WO2026009602A1 - フローサイトメータ及びフローサイトメータ信号解析方法 - Google Patents

フローサイトメータ及びフローサイトメータ信号解析方法

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WO2026009602A1
WO2026009602A1 PCT/JP2025/018952 JP2025018952W WO2026009602A1 WO 2026009602 A1 WO2026009602 A1 WO 2026009602A1 JP 2025018952 W JP2025018952 W JP 2025018952W WO 2026009602 A1 WO2026009602 A1 WO 2026009602A1
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WO
WIPO (PCT)
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light
laser
capillary
capillaries
sample
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2025/018952
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English (en)
French (fr)
Inventor
直子 千田
惟夫 香村
樹生 中川
喜実 野口
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Ltd filed Critical Hitachi Ltd
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Pending legal-status Critical Current
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing
    • G01N15/1409—Handling samples, e.g. injecting samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements

Definitions

  • the present invention relates to flow cytometers and flow cytometer signal analysis methods.
  • FCM Flow cytometry
  • FSC forward scattered light
  • SSC side scattered light
  • the surface antigens to be observed are labeled with fluorescently labeled antibodies before measurement by flow cytometry.
  • the fluorescence emitted by the fluorescently labeled antibodies allows users to determine the presence or absence of protein expression and the intensity of expression for each cell.
  • flow cytometry can obtain parameters such as the size, internal structure, and protein expression of individual samples. Users can then classify sample groups using these parameters and understand the populations within each group.
  • the hydrodynamic focusing effect is an effect in which samples are aligned inside a flow cell by forming a flow of sheath fluid on the outside and a flow of sample solution on the inside.
  • capillary flow cytometry a type of flow cytometry that uses a different method from the hydrodynamic focusing effect.
  • capillary flow cytometry a sample solution is circulated through a capillary with a diameter slightly larger than the sample. This aligns the individual samples and allows measurements to be taken for each sample.
  • Capillary flow cytometry has the advantage of not requiring sheath liquid and producing little waste liquid.
  • capillary flow cytometry makes it relatively easy to multiply sample measurements by N by parallelizing the flow of samples. For this reason, capillary flow cytometry is expected to be used in applications that require measuring a large number of samples in a short period of time, particularly in clinical applications.
  • Non-Patent Document 1 describes the use of ultrasound in parallel capillary flow cytometry to align cells in capillaries with high precision.
  • forward scattered light emitted in a direction between 1° and 10° from the incident laser provides important information that reflects the size of the sample, so it is necessary to devise a way to prevent forward scattered light from being mixed in.
  • Non-Patent Document 1 in parallel capillary flow cytometry, ultrasound is used to successfully align cells in capillaries with high precision.
  • forward scattered light scattered in directions between 1° and 10° cannot be detected, and instead of forward scattered light, backscattered light data at 25° is acquired.
  • the technology described in Non-Patent Document 1 cannot prevent the mixing in of forward scattered light.
  • the present invention was made in light of this background, and its objective is to prevent the mixing of forward scattered light even when capillaries are integrated in a narrow space.
  • the present invention provides a flow cytometer comprising a light source unit that irradiates laser light onto a plurality of capillaries, a light receiving unit that receives forward scattered light that scatters on the capillaries in the direction opposite to the side where the laser light is irradiated, and a laser blocker that blocks light
  • the laser blockers include a first laser blocker that is placed in a position close to the light source unit including the alignment surface of the capillaries on the side where the laser light is incident and at a position shifted from the position where the axial center of the capillary is projected in the direction of the light source unit, a second laser blocker that is installed between the capillary and the light receiving unit and between the capillaries themselves, and a third laser blocker that is installed on the light receiving surface of the light receiving unit at a position where the axial center of the capillary is projected in the direction of the light receiving unit.
  • Other solutions will be described as appropriate in the embodiments.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a flow cytometer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing the arrangement position of a laser blocker.
  • FIG. 1 is a diagram (part 1) of a flow cytometer viewed from the direction of incidence of laser light.
  • FIG. 2 is a view (part 2) of the flow cytometer viewed from the incident direction of the laser light.
  • FIG. 10 is a diagram showing a configuration for acquiring fluorescent light and side-scattered light.
  • FIG. 10 is a diagram showing the detected intensity when each sample was measured once. 10 is an example showing the results of gating.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measuring one sample at each intersection.
  • FIG. 1 shows an example of plotting mean values and gating sample populations.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration of a processing device.
  • 1 is a flowchart showing the procedure of a flow cytometer signal analysis method according to the present embodiment.
  • the flow cytometer 1 is a device that uses capillary flow cytometry, a type of flow cytometry.
  • Fig. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a flow cytometer 1 according to this embodiment
  • Fig. 2 is a diagram showing the arrangement position of a laser blocker 110.
  • the flow cytometer 1 comprises a light sheet 121, which is a light source, multiple capillaries 122, and a line sensor 123, which is a light-receiving unit.
  • the light sheet 121 emits laser light 141.
  • Figure 1 shows the flow cytometer 1 viewed from a direction 90 degrees to the incident direction of the laser light 141.
  • the capillary 122 is shown in cross section along a plane perpendicular to the flow direction of the sample 131, which flows from the depth of the page to the front of the page.
  • the sample 131 flows through the inside of the capillary 122 together with the liquid flowing inside the capillary 122.
  • the liquid flowing inside the capillary 122 is driven by the discharge force of a pump (not shown).
  • the capillary 122 is made of glass such as quartz, soda lime, or borosilicate, or a resin such as polycarbonate.
  • the light sheet 121 irradiates laser light 141 onto multiple capillaries 122.
  • the line sensor 123 receives forward scattered light 142 that is scattered in the opposite direction from the side of the capillaries 122 where the laser light 141 is irradiated.
  • the opposite side is the side of the line sensor 123, which is the light receiving unit.
  • the flow cytometer 1 is equipped with a laser blocker 110 that blocks light.
  • a laser blocker 110 that blocks light.
  • Three types of laser blockers 110 are provided: a first laser blocker 111, a second laser blocker 112, and a third laser blocker 113.
  • the second laser blocker 112 and the third laser blocker 113 are provided to block forward scattered light 142 originating from adjacent capillaries 122.
  • the first laser blocker 111 is positioned near the light sheet 121, which includes the alignment surface 151a of the capillary on the side where the laser light 141 is incident.
  • the first laser blocker 111 is positioned at a position offset from the position (arrow 171) where the axial center 122a of the capillary 122 is projected toward the light sheet 121.
  • the first laser blocker 111 is installed on the alignment surface 151a of the capillary 122 on the side where the laser light 141 is incident. Note that in the example shown in FIG. 2, the first laser blocker 111 is installed on the alignment surface 151a of the capillary 122 on the side where the laser light 141 is incident, but this is not limited to this.
  • the first laser blocker 111 may be installed at a position closer to the light sheet 121 than the alignment surface 151a of the capillary 122 (above the alignment surface 151a). This can be achieved, for example, by making the thickness of the transparent member 151 thicker than the outer diameter of the capillary 122.
  • the second laser blocker 112 is installed between the capillary 122 and the line sensor 123, and between the capillaries 122. Specifically, the second laser blocker 112 is installed from the alignment surface 151a of the capillary 122 on the side where the laser light 141 is incident to the light receiving surface 123a of the line sensor 123.
  • the third laser blocker 113 is installed on the light receiving surface 123a of the line sensor 123 at a position (arrow 172) where the axial center 122a of the capillary 122 is projected in the direction of the line sensor 123.
  • the laser blocker 110 is made of resins such as polycarbonate, acrylic, or polypropylene, or metals such as glass or aluminum. It is desirable that the laser blocker 110 be anti-reflection treated. This treatment prevents the laser light 141 from being diffused and is absorbed by the laser blocker 110. Care must be taken if the laser blocker 110 is not anti-reflection treated, as stray light caused by diffused reflection may be detected by the line sensor 123. Examples of anti-reflection treatments include coloring the laser blocker 110 (black, for example), providing a finely textured surface, or laminating a dielectric film on the surface.
  • the size of each laser blocker 110 in the axial direction of the capillary 122 (the size in the depth direction in Figures 1 and 2) is a size that can block the laser light 141 and forward scattered light 142.
  • Capillary 122 is embedded in transparent member 151. Furthermore, second laser blocker 112 is embedded in transparent members 151 and 152.
  • Transparent members 151 and 152 are highly transparent members and are made of resins such as polycarbonate, acrylic, polypropylene, or glass (they are made of highly transparent materials regardless of whether they are organic or inorganic). Note that in the example shown in Figure 1, two transparent members, 151 and 152, are provided, but transparent members 151 and 152 may also be made of a single transparent member.
  • the diameter of the capillaries 122 is 30 ⁇ m.
  • the capillaries 122 are arranged in parallel at intervals of 30 ⁇ m.
  • the diameter of the capillaries 122 and the intervals at which the capillaries 122 are arranged are not limited to 30 ⁇ m.
  • the forward scattered light 142 is light scattered by the sample 131 in a range of 1° to 10° relative to the direction directly below the capillary 122.
  • the direction of the light sheet 121 is considered to be upward, and the direction of the line sensor 123 is considered to be downward.
  • the range (1° to 10°) in which the forward scattered light 142 is scattered is an approximate value. In the configuration shown in Figure 1, the width of the forward scattered light 142 when it reaches the line sensor 123 is approximately 30 ⁇ m.
  • a line sensor 123 is also arranged as a light receiving unit.
  • the line sensor 123 is arranged 180 ⁇ m from the capillary 122 so that the intensity of the forward scattered light 142 can reach the line sensor 123 before the forward scattered light 142 is excessively attenuated by the transparent member 152.
  • the distance between the line sensor 123 and the capillary 122 is not limited to 180 ⁇ m.
  • the line sensor 123 receives the forward scattered light 142, it sends a signal to the processing device 200.
  • the width of the forward scattered light 142 increases, and therefore the intensity per unit area of the forward scattered light 142 that reaches the line sensor 123 decreases.
  • FIGS. 3A and 3B are views of the flow cytometer 1 as viewed from the direction of incidence of the laser light 141.
  • FIG. 1 is a view of FIGS. 3A and 3B as viewed from the direction of the arrows A-A.
  • the laser blocker 110 is omitted from FIGS. 3A and 3B.
  • FIG. 1 reference will be made to FIG. 1 as appropriate, and descriptions of elements already explained in FIG. 1 will be omitted as appropriate.
  • Figure 3A shows an example in which multiple, straight capillaries 122 are arranged independently. That is, in the flow cytometer 1 shown in Figure 3A, each capillary 122 has an inlet and an outlet (arrows shown in Figure 3A).
  • Figure 3B shows an example in which the capillary 122 is a single capillary 122 with a meandering path.
  • Figure 3B shows an example in which a single capillary 122 forms a single continuous flow path by meandering. That is, the flow cytometer 1 shown in Figure 3B has one inlet and one outlet (arrows shown in Figure 3B). Note that in Figure 3B, the capillary 122 has five meanders (five U-shaped portions), but other numbers of meanders are also possible.
  • a light sheet 121 is provided so that laser light 141 is irradiated onto multiple capillaries 122. Also, in Figure 3B, a light sheet 121 is provided so that laser light 141 is irradiated onto multiple points on the capillaries 122. The intersections 161 will be described later.
  • Laser light 141 is irradiated onto the capillaries 122 from the front of the paper in Figures 3A and 3B toward the back of the paper. Forward scattered light 142, side scattered light 144 (see Figure 4), and fluorescence 143 (see Figure 4) originating from each capillary 122 are detected. While a general laser light 141 may be irradiated onto each capillary 122, to simplify the flow cytometer 1, a method of irradiating all capillaries 122 simultaneously across a surface, such as with a light sheet 121, is desirable.
  • laser light 141 of the same wavelength can be irradiated onto all of the parallel capillaries 122 using a single light source (light sheet 121). Note that general laser light 141 irradiates laser light 141 at a single irradiation point.
  • Measurement of sample 131 is performed when sample 131 passes through the illuminated portion of light sheet 121 in each capillary 122.
  • FIG. 4 is a diagram showing a configuration for acquiring the fluorescent light 143 and the side scattered light 144.
  • the flow cytometer 1 is equipped with a focusing lens 311, a laser notch filter 312, a diffraction grating 313, and a 2D CCD camera 314 as components for acquiring fluorescence 143.
  • Fluorescence 143 emitted from the sample 131 is received by the 2D CCD camera 314 via the focusing lens 311, the laser notch filter 312, and the diffraction grating 313.
  • the 2D CCD camera 314 receives the fluorescence 143, it sends a signal to the processing device 200.
  • the flow cytometer 1 also includes a focusing lens 321, a laser bandpass filter 322, and a line sensor 323 as components for acquiring side scattered light 144.
  • the side scattered light 144 scattered by the sample 131 is received by the line sensor 323 via the focusing lens 321 and the laser bandpass filter 322.
  • the line sensor 323 receives the side scattered light 144, it sends a signal to the processing device 200.
  • the flow cytometer 1 acquires forward scattered light 142 using the configuration shown in Figures 1, 3A, and 3B, and acquires fluorescent light 143 and side scattered light 144 using the configuration shown in Figure 4.
  • the meandering of the capillary 122 makes it possible to measure the forward scattered light 142, side scattered light 144, and fluorescence 143 for each sample 131 multiple times.
  • FIGS. 1 to 4 will be referred to as appropriate.
  • FIG. 5A to 9 show an example of gating using the measurement results from such a flow cytometer 1. Using this, a method for clarifying the boundaries of a sample population 401 will be explained with reference to Figures 5A to 9.
  • a sample 131 flows through a serpentine capillary 122 as shown in Figure 3B, and measurements are performed on the same sample 131 at each intersection 161. Then, a sample population 401 (see Figure 6B) is extracted based on the average value of the measurement results. In this way, the second embodiment shows that by extracting the sample population 401 based on the average value of the measurement results, the boundaries of the sample population 401 become clear.
  • capillary flow cytometry which has a capillary 122 that allows only one sample 131 to flow
  • a flow cytometer 1 having a serpentine capillary 122 as shown in Figure 3B is useful.
  • the three types of laser blockers 110 shown in Figure 1 are useful.
  • Figure 5A shows the detection intensity when each sample 131 (cells in the example shown in this embodiment) is measured once.
  • Figure 5B shows an example of the results of gating performed using the results shown in Figure 5A.
  • each sample 131 is measured six times at the intersection 161 of the capillaries 122 and the light sheet 121 shown in Figure 3B.
  • a laser blocker 110 is placed as shown in Figure 1.
  • Figures 5A and 5B show the results measured at each intersection 161 as is.
  • first laser blocker 111 first laser blocker 111
  • second laser blocker 112 second laser blocker 112
  • third laser blocker 113 The arrangement of the three types of laser blockers 110 (first laser blocker 111, second laser blocker 112, and third laser blocker 113) is as described in Figure 1.
  • the line sensor 123 receives forward scattered light 142 scattered by the sample 131 in a direction between 1° and 10° forward. Furthermore, with the configuration shown in FIG. 4, the processing device 200 acquires signals from fluorescence 143 and side scattered light 144 in addition to the forward scattered light 142.
  • the horizontal axis represents the sample 131 (cells in the example shown in this embodiment), and the vertical axis represents the detection intensity.
  • the detection intensity is fluorescence intensity or scattered light intensity.
  • intensity refers to the signal intensity output by the line sensor 123, the 2DCCD camera 314, and the line sensor 323.
  • scattered light refers to forward scattered light 142 or side scattered light 144.
  • scattered light intensity refers to the signal intensity of the forward scattered light 142 or the signal intensity of the side scattered light 144.
  • Gating means clustering the sample population 401.
  • Figure 5B shows a plot of the results of a single measurement performed on one sample 131 using the same method as in Figure 5A.
  • the horizontal and vertical axes represent fluorescence intensity or scattered light intensity.
  • the horizontal and vertical axes represent either fluorescence intensity, the signal intensity of forward scattered light 142, or the signal intensity of side scattered light 144.
  • each plot point 402 represents a sample 131 (a cell in the example shown in this embodiment). Furthermore, by performing gating in Figure 5B, samples 131 with similar properties are grouped (clustered) as a sample population 401.
  • Figure 6A shows the results of measuring one sample 131 at each intersection 161 (see Figure 3B) using the flow cytometer 1 shown in Figure 3B.
  • one sample 131 is measured six times.
  • Figure 6B shows an example of plotting the average values calculated using the method shown in Figure 6A and gating the sample population 401.
  • each plot point 402 represents a sample 131.
  • the same sample 131 is measured multiple times using the flow cytometer 1 shown in Figure 3B, the results are averaged, and the average value is plotted. Gating of the plot points 402 is then performed.
  • the sample population 401 becomes a narrow range. This makes the boundaries of the sample population 401 clear (there is no overlap between sample populations 401). In this way, by measuring the same sample 131 multiple times and using the average value of the results, it is possible to improve the accuracy of gating.
  • Figures 7 to 9 show data verifying that signal variation can be reduced by actually measuring the same sample 131 multiple times.
  • FIG. 7 to 9 shows the results of aligning 33 fluorescent beads in a single microscopic flow path filled with water, and measuring the fluorescence intensity from each bead using a fluorescence microscope. Note that the results of Figures 7 to 9 were obtained from an experiment in which fluorescent beads were aligned in a flow path that resembled capillary 122. In other words, fluorescent beads were not actually circulated through capillary 122 of flow cytometer 1.
  • the 33 fluorescent beads mimic samples 131 belonging to the same sample population 401.
  • Each fluorescent bead basically exhibits the same level of fluorescence intensity, but there is some variation between each fluorescent bead.
  • moving the fluorescent beads within the flow path mimics the following: In other words, it mimics the fact that in the flow cytometer 1, the sample 131 moving through the capillary 122 is measured at a slightly different position and angle relative to the laser light 141 for each measurement.
  • Figure 7 is a box plot plotting the intensity of fluorescence 143 (fluorescence intensity) from 33 fluorescent beads for each of measurements 1 to 10. Each plot point 411 shown in Figure 7 represents the fluorescence intensity from a fluorescent bead. However, since there are multiple results with the same value, the number of plots shown in Figure 7 is less than 33. Note that the "x" marks in the box plot indicate the average value.
  • Figure 8 is a box plot using the average results of 10 measurements for each fluorescent bead.
  • each plot point 412 represents the average of 10 measurements of the fluorescence intensity for each fluorescent bead.
  • Figure 9 shows the results of an experiment similar to those shown in Figures 7 and 8, showing how the variation in fluorescence intensity resulting from Sample 131 (fluorescent beads) decreases with each measurement.
  • the vertical axis shows the coefficient of variation (CV), which is the variation in fluorescence intensity among the 33 fluorescent beads.
  • the horizontal axis shows the cumulative number of measurements used to calculate the variation. For example, if the cumulative number of measurements is three, the average value of the fluorescence intensity from the first to third measurements for each fluorescent bead is used to calculate the variation in fluorescence intensity among the fluorescent beads.
  • the experiments shown in Figures 7 to 9 simulate the flow cytometer 1 measuring the same sample 131 multiple times and treating the average value as the signal value for each sample 131. This makes it possible to reduce data variations due to positional deviations of the sample 131 relative to irradiation with the laser light 141 and differences in orientation. This makes it possible to clearly separate the sample population 401 in analysis by the flow cytometer 1.
  • FIGS. 1 and 4 will be referred to as appropriate.
  • the processing device 200 includes an arithmetic unit 201, a storage device 202, an input device 203, an output device 204, a communication device 205, a memory 210, etc.
  • the arithmetic unit 201 is composed of a CPU (Central Processing Unit), a GPU (Graphic User Interface), etc.
  • the storage device 202 is composed of a HDD (Hard Disk Drive), an SSD (Solid State Drive), etc.
  • the input device 203 is composed of a keyboard, a mouse, etc.
  • the output device 204 is composed of a display, etc.
  • the communication device 205 receives signals from the line sensors 123, 323 and the 2D CCD camera 314 shown in Figures 1 and 4.
  • the memory 210 is composed of volatile memory such as RAM (Random Access Memory).
  • the program stored in the storage device 202 is loaded into the memory 210, and the loaded program is executed by the arithmetic device 201.
  • This embodies the calculation unit 211, gating unit 212, and judgment unit 213.
  • the calculation unit 211 calculates the average value of the measurement values obtained as a result of N measurements.
  • the gating unit 212 gates the measurement results based on the average value calculated by the calculation unit 211 and extracts the sample population 401.
  • the determination unit 213 determines whether adjacent sample populations 401 are clearly separated.
  • (flowchart) 11 is a flowchart showing the procedure of the flow cytometer signal analysis method according to this embodiment, with reference to FIGS. 1 and 10 as appropriate.
  • Step S1 is a measurement step in which multiple measurements are performed on each of the multiple samples 131.
  • Step S2 is a statistical processing step that performs statistical processing on the measurement results from the measurement step (S1).
  • step S2 the calculation unit 211 calculates the average value of the results of the multiple measurements for each sample 131.
  • the gating unit 212 then plots the N-time average values of each sample 131 calculated in step S2 on a plot diagram such as those shown in Figures 5B and 6B.
  • the gating unit 212 then performs gating (clustering) on the plot points 402 (see Figures 5B and 6B) to extract a sample population 401 (S3).
  • Step S3 is a gating step that performs gating to extract the sample population 401 based on the results of the statistical processing step (S2).
  • the gating unit 212 performs gating using the k-means method, a support vector machine, or the like.
  • the gating unit 212 extracts the sample population 401 based on the average values.
  • the determination unit 213 determines whether the boundaries of the sample populations 401 extracted in step S3 are clear (S4).
  • the determination unit 213 determines whether the boundaries of the sample populations 401 are clear by determining whether the boundaries of adjacent sample populations 401 do not overlap. If the boundaries of adjacent sample populations 401 do not overlap, the determination unit 213 determines that the boundaries of the sample populations 401 are clear.
  • outliers are removed from the N measured values (S5).
  • the removal of outliers may be performed manually by the user based on the plot, or by the gating unit 212 using Mahalanobis distance, box plots, etc.
  • step S5 After outliers are removed in step S5, the processing device 200 returns to step S2. As a result, the processing device 200 performs N-time averaging and gating using the data from which outliers have been removed. By extracting the sample population 401 using the average value of multiple measurements, the number of times outliers are removed in step S5 can be reduced.
  • the spread of the population at plot points 402 can be reduced compared to the case of a single measurement.
  • the boundaries of the sample population 401 can be clearly defined during gating.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail to clearly explain the present invention, and are not necessarily limited to those having all of the configurations described.
  • it is possible to replace part of the configuration of one embodiment with the configuration of another embodiment and it is also possible to add the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment.
  • the flow cytometer 1 may be an analyzer or a cell sorter.
  • the above-mentioned configurations, functions, calculation unit 211 to determination unit 213, storage device 202, etc. may be realized in hardware, for example by designing them as integrated circuits.
  • the above-mentioned configurations, functions, etc. may be realized in software by a processor such as a CPU interpreting and executing programs that realize the respective functions.
  • a processor such as a CPU interpreting and executing programs that realize the respective functions.
  • information such as programs, tables, and files that realize the respective functions can be stored in memory, storage devices such as SSDs, or storage media such as IC (Integrated Circuit) cards, SD (Secure Digital) cards, and DVDs (Digital Versatile Discs).
  • control lines and information lines shown are those considered necessary for explanation, and not all control lines and information lines in the product are necessarily shown. In reality, it can be assumed that almost all components are interconnected.

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Abstract

キャピラリを狭い空間に集積させても、前方散乱光の混在を生じさせないため、複数のキャピラリ（１２２）にレーザ光（１４１）を照射するライトシート（１２１）と、キャピラリ（１２２）に対し、レーザ光（１４１）が照射された側とは反対側に散乱する前方散乱光（１４２）を受光するラインセンサ（１２３）と、レーザ光（１４１）が入射する側におけるキャピラリ（１２２）の整列面を含む光源部に近い位置、かつ、ライトシート（１２１）の方向にキャピラリ（１２２）の軸中心を投影した位置からずれた位置に配置される第１のレーザブロッカ（１１１）と、キャピラリ（１２２）と、ラインセンサ（１２３）との間、かつ、キャピラリ（１２２）同士の間に設置される第２のレーザブロッカ（１１２）と、ラインセンサ（１２３）の受光面において、ラインセンサ（１２３）の方向にキャピラリ（１２２）の軸中心を投影した位置に設置される第３のレーザブロッカ（１１３）と、を有する。

Description

フローサイトメータ及びフローサイトメータ信号解析方法
　本発明は、フローサイトメータ及びフローサイトメータ信号解析方法の技術に関する。
　フローサイトメトリ（ＦＣＭ）は細胞等といったサンプルの表面や内部の分子の発現を分析する技術である。フローサイトメトリでは、サンプルが整列して流され、１つのサンプル毎に順番にレーザ光による測定が行われる。そして、個々のサンプルから発せられた散乱光と蛍光の強度が記録される。
　散乱光は、入射するレーザに対して１°～１０°の方向に射出される前方散乱光（ＦＳＣ： forward scatter）と、９０°の方向に反射する側方散乱光（ＳＳＣ：side scatter）の２種類が存在する。前方散乱光の強度はサンプルの大きさの情報を反映する。側方散乱光強度はサンプル内部構造の複雑さを反映する。
　細胞表面におけるタンパク質発現計測の場合、細胞はフローサイトメトリによる計測前に観測対象となる表面抗原が蛍光標識抗体でラベルされている。そして、ユーザは、蛍光標識抗体が発する蛍光によりタンパク質発現の有無や発現強度を細胞毎に知ることができる。
　このように、フローサイトメトリでは個々のサンプルの大きさ・内部構造・タンパク質発現等のパラメータを得ることができる。そして、ユーザは、それらのパラメータでサンプル集団を分類し、集団毎のポピュレーションを知ることができる。
　従来のフローサイトメトリではサンプル等のサンプルを整列させる手法として流体力学的絞り込み効果が用いられてきた。流体力学的絞り込み効果はフローセル内部で、外側にシース液の流れ、内側にサンプル溶液の流れが形成されることによりサンプルが整列する効果である。
　一方で、流体力学的絞り込み効果とは方式の異なるフローサイトメトリとしてキャピラリフローサイトメトリがある。キャピラリフローサイトメトリでは、サンプルより少し大きい径を有するキャピラリの中にサンプル溶液を流通させる。これにより、個々のサンプルが整列し、サンプル毎に計測が行われる。キャピラリフローサイトメトリはシース液が不要であり、且つ廃液も少ないという利点がある。加えて、キャピラリフローサイトメトリはサンプルの流通を並列化することにより、サンプル計測をＮ倍化することが比較的容易である。そのため、キャピラリフローサイトメトリは、特に臨床応用において多数のサンプルを短い時間で測定するアプリケーションでの活用が期待されている。
　非特許文献１には、並列化したキャピラリフローサイトメトリにおいて、超音波を用いることでキャピラリ中の細胞を精度高く整列させることが記載されている。
Menake E. Piyasena、 "Multinode Acoustic Focusing for Parallel Flow Cytometry"、Analytical Chemistry、 84、4(2012) 1831-1839.
　キャピラリフローサイトメトリにおいて、装置の小型化や、部品点数削減のためにはキャピラリを狭い空間に集積させることが望ましい。しかしながら、キャピラリを狭い空間に集積させると、隣接するキャピラリによる前方散乱光と、本来計測したい前方散乱光との区別が困難であるという課題がある。つまり、隣接するフローサイトメトリ同士で信号が混在する。
　前記した通り、入射するレーザに対して１°～１０°の方向に射出される前方散乱光はサンプルの大きさを反映する重要な情報であるため、前方散乱光が混在しないようにする工夫が必要である。
　例えば、非特許文献１では、前記したように並列化したキャピラリフローサイトメトリにおいて、超音波を用いることによってキャピラリ中の細胞を精度高く整列させることに成功している。しかし、この中でも１°～１０°の方向に散乱される前方散乱光は検出できておらず、前方散乱光の代わりに２５°の後方散乱光データが取得されている。つまり、非特許文献１に記載の技術では、前方散乱光の混在を防止することはできない。
　このような背景に鑑みて本発明がなされたのであり、本発明は、キャピラリを狭い空間に集積させても、前方散乱光の混在を生じさせないことを課題とする。
　前記した課題を解決するため、本発明は、複数のキャピラリにレーザ光を照射する光源部と、前記キャピラリに対し、前記レーザ光が照射された側とは反対側に散乱する前方散乱光を受光する受光部と、光を遮蔽するレーザブロッカと、を備えるフローサイトメータであって、前記レーザブロッカとして、前記レーザ光が入射する側における前記キャピラリの整列面を含む前記光源部に近い位置、かつ、前記光源部の方向に前記キャピラリの軸中心を投影した位置からずれた位置に配置される第１のレーザブロッカと、前記キャピラリと、前記受光部との間、かつ、キャピラリ同士の間に設置される第２のレーザブロッカと、前記受光部の受光面において、前記受光部の方向に前記キャピラリの軸中心を投影した位置に設置される第３のレーザブロッカと、を有する。
　その他の解決手段は実施形態中において適宜記載する。
　本発明によれば、キャピラリを狭い空間に集積させても、前方散乱光の混在を生じさせないことが可能である。
本実施形態に係るフローサイトメータの構成を示す模式図である。 レーザブロッカの配置位置を示す図である。 フローサイトメータをレーザ光の入射方向から見た図（その１）である。 フローサイトメータをレーザ光の入射方向から見た図（その２）である。 蛍光及び側方散乱光を取得するための構成を示す図である。 それぞれのサンプルを１回ずつ測定した際における検出強度を示す図である。 ゲーティングを行った結果を示す例である。 １つのサンプルを交点毎に測定した結果を示す図である。 平均値をプロットし、サンプル集団のゲーティングを行った例を示す図である。 １～１０回までの各測定回における、３３個の蛍光ビーズに由来する蛍光の強度（蛍光強度）をプロットした箱ひげ図である。 それぞれの蛍光ビーズについて１０回の測定値を平均した結果を用いた箱ひげ図である。 サンプルに由来する蛍光強度のばらつきが、測定回を重ねるごとに減少していく様子を示した結果である。 処理装置の構成を示す図である。 本実施形態に係るフローサイトメータ信号解析方法の手順を示すフローチャートである。
　本発明の実施形態について、図面を用いて説明する。ただし、本発明は以下に示す実施形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。また図面等において示す各構成の位置、大きさ、形状、範囲などは、発明の理解を容易にするため、実際の位置、大きさ、形状、範囲などを表していない場合がある。このため、本発明は、必ずしも、図面等に開示された位置、大きさ、形状、範囲などに限定されない。
　また、本実施形態において、フローサイトメータ１は、フローサイトメトリの１つであるキャピラリフローサイトメトリの技術を用いた装置である。
　［第１実施形態］
　図１は、本実施形態に係るフローサイトメータ１の構成を示す模式図である。また、図２は、レーザブロッカ１１０の配置位置を示す図である。
　フローサイトメータ１は、光源部であるライトシート１２１、複数のキャピラリ１２２、受光部であるラインセンサ１２３を備える。ライトシート１２１はレーザ光１４１を発するものである。ちなみに、図１は、レーザ光１４１の入射方向に対して９０度の方向からフローサイトメータ１を見た図である。また、キャピラリ１２２は、サンプル１３１の流通方向に対して直交する面による断面を示しており、サンプル１３１の流通方向は、紙面奥行き方向から紙面手前方向となる。サンプル１３１はキャピラリ１２２の内部を流れる液体とともにキャピラリ１２２の内部を流通する。なお、キャピラリ１２２の内部を流れる液体は、図示しないポンプの吐出力によって流通する。なお、キャピラリ１２２は石英、ソーダ石灰、ホウケイ酸といったガラスもしくはポリカーボネートといった樹脂によって構成されている。
　ライトシート１２１は、複数のキャピラリ１２２にレーザ光１４１を照射するものである。また、ラインセンサ１２３は、キャピラリ１２２に対し、レーザ光１４１が照射された側とは反対側に散乱する前方散乱光１４２を受光するものである。なお、反対側とは、受光部であるラインセンサ１２３の側である。
　フローサイトメータ１には、光を遮蔽するレーザブロッカ１１０が設けられている。レーザブロッカ１１０として、第１のレーザブロッカ１１１、第２のレーザブロッカ１１２、第３のレーザブロッカ１１３の３種類が設けられている。第２のレーザブロッカ１１２、第３のレーザブロッカ１１３は、隣接するキャピラリ１２２に由来する前方散乱光１４２をブロックするために設けられている。
　図２に示すように、第１のレーザブロッカ１１１は、レーザ光１４１が入射する側におけるキャピラリの整列面１５１ａを含むライトシート１２１に近い位置に配置される。そして、第１のレーザブロッカ１１１は、ライトシート１２１の方向にキャピラリ１２２の軸中心１２２ａを投影した位置（矢印１７１）からずれた位置に配置される。具体的には、第１のレーザブロッカ１１１は、レーザ光１４１が入射する側におけるキャピラリ１２２の整列面１５１ａに設置される。なお、図２に示す例では、第１のレーザブロッカ１１１は、レーザ光１４１が入射する側におけるキャピラリ１２２の整列面１５１ａに設置されているが、これに限らない。例えば、キャピラリ１２２の整列面１５１ａよりライトシート１２１に近い位置（整列面１５１ａより上方）に設置されてもよい。これは、例えば、透明部材１５１の厚みを、キャピラリ１２２の外径より厚くすることで可能となる。
　また、図２に示すように、第２のレーザブロッカ１１２は、キャピラリ１２２と、ラインセンサ１２３との間、かつ、キャピラリ１２２同士の間に設置される。具体的には、第２のレーザブロッカ１１２は、レーザ光１４１が入射する側におけるキャピラリ１２２の整列面１５１ａからラインセンサ１２３の受光面１２３ａまで設置される。
　そして、図２に示すように、第３のレーザブロッカ１１３は、ラインセンサ１２３の受光面１２３ａにおいて、ラインセンサ１２３の方向にキャピラリ１２２の軸中心１２２ａを投影した位置（矢印１７２）に設置される。
　また、レーザブロッカ１１０は、ポリカーボネート、アクリル、ポリプロピレン等の樹脂や、ガラス、アルミ等の金属で構成される。なお、レーザブロッカ１１０には反射防止処理を施していることが望ましい。この処理により、レーザ光１４１は乱反射せずレーザブロッカ１１０に吸光される。もし、反射防止処理がない場合、乱反射による迷光がラインセンサ１２３で光検出される可能性があるため注意が必要である。反射防止処理の例としては，レーザブロッカ１１０の着色(黒色等)，表面に微細な凹凸構造の付与，誘電体膜の表面積層等が挙げられる。なお、キャピラリ１２２の軸方向における、それぞれのレーザブロッカ１１０のサイズ（図１、図２における奥行き方向のサイズ）は、レーザ光１４１及び前方散乱光１４２をブロックできるサイズである。
　キャピラリ１２２は、透明部材１５１に埋設されている。さらに、第２のレーザブロッカ１１２は、透明部材１５１及び透明部材１５２に埋設されている。透明部材１５１、１５２は、透明性の高い部材であり、ポリカーボネート、アクリル、ポリプロピレン等の樹脂や、ガラス等で構成される（有機材料や無機材料を問わず透明性の高い部材で構成）。なお、図１に示す例では、透明部材１５１及び透明部材１５２の２つが設けられているが、透明部材１５１及び透明部材１５２の部分が１つの透明部材で構成されてもよい。
　図１に示す例では、キャピラリ１２２の径は３０μｍとする。そして、それぞれのキャピラリ１２２は、３０μｍ間隔で並列に配置されている。ただし、キャピラリ１２２の径及びキャピラリ１２２の配置間隔は、３０μｍに限らない。
　また、前方散乱光１４２は、キャピラリ１２２の直下方向に対して１°～１０°の範囲でサンプル１３１によって散乱される光である。ちなみに、本実施形態ではライトシート１２１の方向を上方とし、ラインセンサ１２３の方向を下方とする。また、前方散乱光１４２が散乱する範囲（１°～１０°）は、おおよその値である。図１に示す構成の場合、ラインセンサ１２３に到達した際における前方散乱光１４２の幅は、およそ３０μｍとなる。
　また、受光部としてラインセンサ１２３が配置されている。図１に示す例では、前方散乱光１４２の強度が、透明部材１５２によって前方散乱光１４２が減衰しすぎないうちに前方散乱光１４２がラインセンサ１２３に到達できるよう、キャピラリ１２２から１８０μｍの距離にラインセンサ１２３が配置されている。ただし、ラインセンサ１２３とキャピラリ１２２の距離は１８０μｍに限らない。ラインセンサ１２３は、前方散乱光１４２を受光すると信号を処理装置２００へ送る。ちなみに、キャピラリ１２２とラインセンサ１２３と間の距離が長くなると、前方散乱光１４２の幅は広くなるので、ラインセンサ１２３に到達する前方散乱光１４２の単位面積当たりの強度は弱くなる。
　図３Ａ及び図３Ｂは、フローサイトメータ１をレーザ光１４１の入射方向から見た図である。なお、図１は、図３Ａ及び図３ＢをＡ－Ａ矢視方向から見た図である。なお、図３Ａ及び図３Ｂにおいて、レーザブロッカ１１０は図示省略されている。また、図１を適宜参照し、図１において説明済みの要素については説明を適宜省略する。
　図３Ａは、直線状のキャピラリ１２２のそれぞれが独立して複数配置されている例である。つまり、図３Ａに示すフローサイトメータ１では、それぞれのキャピラリ１２２において、キャピラリ１２２毎に導入口と排出口が設けられている（図３Ａに示す矢印）。また、図３Ｂは、キャピラリ１２２が、蛇行している経路を有する１本のキャピラリ１２２である例を示している。図３Ｂは、１つのキャピラリ１２２が蛇行することによって、連続したひとつの流路を形成している例である。すなわち、図３Ｂに示すフローサイトメータ１では、１つの導入口と１つの排出口を有している（図３Ｂに示す矢印）。なお、図３Ｂにおいて、キャピラリ１２２の蛇行回数は５となっているが（Ｕ字部分は５つとなっているが）、これ以外の蛇行回数も可能である。
　図３Ａに示す例では、複数のキャピラリ１２２に対してレーザ光１４１が照射されるようライトシート１２１が設けられている。また、図３Ｂでは、キャピラリ１２２の複数個所にレーザ光１４１が照射されるようライトシート１２１が設けられている。なお、交点１６１については後記する。
　レーザ光１４１は、キャピラリ１２２に対し図３Ａ、図３Ｂの紙面手前方向から紙面奥側方向に向けて照射される。そして、それぞれのキャピラリ１２２に由来する前方散乱光１４２や、側方散乱光１４４（図４参照）、蛍光１４３（図４参照）が検出される。レーザ光１４１の照射は、一般的なレーザ光１４１をキャピラリ１２２毎に照射してもよいが、フローサイトメータ１の簡略化を達成するためには、ライトシート１２１のように面で一度にすべてのキャピラリ１２２に照射する方法が望ましい。このように、光源としてライトシート１２１が用いられることで、１つの光源（ライトシート１２１）で並列化したキャピラリ１２２のすべてに同一波長のレーザ光１４１を照射することができる。なお、一般的なレーザ光１４１とは、１つの照射ポイントにピンポイントでレーザ光１４１を照射するものである。
　サンプル１３１の測定は、サンプル１３１が、それぞれのキャピラリ１２２においてライトシート１２１の照射部分を通過したときに実施される。
　（蛍光１４３及び側方散乱光１４４の取得）
　図４は、蛍光１４３及び側方散乱光１４４を取得するための構成を示す図である。
　図４において、サンプル１３１（図１参照）は、キャピラリ１２２の内部を白抜き矢印方向に流れるものとする。
　レーザ光１４１がキャピラリ１２２の内部を流通しているサンプル１３１に照射されると、サンプル１３１から前方散乱光１４２（図１参照）の他に、蛍光１４３及び側方散乱光１４４が発せられる。
　フローサイトメータ１は、蛍光１４３を取得するための構成として集光用レンズ３１１、レーザ用ノッチフィルタ３１２、回折格子３１３、２ＤＣＣＤカメラ３１４を備える。サンプル１３１から発した蛍光１４３は、集光用レンズ３１１、レーザ用ノッチフィルタ３１２、回折格子３１３を介して２ＤＣＣＤカメラ３１４で受光される。２ＤＣＣＤカメラ３１４は、蛍光１４３を受光すると、信号を処理装置２００へ送る。
　また、フローサイトメータ１は、側方散乱光１４４を取得するための構成として、集光用レンズ３２１、レーザ用バンドパスフィルタ３２２、ラインセンサ３２３を備える。サンプル１３１によって散乱する側方散乱光１４４は、集光用レンズ３２１、レーザ用バンドパスフィルタ３２２を介してラインセンサ３２３で受光される。ラインセンサ３２３は、側方散乱光１４４を受光すると信号を処理装置２００へ送る。
　フローサイトメータ１は、図１、図３Ａ、図３Ｂに示す構成によって前方散乱光１４２を取得するとともに、図４に示す構成によって蛍光１４３及び側方散乱光１４４を取得する。
　即ち、図４に示す構成を併せ持つことにより、複数のキャピラリ１２２に由来する前方散乱光１４２とともに、蛍光１４３や側方散乱光１４４をまとめて測定、解析することが可能である。
　第１実施形態に示すフローサイトメータ１によれば、キャピラリ１２２を並列化したフローサイトメータ１において、図２を参照して説明した場所に。３種類のレーザブロッカ１１０が配置される。
　これにより、隣接するキャピラリ１２２に由来する前方散乱光１４２の影響を受けることなく、それぞれのキャピラリ１２２に由来する前方散乱光１４２の取得が可能になる。つまり、隣接するキャピラリ１２２に由来する信号の影響を受けずにキャピラリ１２２毎にサンプル１３１に由来する前方散乱光１４２を取得することができる。これにより、キャピラリ１２２の間の距離を小さくすることができるため、キャピラリ１２２の集積化が可能となる。
　さらに、図３Ｂに示すように、キャピラリ１２２が蛇行することにより、個々のサンプル１３１に対して複数回ずつ前方散乱光１４２、側方散乱光１４４、蛍光１４３の測定を行うことが可能となる。
　［第２実施形態：フローサイトメータ信号解析方法］
　続いて、図５Ａ～図９を参照して、フローサイトメータ１によってラインセンサ１２３、３２３、２ＤＣＣＤカメラ３１４から取得した信号の解析方法を説明する。以降の説明において、図１～図４を適宜参照する。
　そして、以降の説明では、図３Ｂに示すような蛇行流路として並列化したキャピラリ１２２による測定結果を用いることとする。蛇行流路として並列化したキャピラリ１２２を用いることにより、同一のサンプル１３１を複数回測定することができる。図５Ａ～図９では、このようなフローサイトメータ１による測定結果を用いたゲーティングの例を示す。これにより、図５Ａ～図９を参照してサンプル集団４０１の境界を明瞭にする方法を説明する。
　第２実施形態では、図３Ｂに示すような蛇行するキャピラリ１２２中をサンプル１３１が流通することによって、同一のサンプル１３１について交点１６１毎に測定が行われる。そして、測定結果の平均値を基にサンプル集団４０１（図６Ｂ参照）が抽出される。このように、測定結果の平均値を基にサンプル集団４０１が抽出されることで、サンプル集団４０１の境界が明瞭になることを第２実施形態で示す。
　このように、測定結果の平均値を基にサンプル集団４０１を抽出する際には、サンプル１３１を１つのみ流通させるキャピラリ１２２を有するキャピラリフローサイトメトリの技術が有用である。特に、図３Ｂのように蛇行するキャピラリ１２２を有するフローサイトメータ１が有用である。そして、図３Ｂのように蛇行するキャピラリ１２２を有するフローサイトメータ１の小型化や、部品点数削減を行う際に、図１に示す、３種類のレーザブロッカ１１０が有用となる。
　図５Ａは、それぞれのサンプル１３１（本実施形態に示す例では細胞）を１回ずつ測定した際における検出強度を示す図である。また、図５Ｂは、図５Ａに示す結果を用いてゲーティングを行った結果を示す例である。
　前記したように、キャピラリ１２２の配置は図３Ｂに示すものであり、光源としてライトシート１２１が用いられているものとする。また、前記したように、個々のサンプル１３１は図３Ｂに示すキャピラリ１２２とライトシート１２１の交点１６１において６回測定される。この際、隣接するキャピラリ１２２に由来する前方散乱光１４２の干渉を避けるため、図１に示すようにレーザブロッカ１１０が配置される。図５Ａ及び図５Ｂでは、それぞれの交点１６１で計測された結果が、そのまま示されている。
　３種類のレーザブロッカ１１０（第１のレーザブロッカ１１１、第２のレーザブロッカ１１２、第３のレーザブロッカ１１３）の配置は、図１で説明した通りである。
　そして、図１に示すように、ラインセンサ１２３は、サンプル１３１によって前方１°～１０°の方向に散乱する前方散乱光１４２を受光する。また、図４に示す構成により、処理装置２００は、前方散乱光１４２とともに、蛍光１４３及び側方散乱光１４４による信号も取得する。
　図５Ａにおいて、横軸は、サンプル１３１（本実施形態に示す例では細胞）、縦軸は検出強度を示している。検出強度は、蛍光強度もしくは散乱光強度である。なお、強度とは、ラインセンサ１２３、２ＤＣＣＤカメラ３１４、及び、ラインセンサ３２３が出力する信号強度である。また、以降において、散乱光とは、前方散乱光１４２、又は、側方散乱光１４４を指すものとする。つまり、散乱光強度とは、前方散乱光１４２の信号強度、又は、側方散乱光１４４の信号強度である。
　フローサイトメータ１の測定では、図５Ｂに示すようにサンプル集団４０１をプロット点４０２でゲーティングすることが重要である。ゲーティングとは、サンプル集団４０１をクラスタリングすることである。
　１つのサンプル１３１に対し、１度の測定しか行わないと、図５Ａに示すように、検出強度にばらつきが生じる。このようなばらつきは、サンプル１３１の測定時におけるレーザ光１４１に対するサンプル１３１の位置ブレや、サンプル１３１の向きの違いが影響していると考えられる。
　図５Ｂは、図５Ａと同様の手法で、１つのサンプル１３１について測定を１度行い、その結果をプロットしたものである。図５Ｂにおいて、横軸及び縦軸は、蛍光強度もしくは散乱光強度を示している。つまり、図５Ｂにおいて、横軸及び縦軸は、蛍光強度、前方散乱光１４２の信号強度、及び、側方散乱光１４４の信号強度のうち、いずれかである。
　また、図５Ｂに示す図において、プロット点４０２の１つ１つはサンプル１３１（本実施形態で示す例では細胞）を示している。そして、図５Ｂではゲーティングが行われることにより、類似している性質をもつサンプル１３１をサンプル集団４０１としてグループ分け（クラスタリング）している。
　図５Ｂに示す図では、サンプル集団４０１の一部が重複している。このような状態は、サンプル１３１の測定を１度しか行わない場合、しばしば生じる。このような、サンプル集団４０１の重複は、図５Ａに示すような検出強度のばらつきによるものと考えられる。
　図６Ａは、図３Ｂに示すフローサイトメータ１を使用することにより、１つのサンプル１３１を交点１６１（図３Ｂ参照）毎に測定した結果を示す図である。本実施形態に示す例において、１つのサンプル１３１に対する測定回数は６回となる。
　図６Ａでは、サンプル１３１に交点１６１毎に測定された結果を平均し、その平均値と、標準偏差が示されている。なお、平均値及び標準偏差は、測定結果のうち、ユーザが外れ値を除外した上で、処理装置２００が平均値及び標準偏差を算出してもよい。
　図６Ｂは、図６Ａで示す方法で算出した平均値をプロットし、サンプル集団４０１のゲーティングを行った例を示す図である。
　図６Ｂにおいても、図５Ａと同様、プロット点４０２の１つ１つはサンプル１３１を示している。しかし、図６Ｂでは、図３Ｂに示すフローサイトメータ１を用いて、同じサンプル１３１を複数回測定し、その結果を平均化し、その平均値をプロットしている。その上で、プロット点４０２のゲーティングが行われている。
　図６Ｂに示すように、同じサンプル１３１を複数回測定し、その結果を平均化した値を用いることにより、サンプル集団４０１が狭い範囲となる。これにより、サンプル集団４０１の境界が明瞭になる（サンプル集団４０１間で重複が生じない）。このように、同じサンプル１３１を複数回測定し、その結果を平均化した値を用いることにより、ゲーティングの精度を向上させることができる。
　次に、実際に同じサンプル１３１を複数回測定することにより、信号のばらつきが抑えられることを検証したデータを図７～図９に示す。
　図７～図９のそれぞれは、３３個の蛍光ビーズを水の入った微細な１つの流路に整列させ、それぞれにビーズに由来する蛍光強度を蛍光顕微鏡で測定した結果である。なお、図７～図９の結果は、キャピラリ１２２を模した流路に蛍光ビーズを整列させて行われた実験によって得られたものである。つまり、実際にフローサイトメータ１のキャピラリ１２２に蛍光ビーズを流通させたものではない。
　測定は、１０回繰り返し実施され、それぞれの測定の間で蛍光ビーズを流路内で順番が変わらぬように静かに動かした。ただし、蛍光ビーズは流れていない状態で、動かされている。なお、図７～図９では、蛍光１４３が用いられているが、蛍光１４３を前方散乱光１４２に置き換えることで、前方散乱光１４２についても同様の議論を行うことができる。
　３３個の蛍光ビーズは、同じサンプル集団４０１に属すサンプル１３１を模している。それぞれの蛍光ビーズは、基本的には同程度の蛍光強度を示すが、蛍光ビーズ毎ごとに多少のばらつきがある。また、蛍光ビーズを流路内で動かすことは、以下のことを模している。つまり、フローサイトメータ１において、キャピラリ１２２を移動しているサンプル１３１が、レーザ光１４１に対して測定回毎に微妙に異なる位置や角度で測定されることを模している。
　図７は、１～１０回までの各測定回における、３３個の蛍光ビーズに由来する蛍光１４３の強度（蛍光強度）をプロットした箱ひげ図である。図７に示すひとつひとつのプロット点４１１は、蛍光ビーズによる蛍光強度を表している。ただし、同じ数値の結果が複数存在するため、図７におけるプロット数は３３より少なく示されている。なお、箱ひげ図における「×」印は平均値を示している。
　一方、図８は、それぞれの蛍光ビーズについて１０回の測定値を平均した結果を用いた箱ひげ図である。図８において、ひとつひとつのプロット点４１２は、それぞれの蛍光ビーズにおける蛍光強度の１０回平均値を表している。図７と同様、同じ数値の結果が存在するため、図７におけるプロット数は１０より少なく示されている。
　図７及び図８に示す結果を比較すると、蛍光強度を複数回測定に基づく平均値とした場合（図８）、単回測定の場合（図７）よりも、蛍光ビーズ間の蛍光強度のばらつきが小さくなっていることがわかる。
　また、図９は、図７及び図８と同様の実験において、サンプル１３１（蛍光ビーズ）に由来する蛍光強度のばらつきが、測定回を重ねるごとに減少していく様子を示した結果である。
　図９において、縦軸には、３３個の蛍光ビーズ間での蛍光強度のばらつきとして変動係数（ＣＶ：Coefficient of Variation）が示されている。横軸は、ばらつきの計算に用いた積算測定回数を示している。例えば、積算測定回数が３回の場合は、それぞれの蛍光ビーズについて１回目～３回目の測定における蛍光強度の平均値を用いて、蛍光ビーズ間での蛍光強度のばらつきが計算されている。
　図９によれば、６回程度の測定により、サンプル１３１に由来する蛍光強度のばらつきが最小化している。前記したように、フローサイトメータ１のサンプル１３１（細胞）同様、それぞれの蛍光ビーズに元々備わっている、蛍光強度の差（ばらつき）がある。そのため、測定回数を増やし続けても、ばらつき抑制の効果は頭打ちとな。
　つまり、図７～図９に示す実験では、フローサイトメータ１で同一のサンプル１３１を複数回測定し、その平均値をサンプル１３１それぞれの信号値として扱うことが模擬されている。これにより、レーザ光１４１の照射に対するサンプル１３１の位置ブレや、向きの違いによるデータばらつきを抑えることができる。これにより、フローサイトメータ１の解析においてサンプル集団４０１の分離を明瞭化することができる。
　（処理装置２００）
　図１０は、処理装置２００の構成を示す図である。適宜、図１、図４を参照する。
　処理装置２００は、演算装置２０１、記憶装置２０２、入力装置２０３、出力装置２０４、通信装置２０５、メモリ２１０等を備える。
　演算装置２０１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）や、ＧＰＵ（Graphic User Interface）等で構成される。記憶装置２０２は、ＨＤＤ（Hard Disk Drive）や、ＳＳＤ（Solid State Drive）等で構成される。入力装置２０３は、キーボードや、マウス等で構成される。出力装置２０４は、ディスプレイ等で構成される。通信装置２０５は、図１、図４で示すラインセンサ１２３、３２３や、２ＤＣＣＤカメラ３１４から信号を受け取る。メモリ２１０は、ＲＡＭ（Random Access Memory）等の揮発性メモリで構成される。
　そして、記憶装置２０２に格納されているプログラムがメモリ２１０にロードされ、ロードされたプログラムが演算装置２０１によって実行される。これにより、計算部２１１、ゲーティング部２１２、判定部２１３が具現化する。
　計算部２１１は、図５Ａ～図９で説明したように、Ｎ回測定された結果、得られる測定値の平均値を算出する。ゲーティング部２１２は、計算部２１１が計算した平均値を基に測定結果をゲーティングし、サンプル集団４０１を抽出する。判定部２１３は、隣接するサンプル集団４０１が明瞭に分かれているか否かを判定する。
　（フローチャート）
　図１１は、本実施形態に係るフローサイトメータ信号解析方法の手順を示すフローチャートである。適宜、図１、図１０を参照する。
　まず、それぞれのサンプル１３１がフローサイトメータ１でＮ回（図５Ａ～図９に示す例では、Ｎ＝６あるいは１０）測定される（Ｓ１）。ステップＳ１は、複数のサンプル１３１に対し、それぞれのサンプル１３１について複数回測定を行う測定ステップである。
　続いて、計算部２１１は、それぞれのサンプル１３１について、散乱光強度及び蛍光強度のＮ回平均値を算出する（Ｓ２）。ステップＳ２は、測定ステップ（Ｓ１）による測定結果に対して統計処理を行う統計処理ステップである。ステップＳ２において、計算部２１１は、それぞれのサンプル１３１について、前記複数回測定の結果の値の平均値を算出する。
　そして、ゲーティング部２１２は、ステップＳ２で算出された、それぞれのサンプル１３１のＮ回平均値を図５Ｂ、図６Ｂに示すようなプロット図にプロットする。そして、ゲーティング部２１２は、プロット点４０２（図５Ｂ、図６Ｂ参照）に対してゲーティング（クラスタリング）を行うことで、サンプル集団４０１を抽出する（Ｓ３）。ステップＳ３は、統計処理ステップ（Ｓ２）の結果を基に、サンプル集団４０１を抽出するゲーティングを行うゲーティングステップである。ステップＳ３において、ゲーティング部２１２は、ｋ－ｍｅａｎｓ法や、サポートベクトルマシン等を用いてゲーティングを行う。ステップＳ３において、ゲーティング部２１２は、平均値に基に、サンプル集団４０１を抽出する
　続いて、判定部２１３が、ステップＳ３で抽出されたサンプル集団４０１の境界は明瞭であるか否かを判定する（Ｓ４）。判定部２１３は、隣接するサンプル集団４０１の境界が重複していないか否かを判定することで、サンプル集団４０１の境界は明瞭であるか否かを判定する。判定部２１３は、隣接するサンプル集団４０１の境界が重複していない場合、サンプル集団４０１の境界は明瞭であると判定する。
　サンプル集団４０１の境界が明瞭である場合（Ｓ４→Ｙｅｓ）、解析は終了となる。
　サンプル集団４０１の境界が明瞭ではない場合（Ｓ４→Ｎｏ）、Ｎ回測定値の中から外れ値の除外が行われる（Ｓ５）。外れ値の除外は、ユーザがプロット図を基に手作業で行ってもよいし、マハラノビス距離や、箱ひげ図等を用いてゲーティング部２１２が行ってもよい。
　ステップＳ５で外れ値の除外が行われた後、処理装置２００はステップＳ２へ処理を戻す。これにより、処理装置２００は、外れ値の除外が行われたデータを用いてＮ回平均値、ゲーティングを行う。複数回測定の平均値によってサンプル集団４０１が抽出されることにより、ステップＳ５における外れ値の除外の回数を低減することができる。
　第２実施形態によれば、複数回の測定結果を解析することにより、単回測定の場合と比較してプロット点４０２（図５Ｂ及び図６Ｂ参照）における集団の広がりを小さく抑えることができる。この結果、ゲーティングにおいてサンプル集団４０１の境界を明瞭にすることができる。
　本発明は前記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明したすべての構成を有するものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　また、フローサイトメータ１は、アナライザでもセルソータでもよい。
　また、前記した各構成、機能、計算部２１１～判定部２１３、記憶装置２０２等は、それらの一部又はすべてを、例えば集積回路で設計すること等によりハードウェアで実現してもよい。また、図１０に示すように、前記した各構成、機能等は、ＣＰＵ等のプロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、ＨＤに格納すること以外に、メモリや、ＳＳＤ（等の記録装置、又は、ＩＣ（Integrated Circuit）カードや、ＳＤ（Secure Digital）カード、ＤＶＤ（Digital Versatile Disc）等の記録媒体に格納することができる。
　また、各実施形態において、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしもすべての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には、ほとんどすべての構成が相互に接続されていると考えてよい。
　１　　　フローサイトメータ
　１１０　レーザブロッカ
　１１１　第１のレーザブロッカ
　１１２　第２のレーザブロッカ
　１１３　第３のレーザブロッカ
　１２１　ライトシート（光源部）
　１２２　キャピラリ
　１２２ａ　軸中心
　１２３　ラインセンサ（受光部）
　１２３ａ　受光面
　１３１　サンプル
　１４１　レーザ光
　１４２　前方散乱光
　１５１ａ　整列面
　１７１　矢印（光源部の方向にキャピラリの軸中心を投影した位置）
　１７２　矢印（受光部の方向にキャピラリの軸中心を投影した位置）
　２００　処理装置
　４０１　サンプル集団
　Ｓ１　　それぞれのサンプルをＮ回測定（測定ステップ）
　Ｓ２　　Ｎ回平均値を算出（統計処理ステップ）
　Ｓ３　　サンプル集団の抽出（ゲーティングステップ）

Claims (6)

  1. 　複数のキャピラリにレーザ光を照射する光源部と、
    　前記キャピラリに対し、前記レーザ光が照射された側とは反対側に散乱する前方散乱光を受光する受光部と、
    　光を遮蔽するレーザブロッカと、
    　を備えるフローサイトメータであって、
    　前記レーザブロッカとして、
    　前記レーザ光が入射する側における前記キャピラリの整列面を含む前記光源部に近い位置、かつ、前記光源部の方向に前記キャピラリの軸中心を投影した位置からずれた位置に配置される第１のレーザブロッカと、
    　前記キャピラリと、前記受光部との間、かつ、キャピラリ同士の間に設置される第２のレーザブロッカと、
    　前記受光部の受光面において、前記受光部の方向に前記キャピラリの軸中心を投影した位置に設置される第３のレーザブロッカと、
    　を有するフローサイトメータ。
  2. 　前記第１のレーザブロッカは、前記レーザ光が入射する側における前記キャピラリの整列面に設置され、
    　前記第２のレーザブロッカは、前記レーザ光が入射する側における前記キャピラリの整列面から前記受光部の受光面まで設置される
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
  3. 　前記キャピラリは、蛇行している経路を有する１本のキャピラリである
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
  4. 　直線状の前記キャピラリが複数配置される
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
  5. 　前記光源部は、ライトシートである
    　ことを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
  6. 　複数のキャピラリにレーザ光を照射する光源部と、
    　前記キャピラリに対し、前記レーザ光が照射された側とは反対側に散乱する前方散乱光を受光する受光部と、
    　光を遮蔽するレーザブロッカと、
    　処理装置と、
    　を備え、
    　前記レーザブロッカとして、
    　前記レーザ光が入射する側における前記キャピラリの整列面を含む前記光源部に近い位置、かつ、前記光源部の方向に前記キャピラリを投影した位置からずれた位置に配置される第１のレーザブロッカと、
    　前記キャピラリと、前記受光部との間、かつ、前記キャピラリの間に設置される第２のレーザブロッカと、
    　前記受光部の受光面において、キャピラリとの間に設置される第３のレーザブロッカと、
    　を有し、
    　前記処理装置は、
    　複数のサンプルに対し、それぞれの前記サンプルについて複数回測定を行う測定ステップと、
    　前記測定ステップによる測定結果に対して統計処理を行う統計処理ステップと、
    　前記統計処理ステップの結果を基に、サンプル集団を抽出するゲーティングを行うゲーティングステップと、
    　を実行し、
    　前記処理装置は、
    　前記統計処理ステップで、
    　それぞれのサンプルについて、前記複数回測定の結果の値の平均値を算出し、
    　前記ゲーティングステップで、
    　当該平均値に基に、前記サンプル集団を抽出する
    　フローサイトメータ信号解析方法。
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