WO2026009883A1 - 心筋ダイレクトリプログラミングのための組換えアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

心筋ダイレクトリプログラミングのための組換えアデノ随伴ウイルスベクター

Info

Publication number
WO2026009883A1
WO2026009883A1 PCT/JP2025/023598 JP2025023598W WO2026009883A1 WO 2026009883 A1 WO2026009883 A1 WO 2026009883A1 JP 2025023598 W JP2025023598 W JP 2025023598W WO 2026009883 A1 WO2026009883 A1 WO 2026009883A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aav
seq
base sequence
postn
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/023598
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真樹 家田
威太郎 貞廣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Publication of WO2026009883A1 publication Critical patent/WO2026009883A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus vector for direct myocardial reprogramming.
  • Cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide.
  • myocardial infarction a type of cardiovascular disease, cardiac fibroblasts are activated and proliferate after the onset, causing myocardial fibrosis and cardiac dysfunction.
  • adult cardiomyocytes are terminally differentiated cells with little regenerative capacity, so treatment methods for heart disease are limited.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Documents 1-3. It has been disclosed that in vivo cardiac reprogramming using retroviral vectors, Sendai virus vectors, etc., can reprogram cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes and repair the hearts of infarcted mice (Non-Patent Document 2). It has also been disclosed that cardiac reprogramming improves myocardial contractility and suppresses fibrosis through regenerative and anti-fibrotic effects in a mouse model of chronic myocardial infarction (Non-Patent Document 3).
  • myocardial reprogramming factors such as GATA4, MEF2C, and TBX5
  • An objective of the present invention is to provide a novel vector capable of direct myocardial reprogramming in vivo.
  • cardiac fibroblasts can be induced to become cardiomyocytes in vivo by using a recombinant adeno-associated virus vector containing a nucleic acid molecule containing a specific promoter sequence and an adeno-associated virus DJ capsid protein.
  • the present invention has been completed based on these findings and includes the following broad aspects.
  • a recombinant adeno-associated virus vector comprising a polynucleotide including at least one promoter sequence selected from the group consisting of a periostin promoter sequence, a collagen 1a2 promoter sequence, and a cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence, and an AAV-DJ capsid protein, a recombinant adeno-associated virus vector, wherein the collagen 1a2 promoter sequence is any one of the following (2-1) to (2-4), and the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence is any one of the following (3-1) to (3-4): (2-1) a base sequence represented by SEQ ID NO: 9; (2-2) A base sequence in which one or several bases are substituted, added, or deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9; (2-3) a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9; (2-4) a base sequence
  • a pharmaceutical composition comprising the recombinant adeno-associated virus vector of Item 1 or 2.
  • Item 3 A cardiac function improving agent comprising the recombinant adeno-associated virus vector according to Item 2.
  • a method for expressing a gene in activated cardiac fibroblasts comprising administering the recombinant adeno-associated virus vector according to Item 1 or 2.
  • Item 6 The gene expression method according to Item 5, wherein the activated cardiac fibroblasts include cardiac fibroblasts after myocardial infarction.
  • Item 3 A method for inducing cardiomyocytes from cardiac fibroblasts, comprising administering the recombinant adeno-associated virus vector according to Item 1 or 2.
  • the present invention provides a novel vector capable of direct myocardial reprogramming in vivo.
  • AAV1-10 and AAV-DJ AAV vector contained a CMV promoter-driven GFP (AAV-CMV-GFP).
  • AAV-CMV-GFP CMV promoter-driven GFP
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the analysis of R26-tomato mice into which the AAV-Postn-Cre vector was directly injected into the heart after myocardial infarction.
  • Higher magnification images (bottom) show the border area.
  • the scale bar represents 50 ⁇ m.
  • FIG. 1 shows an experimental scheme for injecting AAV-DJ-Postn-GFP into the heart of an ICR mouse after myocardial infarction.
  • Immunohistochemical staining for GFP, cTnT, and DAPI was performed in AAV-DJ-Postn-GFP injected mouse hearts 1, 2, and 4 weeks after myocardial infarction.
  • Tcf21 iCre/Tomato mice were intraperitoneally injected with tamoxifen for 5 days, and then one week later underwent myocardial infarction and AAV gene transfer. Four weeks after myocardial infarction, the hearts were removed and immunohistochemically stained. Immunohistochemical staining for Tomato, ⁇ -actinin, and DAPI was performed on cardiac sections from Tcf21 iCre/Tomato mice 4 weeks after myocardial infarction.
  • LVEF left ventricular ejection fraction
  • LVFS left ventricular fractional shortening
  • B Quantitative analysis of GFP+/cTNT+ cells in non-cardiomyocytes.
  • 1 shows an outline of the experiment in Example 9. Shown are the results of immunohistochemical staining of in vivo cardiac fibroblasts in ICR mice with myocardial infarction.
  • polynucleotide can be alternatively referred to as “nucleic acid” or “nucleic acid molecule,” and refers to a polymer of nucleotides.
  • base sequence can be alternatively referred to as “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence.”
  • the "viral genome” and “polynucleotide” of the present invention may each exist in the form of DNA (e.g., cDNA or genomic DNA), but may also be in the form of RNA (e.g., mRNA).
  • the viral genome and polynucleotide used herein may each be double-stranded or single-stranded DNA. In the case of single-stranded DNA or RNA, it may be the coding strand (also known as the sense strand) or the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • coding strand also known as the sense strand
  • the non-coding strand also known as the antisense strand
  • protein can also be referred to as “polypeptide.”
  • packaging refers to events including the preparation of a single-stranded viral genome, the assembly of a capsid, and the encapsidation of the viral genome.
  • an appropriate plasmid vector usually multiple plasmids
  • recombinant viral particles i.e., viral virions, viral vectors
  • operably linked refers to a functional linkage between nucleic acids that confers a desired function, such as transcription, translation, etc.
  • a nucleic acid expression control sequence such as a promoter or signal sequence
  • the expression control sequence affects the transcription and/or translation of the polynucleotide sequence encoding the protein of interest.
  • activated cardiac fibroblasts refers to cardiac fibroblasts that are not in a quiescent state. When cardiac fibroblasts are exposed to stress such as myocardial infarction, cardiac damage, or chronic hypertension, their migration activity increases, they begin to proliferate, and they are transformed into myofibroblasts. Myofibroblasts are characterized by enhanced motility, expression of smooth muscle actin, and increased synthesis of collagen and other ECM components. As used herein, such cardiac fibroblasts that are not in a quiescent state are collectively referred to as "activated cardiac fibroblasts.”
  • the present invention provides a recombinant adeno-associated virus vector (rAAV vector).
  • the rAAV vector of the present invention comprises a polynucleotide containing at least one promoter sequence selected from the group consisting of a periostin promoter sequence, a collagen 1a2 promoter sequence, and a cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence, and an AAV-DJ capsid protein.
  • AAVs Natural adeno-associated viruses
  • ITR inverted terminal repeat
  • the Rep proteins rep78, rep68, rep52, and rep40
  • the cap gene encodes three capsid proteins (VP1, VP2, and VP3).
  • the rAAV vectors of the present invention comprise an AAV-DJ capsid protein.
  • AAV-DJ forms hybrid capsids derived from eight different natural serotypes through DNA family shuffling (Grimm D., et al., J. Virol., 82(12), 5887-5911 (2008)).
  • the AAV-DJ capsid protein contained in the rAAV vectors of the present invention includes a protein that has an amino acid sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and is capable of forming a capsid.
  • proteins that can form capsids include those that contain an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in which, for example, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 35, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 14, 1 to 13, 1 to 12, 1 to 11, 1 to 10, 1 to 9 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 amino acid residue has been deleted, substituted, inserted, and/or added. A combination of two or more of these deletions, substitutions, insertions, and additions may also be present.
  • the capsid protein used in the present invention has the function of forming a capsid.
  • a polynucleotide containing a gene of interest e.g., a sequence encoding a reprogramming factor
  • polynucleotides encoding the AAV-DJ capsid proteins used in the present invention encode proteins functionally equivalent to the capsid proteins capable of forming the rAAV vectors of the present invention.
  • examples of such polynucleotides include the following: (i) A polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. (ii) A polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases have been substituted, added, or deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. (iii) A polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. (iv) A polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and capable of forming a capsid in the rAAV vector of the present invention is included.
  • the number of one or several bases to be substituted, deleted, added, or inserted is not particularly limited, as long as it is an integer of 1 or greater.
  • it can be from 1 to several tens of bases, preferably from 1 to 20, more preferably from 1 to 15, even more preferably from 1 to 10, and particularly preferably from 1 to 5.
  • This includes polynucleotides that contain a base sequence in which one or several bases have been substituted, added, or deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and that are capable of forming a capsid in the rAAV vector of the present invention.
  • the number of bases to be substituted, added, or deleted can be approximately 1 to 220 so that the base sequence has 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 2, preferably approximately 1 to 110 so that the identity is 95% or more, more preferably approximately 1 to 66 so that the identity is 97% or more, even more preferably approximately 1 to 44 so that the identity is 98% or more, and particularly preferably approximately 1 to 22 so that the identity is 99% or more.
  • the identity of the nucleotide sequences can be 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology or identity of the nucleotide sequences can be less than 100%.
  • the homology and identity between nucleotide sequences can be determined using known algorithms such as BLAST. Polynucleotides containing a nucleotide sequence that is 90% or more identical to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that are capable of forming a capsid in the rAAV vector of the present invention are included.
  • stringent conditions refers to conditions under which only specific hybridization occurs and nonspecific hybridization does not occur.
  • stringent conditions include, but are not limited to, hybridization at 42°C in 1xSSC (0.9M NaCl, 0.09M trisodium citrate) or 6xSSPE (3M NaCl, 0.2M NaH2PO4 , 20mM EDTA-2Na, pH 7.4), followed by washing with 0.5xSSC at 42°C.
  • 1xSSC 0.09M trisodium citrate
  • 6xSSPE 3M NaCl, 0.2M NaH2PO4 , 20mM EDTA-2Na, pH 7.4
  • Polynucleotides containing a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and that are capable of forming capsids in the rAAV vectors of the present invention are also encompassed.
  • a polynucleotide sequence encoding a protein of interest is operably combined with a promoter sequence to express the protein.
  • the promoter sequence used is at least one selected from the group consisting of the periostin promoter sequence, collagen 1a2 promoter sequence, and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence.
  • Periostin is an extracellular matrix protein expressed only in activated cardiac fibroblasts.
  • Cardiac fibroblasts are known to be activated in myocardial tissues subjected to stress such as myocardial infarction or pressure overload.
  • a protein of interest can be selectively expressed in activated cardiac fibroblasts (e.g., cardiac fibroblasts after myocardial infarction).
  • a protein of interest can be expressed in activated cardiac fibroblasts in the acute phase of myocardial infarction (within 10 days after the onset of myocardial infarction).
  • Collagen 1a2 is a protein expressed in all cardiac fibroblasts, regardless of whether myocardial infarction is present or not.
  • Cartilage oligomeric matrix protein is a protein whose expression level increases during the chronic phase of myocardial infarction (after 10 days from the onset of myocardial infarction).
  • the periostin promoter sequence of the present invention is preferably any one of the following (1-1) to (1-4): (1-1) The base sequence represented by SEQ ID NO: 3. (1-2) A base sequence in which one or several bases have been substituted, added, or deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. (1-3) A nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3. (1-4) A base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 3 is a sequence in which a mouse periostin promoter sequence is fused to a mouse periostin enhancer sequence (Table 1).
  • the number of one or several bases to be substituted, deleted, added, or inserted is not particularly limited, as long as it is an integer of 1 or more.
  • it can be about 1 to several tens of bases, preferably about 1 to 20 bases, more preferably about 1 to 15 bases, even more preferably about 1 to 10 bases, and particularly preferably about 1 to 5 bases.
  • the number of one or more bases to be substituted, added, or deleted can be approximately 1 to 140 to achieve a base sequence identity of 90% or more with the base sequence of SEQ ID NO: 3, preferably approximately 1 to 69 to achieve an identity of 95% or more, more preferably approximately 1 to 42 to achieve an identity of 97% or more, even more preferably approximately 1 to 28 to achieve an identity of 98% or more, and particularly preferably approximately 1 to 14 to achieve an identity of 99% or more.
  • the identity of the nucleotide sequences can be 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology or identity of the nucleotide sequences can be less than 100%.
  • the homology and identity between nucleotide sequences can be determined using known algorithms such as BLAST. Included are nucleotide sequences that share 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and have the function of a periostin promoter.
  • stringent conditions refer to conditions under which only specific hybridization occurs and nonspecific hybridization does not occur.
  • Examples of stringent conditions include, but are not limited to, hybridization in 1xSSC (0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate) or 6xSSPE (3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4 , 20 mM EDTA-2Na, pH 7.4) at 42°C, followed by washing with 0.5xSSC at 42°C.
  • 1xSSC 0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate
  • 6xSSPE 3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4 , 20 mM EDTA-2Na, pH 7.4
  • the collagen 1a2 promoter sequence of the present invention is any one of the following (2-1) to (2-4).
  • (2-3) A nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • SEQ ID NO: 9 is the following sequence obtained by extracting and combining sequences important for gene expression from the mouse collagen 1a2 promoter sequence.
  • the number of one or several bases to be substituted, deleted, added, or inserted is preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 15, even more preferably about 1 to 10, and particularly preferably about 1 to 5.
  • the number of bases to be substituted, added, or deleted can be approximately 1 to 195 so that the base sequence has 90% or more identity with the base sequence of SEQ ID NO: 9, preferably approximately 1 to 97 so that the identity is 95% or more, more preferably approximately 1 to 58 so that the identity is 97% or more, even more preferably approximately 1 to 39 so that the identity is 98% or more, and particularly preferably approximately 1 to 19 so that the identity is 99% or more.
  • the identity of the base sequences can be 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology or identity of the base sequences can be less than 100%.
  • the homology and identity between base sequences can be determined using known algorithms such as BLAST. Base sequences that share 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and have the function of a collagen 1a2 promoter are included.
  • stringent conditions refers to conditions under which only specific hybridization occurs and nonspecific hybridization does not occur.
  • Examples of stringent conditions include hybridization at 42°C in 1xSSC (0.9M NaCl, 0.09M trisodium citrate) or 6xSSPE (3M NaCl, 0.2M NaH2PO4 , 20mM EDTA-2Na, pH 7.4), followed by washing with 0.5xSSC at 42°C. These conditions are not limited to these. Examples of such conditions are described, for example, in M. R. Green et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012).
  • Examples of stringent conditions include a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:9 and has collagen 1a2 promoter function.
  • the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence of the present invention is any one of the following (3-1) to (3-4).
  • (3-1) A base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • (3-2) A base sequence in which one or several bases have been substituted, added, or deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • (3-3) A nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • (3-4) A base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 10 is the following sequence containing a portion of the human cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence that is known to be highly conserved between humans and mice.
  • the number of one or several bases to be substituted, deleted, added, or inserted is not particularly limited, as long as it is an integer of 1 or greater.
  • it can be from 1 to several tens of bases, preferably from 1 to 20, more preferably from 1 to 15, even more preferably from 1 to 10, and particularly preferably from 1 to 5.
  • This includes base sequences in which one or several bases have been substituted, added, or deleted from the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, and which have the function of a cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter.
  • COMP cartilage oligomeric matrix protein
  • the number of one or more bases to be substituted, added, or deleted can be approximately 1 to 170 to achieve a base sequence identity of 90% or more with the base sequence of SEQ ID NO: 10, preferably approximately 1 to 85 to achieve an identity of 95% or more, more preferably approximately 1 to 51 to achieve an identity of 97% or more, even more preferably approximately 1 to 34 to achieve an identity of 98% or more, and particularly preferably approximately 1 to 17 to achieve an identity of 99% or more.
  • the identity of the base sequences can be 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the homology or identity of the base sequences can be less than 100%.
  • the homology and identity between base sequences can be determined using known algorithms such as BLAST.
  • Base sequences that share 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and have the function of a cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter are included.
  • stringent conditions refers to conditions under which only specific hybridization occurs and nonspecific hybridization does not occur.
  • stringent conditions include, but are not limited to, hybridization in 1xSSC (0.9M NaCl, 0.09M trisodium citrate) or 6xSSPE (3M NaCl, 0.2M NaH2PO4 , 20mM EDTA-2Na, pH 7.4) at 42°C, followed by washing with 0.5xSSC at 42°C.
  • 1xSSC 0.09M trisodium citrate
  • 6xSSPE 3M NaCl, 0.2M NaH2PO4 , 20mM EDTA-2Na, pH 7.4
  • Examples of stringent conditions include a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and has the function of a cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter.
  • COMP cartilage oligomeric matrix protein
  • the polynucleotide packaged within the rAAV vector of the present invention incorporates a polynucleotide encoding a protein of interest.
  • the protein encoded may be one type or two or more types, but it is preferable that the total length of the polynucleotide packaged within the rAAV vector, including the polynucleotide encoding the protein of interest, is approximately the same as that of the wild-type genome. That is, the total length is preferably approximately the same as the wild-type total length of 5 kb, for example, approximately 2 to 6 kb, and preferably approximately 4 to 6 kb.
  • polynucleotide encoding the protein of interest is preferably approximately 0.01 to 3.7 kb in length, more preferably approximately 0.01 to 2.5 kb in length, and even more preferably approximately 0.01 to 2 kb in length, but is not limited to this.
  • the target protein is a reprogramming factor.
  • reprogramming factors include Gata4, Hand2, Tbx5, Mef2c, Mef2c-TAD, MYOCD (myocardin), ASCL1 (Achaete-scute family bHLH transcription factor 1), miR-133 (microRNA), etc. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the reprogramming factor encoded in the polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention is preferably at least one selected from the group consisting of Gata4, Hand2, Tbx5, Mef2c, Mef2c-TAD, MYOCD, ASCL1, and miR-133, more preferably two or more, even more preferably three or more, and particularly preferably four or more.
  • the polynucleotide packaged within the rAAV vector of the present invention encodes Gata4, Hand2, and Tbx5, and preferably further encodes Mef2c or Mef2c-TAD, and more preferably encodes Gata4, Hand2, Tbx5, and Mef2c-TAD.
  • Gata4 Gata4 polypeptide is a member of the GATA family of zinc finger transcription factors that recognizes and binds to the GATA motif present in the promoter regions of many genes.
  • Amino acid sequences for Gata4 polypeptides from various species and nucleotide sequences encoding Gata4 polypeptides are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences for Gata4 polypeptides include, for example, NP_002043 (Homo sapiens), NP_032118 (Mus musculus), and NP_653331 (Rattus norvegicus).
  • Accession numbers for nucleotide sequences encoding Gata4 polypeptides include, for example, NM_002052 (Homo sapiens), NM_008092 (Mus musculus), and NM_144730 (Rattus norvegicus).
  • the amino acid sequence of the Gata4 polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • the nucleotide sequence encoding the Gata4 polypeptide comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • a polypeptide functionally equivalent to a Gata4 polypeptide can be used.
  • a Gata5 polypeptide (or a nucleotide sequence encoding a Gata5 polypeptide) is used.
  • a Gata6 polypeptide (or a nucleotide sequence encoding a Gata6 polypeptide) is used.
  • the amino acid sequence of the Gata5 polypeptide and the nucleotide sequence encoding the Gata5 polypeptide are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences related to the Gata5 polypeptide include, for example, NP_536721 (Homo sapiens), NP_032119 (Mus musculus), and NP_001019487 (Rattus norvegicus). Accession numbers for nucleotide sequences encoding the Gata5 polypeptide include, for example, NM_080473 (Homo sapiens), NM_008093 (Mus musculus), and NM_001024316 (Rattus norvegicus).
  • the amino acid sequence of the Gata6 polypeptide and the nucleotide sequence encoding the Gata6 polypeptide are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences related to the Gata6 polypeptide include, for example, NP_005248 (Homo sapiens), NP_034388 (Mus musculus), and NP_062058 (Rattus norvegicus). Accession numbers for nucleotide sequences encoding the Gata6 polypeptide include, for example, NM_005257 (Homo sapiens), NM_010258 (Mus musculus), and NM_019185 (Rattus norvegicus).
  • a suitable functional equivalent of a Gata4 polypeptide is a polypeptide having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% amino acid sequence identity to the amino acid sequence of a Gata5 polypeptide or a Gata6 polypeptide.
  • a nucleotide sequence encoding a functional equivalent of a Gata4 polypeptide comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% nucleotide sequence identity to a nucleotide sequence encoding a Gata5 polypeptide or a Gata6 polypeptide.
  • Hand2 The Hand2 polypeptide belongs to the helix-loop-helix transcription factor family and is known to play an important role in cardiac development.
  • Hand2 polypeptides derived from various species and nucleotide sequences encoding Hand2 polypeptides are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences for Hand2 polypeptides include, for example, NP_068808.1 (Homo sapiens), NP_034532.3 (Mus musculus), and NP_073187.1 (Rattus orvegicus). Accession numbers for nucleotide sequences encoding Hand2 polypeptides include, for example, NM_021973.3 (Homo sapiens), NM_010402.4 (Mus musculus), and NM_022696.2 (Rattus orvegicus).
  • the amino acid sequence of the Hand2 polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • the nucleotide sequence encoding the Hand2 polypeptide comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • Tbx5 Tbx5 (T-box transcription factor 5) is a transcription factor that recognizes and binds to a T-box in the promoter region of some genes, and activates the transcription of genes operably linked to the promoter.
  • Amino acid sequences for Tbx5 polypeptides from various species and nucleotide sequences encoding Tbx5 polypeptides are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences for Tbx5 polypeptides include, for example, CAA70592.1 (Homo sapiens), NP_000183 (Homo sapiens), NP_035667 (Mus musculus), and NP_001009964.1 (Rattus orvegicus).
  • Accession numbers for nucleotide sequences encoding Tbx5 polypeptides include, for example, Y09445 (Homo sapiens), NM_000192 (Homo sapiens), NM_011537 (Mus musculus), and NM_001009964 (Rattus orvegicus).
  • the amino acid sequence of the Tbx5 polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • the nucleotide sequence encoding the Tbx5 polypeptide comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • Mef2c Mef2c (muscle cell-specific enhancer factor 2c) is a transcriptional activator that specifically binds to the MEF2 element present in the regulatory regions of many muscle-specific genes. Mef2c may be post-translationally modified, for example, by phosphorylation on Ser-59 and Ser-396; sumoylation on Lys-391; and acetylation on Lys-4.
  • the amino acid sequences of Mef2c polypeptides from various species and the nucleotide sequences encoding them are known in the art. Examples of amino acid sequences for Mef2c polypeptides and accession numbers for the nucleotide sequences encoding them are shown below.
  • Accession numbers for amino acid sequences related to Mef2c polypeptides include, for example, NP_001124477 (Homo sapiens), NP_002388 (Homo sapiens), NP_079558.1 (Mus musculus), NP_001164008 (Mus musculus), and XP_001056692 (Rattus norvegicus).
  • Accession numbers for nucleotide sequences encoding Mef2c polypeptides include, for example, NM_001131005 (Homo sapiens), NM_002397 (Homo sapiens), NM_025282 (Mus musculus), NM_00 1170537 (Mus musculus), and XM_001056692 (Rattus norvegicus).
  • the amino acid sequence of the Mef2c polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • the nucleotide sequence encoding the Mef2c polypeptide comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in one of the above GenBank entries.
  • a polypeptide functionally equivalent to a Mef2c polypeptide is used.
  • a Mef2a polypeptide (or a nucleotide sequence encoding a Mef2a polypeptide) is used.
  • a Mef2b polypeptide (or a nucleotide sequence encoding a Mef2b polypeptide) is used.
  • a Mef2d polypeptide (or a nucleotide sequence encoding a Mef2d polypeptide) is used.
  • Mef2a polypeptide The amino acid sequence of Mef2a polypeptide and the nucleotide sequence encoding Mef2a polypeptide are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences related to Mef2a polypeptide include, for example, NP_005578.2 (Homo sapiens), NP_001124398.1 (Homo sapiens), NP_001124399.1 (Homo sapiens), and NP_001124400.1 (Homo sapiens).
  • Accession numbers for nucleotide sequences encoding Mef2a polypeptide include, for example, NM_005587 (Homo sapiens), NM_001130926 (Homo sapiens), NM_001130927 (Homo sapiens), and NM_001130928 (Homo sapiens).
  • Mef2b polypeptide The amino acid sequence of Mef2b polypeptide and the nucleotide sequence encoding Mef2b polypeptide are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences related to Mef2b polypeptide include, for example, NP_001139257.1 (Homo sapiens), NP_005910.1 (Homo sapiens), NP_032604.2 (Mus musculus), and NP_001038949.1 (Mus musculus).
  • Accession numbers for nucleotide sequences encoding Mef2b polypeptide include, for example, NM_001145785 (Homo sapiens), NM_005919 (Homo sapiens), NM_008578 (Mus musculus), and NM_001045484 (Mus musculus).
  • the amino acid sequence of the Mef2d polypeptide and the nucleotide sequence encoding the Mef2d polypeptide are known in the art. Accession numbers for amino acid sequences related to the Mef2d polypeptide include, for example, NP_005911.1 (Homo sapiens) and NP_598426.1 (Mus musculus). Accession numbers for nucleotide sequences encoding the Mef2d polypeptide include, for example, NM_005920 (Homo sapiens) and NM_133665 (Mus musculus).
  • a suitable functional equivalent of a Mef2c polypeptide is a polypeptide having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% amino acid sequence identity with the amino acid sequence of a Mef2a polypeptide, a Mef2b polypeptide, or a Mef2d polypeptide.
  • suitable nucleotide sequences encoding functional equivalents of Mef2c polypeptides include nucleotide sequences having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% nucleotide sequence identity to a nucleotide sequence encoding a Mef2a polypeptide, a Mef2b polypeptide, or a Mef2d polypeptide.
  • Mef2c-TAD is an artificial transcription factor that fuses Mef2c with the transactivation domain (TAD) of MYOD, and overexpresses genes downstream of Mef2c.
  • Mef2c-TAD is described, for example, in Kojima et al. (2023). Stem Cell Reports 18, 1274-1283.
  • Microarray and RNA-seq data for Mef2c-TAD are available under accession numbers GSE196293 and GSE222869.
  • the amino acid sequence of the Mef2c-TAD polypeptide comprises an amino acid sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4.
  • the nucleotide sequence encoding the Mef2c-TAD polypeptide comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:5.
  • the polynucleotide encoding the protein of interest may be a marker gene.
  • An rAAV vector packaging a polynucleotide incorporating a marker gene is administered to a test animal, and the number and distribution of cells into which the gene has been introduced can be confirmed by identifying cells that express the marker gene.
  • Any known marker gene can be used without particular limitation. Examples of such marker genes include the green fluorescent protein (GFP) gene, the LacZ gene, and luminescent protein genes (such as firefly luciferase).
  • target proteins include, but are not limited to, Cre recombinase.
  • a method for obtaining a polynucleotide encoding a protein of interest can be a method using nucleic acid amplification techniques such as PCR.
  • primers are prepared from the 5' and 3' sequences (or their complementary sequences) of the cDNA of the polynucleotide, and these primers are used to perform PCR or the like using genomic DNA or cDNA as a template to amplify the DNA region sandwiched between the two primers. This makes it possible to obtain large quantities of DNA fragments containing the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention is preferably a polynucleotide in which the polynucleotide in the internal region located between the ITR sequences located on the 5' and 3' sides of the AAV genome (i.e., one or both of the rep gene and cap gene) has been replaced with a polynucleotide encoding a protein of interest (e.g., a reprogramming factor, etc.) and a gene cassette containing at least one promoter sequence selected from the group consisting of the periostin promoter sequence, collagen 1a2 promoter sequence, and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter sequence. It is more preferable that the polynucleotide has an ITR sequence at each of its 5' and 3' ends.
  • the ITR of an adeno-associated virus is a region approximately 145 bases long that functions as an origin of replication, etc.
  • the ITR sequence of the polynucleotide may be derived from any AAV serotype, as long as it has at least one of the functions of an original ITR, such as functioning as an origin of replication or inserting a gene into a host cell, but is preferably derived from AAV2.
  • the 5' ITR sequence comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
  • the 3' ITR sequence comprises a nucleotide sequence having at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
  • the ITR portion easily takes on a sequence in which the complementary sequence is reversed, and therefore the ITRs contained in the polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention may have the 5' and 3' orientations reversed.
  • the rAAV vectors of the present invention can be prepared by known methods. Such methods include, for example, transfecting cultured cells with an AAV helper plasmid (plasmid 1) and an rAAV vector plasmid (plasmid 2). The method can further include transfecting the cultured cells with an adenovirus helper plasmid or infecting the cultured cells with adenovirus. The method can further include culturing the transfected cultured cells and collecting the recombinant adeno-associated virus vector from the culture supernatant.
  • AAV helper plasmid plasmid 1
  • plasmid 2 rAAV vector plasmid 2
  • the method can further include transfecting the cultured cells with an adenovirus helper plasmid or infecting the cultured cells with adenovirus.
  • the method can further include culturing the transfected cultured cells and collecting the recombinant adeno-associated virus vector from the culture
  • the AAV helper plasmid (plasmid 1) contains a polynucleotide encoding the AAV-DJ capsid protein and a polynucleotide encoding the Rep protein.
  • the AAV-DJ capsid protein and the Rep protein may be incorporated into one or more plasmids. Furthermore, one or more of these AAV-DJ capsid proteins and Rep proteins may be included in the rAAV genome. In the present invention, it is preferable that the AAV-DJ capsid protein and the Rep protein are all encoded by a single polynucleotide and used as an AAV helper plasmid.
  • the polynucleotide is operably linked to a known promoter sequence that is operable in cultured cells.
  • promoter sequences that can be used appropriately include the cytomegalovirus (CMV) promoter, EF-1 ⁇ promoter, and SV40 promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • EF-1 ⁇ promoter EF-1 ⁇ promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • the AAV helper plasmid may contain known enhancer sequences, Kozak sequences, poly(A) addition signal sequences, and the like, as appropriate.
  • the Rep protein used in the present invention may have an amino acid sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of the Rep protein of wild-type AAV, so long as it has known functions, such as recognizing ITR sequences and replicating the genome in a manner dependent on those sequences, recruiting and packaging an rAAV genome (or wild-type AAV genome) into a viral vector, and forming the rAAV vector of the present invention, to the same extent as the Rep protein of wild-type AAV.
  • the Rep protein may have an amino acid sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to the amino acid sequence of the Rep protein of AAV-DJ (SEQ ID NO: 8).
  • a Rep protein derived from a known AAV-DJ is preferably used.
  • the polynucleotide encoding the Rep protein used in the present invention may contain a nucleotide sequence that has at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% sequence identity to the nucleotide sequence encoding the Rep protein of wild-type AAV, so long as it encodes a Rep protein that has known functions, such as recognizing ITR sequences and replicating the genome in a manner dependent on those sequences, recruiting and packaging an rAAV genome (or wild-type AAV genome) into a viral vector, and forming the rAAV vector of the present invention, to the same extent as the Rep protein of wild-type AAV.
  • the rAAV vector plasmid (plasmid 2) is a plasmid containing a nucleotide sequence encoding a protein of interest located between two ITR sequences.
  • Plasmid 2 contains a polynucleotide sequence encoding the protein of interest in a position operable with at least one promoter selected from the group consisting of the periostin promoter, collagen 1a2 promoter, and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter. It may also contain known enhancer sequences, Kozak sequences, poly(A) addition signal sequences, etc., as appropriate.
  • An adenovirus helper plasmid is a plasmid encoding adenovirus-derived factors. Because AAV is a helper-dependent virus, preparing the rAAV vector of the present invention requires co-infection with a helper virus such as adenovirus when infecting cultured cells. In the absence of co-infection with a helper virus, AAV inserts the viral genome into the host cell chromosome, but no infectious AAV vector derived from the inserted viral genome is produced. When a host carrying the inserted viral genome is infected with a helper virus, an infectious AAV vector derived from the integrated genome can be produced.
  • a helper virus such as adenovirus
  • an adenovirus helper plasmid can be introduced into cultured cells simultaneously with the above-mentioned Plasmid 1 and Plasmid 2.
  • the adenovirus helper plasmid is preferably derived from the same virus species as the cultured cells.
  • an adenovirus helper plasmid derived from human AdV can be used.
  • Commercially available adenovirus helper plasmids can be used.
  • rAAV vector of the present invention various known methods can be used to transfect cultured cells with one or more of the above-mentioned plasmids, such as the calcium phosphate method, lipofection, and electroporation. Such methods are described, for example, in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc.
  • compositions comprising the rAAV vectors of the invention.
  • the rAAV vector of the present invention comprises a polynucleotide encoding a reprogramming factor.
  • Pharmaceutical compositions comprising such rAAV vectors are useful for treating various cardiac disorders (e.g., myocardial infarction, heart failure, arrhythmia, etc.).
  • the pharmaceutical compositions can be used as agents for improving cardiac function.
  • the reprogramming factors described above are preferably used.
  • the content of the above-mentioned rAAV vector in the pharmaceutical composition of the present invention can be approximately 0.001 to 100 parts by mass per 100 parts by mass of the pharmaceutical composition.
  • the above-mentioned rAAV vector itself may be used as the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated with pharmaceutically acceptable carriers or additives used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • Such carriers or additives are well known, and specific examples include any carrier, diluent, excipient, suspending agent, lubricant, adjuvant, vehicle, delivery system, emulsifier, disintegrant, absorbent, preservative, surfactant, colorant, flavoring, or sweetener.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in any dosage form by appropriately combining the above-mentioned carriers or compounds.
  • Specific dosage forms include injections such as intravenous injections, infusions, implant injections, and sustained-release injections; tablets such as plain tablets, sugar-coated tablets, film-coated tablets, enteric-coated tablets, orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, dispersible tablets, and dissolving tablets; capsules such as hard capsules and soft capsules; granules including effervescent granules, sustained-release granules, and enteric-coated granules; powders; oral liquids such as elixirs, suspensions, emulsions, and lemonades; syrups such as syrup preparations; and oral jellies.
  • the target animals for use with the pharmaceutical composition of the present invention are not limited to humans, and can be any living animal. Examples include laboratory animals such as mice, rats, rabbits, hamsters, guinea pigs, monkeys, and chimpanzees; pet animals such as dogs and cats; and any other animal species requiring protection.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and any known administration method may be adopted, taking into account the above-mentioned administration target, dosage form, etc., as appropriate. Specific examples include administration into cardiac tissue, intravenously, orally, intramuscularly, intraarterially, etc., with administration into cardiac tissue or intravenously being preferred, and direct administration into cardiac tissue being more preferred.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention involves contacting the pharmaceutical composition of the present invention with fibroblasts of an individual. "Contact” includes administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual at or near the treatment site (e.g., in or around the heart).
  • One example of an administration method is to insert a catheter into a distal artery and guide it to the vicinity of the affected area of the heart, and then inject the pharmaceutical composition of the present invention from the tip of the catheter into the fibrotic affected tissue to bring it into contact with the tissue.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dosage can be selected depending on various conditions, such as the type of disease, the patient's age and symptoms, the route of administration, the purpose of treatment, and the presence or absence of concomitant medications.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is typically about 0.1 to 50 mg/kg for humans, and about 0.1 to 50 mg/kg for mice.
  • vg vector genome
  • the dosage can be selected from the range of, for example, 10 9 to 10 14 vg per kg of body weight, preferably 10 10 to 10 13 vg, and more preferably 10 10 to 10 12 vg per kg of body weight, but is not limited thereto.
  • the dosage can be appropriately determined based on the dosages for humans and mice described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in the above-mentioned amounts once a day or in divided doses. Furthermore, the administration interval may be daily, every other day, weekly, biweekly, every 2 to 3 weeks, monthly, bimonthly, or every 2 to 3 months, as long as it provides a therapeutic effect.
  • a gene expression method using the AAV vector of the present invention comprises administering the rAAV vector of the present invention.
  • the subject of administration may be an individual, tissue, cell, or the like.
  • the AAV vector of the present invention can express a gene of interest in activated cardiac fibroblasts.
  • the activated cardiac fibroblasts are preferably cardiac fibroblasts following myocardial infarction.
  • the individual is a non-human mammal.
  • the gene expression method includes administering an rAAV vector containing a polynucleotide encoding a reprogramming factor.
  • the polynucleotide encoding the reprogramming factor is preferably one described above.
  • Cardiomyocytes are induced from activated cardiac fibroblasts by the gene expression method using such an rAAV vector.
  • kits for preparing the rAAV vectors of the present invention may include, for example, the above-described Plasmid 1 and Plasmid 2.
  • kits for preparing the rAAV vectors of the present invention may further include any of the components described herein (e.g., adenovirus helper plasmids, etc.).
  • AAV vector production AAV vectors were prepared according to the methods described in Kurosaki et al., 2017 and Mizukami et al., 2006. Recombinant AAV vector plasmids were generated by PCR amplification of the coding regions of GFP, Cre, GATA4, HAND2, TBX5, MEF2C, and MEF2C-TAD. The amplified DNA was subcloned into AAV-CMV (Agilent Technologies) and AAV-Postn (periostin) (Piras et al., 2016). Amplified GFP DNA was subcloned into AAV-COMP and AAV-Col1a2.
  • AAV-DJ Rep-Cap was purchased from Cell Biolabs, Inc.
  • Packaging plasmids AAV1-10, DJ
  • helper plasmids pHelper for AAV1-10: Agilent Technologies
  • pHelper for AAV-DJ Cell Biolabs Inc.
  • Virus-containing medium was collected after 3 days, and cells were resuspended in PBS.
  • AAV vectors were purified using polyethylene glycol precipitation and ultracentrifugation using cesium chloride.
  • the titer (VG) of each vector was measured by real-time PCR (Thermal Cycler Dice® Real Time System III, Takara Bio Inc.).
  • the amino acid sequence of the AAV-DJ capsid protein used in this example is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide sequence encoding the AAV-DJ capsid protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide sequence of the periostin promoter is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of the Mef2c-TAD polypeptide is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the polynucleotide sequence encoding the Mef2c-TAD polypeptide is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide sequence of the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) promoter is shown in SEQ ID NO: 9.
  • the polynucleotide sequence of the collagen 1a2 promoter is shown in SEQ ID NO: 10.
  • Tcf21 iCre/Tomato mice were obtained by crossing Tcf21 iCre mice with R26R-tdTomato mice.
  • Genetically modified Postn MCM/Tomato mice were obtained by crossing Postn MCM mice with R26R-tdTomato mice.
  • ICR (Jcl:ICR) mice were purchased from CLEA Japan, Inc. The transgenic mice showed no immunodeficiency or other health problems and were drug-free and experimentally naive until the start of this study. All animals were group-housed in a dedicated specific pathogen-free (SPF) facility with a 12-hour/12-hour light/dark cycle, with free access to food and water, and monitored daily. Their health status was regularly monitored to maintain SPF status. Animals undergoing surgical procedures were transferred to the SPF facility under the same conditions.
  • SPPF pathogen-free
  • AAV vector-containing solution (1 ⁇ 10 12 VG/mouse) was injected via the tail vein immediately after coronary artery ligation.
  • the mouse operators were blinded to the study.
  • the mortality rate after myocardial infarction was recorded as less than 10%.
  • Echocardiography was performed on postoperative day 2, and mice with an ejection fraction (EF) of 45% or greater were excluded from analysis.
  • EF ejection fraction
  • rat cardiomyocytes and primary cultured rat cardiac fibroblasts Cells derived from postnatal Sprague-Dawley rats (P1-3) were separated into cardiomyocytes and cardiac fibroblasts based on centrifugation using Percoll gradient centrifugation, and then allowed to adhere to plastic dishes to obtain cardiomyocytes (Haginiwa et al., 2019). Cells were resuspended in DMEM/Medium 199 supplemented with 10% FBS and cultured at 37°C and 5% CO2 , with the medium changed every 2–3 days. The following day, rat cardiomyocytes and cardiac fibroblasts were transduced with the above vectors (2.5 ⁇ 10 5 VG/cell) and cultured for an additional week.
  • Mouse embryos were collected between 12.5 and 13.5 days of gestation. The head, heart, and other internal organs were removed under a stereomicroscope under sterile conditions. The remaining torsos (3-5 individuals) were collected and minced with scissors. The resulting tissue fragments were transferred to 15 mL of 0.25% trypsin/EDTA solution preheated to 37°C and incubated at 37°C for 20 minutes. An equal volume of FBS (15 mL) was added to stop the reaction, and the tissue was dissociated by pipetting several times. The dissociated suspension was centrifuged, and the resulting pellet was resuspended in 10 mL of MEF medium.
  • MEF Mobility Embryonic Fibroblasts
  • the resuspended cells were seeded into 100 mm dishes and cultured at 37°C in 5% CO 2 .
  • the medium was prepared by adding 10% fetal bovine serum (FBS), 1% sodium pyruvate, 1% non-essential amino acids (NEAA), and 1% antibiotic-antimycotic mixture (PSA) to Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  • FBS fetal bovine serum
  • NEAA non-essential amino acids
  • PSA antibiotic-antimycotic mixture
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Tcf21 iCre/Tomato mice were intraperitoneally administered tamoxifen citrate (2 mg/day; Millipore Sigma, T5648) for five consecutive days. Tamoxifen was dissolved in 90% peanut oil (Millipore Sigma, P2144) and 10% ethanol to a concentration of 50 mg/mL. MI surgery was performed 7 days after the last day of tamoxifen administration. Postn MCM/Tomato mice were continuously administered tamoxifen-containing food pellets for two weeks after myocardial infarction surgery.
  • Food pellets were prepared by adding 0.4 g of tamoxifen citrate (T2510, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 49.6 g of sucrose per kg of standard mouse chow (MF, Oriental Yeast Co., Ltd.).
  • AAV vectors In vitro infection with AAV vectors
  • Fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis After euthanasia by CO2 inhalation, the heart was immediately cannulated and perfused with chilled PBS (50 mL). After removal, the atria and valves were dissected to separate the ventricles. The ventricular myocardium was then cut into approximately 1 mm pieces on a sterile dish on ice. The pieces were transferred to a 10 mL tube containing 3 mL of enzyme solution and incubated in a 37°C water bath for 45 minutes, with pipetting every 15 minutes. The enzyme solution contained 2 mg/mL collagenase type IV (Worthington Biochemical, CLS-4) and 1.2 U/mL Dispase II (Sigma, 255-914-4).
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • the cell suspension was filtered through a 40 ⁇ m cell strainer. After removing debris by centrifugation using Debris Removal Solution (Miltenyi Biotec, 130-109-398), red blood cells were removed using RBC lysis buffer (pluriSelect, 60-00050-11). The cells were then analyzed using a flow cytometer (Beckman Coulter, CytoFLEX S) and FlowJo software (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) to detect GFP expression.
  • a flow cytometer Beckman Coulter, CytoFLEX S
  • FlowJo software BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA
  • DAPI Thermo, D21490
  • Confocal microscopy was performed using an LSM800 microscope (Carl Zeiss), and Z-stack images were collected according to standard protocols. Measurements and calculations were performed blinded. Comp+ areas were measured using the analysis tool in Adobe Photoshop. The percentage of immunoreactive cells was measured in six randomly selected fields per section. Data for each mouse were calculated based on 30 to 50 sections, with five mice observed per group. A total of 36,000–60,000 cells were counted for each mouse.
  • Masson's trichrome staining was performed on paraffin-embedded sections according to standard procedures. To measure scar size, the scar area (blue) and healthy area (red) were measured on transverse sections across three levels within the left ventricle (apex, mid-base) using Adobe Photoshop. Three tissue sections were measured at each level (a total of nine sections), and five mice per group were examined. Measurements and calculations were performed blinded.
  • CLC Genomics Workbench CLC Genomics Workbench
  • Heat maps were created using Morpheus software (https://software.broadinstitute.org/morpheus). Differential gene expression analysis was performed using the Empirical Analysis of DGE in CLC. Principal component analysis (PCA) was performed using BioJupies software (Torre et al., 2018). Relative expression was analyzed using normalized expression values as a ratio to the Ctrl group.
  • PCA Principal component analysis
  • AAV1, AVV6, and AVV-DJ exhibited the highest transduction efficiency in cardiac fibroblasts among the 11 serotypes (Fig. 2).
  • AAV2 and AAV9 which are widely used in cardiomyocyte gene therapy, exhibited low transduction efficiency in cardiac fibroblasts in vitro.
  • most AAV vectors, including AAV-DJ showed moderate transduction efficiency ( ⁇ 40%) in cardiac myocytes in vitro (Fig. 3).
  • Immunofluorescence staining revealed that AAV1, AAV6, and AAV-DJ showed strong GFP expression in cardiac fibroblasts, whereas AAV1 and AAV4 showed strong GFP expression in cardiac myocytes in culture (Fig. 4).
  • Example 1 In vivo gene expression in cardiac fibroblasts using the AAV-DJ-Postn vector.
  • An AAV construct containing periostin (Postn) promoter-driven Cre recombinase (AAV-Postn-Cre) was constructed and packaged into AAV6, 9, and DJ capsids ( Figure 6).
  • AAV6-Postn-Cre vector, AAV9-Postn-Cre vector, and AAV-DJ-Postn-Cre vector (hereinafter sometimes simply referred to as AAV6-Postn-Cre, AAV9-Postn-Cre, and AAV-DJ-Postn-Cre) were directly injected into the hearts of Tomato reporter mice after myocardial infarction, and transgene expression was measured (Figure 7).
  • AAV6-Postn-Cre, AAV9-Postn-Cre, and AAV-DJ-Postn-Cre were directly injected into the hearts of Tomato reporter mice after myocardial infarction, and transgene expression was measured (Figure 7).
  • AAV6-Postn-Cre, AAV9-Postn-Cre, and AAV-DJ-Postn-Cre the Tomato reporter was expressed primarily in the infarct and border zones, but not in distant zones (Figure 8).
  • AAV-DJ-Postn-Cre showed the highest transduction efficiency among the three serotypes (Figure 9).
  • Co-immunostaining using multiple antibodies against cardiomyocytes (cTnT), cardiac fibroblasts (COL1), smooth muscle cells (SMC; SMMHC), and endothelial cells (EC; CD31) demonstrated that Tomato was primarily expressed in resident CFs, and the transduction efficiency of AAV-DJ-Postn-Cre injection reached approximately 90% (Figure 10). Tomato+ cells persisted in the border and infarct areas for 4 weeks after myocardial infarction.
  • Example 2 Gene expression in primary cultured human cardiac fibroblasts using the AAV-DJ-Postn vector.
  • human cardiac fibroblasts were cultured, AAV-DJ-Postn-GFP was constructed, and gene transfer was performed. Gene transfer was performed at a multiplicity of infection of 5 x 104 vg/cell, and the transfer efficiency was determined using immunofluorescence (IF) 1 week after transfer. As a result, gene expression was confirmed in human cardiac fibroblasts in vitro when the AAV-DJ-Postn vector was used (data not shown).
  • Example 3 Confirmation of the time course of transgene expression under the control of the Postn promoter
  • AAV-DJ-Postn-GFP was constructed and directly injected into the hearts of mice after myocardial infarction (Figure 11).
  • GFP expression decreased 2 and 4 weeks after myocardial infarction compared to 1 week after myocardial infarction ( Figure 12).
  • Example 4 Specificity of the AAV-DJ-Postn Vector. Immunohistochemical staining and FACS analysis confirmed that GFP+ cells were detected in the heart after 1 week, but not in other tissues, such as the liver, lung, or skeletal muscle ( Figures 13-15). When AAV-DJ-Postn-GFP was directly injected into the hearts of healthy, non-infarcted mice, low levels of GFP expression were detected only at the injection site. Furthermore, when AAV-DJ-Postn-Cre was systemically administered via the tail vein to healthy control mice ( Figures 16 and 17) and infarcted Tomato reporter mice ( Figures 18 and 19), Tomato expression was observed only in the infarcted area, but not in healthy myocardium or other tissues. These results suggest that the AAV-DJ-Postn vector preferentially targets activated CFs after myocardial injury, but not quiescent CFs or other organs.
  • Example 5 In vivo myocardial reprogramming of cardiac fibroblasts using AAV-DJ-Postn vector (1)
  • AAV-DJ-Postn vectors expressing reprogramming factors, including GATA4, HAND2, TBX5, MEF2C, and MEF2C-TAD (M-TAD) Figure 20.
  • mice were continuously administered tamoxifen for 2 weeks after myocardial infarction, and hearts were harvested 2 weeks later (Kanisicak et al., 2016). Immunohistochemical staining revealed that both AAV-DJ-Postn-GHT/M and AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD induced ⁇ -actinin expression in Tomato+ cells (Figure 23). ⁇ -Actinin+/Tomato+-induced cardiomyocytes displayed distinct sarcomere structures, and three-dimensional analysis confirmed that the cells expressed both proteins.
  • AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD generated twofold more induced cardiomyocytes than AAV-DJ-Postn-GHT/M in the border region, suggesting that activated MEF2C promotes cardiac reprogramming in vivo (Fig. 24).
  • Example 6 In vivo myocardial reprogramming of cardiac fibroblasts using AAV-DJ-Postn vector (2) Tcf21 iCre/Tomato mice were administered tamoxifen before myocardial infarction, allowing for specific labeling of quiescent cardiac fibroblasts and lineage tracking of cardiac fibroblasts without leaky expression in cardiomyocytes. Tcf21 iCre/Tomato mice were treated with tamoxifen for 5 days to label Tcf21-expressing cardiac fibroblasts before myocardial infarction. Coronary artery ligation was performed 7 days after the final tamoxifen treatment.
  • Example 7 Confirmation of fibrosis suppression by myocardial reprogramming using AAV-DJ-Postn vector
  • AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD To investigate the molecular changes induced by cardiac reprogramming with AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD, we performed RNA sequencing analysis on hearts from mice injected with Ctrl- and AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD 4 weeks after myocardial infarction.
  • Gene set enrichment analysis revealed that genes upregulated in GHT/M-TAD hearts were enriched in clusters related to cardiac function, such as cardiac contractility or metabolic processes, whereas genes downregulated were enriched in fibroblast signatures or inflammatory responses (Figure 29).
  • cardiac function in Ctrl mice, AAV-DJ-Postn-GFP mice, and AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD-injected mice was evaluated using echocardiography 2 days, 2 weeks, and 4 weeks after myocardial infarction.
  • AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD administration significantly improved left ventricular ejection fraction and fractional shortening after 4 weeks ( Figure 30).
  • Histological analysis using Masson's trichrome staining was also performed to quantify scar size after 4 weeks.
  • the fibrotic area was significantly reduced in the AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD-treated hearts compared with the Ctrl- and AAV-DJ-Postn-GFP-treated hearts ( Figure 31).
  • Example 8 Gene Expression in Mouse Embryonic Fibroblasts and Cardiac Fibroblasts Using AAV-DJ-Col1a2 and AAV-DJ-COMP Vectors. To examine the transduction efficiency of mouse embryonic fibroblasts, these cells were cultured and transduced with AAV-DJ-Col1a2-GFP and AAV-DJ-COMP-GFP vectors ( Figure 32). Gene transduction was performed at a multiplicity of infection (MOI) of 5 x 104 vg/cell, and transduction efficiency was determined by immunofluorescence (IF) 1 week after transduction.
  • MOI multiplicity of infection
  • IF immunofluorescence
  • Example 9 Gene expression in cardiac fibroblasts in vivo using the AAV-DJ-Col1a2 vector
  • the AAV-DJ-Col1a2-GFP vector was directly injected into the hearts of ICR mice after myocardial infarction, and transgene expression was observed by immunohistochemical staining 1, 2, and 4 weeks later ( Figure 35).
  • Figure 36 significant gene expression was observed at all time points after myocardial infarction ( Figure 36), demonstrating that the AAV-DJ-Col1a2 vector is capable of widespread gene expression from the acute to chronic phases of myocardial infarction.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

ペリオスチンプロモーター配列、コラーゲン1a2プロモーター配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列からなる群より選択される少なくとも１種を含むポリヌクレオチドと、AAV-DJカプシドタンパク質とを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、　前記コラーゲン1a2プロモーター配列は、明細書中に記載の（2-1）～（2-4）のいずれかであり、前記軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列は、明細書中に記載の（3-1）～（3-4）のいずれかである、組換えアデノ随伴ウイルスベクター： 。

Description

心筋ダイレクトリプログラミングのための組換えアデノ随伴ウイルスベクター
　本発明は、心筋ダイレクトリプログラミングのための組換えアデノ随伴ウイルスベクターに関する。
　心血管疾患は世界的な死亡原因の第１位である。心血管疾患の１種である心筋梗塞では、発症後に心臓線維芽細胞が活性化されて増殖し、心筋の線維化と心機能障害を引き起こすことが知られている。しかし、成人の心筋細胞は終末分化した細胞であり、ほとんど再生能力を有さないため、心臓疾患の治療方法は限定されている。
　これまでに、心筋リプログラミング因子（GATA4、MEF2C、及びTBX5等）を用いて、心臓線維芽細胞から心筋細胞を誘導する方法が見出されている（特許文献１、非特許文献１～３）。レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いたin vivo心臓リプログラミングは、心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞にリプログラムし、梗塞したマウスの心臓を修復できることが開示されている（非特許文献２）。また、心臓リプログラミングは、マウスの慢性心筋梗塞モデルにおいて、心筋収縮を改善し、再生効果と抗線維化効果によって線維化を抑制することが開示されている（非特許文献３）。
国際公開第２０１１／１３９６８８号
Cell 2010, 142, 375-386 Cell Stem Cell 2018, 22, 91-103 Circulation 2023, 147, 223-238.
　上記文献に開示されている方法においては、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が用いられているが、それぞれ挿入突然変異、免疫反応等を引き起こす可能性があった。そのため、安全で効率的な遺伝子導入システムの開発が求められている。
　本発明は、生体内での心筋ダイレクトリプログラミングを行うことのできる、新規ベクターを提供することを課題とする。
　上記課題を解決すべく、発明者らは鋭意研究を重ねた結果、特定のプロモーター配列を含む核酸分子と、アデノ随伴ウイルスDJカプシドタンパク質とを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いると、生体内で心臓線維芽細胞から心筋細胞に誘導できることを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す広い態様の発明を含むものである。
［項１］
　ペリオスチンプロモーター配列、コラーゲン1a2プロモーター配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列からなる群より選択される少なくとも１種を含むポリヌクレオチドと、AAV-DJカプシドタンパク質とを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、
　前記コラーゲン1a2プロモーター配列は、以下の（2-1）～（2-4）のいずれかであり、前記軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列は、以下の（3-1）～（3-4）のいずれかである、組換えアデノ随伴ウイルスベクター：
（2-1）配列番号９で表される塩基配列、
（2-2）配列番号９で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列、
（2-3）配列番号９で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列、
（2-4）配列番号９で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
（3-1）配列番号１０で表される塩基配列、
（3-2）配列番号１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列、
（3-3）配列番号１０で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列、
（3-4）配列番号１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
［項２］
　前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、Gata4、Hand2、Tbx5、及びMef2cからなる群より選択される少なくとも１つのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含む、項１に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［項３］
　項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む、医薬組成物。
［項４］
　項２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む、心機能改善剤。
［項５］
　項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む、活性化された心臓線維芽細胞における遺伝子発現方法。
［項６］
　活性化された心臓線維芽細胞が、心筋梗塞後の心臓線維芽細胞を含む、項５に記載の遺伝子発現方法。
［項７］
　項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む、心臓線維芽細胞から心筋細胞を誘導する方法。
　本発明によれば、生体内での心筋ダイレクトリプログラミングを行うことのできる、新規ベクターを提供することができる。
複数のAAVカプシド(AAV1～10及びAAV-DJ)のin vitro及びin vivoスクリーニングの概略図。AAVベクターはCMVプロモーター駆動型GFP（AAV-CMV-GFP）を含んでいた。 AAVカプシドのin vitroスクリーニング。1週間後、感染多重度2.5×105 VG/cellにおける、AAV-CMV-GFPベクターで形質導入された心臓線維芽細胞でのGFP発現のFACS分析における定量的データを示す（n = 3）。平均値±SD。* p < 0.05、** p < 0.01。 AAVカプシドのin vitroスクリーニング。1週間後、感染多重度2.5×105 VG/cellにおける、AAV-CMV-GFPベクターで形質導入された心筋細胞でのGFP発現のFACS分析における定量的データを示す（n = 3）。平均値±SD。* p < 0.05、** p < 0.01。 AAVカプシドの細胞トロピズムの in vitroスクリーニング。1週間後、感染多重度2.5x105 VG/cellでAAV-CMV-GFPベクターを形質導入した心筋細胞（上）および心臓線維芽細胞（下）における代表的な免疫蛍光GFP発現。スケールバーは50μmを表す。 AAVカプシドのin vivoスクリーニング。AAV-CMV-GFPベクター（1×1011 VG/マウス）を心筋梗塞1週間後のマウスの心臓に直接注入した。ほとんどのGFP+細胞はα-アクチニン+心筋細胞であった。非筋細胞（左）及び心筋細胞（右）におけるGFP発現の定量的データを示す（n = 5）。平均値±SD。* p < 0.05、** p < 0.01。 Postnプロモーター駆動型Creリコンビナーゼ（AAV-Postn-Cre）を含むAAV発現カセットへのAAV6、9、DJカプシドのパッケージングによるAAV-DJ-Postnベクターの構築。 AAV-Postn-Creベクターを心筋梗塞後の心臓に直接注入したR26-tomatoマウスの解析の概略図を示す。 AAV6-Postn-Cre、AAV9-Postn-Cre、AAV-DJ-Postn-Creを注入した心筋梗塞2週間後のTomatoマウス心臓におけるTomato、cTnT、DAPIの免疫組織染色。高倍率図（下段）は境界領域を示す。スケールバーは50μmを表す。 AAV6-Postn-Cre、AAV9-Postn-Cre、AAV-DJ-Postn-Creの注入によるTomato+細胞の定量データを示す（n = 5）。平均値±SD。** p < 0.01。 心筋梗塞の2週間後にAAV-DJ-Postn-Creを注入したTomatoマウスの心臓におけるTomato、cTnT、COL1、SMMHC、CD31、DAPIの免疫組織染色を行ったところ、ほとんどのTomato+ 細胞はCOL1に対して免疫陽性であった。cTnT+ 心筋細胞（CM）、COL1+ 心臓線維芽細胞（CF）、SMMHC+ 平滑筋細胞（SMC）、及びCD31+ 内皮細胞（EC）のTomato+ 細胞に対する比率を示す（n = 5）。平均値±SD。** p < 0.01。 ICRマウスの心筋梗塞後の心臓へのAAV-DJ-Postn-GFP注入の実験スキームを示す。 心筋梗塞から1、2、4週後のAAV-DJ-Postn-GFP注入マウス心臓におけるGFP、cTnT、DAPIの免疫組織染色を行った。境界/梗塞部におけるGFP+細胞の定量的データを示す（n = 5）。平均値±SD。** p < 0.01。 ICRマウスの心筋梗塞後の心臓へのAAV-DJ-Postn-GFPベクターの直接注入を示す模式図。 心筋梗塞後の心臓へのAAV-DJ-Postn-GFPベクター直接注入1週間後の肝臓、肺、骨格筋におけるGFPとDAPIの免疫組織染色を行った。GFP+/DAPI+細胞の定量分析を示す（n = 5）。定量は心臓の境界／梗塞部で行った。平均値±SD。** p < 0.01。 心筋梗塞後の心臓にAAV-DJ-Postn-GFPベクターを直接注入したICRマウスの心臓（全心室）、肝臓、肺、骨格筋におけるGFP+ 細胞のFACS解析を行った。GFP+ 細胞の定量的解析を示す（n = 5）。定量は心室全体について行った。平均値±SD。** p < 0.01。 尾静脈注射による健常TomatoマウスへのAAV-DJ-Postn-Creベクターの全身投与を示す模式図。 健常TomatoマウスへのAAV-DJ-Postn-Creベクター全身投与1週間後の心臓、肝臓、肺、骨格筋における免疫組織染色を行った。Tomato+/DAPI+細胞の定量的解析を示す（n = 5）。平均値±SD。 尾静脈注射による心筋梗塞TomatoマウスへのAAV-DJ-Postn-Creベクターの全身投与を示す模式図。冠動脈結紮直後にAAV-DJ-Postn-Creを注入した。 AAV-DJ-Postn-Creの全身投与1週間後の心筋梗塞後の心臓、肝臓、肺、骨格筋におけるTomatoの免疫組織染色を行った。Tomato+/DAPI+細胞の定量的解析を示す（n = 5つの独立した生物学的実験）。平均値±SD。** p < 0.01。 MEF2C及びMEF2C-TADの構造を示す。GATA4、HAND2、TBX5、MEF2CをコードするAAV-DJ-Postnベクター、及び、GATA4、HAND2、TBX5、MEF2C-TAD（M-TAD）をコードするAAV-DJ-Postnベクターを作製した。 Postn MCM/Tomatoマウスの作製の概略を示す。 Postn MCM/Tomatoマウスの心臓に、心筋梗塞後にPBS（Ctrl）、AAV-DJ-Postn-GHT/M、又はAAV-DJ-Postn-GHT/M-TADを直接注射した。その後、タモキシフェン含有フードペレット(TAM food)を2週間連続投与した。 心筋梗塞4週間後のPostn MCM/Tomatoマウス心臓におけるTomato、α-アクチニン（α-actinin）、DAPIの免疫組織染色の結果を示す。高倍率の挿入図はサルコメア組織を示す。スケールバーは50μmを表す。 境界領域におけるα-アクチニン+/Tomato+細胞の定量解析の結果を示す（n = 5）。各マウスについて合計36,000-60,000個の細胞を数え、1群につき5匹のマウスを分析した。平均値±SD。* p < 0.05; ** p < 0.01。 Tcf21 iCre/Tomatoマウスの作製の概略を示す。 Tcf21 iCre/Tomatoマウスにタモキシフェンを5日間腹腔内注射し、1週間後に心筋梗塞とAAV遺伝子導入を行った。心筋梗塞の4週間後に心臓を摘出し、免疫組織染色を行った。 心筋梗塞から4週間後のTcf21 iCre/Tomatoマウス心臓の切片において、Tomato、α-アクチニン、DAPIの免疫組織染色を行った。スケールバーは50μmを表す。 境界領域におけるα-アクチニン+/Tomato+細胞の定量解析の結果を示す（n = 5）。各マウスについて合計36,000-60,000個の細胞を数え、1群につき5匹のマウスを分析した。平均値±SD。* p < 0.05; ** p < 0.01。 GHT/M-TADを注入したマウスの心臓でCtrlと比較して発現が増加した遺伝子と減少した遺伝子の遺伝子セット濃縮解析結果を示す。 Ctrl、AAV-DJ-Postn-GFP、及びAAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD注射マウスにおける左室駆出率（LVEF）及び左室分画短縮率（LVFS）を、心筋梗塞の4週間後に心エコー法で測定した（n＝15）。平均値±SD。* p < 0.05。 心筋梗塞から4週間後のCtrl、AAV-DJ-Postn-GFP、AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD心臓の線維化を比較した。線維化はMasson's trichrome染色を用いてBase、Mid、Apexレベルで評価した。各レベルにおける線維化領域（Fibrotic area）の定量的解析結果を示す（n = 5）。平均値±SD。* p < 0.05; ** p < 0.01。 AAV-DJ-Col1a2-GFPベクター及びAAV-DJ-COMP-GFPベクターの概要図を示す。 A：マウス胎児線維芽細胞におけるGFP発現の定量的データを示す。B：心臓線維芽細胞におけるGFP発現の定量的データを示す。 A：心筋細胞におけるGFP+/cTNT+細胞の定量解析の結果を示す。B：非心筋細胞におけるGFP+/cTNT+細胞の定量解析の結果を示す。 実施例９における実験の概要を示す。 心筋梗塞ICRマウスにおけるin vivoでの心臓線維芽細胞における免疫組織化学染色の結果を示す。
　本明細書において、単数形（a, an, the等）は、本明細書で別途明示がある場合又は文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を含むものとする。 
　本明細書において、「含有する（comprise）」は、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」も包含する概念である 。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」とも換言できる。
　本発明に係る「ウイルスゲノム」及び「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例えば、cDNA又はゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノム及びポリヌクレオチドは各々、二本鎖又は一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNA又はRNAの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナル等の遺伝子上の配置について説明される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。
　本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」とも換言できる。
　本明細書中において使用される場合、「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲノムの調製、カプシドの組み立て、及びウイルスゲノムをカプシドで包むこと等を含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立てられ、培養物中に分泌される。
　本明細書において、「作動可能に連結する」とは、転写、翻訳等のような所望の機能を与える核酸間の機能的連結を指す。例えば、プロモーター、シグナル配列等の核酸発現制御配列と目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を含む。発現制御配列は目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳に影響する。
　本明細書において、「活性化された心臓線維芽細胞」とは、休止状態でない心臓線維芽細胞を指す。心臓線維芽細胞は、心筋梗塞、心臓の損傷、慢性的な高血圧等のストレスにさらされると、遊走活性が増加し、増殖するようになるとともに、筋線維芽細胞へ転換される。筋線維芽細胞は、運動性の増強、平滑筋アクチンの発現、コラーゲンその他ECM成分の合成の増加、等を特徴とする。本明細書においては、このような休止状態でない心臓線維芽細胞をまとめて、「活性化された心臓線維芽細胞」と呼ぶ。
１．組換えアデノ随伴ウイルスベクター
　本発明は、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAVベクター）を提供する。本発明のrAAVベクターは、ペリオスチンプロモーター配列、コラーゲン1a2プロモーター配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列からなる群より選択される少なくとも１種を含むポリヌクレオチドと、AAV-DJカプシドタンパク質とを含む。本発明のrAAVベクターを遺伝子発現に用いることにより、活性化された心臓線維芽細胞（例えば、心筋梗塞後の心臓線維芽細胞等）に選択的に、目的のタンパク質を発現させることができる。
（アデノ随伴ウイルス）
　天然のアデノ随伴ウイルス（AAV）は、非病原性であり、免疫原性が低い。野生型AAVでは、カプシドにパッケージングされた1本鎖DNAのウイルスゲノム上に、両端の逆方向末端反復（ITR）配列に挟まれたrep遺伝子及びcap遺伝子が存在する。rep遺伝子から産生されるRepタンパク質（rep78、rep68、rep52及びrep40）は、ウイルスゲノムの複製、転写調節、染色体への組み込みに必要とされる。cap遺伝子は3つのカプシドタンパク質（VP1、VP2及びVP3）をコードする。
（カプシドタンパク質）
　本発明のrAAVベクターは、AAV-DJカプシドタンパク質を含む。AAV-DJはDNAファミリーシャッフリングによって８種類の異なる天然型セロタイプ由来のハイブリッドカプシドを形成している（Grimm D.,et al.,J. Virol., 82(12), 5887～5911(2008).）。一実施形態において、本発明のrAAVベクターが含むAAV-DJカプシドタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、カプシドを形成可能なタンパク質が含まれる。また、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、例えば、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／ 又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつカプシドを形成可能であるタンパク質が挙げられる。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。一実施形態において、本発明に用いるカプシドタンパク質は、カプシドを形成する機能を有する。また、当該カプシド内には、目的の遺伝子（例えばリプログラミング因子をコードする配列）等を含むポリヌクレオチドがパッケージングされる。
　本発明に用いられるAAV-DJカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のrAAVベクターを形成可能であるカプシドタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする。このようなポリヌクレオチドは、例えば以下が挙げられる。
（i）配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ii）配列番号２で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（iii）配列番号２で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（iv）配列番号２で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
　上記（i）において、配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、本発明のrAAVベクターにおけるカプシドを形成可能なものが包含される。　
　上記（ii）において、置換、欠失、付加又は挿入する１又は数個の塩基の数は、１以上の整数であれば特に限定されない。例えば、１～数十個程度、好ましくは１～20個程度、より好ましくは１～15個程度、さらに好ましくは１～10個程度、特に好ましくは１～５個程度とすることができる。配列番号２で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、本発明のrAAVベクターにおけるカプシドを形成可能なものが包含される。
　ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、配列番号２の塩基配列との塩基配列の同一性が90％以上となるように１～220個程度、好ましくは同一性が95％以上となるように１～110個程度、より好ましくは同一性が97％以上となるように1～66個程度、さらに好ましくは同一性が98％以上となるように１～44個程度、特に好ましくは同一性が99％以上となるように１～22個程度とすることができる。
　上記（iii）において、塩基配列の同一性は、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上とすることができる。塩基配列の相同性若しくは同一性は、100％未満とすることができる。塩基配列間の相同性及び同一性は、BLAST等の公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。配列番号２で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、本発明のrAAVベクターにおけるカプシドを形成可能なものが包含される。
　上記（iv）において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「1×SSC（0.9M NaCl，0.09M クエン酸三ナトリウム）又は6×SSPE（3M NaCl，0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA・2Na，pH7.4）中の42℃でハイブリダイズさせ、さらに42℃で0.5×SSCにより洗浄する」条件が、ストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。このような条件は、例えば、M. R. Greenら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2012）に記載されている。配列番号２で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドであって、本発明のrAAVベクターにおけるカプシドを形成可能なものが包含される。　
（ポリヌクレオチド（rAAVゲノム））
　本発明のrAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチド（rAAVゲノム）は、目的のタンパク質（例えば、リプログラミング因子等）を発現させるため、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列がプロモーター配列と作動可能に組み合わされる。本発明において、プロモーター配列としては、ペリオスチンプロモーター配列、コラーゲン1a2プロモーター配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列からなる群より選択される少なくとも１種が用いられる。
　ペリオスチンは、活性化された心臓線維芽細胞においてのみ発現する細胞外マトリックスタンパク質である。心臓線維芽細胞は、心筋梗塞、圧負荷等のストレスを受けた心筋組織において活性化することが知られている。ペリオスチンプロモーター配列を用いることにより、活性化された心臓線維芽細胞（例えば、心筋梗塞後の心臓線維芽細胞等）に選択的に、目的のタンパク質を発現させることができる。ペリオスチンプロモーター配列を用いることにより、心筋梗塞急性期（心筋梗塞の発生から10日以内）における活性化された心臓線維芽細胞に目的のタンパク質を発現させることができる。
　コラーゲン1a2は、心臓線維芽細胞全体で、心筋梗塞の有無にかかわらず発現するタンパク質である。コラーゲン1a2プロモーター配列を用いることにより、心臓線維芽細胞に選択的に目的のタンパク質を発現させることができる。そのため、心筋梗塞の急性期及び慢性期における心臓線維芽細胞においても目的のタンパク質を発現させることができる。
　軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）は、心筋梗塞慢性期（心筋梗塞の発生から10日後以降）に発現量が増加するタンパク質である。軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列を用いることにより、心筋梗塞慢性期における心臓線維芽細胞に選択的に目的のタンパク質を発現させることができる。
　本発明におけるペリオスチンプロモーター配列としては、下記（1-1）～（1-4）のいずれかであることが好ましい。
（1-1）配列番号３で表される塩基配列。
（1-2）配列番号３で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列。
（1-3）配列番号３で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列。
（1-4）配列番号３で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
　上記（1-1）において、配列番号３で表される塩基配列であって、ペリオスチンプロモーターの機能を有するものが包含される。なお、配列番号３は、マウスのペリオスチンのエンハンサー配列にマウスのペリオスチンのプロモーター配列を結合した配列である（表１）。
　上記（1-2）において、置換、欠失、付加又は挿入する１又は数個の塩基の数は、１以上の整数であれば特に限定されない。例えば、１～数十個程度、好ましくは１～20個程度、より好ましくは１～15個程度、さらに好ましくは１～10個程度、特に好ましくは１～５個程度とすることができる。配列番号３で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列であって、ペリオスチンプロモーターの機能を有するものが包含される。
　ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、配列番号３の塩基配列との塩基配列の同一性が90％以上となるように１～140個程度、好ましくは同一性が95％以上となるように１～69個程度、より好ましくは同一性が97％以上となるように1～42個程度、さらに好ましくは同一性が98％以上となるように１～28個程度、特に好ましくは同一性が99％以上となるように１～14個程度とすることができる。
　上記（1-3）において、塩基配列の同一性は、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上とすることができる。塩基配列の相同性若しくは同一性は、100％未満とすることができる。塩基配列間の相同性及び同一性は、BLAST等の公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。配列番号３で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列であって、ペリオスチンプロモーターの機能を有するものが包含される。
　上記（1-4）において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「1×SSC（0.9M NaCl，0.09M クエン酸三ナトリウム）又は6×SSPE（3M NaCl，0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA・2Na，pH7.4）中の42℃でハイブリダイズさせ、さらに42℃で0.5×SSCにより洗浄する」条件が、ストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。このような条件は、例えば、M. R. Greenら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2012）に記載されている。配列番号３で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ペリオスチンプロモーターの機能を有するものが包含される。
　本発明におけるコラーゲン1a2プロモーター配列は、下記（2-1）～（2-4）のいずれかである。
（2-1）配列番号９で表される塩基配列。
（2-2）配列番号９で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列。
（2-3）配列番号９で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列。
（2-4）配列番号９で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
　上記（2-1）において、配列番号９で表される塩基配列であって、コラーゲン1a2プロモーターの機能を有するものが包含される。なお、配列番号９は、マウスのコラーゲン1a2プロモーター配列において、遺伝子発現に重要となる配列を抽出して結合した以下の配列である。
配列番号９：AGAGAAGTGGAGAGAGCCAGACAAAGGAAGAAGAGGGAGAACAGGAGAGGAGATGAGGGGGGAGATTAGAATGGGGTAAGGGAGAGAACAGGAGCTGAGAAGAGCGGGAGAGGGGGAGAGAAGGATTCAGACATTCTAAACTCTCTTCCTGAGTGCTATTTAAAGCAGTTTCCAACCTGGAGAGAATGTAATGCACAGTTCCTCCATGTGTTTAGTTAAGGACCTCATGAGTCTTGTGGATTTCTCCACAACCTAAGTGGTTATTATGCTGACCCGAGGGTGTGCCATTTGGTGGGACACTTCATCTTATTGTCCCTGTTTATGTGTAGCAAGCAAGTTCAGTTCTGTAAGACACTGATTAGAGGGGCAGGAAAATTGTTCTCTACTGTGCCTTGTGTACAGCAAGAAGCTGTCCAGTGTTGTTCACATAATTGAATGTGTGGAACTTCCCAGCTTGCAGGTGGGGTCTTCAGTTCTACCTCAGTCTCTTTGGGAGACTACCACAACTCACCTTGAGTAATTAGAAAACAGCACAGAAGTGGCTGCGCTTCCTGAAGACTACAAAGGAGCTGTTGCCTGCTTCTCTTAACTCCATCTTGGGCTCAGCTGACCCAAAAGCGGCTGTCTTTGTTTACACCAGATTTCAACTTTGCAGGCAATCTTACTAAGCAGAGGGAGGCAGTGGGGGATGGTATTGGGGGTGAGTTACTTAGTCCAAGTCCCAGAGCTGAGGGTGAGGGAGATGCTGTACTTTCTTACCAGCTGTTATGCATCAAGAAGAGACAGGCTTGTGTAACCCTTTCTTCTCCTGCACGTTTCAAGCAAAAGCCAGGCACTCACTGAGTTTTGTAAAGATTTTCCCGTGAAGACATACACACAGCGTAATTCCATGCAATAATTTCTGTGTAAAGCCCTTAGTGCAGTGTACCATTGTTTGTGTCTGGGTCTTGAATTGTCACAATTAAGTGTGAGCACACACACAATGTGCTCTTTAGCCAAAGTCATAACACTGCTACCTGCTTCCCTTTGAAAGAAAACAGCCATCTTCTCAGGAAATGTAAGGGGGCAAGGGGTGGGGGTTGGGGGGAAGGACAAGATTGTAAAAAGCCAAAAGCCTAGGGCTTGGAGCTGCTTTGGCCAAGCCTAGAATCTATTTAAATGCCCTTCCCTGAAGGGTTAAGTGTGGAACACCTCCCAGGAAATGACAAATGGCCAGAGTTCTGCCCACTCCCTTCCCCCCATCTTCCAGACATCAAATACTTAGGAACTGTTTGGCTTGAAATGGTTCCTGAGACTCATACTCACAGAACACATTCTTTTTACTCTCCTCCCCCAGCCCAGTACAGGCTGGAGGTGGCTGGCGGGGGTAGGGGGGGATGGGTGAAGGGGGCAAGCTTGACATTCTAAAGATAGAATCTCACAAAACTGTCCACGTTGCTTGCTGAAGGGAGGTTGGGAGAGAAGAGAGAGGTTGGAGGAAGAGACAGAGAGTGAGAAAAAAAGAGAGAGGGAGAGAGGGACAGGGGGAAGAGAGAGAGGGAGAGAGAGGAGTCCTCAAAAAGAATGGAACCAATTTAAGAAGCCCCGTAGCCACGTCCCTCCCCCCTCGGCTCCCTCCCCTGCTCCCCCGCAGTCTCCTCCCAGCACTGAGTCCCGGGCCCCTAGCCCTAGCCCTCCCATTGGTGGAGACGTTTTTGGAGGCACCCTCCGGCTGGGGAAACTTTTCCCATATAAATAAGGCAGGTCTGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCAGCAGGAGGTTTCGACTAAGTTGGAGGGAACGGTCCACGATTGCATGCCTGCGCCCGCCAGGTGATACCTCCGCTGGTGACCCAGGGGCTCTGCAACACAAGGAGTCTGCATGTCTAAGTGGTAGACATGCTCAGCTTTGTGGATACGCGGACTCTGTTGCTGCTTGCAGTAACTTCGTGC
　上記（2-2）において、置換、欠失、付加又は挿入する１又は数個の塩基の数は、好ましくは１～20個程度、より好ましくは１～15個程度、さらに好ましくは１～10個程度、特に好ましくは１～５個程度とすることができる。配列番号９で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列であって、コラーゲン1a2プロモーターの機能を有するものが包含される。
　ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、配列番号９の塩基配列との塩基配列の同一性が90％以上となるように１～195個程度、好ましくは同一性が95％以上となるように１～97個程度、より好ましくは同一性が97％以上となるように1～58個程度、さらに好ましくは同一性が98％以上となるように１～39個程度、特に好ましくは同一性が99％以上となるように１～19個程度とすることができる。
　上記（2-3）において、塩基配列の同一性は、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上とすることができる。塩基配列の相同性若しくは同一性は、100％未満とすることができる。塩基配列間の相同性及び同一性は、BLAST等の公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。配列番号９で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列であって、コラーゲン1a2プロモーターの機能を有するものが包含される。
　上記（2-4）において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「1×SSC（0.9M NaCl，0.09M クエン酸三ナトリウム）又は6×SSPE（3M NaCl，0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA・2Na，pH7.4）中の42℃でハイブリダイズさせ、さらに42℃で0.5×SSCにより洗浄する」条件が、ストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。このような条件は、例えば、M. R. Greenら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2012）に記載されている。配列番号９で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コラーゲン1a2プロモーターの機能を有するものが包含される。
　本発明における軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列は、下記（3-1）～（3-4）のいずれかである。
（3-1）配列番号１０で表される塩基配列。
（3-2）配列番号１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列。
（3-3）配列番号１０で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列。
（3-4）配列番号１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
　上記（3-1）において、配列番号１０で表される塩基配列であって、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーターの機能を有するものが包含される。なお、配列番号１０は、ヒトの軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列において、ヒトとマウスでの保存度が高いことが知られている部分を含む以下の配列である。
配列番号１０：
TTCACATGCTTCCCTCCACCAAAACTGCCCTCACCTTTTCCCTCTGCTGATCCAAGTCCTCCTTTTCTTTTATGTCTGTCTCCTTGCTACCTCCTCCAGGAAGCCCTCGGTGACTTCTCTGTAGGCTCCCCAGAAAACATATCTGGCTCTGAGTCTAGATTCACCCCTGCCCTCGGGCAGTGGCCTTAGGCCAGTCACTTTTTCTCTCTGGGCCTCAGTTTCTCTGTCTATAGAATAGACGCTGTGAGTACTGGAAGGTGGGAGTGGAGAGTGTTAACTGATTGCAGGAGGTTAAGGGGTTTTGTAACTCCAGAGTGTGGCTGGCCAGTTAGCGGTAACTTTTATTTTTATTACAGGCTGTTCCCACAGCAGCTGGAGCACAGTTTGGAAGGTATGGCACAGCCTGGACAAACAGAAGCCCCGGACCTCCCCTTGCTAGAGCCCTTTAACTTGCTCCCCTCCAGATGGGGGCCTCACACCCCATTGCGCAGATTGGAAAACCAAGTGGGCCTGTCCCCTTGGACAGGGGTTGGGGCAAGATCCTGAACGCTGTCCCCTCCTCCACCAGCCGAGGGACCATGGGGAGGGGAGGGAACACCAGCAATGAGTTGGGTTGGGGGGAGTCATTTGCAGCCCTCCAGCGTTGGGGCCAGAAGCGGCCTCCTTGGACAGAGGCAGGAAAATTGAGAGTCCCAGGTCTCAACTGCCCCTCCCCTATTTTCCATTCATCATCATAATCATCATTACTATTAATCATTAATTAATAATTATTAACTTATTACCTCCATTGTGCAAGGGAGGAATTACGCCTGGGTAATTTTTGTACTTTTAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTAGCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGGTGATCTGCCCGCCTTGGCTTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACCGCACCCAGCAACTTACCCAGTTTTGAAGCACTTCAGGAGGAGTGGAGGGCCAGTCAGTCTGATCCATAGTGGGTGGACCTATTTTTTCAGACGCTGGTGACTCTGTTTCCCGAAGTGTGAGCTGAGAGCGTGGCCATGGAGCCTGCCTTGTTTGGAACTGGAACTCAGGTTTGGCATACAGCAAGCACTCAATCAATCAATCAATCAATGAGCTGAATGCTATGGCTGGATCCTGTAATCCCAGTTATGTGGGGAGTATCGCTTGAGGCCGGGAGTTTGAGACTACTAGCCTGCAGGACATAGCCAGACCCGGTCTCTAAAAATAAAAATAAAAATAAAAATAAATTAGCTGGACTTGGTGGTGCGGGCTTGTAGTCCCAGCTACATGGGAGACTGAAGCAAGAGGATGCGATACAGCCACACCCCGTCACACACACACACACACACACACACAGACGCACACACACAGTGAATGAAAGTGGGGGCAGTACCCCCTGACTCCCTGCCCCACCAGCTCTCTCCACAGACCCCGGGACTCAGTTTCCCCACCATGTCGGATTCAGCCGCGGGCGACTTCGCGGGGCATTCCGGGCGGGGACTTGAACGCAGGGGCCAGCGCCATCTGTTTACCTTGAGGCTGGACGTTGGGCAGGGCTGTGGTGGGCCGTCCCTGGGGCCGGCCGTGCCTTGGGGATAAATAGGCCCCGCGGGCCTCGTGGGCGGTAGAAAGCGAGCAGCCACCCAGCTCCCCGCCACCGCC
　上記（3-2）において、置換、欠失、付加又は挿入する１又は数個の塩基の数は、１以上の整数であれば特に限定されない。例えば、１～数十個程度、好ましくは１～20個程度、より好ましくは１～15個程度、さらに好ましくは１～10個程度、特に好ましくは１～５個程度とすることができる。配列番号１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列であって、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーターの機能を有するものが包含される。
　ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、配列番号１０の塩基配列との塩基配列の同一性が90％以上となるように１～170個程度、好ましくは同一性が95％以上となるように１～85個程度、より好ましくは同一性が97％以上となるように1～51個程度、さらに好ましくは同一性が98％以上となるように１～34個程度、特に好ましくは同一性が99％以上となるように１～17個程度とすることができる。
　上記（3-3）において、塩基配列の同一性は、90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上とすることができる。塩基配列の相同性若しくは同一性は、100％未満とすることができる。塩基配列間の相同性及び同一性は、BLAST等の公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。配列番号１０で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列であって、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーターの機能を有するものが包含される。
　上記（3-4）において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「1×SSC（0.9M NaCl，0.09M クエン酸三ナトリウム）又は6×SSPE（3M NaCl，0.2M NaH2PO4, 20mM EDTA・2Na，pH7.4）中の42℃でハイブリダイズさせ、さらに42℃で0.5×SSCにより洗浄する」条件が、ストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。このような条件は、例えば、M. R. Greenら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2012）に記載されている。配列番号１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーターの機能を有するものが包含される。
　本発明のrAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドには、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれる。コードするタンパク質は、１種類であっても２種以上であってもよいが、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含めて、rAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドの全長は野生型ゲノムと同等程度であることが好ましい。すなわち、全長が野生型の全長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。また、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb 、さらに好ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。　
　一実施形態において、上記目的のタンパク質としては、リプログラミング因子があげられる。リプログラミング因子としては、Gata4、Hand2、Tbx5、Mef2c、Mef2c-TAD、MYOCD（ミオカルディン）、ASCL1（Achaete-scute ファミリーbHLH転写因子１）、miR-133（マイクロRNA）等があげられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明のrAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチド中にコードされるリプログラミング因子は、Gata4、Hand2、Tbx5、Mef2c、Mef2c-TAD、MYOCD、ASCL1、及びmiR-133からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、２種以上であることがより好ましく、３種以上であることがさらに好ましく、４種以上であることが特に好ましい。一実施形態において、本発明のrAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドは、Gata4とHand2とTbx5とをコードし、さらにMef2c又はMef2c-TADをコードすることが好ましく、Gata4とHand2とTbx5とMef2c-TADをコードすることがより好ましい。
　Gata4
　Gata4ポリペプチドは多くの遺伝子のプロモーター領域に存在するGATAモチーフを認識して結合するGATAファミリー亜鉛フィンガー転写因子のメンバーである。様々な種に由来するGata4ポリペプチドに関するアミノ酸配列及びGata4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が当該分野で知られている。Gata4ポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_002043（Homo sapiens）、NP_032118（Mus musculus）、NP_653331（Rattus norvegicus）等があげられる。Gata4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_002052（Homo sapiens）、NM_008092（Mus musculus）、NM_144730（Rattus norvegicus）等があげられる。
　いくつかの実施形態において、Gata4ポリペプチドのアミノ酸配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　いくつかの実施形態において、Gata4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　一部の実施形態において、Gata4ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチド（又はそのような機能的等価物をコードするヌクレオチド配列）を使用することができる。例えば、一部の実施形態においては、Gata5ポリペプチド（又はGata5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。他の実施形態において、Gata6ポリペプチド（又はGata6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。
　Gata5ポリペプチドのアミノ酸配列及びGata5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。Gata5ポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_536721（Homo sapiens）、NP_032119（Mus musculus）、NP_001019487（Rattus norvegicus）等があげられる。Gata5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_080473（Homo sapiens）、NM_008093（Mus musculus）、NM_001024316（Rattus norvegicus）等があげられる。
　Gata6ポリペプチドのアミノ酸配列及びGata6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。Gata6ポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_005248（Homo sapiens）、NP_034388（Mus musculus）、NP_062058（Rattus norvegicus）等があげられる。Gata6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_005257（Homo sapiens）、NM_010258（Mus musculus）、NM_019185（Rattus norvegicus）等があげられる。　
　一部の実施形態においては、Gata4ポリペプチドの好適な機能的等価物はGata5ポリペプチド又はGata6ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
　一部の実施形態においては、Gata4ポリペプチドの機能的等価物をコードするヌクレオチド配列はGata5ポリペプチド又はGata6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　Hand2
　Hand2ポリペプチドは、ヘリックスループヘリックス転写因子ファミリーに属し、心臓の発生に重要な働きをすることが知られている。
　様々な種に由来するHand2ポリペプチドに関するアミノ酸配列、及びHand2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が当該分野で知られている。Hand2ポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_068808.1（Homo sapiens）、NP_034532.3（Mus musculus）、NP_073187.1（Rattusn orvegicus）等があげられる。Hand2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_021973.3（Homo　sapiens）、NM_010402.4（Mus musculus）、NM_022696.2（Rattusn orvegicus）等があげられる。
　いくつかの実施形態において、Hand2ポリペプチドのアミノ酸配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　いくつかの実施形態において、Hand2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　Tbx5
　Tbx5（T-ボックス転写因子5）は一部の遺伝子のプロモーター領域におけるT-ボックスを認識して結合する転写因子であり、そして当該プロモーターに作動可能に連結した遺伝子の転写を活性化する。
　様々な種に由来するTbx5ポリペプチドに関するアミノ酸配列、及びTbx5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が当該分野で知られている。Tbx5ポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、CAA70592.1（Homo sapiens）、NP_000183（Homo sapiens）、NP_035667（Mus musculus）、NP_001009964.1（Rattusn orvegicus）等があげられる。Tbx5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、Y09445（Homo　sapiens）、NM_000192（Homo sapiens）、NM_011537（Mus musculus）、NM_ 001009964（Rattusn orvegicus）等があげられる。
　いくつかの実施形態において、Tbx5ポリペプチドのアミノ酸配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　いくつかの実施形態において、Tbx5ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　Mef2c
　Mef2c（筋細胞特異的エンハンサー因子2c）は多くの筋特異的遺伝子の調節領域に存在するMEF2エレメントに特異的に結合する転写活性化物質である。Mef2cは、例えばSer-59及びSer-396上のホスホリル化；Lys-391上のスモイル化；及びLys-4上のアセチル化等といった翻訳後修飾がされていてもよい。様々な種に由来するMef2cポリペプチドのアミノ酸配列及びMef2cポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。Mef2cポリペプチドに関するアミノ酸配列及びMef2cポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号の一例を以下に示す。
　Mef2cポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_001124477（Homo sapiens）、NP_002388（Homo sapiens）、NP_079558.1（Mus musculus）、NP_001164008（Mus musculus）、XP_001056692（Rattus norvegicus）等があげられる。Mef2cポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_001131005（Homo sapiens）、NM_002397（Homo sapiens）、NM_025282（Mus musculus）、NM_00 1170537（Mus musculus）、XM_001056692（Rattus norvegicus）等があげられる。
　いくつかの実施形態において、Mef2cポリペプチドのアミノ酸配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　いくつかの実施形態において、Mef2cポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、上記のGenBankエントリのうちの一つに示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　一部の実施形態においては、Mef2cポリペプチドに機能的に等価なポリペプチド（又はそのような機能的等価物をコードするヌクレオチド配列）を使用する。例えば、一部の実施形態においては、Mef2aポリペプチド（又はMef2aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。他の実施形態において、Mef2bポリペプチド（又はMef2bポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。他の実施形態 において、Mef2dポリペプチド（又はMef2dポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）を使用する。　
　Mef2aポリペプチドのアミノ酸配列及びMef2aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。Mef2aポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_005578.2（Homo sapiens）、NP_00 1124398.1（Homo sapiens）、NP_001124399.1（Homo sapiens）、NP_001124400.1（Homo sapiens）等があげられる。Mef2aポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_005587（Homo sapiens）、NM_001130926（Homo sapiens）、NM_001130927（Homo sapiens）、NM_001130928（Homo sapiens）等があげられる。
　Mef2bポリペプチドのアミノ酸配列及びMef2bポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。Mef2bポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_001139257.1（Homo sapiens）、NP_005910.1（Homo sapiens）、NP_032604.2（Mus musculus）、NP_001038949.1（Mus musculus）等があげられる。Mef2bポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_001145785（Homo sapiens）、NM_005919（Homo sapiens）、NM_008578（Mus musculus）、NM_001045484（Mus musculus）等があげられる。
　Mef2dポリペプチドのアミノ酸配列及びMef2dポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は当該分野で知られている。Mef2dポリペプチドに関するアミノ酸配列のアクセッション番号としては、例えば、NP_005911.1（Homo sapiens）、NP_598426.1（Mus musculus）等があげられる。Mef2dポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のアクセッション番号としては、例えば、NM_005920（Homo sapiens）、NM_133665（Mus musculus）等があげられる。
　一部の実施形態においては、Mef2cポリペプチドの好適な機能的等価物はMef2aポリペプチド、Mef2bポリペプチド、又はMef2dポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。
　一部の実施形態においては、Mef2cポリペプチドの機能的等価物をコードする好適なヌクレオチド配列はMef2aポリペプチド、Mef2bポリペプチド、又はMef2dポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　Mef2c-TAD
　Mef2c-TADは、Mef2cとMYODのトランスアクティベーションドメイン（TAD）とを融合させた、Mef2cの下流にある遺伝子を過剰発現させる人工転写因子である。Mef2c-TADについては、例えばKojima et al. (2023). Stem Cell Reports 18, 1274-1283.に記載されている。Mef2c-TADのマイクロアレイデータ及びRNA配列データはアクセッション番号GSE196293及びGSE222869を参照することができる。
　いくつかの実施形態において、Mef2c-TADポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　いくつかの実施形態において、Mef2c-TADポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
　他の実施形態において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、マーカー遺伝子があげられる。マーカー遺伝子を組み込んだポリヌクレオチドをパッケージングしたrAAVベクターを被験動物に投与し、当該マーカー遺伝子を発現する細胞を確認することにより、遺伝子導入された細胞数及び分布を確認することができる。上記マーカー遺伝子としては、公知のものを特に制限なく用いることができる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子、LacZ遺伝子、発光タンパク質遺伝子（ホタルルシフェラーゼ等）等が挙げられる。
　その他、目的のタンパク質としては、例えば、Creリコンビナーゼ等があげられるが、特に限定されない。
　目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する方法として、PCR等の核酸増幅法を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該ポリヌクレオチドのcDNAのうち、5’側及び3’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムDNA又はcDNA等を鋳型にしてPCR等を行い、両プライマー間に挟まれるDNA領域を増幅する。これによって、本発明に係るポリヌクレオチドを含むDNA断片を大量に取得できる。
　本発明のrAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドは、AAVゲノムの5’側及び3’側に位置するITR配列の間に位置する内部領域（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方又は両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、リプログラミング因子等）及びペリオスチンプロモーター配列、コラーゲン1a2プロモーター配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列からなる群より選択される少なくとも１種を含む遺伝子カセットで置換したポリヌクレオチドであることが好ましい。当該ポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端には、それぞれITR配列を有することがより好ましい。　
　アデノ随伴ウイルスのITRは、おおよそ145塩基の鎖長の領域であり、複製開始点等として機能する。本発明において、当該ポリヌクレオチドのITR配列は、複製開始点としての機能や宿主細胞への遺伝子挿入等の、本来のITRの機能の少なくとも一つを有するものである限り、いずれのセロタイプのAAV由来のものであってもよいが、好ましくはAAV2に由来するものである。
　一実施形態において、5’側ITR配列は、配列番号６に示す塩基配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有する塩基配列を含む。一実施形態において、3’側ITR配列は、配列番号７に示す塩基配列と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有する塩基配列を含む。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列をとるため、本発明のrAAVベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転していてもよい。
２．rAAVベクターの調製
　本発明のrAAVベクターを調製する方法としては、公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、AAVヘルパープラスミド（プラスミド１）、及びrAAVベクタープラスミド（プラスミド２）を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含む。当該方法はさらに、アデノウイルスヘルパープラスミドを培養細胞にトランスフェクトする工程、又は、アデノウイルスを培養細胞に感染させる工程を含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、及び培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むことができる。
　上記AAVヘルパープラスミド（プラスミド１）は、AAV-DJカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びRepタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。AAV-DJカプシドタンパク質、及びRepタンパク質は、１種、又は２種以上のプラスミドに組込まれていてもよい。また、これらのAAV-DJカプシドタンパク質及びRepタンパク質のうちの１種以上がrAAVゲノムに含まれてもよい。本発明において、AAV-DJカプシドタンパク質及びRepタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、AAVヘルパープラスミドとして用いられることが好ましい。また、上記ポリヌクレオチドは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動可能に結合されることが好ましい。このようなプロモーター配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、EF-1αプロモーター、SV40プロモーター等を適宜使用することができる。さらに、AAVヘルパープラスミドは、公知のエンハンサー配列、Kozak配列、ポリA付加シグナル配列等を適宜含み得る。
　本発明において用いられるRepタンパク質は、ITR配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へとrAAVゲノム（又は野生型AAVゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能等公知の機能を野生型AAVのRepタンパク質と同程度に有する限り、野生型AAVのRepタンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。一実施形態において、AAV-DJのRepタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。本発明において、好ましくは、公知のAAV-DJ由来のRepタンパク質が使用される。
　本発明において用いられるRepタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ITR配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へとrAAVゲノム（又は野生型AAVゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能等公知の機能を野生型AAVのRepタンパク質と同程度に有するRepタンパク質をコードする限り、野生型AAVのRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。一実施形態において、AAV-DJのRepタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％の配列同一性を有するヌクレオチド酸配列を含んでもよい。本発明において、好ましくは、公知のAAV-DJ由来のRep遺伝子が使用される。
　rAAVベクタープラスミド（プラスミド２）は、２つのITR配列の間に配置された目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドである。プラスミド２は、ペリオスチンプロモーター、コラーゲン1a2プロモーター、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーターからなる群より選択される少なくとも１種と作動可能である位置に目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Kozak配列、ポリA付加シグナル配列等を適宜含み得る。
　アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス由来因子をコードするプラスミドである。AAVはヘルパー依存性ウイルスであるため、本発明のrAAVベクターを調製するためには、培養細胞に感染する際に、アデノウイルス等のヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの共感染がない場合、AAVは、ウイルスゲノムを宿主細胞染色体に挿入するが、挿入されたウイルスゲノムに由来する感染性AAVベクターは生成されない。その挿入されたウイルスゲノムを有する宿主がヘルパーウイルスに感染される場合、組み込まれたゲノムに由来する感染性AAVベクターを生じ得る。
　本発明のrAAVベクターの調製において、アデノウイルスヘルパープラスミドが、上記プラスミド１及びプラスミド２と同時に培養細胞に導入され得る。本発明において、好ましくは、アデノウイルスヘルパープラスミドは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養細胞293Tを用いる場合、ヒトAdV由来のアデノウイルスヘルパープラスミドを用いることができる。このようなアデノウイルスヘルパープラスミドとして、市販品を使用することができる。
　本発明のrAAVベクターの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトランスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法は、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等に記載されている。
３．本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物
　別の実施形態において、本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物を提供する。
　一実施形態において、本発明のrAAVベクターは、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含む。このようなrAAVベクターを含む医薬組成物は、種々の心臓障害（例えば、心筋梗塞、心不全、不整脈等）に対する治療に有用である。当該医薬組成物は、心機能改善剤として用いることができる。リプログラム因子としては、上記に記載のものを好ましく用いることができる。
　本発明の医薬組成物における、上記のrAAVベクターの含有量は、医薬組成物100質量部に対して、0.001～100質量部程度とすることができる。すなわち、上記のrAAVベクターそのものを、本発明に係る医薬組成物としてもよい。
　本発明の医薬組成物には、薬学分野の組成物を製造する際に使用される薬学的に許容可能な担体又は添加物を配合してもよい。この様な担体あるいは添加物は公知であり、その具体例として、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、又は甘味料等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は上記の担体又は配合物を適宜組み合わせてあらゆる剤形とすることができる。具体的には、具体的な剤形としては、静脈注射剤、輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射剤等の注射剤；素錠、糖衣錠、フィルムコート錠、腸溶錠、口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠、溶解錠等の錠剤；硬カプセル錠、軟カプセル錠等のカプセル剤；発泡顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤等を含む顆粒剤；散剤；エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤等の経口液剤；シロップ用剤等のシロップ剤；経口ゼリー剤等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の使用対象動物は、生体であればヒトに限らずあらゆる動物個体を対象とできる。例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、サル、チンパンジー等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物；その他保護を必要とするあらゆる動物種等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与方法は、特に限定されず、上記の投与対象、剤形等を適宜勘案して公知の投与方法を採用すればよい。具体的には、心臓組織内、静脈内、経口、筋肉内、動脈内等へ投与する方法が挙げられ、心臓組織内又は静脈内への投与が好ましく、心臓組織内へ直接投与することがより好ましい。一実施形態において、本発明の医薬組成物の投与方法は、本発明の医薬組成物を個体の線維芽細胞に接触させることを包含する。「接触」は、本発明の医薬組成物を、治療部位又はその近傍（例えば心臓の中又は周囲）において、個体に投与することを含む。投与の方法としては、例えば、末端の動脈に挿入したカテーテルを心臓患部近傍まで導き、カテーテルの先端から線維化した患部組織に本発明の医薬組成物を注入して接触させる方法が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢、症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、ヒトであれば、通常は0.1～50mg/kg程度とすればよく、投与対象動物がマウスであれば、通常は0.1～50mg/kg程度とすればよい。また、投与単位としてvg（vector genome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、109～1014vg、好ましくは1010～1013vg、さらに好ましくは1010～1012vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。その他の投与対象動物であれば、上記のヒト及びマウスにおける投与量を基に適宜設定することができる。また、本発明の医薬組成物の投与は、上記の量を一日に一度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２～３週毎、毎月、隔月又は２～３ヶ月毎でもよい。
４．本発明のrAAVベクターを用いた遺伝子発現
　一実施形態において、本発明のAAVベクターを用いた遺伝子発現方法を提供する。当該方法は、本発明のrAAVベクターを投与することを含む。投与の対象としては、個体であってもよく、組織、細胞等であってもよい。本発明のAAVベクターは、活性化された心臓線維芽細胞において目的の遺伝子を発現させることができる。活性化された心臓線維芽細胞は、心筋梗塞後の心臓線維芽細胞であることが好ましい。一実施形態において、個体は非ヒト哺乳動物である。
　一実施形態において、当該遺伝子発現方法は、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むrAAVベクターを投与することを含む。リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドとしては、上記に記載のものが好ましく用いられる。このようなrAAVベクターを用いた当該遺伝子発現方法により、活性化された心臓線維芽細胞から心筋細胞が誘導される。
５．本発明のrAAVベクターの調製キット
　本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVベクターを調製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、上記のプラスミド１、及びプラスミド２を含むことができる。また、本発明のrAAVベクターを調製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構成（例えば、アデノウイルスヘルパープラスミド等）もさらに含むことができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　以下に示す実験はすべて、筑波大学の動物実験倫理委員会の承認を受けて実施された実験である。
［材料及び方法］
（AAVベクターの作製）
　AAVベクターは、Kurosaki et al., 2017及びMizukami et al., 2006に記載された方法により作製した。組換えAAVベクタープラスミドは、GFP、Cre、GATA4、HAND2、TBX5、MEF2C、及びMEF2C-TADのコード領域をPCRで増幅することによって作製した。増幅した上記DNAをAAV-CMV（Agilent Technologies）及びAAV-Postn（ペリオスチン）（Piras et al., 2016） にサブクローニングした。また、増幅したGFPのDNAをAAV-COMP及びAAV-Col1a2にサブクローニングした。AAV-DJ Rep-CapはCell Biolabs, Inc.から購入した。パッケージングプラスミド(AAV1～10, DJ)とヘルパープラスミド(pHelper for AAV1～10：Agilent Technologies、pHelper for AAV-DJ：Cell Biolabs Inc.)を、リン酸カルシウム沈殿を用いてHEK293細胞に共導入した。ウイルス含有培地を3日後に回収し、細胞をPBSに再懸濁した。AAVベクターは、ポリエチレングリコール沈殿と塩化セシウムを用いた超遠心分離を用いて精製した。各ベクターの力価（VG）は、リアルタイムPCR（Thermal Cycler Dice（登録商標） Real Time System III, Takara Bio Inc.）で測定した。なお、本実施例にて使用したAAV-DJカプシドタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。AAV-DJカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を配列番号２に示す。ペリオスチンプロモーターのポリヌクレオチド配列を配列番号３に示す。Mef2c-TADポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に示す。Mef2c-TADポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を配列番号５に示す。軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーターのポリヌクレオチド配列を配列番号９に示す。コラーゲン1a2プロモーターのポリヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。
（マウス）
　遺伝子改変Tcf21 iCre/Tomatoマウスは、Tcf21 iCreマウスとR26R-tdTomatoマウスとの交配により得た。また、遺伝子改変Postn MCM/Tomatoマウスは、Postn MCMマウスとR26R-tdTomatoマウスとの交配により得た。ICR（Jcl：ICR）マウスは日本クレア株式会社から購入した。トランスジェニックマウスに免疫不全及び他の健康問題は観察されず、本実験開始まで他実験及び薬物未使用の状態であった。すべての動物を、12時間/12時間の明暗サイクルを持つ専用の飼育SPF(Specific pathogen free)施設にて群飼いし、餌と水に自由にアクセスできる状態で、毎日モニターした。SPFグレードを維持するために定期的に健康状態をチェックした。外科処置の対象となった動物は、同じ条件下でSPF施設に移した。
（マウス心筋梗塞モデル）
　実験は8週齢の雌雄マウスを無作為に割り付けて行った。麻酔の導入と維持にはイソフルランを使用した。低体温を防ぐためにホットマットを使用した。経口気管挿管を行い、皮膚と心臓上の肋間切開から胸部アプローチを行った。心臓を露出し、7-0絹縫合糸を用いて左冠動脈を結紮した。冠動脈結紮後すぐに、60μLのAAVベクター含有溶液（1×1011 VG/マウス）を29ゲージの注射針で梗塞と境界域の境界に3箇所注射した。全身投与では、冠動脈結紮直後に尾静脈からAAVベクター含有溶液（1×1012 VG/マウス）200μLを注入した。マウスを操作する人は、この試験について盲検化されていた。心筋梗塞後の死亡率は10％未満と記録された。心エコー検査は術後2日目に行い、駆出率（EF）が45％以上のマウスは解析から除外した。
（ラット初代培養心筋細胞及びラット初代培養心臓線維芽細胞）
　出生後のSprague-Dawleyラット（P1-3）由来の細胞を、パーコール勾配遠心法を用いて行った遠心分離に基づいて心筋細胞と心臓線維芽細胞に分け、プラスチックディッシュに付着させて心筋細胞を得た （Haginiwa et al., 2019）。細胞を10％FBS添加DMEM/Medium199に再懸濁し、37℃、5％CO2で培養し、培地は2-3日ごとに交換した。ラット心筋細胞及び心臓線維芽細胞は、翌日に上記ベクター（2.5×105 VG/細胞）で形質導入し、さらに1週間培養した。
（マウス胎児線維芽細胞 (MEF)）
　妊娠12.5～13.5日のマウス胎児を回収し、無菌的に実体顕微鏡下で頭部、心臓、その他の内臓を取り除き、残った胴体部を3～5個体分集めてハサミで細かく刻んだ。得られた組織片を、あらかじめ37℃に予温した0.25%トリプシン/EDTA溶液15 mLに移し、37℃で20分間インキュベートし、反応停止のために同量のFBS（15 mL）を加え、ピペッティングを数回行って組織を解離した。解離後の懸濁液を遠心し、得られたペレットを10 mLのMEF培地に再懸濁し、再懸濁した細胞を100 mmディッシュに播種し、5% CO２、37℃の条件下で培養した。
　なお、培地は、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に10%ウシ胎児血清（FBS）、1%ピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸（NEAA）、1%抗生物質・抗真菌剤混合液（PSA）を加えて調製した。
（タモキシフェン投与）
　Tcf21 iCre/Tomatoマウスに、クエン酸タモキシフェンを5日間連続で腹腔内投与した（2 mg/日；Millipore Sigma, T5648）。タモキシフェンは90％ピーナッツ油（Millipore Sigma, P2144）と10％エタノールに溶解し、50mg/mLの濃度とした。MI手術はタモキシフェン投与最終日の7日後に行った。Postn MCM /Tomatoマウスでは、タモキシフェン含有フードペレットを心筋梗塞手術後2週間継続して投与した。フードペレットは、クエン酸タモキシフェン0.4g（T2510、東京化成工業）及び標準マウスチャウ（MF、オリエンタル酵母工業）1kgあたりショ糖49.6gを添加して調製した。
（試験管内でのAAVベクターの感染）
　一次培養した新生児ラットの心筋細胞及び心臓線維芽細胞を指定のAAVベクター（2.5×105 VG/細胞）で形質導入し、さらに1週間培養した。細胞をFACS及び免疫蛍光で分析し、AAVの細胞トロピズムを決定した。
（インビボでのAAVベクターの感染）
　心臓への直接注射では、1×1011 VGのAAVベクターを心筋梗塞後又は無傷のマウスの心臓に注射した。全身投与では、1×1012 VGのAAVベクターをマウスの尾静脈に注射した。
（蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析）
　マウスをCO2吸入で安楽死後、心臓を直ちにカニュレーションして冷却PBS (50 mL) で灌流した。心臓を摘出後、心房と弁を切離して心室を分離し、心室心筋を氷上の滅菌シャーレ上で1 mm程度のサイズに切断した。酵素溶液 3 mL を含む 10 mL チューブに移し、37℃のウォーターバスで 45 分間インキュベートし、15 分ごとにピペッティングした。酵素液には、2 mg/mL collagenase type IV (Worthington Biochemical,、CLS-4) と 1.2 U/mL Dispase II (Sigma,、255-914-4) が含まれていた。最終ピペッティング後、細胞懸濁液を 40 μm セルストレーナーで濾過した。Debris removal solution（Miltenyi Biotec,、130-109-398）による遠心分離でデブリを除去後、RBC lysis buffer（pluriSelect,、60-00050-11）を用いて赤血球を除去した。
　その後、GFP発現を検出するために、フローサイトメーター（Beckman Coulter, CytoFLEX S）とFlowJoソフトウェア（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）を用いて細胞を解析した。 
（免疫細胞化学）
　細胞を4％PFAで25℃、15分間固定し、5％正常ヤギ血清ブロッキング液（Vector Laboratories, S-1000）でブロックし、0.2％TritonX-100（Sigma）で10分間透過処理し、GFPに対する一次抗体とインキュベートした。その後、Alexa Fluor 488を結合させた二次抗体とインキュベートした。観察は、オールインワン蛍光顕微鏡（Keyence, BZX810）を用いて行った。
（免疫組織化学）
　マウスの心臓、肝臓、肺、骨格筋を4％PFAで一晩固定した後、20％スクロース溶液で置換し、OCTに包埋し、液体窒素で凍結した。凍結切片は7μmの厚さで切り取った。切片をα-アクチニン（Sigma, A7811）、CD31（Abcam, ab28364）、CD45（Thermo, 30-F11）、COL1（Millipore, Millipore Sigma, AB765P）、COMP（PGI, 28369-1-AP）、cTnT（Thermo, MS-295-P1）、GFP（MBLライフサイエンス, 598）、及びSMMHC（Biomedical Technologies, Madrid, Spain, BT562）に対する一次抗体で染色した。Alexa 546又はAlexa 488を結合させた二次抗体とインキュベートし、DAPI（Thermo, D21490）を用いて細胞核を染色した。共焦点顕微鏡はLSM800顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて行い、標準プロトコールに従ってZスタック画像を収集した。測定と計算は盲検下で行った。Comp+ の面積はAdobe Photoshopの解析ツールを用いて測定した。免疫陽性細胞の比率は、セクションごとに無作為に選んだ6フィールドで測定した。各マウスのデータは30から50の切片をもとに計算し、1群につき5匹のマウスを観察した。各マウスについて合計36,000-60,000個の細胞をカウントした。
（線維化領域の測定）
　マッソン三色染色は、標準的な手順に従ってパラフィン包埋切片に対して行った。瘢痕の大きさを測定するために、Adobe Photoshopを用いて、左心室内の3つのレベル（心尖部、中間部、基部）にまたがる横断切片の瘢痕面積（青色）と健常域面積（赤色）を測定した。各レベルで3枚の組織切片（合計9切片）を測定し、1群につき5匹のマウスを観察した。測定と計算は盲検下で行った。
（心エコー検査）
　心機能は心エコー（Vevo 2100, Visual Sonics）を用いて評価した。心エコーはイソフルラン麻酔下で行った。麻酔深度は心拍数が約500/分になるように調整した。左室短軸像を描出し、乳頭筋レベルでMモードを測定して左室拡張末期径と収縮末期径を求め、駆出率（EF）を算出した。駆出率（EF）と短縮率（FS）はTeichholtzの式を用いて算出した。
（RNA塩基配列解析）
　RNA塩基配列解析は、Tsukuba i-Laboratory LLPを用いて行った。TRIzol（Invitrogen社）を用いて、PBS及びGHT/M-TAD注射マウスの心筋梗塞後4週目の左心室境界梗塞部から、製造元のプロトコールに従って全RNAを抽出した（n = 5ずつ）。RNAシーケンシングはNextSeq500（Illumina）を用いて行った。リードはmm10マウスリファレンスゲノムにマッピングし、CLC Genomics Workbench (CLC-GW, Version 10.1.1; Qiagen, Venlo, Netherlands)を用いて定量した。正規化は分位数法を用いて行い、ヒートマップ生成のために1加算した後、正規化値をlog2変換した。ヒートマップはMorpheusソフトウェア（https://software.broadinstitute.org/morpheus）を用いて作成した。遺伝子発現差解析は、CLCにおけるDGEのEmpirical Analysisを用いて行った。主成分分析（PCA）はBioJupiesソフトウェア (Torre et al., 2018)を用いて行った。相対発現は、Ctrl群に対する比として正規化した発現値を用いて解析した。
（統計）
　統計解析はGraphPad Prism version 8.4.3 (GraphPad Software Inc.)を用いて行った。統計的有意性は、対応のないt検定又は一元配置分散分析、Tukey's又はDunnett's post-hoc検定を用いて調べた。p値＜0.05の差を有意とみなした。
［比較例１］CMVプロモーターを用いたin vitro及びin vivoスクリーニング（in vitro）
　AAVカプシドの心臓線維芽細胞トロピズムを調べるため、10種類の天然型（AAV1～10）と1種類のキメラ型（AAV-DJ）をスクリーニングした。構成的CMVプロモーターの制御下でGFPを発現する11種類のAAVベクター血清型（AAV-CMV-GFP）を感染多重度2.5×105 VG/cell（ベクターゲノム/細胞）でin vitroで初代培養ラットCF及びCMに導入した。導入効率は、1週間後に蛍光活性化セルソーティング（FACS）と免疫蛍光（IF）を用いて決定した（図１）。FACS解析の結果、AAV1、AVV6、AVV-DJが11種類の血清型の中で心臓線維芽細胞において高い形質導入効率を示した（図２）。心筋細胞の遺伝子治療に広く用いられているAAV2とAAV9は、in vitroでは心臓線維芽細胞での導入効率が低かった。対照的に、AAV-DJを含むほとんどのAAVベクターは、in vitroで心筋細胞において中程度の導入効率（～40％）を示した（図３）。免疫蛍光染色により、AAV1、AAV6、及びAAV-DJは心臓線維芽細胞において強いGFP発現を示し、AAV1とAAV4は培養中の心筋細胞において強いGFP発現を示した（図４）。
（in vivo）
　冠動脈結紮による心筋梗塞後のICRマウス心臓にAAV-CMV-GFP（1×1011 VG/マウス）を直接注入することにより、in vivoにおけるAAVカプシドの細胞トロピズムを決定した。心筋細胞及び非筋細胞におけるGFP発現を、免疫組織化学染色（図１）を用いて2週間後に解析した。注目すべきことに、免疫組織化学染色は、AAV6とAAV-DJを含むすべてのAAVカプシドが、非筋細胞よりもむしろα-アクチニン＋CMにおいてGFPを優先的に発現することを明らかにした（図５）。AAV-DJ-CMV-GFPのin vivoでの非筋細胞及び心筋細胞への導入効率は、それぞれ～20％及び～80％であった（図５）。これらの結果は、AAVベクターのトロピズムがin vitroとin vivoの条件下で異なる可能性を示唆しており、これは先行研究（Guanら、2015；Zincarelliら、2010）と一致している。
［実施例１］AAV-DJ-Postnベクターを用いたin vivoでの心臓線維芽細胞での遺伝子発現　ペリオスチン（Postn）プロモーター駆動型Creリコンビナーゼ（AAV-Postn-Cre）を含むAAVコンストラクトを作製し、AAV6、9、DJカプシドにパッケージした（図６）。AAV6-Postn-Creベクター、AAV9-Postn-Creベクター、AAV-DJ-Postn-Creベクター（以後、単にAAV6-Postn-Cre、AAV9-Postn-Cre AAV-DJ-Postn-Creと称する場合がある）を心筋梗塞後のTomatoレポーターマウスの心臓に直接注入し、導入遺伝子の発現を測定した（図７）。AAV6-Postn-Cre, AAV9-Postn-Cre, AAV-DJ-Postn-Creでは、Tomatoレポーターは主に梗塞領域と境界領域で発現したが、遠隔領域では発現しなかった（図８）。特に、AAV-DJ-Postn-Creは3つの血清型の中で最も高い導入効率を示した（図９）。心筋細胞(cTnT)、心筋線維芽細胞(COL1)、平滑筋細胞(SMC; SMMHC)、内皮細胞(EC; CD31)に対する複数の抗体を用いた共免疫染色により、Tomatoが主に常在CFで発現していることが示され、AAV-DJ-Postn-Cre注入による導入効率は約90%に達した(図１０)。Tomato＋細胞は、心筋梗塞後4週間、境界部と梗塞部で維持された。
［実施例２］AAV-DJ-Postnベクターを用いたヒト初代培養心臓線維芽細胞での遺伝子発現　ヒト心臓線維芽細胞における遺伝子導入効率を調べるために、ヒト心臓由来心臓線維芽細胞を培養し、AAV-DJ-Postn-GFPを構築し、遺伝子導入を行った。感染多重度5x104 vg/cellの条件で遺伝子導入を行い、導入効率は導入1週間後に免疫蛍光（IF）を用いて決定した。その結果、AAV-DJ-Postnベクターを用いた場合、ヒト心臓線維芽細胞においてもin vitroで遺伝子発現が確認された（データ非図示）。
［実施例３］Postnプロモーターの制御下での導入遺伝子発現の時間経過の確認
　Postnプロモーターの制御下での導入遺伝子発現の時間経過を調べるため、AAV-DJ-Postn-GFPを構築し、心筋梗塞後のマウス心臓に直接注入した（図１１）。心筋梗塞後の心臓では、心筋梗塞1週間後と比較して、2週間後と4週間後にGFP発現が低下した（図１２）。
［実施例４］AAV-DJ-Postnベクターの特異性
　免疫組織化学染色及びFACS解析により、1週間後、GFP+細胞が心臓で検出されたが、肝臓、肺、骨格筋等の他の組織では検出されなかったことが確認された（図１３～１５）。AAV-DJ-Postn-GFPを健康で梗塞のないマウスの心臓に直接注入すると、注入部位でのみ低レベルのGFP発現が検出された。さらに、AAV-DJ-Postn-Creを尾静脈から健常対照マウス（図１６，１７）及び梗塞Tomatoレポーターマウス（図１８，１９）に全身投与したところ、Tomatoは梗塞部でのみ発現し、健常心筋及びその他の組織では発現しなかった。これらの結果は、AAV-DJ-Postnベクターが心筋損傷後の活性化CFを優先的に標的とするが、静止CF及び他の臓器は標的としないことを示唆している。　
［実施例５］AAV-DJ-Postnベクターを用いたin vivoでの心筋線維芽細胞の心筋リプログラミング（１）
　AAV-DJ-Postnベクターを用いた遺伝子導入により、生体内に常在する心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞にリプログラミングできるかどうかを調べた。まず、GATA4、HAND2、TBX5、MEF2C、及びMEF2C-TAD（M-TAD）を含むリプログラミング因子を発現するAAV-DJ-Postnベクターを作製した（図２０）。インビボでの心臓リプログラミングを試験するために、
　（i）リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（コントロール、Ctrl）、
　（ii）PBSに懸濁したAAV-DJ-Postn-GATA4、AAV-DJ-Postn-HAND2、AAV-DJ-Postn-ＴBX5とAAV-DJ-Postn-MEF2C（AAV-DJ-Postn-GHT/M）、又は
　（iii）PBSに懸濁したAAV-DJ-Postn-GATA4、AAV-DJ-Postn-HAND2、AAV-DJ-Postn-ＴBX5とAAV-DJ-Postn-MEF2C-TAD（AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD）
上記（i）～（iii）のいずれかを心筋梗塞直後のPostn MCM/Tomatoマウス心臓に直接注入し、活性化されたCF系譜を追跡した（図２１，２２）。マウスには心筋梗塞後2週間タモキシフェンを継続投与し、2週間後に心臓を採取した（Kanisicakら、2016）。免疫組織化学染色により、AAV-DJ-Postn-GHT/M及びAAV-DJ-Postn-GHT/M-TADの両方が、Tomato+細胞にα-アクチニン発現を誘導することが明らかになった（図２３）。α-アクチニン+/Tomato+ 誘導心筋細胞は明瞭なサルコメア構造を示し、三次元解析により細胞が両方のタンパク質を発現していることが確認された。重要なことは、AAV-DJ-Postn-GHT/M-TADは、境界領域においてAAV-DJ-Postn-GHT/Mよりも2倍多くの誘導心筋細胞を生成したことであり、活性化MEF2Cがin vivoでの心臓リプログラミングを促進することを示唆している（図２４）。
［実施例６］AAV-DJ-Postnベクターを用いたin vivoでの心筋線維芽細胞の心筋リプログラミング（２）
　Tcf21 iCre/Tomatoマウスは、心筋梗塞前にタモキシフェンを投与することで、静止期の心臓線維芽細胞を特異的に標識することができるため、心筋細胞におけるリーク発現なしに心臓線維芽細胞の系統を追跡することができる。Tcf21 iCre/Tomatoマウスは、心筋梗塞前にTcf21発現心臓線維芽細胞を標識するために5日間タモキシフェンで処理され、最後のタモキシフェン処理から7日後に冠動脈結紮が行われた。Tcf21 iCre/Tomatoマウスの心筋梗塞4週後の境界/梗塞部には、Postn MCM/Tomatoマウスと同様に、多数のTomato+心臓線維芽細胞が認められた（図２５～２７）。心筋梗塞直後のTcf21 iCre/Tomatoマウスの心臓にPBS又はAAV-DJ-Postn-GHT/M-TADを直接注入した。免疫組織化学染色の結果、各群5匹ずつ計36,000～60,000個の細胞をカウントしたところ、AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD群では境界部のTomato+細胞の約1.8％がα-アクチニンを発現していたのに対し、Ctrl群では0.3％がα-アクチニンを発現していた（図２８）。誘導心筋細胞は明確なサルコマー構造を示した。これらの結果は、活性化MEF2CとGHTを発現するAAV-DJ-Postnベクターが、心筋梗塞後の常在心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞に効率的にリプログラミングすることを示している。
［実施例７］AAV-DJ-Postnベクターを用いた心筋リプログラミングによる線維化抑制の確認
　AAV-DJ-Postn-GHT/M-TADによる心臓リプログラミングによって誘導される分子変化を調べるために、心筋梗塞の4週間後にCtrl-及びAAV-DJ-Postn-GHT/M-TADを注入したマウスの心臓でRNAシークエンス解析を行った。遺伝子セットの濃縮解析から、GHT/M-TAD心臓で発現上昇した遺伝子は、心収縮又は代謝過程等心機能に関連するクラスターに濃縮されていたのに対し、発現低下した遺伝子は線維芽細胞シグネチャー又は炎症反応に濃縮されていた（図２９）。
　次に、Ctrlマウス、AAV-DJ-Postn-GFP-マウス、及びAAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD-注射マウスの心機能を、心筋梗塞の2日後及び2週後と4週後に心エコー図を用いて評価した。AAV-DJ-Postn-GHT/M-TAD投与は、4週間後に左室駆出率、分画短縮を有意に改善した（図３０）。
　また、4週後の瘢痕の大きさを定量化するために、マッソン三色染色を用いて組織学的解析を行った。AAV-DJ-Postn-GHT/M-TADを投与した心臓では、線維化領域がCtrl及びAAV-DJ-Postn-GFPを投与した心臓よりも有意に減少した（図３１）。
　このように、AAV-DJ-Postn-GHT/M-TADを用いたin vivo心臓リプログラミングは、心筋梗塞後の心機能を改善し、線維症を減少させた。
［実施例８］AAV-DJ-Col1a2ベクターおよびAAV-DJ-COMPベクターを用いたマウス胎児線維芽細胞、心臓線維芽細胞での遺伝子発現
　マウス胎児線維芽細胞及び遺伝子導入効率を調べるために、これらの細胞を培養し、AAV-DJ-Col1a2-GFPベクター及びAAV-DJ-COMP-GFPベクターを構築し（図３２）、遺伝子導入を行った。感染多重度5x104 vg/cellの条件で遺伝子導入を行い、導入効率は導入1週間後に免疫蛍光（IF）を用いて決定した。その結果、AAV-DJ-Col1a2ベクターを用いた場合、AAV-DJ-CMVベクター及びAAV-DJ-Postnベクターには効率が劣るものの、マウス胎児線維芽細胞及び心臓線維芽細胞においてin vitroで遺伝子発現が確認された（図３３）。また、AAV-DJ-COMP-GFPベクターを用いた場合、導入効率は低いものの、マウス胎児線維芽細胞及び心臓線維芽細胞においてin vitroで遺伝子発現が確認された（図３３）。
　一方、心筋細胞においても同様に検討した結果、いずれのベクターにおいても心筋細胞では発現が見られず（図３４）、非心筋細胞への選択性が確認できた。
［実施例９］AAV-DJ-Col1a2ベクターを用いたin vivoでの心臓線維芽細胞での遺伝子発現
　AAV-DJ-Col1a2-GFPベクターを心筋梗塞後のICRマウスの心臓に直接注入し、１週間後、２週間後、４週間後での導入遺伝子の発現を免疫組織化学染色で観察した（図３５）。
　その結果、心筋梗塞後のいずれの期間においても有意な遺伝子発現が観察された（図３６）。AAV-DJ-Col1a2ベクターでは、心筋梗塞の急性期から慢性期まで広く遺伝子発現が可能であることが明らかとなった。

Claims (7)

  1. 　ペリオスチンプロモーター配列、コラーゲン1a2プロモーター配列、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列からなる群より選択される少なくとも１種を含むポリヌクレオチドと、AAV-DJカプシドタンパク質とを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、
    　前記コラーゲン1a2プロモーター配列は、以下の（2-1）～（2-4）のいずれかであり、前記軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（COMP）プロモーター配列は、以下の（3-1）～（3-4）のいずれかである、組換えアデノ随伴ウイルスベクター：
    （2-1）配列番号９で表される塩基配列、
    （2-2）配列番号９で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列、
    （2-3）配列番号９で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列、
    （2-4）配列番号９で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
    （3-1）配列番号１０で表される塩基配列、
    （3-2）配列番号１０で表される塩基配列において１又は数個の塩基が置換、付加、又は欠失した塩基配列、
    （3-3）配列番号１０で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列、
    （3-4）配列番号１０で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
  2. 　前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、Gata4、Hand2、Tbx5、及びMef2cからなる群より選択される少なくとも１つのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  3. 　請求項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む、医薬組成物。
  4. 　請求項２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む、心機能改善剤。
  5. 　請求項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む、活性化された心臓線維芽細胞における遺伝子発現方法。
  6. 　活性化された心臓線維芽細胞が、心筋梗塞後の心臓線維芽細胞を含む、請求項５に記載の遺伝子発現方法。
  7. 　請求項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む、心臓線維芽細胞から心筋細胞を誘導する方法。 
PCT/JP2025/023598 2024-07-03 2025-07-01 心筋ダイレクトリプログラミングのための組換えアデノ随伴ウイルスベクター Pending WO2026009883A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024107728 2024-07-03
JP2024-107728 2024-07-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2026009883A1 true WO2026009883A1 (ja) 2026-01-08

Family

ID=98318348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2025/023598 Pending WO2026009883A1 (ja) 2024-07-03 2025-07-01 心筋ダイレクトリプログラミングのための組換えアデノ随伴ウイルスベクター

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2026009883A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524837A (ja) * 2010-04-28 2013-06-20 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 心筋細胞を発生させるための方法
JP2024522074A (ja) * 2021-05-19 2024-06-11 アスガード セラピューティクス エービー １型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞への細胞のリプログラミング

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013524837A (ja) * 2010-04-28 2013-06-20 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 心筋細胞を発生させるための方法
JP2024522074A (ja) * 2021-05-19 2024-06-11 アスガード セラピューティクス エービー １型の通常型樹状細胞または抗原提示細胞への細胞のリプログラミング

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenBank 26 July 2016 (2016-07-26), ANONYMOUS: "Homo sapiens cartilage oligomeric matrix protein (COMP) gene, promoter region and partial cds.", XP093384616, Database accession no. AF069520 *
DATABASE Nucleotide 11 June 2001 (2001-06-11), ANONYMOUS: "Mus musculus collagen alpha2(I) upstream enhancer sequence -", XP093384612, Database accession no. AF345994 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6825167B2 (ja) アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよびその使用方法
JP2022528416A (ja) 組換えアデノ随伴ウイルス及びその使用
AU2024278250A1 (en) Compositions and methods of treating Huntington&#39;s Disease
KR102554850B1 (ko) 최적화된 인간 응고 인자 viii 유전자 발현 카세트 및 그의 용도
US11034974B2 (en) Hairpin MRNA elements and methods for the regulation of protein translation
US20220154213A1 (en) Bocaparvovirus small noncoding rna and uses thereof
TW201741458A (zh) 治療ａ型血友病之基因治療
JP7737385B2 (ja) 遺伝子療法のためのａａｖ２をベースとするウイルスベクター粒子
JP2008506363A (ja) ベクター内非相同末端パリンドローム配列を有するアデノ随伴ウイルスベクター
CN112512595A (zh) 心脏、骨骼肌和肌肉干细胞中的体内同源性定向修复
US10729789B2 (en) Compositions and methods for adeno-associated virus mediated gene expression in myofibroblast-like cells
CN121358753A (zh) 用于递送有效载荷的含rgd的肽
ES2975422T3 (es) Proteínas con actividad cardioprotectora
US10391144B2 (en) Atherosclerosis inhibition via modulation of monocyte-macrophage phenotype using Apo A-I Milano gene transfer
WO2018148743A1 (en) Modulation of ischemic cell bioenergetics
KR20210086638A (ko) 진행성 가족성 간내 담즙정체 3형 (pfic3)의 치료를 위한 코돈-최적화 전이유전자
WO2020176732A1 (en) TREATMENT OF PULMONARY FIBROSIS WITH SERCA2a GENE THERAPY
Qi et al. Selective tropism of the recombinant adeno‐associated virus 9 serotype for rat cardiac tissue
CN116473999A (zh) 人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的应用
Yu et al. Screening of a retinal-targeting Adeno-Associated Virus (AAV) via DNA shuffling
JP2024502257A (ja) 心筋細胞由来核酸調節エレメント並びにその方法及び使用
CN113454226A (zh) 用于治疗糖原贮积病的方法和组合物
EP4337780B1 (en) Recombinant tert-encoding viral genomes and vectors
US20250084129A1 (en) Aav5 capsid variants
CN116194121A (zh) 用于治疗扩张型心肌病的cilp-1抑制剂

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 25832960

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1