WO2026013147A1 - Région promotrice du gène régulateur gadr2 et son utilisation pour la surproduction d'acide gamma-aminobutyrique - Google Patents

Région promotrice du gène régulateur gadr2 et son utilisation pour la surproduction d'acide gamma-aminobutyrique

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WO2026013147A1
WO2026013147A1 PCT/EP2025/069626 EP2025069626W WO2026013147A1 WO 2026013147 A1 WO2026013147 A1 WO 2026013147A1 EP 2025069626 W EP2025069626 W EP 2025069626W WO 2026013147 A1 WO2026013147 A1 WO 2026013147A1
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WO
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gadr2
lactic acid
gaba
plasmid
promoter region
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Pending
Application number
PCT/EP2025/069626
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English (en)
Inventor
Nathalie BALLET
Sophie LEGRAIN
Muriel COCAIGN-BOUSQUET
Valérie LAROUTE
Marie-Line DAVERAN-MINGOT
Romain BERNARDO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ecole D'ingenieurs De Purpan
Lesaffre et Cie SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universite de Toulouse
Original Assignee
Ecole D'ingenieurs De Purpan
Lesaffre et Cie SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA
Institut National de Recherche pour lAgriculture lAlimentation et lEnvironnement
Universite de Toulouse
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Publication date
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a promoter region of the gadR2 regulatory gene capable of inducing gadR2 overexpression, a gadR2 regulatory cassette comprising a gadR2 regulatory gene and its promoter region, and the use of said cassette to induce upregulation of the gadCB promoter.
  • the invention also relates to a plasmid comprising the gadR2 regulatory cassette and a transformed lactic acid bacterium comprising the plasmid, the plasmid, and the bacterium, which can be used to induce gamma-aminobutyric acid (GABA) overproduction.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • the invention further relates to a method for producing GABA comprising culturing a transformed lactic acid bacterium according to the invention and a method for producing a genetically modified GABA-producing lactic acid bacterium comprising introducing a plasmid according to the invention into said lactic acid bacterium.
  • Lactic acid bacteria are widely used in the food industry (cheese, buttermilk, cream, yogurt) for their acidifying (conversion of sugars to lactic acid), texturizing (production of exopolysaccharides), and protective properties against pathogenic bacteria (production of bacteriocins). They also contribute to the flavor of dairy products, and interest in their potential use as cellular factories for the chemical industry (biofuels, solvents, bio-based plastics) has grown in recent years. Another attractive characteristic of lactic acid bacteria is their ability to produce a range of molecules with applications in the health field, such as bioactive peptides, vitamins, hyaluronic acid, and GABA.
  • GABA a neurotransmitter widely distributed in the sympathetic nervous system, has been the subject of particular research for several years due to its numerous health benefits. GABA plays a crucial role in lowering blood pressure, reduces the risk of lung adenocarcinoma, and possesses antidiabetic, neuroprotective, antidepressant, anti-inflammatory, and visceral antinociceptive properties.
  • Lactic acid bacteria are capable of producing large quantities of GABA.
  • this GABA production varies greatly between species and even between strains within the same species.
  • GABA production can vary depending on the species of lactic acid bacteria, but in the species Lactococcus lactis the These strains have a gadCB operon: gadC encoding the glutamate and GABA transporter and gadB encoding glutamate decarboxylase. These two genes depend on the same gadCB promoter (PgadCB). Upstream, there is a gene, called gadR2 (or gadR), a positive regulator of the gadCB promoter (PgadCB), which has its own promoter.
  • gadCB gadCB promoter
  • gadR2 or gadR
  • PgadCB a positive regulator of the gadCB promoter
  • the inventors of the present invention have now surprisingly discovered that the promoter region of the gadR2 gene (PgadR2) can induce overexpression of the gadR2 regulatory gene, leading to overexpression of the genes of the gadCB operon and overproduction of GABA.
  • PgadR2 the promoter region of the gadR2 gene
  • the present invention relates to a promoter region of the gadR2 regulatory gene capable of inducing the overexpression of gadR2, said region comprising or consisting of:
  • the present invention also relates to a gadR2 regulatory cassette comprising a gadR2 regulatory gene and its PgadR2 promoter region according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a regulatory cassette according to the invention, to induce positive regulation of the gadCB promoter.
  • the present invention also relates to a method for inducing positive regulation of the gadCB promoter, said method comprising a step implementing a gadR2 regulatory cassette comprising a gadR2 regulatory gene and its PgadR2 promoter region according to the invention.
  • It also relates to a plasmid comprising a gadR2 regulatory cassette according to the invention.
  • the present invention also relates to a transformed lactic acid bacterium comprising the plasmid according to the invention.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • the present invention also relates to a method for producing GABA comprising the culture of a lactic acid bacterium transformed according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for producing a genetically modified GABA-producing lactic acid bacterium comprising the introduction into said lactic acid bacterium of a plasmid according to the invention.
  • the invention relates to a promoter region of the gadR2 regulatory gene (PgadR2) capable of inducing overexpression of the gadR2 regulatory gene, said promoter region comprising or consisting of:
  • This specific promoter region allows for overexpression of the gadR2 regulatory gene, and therefore of the genes of the gadCB operon, as well as an overproduction of GABA.
  • overexpression of the gadR2 regulatory gene we mean, in particular, an expression greater than that obtained with a control promoter region of the gadR2 regulatory gene, for example, the promoter region of the gadR2 regulatory gene of the model strain Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, also known as strain NCDO2118. More specifically, the promoter region according to the invention allows for an expression of the gadR2 regulatory gene at least 14 times greater than the expression obtained with a control promoter region of strain NCDO2118.
  • the gadCB operon genes we mean, in particular, a higher expression of the gadC and gadB genes compared to that obtained with a control promoter region, for example, the promoter region of the gadCB operon of the model strain NCDO2118.
  • the promoter region with the gadR2 regulator according to the invention allows the basal level of the PgadCB promoter responsible for the expression of the gadC and gadB genes to be activated by a factor of 268 compared to the basal level, and to increase by a factor of 3 compared to the expression obtained with a control promoter region and its regulator gadR2 of the model strain NCDO2118.
  • the basal level corresponds to the expression of the gadCB promoter without the gadR2 regulator.
  • GABA overproduction is meant a production of GABA greater than that obtained with a control promoter region, for example the promoter region with the gadR2 regulator of the control strain NCDO2118, or the promoter region with the gadR2 regulator of the non-producing strain Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, also called strain IL1403.
  • the promoter region according to the invention makes it possible to obtain a production of GABA 18 times greater than the production obtained with a control promoter region of the strain NCDO2118 and 21 times greater than the production obtained with the promoter region of the low-producing strain IL1403 (values obtained by culturing the strains transformed with a plasmid carrying or not the promoter and the regulator in a bioreactor).
  • GABA also known as gamma-aminobutyric acid
  • CNS central nervous system
  • GABA is produced by neurons in the central nervous system and by lactic acid bacteria in the digestive system, such as Lactococcus and Lactobacillus. It is also found in many fermented foods, as lactic acid bacteria, such as Lactococcus, produce it. These bacteria produce GABA through the action of a glutamic acid decarboxylase (GAD) system, which includes a GAD enzyme encoded by the gadA or gadB genes and a glutamate/GABA antiporter encoded by the gadC gene.
  • GAD glutamic acid decarboxylase
  • SEQ ID No. 1 corresponds to the following sequence: 5’-
  • This sequence includes all the nucleotides upstream of the coding sequence of the gadR2 gene including the -10, -35 boxes and the 5'UTR region with the RBS (Ribosome Binding Site).
  • Said promoter region includes a SNP (single nucleotide polymorphism) consisting of the inversion of an A to T upstream of box -10, and the insertion of an A between box -10 and the RBS, compared to the promoter region of the gadR2 regulator of the model strain NCDO2118 which is taken as control (in bold in Seq ID No. 1).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • PgadR2 is derived from the Lactococcus lactis EIP3I strain (CNCM I-5388).
  • the Lactococcus lactis EIP3I strain was deposited at the CNCM (National Collection of Microorganism Cultures, 25 rue du Dondel Roux, Paris) on December 13, 2018 under number I-5388.
  • polynucleotides can be readily obtained by those skilled in the art.
  • the polynucleotides according to the invention can, for example, be obtained by in vitro DNA synthesis. The polynucleotide can then be cloned into a plasmid.
  • promoter region refers to DNA, including complementary strand DNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • Polynucleotides can have any three-dimensional structure.
  • a polynucleotide can be double-stranded.
  • Polynucleotides isolated according to the invention can be purified or recombined.
  • the promoter region according to the invention may, for example, consist of a minimum of 160 nucleotides.
  • This promoter region according to the invention is an isolated sequence.
  • isolated in reference to a biological component refers to a biological component that has been substantially separated or purified from other biological components of the organism's cell, or of the organism itself, in which the component is naturally present, such as other chromosomal and extrachromosomal DNA, proteins, cells, and organelles.
  • isolated promoter regions include nucleic acid molecules purified by standard purification methods. This term also encompasses nucleic acids prepared by amplification and/or cloning, as well as chemically synthesized nucleic acids.
  • polynucleotide sequence identical to at least 80% of SEQ ID No. 1 and which allows overexpression of the gadR2 regulatory gene we mean in particular a polynucleotide sequence identical to 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 99% of SEQ ID No. 1 and which allows overexpression of the gadR2 regulatory gene.
  • a polynucleotide sequence "95% identical" means that the polynucleotide sequence is identical to the SEQ ID No.
  • sequence and allows overexpression of the gadR2 regulatory gene, except that the sequence may This includes up to five nucleotide alterations per 100 nucleotides of SEQ ID No. 1.
  • up to 5% (5 out of 100) of the nucleotides in the sequence can be inserted, deleted, or replaced by another nucleotide.
  • the sequences must be compared along their entire length (i.e., by preparing a global alignment). For example, a first polynucleotide of 100 nucleotides contained within a second polynucleotide of 200 nucleotides is 50% identical to that second polynucleotide.
  • the Needle program which uses the Needleman-Wunsch global alignment algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol. 48:443-453) to find the optimal alignment (including gaps) of two sequences, taking into account their total length, can be used, for example.
  • the percentage of identity according to the invention is calculated using the Needle program with a "Gap open" parameter of 10.0, a "Gap Extend” parameter of 0.5, and a Blosum 62 matrix.
  • the Needle program is available, for example, on the website ebi.ac.uk.
  • a “complementary sequence” as used here refers to a sequence that specifically hybridizes in solution, for example, according to Watson-Crick base-matching rules.
  • the gadR2 regulatory gene according to the invention comprises or consists of the polynucleotide sequence comprising or consisting of a sequence at least 80% identical to SEQ ID No. 2.
  • SEQ ID No. 2 corresponds to the following sequence: 5'-
  • polynucleotide sequence identical to at least 80% to SEQ ID No. 2 we mean in particular a polynucleotide sequence identical to 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% to SEQ ID No. 2.
  • a polynucleotide sequence “identical” to 95%” means that the polynucleotide sequence is identical to the SEQ ID No. 2 sequence, except that the sequence may include up to five nucleotide alterations per 100 nucleotides of SEQ ID No. 2.
  • a polynucleotide whose sequence is at least 95% identical to SEQ ID No. 2 up to 5% (5 out of 100) of the nucleotides in the sequence can be inserted, deleted, or replaced by another nucleotide.
  • the sequences must be compared along their entire length (i.e., by preparing a global alignment). For example, a first polynucleotide of 100 nucleotides contained within a second polynucleotide of 200 nucleotides is 50% identical to that second polynucleotide.
  • the Needle program which uses the Needleman-Wunsch global alignment algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol. 48:443-453) to find the optimal alignment (including gaps) of two sequences, taking into account their total length, can be used, for example.
  • the percentage of identity according to the invention is calculated using the Needle program with a "Gap open" parameter of 10.0, a "Gap Extend” parameter of 0.5, and a Blosum 62 matrix.
  • the Needle program is available, for example, on the website ebi.ac.uk.
  • the present invention also relates to a gadR2 regulatory cassette comprising a gadR2 regulatory gene according to the invention and its PgadR2 promoter region according to the invention.
  • a regulatory cassette according to the invention is a natural DNA fragment or a recombinant construct comprising an artificial combination of nucleic acid fragments, including, but not limited to, regulatory and coding sequences not found together in nature.
  • a recombinant DNA construct may include regulatory and coding sequences from different sources, or regulatory and coding sequences from the same source arranged in a manner different from that found in nature.
  • the expression cassette may comprise 5' and 3' regulatory sequences operationally linked to the PgadR2 promoter and/or the gadR2 regulatory gene according to the invention. "Operationally linked" means a functional link between two or more elements.
  • Regulatory sequences are nucleotides located upstream (5' non-coding sequences), within, or downstream (3' non-coding sequences) of a coding sequence and that can influence the transcription, RNA processing, stability, or translation of the associated coding sequence. Regulatory sequences may include, but are not limited to, translation head sequences and polyadenylation recognition sequences.
  • the present invention also relates to the use of a regulatory cassette according to the invention, to induce positive regulation of the gadCB promoter.
  • It also relates to a method for inducing positive regulation of the gadCB promoter, said method comprising a step implementing a gadR2 regulatory cassette comprising a gadR2 regulatory gene and its PgadR2 promoter region according to the invention.
  • the gadCB operon includes the gadC gene which codes for the glutamate and GABA transporter and gadB which codes for glutamate decarboxylase, these two genes depending on the same gadCB promoter (PgadCB).
  • positive regulation we mean that the regulatory cassette according to the invention will induce an activation of PgadCB, in particular an overactivation of PgadCB.
  • PgadCB overactivation we mean, in particular, a greater activation of PgadCB compared to that obtained with a control promoter region, for example, the promoter region of the gadCB operon of the NCDO2118 model strain. More specifically, the promoter region according to the invention enables the basal level of the PgadCB promoter responsible for the expression of the gadC and gadB genes to be activated by a factor of 268 compared to the basal level, and to increase by a factor of 3 compared to the expression obtained with a control promoter region and its regulator gadR2 of the NCDO2118 model strain (values obtained by fusion of the promoter to a reporter gene).
  • Basal level has the same definition as that given in the paragraph relating to the PgadR2 promoter region. Plasmid
  • the present invention also relates to a plasmid comprising a gadR2 regulatory cassette according to the invention.
  • "Plasmid” herein means a circular, double-stranded DNA molecule.
  • the plasmid may include a marker gene for selecting cells containing said plasmid, an origin of replication to enable the cell to replicate the plasmid, and/or a multiple cloning site for inserting a DNA fragment, in particular the cassette according to the invention.
  • said plasmid is selected from those described in Table 1.
  • the present invention also relates to the use of a plasmid according to the invention to induce an overproduction of GABA. It also relates to a method for inducing an overproduction of gamma-aminobutyric acid (GABA), said method comprising a step implementing a plasmid according to the invention.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • the use of the plasmid according to the invention will make it possible in particular to transform a lactic acid bacterium in order to obtain a strain that overproduces GABA.
  • the present invention therefore also relates to a transformed lactic acid bacterium comprising the plasmid according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of a lactic acid bacterium transformed according to the invention, to induce an overproduction of GABA.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • Lactic acid bacteria are well known to those skilled in the art, who can carry out the transformation based on their general knowledge.
  • Lactic acid bacteria according to the invention will in particular be selected from Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, as described in Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11:260-263, and Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, as described in Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118, a GABA-Producing Strain.
  • the overproduction of GABA is as defined above and will result from the presence of the plasmid according to the invention, itself comprising a regulatory cassette according to the invention, said cassette comprising the promoter region according to the invention capable of in the end inducing the overproduction of GABA.
  • the present invention also relates to a method for producing GABA comprising the culture of a lactic acid bacterium transformed according to the invention.
  • lactic acid bacteria are well known to those skilled in the art, who can carry out the transformation based on their general knowledge.
  • the preparation of culture media and the definition of culture conditions enabling the growth and production of GABA in the lactic acid bacteria strains of this type are also required.
  • inventions are well known to those skilled in the art; these culture media can be adapted to each specific strain of Lactococcus lactis.
  • the culture of transformed lactic acid bacteria can be carried out between 25 and 42°C.
  • the culture of transformed lactic acid bacteria can be performed under aerobic or anaerobic conditions. Temperature conditions can be regulated using a thermostatic bath, a heating jacket, a jacket, etc.
  • the term "anaerobic conditions" used here refers to an environment with low oxygen levels or no oxygen in which lactic acid bacteria can proliferate.
  • anaerobic conditions can be achieved by using an anaerobic chamber, an anaerobic box, an airtight container or bag containing a deoxidizer, or simply by sealing a culture container airtight.
  • Culture formats can include static culture, stirred culture, and tank culture. Furthermore, the culture duration can range from 3 to 96 hours.
  • the pH of the medium can be maintained between 4.5 and 7.0 at the beginning of the culture.
  • the culture medium and culture conditions used in a bioreactor may be as follows: 5 g/L of glutamic acid, 50 g/L of glucose and 5 pg/mL of erythromycin in a base medium with yeast extract at 10 g/L, pH regulation at 6.6 for 7 h then a decrease in pH to 4.6.
  • Such lactic acid bacteria will be specifically chosen from Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, as described in Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11:260-263., and Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, as described in Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118, a GABA-Producing Strain.
  • the overproduction of GABA is as defined previously and will result from the presence of the plasmid according to the invention, itself comprising a regulatory cassette according to the invention, said cassette comprising the promoter region according to the invention capable of ultimately inducing the overproduction of GABA.
  • the culture obtained from transformed lactic acid bacteria producing GABA can be used directly.
  • the culture of transformed lactic acid bacteria may undergo further processing, including sterilization, crude purification by centrifugation, and/or solid-liquid separation by filtration, depending on the needs.
  • the lactic acid bacteria transformed according to the invention may be in the form of viable bacterial cells and/or in the form of moist bacterial cells or dried bacterial cells.
  • the lactic acid bacteria transformed according to the invention may also be dead bacteria, said bacteria having retained their intact cell morphology as well as GAD activity. In one embodiment, these dead bacteria have been inactivated with ethanol.
  • a sterilized product can be prepared by a sterilization process using transformed lactic acid bacteria.
  • Sterilization processes may include filtration sterilization, radiation disinfection, overheating disinfection, and pressure disinfection.
  • a heated product can be prepared by heat treatment of transformed lactic acid bacteria.
  • the heat treatment may include high-temperature treatment (e.g., 80°C to 150°C) of the transformed lactic acid bacteria for a certain time (e.g., from 10 minutes to 1 hour, or from 10 to 20 minutes).
  • a destructured product or cell-free extract can be prepared by destructuring, fracturing, reducing in size, crushing, pulverizing, disintegrating, or grinding the transformed lactic acid bacteria.
  • physical destructuring e.g., agitation or filtration
  • enzymatic lysis treatment e.g., chemical treatment, and/or autolysis induction treatment
  • chemical treatment e.g., chemical treatment, and/or autolysis induction treatment
  • an extract can be obtained by extraction of the transformed lactic acid bacteria using a suitable aqueous or organic solvent.
  • a suitable aqueous or organic solvent e.g., water, methanol, or ethanol
  • the transformed lactic acid bacteria can be immersed in an aqueous or organic solvent (e.g., water, methanol, or ethanol), or can be agitated or refluxed in the solvent.
  • the transformed lactic acid bacteria can be converted into a powder or granular product by drying. Drying methods include spray drying, drum drying, vacuum drying, and freeze-drying, which can be used alone or in combination.
  • GABA can be purified from transformed lactic acid bacteria by a known separation/purification method.
  • separation/purification methods include: a method involving the precipitation of salts or organic solvents based on degrees of solubility; a method involving dialysis, ultrafiltration, or gel filtration based on molecular weight differences; and a method involving exchange chromatography. of ions as a function of charge differences; a method involving affinity chromatography as a function of specific binding degrees; and a method involving hydrophobic chromatography or reversed-phase chromatography as a function of hydrophobicity degrees, or a combination of these methods.
  • the present invention also relates to a method for producing a genetically modified GABA-producing lactic acid bacterium comprising the introduction into said lactic acid bacterium of a plasmid according to the invention.
  • lactic acid bacteria are well known to those skilled in the art who can genetically modify the lactic acid bacteria based on their general knowledge.
  • Such lactic acid bacteria will be specifically chosen from Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, as described in Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11:260-263, and Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, as described in Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO2118, a GABA-Producing Strain.
  • Genetically modified lactic acid bacteria as described here, can be propagated under conditions and in media known to those skilled in the art.
  • genetically modified lactic acid bacteria can be prepared by culture under suitable conditions using a medium conventionally used for culturing lactic acid bacteria.
  • a natural or synthetic medium can be used as the culture medium provided it contains a carbon source, a nitrogen source, a mineral salt, a genetic construct selection agent (e.g., erythromycin), and other components, and that it allows the efficient culture of genetically modified lactic acid bacteria.
  • the medium must contain free glutamate, as this is the precursor to GABA.
  • a person skilled in the art can adequately select a known medium suitable for a particular bacterial strain. Examples of carbon sources that can be used include lactose, glucose, sucrose, fructose, galactose, and blackstrap molasses.
  • nitrogen sources examples include examples of media used include nitrogen-containing organic substances such as casein hydrolysate, whey protein hydrolysate, and soy protein hydrolysate.
  • Mineral salts that can be used include phosphate, sodium, potassium, and magnesium.
  • Suitable media for culturing lactic acid bacteria include MRS liquid medium, GAM medium, BL medium, Briggs liver broth, animal milk, skimmed milk, and whey derived from milk.
  • Tomato juice, carrot juice, other vegetable juices, apple juice, pineapple juice, and grape juice are examples of natural media that can be used.
  • the genetically modified lactic acid bacteria obtained by the process according to the invention can be used and processed according to the methods described in the paragraph relating to the GABA production process.
  • GABA can be used to address intestinal pain, mood disorders, stress management, and more broadly, human and animal health and nutrition. It is also used as a bitterness blocker and/or food flavoring agent.
  • the lactic acid bacteria according to the invention can be used in human and animal health and/or nutrition.
  • the sequences of the promoter regions (PgadCB and PgadR2) and the gadR2 genes of the EIP3I and NCDO2118 strains were aligned using the CLUSTALW algorithm (default parameters used) available in the MEGA11 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) software.
  • the BENCHLING software was used for the in silico construction of plasmids as well as for the design of oligonucleotides.
  • Figure 1 illustrates the strategies used to construct the different plasmids.
  • Table 1 describes the cloning method used for each plasmid (GIBSON cloning or blunt-end ligation cloning).
  • Table 2 describes the sequence of oligonucleotides (or primers) used to perform the different cloning methods.
  • Oligonucleotides used (Floating tail in bold) The oligonucleotides were synthesized by EUROFINS GENOMICS. All cloning was carried out in the E. coli DH5a strain.
  • the pTRKH3-Perm-eGFP plasmid (Ref Plasmid #27169) was purchased from Addgene (Addgene Europe, Teddington, UK).
  • This plasmid contains two origins of replication (or/p15A allowing its replication in E. coli, and o pAMpi allowing its replication in L. lactis), an erythromycin resistance gene allowing selection in E. coli (ery 150 pg/mL) or L. lactis (ery 5 pg/mL), as well as eGFP under the control of the promoter of the erythromycin resistance gene (Perm).
  • the pTRKH3-eGFP (T-) plasmid was obtained by deletion of the Perm promoter after PCR amplification of 10 pg of pTRKH3-Perm-eGFP template DNA with oligonucleotides A1 and A2 (0.5 pM final volume for each). Amplification was performed using the CloneAmp HiFi PCR Premix (cat. No. 639298) from TaKaRa (TaKaRa Bio Europe SAS) in a final volume of 25 pL, according to the manufacturer's recommendations. The PCR conditions were as follows:
  • the hybridization temperature was determined using the Tm calculator software (https://tmcalculator.neb.eom/#l/main), the elongation time is 5 sec / kb).
  • the purified DNA (100 ng) is then phosphorylated with T4 polynucleotide kinase (Ref M0201S from New England Biolabs) and ligated using T4 DNA ligase (M0202S from New England Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • T4 polynucleotide kinase Ref M0201S from New England Biolabs
  • M0202S T4 DNA ligase
  • ⁇ A5- A colony is then cultured, and plasmid DNA is extracted using the Monarch Plasmid Miniprep kit (Ref T1010L from New England Biolabs) according to the supplier's recommendations. The DNA sequence is verified by Sanger sequencing (EUROFINS).
  • or pCB 2118 insert DNAs were amplified by PCR using genomic DNA (1 ng) from the EIP3I and NCDO2118 strains, respectively, as templates. Amplification was performed with the Q5-HF DNA polymerase (M0491 from New England Biolabs) in a final volume of 50 pL with primers A4 and A5, according to the manufacturer's recommendations.
  • the PCR conditions were as follows:
  • the hybridization temperature was determined using the Tm calculator software (https://tmcalculator.neb.eom/#l/main), the elongation time is 20 sec / kb).
  • the DNA is passed on gel and purified on a QIAGEN column as previously described in A2.
  • B3 - Primers A4 and A5 have floating tails (nucleotides in bold) that allow hybridization to the pTRKH3-Perm-eGFP vector DNA, which has been previously amplified with A1 and A2. This enables Gibson-type assembly. Therefore, 50 ng of pTRKH3-Perm-eGFP vector DNA amplified with A1 and A2 will be mixed with EIP3I or NCDO2118 insert DNA amplified with A4 and A5 in molar ratios of 1 mole of vector to 3 moles of insert. Gibson cloning will be performed using the NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix kit (E2621 from New England Biolabs).
  • ⁇ B4- 4 pL of the GIBSON product are then used to transform chemocompetent E. coli NEB 5a cells (C2987H from New England Biolabs). Selection is performed on LB + ery (150 pg/mL).
  • ⁇ B5- A colony is then cultured, and plasmid DNA is extracted using the Monarch Plasmid Miniprep kit (Ref T1010L from New England Biolabs) according to the supplier's recommendations. The DNA sequence is verified by Sanger sequencing (EUROFINS).
  • the pTRKH3-pCB E iR3i-eGFP and pTRKH3-pCB2 n8 -eGFP vectors were amplified by PCR with primers A1 and A6 and the R2 E IP3I and R2 2118 inserts were amplified from genomic DNA with primers A7 and A8 and a GIBSON cloning was performed as described previously in part B.
  • the plasmids pTRKH3-pR2 E iP3i-eGFP and pTRKH3-pR2 2118 -eGFP were obtained by deleting the fragments [gadR2 H p 3r pCB E
  • the pTRKH3-R2 E iP3i plasmid was obtained by deleting the [pCB E
  • the preparation of electrocompetent cells was carried out following the protocol of Le Bourgeois P et al., 2000 (Electrotransformation of bacteria, Chapter 6, Springer Lab Manual, N. Eynard, J. Tessié (eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2000) with the following adjustments: the cells were pre-adapted to glycine during a first preculture of 5 mL in M17 + 5 g/L glucose + 0.5 M sucrose + 1% glycine for 24 h at 30°C without shaking. Then a second preculture was carried out by inoculating 50 pL of the first preculture into the same culture medium except for the addition of 2% glycine.
  • the rendered competent cells are aliquoted at a rate of 75 pL into microtubes, then immediately frozen for 1 min in liquid nitrogen and stored at -80°C. For transformation, one aliquot is thawed on ice. 15 ng of plasmid are added directly to the cells and incubated for 4 min on ice, then transferred to a pre-chilled electroporation chamber. The electroporation conditions are: 2.40 kV, 400 ohms, 25 pF. Then, 900 pL of M17 + 5 g/L glucose + 0.5 M sucrose are immediately added, and the cells are transferred to a microtube for phenotypic expression for 3 h at 30°C without agitation. 100 pL of direct or 10 ' dilution are spread on GM 17 plate + Agar + 5 pg/mL erythromycin and incubated for 48 h at 30°C. Fluorescence level measurement
  • Yeast Extract 1 mL of Yeast Extract (YE) at 10 g/L + Erythromycin (ery) at 5 pg/mL is inoculated with the different IL1403 strains transformed with the plasmids described above from cryotubes. Growth is carried out overnight at 30°C without shaking. Then, 10 pL of this preculture is inoculated into 1 mL of YE + ery 5 pg/mL and cultured at 30°C without shaking. After 8 h of growth, 10 pL of this last preculture is inoculated into 1 mL of the previously described medium and cultured overnight at 30°C without shaking. Four biological replicates are prepared.
  • YE Yeast Extract
  • ery Erythromycin
  • This culture is then centrifuged at 6000 rpm for 5 min, and the bacterial pellet is resuspended in 1 mL of PBS buffer. This step is repeated.
  • This bacterial suspension is then diluted to the Hth in PBS buffer and loaded into a flat-bottom microplate (Microtest Plate 96 well, Ref 82.1581001 from Starsted). Eight technical replicates are performed.
  • the emitted fluorescence is read using a fluorometer (BIOTEK, Synergy H1, Microplate Reader) with the following wavelengths: 485 nm (excitation) and 514 nm (emission).
  • the activity level of the different PgadCB promoters was studied by fusion with the fluorescent marker eGFP.
  • the different constructs carried by replicative plasmids in Lactococcus lactis were introduced by transformation into the strain IL1403, a low-GABA-producing strain, serves as the reference. The results are shown in [Figure 4].
  • the gadR2 regulatory gene is necessary for the activation of the PgadCB promoter (activation of a factor 268 for PgadCB HP3/ and of a factor 70 for PgadCB 2118 )
  • the activity level of the different PgadR2 promoters was studied through fusion with the fluorescent marker eGFP.
  • the PgadR2 promoter of the EIP3I strain is 14 times stronger than the PgadR2 promoter of the NCDO2118 strain. It therefore seems that the sequence differences between these 2 promoters (inversion of an A to a T upstream of box -10 and/or insertion of an A for the EIP3I strain) allow it to express the regulator more strongly.
  • Incubation was carried out at 30°C with stirring (250 rpm) under microaerobic conditions (initial aeration of the medium followed by cessation of gas exchange with the medium).
  • the pH was maintained at 6.6 with 10 N KOH for 7 h, then adjusted to 4.6 by the addition of orthophosphoric acid.
  • the cultures were inoculated with cells from precultures in Erlenmeyer flasks in a similar medium but without glutamic acid. They were harvested during the exponential phase and concentrated to obtain an initial optical density (OD) at 580 nm of 0.25 in the fermenter.
  • OD optical density
  • GABA represents the concentration of GABA (mM) measured at 12 hours of culture.
  • PgadR2 of the EIP3I strain allows overexpression of the EIP3I gadR2 regulatory gene, which increases the production of GABA in this hyper-producing strain under fermentation conditions.

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Abstract

La présente invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d'induire la surexpression de gadR2, une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice, ainsi que l'utilisation de ladite cassette pour induire une régulation positive du promoteur gadCB. L'invention concerne également un plasmide comprenant la cassette régulatrice gadR2 ainsi qu'une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide, le plasmide et la bactérie pouvant être utilisés pour induire une surproduction d'acide gamma-aminobutyrique (GABA). L'invention concerne également un procédé de production de GABA comprenant la culture d'une bactérie lactique transformée selon l'invention et un procédé de production d'une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l'introduction dans ladite bactérie lactique d'un plasmide selon l'invention.

Description

Titre : Région promotrice du gène régulateur gadR2 et son utilisation pour la surproduction d’acide gamma-aminobutyrique
La présente invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2, une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice, ainsi que l’utilisation de ladite cassette pour induire une régulation positive du promoteur gadCB. L’invention concerne également un plasmide comprenant la cassette régulatrice gadR2 ainsi qu’une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide, le plasmide et la bactérie pouvant être utilisés pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). L’invention concerne également un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention et un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention.
Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans l'industrie alimentaire (fromage, babeurre, crème fraîche, yaourt) pour leurs propriétés acidifiantes (conversion des sucres en acide lactique), texturantes (production d’exopolysaccharides) et préservatrices contre des bactéries pathogènes (production de bactériocines). Elles contribuent également à la saveur des produits laitiers et l'intérêt pour leur utilisation potentielle en tant qu'usines cellulaires pour l'industrie chimique (biocarburants, solvants, plastiques d'origine biologique) s'est accru ces dernières années. Une autre caractéristique attrayante des bactéries lactiques est leur capacité à produire une gamme de molécules ayant des applications dans le domaine de la santé, telles que des peptides bioactifs, des vitamines, de l'acide hyaluronique et du GABA.
Le GABA, neurotransmetteur très répandu dans le système nerveux sympathique, fait l'objet d'une recherche particulière depuis plusieurs années en raison de ses nombreux avantages pour la santé. Le GABA joue un rôle crucial dans l'abaissement de la tension artérielle, réduit le risque d'adénocarcinome pulmonaire et possède des propriétés antidiabétiques, neuroprotectrices, antidépressives, anti-inflammatoires et antinociceptives viscérales.
Les bactéries lactiques sont des bactéries capables de produire de grandes quantités de GABA. Toutefois, cette production de GABA diffère grandement selon les espèces et même selon les souches à l’intérieur d’une même espèce.
L’organisation des gènes impliqués dans la production de GABA peut varier en fonction des espèces de bactéries lactiques, mais dans l’espèce Lactococcus lactis les souches ont un opéron gadCB : gadC codant le transporteur du glutamate et du GABA et gadB codant la glutamate décarboxylase. Ces deux gènes dépendent du même promoteur gadCB (PgadCB). En amont, se trouve un gène, nommé gadR2 (ou gadR), régulateur positif du promoteur gadCB (PgadCB) et qui possède son propre promoteur.
Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de façon surprenante que la région promotrice du gène gadR2 (PgadR2) peut induire une surexpression du gène régulateur gadR2 induisant une surexpression des gènes de l’opéron gadCB et la surproduction de GABA.
Résumé de l’invention
Ainsi la présente invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2, ladite région comprenant ou consistant en :
(a) La séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en la SEQ ID N°1 ;
(b) Une séquence polynucléotidique au moins 80% identique à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ; ou
(c) Une séquence complémentaire des séquences polynucléotidiques (a) ou (b), dans laquelle la séquence complémentaire et la séquence polynucléotidique ont le même nombre de nucléotides et sont 100% complémentaires.
La présente invention concerne également une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice PgadR2 selon l’invention.
La présente invention concerne aussi l’utilisation d’une cassette régulatrice selon l’invention, pour induire une régulation positive du promoteur gadCB.
La présente invention concerne aussi une méthode pour induire une régulation positive du promoteur gadCB, ladite méthode comprenant une étape mettant en œuvre une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice PgadR2 selon l’invention.
Elle concerne également un plasmide comprenant une cassette régulatrice gadR2 selon l’invention.
La présente invention concerne aussi une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide selon l’invention.
Elle concerne également l’utilisation d’un plasmide selon l’invention ou d’une bactérie lactique transformée selon l’invention, pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA). Elle concerne également une méthode pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA), ladite méthode comprenant une étape mettant en œuvre un plasmide selon l’invention ou une bactérie lactique transformée selon l’invention.
La présente invention concerne aussi un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention.
La présente invention concerne également un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention.
Description détaillée
Région promotrice du gène régulateur qadR2 (PgadR2)
L’invention concerne une région promotrice du gène régulateur gadR2 (PgadR2) capable d’induire la surexpression du gène régulateur gadR2 ladite région promotrice comprenant ou consistant en :
(a) La séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en la SEQ ID N°1 ;
(b) Une séquence polynucléotidique au moins 80% identique à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ; ou
(c) Une séquence complémentaire des séquences polynucléotidiques (a) ou (b), dans laquelle la séquence complémentaire et la séquence polynucléotidique ont le même nombre de nucléotides et sont 100% complémentaires.
L’identification de cette région promotrice spécifique permet une surexpression du gène régulateur gadR2, et de ce fait des gènes de l’opéron gadCB, ainsi qu’une surproduction de GABA.
Par « surexpression du gène régulateur gadR2 », on entend en particulier une expression supérieure à l’expression du gène régulateur gadR2 obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice du gène régulateur gadR2 de la souche modèle Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, également appelée souche NCDO2118. Plus particulièrement, la région promotrice selon l’invention permet une expression du gène régulateur gadR2 au moins 14 fois plus importante que l’expression obtenue avec une région promotrice contrôle de la souche NCDO2118.
Par « surexpression des gènes de l’opéron gadCB», on entend en particulier une expression supérieure des gènes gadC et gadB par rapport à celle obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice de l’opéron gadCB de la souche modèle NCDO2118. Plus particulièrement, la région promotrice avec le régulateur gadR2 selon l’invention permet d’activer le niveau basal du promoteur PgadCB responsable de l’expression des gènes gadC et gadB d’un facteur 268 par rapport au niveau basal, et d’augmenter d’un facteur 3 par rapport à l’expression obtenue avec une région promotrice contrôle et son régulateur gadR2 de la souche modèle NCDO2118.
Le niveau basal correspond à l’expression du promoteur gadCB sans le régulateur gadR2.
Par « surproduction de GABA », on entend une production de GABA supérieure à celle obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice avec le régulateur gadR2 de la souche contrôle NCDO2118, ou la région promotrice avec le régulateur gadR2 de la souche non productrice Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, également appelée souche IL1403. Plus particulièrement, la région promotrice selon l’invention permet d’obtenir une production de GABA 18 fois plus importante que la production obtenue avec une région promotrice contrôle de la souche NCDO2118 et 21 fois plus importante que la production obtenue avec la région promotrice de la souche peu productrice IL1403 (valeurs obtenues par culture des souches transformées par un plasmide portant ou non le promoteur et le régulateur en bioréacteur).
Le GABA, également connu sous le nom d’acide gamma-aminobutyrique, est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central (SNC) et présente la structure suivante :
[Chem 1]
Le GABA est produit par les neurones du SNC et par des bactéries lactiques présentes dans le système digestif telles que Lactococcus et Lactobacillus. On le trouve également dans de nombreux aliments fermentés, car les bactéries lactiques, telles que Lactococcus le produisent. Les bactéries produisent le GABA par l'action d'un système de décarboxylase de l'acide glutamique (GAD), qui comprend une enzyme GAD codée par les gènes gadA ou gadB et un antiporteur glutamate/GABA codé par le gène gadC.
La SEQ ID N°1 répond à la séquence suivante : 5’-
CTAATAGAGCAGATGATGAGCCCAGTATAAGCTTTCACACTGTTTTTATTAATAGCCT AAGAGAAATATAAAGTAATATAAATGTTTTTTATTATAAATTATGTAAGATATACTTTTT GTATGAACTGGTATAAATTTGACGATTAAGTCCTAAATATGTTATAATCTCAATTGCGT AATTTCTTAAATCCAGAAATAACAGCTACATTGACATACTGATTAAAGAGTATAGCCAA TGAACTGTTATAAATCTTGAAAAAACAATAAAAATAATAGTTTGGGGGATGTTGAGA-3’ Cette séquence comprend tous les nucléotides en amont de la séquence codante du gène gadR2 dont les boîtes -10, -35 et la région 5’UTR avec le RBS (Ribosome Binding Site).
Ladite région promotrice comprend un SNP (single nucleotide polymorphism) consistant à l’inversion d’un A en T en amont de la boite -10, et l’insertion d’un A entre la boîte -10 et le RBS, par rapport à la région promotrice du régulateur gadR2 de la souche modèle NCDO2118 qui est prise comme contrôle (en gras dans Seq ID N°1).
En particulier, le PgadR2 est issu de la souche Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I- 5388). La souche Lactococcus lactis EIP3I a été déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris) le 13 décembre 2018 sous le numéro I-5388.
De tels polynucléotides peuvent être facilement obtenus par l'Homme du métier. Les polynucléotides selon l'invention peuvent par exemple être obtenus par synthèse d’ADN in vitro. Le polynucléotide peut ensuite être cloné dans un plasmide.
Le terme "région promotrice" désigne ici à la fois l'ADN, y compris l'ADN du brin complémentaire, l'ADN génomique et l'ADN synthétique. Les polynucléotides peuvent avoir n'importe quelle structure tridimensionnelle. Un polynucléotide peut être double brin. Les polynucléotides isolés selon l'invention peuvent être purifiés ou recombinés.
La région promotrice selon l'invention peut par exemple consister en un minimum de 160 nucléotides.
Cette région promotrice selon l’invention est une séquence isolée.
Le terme "isolée" en référence à un composant biologique désigne un composant biologique qui a été substantiellement séparé ou purifié des autres composants biologiques de la cellule de l'organisme, ou de l'organisme lui-même, dans lesquels le composant est naturellement présent, tels que d'autres ADN chromosomiques et extra-chromosomiques, des protéines, des cellules et des organites. Les "régions promotrices isolées" comprennent les molécules d'acide nucléique purifiées par des méthodes de purification standard. Ces termes englobent également les acides nucléiques préparés par amplification et/ou clonage, ainsi que les acides nucléiques synthétisés chimiquement.
Par "séquence polynucléotidique identique à au moins 80 % à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2', on entend en particulier une séquence polynucléotidique identique à 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2. Par exemple, une séquence polynucléotidique « identique" à 95 % » signifie que la séquence du polynucléotide est identique à la séquence SEQ ID N°1 et permet la surexpression du gène régulateur gadR2, à l'exception du fait que la séquence peut comprendre jusqu'à cinq altérations nucléotidiques pour 100 nucléotides de la SEQ ID N°1. En d'autres termes, pour obtenir un polynucléotide dont la séquence est identique à au moins 95 % à la SEQ ID N°1 , jusqu'à 5 % (5 sur 100) des nucléotides de la séquence peuvent être insérés, supprimés ou remplacés par un autre nucléotide. En d'autres termes, les séquences doivent être comparées sur toute leur longueur (c'est-à-dire en préparant un alignement global). Par exemple, un premier polynucléotide de 100 nt (nucléotides) compris dans un second polynucléotide de 200 nt est identique à 50 % à ce second polynucléotide.
Le programme needle, qui utilise l'algorithme d'alignement global de Needleman- Wunsch (Needleman et Wunsch, 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol. 48:443-453) pour trouver l'alignement optimal (y compris les lacunes) de deux séquences en tenant compte de leur longueur totale, peut par exemple être utilisé. De préférence, le pourcentage d'identité selon l'invention est calculé à l'aide du programme needle avec un paramètre "Gap open" égal à 10,0, un paramètre "Gap Extend" égal à 0,5, et une matrice de Blosum 62. Le programme needle est par exemple disponible sur le site Web ebi.ac.uk.
Une "séquence complémentaire" telle qu'elle est utilisée ici se réfère à une séquence qui s'hybride spécifiquement en solution, par exemple, selon les règles d'appariement des bases de Watson-Crick.
En particulier, le gène régulateur gadR2 selon l’invention comprend ou consiste en la séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en une séquence au moins 80% identique à la SEQ ID N°2.
La SEQ ID N°2 répond à la séquence suivante : 5‘-
ATGTATAAAAAATATGGAGATTGTTTTAAAAAGTTACGAAACCAAAAGAATTTAGGATT ATCATACTTTAGTAAATTAGGAATAGACCGTTCAAATATATCTAGATTTGAACATGGAA AGTGTATGATGAGTTTTGAGCGCATAGATTTGATGTTAGAAGAAATGCAAGTGCCATT AGCTGAGTACGAATTGATAGTAAATAATTATATGCCGAATTTCCAAGAATTTTTTATAT TAGAATTGGAAAAAGCTGAATTTAGTCAAAATCGAGATAAAATAAAAGAGTTATATTCT GAGGTTAAAGAAACAGGGAATCATTTACTGACGATTACCGTTAAAACGAAGCTTGGG ACTATTAGTCAGACAGAAGTTAAGGAAATTGAAACTTATCTTTGTAATATTGAAGAGTG GGGATATTTTGAACTAACTTTATTCTATTTTGTATCTGATTATCTCAATGTCAATCAATT AGAATTGCTGCTTTTTAACTTTGACAAAAGATGTGAAAATTACTGTAGAGTCTTAAAAT ATAGAAGGAGACTATTGCAAATAGCCTATAAAAGCGTTGCGATATACGCGGCTAATG GAGAAAGAACAAAAGCCGAAAATATTTTAGAAATGACTAAAAAATATCGGACTGTAGG TGTTGATTTATATTCTGAAGTATTAAGACATCTTGCCAGAGGTATCATTATTTTTAATTT TGAAAATGCAGAAGTGGGAGAAGAAAAAATAAATTATGCGCTTGAAACTTTGGAAGAA TTTGGAGGAATGAAGATAAAAGAATTCTATCAGAAAAAAATGGAAAAGTATTTGAAAA AGTCAATTTAG-3’.
Par "séquence polynucléotidique identique à au moins 80 % à la SEQ ID N°2, on entend en particulier une séquence polynucléotidique identique à 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % à la SEQ ID N°2. Par exemple, une séquence polynucléotidique « identique" à 95 % » signifie que la séquence du polynucléotide est identique à la séquence SEQ ID N°2, à l'exception du fait que la séquence peut comprendre jusqu'à cinq altérations nucléotidiques pour 100 nucléotides de la SEQ ID N°2. En d'autres termes, pour obtenir un polynucléotide dont la séquence est identique à au moins 95 % à la SEQ ID N°2, jusqu'à 5 % (5 sur 100) des nucléotides de la séquence peuvent être insérés, supprimés ou remplacés par un autre nucléotide. En d'autres termes, les séquences doivent être comparées sur toute leur longueur (c'est-à-dire en préparant un alignement global). Par exemple, un premier polynucléotide de 100 nt (nucléotides) compris dans un second polynucléotide de 200 nt est identique à 50 % à ce second polynucléotide.
Le programme needle, qui utilise l'algorithme d'alignement global de Needleman- Wunsch (Needleman et Wunsch, 1970, A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins, J. Mol. Biol. 48:443-453) pour trouver l'alignement optimal (y compris les lacunes) de deux séquences en tenant compte de leur longueur totale, peut par exemple être utilisé. De préférence, le pourcentage d'identité selon l'invention est calculé à l'aide du programme needle avec un paramètre "Gap open" égal à 10,0, un paramètre "Gap Extend" égal à 0,5, et une matrice de Blosum 62. Le programme needle est par exemple disponible sur le site Web ebi.ac.uk.
Cassette régulatrice gadR2
La présente invention concerne également une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 selon l’invention et sa région promotrice PgadR2 selon l’invention.
Une cassette régulatrice selon l’invention est un fragment d’ADN naturel ou une construction recombinante comprenant une combinaison artificielle de fragments d'acide nucléique, y compris, mais sans s'y limiter, des séquences régulatrices et codantes qui ne se trouvent pas ensemble dans la nature. Par exemple, une construction d'ADN recombinant peut comprendre des séquences régulatrices et des séquences codantes provenant de sources différentes, ou des séquences régulatrices et des séquences codantes provenant de la même source et disposées d'une manière différente de celle que l'on trouve dans la nature. La cassette d'expression pourra comprendre des séquences régulatrices 5' et 3' liées de manière opérationnelle au promoteur PgadR2 et/ou gène régulateur gadR2 selon l’invention. Par "lié de manière opérationnelle", on entend un lien fonctionnel entre deux éléments ou plus. Les "séquences régulatrices" sont des nucléotides situés en amont (séquences 5' non codantes), à l'intérieur ou en aval (séquences 3' non codantes) d'une séquence codante et qui peuvent influencer la transcription, le traitement de l'ARN, la stabilité ou la traduction de la séquence codante associée. Les séquences régulatrices peuvent inclure, sans s'y limiter, les séquences de tête de traduction, et les séquences de reconnaissance de la polyadénylation.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une cassette régulatrice selon l’invention, pour induire une régulation positive du promoteur gadCB.
Elle concerne aussi une méthode pour induire une régulation positive du promoteur gadCB, ladite méthode comprenant une étape mettant en œuvre une cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 et sa région promotrice PgadR2 selon l’invention.
L’opéron gadCB comprend le gène gadC qui code le transporteur du glutamate et du GABA et gadB qui code la glutamate décarboxylase, ces deux gènes dépendant du même promoteur gadCB (PgadCB).
Par « régulation positive », on entend que la cassette régulatrice selon l’invention va induire une activation de PgadCB, en particulier une suractivation de PgadCB.
Cette régulation positive du promoteur gadCB permet une surexpression des gènes gadC et gadB, ce qui entraîne une surproduction de GABA.
Par « surexpression des gènes gadC et gadB », et « surproduction de GABA », on entend la même définition que celle indiquée dans le paragraphe relatif à la région promotrice PgadR2.
Par « suractivation de PgadCB », on entend en particulier une activation supérieure de PgadCB par rapport à celle obtenue avec une région promotrice contrôle, par exemple la région promotrice de l’opéron gadCB de la souche modèle NCDO2118. Plus particulièrement, la région promotrice selon l’invention permet d’activer le niveau basal du promoteur PgadCB responsable de l’expression des gènes gadC et gadB d’un facteur 268 par rapport au niveau basal, et d’augmenter d’un facteur 3 par rapport à l’expression obtenue avec une région promotrice contrôle et son régulateur gadR2 de la souche modèle NCDO2118 (valeurs obtenues par fusion du promoteur à un gène rapporteur). Par « niveau basal » on entend la même définition que celle indiquée dans le paragraphe relatif à la région promotrice PgadR2. Plasmide
La présente invention concerne également un plasmide comprenant une cassette régulatrice gadR2 selon l’invention. Par "plasmide", on entend ici un ADN circulaire à double brin. Le plasmide peut comprendre un gène marqueur permettant de sélectionner les cellules comprenant ledit plasmide, une origine de réplication pour permettre à la cellule de répliquer le plasmide et/ou un site de clonage multiple permettant l'insertion d'un fragment d'ADN, en particulier la cassette selon l'invention. En particulier, ledit plasmide est choisi parmi ceux décrits dans le tableau 1.
[Tableau 1]
La présente invention concerne également l’utilisation d’un plasmide selon l’invention, pour induire une surproduction de GABA. Elle concerne également une méthode pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA), ladite méthode comprenant une étape mettant en œuvre un plasmide selon l’invention selon l’invention. Ce qu’on entend par « surproduction de GABA » a déjà été explicité dans la partie relative à la région promotrice PgadR2.
Dans le cadre de la présente invention, l’utilisation du plasmide selon l’invention va permettre notamment de transformer une bactérie lactique dans le but d’obtenir une souche surproductrice de GABA.
Bactérie lactique transformée
La présente invention concerne donc également une bactérie lactique transformée comprenant le plasmide selon l’invention.
La présente invention concerne également l’utilisation d’une bactérie lactique transformée selon l’invention, pour induire une surproduction de GABA.
Elle concerne également une méthode pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA), ladite méthode comprenant une étape mettant en œuvre une bactérie lactique transformée selon l’invention.
Les bactéries lactiques sont bien connues de l’homme du métier qui pourra opérer la transformation sur la base de ses connaissances générales.
Des bactéries lactiques selon l’invention seront en particulier choisies parmi Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, telle que décrite dans Chopin A, Chopin MC, Moillo- Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11 :260-263, Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, telle que décrite dans Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc. 2014;2:e00980-14., et Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R.
La surproduction de GABA est telle que définie précédemment et proviendra de la présence du plasmide selon l’invention, comprenant lui-même une cassette régulatrice selon l’invention, ladite cassette comprenant la région promotrice selon l’invention capable d’induire in fine la surproduction de GABA.
Procédé de production de GABA
La présente invention concerne également un procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon l’invention.
Tel que déjà mentionné, les bactéries lactiques sont bien connues de l’homme du métier qui pourra opérer la transformation sur la base de ses connaissances générales. La préparation des milieux de culture et la définition des conditions de culture permettant la croissance et la production de GABA dans les souches de bactéries lactiques de la présente invention sont bien connues de l'homme du métier; ces milieux de culture peuvent être adaptés à chaque souche spécifique de Lactococcus lactis.
En outre, la culture des bactéries lactiques transformées peut être effectuée entre 25 et 42°C. Dans certains cas, la culture des bactéries lactiques transformées peut se faire dans des conditions aérobies ou anaérobies. Les conditions de température peuvent être réglées à l'aide d'un bain thermostatique, d'un manteau chauffant, d'une jaquette, etc. En outre, le terme "conditions anaérobies" utilisé ici fait référence à un environnement à faible teneur en oxygène ou en absence d’oxygène dans lequel les bactéries lactiques peuvent proliférer. Par exemple, dans un tel environnement, les conditions anaérobies peuvent être assurées par l'utilisation d'une chambre anaérobie, d'une boîte anaérobie, d'un conteneur ou d'un sac hermétique contenant un désoxydant, ou autre, ou simplement en scellant un récipient de culture de manière hermétique. Le format de culture peut comprendre la culture statique, la culture par agitation et la culture en cuve. En outre, la durée de la culture peut être comprise entre 3 et 96 heures. Dans certains cas, le pH du milieu peut être maintenu entre 4,5 et 7,0 au début de la culture.
Par exemple le milieu de culture et les conditions de cultures utilisées en bioréacteur peuvent être les suivantes : 5 g/L d’acide glutamique, 50 g/L de glucose et 5 pg/mL d’érythromycine dans un milieu de base avec de l’extrait de levure à 10 g/L, une régulation du pH à 6.6 pendant 7 h puis une baisse du pH à 4.6.
De telles bactéries lactiques seront en particulier choisies parmi Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, telle que décrite dans Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11 :260-263., Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, telle que décrite dans Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc. 2014;2:e00980-14., Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R.
Là encore, la surproduction de GABA est telle que définie précédemment et proviendra de la présence du plasmide selon l’invention, comprenant lui-même une cassette régulatrice selon l’invention, ladite cassette comprenant la région promotrice selon l’invention capable d’induire in fine la surproduction de GABA.
En particulier, la culture obtenue de bactéries lactiques transformées produisant du GABA peut être directement utilisée. Dans certains cas, la culture de bactéries lactiques transformées peut être soumise à d'autres traitements, notamment la stérilisation, la purification brute par centrifugation et/ou la séparation solide-liquide par filtration, selon les besoins. En outre, les bactéries lactiques transformées selon l’invention peuvent se présenter sous la forme de cellules bactériennes viables et/ou sous la forme de cellules bactériennes humides ou de cellules bactériennes séchées. Les bactéries lactiques transformées selon l’invention peuvent également être des bactéries mortes, lesdites bactéries ayant conservé leur morphologie cellulaire intacte ainsi que l’activité GAD. Selon un mode de réalisation, ces bactéries mortes ont été inactivées avec de l’éthanol.
En particulier, un produit stérilisé peut être préparé par un traitement de stérilisation des bactéries lactiques transformées. Le traitement de stérilisation peut comprendre la stérilisation par filtration, la désinfection par rayonnement, la désinfection par surchauffe et la désinfection par pression.
Dans certains modes de réalisation, un produit chauffé peut être préparé par traitement thermique des bactéries lactiques transformées. Le traitement thermique peut comprendre un traitement à haute température (par exemple, 80°C à 150°C) de la bactérie lactique transformée pendant un certain temps (par exemple, de 10 minutes à 1 heure, ou de 10 à 20 minutes).
Dans certains modes de réalisation, un produit déstructuré ou un extrait acellulaire peut être préparé en déstructurant, en fracturant, en réduisant la taille, en écrasant, en pulvérisant, en désintégrant ou en broyant les bactéries lactiques transformées. Par exemple, il est possible de procéder à une désorganisation physique (par exemple, agitation ou filtration), à un traitement de lyse enzymatique, à un traitement chimique et/ou à un traitement d'induction de l'autolyse.
Dans certains modes de réalisation, un extrait peut être obtenu par extraction des bactéries lactiques transformées à l'aide d'un solvant aqueux ou organique adéquat. Par exemple, les bactéries lactiques transformées peuvent être immergées dans un solvant aqueux ou organique (par exemple, l'eau, le méthanol ou l'éthanol), ou peuvent être agitées ou soumises à un reflux dans le solvant.
Dans certains modes de réalisation, les bactéries lactiques transformées peuvent être transformées en un produit pulvérulent (poudre) ou granuleux par séchage. Les méthodes de séchage comprennent le séchage par pulvérisation, le séchage en tambour, le séchage sous vide et la lyophilisation, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison.
Dans certains modes de réalisation, le GABA peut être purifié à partir des bactéries lactiques transformées par une méthode de séparation/purification connue. Des exemples de telles méthodes de séparation/purification comprennent : une méthode impliquant la précipitation de sels ou de solvants organiques en fonction des degrés de solubilité ; une méthode impliquant la dialyse, l'ultrafiltration ou la filtration sur gel en fonction des différences de poids moléculaire ; une méthode impliquant la chromatographie d'échange d'ions en fonction des différences de charge ; une méthode impliquant la chromatographie d'affinité en fonction des degrés de liaison spécifique ; et une méthode impliquant la chromatographie hydrophobe ou la chromatographie en phase inverse en fonction des degrés d'hydrophobicité, ou une combinaison de ces méthodes.
Procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA
La présente invention concerne également un procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon l’invention.
Tel que déjà mentionné, les bactéries lactiques sont bien connues de l’homme du métier qui pourra modifier génétiquement la bactérie lactique sur la base de ses connaissances générales.
De telles bactéries lactiques seront en particulier choisies parmi Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403, telle que décrite dans Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P (1984) Two plasmid determined restriction and modification systems in Streptococcus lactis. Plasmid 11 :260-263, Lactococcus lactis ssp. lactis NCDO2118, telle que décrite dans Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc. 2014;2:e00980-14, Lactococcus lactis EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R.
Les bactéries lactiques génétiquement modifiées, telles que décrites ici, peuvent être propagées dans des conditions et dans des milieux connus de l'homme du métier.
Dans certains modes de réalisation, les bactéries lactiques génétiquement modifiées peuvent être préparées par culture dans des conditions adéquates à l'aide d'un milieu conventionnellement utilisé pour la culture de bactéries lactiques. Un milieu naturel ou synthétique peut être utilisé comme milieu de culture à condition qu'il contienne une source de carbone, une source d'azote, un sel minéral, un agent de sélection de la construction génétique (par exemple, l'érythromycine) et d'autres composants, et qu'il permette la culture de bactéries lactiques génétiquement modifiées avec efficacité. Pour produire du GABA, le milieu doit contenir du glutamate libre car c’est le précurseur du GABA. L’homme du métier peut sélectionner de manière adéquate un milieu connu approprié à une souche bactérienne à utiliser. Parmi les exemples de sources de carbone pouvant être utilisées, on peut citer le lactose, le glucose, le saccharose, le fructose, le galactose et la mélasse noire. Parmi les exemples de sources d'azote pouvant être utilisées, on peut citer les substances organiques contenant de l'azote telles que l'hydrolysat de caséine, l'hydrolysat de protéines de lactosérum et l'hydrolysat de protéines de soja. Parmi les sels minéraux pouvant être utilisés, on peut citer le phosphate, le sodium, le potassium et le magnésium. Parmi les exemples de milieux appropriés pour la culture de bactéries lactiques, on peut citer le milieu liquide MRS, le milieu GAM, le milieu BL, le bouillon de foie de Briggs, le lait animal, le lait écrémé et le lactosérum dérivé du lait. Le jus de tomate, le jus de carotte, d'autres jus de légumes, le jus de pomme, le jus d'ananas et le jus de raisin sont des exemples de milieux naturels qui peuvent être utilisés.
La bactérie lactique génétiquement modifiée obtenue par le procédé selon l’invention peut être utilisée et traité selon les méthodes décrites dans le paragraphe relatif au procédé de production de GABA.
Tel que susmentionné le GABA permet d’agir sur les douleurs intestinales, les troubles de l'humeur, la gestion du stress, et plus globalement sur la santé et la nutrition humaine et animale. Il est également utilisé en tant que bloqueurs d'amertume et/ou arômes alimentaires.
Ainsi, les bactéries lactiques selon l’invention pourront être utilisées dans la santé et/ou la nutrition humaine et animale.
L’invention est maintenant illustrée par les figures et exemples suivants.
Figures
[Fig 1] : Stratégie de construction des différents plasmides utilisés
[Fig 2] : Protocole de mesure de fluorescence en point final
[Fig 3] : Alignement des séquences des promoteurs PgadR2 des souches L. lactis EIP3I et NCDO2118
[Fig 4] : Mesure de l'activation des promoteurs PgadCB avec ou sans régulateur dans les souches EIP3I et NCDO2118
[Fig 5] : Mesure de l'activation du promoteur PgadR2 dans les souches L. lactis EIP3I et NCDO2118
Exemples
Etude de l’expression des gènes gad chez différentes souches de L. lactis
Les niveaux d'expression des différents gènes gad de 2 souches de L. lactis (EIP3I (CNCM I-5388) telle que décrite dans Gomes P et al., 2023, FASEB J., https://doi.org/10.1096/fj.202301588R) et NCDO2118 (Oliveira LC, Saraiva TDL, Soares SC, Ramos RTJ, Sà PHCG, Carneiro AR, et al. Genome Sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO2118, a GABA-Producing Strain. Genome Announc. 2014;2:e00980- 14) ont été mesurés en fusionnant les promoteurs gadR2, les gènes gadR2 et les promoteurs gadCB avec l'eGFP (forme améliorée de la protéine fluorescente verte GFP) dans un plasmide pTRKH3-eGFP et le plasmide a été introduit dans la souche de référence L. lactis IL1403.
Matériel et méthodes
Analyse in silico
Les séquences des régions promotrices (PgadCB et PgadR2) et des gènes gadR2 des souches EIP3I et NCDO2118 ont été alignées grâce au l’algorithme CLUSTALW (paramètres par défaut utilisés) disponible dans le logiciel MEGA11 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)
Le logiciel BENCHLING a été utilisé pour la construction des plasmides in silico ainsi que pour le design des oligonucléotides.
Construction des différents plasmides utilisés dans l’étude
La [Figure 1] illustre les stratégies utilisées pour la construction des différents plasmides. Le tableau 1 décrit le mode de clonage utilisé pour chaque plasmide (clonage GIBSON ou clonage ligation blunt-end). Le tableau 2 décrit la séquence des oligonucléotides (ou amorces) utilisés pour réaliser les différents clonages.
[Tableau 2]
Oligonucléotides utilisés (Queue flottante en gras) Les oligonucléotides ont été synthétisés par EUROFINS GENOMICS. Tous les clonages ont été réalisés dans la souche E. coli DH5a.
Plus précisément, le plasmide pTRKH3-Perm-eGFP (Ref Plasmid #27169) a été acheté chez Addgene (Addgene Europe, Teddington, UK). Ce plasmide contient 2 origines de réplication (or/ P15A permettant sa réplication chez E. coli, et o pAMpi permettant sa réplication chez L.lactis), un gène de résistance à l’érythromycine permet la sélection chez E. coli (ery 150 pg/mL) ou L. lactis (ery 5 pg/mL) ainsi que la eGFP sous le contrôle du promoteur du gène conférant la résistance à l’érythromycine (Perm)
■ A1 - Le plasmide pTRKH3-eGFP (T-) a été obtenu par délétion du promoteur Perm après amplification PCR de 10 pg d’ADN matrice du pTRKH3-Perm-eGFP avec les oligonucléotides A1 et A2 (0.5 pM final pour chacun). L’amplification a été réalisée avec la CloneAmp HiFi PCR Premix (cat. No. 639298) de chez TaKaRa (TaKaRa Bio Europe SAS) dans un volume final de 25 pL et selon les recommandations du fournisseur. Les conditions de PCR sont les suivantes :
1- Dénaturation 2 min à 98°C ;
2- Dénaturation 10 sec à 98°C ;
3- Hybridation 10 sec à 58°C ;
4- Élongation 1 min 30 à 72°C ;
5- 30 cycles PCR sont effectués (étape 2 à 4) ;
6- Élongation 2 min à 72°C.
(La température d’hybridation a été déterminée grâce au logiciel Tm calculator (https://tmcalculator.neb.eom/#l/main), le temps d’élongation est de 5 sec / kb).
■ A2- Après amplification, 5 pL du mix PCR sont passés sur gel afin de vérifier la taille du fragment amplifié (7600 pb), et les 20 pL restants sont purifiés avec le kit QIAquick PCR de chez QIAGEN (Ref 28104) selon le protocole du fabricant.
■ A3- L’ADN purifié (100 ng) est ensuite phosphorylé avec la T4 polynucleotide kinase (Ref M0201S de chez New England Biolabs) et ligaturé grâce à la T4 DNA ligase (M0202S de chez New England Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
■ A4- 5 pL d’ADN ligaturé (= clonage blunt end) sont utilisés pour transformer des cellules d’E. coli NEB 5a (dérivée de la souche E. coli DH5a) chimio-compétentes (C2987H de chez New England Biolabs). La sélection se fait sur LB + ery (150 pg/mL).
■ A5- Une colonie est ensuite mise en culture, l’ADN plasmidique est extrait grâce au kit Monarch Plasmid Miniprep (Ref T1010L de chez New England Biolabs) et selon les recommandations du fournisseur. La séquence de l’ADN est vérifiée par séquençage Sanger (EUROFINS). ■ B1- Les plasmides pTRKH3-pCBEiP3reGFP et pTRKH3-pCB2ii8-eGFP ont été construits par remplacement de Perm par pCBE|P3| ou pCB2n8 respectivement. Plus précisément, l’ADN vecteur pTRKH3-Perm-eGFP a été amplifié par PCR avec les amorces A1 et A2 comme décrit plus haut. Les ADN insert pCBE|P3| ou pCB2118 faisant 350 pb chacun ont été amplifiés par PCR avec comme matrice l’ADN génomique (1 ng) des souches EIP3I et NCDO2118 respectivement. L’amplification a été réalisée avec la DNA polymerase Q5-HF (M0491 de chez New England Biolabs) dans un volume final de 50 pL avec les amorces A4 et A5 et selon les recommandations du fournisseur. Les conditions de PCR sont les suivantes :
1- Dénaturation 2 min à 98°C ;
2- Dénaturation 10 sec à 98°C ;
3- Hybridation 30 sec à 58°C ;
4- 30 sec à 72°C ;
5- 30 cycles PCR sont effectués (étape 2 à 4) ;
6- Élongation 2 min à 72°C.
■ (La température d’hybridation a été déterminée grâce au logiciel Tm calculator (https://tmcalculator.neb.eom/#l/main), le temps d’élongation est de 20 sec / kb).
■ B2- Après amplification des fragments inserts, l’ADN est passé sur gel et purifié sur colonne QIAGEN comme décrit précédemment en A2.
■ B3- Les amorces A4 et A5 portent des queues flottantes (nucléotides en gras) permettant l’hybridation à l’ADN vecteur pTRKH3-Perm-eGFP préalablement amplifié par A1 et A2. Ceci permet de faire un assemblage de type GIBSON. Ainsi 50 ng d’ADN vecteur pTRKH3-Perm-eGFP amplifié avec A1 et A2 seront mélangés à l’ADN insert EIP3I ou NCDO2118 amplifié avec A4 et A5 dans des proportions molaires de 1 mole de vecteur pour 3 moles d’insert. Le clonage GIBSON sera réalisé grâce au kit NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621 de chez New England Biolabs).
■ B4- 4 pL du produit GIBSON sont ensuite utilisés pour transformer des cellules d’E. coli NEB 5a chimio-compétentes (C2987H de chez New England Biolabs). La sélection se fait sur LB + ery (150 pg/mL).
■ B5- Une colonie est ensuite mise en culture, l’ADN plasmidique est extrait grâce au kit Monarch Plasmid Miniprep (Ref T1010L de chez New England Biolabs) et selon les recommandations du fournisseur. La séquence de l’ADN est vérifiée par séquençage Sanger (EUROFINS).
■ C1- Les plasmides pTRKH3-R2E|P3.pCBE|P3reGFP et pTRKH3-R22118-pCB2118- eGFP ont été construits en clonant en amont des pCBE|P3| et pCB2118 des gènes régulateurs gadR2EiP3i et gadR22H8 sous le contrôle de leur propre promoteurs (R2EIP3I et R22118). Les vecteurs pTRKH3-pCBEiR3i-eGFP et pTRKH3-pCB2n8-eGFP, ont été amplifiés par PCR avec les amorces A1 et A6 et les inserts R2EIP3I et R22118 ont été amplifiés à partir des ADN génomiques avec les amorces A7 et A8 et un clonage GIBSON a été réalisé comme décrit précédemment dans la partie B.
■ D1- Les plasmides pTRKH3-pR2EiP3i-eGFP et pTRKH3-pR22118-eGFP ont été obtenus en délétant les fragments [gadR2Hp3rpCBE|P3|] et [gadR22 8-pCB2118] des plasmides pTRKH3-R2Eip3.pCBEip3|-eGFP et pTRKH3-R22118-pCB2118-eGFP respectivement. Ces derniers ont été amplifiés par PCR avec les amorces A2 et A11 et recircularisés selon le protocole décrit dans la partie A (ligation blunt end).
• E1- Le plasmide pTRKH3-R2EiP3i a été obtenu en délétant la cassette [pCBE|P3|- eGFP] du plasmide pTRKH3-R2E|P3.pCBE|P3|-eGFP. Pour cela, celui-ci a été amplifié par PCR avec les amorces A3 et A16 et recircularisé selon le protocole décrit dans la partie A (ligation blunt end).
Electro-transformation de la souche Lactococcus lactis IL1403
La préparation de cellules électro-compétentes a été réalisée en suivant le protocole de Le Bourgeois P et al., 2000 (Electrotransformation of bacteria, Chapter 6, Springer Lab Manual, N. Eynard, J. Tessié (eds) Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2000) avec les ajustements suivants : les cellules sont préadaptées à la glycine lors d’une première préculture de 5 mL en M17 + glucose à 5 g/L + saccharose à 0.5 M + 1 % de glycine pendant 24 h à 30°C sans agitation. Puis une deuxième préculture est réalisée en inoculant 50 pL de la première préculture dans le même milieu de culture excepté la glycine qui est rajoutée à 2%. Enfin la culture finale est réalisée dans le même milieu que la deuxième préculture, à 30°C sans agitation jusqu’à obtenir une DO comprise entre 0.5 et 0.8. La suite du protocole est réalisée selon Le Bourgeois P ét al., 2000, cité ci-dessus.
Les cellules rendues compétentes sont aliquotées à raison de 75 pL dans des microtubes, puis congelées immédiatement pendant 1 min dans de l’azote liquide et stockées à -80°C. Pour la transformation, un aliquot est décongelé dans la glace. 15 ng de plasmide sont ajoutés directement aux cellules et incubés 4 min dans la glace, puis transférés dans une cuve d’électroporation préalablement refroidie. Les conditions du choc électrique sont : 2.40kV, 400 ohms, 25 pF. Puis 900 pL de M17 + glucose à 5 g/L + saccharose à 0.5 M sont immédiatement ajoutés et les cellules sont transférées dans un microtube pour une expression phénotypique de 3 h à 30°C sans agitation. 100 pL de direct ou de la dilution 10’1sont étalés sur boite GM 17 + Agar + 5 pg/mL érythromycine et incubés 48 h à 30°C. Mesure du niveau de fluorescence
Le protocole est illustré par la [Figure 2],
Plus précisément, 1 mL de Yeast Extract (YE) à 10 g/L + Erythromycine (ery) à 5 pg/mL est ensemencé avec les différentes souches IL1403 transformées avec les plasmides décrits ci-dessus à partir de cryotubes de conservation. La croissance dure la nuit à 30°C sans agitation. Puis 10 pL de cette préculture sont ensemencés dans 1 mL du YE + ery 5 pg/mL et mis en culture à 30°C sans agitation. Après 8 h de croissance, 10 pL de cette dernière préculture sont ensemencés dans 1 mL du milieu précédemment décrit et mis en culture la nuit à 30°C sans agitation. 4 réplicats biologiques sont réalisés. Cette culture est ensuite centrifugée à 6000 rpm pendant 5 min et le culot bactérien est repris dans 1 mL de tampon PBS. Cette étape est réalisée une deuxième fois. Puis cette suspension bactérienne est diluée au Hième dans du tampon PBS et déposée dans une microplaque à fond plat (Microtest Plate 96 well , Ref 82.1581001 de chez Starsted). 8 réplicats techniques sont réalisés. La fluorescence émise est lue grâce à un fluorimètre (BIOTEK, Synergy H1 , Microplate Reader) en utilisant les longueurs d’onde suivantes : 485 nm (excitation) et 514 nm (émission).
Résultats
Analyse in silico des promoteurs PgadCB, PgadR2 et des gènes régulateurs gadR2 des souches EIP3I et NCDO2118
L’alignement des séquences a permis de montrer que les promoteurs PgadCB des souches EIP3I et NCDO2118 sont identiques.
Par contre, l’alignement des séquences des promoteurs PgadR2 des souches EIP3I et NCDO2118 montre 2 différences : 1 SNP (single nucleotide polymorphism) en amont de la boîte -10 (T dans la séquence EIP3I à la place de A dans la séquence NCDO2118), et l’insertion d’un A en amont du RBS pour la séquence de la souche EIP3I. Ces résultats sont illustrés dans la [Figure 3],
L’alignement des séquences des gènes gadR2 permet de montrer qu’elles sont identiques pour les souches EIP3I et NCDO2118.
Comparaison de l’activité des promoteurs PgadCB des souches L. lactis EIP3I et NCDO2118 sous le contrôle de leur régulateur gadR2 respectifs.
Le niveau d’activité des différents promoteurs PgadCB a été étudié grâce à la fusion avec le marqueur fluorescent eGFP. Les différentes constructions portées par des plasmides réplicatifs chez Lactococcus lactis ont été introduites par transformation dans la souche IL1403, souche faiblement productrice de GABA et servant de référence. Les résultats sont indiqués dans la [Figure 4]
La mesure de la fluorescence a permis de montrer que
1- Le gène régulateur gadR2 est nécessaire à l’activation du promoteur PgadCB (activation d’un facteur 268 pour PgadCBHP3/et d’un facteur 70 pour PgadCB2118)
2- L’activation du promoteur PgadCBEiP3i sous le contrôle de son régulateur gadR2EiP3i est 3 fois supérieure à l’activation du promoteur PgadCB2118 sous le contrôle de son régulateur gadR22118.
3- Comme les séquences des promoteurs PgadCBEiP3i et PgadCB2118 sont identiques ainsi que les gènes gadR2 dans ces 2 souches, les différences observées doivent provenir du niveau d’activation des promoteurs PgadR2
Comparaison de l’activité des promoteurs PgadR2 des souches EIP3I et NCDO2118
Le niveau d’activité des différents promoteurs PgadR2 a été étudié grâce à la fusion avec le marqueur fluorescent eGFP.
Les résultats sont indiqués dans la [Figure 5],
Le promoteur PgadR2 de la souche EIP3I est 14 fois plus fort que le promoteur PgadR2 de la souche NCDO2118. Il semble donc que les différences de séquence entre ces 2 promoteurs (inversion d’un A en T en amont de la boîte -10 et/ou insertion d’un A pour la souche EIP3I) lui permettent d'exprimer davantage le régulateur.
Etude de l’impact de PgadR2 de la souche L. lactis EIP3I sur la production de GABA chez différentes souches de L. lactis
L’étude a été mise en place pour illustrer la surproduction de GABA dans 2 souches différentes : la souche IL1403 qui produit très peu de GABA et la souche NCDO2118 dont l'opéron gadCB est déjà bien fonctionnel.
Matériels et méthodes
Six souches transformées ont été étudiées : 1- EIP3I portant le plasmide pTRKH3-R2E|P3|, 2- EIP3I portant le plasmide témoin pTRKH3-eGFP, 3- NCDO2118 portant le plasmide pTRKH3-R2E|P3|, 4- NCDO2118 portant le plasmide témoin pTRKH3-eGFP, 5- IL1403 portant le plasmide pTRKH3-R2E|P3| et 6- IL1403 portant le plasmide témoin pTRKH3-eGFP. Elles ont été cultivées sur le milieu M17 avec 20 g/L de glucose et 5 pg/mL d’érythromycine en mode statique, à 30°C et prélevées en phase exponentielle de croissance (densité optique à 580 nm, DO580 ~ 2), pour être aliquotées dans des cryotubes de 2 mL en présence de 20% volume/volume de glycérol et stockées à -80°C. Ces stocks ont servi à la réalisation des précultures et cultures en bioréacteur. Les cultures microbiennes ont été réalisées en duplicate dans des bioréacteurs de 2 L (BiostatB plus, Sartorius, Melsungen, Allemagne) avec du milieu M17 (Tableau 3) supplémenté avec 5 g/L d’acide glutamique, 50 g/L de glucose et 5 pg/mL d’érythromycine. L’incubation s’est effectuée à 30°C sous agitation (250 rpm) en micro-aérobiose (aération initiale du milieu puis arrêt des échanges gazeux avec le milieu). Le pH a été maintenu à 6.6 par 10 N de KOH pendant 7 h puis le pH a été ajusté à 4.6 par ajout d’acide orthophosphorique.
[Tableau 3]
Composition of medium M17
Les cultures ont été inoculées avec des cellules issues de précultures en Erlenmeyer flask dans un milieu similaire mais sans acide glutamique. Elles ont été récoltées pendant la phase exponentielle et concentrées afin d'obtenir une densité optique (DO) initiale à 580 nm de 0.25 dans le fermenteur.
La croissance a été suivie par mesure de l’absorbance à 580 nm (Libra S11 , Biochom, une unité d’absorbance est équivalente à 0.3 g/L).
Les échantillons ont été collectés toutes les 30 min pendant 15 h puis au point 24 h, conservés à -20°C après élimination de la biomasse par centrifugation (4 min à 13 000 rpm à 4°C) pour ultérieurement quantifier les concentrations en GABA par HPLC selon la méthode décrite par Laroute V, Yasaro C, Narin W, Mazzoli R, Pessione E, Cocaign- Bousquet M, et al. GABA Production in Lactococcus lactis Is Enhanced by Arginine and Coaddition of Malate. Front Microbiol. 2016;7 doi: 10.3389/fmicb.2016.01050. Préparation du plasmide pT R KH 3- R2FIPSI et plasmide témoin (pT RKH3-eGFP) cf § Construction des différents plasmides utilisés dans l’étude, partie A1 et E1 Résultats
Les résultats sont indiqués dans le [Tableau 4] ci-dessous.
GABA représente la concentration de GABA (mM) mesurée à 12 heure de culture.
[Tableau 4]
PgadR2 de la souche EIP3I permet une surexpression du gène régulateur gadR2 de EIP3I ce qui permet d’augmenter la production de GABA de cette souche hyper productrice dans les conditions de fermentation.
La surexpression du gène régulateur gadR2 de EIP3I dans la souche NCDO2118 lui confère la capacité de produire de plus grandes quantités de GABA.
La surexpression du gène régulateur gadR2 de EIP3I dans la souche IL1403 lui confère la capacité de produire de plus grandes quantités de GABA.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Région promotrice du gène régulateur gadR2 capable d’induire la surexpression de gadR2 ladite région promotrice comprenant ou consistant en :
(a) La séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en la SEQ ID N°1 ;
(b) Une séquence polynucléotidique au moins 80% identique à la SEQ ID N°1 et qui permet la surexpression du gène régulateur gadR2 ; ou
(c) Une séquence complémentaire des séquences polynucléotidiques (a) ou (b), dans laquelle la séquence complémentaire et la séquence polynucléotidique ont le même nombre de nucléotides et sont 100% complémentaires.
2. Région promotrice selon la revendication 1 , dans laquelle le gène régulateur gadR2 comprend ou consiste en la séquence polynucléotidique comprenant ou consistant en une séquence au moins 80% identique à la SEQ ID N°2.
3. Cassette régulatrice gadR2 comprenant un gène régulateur gadR2 tel que défini dans la revendication 2 et sa région promotrice telle que définie dans la revendication 1 .
4. Utilisation d’une cassette régulatrice selon la revendication 3, pour induire une régulation positive du promoteur gadCB.
5. Plasmide comprenant une cassette régulatrice gadR2 selon la revendication 3.
6. Bactérie lactique transformée comprenant le plasmide tel que défini dans la revendication 5.
7. Utilisation d’un plasmide selon la revendication 5 ou d’une bactérie lactique transformée selon la revendication 6, pour induire une surproduction d’acide gamma-aminobutyrique (GABA).
8. Procédé de production de GABA comprenant la culture d’une bactérie lactique transformée selon la revendication 6.
9. Procédé de production d’une bactérie lactique génétiquement modifiée productrice de GABA comprenant l’introduction dans ladite bactérie lactique d’un plasmide selon la revendication 5.
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