentation process or the fermentation process of the sequential saccharification and fermentation process is the same as described above.
  • the temperature of the fermentation liquid in the reaction tank in the multiple parallel fermentation process is not particularly limited as long as it is within the optimal temperature range for the saccharification enzyme and/or yeast, but is preferably 20 to 40°C, and more preferably 30 to 40°C.
  • the temperature of the fermentation liquid in the reaction tank in the saccharification and fermentation process in the semi-parallel multiple fermentation process or the fermentation process in the sequential saccharification and fermentation process is the same as described above.
  • the temperature of the saccharification liquid in the reaction tank in the saccharification process in the semi-parallel multiple fermentation process or the saccharification process in the sequential saccharification and fermentation process is not particularly limited as long as it is within the optimal temperature range for the saccharification enzyme, but is preferably 30 to 70°C, and more preferably 40 to 60°C.
  • the number of bacterial cells in the reaction tank in the multiple parallel fermentation process is not particularly limited, but is preferably 10 cells/mL or more, more preferably 10 cells/mL or more.
  • the preferred range of bacterial cell number is 10 to 10 cells/mL, more preferably 10 to 10 cells/mL.
  • the number of bacterial cells in the reaction tank in the saccharification and fermentation step of the semi-parallel multiple fermentation process or the fermentation step of the sequential saccharification and fermentation process is the same as above.
  • the number of bacteria inoculated into a reaction tank in a multiple parallel fermentation process is not particularly limited, but the final concentration is preferably 10 cells/mL or more, more preferably 10 cells/mL or more.
  • the preferred range of the number of bacteria inoculated is 10 to 10 cells/mL, more preferably 10 to 10 cells/mL.
  • the number of bacteria inoculated into a reaction tank in the saccharification and fermentation step of a semi-parallel multiple fermentation process or the fermentation step of a sequential saccharification and fermentation process is the same as described above.
  • the ratio of the initial content of antifoaming agent in the fermentation liquor in the reaction tank in a multiple parallel fermentation process to the initial volume of the fermentation liquor (volume on day 1) is not particularly limited, but may be, for example, 1:500 to 1:40,000, preferably 1:850 to 1:20,000, and more preferably 1:1,000 to 1:15,000.
  • the ratio of the initial content of antifoaming agent in the fermentation liquor in the reaction tank in the saccharification and fermentation process of a semi-parallel multiple fermentation process or the fermentation process of a sequential saccharification and fermentation process is the same as above.
  • the ratio of the initial content of antifoaming agent in the saccharified solution to the initial volume of the saccharified solution (volume on day 1) in the reaction tank during the saccharification process of a semi-parallel multiple fermentation process or a sequential saccharification and fermentation process is not particularly limited, but may be, for example, 1:200 to 1:500,000, preferably 1:500 to 1:400,000, and more preferably 1:1,000 to 1:200,000.
  • a preferred saccharified solution is a mixed solution containing lignocellulosic biomass and saccharifying enzymes prior to the saccharification reaction.
  • the ratio of the initial content of antifoaming agent to the initial content of lignocellulosic biomass in the fermentation liquor in the reaction tank in the parallel multiple fermentation process is not particularly limited, but may be, for example, 1:50 to 1:2,000, preferably 1:75 to 1:1,000, and more preferably 1:100 to 1:800.
  • the ratio of the initial content of antifoaming agent to the initial content of lignocellulosic biomass in the fermentation liquor in the reaction tank in the saccharification and fermentation process of the semi-parallel multiple fermentation process or the fermentation process of the sequential saccharification and fermentation process is the same as above.
  • the ratio of the initial antifoaming agent content to the initial lignocellulosic biomass content (initial antifoaming agent content:initial lignocellulosic biomass content) in the saccharification solution in the reaction tank during the saccharification process of a semi-parallel simultaneous fermentation process or the saccharification process of a sequential saccharification and fermentation process is not particularly limited, but may be, for example, 1:50 to 1:40,000, preferably 1:75 to 1:20,000, and more preferably 1:100 to 1:10,000.
  • the amount of antifoaming agent added each time can be determined as appropriate by one skilled in the art.
  • the mass ratio of the amount of antifoaming agent added each time to the amount of fermentation broth added is not particularly limited, but may be, for example, 1:200 to 1:50,000, preferably 1:500 to 1:40,000, and more preferably 1:1,000 to 1:20,000.
  • the mass ratio of the amount of antifoaming agent added each time to the amount of fermentation broth added in the saccharification and fermentation process of a semi-parallel multiple fermentation process or the fermentation process of a sequential saccharification and fermentation process is the same as above.
  • the mass ratio of the amount of antifoaming agent added each time to the amount of saccharified solution added (antifoaming agent:saccharified solution) in the saccharification step of a semi-parallel multiple fermentation process or a sequential saccharification and fermentation process is not particularly limited, but may be, for example, 1:200 to 1:500,000, preferably 1:500 to 1:400,000, and more preferably 1:1,000 to 1:200,000.
  • the timing of adding the antifoaming agent is not particularly limited, but may include, for example, when preparing the fermentation liquor, when foaming occurs, or when adding lignocellulosic biomass.
  • "when preparing the fermentation liquor” includes adding the antifoaming agent to a fermentation liquor containing lignocellulosic biomass, saccharification enzymes, and yeast, or adding the antifoaming agent to a fermentation liquor containing a saccharification liquor and yeast.
  • “adding the antifoaming agent to a fermentation liquor containing a saccharification liquor and yeast” includes not only adding the antifoaming agent to a fermentation liquor containing a saccharification liquor and yeast, but also adding the antifoaming agent to the saccharification liquor and then mixing it with the yeast to form a fermentation liquor.
  • “when foaming occurs” includes adding the antifoaming agent when foam reaches a certain height. The foam height can be appropriately determined by one skilled in the art.
  • the antifoaming agent may be added continuously or intermittently during the culture period, with intermittent addition being preferred.
  • the antifoaming agent in a semi-parallel multiple fermentation process or a sequential saccharification and fermentation process, may be added to the saccharified solution in the saccharification step of the semi-parallel multiple fermentation process or the saccharification step of the sequential saccharification and fermentation process.
  • use of the antifoaming agent of the present invention is advantageous in improving the antifoaming effect of the saccharified solution.
  • the multiple parallel fermentation process is preferably a continuous process, but may also be a semi-batch or batch process.
  • continuous refers to, for example, a mode in which raw material supply and ethanol production are continuous.
  • the methods used in the multiple semi-parallel fermentation process and the sequential saccharification and fermentation process are the same as those described above.
  • the concentration of lignocellulosic biomass in the fermentation liquid so that it is maintained within a predetermined range.
  • the predetermined range include 5 to 30% by mass, and preferably 10 to 20% by mass.
  • This adjustment is performed, for example, by supplying lignocellulosic biomass to the reaction tank.
  • the supply rate of lignocellulosic biomass to the reaction tank is not particularly limited. However, if the parallel multiple fermentation process is continuous and the fermentation liquid is discharged from the reaction tank, it is preferable that the supply rate of lignocellulosic biomass to the reaction tank and the discharge rate of the fermentation liquid from the reaction tank are approximately the same.
  • the concentration of lignocellulosic biomass in the saccharification and fermentation process of the semi-parallel simultaneous fermentation process or the fermentation process of the sequential saccharification and fermentation process is the same as described above.
  • the concentration of the saccharifying enzyme in the fermentation liquor in the multiple parallel fermentation process, it is preferable to adjust the concentration of the saccharifying enzyme in the fermentation liquor so that it is maintained within a predetermined range.
  • the predetermined range is 50 to 500 U/L, preferably 100 to 300 U/L.
  • the adjustment is performed, for example, by supplying the saccharifying enzyme to the reaction vessel.
  • the solids-enriched fermentation liquor may be recovered and transferred to the reaction vessel, thereby supplying the recovered saccharifying enzyme.
  • the concentration of the saccharifying enzyme in the saccharification and fermentation process of the semi-parallel multiple fermentation process or the saccharification process of the sequential saccharification and fermentation process is the same as described above.
  • the fermentation broth discharged from the reaction tank can be separated into a solids-enriched fermentation broth and an aqueous solution, for example, a solids-enriched fermentation broth and an aqueous ethanol solution, using a separation device such as a vacuum distillation device or a membrane separator in a solid-liquid separation step.
  • a separation device such as a vacuum distillation device or a membrane separator in a solid-liquid separation step.
  • vacuum distillation devices that can be used include a rotary evaporator and a flash evaporator. Under reduced pressure, ethanol can be separated at a low temperature, preventing enzyme deactivation. The resulting aqueous ethanol solution can be concentrated in the ethanol concentration step described below.
  • the solids-concentrated fermentation liquid obtained after separating the aqueous ethanol solution can be recovered and transferred directly to a reaction tank, or it can be separated into a residue and a supernatant using a solids removal device, as described below.
  • the aqueous ethanol solution obtained in the solid-liquid separation step can be further concentrated by distillation or using various separation membranes, for example, zeolite membranes, to produce high-purity ethanol. Furthermore, the aqueous ethanol solution may be transferred to a reaction vessel after removing the ethanol.
  • the solids-enriched fermentation broth obtained after separation of the aqueous ethanol solution in the solid-liquid separation step may be transferred to a solids removal device and separated into a residue and a supernatant.
  • the resulting supernatant may be transferred to a reaction tank.
  • solids removal devices that can be used include a disk centrifuge, a screw press, a screen, a filter press, a belt press, and a rotary press.
  • the separated residue contains enzymes, lignin, and yeast.
  • the enzymes adsorbed to the residue can be liberated, recovered, and reused.
  • Lignin can be recovered as a combustion material and used as energy, or the lignin can be recovered and effectively utilized.
  • the yeast can also be separated from the residue and reused in a parallel multiple fermentation process, a semi-parallel multiple fermentation process, or a sequential saccharification and fermentation process.
  • the ethanol production method of the present invention allows for efficient production of ethanol from lignocellulosic feedstocks.
  • Ethanol obtained by this ethanol production method can be suitably used, for example, as fuel ethanol, industrial ethanol, or ethanol for use as a food additive.
  • a defoaming agent for use in a method for producing ethanol from lignocellulosic biomass selected from the group consisting of recycled paper pulp and unbleached pulp, the defoaming agent comprising a nonionic surfactant.
  • JIS Japanese Industrial Standards
  • the cell count of the yeast Saccharomyces cerevisiae used in the test examples was observed and measured under an optical microscope (magnification 400x) using a Thoma hemocytometer.
  • ethanol concentration in the fermentation broth was measured by heating the fermentation broth at 95°C for 10 minutes to inactivate the yeast and enzymes, and then analyzing and measuring the ethanol concentration in the fermentation broth using a refractive index (RI) detector on an HPLC (Prominence, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • RI refractive index
  • HPLC Prominence, manufactured by Shimadzu Corporation.
  • the HPLC measurement conditions are as follows. Column: Shodex SUGAR SP0810 (Showa Denko K.K.) Mobile phase: ultrapure water flow rate: 0.8mL/min Temperature: 80°C
  • Test Example 1 Preparation of Paper Cup-Derived (Waste Paper-Derived) Pulp Paper cup-derived pulp was prepared by a general preparation method. Specifically, the method was as follows. First, commercially available waterproofed paper cups were cut into pieces 8 mm wide or less using a cutter. The cut paper cups were placed in a Waring blender so that the weight was 4% by mass (equivalent to 40 g on a dry weight basis), and water was added to make the total weight 1000 g. After adjusting to 1000 g, the paper cups were disintegrated by intermittent rotation at a rotation speed of 19,000 rpm for 30 minutes or more. The paper cup disintegration liquid was placed in a laundry net, washed with at least four times the amount of water, and dehydrated twice to obtain paper cup-derived pulp with a moisture content of approximately 70% by mass.
  • the foam-inhibiting and foam-defoaming effects of antifoaming agents were investigated during ethanol production using pulp derived from paper cups (waste paper).
  • 5% by mass (equivalent to 30 g dry weight) of the paper cup-derived pulp obtained above, 79 U of saccharifying enzyme, 80 ppm antibacterial agent, and 60 ppm antibiotic were added to a 1 L culture tank, and the volume of the liquid was adjusted with sterilized water to a reaction weight of approximately 500 g. After adjustment, the mixture was allowed to react for 24 hours at 33 °C, a stirring speed of 370 rpm, and pH 4.8, while maintaining a constant temperature.
  • reaction solution sacharified solution obtained from the above reaction was dispensed in 10 mL aliquots into 50 mL conical tubes.
  • the antifoaming agent shown in Table 1 was added to the conical tube containing the reaction solution at concentrations of 5, 10, 20, 50, or 100 ppm.
  • the conical tube containing the reaction solution and antifoaming agent was vigorously shaken. Immediately after foaming, the conical tube was left to stand, and the state of the foam was observed after 10 seconds.
  • Table 2 shows the minimum concentration of the antifoaming agent at which the foam disappeared within 10 seconds after standing for various antifoaming agents.
  • Test Example 2 Confirmation of antifoaming agent effect in continuous saccharification and fermentation Based on the results obtained in Test Example 1, the antifoaming effects of silicone antifoam agent KM-70 (Test Area 2-1) and ADEKA NOL LG-294 (Test Area 2-2) in continuous saccharification and fermentation were compared. Note that in Test Example 1, ADEKA NOL LG-294 had a shorter defoaming time than ADEKA NOL LG-299, so LG-294 was used in Test Example 2.
  • a 1 L culture vessel was charged with 5% by mass of paper cup-derived pulp (dry weight basis, equivalent to 30 g), 79 U of saccharifying enzyme, 0.22% by mass of urea, 1% by mass of CSL (corn steep liquor), and 10 ppm of antibacterial agent, and the yeast Saccharomyces cerevisiae was inoculated at a final concentration of 1.0 x 10 7 cells / mL.
  • the liquid volume was adjusted with sterilized water so that the reaction weight was approximately 500 g. 100 ppm of antifoaming agent was added to each of the prepared fermentation liquors, and the temperature was controlled to be constant at 33 ° C, a stirring speed of 370 rpm, and pH 4.8, and the reaction was carried out for 24 hours.
  • the conditions for preparing the fermentation liquid are as follows:
  • the composition of the fermentation liquid is shown below.
  • Table 5 shows the total amount of antifoaming agent added over 10 days of culture in Test Example 2.
  • Test Plot 2-1 100 ppm of antifoaming agent was added 168, 192, and 216 hours after the start of culture.
  • Test Plot 2-2 100 ppm of antifoaming agent was added 168 hours after the start of culture.
  • the ethanol concentrations in the fermentation broth for test plots 2-1 and 2-2 are shown in Figure 1.
  • the ethanol concentration in the fermentation broth for test plot 2-1 was 47.6 g/L at 48 hours, 46.0 g/L at 96 hours, 44.3 g/L at 144 hours, and 42.0 g/L at 192 hours.
  • the ethanol concentration in the fermentation broth for test plot 2-2 was 47.5 g/L at 48 hours, 45.5 g/L at 96 hours, 44.1 g/L at 144 hours, and 42.0 g/L at 192 hours.
  • the ethanol concentrations in the fermentation broth were similar between test plots 2-1 and 2-2.
  • test area 2-3 cultivation was carried out under the same conditions as test area 2-1, except that hardwood bleached kraft pulp (LBKP) was used as the lignocellulosic biomass.
  • LKP hardwood bleached kraft pulp
  • KM-70 antifoaming agent

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Abstract

本発明は、リグノセルロース系バイオマスを用いた場合の発酵液の消泡効果を向上させる方法を提供する。より詳細には、リグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法であって、並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含み、並行複発酵工程を含む場合において、前記並行複発酵工程が、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合において、前記半並行複発酵工程または前記逐次発酵工程が、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、前記消泡剤が非イオン性界面活性剤を含む、方法を提供する。

Description

リグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法 関連出願の参照
　本特許出願は、２０２４年７月１９日に出願された日本国特許出願２０２４－１１６１４５号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明はリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法に関する。
　非可食のリグノセルロース系バイオマスから糖を製造する技術は、製造された糖を微生物の発酵基質として用いることによりアルコールのようなガソリンの代替となる燃料等を製造することができ、また食糧との競合を防ぐことができるため、循環型社会の形成に極めて有益な技術である。
　リグノセルロース系バイオマス中の多糖類から発酵基質となる単糖やオリゴ糖等の糖類を製造する方法として、セルロース分解酵素等の糖化酵素やその糖化酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法が知られている。
　また、酵素糖化法を応用しリグノセルロースからエタノールを製造する方法として、並行複発酵、半並行複発酵、逐次糖化発酵が知られている。並行複発酵（同時糖化発酵ともいう）においては、例えば、上記糖化酵素と共にエタノール発酵微生物を共存させ、酵素糖化反応とエタノール発酵とが同時に行われる。半並行複発酵においては、例えば、一つの反応槽にリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素を添加し酵素糖化反応が行われた後、同じ反応槽にエタノール発酵微生物を添加し酵素糖化反応とエタノール発酵とが行われる。逐次糖化発酵においては、例えば、反応槽にまずリグノセルロース系バイオマスと糖化酵素を添加し糖化が行われ、得られた糖化液を別の反応槽に移送後、エタノール発酵微生物を添加しエタノール発酵が行われる。
　上記発酵工程では発泡という問題がある。上述のように、反応槽（発酵槽）にはオリゴ糖等の糖類が含まれるため発酵槽内の培養液は粘性が高く、また、酵母等のエタノール発酵微生物により発酵槽の糖類からエタノールと共に二酸化炭素ガスが合成されるため、発酵槽は発泡しやすい環境にある。
　ここで、発泡によって、発酵槽からの発酵液の流出、ポンプの泡かみによる移送不良の発生、泡が多くなることによる発酵槽の有効容量の減少、泡により培養液上層がおおわれるためｐＨ制御が困難となることによるエタノール生産性の低下、および、泡が破裂する際の糖化酵素の失活、といった問題が生じ好ましくない。
　上記発泡という問題を解決する手段として、特許文献１には、キシロース資化能力を有する酵母に対し、リグノセルロース系バイオマス由来の糖化液を発酵槽に添加しながら培養を行う流加培養により発酵を行う第１の発酵工程と、添加された前記糖化液が一定量に達したとき、前記糖化液の添加を停止し、回分培養により発酵を行う第２の発酵工程とを備え、前記第１の発酵工程における前記酵母に対する前記糖化液の流加速度を、前記酵母の糖消費速度により調節し、前記酵母の糖消費速度が、培養液中に残留するグルコース及びキシロースが発生しない最大の糖消費速度以上、酵母の最大糖消費速度以下であることを特徴とするエタノールの製造方法が記載されている。特許文献１には、リグノセルロース系バイオマスとして、針葉樹、広葉樹と共に古紙の記載はあるものの、実施例等での具体的な記載はない。
　特許文献２には、コーンスティプリカーと、少なくとも1種の消泡剤（a）若しくは少なくとも1種の界面活性剤（b）の少なくとも一方、又はそれらの任意の組み合わせとを含む栄養組成物を含有する成長培地中で、少なくとも1種の酵母を培養して、増殖した酵母培養物を得ることを含む、生物産物の製造のための酵母成長の増強方法が記載されている。
　特許文献３には、バイオエタノール発酵処理に好適な泡制御剤であって、特定の構造を有するポリグリセロールエーテルを含む、泡制御剤が記載されている。
特許６０９７８６９号公報 特表２０１８－５３７０７５号公報 特表２０２３－５２２８３９号公報
　エタノールの製造時に、古紙等のリグノセルロース系バイオマスを用いることにより、通常の漂白済パルプに比べて発泡が激しくなる、という問題があった。一方、上記特許文献１～３には、リグノセルロース系バイオマスとして古紙等を具体的に用いるものは認められない。
　上記の問題を解決するため、検討を重ねた結果、本発明者らは、特定の消泡剤を用いることにより、発酵液の消泡効果が向上することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。なお、発酵液に用いるリグノセルロース系バイオマスとしては、古紙等が挙げられる。
　従って、本発明は、リグノセルロース系バイオマス（例えば、古紙パルプや漂白されていないパルプ）を用いた場合の発酵液の消泡効果を向上させる方法を提供する。
　本発明は、以下の［１］～［１０］を包含する。
［１］
　リグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法であって、
　並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含み、
　　並行複発酵工程を含む場合において、前記並行複発酵工程が、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、
　　半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合において、前記半並行複発酵工程もしくは前記逐次発酵工程が、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に、消泡剤を添加する工程を含んでなり、
　前記消泡剤が非イオン性界面活性剤を含む、方法。
［２］
　前記リグノセルロース系バイオマスが古紙パルプおよび漂白されていないパルプから選択される少なくとも１種である、［１］に記載のエタノールの製造方法。
［３］
　前記消泡剤を連続的または間欠的に添加することを含んでなる、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］
　前記古紙が、紙カップ、紙器、および雑紙からなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか一つに記載のエタノールの製造方法。
［５］
　前記消泡剤がポリオキシアルキレンエーテル型の非イオン性界面活性剤を含む、［１］～［４］のいずれか一つに記載のエタノールの製造方法。
［６］
　前記消泡剤の２５℃での比重が０．９５～１．００である、［１］～［５］のいずれか一つに記載のエタノールの製造方法。
［７］
　前記消泡剤の曇点が、当該消泡剤の１０質量％水溶液で１０℃以下である、［１］～［６］のいずれか一つに記載のエタノールの製造方法。
［８］
　培養全体における、消泡剤の総量とリグノセルロース系バイオマスの総量との質量比（消泡剤の総量：リグノセルロース系バイオマスの総量）が１：１００～１：１０，０００である、［１］～［７］のいずれか一つに記載のエタノールの製造方法。
［９］
　前記並行複発酵工程、前記半並行複発酵工程または前記逐次糖化発酵工程が、連続式で行われる、［１］～［８］のいずれか一つに記載のエタノールの製造方法。
［１０］
　古紙パルプおよび漂白されていないパルプから選択される少なくとも１種のリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法に用いるための消泡剤であって、非イオン界面活性剤を含む、消泡剤。
　本発明によれば、リグノセルロース系バイオマス（例えば、古紙パルプや漂白されていないパルプ）からエタノールを製造する方法であって、並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含み、並行複発酵工程を含む場合において、前記並行複発酵工程が、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合において、前記半並行複発酵工程もしくは前記逐次発酵工程が、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、前記消泡剤が非イオン性界面活性剤を含むことにより、発酵液の消泡効果を向上することができる。
試験区２－１および試験区２－２のエタノール濃度の経時変化を示す。
発明の具体的説明
　本発明のリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法は、並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含み、並行複発酵工程を含む場合において、前記並行複発酵工程が、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液（好ましくは、糖化発酵液）に消泡剤を添加する工程を含んでなり、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合において、前記半並行複発酵工程または前記逐次発酵工程が、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、前記消泡剤が非イオン性界面活性剤を含むことを一つの特徴としている。前記リグノセルロース系バイオマスが古紙パルプおよび漂白されていないパルプから選択される少なくとも１種であることが好ましい。なお、本明細書において、「リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液」とは、前記糖化液、前記発酵液、または、前記糖化液および前記発酵液の組合せをいう。
＜製造方法＞
　本発明のリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法は、並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含み、並行複発酵工程を含む場合において、前記並行複発酵工程が、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合において、前記半並行複発酵工程または前記逐次発酵工程が、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に非イオン性界面活性剤を含む消泡剤を添加する工程を含む。前記リグノセルロース系バイオマスは古紙パルプおよび漂白されていないパルプからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。ここで、本発明の「リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液」は、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を用いた発酵で生じる発酵液のみならず、発酵前の培養液（例えば、並行複発酵工程におけるリグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含む培養液、および、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを混合して糖化反応を行うことにより得られた糖化液および酵母を含んでなる培養液）を含む。また、本発明の「リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液」は、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを混合して糖化反応を行うことにより得られる糖化液のみならず、糖化反応前の混合液（例えば、半並行複発酵工程または逐次発酵工程の糖化工程における、糖化反応前の、リグノセルロース系バイオマスおよび糖化酵素を含んでなる混合液）を含む。
　本発明の一つの実施態様によれば、本発明のリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法は、以下の工程の少なくとも一つを含んでいてもよく、並行複発酵工程を含む場合、並行複発酵工程において、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に非イオン性界面活性剤を含む消泡剤を添加することを含み、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合、半並行複発酵工程または逐次発酵工程において、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に、非イオン性界面活性剤を含む消泡剤を添加することを含む。
（１）並行複発酵工程、
　　　半並行複発酵工程、または
　　　逐次糖化発酵工程
（２）固液分離工程
（３）エタノール濃縮工程
（４）固形分除去工程
＜並行複発酵工程＞
　並行複発酵工程は、一般的には原料の糖化と発酵によるエタノール生産とが同時に進行する工程をいう。本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程は、糖化酵素と共にエタノール発酵微生物を共存させ、糖化反応（酵素糖化反応ともいう）とエタノール発酵とを同時に行う工程であり、例えば、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液を用いて、糖化反応とエタノール発酵とを同時に行う工程である。
　並行複発酵工程の具体的な方法としては、例えば、まず、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を反応槽中に供給する。本発明において、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母は予め混合して反応槽内に供給してもよく、それぞれを別々に反応槽内に供給してもよいが、反応槽中に予め供給されたリグノセルロース系バイオマスに糖化酵素および酵母を添加することが好ましい。リグノセルロース系バイオマスは糖化酵素により糖化され、生成された糖類が酵母による発酵でエタノールに変換される。
＜半並行複発酵工程＞
　半並行複発酵工程は、一般的には、原料の糖化が一部進んだところで、発酵によるエタノール生産が同時に行われる工程をいう。本発明の一つの実施態様によれば、半並行複発酵工程は、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを混合して糖化反応を行い糖化液を得た（糖化工程ともいう）後、得られた糖化液とエタノール発酵微生物（好ましくは酵母）とを混合して得られた発酵液を用いて糖化反応とエタノール発酵とを行う（糖化発酵工程ともいう）工程である。ここで、半並行複発酵工程における糖化工程を行う反応槽と糖化発酵工程を行う反応槽は同一であっても別であってもよく、好ましくは、半並行複発酵工程がバッチ式で行われ、エタノール発酵微生物が酵母である場合、糖化工程を行う反応槽と糖化発酵工程を行う反応槽が同一であり、半並行複発酵工程が連続式で行われる場合、糖化工程を行う反応槽と糖化発酵工程を行う反応槽が別である。
　半並行複発酵工程の具体的な方法としては、例えば、まず、リグノセルロース系バイオマスおよび糖化酵素を反応槽中に供給する。リグノセルロース系バイオマスは、まず糖化酵素により糖化される（糖化工程）。その後、同じ反応槽に酵母を添加し酵素糖化反応とエタノール発酵とが行われ、生成された糖類が酵母による発酵でエタノールに変換される（糖化発酵工程）。
＜逐次糖化発酵工程＞
　逐次糖化発酵工程は、一般的には、原料の糖化と発酵によるエタノール生産とを段階的に行う工程をいう。本発明の一つの実施態様によれば、逐次糖化発酵工程は、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを混合して糖化を行い糖化液を得た（糖化工程ともいう）後、得られた糖化液とエタノール発酵微生物（好ましくは、酵母）とを混合して得られた発酵液を用いてエタノール発酵を行う（発酵工程ともいう）工程であって、好ましくは、糖化工程を行う反応槽と発酵工程を行う反応槽が別であり、糖化工程で得られた糖化液は糖化工程とは別の反応槽に移送される。
　逐次糖化発酵工程の具体的な方法としては、例えば、まず、リグノセルロース系バイオマスおよび糖化酵素を反応槽中に供給する。リグノセルロース系バイオマスは糖化酵素により糖化される（糖化工程）。その後、得られた糖化液を別の反応槽に移送後、酵母を添加し、生成された糖類が酵母による発酵でエタノールに変換される（発酵工程）。
（リグノセルロース系バイオマス）
　本発明の一つの実施態様によれば、リグノセルロース系バイオマスは、特に限定されないが、パルプまたはパルプ以外のリグノセルロースを含む原料が挙げられ、好ましくは、通常の発酵に比べて発泡の多いリグノセルロースを含むバイオマスとされる。ここで、通常の発酵とは、例えば、広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）等を用いた発酵が挙げられる。また、リグノセルロース系バイオマスは１種を単独で用いてもよいし、２種以上混合して用いてもよい。ここで、「通常の発酵に比べて発泡の多い」とは、ほぼ同量の発酵液を用いて培養する場合、通常の発酵に比べて泡の高さが高くなることが挙げられる。例えば、１Ｌ培養槽（円筒形の培養槽の底面の直径８ｃｍ）に６００ｍＬの培養液を入れて、酵母の菌体数が１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上に達した後、５質量％のパルプを投入してから３０分後に泡の高さを比較した際、通常の発酵であるＬＢＫＰを用いた発酵では泡の高さが１ｃｍ未満であり、古紙パルプを用いた発酵では３～４ｃｍ以上の高さとなる。
　上記の通常の発酵に比べて発泡の多いリグノセルロース系バイオマスとしてのパルプとしては、例えば、古紙パルプ、漂白されていないパルプ等が挙げられ、好ましくは古紙パルプとされる。上記古紙パルプにおける古紙としては、具体的には、紙カップ、圧着ハガキ、カートカン、ワンプ等の耐水性古紙、カタログ（例えば、色上質紙）、紙器、シュレッダー紙（例えば、ＯＡ紙のシュレッダー紙）等の普通印刷古紙、ノーカーボン紙、箔押し紙器等の特殊印刷古紙、雑誌等のリグニンを多く含む古紙等が挙げられ、好ましくは、耐水性古紙、普通印刷古紙とされ、より好ましくは、紙カップ、紙器とされる。上記漂白されていないパルプ（未漂白パルプや無漂白パルプともいう）としては、化学パルプ、機械パルプが挙げられ、より具体的には広葉樹クラフトパルプ（例えば、未晒クラフトパルプ、酸素晒し未漂白クラフトパルプ）、針葉樹クラフトパルプ（例えば、未晒クラフトパルプ、酸素晒し未漂白クラフトパルプ）、サルファイトパルプ、ソーダパルプ等の化学パルプ、セミケミカルパルプ、ケミグラウンドウッドパルプ、廃材由来パルプ等が挙げられ、好ましくは、広葉樹未晒クラフトパルプ、広葉樹酸素晒し未漂白クラフトパルプ、針葉樹未晒クラフトパルプ、針葉樹酸素晒し未漂白クラフトパルプ、サルファイトパルプ、ソーダパルプとされる。上記漂白されていないパルプとしては、漂白処理が行われていないパルプであり、漂白処理としては、特に限定されないが、塩素漂白、過酸化水素漂白等各種の方法が挙げられる。
　また、パルプ以外のリグノセルロース系バイオマスとしては、古紙、パルプスラッジ、スラッジ、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられ、好ましくは古紙とされる。古紙の種類に関しては上述の通りである。これらのバイオマスは、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであってもよい。
　上述のパルプ以外のリグノセルロース系原料は、前処理（脱リグニン処理等）を行った上で好適に使用される。
　本発明の一つの実施態様によれば、反応槽中の発酵液におけるリグノセルロース系バイオマスの濃度は、好ましくは５～３０質量％であり、さらに好ましくは１０～２０質量％である。リグノセルロース系バイオマスの濃度を５質量％以上にすることは、最終的に生産物の濃度が低すぎてエタノールの濃縮のコストが高くなるという問題を回避する上で有利である。また、リグノセルロース系バイオマスの濃度を３０質量％以下とすることは、高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題を回避する上で有利である。
（糖化酵素）
　糖化酵素はセルロースまたはヘミセルロース分解酵素である限り特に限定されない。セルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性等を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素が挙げられる。各セルロース分解酵素は、それぞれの活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルロース分解酵素剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルロース分解酵素剤を用いても良い。
　市販のセルロース分解酵素剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属等に由来するセルロース分解酵素剤がある。このようなセルロース分解酵素剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロシンＡＬ８（エイチビィアイ社製）、Ｃｅｌｌｉｃ　ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、セルラーゼＹ－ＮＣ（ヤクルト薬品工業社製）、メイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ　Ｓｅｉｋａ　ファルマ社製）等が挙げられる。
　使用される糖化酵素は、セルロース分解酵素剤の性質等を勘案して、単独または組み合わせて用いることができる。
　本明細書における糖化酵素の活性は、以下の通りに定義される。
　１Ｍ酢酸緩衝液１．５ｍＬを含む８ｍＬの水溶液（ｐＨ４．８）に酵素液３７５μＬ、広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）絶乾重量０．５ｇを加えた計１０ｍＬの系で３３℃、４時間反応を行ったのち、９５℃、１０分間加熱して反応停止させた。これを高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所社製）にて示差屈折率（ＲＩ）検出器を用いて分析、グルコース濃度を測定する。測定結果に基づき、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生じる酵素タンパク量を１単位（Ｕ）とする。
　ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＵＧＡＲ　ＳＰ０８１０（昭和電工株式会社製）
移動相：超純水
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度：８０℃
　本発明の一つの実施態様によれば、反応槽中の発酵液における糖化酵素の投入量は、特に限定されないが、好ましくは５０～５００Ｕ／Ｌであり、さらに好ましくは１００～３００Ｕ／Ｌである。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程での、反応槽中の発酵液における糖化酵素の投入量とリグノセルロース系バイオマスとの比（糖化酵素の初期含量（Ｕ）／リグノセルロース系バイオマスの初期含量（ｋｇ））は、好ましくは５００～５，０００Ｕ／ｋｇであり、さらに好ましくは１，０００～３，０００Ｕ／ｋｇである。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における、反応槽中の発酵液における糖化酵素の投入量とリグノセルロース系バイオマスとの比は上記と同様である。
（酵母）
　酵母は、特に限定されないが、糖類（六炭糖、五炭糖）を発酵できることが好ましい。具体的には、酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロマイセス属酵母、シェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）から変更）等のシェフェルソマイセス属酵母、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｈｉｈａｔａｅ）等のキャンディダ属酵母、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ　ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）等のパチソレン属酵母等の酵母が挙げられ、好ましくはサッカロマイセス属に属する酵母、さらに好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエである。また、遺伝子組換技術を用いて作製した酵母を用いることもできる。遺伝子組換技術を用いて作製した酵母としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる酵母を特に制限なく用いることができる。好ましい遺伝子組換技術を用いて作製した酵母としては、キシロースからのエタノール生産能の改善された酵母が挙げられ、より好ましくは、キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子、トランスケトラーゼをコードする遺伝子およびアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が発現可能に導入された酵母であり、さらに好ましくは、国際公開２０１６／０６０１７１号に記載の酵母である。ここで、前記遺伝子が、前記酵母の内在性遺伝子であってよい。
（消泡剤）
　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の消泡剤は、例えば、細胞増殖および／または発酵のために使用される発酵液（発酵前の培養液を含む）に対して消泡効果および／または抑泡効果を有する消泡剤であれば、特に限定されないが、好ましくは、消泡効果の観点から、非イオン性界面活性剤を含む消泡剤（好ましくは、非イオン性界面活性剤を主成分として含む消泡剤、以下、非イオン性界面活性剤系消泡剤ともいう）等が挙げられる。したがって、本発明の消泡剤は消泡剤組成物と称してもよい。ここで、消泡剤における非イオン性界面活性剤の含有量としては、８０～１００質量％が挙げられ、好ましくは９０～１００質量％であり、より好ましくは９５～１００質量％である。
　上記非イオン性界面活性剤としては、ポリエーテル型が好ましく、ポリオキシアルキレンエーテル型がより好ましい。市販のポリエーテル型の非イオン性界面活性剤としては、Ａｄｅｋａ社製の商品名「アデカノールＬＧ－１０９」、「アデカノールＬＧ－１２６」、「アデカノールＬＧ－２９４」、「アデカノールＬＧ－２９５Ｓ」「アデカノールＬＧ－２９９」（それぞれ登録商標）、サンノプコ社製の商品名「ノプタム　３００ＥＺ」、花王社製の商品名「消泡剤　ＮＯ．１」、富士フィルム和光純薬製の「消泡剤　ＰＥ－Ｌ」、「消泡剤　ＰＥ－Ｍ」、「消泡剤　ＰＥ－Ｈ」等が挙げられる。また、特殊設計の非イオン性界面活性剤としては、花王社製の商品名「ＦＥＲＭＯＬ　１０００」等が挙げられる。また、市販のポリオキシアルキレンエーテル型の非イオン性界面活性剤としては、Ａｄｅｋａ社製の商品名「アデカノールＬＧ－１０９」、「アデカノールＬＧ－１２６」、「アデカノールＬＧ－２９４」、「アデカノールＬＧ－２９９」（それぞれ登録商標）、サンノプコ社製の商品名「ノプタム　３００ＥＺ」等が挙げられる。
　本発明の別の実施態様によれば、本発明の消泡剤は、例えば、細胞増殖および／または発酵のために使用される発酵液に対して消泡効果および／または抑泡効果を有する消泡剤であれば、特に限定されないが、好ましくは、ポリエーテル型消泡剤とされ、より好ましくはポリオキシアルキレンエーテル型消泡剤とされる。
　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の消泡剤の２５℃における比重（水の密度に対する消泡剤の密度の比）は、０．９０～１．０５であることが挙げられ、発酵液の比重（約１．００～１．０１６）より小さいと液面に存在しやすいため、液面の泡に対して効果が高いという観点から、好ましくは０．９３～１．０１とされ、より好ましくは０．９５～１．００とされ、さらに好ましくは０．９５～０．９９とされる。消泡剤の２５℃における比重は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＪＩＳ Ｋ００６１：２００１「化学製品の密度及び比重測定方法」に記載の浮ひょう法、比重瓶法、振動式密度計法、天びん法等により測定することができ、発酵液の比重は浮ひょう法により測定することができる。
　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の消泡剤の曇点は、例えば、かかる消泡剤の１０質量％水溶液を調製した場合、２５℃以下であることが挙げられ、曇点以下では起泡液中に溶解し消泡機能が著しく低下するという観点から、好ましくは１５℃以下とされ、より好ましくは５℃以下とされる。曇点の下限は特に限定されないが、測定限界以下または０℃以上が好ましい。消泡剤の曇点は、当技術分野において公知の方法で測定できる。公知の曇点の測定方法としては、例えば、イオン交換水で消泡剤を１または１０質量％含む水溶液を、または２５質量％ジエチレングリコールモノブチルエーテル水溶液で消泡剤を１０質量％含む水溶液を調整した後、水溶液を加熱していき、水溶液が濁り始める温度を目視で測定することで行う。例えば、濁り始める温度が２０℃未満の場合は、イオン交換水（１０質量％水溶液）での測定結果を、２０～９０℃の場合は、２５質量％ジエチレングリコールモノブチルエーテル水溶液またはイオン交換水（１質量％水溶液）での測定結果を曇点として採用する。なお、イオン交換水での測定結果に関しては、０℃以下の温度では水が凍結して曇点が測定できなくなるため（測定限界）、０℃で濁っている場合の曇点を０℃以下（測定限界以下）とする。
　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の消泡剤の２５℃における粘度（ｍＰａ・ｓ）は、１００～１０００が挙げられ、作業性の観点から、好ましくは１５０～７００とされ、より好ましくは２００～３００とされる。消泡剤の粘度は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＪＩＳ Ｋ５１０１－６－２：２００４にしたがって測定される。
　本発明の一つの実施態様によれば、本発明の消泡剤の２５℃での水への溶解性（ｇ／１００ｍＬ）は、水に不溶性であるかまたはほとんど溶けないかのいずれかであり、第十八改正日本薬局方に記載の「溶けにくい」、「極めて溶けにくい」および「ほとんど溶けない」に該当する物質を包含する。本発明における消泡剤は、水への溶解度が、２５℃において、例えば、約５ｇ／１００ｍＬ以下が挙げられ、消泡剤は分散している方が消泡効果をより奏するという観点から、好ましくは１ｇ／１００ｍＬ以下とされ、より好ましくは０．１ｇ／１００ｍＬ以下であり、さらに好ましくは０．０１ｇ／１００ｍＬ以下とされる。水への溶解性の下限は特に限定されないが、０．００１ｇ／１００ｍＬ以上が好ましい。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行発酵工程での反応槽中の発酵液のｐＨは、特に限定されないが、３～１０の範囲に維持することが好ましく、４～８の範囲に維持することがより好ましい。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における反応槽中の発酵液のｐＨは、上記と同様である。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程での反応槽中の発酵液の温度は、糖化酵素および／または酵母の至適温度の範囲内であれば特に限定されないが、２０～４０℃が好ましく、３０～４０℃がより好ましい。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における反応槽中の発酵液の温度は、上記と同様である。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における反応槽中の糖化液の温度は、糖化酵素の至適温度の範囲内であれば特に限定されないが、３０～７０℃が好ましく、４０～６０℃がより好ましい。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程における反応槽中の菌体数は、特に限定されないが、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上がより好ましい。また、好ましい菌体数の範囲は、１０７～１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、より好ましい菌体数の範囲は１０８～１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における反応槽中の菌体数は、上記と同様である。
　本発明の別の実施態様によれば、並行複発酵工程における反応槽への植菌数は、特に限定されないが、終濃度として、１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上がより好ましい。また、好ましい植菌数の範囲は、１０６～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、より好ましい植菌数の範囲は１０７～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における反応槽中の植菌数は、上記と同様である。
　発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程における反応槽中の発酵液における消泡剤の初期含量と発酵液の初期量（１日目の量）との比（消泡剤の初期含量：発酵液量の初期含量）は、特に限定されないが、例えば、１：５００～１：４０，０００が挙げられ、好ましくは、１：８５０～１：２０，０００とされ、より好ましくは、１：１，０００～１：１５，０００とされる。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における反応槽中の発酵液における消泡剤の初期含量と発酵液の初期量との比は、上記と同様である。本発明のさらに別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における反応槽中の糖化液における消泡剤の初期含量と糖化液の初期量（１日目の量）との比（消泡剤の初期含量：糖化液量の初期含量）は、特に限定されないが、例えば、１：２００～１：５００，０００が挙げられ、好ましくは、１：５００～１：４００，０００とされ、より好ましくは、１：１，０００～１：２００，０００とされる。ここで、さらに別の実施態様における好ましい糖化液としては、糖化反応前の、リグノセルロース系バイオマスおよび糖化酵素を含んでなる混合液とされる。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程における反応槽中の発酵液における消泡剤の初期含量とリグノセルロース系バイオマスの初期含量との比（消泡剤の初期含量：リグノセルロース系バイオマスの初期含量）は、特に限定されないが、例えば、１：５０～１：２，０００が挙げられ、好ましくは、１：７５～１：１，０００とされ、より好ましくは、１：１００～１：８００とされる。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における反応槽中の発酵液における消泡剤の初期含量とリグノセルロース系バイオマスの初期含量との比は、上記と同様である。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における反応槽中の糖化液における消泡剤の初期含量とリグノセルロース系バイオマスの初期含量（消泡剤の初期含量：リグノセルロース系バイオマスの初期含量）との比は、特に限定されないが、例えば、１：５０～１：４０，０００が挙げられ、好ましくは、１：７５～１：２０，０００とされ、より好ましくは、１：１００～１：１０，０００とされる。
　発明の一つの実施態様によれば、消泡剤の１回あたりの添加量は当業者が適宜設定できるものであるが、例えば、並行複発酵工程における、消泡剤の１回あたりの添加量と添加される発酵液の量との質量比（消泡剤：発酵液）は、特に限定されないが、例えば、１：２００～１：５０，０００が挙げられ、好ましくは、１：５００～１：４０，０００とされ、より好ましくは、１：１，０００～１：２０，０００とされる。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程における、消泡剤の１回あたりの添加量と添加される発酵液の量との質量比は、上記と同様である。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における、消泡剤の１回あたりの添加量と添加される糖化液の量との質量比（消泡剤：糖化液）は、特に限定されないが、例えば、１：２００～１：５００，０００が挙げられ、好ましくは、１：５００～１：４００，０００とされ、より好ましくは、１：１，０００～１：２００，０００とされる。
　本発明の一つの実施態様によれば、前記消泡剤の添加のタイミングは特に限定されないが、発酵液の調整時、泡が発生した時、リグノセルロース系バイオマス添加時等が挙げられる。ここで、「発酵液の調整時」とは、発酵液の調整時に、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に消泡剤を添加することや、糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に消泡剤を添加することを含む。なお、「糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に消泡剤を添加すること」には、糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に消泡剤を添加することのみならず、糖化液に消泡剤を添加し、その後酵母と混合して発酵液とすることも含まれる。また、泡の発生時とは、泡がある一定の高さになった場合に消泡剤を添加することが挙げられる。泡の高さは当業者が適宜設定できる。本発明の別の実施態様によれば、前記消泡剤は、例えば、培養期間中に連続的または間欠的に添加することが挙げられ、間欠的に添加することが好ましい。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程や逐次糖化発酵工程においては、前記消泡剤は、半並行複発酵工程の糖化工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における糖化液に添加してもよい。ここで、本発明の消泡剤を用いることにより、糖化液の消泡効果が向上される上で有利である。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。ここで、連続式とは、例えば、原料供給およびエタノールの生成が継続される態様をいう。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程や逐次糖化発酵工程における方式は、上記と同様である。
　並行複発酵工程においては、発酵液におけるリグノセルロース系バイオマスの濃度が所定の範囲内に維持されるように調節されることが好ましい。上記所定の範囲としては、５～３０質量％が挙げられ、好ましくは１０～２０質量％である。上記調節は、例えば、反応槽にリグノセルロース系バイオマスを供給することにより行われる。ここで、リグノセルロース系バイオマスの反応槽への供給速度は特に限定されないが、並行複発酵工程が連続式であって、反応槽から発酵液が排出されている場合、反応槽へのリグノセルロース系バイオマスの供給速度と反応槽からの発酵液の排出速度が同程度であることが好ましい。また、下記に示すように、固液分離工程において、エタノール水溶液分離後の固形分濃縮発酵液を回収し、反応槽へ移送する場合、該固形分濃縮発酵液と反応槽へのリグノセルロース系バイオマスとの合計の供給速度と反応槽からの発酵液の排出速度とが同程度であることが好ましい。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の発酵工程におけるリグノセルロース系バイオマスの濃度は、上記と同様である。
　本発明の一つの実施態様によれば、並行複発酵工程においては、発酵液における糖化酵素の濃度が所定の範囲内に維持されるように調節されることが好ましい。上記所定の範囲としては、５０～５００Ｕ／Ｌが挙げられ、好ましくは１００～３００Ｕ／Ｌである。上記調節は、例えば、反応槽に糖化酵素を供給することにより行われる。さらに、固液分離工程において、固形分濃縮発酵液を回収し、反応槽へ移送することにより、回収した糖化酵素を供給してもよい。本発明の別の実施態様によれば、半並行複発酵工程の糖化発酵工程や逐次糖化発酵工程の糖化工程における糖化酵素の濃度は、上記と同様である。
＜固液分離工程＞
　上記反応槽から排出された発酵液は、固液分離工程で減圧蒸留装置、膜分離装置等の分離装置により、固形分濃縮発酵液と水溶液、例えば、固形分濃縮発酵液とエタノール水溶液とに分離することができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーター等を用いることができる。減圧下では低い温度でエタノールを分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。得られたエタノール水溶液は下記のエタノール濃縮工程で濃縮されうる。
　エタノール水溶液を分離した後の固形分濃縮発酵液を回収して、そのまま反応槽へと移送してもよく、また、以下に示すように、固形分除去装置により残渣と上清に分離してもよい。
＜エタノール濃縮工程＞
　本発明の一つの実施態様によれば、上記固液分離工程で得られたエタノール水溶液は、さらに蒸留処理または各種分離膜、例えば、ゼオライト膜を用いて濃縮することにより、高純度のエタノールを生成することができる。また、上記エタノール水溶液は、エタノール除去後に反応槽に移送してもよい。
＜固形分除去工程＞
　固液分離工程においてエタノール水溶液を分離した後の固形分濃縮発酵液は、固形分除去装置に移送し残渣と上清に分離してもよい。得られた上清は反応槽へ移送してもよい。固形分除去装置としては、ディスク型遠心分離機、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。分離された残渣には、酵素、リグニン、酵母が含まれている。残渣に吸着している酵素を遊離させて回収し、再利用することもできる。リグニンは、燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。酵母を残渣から分離して、並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次糖化発酵工程で再利用することもできる。
　本発明のエタノールの製造方法によれば、効率的に、リグノセルロース系用原料からエタノールを製造することができる。前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノール、食品添加用エタノール等として好適に利用可能である。
　本発明の別の態様によれば、古紙パルプおよび漂白されていないパルプからなる群から選択されるリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法に用いるための消泡剤であって、非イオン性界面活性剤を含む、消泡剤が提供される。
　上記の、消泡剤の態様はいずれも、本発明の製造方法に関する記載に準じて実施することができる。
　以下、本発明を試験例により具体的に説明するが、本発明はこれら試験例に限定されない。また、特に指摘されない限り、本明細書に記載の単位および測定方法は日本工業規格（ＪＩＳ）による。
菌体数の計測方法
　試験例において用いられた酵母サッカロマイセス・セレビシエの菌体数はトーマ血球計算盤を用い、光学顕微鏡（倍率４００倍）で観察、計測した。
エタノール濃度の測定方法
　発酵液中のエタノール濃度については、発酵液を９５℃、１０分間加熱して酵母および酵素を失活させたのち、これをＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所社製）にて示差屈折率（ＲＩ）検出器を用いて分析、測定した。
　ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＰ０８１０（昭和電工株式会社製）
移動相：超純水
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
温度：８０℃
試験例１
紙カップ由来（古紙由来）パルプの調製
　紙カップ由来パルプは一般的な調製方法で調製した。具体的には、次の方法で行った。まず、市販の防水加工済み紙カップを裁断機にて、８ｍｍ幅以下となるように裁断した。裁断した紙カップをワーリングブレンダーに４質量％（乾燥重量ベース、４０ｇ相当）となるように投入し、水を加えて全量１０００ｇとした。１０００ｇに調整後、回転速度１９，０００ｒｐｍで断続的に３０分以上回転させ、紙カップを離解させた。紙カップ離解液を洗濯ネットに入れ、４倍以上の水で洗浄、脱水を２回繰り返し、含水率７０質量％前後の紙カップ由来パルプを得た。
消泡剤の種類の検討
　紙カップ由来（古紙）由来パルプでのエタノール製造における発泡に対する抑泡効果および消泡効果を確認した。まず、１Ｌ培養槽に、上記で得られた紙カップ由来パルプ５質量％（乾燥重量ベース、３０ｇ相当）、糖化酵素７９Ｕ、抗菌剤８０ｐｐｍ、および抗生物質６０ｐｐｍを添加し、反応重量が約５００ｇとなるよう滅菌水で液量を調整した。調整後、３３℃、攪拌速度３７０ｒｐｍ、ｐＨ４．８で一定になるよう制御し、２４時間反応させた。２４時間経過後、さらに紙カップ由来パルプ５質量％（乾燥重量ベース、３０ｇ相当）を投入し、３３℃、攪拌速度３７０ｒｐｍ、ｐＨ４．８で２時間反応させた。上記反応により得られた反応液（糖化液）を５０ｍＬコニカルチューブに１０ｍＬ分注した。各試験区において、反応液を分注したコニカルチューブに、表１に示す消泡剤を５、１０、２０、５０、１００ｐｐｍとなるように加えた。反応液と消泡剤の入ったコニカルチューブを激しく振とうさせた。発泡後、ただちにコニカルチューブを静置し、１０秒後の泡の状態を確認した。
　各種消泡剤において、静置後１０秒以内に泡が消えた消泡剤添加濃度のうち最小の濃度を表２に示す。
　試験区１－７（アデカノールＬＧ－２９４）および試験区１－８（アデカノールＬＧ－２９９）で高い消泡効果を示した。
試験例２：連続糖化発酵での消泡剤効果の確認
　試験例１で得られた結果に基づき、シリコン消泡剤ＫＭ－７０（試験区２－１）とアデカノールＬＧ－２９４（試験区２－２）の連続糖化発酵での消泡効果を比較した。なお、試験例１において、アデカノールＬＧ－２９４はアデカノールＬＧ－２９９に比べて消泡時間が短かったため、ＬＧ－２９４を試験例２に供した。
　１Ｌ培養槽に紙カップ由来パルプ５質量％（乾燥重量ベース、３０ｇ相当）、糖化酵素７９Ｕ、尿素０．２２質量％、ＣＳＬ（コーンスティプリカー）１質量％、抗菌剤１０ｐｐｍとなる量を投入し、酵母サッカロマイセス・セレビシエを終濃度１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる量で植菌した。反応重量が約５００ｇとなるよう滅菌水で液量を調整した。調整したそれぞれの発酵液に対して、消泡剤を１００ｐｐｍ添加し、３３℃、攪拌速度３７０ｒｐｍ、ｐＨ４．８で一定になるよう制御し、２４時間反応させた。２４時間反応後に紙カップ由来パルプ５質量％（乾燥重量ベース、３０ｇ相当）となる量を投入し、全量６００ｇとした（発酵液面の高さ　１１ｃｍ）のち、さらに２４時間反応させた。反応後、培養槽から約半分量の発酵液を抜き出し、該発酵液を遠心分離した。遠心分離した発酵液の上清３００ｇをエバポレーターにより、完全にエタノールを除去し、エバポレーター留分および遠心残渣を発酵液に戻し、該発酵液を培養槽に戻した。さらに５質量％（乾燥重量ベース、３０ｇ相当）となる量の紙カップ由来パルプを追加し、反応を再開した。この操作を２４時間毎に繰り返し、１０日間培養を継続した。培養期間中に発酵液面より５ｃｍの高さまで発泡した際に消泡剤添加を行い、その量を比較した。
　発酵液の作製条件を以下に示す。
　発酵液の組成を以下に示す。
　表５では、試験例２において培養１０日間で添加した消泡剤の総量を示す。なお、試験区２－１では、培養開始から１６８、１９２、２１６時間後に消泡剤をそれぞれ１００ｐｐｍ添加した。また、試験区２－２では、培養開始から１６８時間後に消泡剤を１００ｐｐｍ添加した。
　試験区２－２（アデカノールＬＧ－２９４）では、試験区２－１（ＫＭ－７０）に比して消泡剤の使用量が半分以下となることを確認した。ここで、試験区２－１では消泡剤を添加しても、培養は行えるものの、泡は完全には消失しなかった。
　試験区２－１～２－２における発酵液中のエタノール濃度を図１に示す。試験区２－１における発酵液中のエタノール濃度は、４８時間では４７．６ｇ／Ｌ、９６時間では４６．０ｇ／Ｌ、１４４時間では４４．３ｇ／Ｌ、１９２時間では４２．０ｇ／Ｌであった。試験区２－２における発酵液中のエタノール濃度は、４８時間では４７．５ｇ／Ｌ、９６時間では４５．５ｇ／Ｌ、１４４時間では４４．１ｇ／Ｌ、１９２時間では４２．０ｇ／Ｌであった。発酵液中のエタノール濃度は試験区２－１、２－２で同等であった。
　試験区２－３では、リグノセルロース系バイオマスとして広葉樹晒クラフトパルプ（ＬＢＫＰ）を用いる以外は、試験区２－１と同様の条件で培養を行った。その結果、培養１０日間で添加した消泡剤（ＫＭ-７０）の総量は、培養開始時の１００ｐｐｍのみであった。

Claims (9)

  1. 　リグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法であって、
    　並行複発酵工程、半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含み、
    　　並行複発酵工程を含む場合において、前記並行複発酵工程が、リグノセルロース系バイオマス、糖化酵素および酵母を含んでなる発酵液に消泡剤を添加する工程を含んでなり、
    　　半並行複発酵工程または逐次発酵工程を含む場合において、前記半並行複発酵工程または前記逐次発酵工程が、リグノセルロース系バイオマスと糖化酵素とを含んでなる糖化液、および／または前記糖化液と酵母とを含んでなる発酵液に、消泡剤を添加する工程を含んでなり、
    　　前記消泡剤が非イオン性界面活性剤を含む、方法。
  2. 　前記リグノセルロース系バイオマスが古紙パルプおよび漂白されていないパルプから選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のエタノールの製造方法。
  3. 　前記古紙が、紙カップ、紙器、および雑紙からなる群から選択される、請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
  4. 　前記消泡剤がポリオキシアルキレンエーテル型の非イオン性界面活性剤を含む、請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
  5. 　前記消泡剤の２５℃での比重が０．９５～１．００である、請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
  6. 　前記消泡剤の曇点が、当該消泡剤の１０質量％水溶液で１０℃以下である、請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
  7. 　培養全体における、消泡剤の総量とリグノセルロース系バイオマスの総量との質量比（消泡剤の総量：リグノセルロース系バイオマスの総量）が１：１００～１：１０，０００である、請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
  8. 　前記並行複発酵工程、前記半並行複発酵工程または前記逐次糖化発酵工程が、連続式で行われる、請求項１に記載のエタノールの製造方法。
  9. 　古紙パルプおよび漂白されていないパルプから選択される少なくとも１種のリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法に用いるための消泡剤であって、非イオン性界面活性剤を含む、消泡剤。
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