WO2025258399A1 - 環状ペプチドのライブラリ、スクリーニング方法、及びペプチドの作製方法 - Google Patents

環状ペプチドのライブラリ、スクリーニング方法、及びペプチドの作製方法

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WO2025258399A1
WO2025258399A1 PCT/JP2025/019357 JP2025019357W WO2025258399A1 WO 2025258399 A1 WO2025258399 A1 WO 2025258399A1 JP 2025019357 W JP2025019357 W JP 2025019357W WO 2025258399 A1 WO2025258399 A1 WO 2025258399A1
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WO
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amino acid
acid residues
cyclic
library
peptide
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PCT/JP2025/019357
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French (fr)
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森 泉田
由紀子 石井
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Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • This disclosure relates to a cyclic peptide library, a screening method, and a method for producing peptides.
  • Peptides and other medium-molecular-weight compounds have attracted attention as compounds that combine the low manufacturing costs and high stability of small molecular weight compounds with the binding ability to target substances of large molecular weight compounds such as antibodies, and are beginning to be used in a wide range of bio-related industries, including therapeutic and diagnostic drugs.
  • peptides are being considered for use as antibody-binding ligands, antibody labeling linkers, antibody-drug conjugate linkers, drug delivery vehicles, etc. (See, for example, JP 2017-095443 A).
  • a modality known as PDC Peptide Drug Conjugate
  • PDC Peptide Drug Conjugate
  • nucleic acids encoding multiple types of peptides with partial or complete randomized amino acid sequences are first prepared.
  • multiple types of peptides are expressed based on the prepared nucleic acids.
  • Peptides are selected based on desired properties, such as binding to the target substance, and the nucleic acids associated with the selected population are amplified. This process is repeated multiple times as necessary, and then the base sequences of the nucleic acids are decoded to identify peptides with the desired activity (see, for example, JP 2012-058092 A and WO 2023/048290 A).
  • the present disclosure relates to a cyclic peptide library that can obtain cyclic peptides with high binding properties to target substances, as well as a screening method using the cyclic peptide library and a method for producing peptides.
  • Means for solving the above problems include the following aspects.
  • a library of 102 or more types of cyclic peptides each having a plurality of amino acid residues constituting a cyclic portion and at least one amino acid residue linked to the cyclic portion, the plurality of amino acid residues constituting the cyclic portion comprise a pair of amino acid residues that are spaced apart in the primary structure of the cyclic peptide and bond to each other to form a ring, and a plurality of amino acid residues that are sandwiched between the pair of amino acid residues in the primary structure of the cyclic peptide;
  • the at least one amino acid residue linked to the cyclic portion at least one amino acid residue adjacent to the pair of amino acid residues is randomized.
  • a library of cyclic peptides ⁇ 2> The cyclic peptide library according to ⁇ 1>, wherein each of the cyclic peptides is linked to a nucleic acid.
  • ⁇ 4> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the pair of amino acid residues is bonded to form a ring by a thioether bond or an amide bond.
  • ⁇ 5> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein, among at least one amino acid residue linked to the cyclic portion, the amino acid residue adjacent to the C-terminal amino acid residue of the pair of amino acid residues is randomized.
  • ⁇ 6> The cyclic peptide library according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein some or all of the amino acid residues sandwiched between the pair of amino acid residues are randomized.
  • ⁇ 7> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the ratio of the number of hydrophilic residues among all randomized amino acid residues to the total number of randomized amino acid residues in the cyclic peptide is 0.4 or more.
  • the hydrophilic residue is an amino acid residue containing at least one selected from the group consisting of a charged functional group, a hydroxyl group, and an amide group.
  • ⁇ 9> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the ratio of the number of charged residues among all randomized amino acid residues to the total number of randomized amino acid residues in the cyclic peptide is 0.2 or more.
  • ⁇ 10> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein none of the randomized amino acid residues in the cyclic peptides contains either an amino group or a sulfhydryl group.
  • ⁇ 11> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, comprising a plurality of cyclic peptides each having a different number of amino acid residues constituting the cyclic portion.
  • ⁇ 12> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, wherein the average number of amino acid residues constituting the cyclic portion is 11 or more.
  • ⁇ 13> The library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, which is an mRNA display library or a cDNA display library.
  • ⁇ 14> Preparing a library of cyclic peptides according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>; selecting a cyclic peptide having binding activity to a target substance from a library of cyclic peptides, and identifying the base sequence of a nucleic acid associated with the selected cyclic peptide;
  • a screening method comprising: ⁇ 15> A method for producing a peptide, comprising obtaining a peptide having binding activity to a target substance based on the base sequence identified by the screening method according to ⁇ 14>.
  • the present disclosure provides a cyclic peptide library that can obtain cyclic peptides with high binding affinity to target substances, as well as a screening method using the cyclic peptide library and a method for producing peptides.
  • 1 shows a schematic diagram of an example of a cyclic peptide. 1 is a graph showing the amount of cyclic peptide bound to FGFR in Example 2.
  • a "step” or a word expressing a step includes not only a step that is independent of other steps, but also a step that cannot be clearly distinguished from other steps as long as the purpose of the step is achieved.
  • a numerical range indicated using “to” indicates a range that includes the numerical values before and after "to" as the minimum and maximum values, respectively.
  • the upper or lower limit value described in one numerical range may be replaced with the upper or lower limit value of another numerical range described in stages.
  • the upper or lower limit value of that numerical range may be replaced with a value shown in the examples.
  • a combination of two or more preferred aspects is a more preferred aspect.
  • the configuration of the embodiment is not limited to the configuration shown in the drawings.
  • the cyclic peptides used in the cyclic peptide library of the present disclosure are cyclic peptides having a plurality of amino acid residues constituting a cyclic portion and at least one amino acid residue linked to the cyclic portion, and the plurality of amino acid residues constituting the cyclic portion are cyclic peptides consisting of a pair of amino acid residues that are spaced apart in the primary structure of the cyclic peptide and bond to each other to form a ring, and a plurality of amino acid residues that are sandwiched between the pair of amino acid residues in the primary structure of the cyclic peptide.
  • a cyclic peptide refers to a peptide that is partially cyclized to form a cyclic portion.
  • a cyclic peptide forms a closed ring structure by binding a pair of cyclized amino acid residues to each other via a bond other than a backbone peptide bond.
  • Cyclic peptides typically have one cyclic portion, but may have two or more (e.g., two or three) cyclic portions as long as they are expected to have binding properties to a target substance.
  • cyclic portion the portion that forms a ring structure is referred to as a "cyclic portion,” and the portion that does not form a ring structure is referred to as a "chain portion.”
  • the “multiple amino acid residues constituting the cyclic portion” are also referred to as “cyclic portion amino acid residues.”
  • At least one amino acid residue linked to the cyclic portion is also referred to as “an amino acid residue in the chain portion.”
  • a “pair of amino acid residues that are spaced apart in the primary structure of a cyclic peptide and bonded to each other to form a ring” is also referred to as a "cyclizing amino acid residue.”
  • amino acid residues adjacent to the above-mentioned pair of amino acid residues are also referred to as "adjacent amino acid residues”.
  • a peptide refers to a molecule in which amino acids are linked by peptide bonds, and there are no limitations on the amino acid sequence, the number of amino acid residues, the type of amino acid, the base sequence encoding the peptide, etc.
  • the term peptide encompasses proteins.
  • amino acids include natural amino acids, unnatural amino acids, and derivatives thereof.
  • natural amino acids refers to amino acids that commonly constitute proteins, including alanine (Ala, A), arginine (Arg, R), asparagine (Asn, N), aspartic acid (Asp, D), cysteine (Cys, C), glutamine (Gln, Q), glutamic acid (Glu, E), glycine (Gly, G), histidine (His, H), isoleucine (Ile, I), leucine (Leu, L), lysine (Lys, K), methionine (Met, M), phenylalanine (Phe, F), proline (Pro, P), serine (Ser, S), threonine (Thr, T), tryptophan (Trp, W), tyrosine (Tyr, Y), and valine (Val, V). Natural amino acids may be natural or artificial.
  • unnatural amino acids refer to amino acids other than the 20 types of amino acids listed above, and may be natural or artificial.
  • unnatural amino acids include amino acids with haloacetyl groups (e.g., chloroacetylated lysine, chloroacetyldiaminobutyric acid, and other chloroacetylated amino acids), N-methylamino acids (e.g., N-methylalanine, N-methylphenylalanine), and the like.
  • Derivatives of natural or unnatural amino acids include hydroxy acids, mercapto acids, and carboxylic acids.
  • Amino acids in peptides may be post-translationally modified.
  • post-translational modifications of amino acids include phosphorylation, methylation, acetylation, glycosylation, and lipidation.
  • Amino acids in a peptide may be modified in other ways.
  • amino acids in a peptide may be bound to a labeling compound.
  • a labeling compound is a substance that can be detected by biochemical, chemical, immunochemical, or electromagnetic detection methods.
  • labeling compounds include dye compounds, fluorescent substances, chemiluminescent substances, bioluminescent substances, radioisotope-labeled substances, enzyme substrates, coenzymes, antigenic substances, substances that bind to specific proteins, and magnetic substances.
  • Labeled amino acids can be classified by function, and include fluorescently labeled amino acids, photoresponsive amino acids, photoswitch amino acids, and fluorescent probe amino acids.
  • the amino acid and labeling compound may be bonded directly or via a spacer.
  • spacers include polyolefins such as polyethylene and polypropylene; polyethers such as polyoxyethylene and polyethylene glycol; polyvinyl alcohol, polystyrene, polyvinyl chloride, polyester, polyamide, polyimide, polyurethane, and polycarbonate.
  • the number of amino acid residues in the cyclic peptide is not particularly limited, and from the viewpoint of binding ability to the target substance, it is preferably 8 or more, more preferably 10 or more, and even more preferably 12 or more. From the viewpoints of the efficiency of forming nucleic acid-peptide conjugates and the production costs of cyclic peptides, the number of amino acid residues in the cyclic peptide is preferably 300 or less, more preferably 150 or less, and even more preferably 100 or less. From these viewpoints, the number of amino acid residues in the cyclic peptide is preferably 8 to 300, more preferably 10 to 150, and even more preferably 12 to 100. If the library contains cyclic peptides with different numbers of amino acid residues, the above range is the average range of the number of amino acid residues of the cyclic peptides present in the library.
  • the cyclic portion amino acid residues consist of a pair of cyclized amino acid residues and multiple amino acid residues sandwiched between the pair of cyclized amino acid residues.
  • the phrase "consisting of a pair of cyclized amino acid residues and multiple amino acid residues sandwiched between the pair of cyclized amino acid residues" means that the amino acid residues in the cyclic portion are composed only of a pair of cyclized amino acid residues and multiple amino acid residues sandwiched between the pair of cyclized amino acid residues, and there are no particular restrictions on the composition other than the amino acid residues.
  • the cyclic portion may or may not contain components other than amino acid residues, such as components added by the above-mentioned post-translational modification (such as sugar chains, lipids, etc.) or labeling compounds.
  • the number of amino acid residues in the cyclic portion is not particularly limited, and from the perspective of library diversity and binding to target substances, it is preferably 6 or more, more preferably 8 or more, even more preferably 10 or more, particularly preferably 11 or more, and extremely preferably 12 or more. From the perspective of nucleic acid-peptide conjugate formation efficiency and production costs, the number of amino acid residues in the cyclic portion is preferably 200 or less, more preferably 100 or less, and even more preferably 50 or less. From these perspectives, the number of amino acid residues in the cyclic portion is preferably 6 to 200, more preferably 8 to 200, even more preferably 10 to 200, particularly preferably 11 to 100, and extremely preferably 12 to 50. If the library contains cyclic peptides with different numbers of amino acid residues in the cyclic portion, the above range refers to the average range of the number of amino acid residues in the cyclic portion of the cyclic peptides present in the library.
  • a pair of cyclized amino acid residues is a pair of amino acid residues that are spaced apart in the primary structure of the cyclic peptide and bond to each other to form a ring.
  • the phrase "spaced apart in the primary structure" means that the pair of amino acid residues is not adjacent amino acids that are bonded by a peptide bond on the main chain.
  • Cyclized amino acid residues are typically bonded by a covalent bond, and it is preferred that the two amino acid residues are covalently bonded by each amino acid residue having a functional group that can be covalently bonded to each other other than the peptide bond on the main chain.
  • the functional group for cyclization may be present on the main chain or the side chain of the peptide, but from the viewpoint of facilitating the placement of amino acid residues on the outside of the cyclic moiety via main chain peptide bonds, the functional group is preferably present on the side chain of the peptide.
  • Examples of functional groups for cyclization include thiol groups, haloacetyl groups (such as chloroacetyl groups), amino groups in the side chains, and carboxy groups in the side chains.
  • Examples of the combination of functional groups in a pair of cyclized amino acid residues include a combination of thiol groups, a combination of a thiol group and a haloacetyl group (such as a chloroacetyl group), and a combination of an amino group and a carboxy group.
  • Examples of the bond between cyclized amino acid residues include a thioether bond, an amide bond, and a disulfide bond. From the viewpoint of chemical stability, a thioether bond or an amide bond is preferred, and from the viewpoint of cyclization efficiency under physiological conditions, a thioether bond is more preferred.
  • amino acids having a thiol group examples include cysteine, homocysteine, etc.
  • amino acids having a chloroacetyl group include chloroacetyldiaminobutyric acid, chloroacetylated lysine, etc.
  • amino acids having a carboxy group in the side chain examples include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acids having an amino group in the side chain include lysine, ornithine, and diaminobutyric acid.
  • the pair of cyclized amino acid residues is preferably a combination of an amino acid having a thiol group (e.g., cysteine) and an amino acid having a chloroacetyl group (e.g., chloroacetyldiaminobutyric acid, chloroacetyllysine).
  • a thiol group e.g., cysteine
  • an amino acid having a chloroacetyl group e.g., chloroacetyldiaminobutyric acid, chloroacetyllysine
  • the type of amino acid residue sandwiched between a pair of cyclized amino acid residues is not particularly limited, and may be any of the amino acids described above.
  • amino acid residues in the cyclic portion may be partially or completely randomized, or may not be randomized. The randomization of amino acid residues will be described later.
  • a cyclic peptide has at least one amino acid residue linked to the cyclic portion (i.e., a chain portion amino acid residue).
  • the chain portion may be present only at the N-terminus of the cyclic portion, only at the C-terminus, or at both the N-terminus and C-terminus.
  • the amino acid residue adjacent to the cyclized amino acid residue is the adjacent amino acid residue.
  • the number of amino acid residues in the linear portion (i.e., the total number of amino acid residues in the linear portion on the N-terminal and C-terminal sides of the cyclic portion) is preferably two or more from the viewpoint of binding affinity to the target substance. From the viewpoints of the efficiency of forming a nucleic acid-peptide conjugate and the production costs of the cyclic peptide, the number of amino acid residues in the linear portion (i.e., the total number of amino acid residues in the linear portion on the N-terminal and C-terminal sides of the cyclic portion) is preferably 100 or less, and more preferably 50 or less.
  • the number of amino acid residues in the linear portion is preferably 2 to 100, and more preferably 2 to 50. If the library contains cyclic peptides with different numbers of amino acid residues in their linear portions, the above range refers to the average range of the number of amino acid residues in the linear portion of the cyclic peptides present in the library.
  • the cyclic peptide library of the present disclosure is a library of 102 or more types of cyclic peptides each having a plurality of amino acid residues constituting a cyclic portion (i.e., cyclic portion amino acid residues) and at least one amino acid residue linked to the cyclic portion (i.e., chain portion amino acid residue), wherein the plurality of amino acid residues constituting the cyclic portion (cyclic portion amino acid residues) are composed of a pair of amino acid residues that are spaced apart in the primary structure of the cyclic peptide and bond to each other to form a ring (i.e., cyclized amino acid residues), and a plurality of amino acid residues sandwiched between the pair of amino acid residues in the primary structure of the cyclic peptide, and at least one amino acid residue adjacent to the pair of amino acid residues (i.e., adjacent amino acid residue) among at least one amino acid residue in the chain portion is randomized
  • Figure 1 is a schematic diagram for illustrative purposes only, and the cyclic peptides of the present disclosure are not limited to the embodiment shown in Figure 1.
  • Figure 1 is a schematic diagram of a portion of an example cyclic peptide, including a cyclic portion 10 and a linear portion 20.
  • a-r each represent any amino acid residues connected in alphabetical order by a main chain peptide bond, with a representing the N-terminal side and r representing the C-terminal side.
  • the multiple amino acid residues d-o constituting the cyclic portion 10 consist of a pair of amino acid residues d (12a) and o (12b) that are spaced apart in the primary structure of the cyclic peptide and bonded to each other to form a ring, and multiple amino acid residues e-n sandwiched between the pair of amino acid residues d (12a) and o (12b) in the primary structure of the cyclic peptide.
  • amino acid residues a-c and p-r linked to the cyclic portion 10 at least one amino acid residue c (22a) and/or p (22b) adjacent to the pair of amino acid residues d (12a) and o (12b) is randomized.
  • amino acid residues d to o are “multiple amino acid residues constituting the cyclic portion,” that is, “cyclic portion amino acid residues.”
  • the amino acid residues a to c and p to r in the example of FIG. 1 are “at least one amino acid residue linked to the cyclic portion,” ie, “chain portion amino acid residues.”
  • amino acid residues d (12a) and o (12b) are "a pair of amino acid residues that are spaced apart in the primary structure of the cyclic peptide and bond to each other to form a ring,” i.e., “cyclizing amino acid residues.”
  • amino acids c (22a) and p (22b) are “among the amino acid residues in the chain portion, amino acid residues adjacent to the above pair of amino acid residues,” i.e., “adjacent amino acid residues.”
  • the cyclic peptide library of the present disclosure makes it possible to obtain cyclic peptides with high binding affinity to target substances.
  • the reason for this is not entirely clear, but is presumed to be as follows:
  • the cyclic peptide library of the present disclosure at least one of the adjacent amino acid residues linked to the cyclic portion of the peptide is randomized. It is presumed that by selecting a preferred cyclic peptide from such a cyclic peptide library based on its binding affinity to a target substance, it is possible to appropriately select adjacent amino acid residues and preferably select a cyclic peptide that can stably form and maintain the three-dimensional structure of the cyclic portion.
  • the cyclic peptide library of the present disclosure makes it possible to obtain cyclic peptides whose binding ability is less likely to decrease even when linked to other functional molecules. Details of the cyclic peptide are as described above.
  • each of the cyclic peptides is preferably associated with a corresponding nucleic acid.
  • each cyclic peptide can be linked to a nucleic acid to form a nucleic acid-peptide conjugate.
  • the nucleic acid-peptide conjugate can be used to prepare an mRNA display library, a cDNA display library, a ribosome display library, etc.
  • the linking position of the nucleic acid is not particularly limited and may be the N-terminus or C-terminus of the cyclic peptide, and is typically linked to the C-terminus of the cyclic peptide.
  • the cyclic peptides may be expressed on the surface of the phage and the corresponding nucleic acid may be incorporated inside the phage.
  • the nucleic acid contains a base sequence unique to each cyclic peptide, typically a base sequence that encodes the cyclic peptide, and the cyclic peptide can be identified by decoding the base sequence of the nucleic acid.
  • nucleic acid refers to a molecule that carries the information for synthesizing a peptide.
  • the term nucleic acid includes all nucleic acids (e.g., DNA, RNA, analogs thereof, natural products, and artificial products), as well as nucleic acids to which low molecular weight compounds, groups, non-nucleic acid molecules, structures, etc. are linked. Nucleic acids may be single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid may comprise mRNA. In one embodiment, the nucleic acid-peptide conjugate may be an mRNA-peptide conjugate. In one embodiment, the nucleic acid may comprise cDNA. In one embodiment, the nucleic acid-peptide conjugate may be a cDNA-peptide conjugate. In one embodiment, the nucleic acid-peptide conjugate may be a conjugate of a double strand of mRNA and cDNA with a peptide (mRNA/cDNA-peptide conjugate).
  • the length of the nucleic acid is preferably 30 bases or more, more preferably 70 bases or more, and even more preferably 100 bases or more.
  • the "length of the nucleic acid” refers to the length of one strand of the nucleic acid.
  • the nucleic acid may be, for example, a transcription product of a population of double-stranded DNA fragments (also referred to as "template nucleic acids") prepared by overlap extension PCR using a random primer set containing a random sequence.
  • the random sequence is, for example, a triplet repeat sequence [NNN] m or [NNK] m (where m is a positive integer, N each independently represents A, T, G, or C, and K each independently represents T or G).
  • the number of triplet [NNN] or [NNK] repeats can be set to any number to prepare a peptide having a random amino acid sequence of any length.
  • the random sequence can be prepared by repeatedly linking an equal mixture of trimer oligonucleotides in which one type of codon is assigned to one type of amino acid.
  • the random sequence is preferably [NNK] m or a trimer oligonucleotide, and more preferably a trimer oligonucleotide.
  • the nucleic acid has a base sequence necessary for synthesizing a peptide using, for example, a cell-free peptide synthesis system.
  • the base sequence necessary for peptide synthesis includes, in addition to the coding region, for example, a ribosome binding sequence.
  • the base sequence of the template nucleic acid may or may not contain a stop codon.
  • a stop codon refers to a codon with which a paired tRNA is not present in the reaction solution of the cell-free peptide synthesis system.
  • the template nucleic acid may also contain a base sequence encoding a tag for translation promotion (also referred to as a "translation-promoting sequence”) described in WO 2023/048290.
  • the 3' end of the template nucleic acid contains a base sequence encoding a spacer.
  • the spacer is, for example, 1 to 100 amino acid residues or peptide residues selected from glycine and serine.
  • nucleic acid-peptide conjugates the nucleic acid and peptide are preferably linked via a component such as a linker or ribosome.
  • a linker is a structure that functions as a linking moiety that links a nucleic acid and a corresponding peptide.
  • linkers include compounds comprising a puromycin-like compound and a single-stranded nucleic acid of 10 to 100 bases (hereinafter, this compound is also referred to as a "puromycin linker"). The puromycin linker binds to the peptide via the puromycin-like compound.
  • the single-stranded nucleic acid of the puromycin linker has a sequence (hereinafter, also referred to as a "complementary portion") complementary to a portion of the nucleic acid portion (e.g., the 3' end of mRNA) that constitutes the nucleic acid-peptide conjugate, and binds to the nucleic acid portion at the complementary portion. This forms a nucleic acid-peptide conjugate.
  • a puromycin-like compound is a compound that has a chemical structure similar to the 3' end of aminoacyl-tRNA and has the ability to bind to the C-terminus of a synthesized peptide when protein synthesis is carried out in a cell-free peptide synthesis system.
  • Aminoacyl-tRNA is a tRNA in which an amino acid is covalently bound to a tRNA.
  • puromycin-like compounds include 3'-N-aminoacylpuromycin aminonucleosides (PANS-amino acids; for example, PANS-Gly, PANS-Val, PANS-Ala, etc.); 3'-N-aminoacyladenosine aminonucleosides (AANS-amino acids; for example, AANS-Gly, AANS-Val, AANS-Ala, etc.) in which the amino group of 3'-aminoadenosine is linked to the carboxyl group of an amino acid via an amide bond formed by dehydration condensation; nucleosides or compounds in which a nucleoside and an amino acid are linked via an ester bond; ribocytidylpuromycin, deoxydylpuromycin, deoxyuridylpuromycin, and the like.
  • PANS-amino acids for example, PANS-Gly, PANS-Val, PANS-Ala, etc.
  • the complementary portion refers to a portion of a single-stranded nucleic acid that binds to a nucleic acid by having a sequence complementary to a portion of the nucleic acid in a nucleic acid-peptide conjugate. From the perspective of the efficiency of forming a nucleic acid-peptide conjugate, it is preferable that the complementary portion bind to the 3' end of the region of the nucleic acid that encodes the peptide.
  • the puromycin linker may contain a spacer between the puromycin-like compound and the complementary portion.
  • the spacer may be any structure that can link the puromycin-like compound and the complementary portion, and examples thereof include polynucleotides, polyalkylenes (such as polyethylene), polyalkylene glycols (such as polyethylene glycol), peptide nucleic acids, polystyrene, and combinations thereof.
  • polyalkylenes such as polyethylene
  • polyalkylene glycols such as polyethylene glycol
  • peptide nucleic acids polystyrene, and combinations thereof.
  • they can be chemically linked using an appropriate linking group (-NH-, -CO-, -O-, -NHCO-, -CONH-, -NHNH-, -(CH 2 ) n - (n is a positive integer), -S-, -SO-, etc.).
  • Puromycin linkers include those described in WO 2005/012902.
  • the library of cyclic peptides is used in a display library, and the library of the present disclosure includes 10 or more types of cyclic peptides. Furthermore, the library of cyclic peptides associated with nucleic acids is used in a nucleic acid display library, and is a collection of multiple different types of cyclic peptides associated with nucleic acids.
  • the "type" of cyclic peptide refers to the type of amino acid sequence, and 102 or more types of cyclic peptides means cyclic peptides having 102 or more different amino acid sequences.
  • the library preferably contains 10 4 types or more of cyclic peptides, more preferably 10 6 types or more of cyclic peptides, even more preferably 10 8 types or more of cyclic peptides, and particularly preferably 10 10 types or more of cyclic peptides.
  • the number of types of cyclic peptides can be confirmed by identifying nucleic acids associated with the cyclic peptides using next-generation sequencing, and can also be calculated from the number of randomized sites and the number of amino acid types in the nucleic acid encoding the cyclic peptide.
  • the adjacent amino acid residue on the N-terminal side may be randomized, the adjacent amino acid residue on the C-terminal side may be randomized, or both may be randomized. From the perspective of likely exhibiting high binding affinity to the target substance, it is preferable that at least the adjacent amino acid residue on the C-terminal side is randomized, and it is more preferable that both the adjacent amino acid residues on the N-terminal side and the C-terminal side are randomized.
  • adjacent amino acid residues are each independently randomized to 10 or more types of amino acid residues, more preferably to 15 or more types of amino acid residues, even more preferably to 19 or more types of amino acid residues, and particularly preferably to 20 or more types of amino acid residues.
  • adjacent amino acid residues are each independently randomized to 25 or fewer types of amino acid residues, more preferably to 22 or fewer types of amino acid residues, and even more preferably to 20 or fewer types of amino acid residues.
  • adjacent amino acid residues are each independently randomized to 10 to 25 types of amino acid residues, more preferably to 15 to 22 types of amino acid residues, and even more preferably to 19 to 20 types of amino acid residues.
  • all other amino acid residues in the cyclic peptide may or may not be randomized.
  • the preferred number of types of amino acid residues to be randomized is independently the same as the preferred number of types of adjacent amino acid residues to be randomized.
  • the pair of cyclized amino acid residues is not randomized.
  • the amino acid residues other than the adjacent amino acid residues in the chain portion amino acid residues may or may not be randomized.
  • multiple contiguous amino acid residues starting from a randomized adjacent amino acid residue may be randomized.
  • the number of multiple contiguous amino acid residues starting from randomized adjacent amino acid residues is preferably 10 or less, and more preferably 5 or less, on each side.
  • the number of multiple contiguous amino acid residues starting from randomized adjacent amino acid residues may be 2 or more, or 3 or more, on each side, independently.
  • Randomization of amino acid residues refers to creating a collection of peptides in which there are two or more types of amino acid residues at corresponding predetermined positions.
  • randomization of amino acid residues at predetermined positions in a cyclic peptide refers to creating a collection of peptides that includes multiple cyclic peptides with the same number of amino acid residues in the cyclic portion (for example, 10 amino acid residues in the cyclic portion), and in which there are two or more types of amino acid residues at corresponding positions in such multiple cyclic peptides.
  • corresponding positions refers to positions that are the same distance from the cyclized amino acid residue on the N-terminal or C-terminal side (i.e., the number of amino acid residues from the cyclized amino acid residue on the N-terminal or C-terminal side).
  • the library contain multiple cyclic peptides with different numbers of amino acid residues in the cyclic portion.
  • the ratio of the number of hydrophilic residues among all randomized amino acid residues to the number of all randomized amino acid residues in the cyclic peptide is preferably 0.4 or more, more preferably 0.5 or more, and even more preferably 0.6 or more.
  • the ratio of the number of hydrophilic residues among all randomized amino acid residues to the number of all randomized amino acid residues is within the above range, nonspecific adsorption due to hydrophobicity is reduced, and a decrease in binding ability due to hydrophobic interactions with other linked molecules tends to be less likely to occur.
  • hydrophilic residue refers to an amino acid residue that does not contain an aromatic structure or an alkyl or alkylene structure having 5 or more carbon atoms in its side chain structure, and that has a hydrophilic group.
  • the hydrophilic residue includes an amino acid residue containing at least one selected from the group consisting of a charged functional group, a hydroxy group, and an amide group.
  • the charged functional group refers to a functional group that contains a positive or negative charge in an aqueous solution of pH 7, and examples thereof include a side chain carboxy group, a side chain amino group, and an imidazole group.
  • the ratio of the number of hydrophilic residues can be adjusted by specifying the types of amino acid residues to be randomized in the base sequence of the template nucleic acid.
  • the ratio of the number of charged residues among all randomized amino acid residues to the total number of randomized amino acid residues in the cyclic peptide is preferably 0.2 or more, more preferably 0.3 or more, and even more preferably 0.4 or more.
  • the ratio of the number of charged residues among all randomized amino acid residues to the total number of randomized amino acid residues is within the above range, nonspecific adsorption due to hydrophobicity is reduced, and a decrease in binding ability due to hydrophobic interactions with other linked molecules tends to be less likely to occur.
  • a charged residue refers to an amino acid residue that contains one or more positive or negative charges in the side chain structure in an aqueous solution at pH 7, and examples thereof include aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, and lysine.
  • the proportion of the number of charged residues can be adjusted by specifying the types of amino acid residues to be randomized in the base sequence of the template nucleic acid.
  • none of the randomized amino acid residues in the cyclic peptide contain an amino group or a sulfhydryl group, and it is even more preferable that they contain neither an amino group nor a sulfhydryl group.
  • the library may be any of a variety of display libraries, such as an mRNA display library, a cDNA display library, a ribosome display library, or a phage display library.
  • display libraries such as an mRNA display library, a cDNA display library, a ribosome display library, or a phage display library.
  • an mRNA display library, a cDNA display library, or a ribosome display library is preferred.
  • an mRNA display library or a cDNA display library is more preferred.
  • the method for producing the library is not particularly limited.
  • the library is produced by a cell-free peptide synthesis system.
  • the cell-free peptide synthesis system is a reaction system for peptide synthesis that does not use cells such as E. coli as they are, but rather utilizes components present within the cells of E. coli or the like.
  • Cell-free peptide synthesis systems include those that use cell extracts and those that use reaction solutions reconstituted with purified components of a cell extract (reconstituted cell-free peptide synthesis systems). Examples of those using cell extracts include those using Escherichia coli extract, wheat germ extract, rabbit erythrocyte extract, and insect cell extract.
  • the reconstituted cell-free peptide synthesis system can be constructed using purified ribosomes, aminoacyl-tRNA synthetases (ARS), tRNA, amino acids, GTP, ATP, translation initiation factors (IFs), elongation factors (EFs), release factors (RFs), ribosome recycling factors, and other factors necessary for cell-free peptide synthesis.
  • ARS aminoacyl-tRNA synthetases
  • tRNA amino acids
  • GTP GTP
  • ATP translation initiation factors
  • EFs elongation factors
  • RFs release factors
  • ribosome recycling factors and other factors necessary for cell-free peptide synthesis.
  • Any known cell-free peptide synthesis system can be used in the process of producing nucleic acid-peptide conjugates.
  • Examples of commercially available cell-free peptide synthesis systems include PUREfrex (Gene Frontier), PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit (New England BioLabs), S30 T7 High-Yield Protein Expression System (Promega), Human Cell-Free Protein Expression System (Takara Bio), Rapid Translation System (Roche), and Expressway Cell-Free Expression System (Invitrogen).
  • the nucleic acid supplied to the cell-free peptide synthesis system be a nucleic acid having a puromycin linker bound to the 3' end.
  • an mRNA-peptide conjugate produced by the cell-free peptide synthesis system may be reverse transcribed to produce a conjugate of a double-stranded mRNA and cDNA with a peptide.
  • the nucleic acid portion becomes a double-stranded nucleic acid, thereby obtaining a nucleic acid display library that eliminates the effects of tertiary structure formation in mRNA.
  • the screening method of the present disclosure includes preparing a library of the cyclic peptides of the present disclosure described above, selecting a cyclic peptide from the library of cyclic peptides that has binding activity for a target substance, and identifying the base sequence of a nucleic acid associated with the selected cyclic peptide.
  • Target substance is a term that includes compounds, groups, molecules, proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates, complexes of these, etc.
  • Target substances are preferably compounds that exhibit physiological activity, and examples include receptors, transcription factors, enzymes, coenzymes, regulatory factors, antibodies, antigens, DNA, RNA, exosomes, cells, tissues, fragments of these, complexes of these, and modifying groups of these.
  • Methods for selecting cyclic peptides with binding activity to target substances include various display methods.
  • Display methods include mRNA display, cDNA display, ribosome display, and phage display. From the perspective of high efficiency in introducing unnatural amino acids, mRNA display, cDNA display, and ribosome display are preferred. Furthermore, from the perspective of large library sizes that can be searched in a single test, mRNA display and cDNA display are more preferred.
  • cyclic peptides with high binding activity can be selected.
  • the method for evaluating binding activity is not particularly limited, and examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), surface plasmon resonance (SPR), and isothermal titration calorimetry (ITC).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • SPR surface plasmon resonance
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • the screening method of the present disclosure includes contacting the library with the target substance and incubating it.
  • the library and target substance are contacted in a buffer solution, and the pH and temperature of the buffer solution and the contact time are adjusted during incubation.
  • the target substance may be immobilized on a solid phase carrier, and the library may be contacted with the immobilized target substance.
  • the solid phase carrier There are no limitations on the solid phase carrier as long as it is capable of immobilizing the target substance, and examples include a microtiter plate, a substrate, beads, magnetic beads, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, and a PVDF membrane.
  • the target substance is immobilized on the solid phase carrier using known techniques.
  • a nucleic acid amplification system refers to a system that uses nucleic acid as a template to amplify nucleic acid.
  • the nucleic acid amplification reaction in a nucleic acid amplification system may be any of the following: polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR), transcription-mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), etc.
  • next-generation sequencers are those that determine base sequences by capturing fluorescence or luminescence linked to complementary strand synthesis by DNA polymerase or complementary strand joining by DNA ligase.
  • Specific examples include MiSeq (Illumina, Inc.; MiSeq is a registered trademark), HiSeq2000 (Illumina, Inc.; HiSeq is a registered trademark), and Roche454 (Roche).
  • the prepared peptide may be linked to another functional molecule.
  • functional molecules include compounds with cell-killing effects, labeling compounds, nucleic acids, liposomes, lipid nanoparticles, antibodies, etc.
  • the prepared peptide may be encapsulated in the liposome or lipid nanoparticle.
  • the cyclic peptide library, screening method, and peptide production method disclosed herein can be widely used in the development of therapeutic drugs, diagnostic agents, research reagents, pharmaceutical production, biomaterials production, etc.
  • the base represented by N is a mixed base consisting of equal amounts of four bases (A, T, G, and C), and the base represented by K is a mixed base consisting of equal amounts of two bases (T and G).
  • the notation (Tri19) represents a mixed base sequence obtained by mixing equal amounts of trimer oligonucleotides corresponding to 19 natural amino acids excluding methionine
  • the notation (Tri18) represents a mixed base sequence obtained by mixing equal amounts of trimer oligonucleotides corresponding to 18 natural amino acids excluding methionine and cysteine.
  • Libraries of SEQ ID NOs: 1 to 10 were prepared, and mRNA display was performed using these libraries under a total of 11 conditions according to the conditions in Table 1.
  • SEQ ID NO: 2 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAACAA AAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 3 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAAC AAAAAAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGCGGCGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 4 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAA CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 5 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAAC AAAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGCGGCGGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 6 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAAC AAAAAACATGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGCGGCGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 7 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAA CAAAAAACATGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGTAAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 8 GAAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATT TTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATATGGTTAAGAAAACAAAAAACA(Tri18)TGT(T ri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) TAG (Tri1 8) GGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGGTAAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • SEQ ID NO: 10 GAAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTT GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTTAAGAAAACA(Tri18)TGT(Tri18)( Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) TAG ( Tri18) GGTGGTTCTGGCGGTAGCAGGACGGGGGCGGCGGGGGTAAATAAATAAGCTTGAGTAT
  • the libraries of SEQ ID NOS: 1 to 10 were prepared by overlap extension PCR. Specifically, three types of DNA, namely, DNA of SEQ ID NOS: 11, 12, and any one of DNAs of SEQ ID NOS: 13 to 22, were mixed at 3 ⁇ mol/L, 1 ⁇ mol/L, and 1 ⁇ mol/L, respectively. In the presence of PlatinumTM SuperFi II DNA Polymerase (Thermo, 12361010), the three steps of 98°C for 30 seconds, followed by 7 cycles of 98°C for 10 seconds, 60°C for 10 seconds, and 72°C for 10 seconds, were repeated, and finally 72°C for 5 minutes. The three DNAs were ligated to prepare the desired library. The prepared library was purified and diluted to 10 ng/ ⁇ L. For condition 2, the two types of libraries prepared were mixed in equal amounts and subjected to the next step.
  • SEQ ID NO: 11 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGGAGATATACATATGGTTAAAAAACAAAAAAC
  • SEQ ID NO: 12 ATACTCAAGCTTATTTATTTATTACCCCCCGCCGCCCCCGTCCTGCTACCGCCAGAACCACC
  • SEQ ID NO: 13 GATATACATATGGTTAAGAAAACACAAAAAACA(Tri19)TGT(Tri19)(Tri19)(Tri 19) (Tri19) (Tri19) (Tri19) (Tri19) (Tri19) (Tri19) TAG (Tri19) GGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 14 GATATACATATGGTTAAGAAAACAAAAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 15 GATATACATATGGTTAAGAAAACAAAAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 16 GATATACATATGGTTAAGAAAACAAAAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 17 GATATACATATGGTTAAGAAAAACAAAACANNKTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNN
  • SEQ ID NO: 18 GATATACATATGGTTAAGAAAACAAAAACATGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGNNKGGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 19 GATATACATATGGTTAAGAAAAACAAAAAACATGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTAGGGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 20 GATATACATATGGTTAAGAAAAACAAAAAACA (Tri18) TGT (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) TAG (Tri18) GGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 21 GATATACATATGGTTAAGAAAAACAAAAAACA (Tri18) TGT (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) TAG (Tri18) GGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • SEQ ID NO: 22 GATATACATATGGTTAAGAAAACACAAAAAACA(Tri18)TGT(Tri18)(Tri18)(Tri 18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) (Tri18) TAG (Tri18) GGTGGTTCTGGCGGTAGC
  • the prepared library (SEQ ID NOs: 1-10 and their mixture) was reacted in the presence of T7 RNA polymerase (TaKaRa, 2540A) at 37°C for 30 minutes to produce library transcripts.
  • T7 RNA polymerase TaKaRa, 2540A
  • the RNA fragments were purified and diluted to 10 ⁇ mol/L.
  • the library transcripts (final concentration 5 ⁇ mol/L) and puromycin linker of SEQ ID NO:23 (final concentration 10 ⁇ mol/L) were mixed in TBS buffer (1.25 mmol/L Tris, 25 mmol/L NaCl, pH 7.5), heated at 95°C for 5 minutes, and then irradiated with 10 J of UV (365 nm) on ice to produce a complex of the library transcripts and puromycin linker.
  • SEQ ID NO: 23 (PsoralenC6)-UACCCCCCGCCGCCCCCCCGUCCU-(Sp18)-(Sp18)-(Sp18)-CC-(Puro) (See the diagram below for the structures of PsoralenC6, Sp18, and Puro.
  • the nucleotides between (PsoralenC6) and (Sp18) are RNA modified with OMe at the 2' position, and the other nucleotides represent unmodified DNA.
  • a tRNA with an anticodon of CUA that pairs with the UAG codon of mRNA was prepared by transcribing DNA of SEQ ID NO: 24.
  • This tRNA was aminoacylated with N-chloroacetylated lysine pdCpA (5'-phospho-2'-deoxyribocytidylylriboadenosine) ester.
  • This aminoacyl-tRNA is called aminoacyl-tRNA (1).
  • SEQ ID NO: 24 GTTGTAAACGACGGCCAGTGCCAAAGCTTGGGCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGT AGTTCAATGGTAGAACGTCGGTCTCTAAAACCGAGCGTTGAGGGTTCGATTCCTTTCTCTCCCAC
  • the library transcript and puromycin linker complex was translated in a translation solution containing PUREfrex 2.0 (Gene Frontier, PF201-0.25-5) and aminoacyl-tRNA. 5.25 ⁇ L of the complex, 7.5 ⁇ L of PUREfrex 2.0 Solution I, 0.75 ⁇ L of Solution II, 1.5 ⁇ L of Solution III, and dried aminoacyl-tRNA (1) (final concentration 0.5 ⁇ g/ ⁇ L) were mixed and reacted at 37°C for 60 minutes to produce an mRNA-cyclic peptide conjugate.
  • SEQ ID NO: 25 GCTACCGCCAGAACCACC
  • the supernatant was then mixed with 10 ⁇ L of magnetic bead-immobilized FGFR (reaction volume 50 ⁇ L) and incubated at room temperature (approximately 25°C) for 45 minutes. After the magnetic beads were washed three times with 100 ⁇ L of TBS buffer, the cDNA-mRNA-cyclic peptide conjugates that bind to FGFR were extracted. The extracted cDNA-mRNA-cyclic peptide conjugates were amplified using the following two-step PCR.
  • the amplification product was obtained by heating at 98°C for 30 seconds, followed by 6 to 15 cycles of three steps: 98°C for 10 seconds, 60°C for 10 seconds, and 72°C for 10 seconds, followed by a final treatment at 72°C for 5 minutes.
  • the amplification product was purified and diluted to 20 nmol/L.
  • SEQ ID NO: 26 GGAGATATACATATGGTTAAGAAAACAAAAC
  • SEQ ID NO: 27 CTGCTACCGCCAGAACCACC
  • the first-stage PCR amplification product (final concentration 10 nmol/L) was mixed with DNA of sequence number 11 (final concentration 0.5 ⁇ mol/L) and DNA of sequence number 12 (final concentration 0.5 ⁇ mol/L), and the mixture was heated in the presence of PlatinumTM SuperFi II DNA Polymerase (Thermo, 12361010) at 98°C for 30 seconds, followed by six cycles of three steps: 98°C for 10 seconds, 60°C for 10 seconds, and 72°C for 10 seconds, followed by a final treatment at 72°C for 5 minutes. This yielded DNA with the same sequence as the original library, except for the random sequence. The resulting library was purified, diluted to 2 ng/ ⁇ L, and used in the next round.
  • the base sequence of the first-stage PCR product from the eighth round was identified using MiSeq (Illumina) and Miseq Reagent kit v2 (300 cycles) (Illumina, MS-102-2022) according to Illumina's standard protocol.
  • Example 2 Evaluation of binding properties of peptides obtained by mRNA display From the group of peptides obtained in Example 1, six sequences that were present in large proportions in the population under each condition were selected, and their binding to FGFR1c was evaluated by ELISA.
  • amino acid sequences of the selected peptides are shown in the table below. Note that the peptides in bold and underlined are the peptides used in Example 3, described below.
  • the peptides used for evaluation were enzymatically synthesized by the following method.
  • a fusion peptide (SEQ ID NO: 31) was designed in which a translation-enhancing sequence (SEQ ID NO: 28), a peptide, a Myc tag (SEQ ID NO: 29), and a HiBiT tag (SEQ ID NO: 30) were linked in this order.
  • a template DNA sequence (SEQ ID NO: 32) was designed in which sequences necessary for transcription and translation initiation, such as a T7 promoter sequence, a Shine-Dalgarno sequence, and an initiation codon (ATG), were added to the 5'-end of the DNA sequence encoding the fusion peptide, and a group of stop codons was added to the 3'-end.
  • sequences necessary for transcription and translation initiation such as a T7 promoter sequence, a Shine-Dalgarno sequence, and an initiation codon (ATG)
  • SEQ ID NO: 28 VKKTKT SEQ ID NO: 29: EQKLISEEDL SEQ ID NO: 30: VSGWRLFKKIS SEQ ID NO: 31: MVKKTKT[ICFHGLYFWDVEXL]GSGSGSEQKLISEEDLGGSVSGWRLFKKIS (X is chloroacetylated lysine, and the amino acid sequence in [ ] is an example of the amino acid sequence of the peptide used in the binding evaluation listed in Table 2.
  • the amino acid sequence in [ ] differs for each peptide.
  • SEQ ID NO: 32 GAAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTA ACTTTAAGAAGGAGATATACCAATGGTTAAAAAAAACAAAAAACA [CATTGCTCTTACGAACGTCTGCAGTTC CATGGTCATGAAGCTCCGTTCCGTGTTTAGGTT]GGTTCTGGCAGTGGTTCCGAACAGAAAACTGATCAGC GAAGAAGATCTGGGTGGCTCTGTAAGTGGATGGCGATTATTCAAGAAGATTAGCTAATGAAATAACTAATCC (The part in [ ] is an example of a DNA sequence encoding the peptide to be evaluated, and the part in [ ] differs for each peptide.)
  • Template DNA was generated by two-step overlap extension PCR.
  • four types of DNA i.e., DNA of SEQ ID NO: 33, DNA of SEQ ID NO: 34, DNA of SEQ ID NO: 35, and DNA of SEQ ID NO: 36, were mixed at concentrations of 0.3 ⁇ mol/L, 0.3 ⁇ mol/L, 0.05 ⁇ mol/L, and 0.05 ⁇ mol/L, respectively, and 27 cycles of three steps of 98°C/10 seconds, 39°C/5 seconds, and 72°C/5 seconds were repeated in the presence of PrimeSTAR Max (TaKaRa, R045B), followed by 98°C/10 seconds, 58°C/5 seconds, and 72°C/5 seconds, were repeated to ligate DNA of SEQ ID NO: 28 and DNA of SEQ ID NO: 29.
  • the ligated DNA was purified and diluted to 50 ng/ ⁇ L.
  • SEQ ID NO: 33 GAAATTAATACGACTCACTATAGG
  • SEQ ID NO: 34 GAACCACTGCCAGAACC
  • SEQ ID NO: 35 GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGGAGATATACCAATGGTTAAAAAACAAAAAAC
  • SEQ ID NO: 36 GAACCACTGCCAGAACC[AACCTAAACACGGAACGGAGCTTCATGACCATGGAACTGCAGACGTTCGTAAGAGCAATG]TGTTTTTTTTTAAC (The part in [ ] is an example of a DNA sequence encoding the peptide to be evaluated, and the part in [ ] differs for each peptide.)
  • DNA of SEQ ID NO: 33 DNA of SEQ ID NO: 37, DNA of SEQ ID NO: 38, and the purified product from the first stage
  • concentrations of 0.3 ⁇ mol/L, 0.3 ⁇ mol/L, 0.0025 ⁇ mol/L, and 0.4 ng/ ⁇ L were mixed at concentrations of 0.3 ⁇ mol/L, 0.3 ⁇ mol/L, 0.0025 ⁇ mol/L, and 0.4 ng/ ⁇ L, respectively, and 30 cycles of 98°C/10 seconds, 58°C/5 seconds, and 72°C/5 seconds were repeated in the presence of PrimeSTAR Max (TaKaRa, R045B) to ligate DNA of SEQ ID NO: 38 and the purified product from the first stage, yielding template DNA (SEQ ID NO: 31).
  • the template DNA was purified and diluted to 50 ng/ ⁇ L.
  • SEQ ID NO: 37 GGATTAGTTATTCATTAGCTAATC
  • SEQ ID NO: 38 GGTTCTGGCAGTGGTTCCGAACAGAAACTGATCAGCGAAGAAGATCTGGGTGGCTCTGTAAGTGGATGGCGATTATTCAAGAAGATTAGCTAATGAATAACTAATCC
  • the concentration of the enzymatically synthesized peptide was measured using peptide diluted with Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution I (TOYOBO, NKB-101) and the Nano Glo HiBiT Lytic Detection System (Promega, N3040) and HiBiT Control Protein (Promega, N3010) according to the standard protocol for the Nano Glo HiBiT Lytic Detection System.
  • the FGFR binding ability of the enzymatically synthesized peptides was measured by ELISA to assess the amount of peptide binding to FGFR.
  • 5 ng of Recombinant Human FGFR1 alpha (IIIc) Fc Chimera Protein, CF (R&D Systems, 658-FR-050) was immobilized in each well of a 96-well plate and blocked with Pierce Protein-Free (PBS) Blocking Buffer (Thermo, 37572). After blocking, peptide diluted with Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution I (TOYOBO, NKB-101) was added and incubated at room temperature (approximately 25°C) for 3 hours.
  • PBS Pierce Protein-Free
  • Figure 2 and Table 3 show the binding amount (A) of peptides to FGFR1c when the added concentration of each peptide was 10 nM.
  • the binding amount (A) of the peptide with the highest binding amount was set to 100, and the normalized result was taken as the normalized binding amount (B).
  • the vertical axis represents the normalized binding amount (B)
  • the horizontal axis represents each condition.
  • the "average binding amount” in Table 3 represents the average value of the normalized binding amount (B) of the six peptides under each condition.
  • FIG. 2 and Table 3 show that peptides with high binding ability can be obtained by introducing random amino acids into the outer adjacent site of the cyclic portion. It was found that the average binding amount was higher under the condition where a random amino acid was introduced at the site adjacent to the C-terminus (condition 7) than under the condition where a random amino acid was introduced at the site adjacent to the N-terminus of the cyclic part (condition 6), and that the average binding amount was particularly higher under the condition where a random amino acid was introduced at both sites (condition 3). It was also found that the larger the ring size (the number of amino acid residues constituting the ring portion), the higher the average binding amount (conditions 3 to 5).
  • Example 3 Evaluation of linkage between mRNA display-obtained peptide and functional molecule From the peptides obtained in Example 2, one peptide with high binding ability was selected each under conditions 3, 6, 7, and 8, and the effect of randomizing adjacent amino acid residues on binding ability when linked to other functional molecules was investigated. Specifically, other peptide sequences mimicking functional molecules were linked to the N-terminus and C-terminus, and changes in binding ability before and after linkage were evaluated.
  • the amino acid sequence RRR was used as an example of a positively charged molecule
  • the amino acid sequence EEE was used as an example of a negatively charged molecule.
  • the peptide sequence before linkage is written as (Peptide)
  • the peptide sequences after linkage are RRR-(Peptide)-RRR and EEE-(Peptide)-EEE, respectively.
  • the peptides used for each evaluation and the evaluation of FGFR1c binding were prepared in the same manner as in Example 1. Under each of conditions 3, 6, 7, and 8, the amount of peptide binding to FGFR1c was measured for the peptide sequence before linkage, the peptide sequence linked with RRR, or the peptide sequence linked with EEE, and the normalized binding amount (B) was calculated.
  • the normalized binding amount (B) of the peptide sequence before linkage was used as the denominator and the normalized binding amount (B) of the peptide sequence after linkage was used as the numerator, and the results of calculating the change in binding amount due to linkage are shown in Table 4.

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Abstract

【解決手段】環状部を構成する複数のアミノ酸残基と、環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基と、を有する１０２種類以上の環状ペプチドのライブラリであって、環状部を構成する複数のアミノ酸残基は、環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基と、環状ペプチドの一次構造において上記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなり、環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基のうち、上記一対のアミノ酸残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基がランダム化されている、環状ペプチドのライブラリ。

Description

環状ペプチドのライブラリ、スクリーニング方法、及びペプチドの作製方法
　本開示は、環状ペプチドのライブラリ、スクリーニング方法、及びペプチドの作製方法に関する。
　低分子化合物が有する安価な製造原価及び高い安定性と、抗体等の高分子化合物が有する標的物質への結合性を併せ持つ化合物として、ペプチドをはじめとする中分子化合物が注目されており、治療薬及び診断薬をはじめとした広範囲のバイオ関連産業で使用され始めている。例えば、ペプチドは、抗体結合性リガンド、抗体標識用リンカー、抗体薬物複合体用リンカー、薬物運搬体等としての使用が検討されている（例えば、特開２０１７－０９５４４３号公報参照）。また、ペプチドと他の分子を連結することで薬効を発現する、ＰＤＣ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼ばれるモダリティも注目を集めている。
　標的物質への結合性等の、目的の活性を有するペプチドを効率的に取得する手法として、ファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ法、ｃＤＮＡディスプレイ法、リボソームディスプレイ法等の試験管内分子進化法が知られている。試験管内分子進化法では、まず、一部又は全部のアミノ酸配列がランダム化された複数種のペプチドをコードする核酸を調製する。次に、調製した核酸に基づき複数種のペプチドを発現する。標的物質に対する結合性等の、所望の性質に基づきペプチドを選抜し、選抜した集団と関連付けられた核酸を増幅する。これを必要に応じて複数ラウンド繰り返した後、核酸の塩基配列を解読することで、目的の活性を有するペプチドを特定する（例えば、特開２０１２－０５８０９２号公報、及び国際公開第２０２３／０４８２９０号参照）。
　従来の手法で標的物質に結合するペプチドを取得する場合、取得したペプチドの結合性が弱かったり、取得したペプチドに他の機能性分子を連結するとペプチドの結合性が低下したりするという問題があった。かかる状況に鑑み、本開示は、標的物質への高い結合性を有する環状ペプチドを取得可能な、環状ペプチドのライブラリ、並びに環状ペプチドのライブラリを用いたスクリーニング方法、及びペプチドの作製方法に関する。
　上記課題を解決するための手段は、以下の態様を含む。
＜１＞　環状部を構成する複数のアミノ酸残基と、環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基と、を有する１０２種類以上の環状ペプチドのライブラリであって、
　環状部を構成する複数のアミノ酸残基は、環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基と、環状ペプチドの一次構造において上記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなり、
　環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基のうち、上記一対のアミノ酸残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基がランダム化されている、
環状ペプチドのライブラリ。
＜２＞　環状ペプチドのそれぞれが、核酸と連結されている、＜１＞に記載の環状ペプチドライブラリ。
＜３＞　上記一対のアミノ酸残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基が、１９種類以上のアミノ酸残基にランダム化されている、＜１＞又は＜２＞に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜４＞　上記一対のアミノ酸残基がチオエーテル結合又はアミド結合により結合して環を形成している、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜５＞　環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基のうち、上記一対のアミノ酸残基のうちＣ末端側のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基がランダム化されている、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜６＞　さらに、上記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基の一部又は全てがランダム化されている、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜７＞　環状ペプチド中のランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、ランダム化された全てのアミノ酸残基中の親水性残基数の割合が０．４以上である、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜８＞　親水性残基が、荷電官能基、ヒドロキシ基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸残基である、＜７＞に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜９＞　環状ペプチド中のランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、ランダム化された全てのアミノ酸残基中の荷電残基数の割合が０．２以上である、＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜１０＞　環状ペプチド中のランダム化されたいずれのアミノ酸残基も、アミノ基及びスルフヒドリル基のいずれも含まない、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜１１＞　環状部を構成する複数のアミノ酸残基の数が異なる複数の環状ペプチドを含む、＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜１２＞　環状部を構成する複数のアミノ酸残基の平均個数が１１個以上である、＜１＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜１３＞　ｍＲＮＡディスプレイライブラリ又はｃＤＮＡディスプレイライブラリである、＜１＞～＜１２＞に記載の環状ペプチドのライブラリ。
＜１４＞　＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリを準備することと、
　環状ペプチドのライブラリから標的物質に対する結合活性を有する環状ペプチドを選択し、選択した環状ペプチドと関連付けられた核酸の塩基配列を同定することと、
を含む、スクリーニング方法。
＜１５＞　＜１４＞に記載のスクリーニング方法によって同定された塩基配列に基づき、標的物質に対する結合活性を有するペプチドを取得することを含む、ペプチドの作製方法。 
　本開示によれば、標的物質への高い結合性を有する環状ペプチドを取得可能な、環状ペプチドのライブラリ、並びに環状ペプチドのライブラリを用いたスクリーニング方法、及びペプチドの作製方法が提供される。
環状ペプチドの一例の概略図を示す。 実施例２における、ＦＧＦＲに対する環状ペプチドの結合量を示すグラフである。
　以下、本開示の実施形態を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示の実施形態は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示の実施形態を制限するものではない。
　本開示において「工程」又は工程を表す語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
　本開示において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
　本開示において実施形態を図面を参照して説明する場合、当該実施形態の構成は図面に示された構成に限定されない。
＜環状ペプチド＞
　本開示の環状ペプチドライブラリに用いられる環状ペプチドは、環状部を構成する複数のアミノ酸残基と、環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基と、を有する環状ペプチドであって、環状部を構成する複数のアミノ酸残基は、環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基と、環状ペプチドの一次構造において上記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなる、環状ペプチドである。
　本開示において、環状ペプチドとは、一部が環化して環状部を形成しているペプチドを表す。環状ペプチドは、一対の環化アミノ酸残基が互いに主鎖ペプチド結合以外の結合により結合することで、閉じた環構造を形成している。環状ペプチドは、典型的には１つの環状部を有するが、標的物質に対する結合性等が見込まれる限り、２つ以上（例えば２つ又は３つ）の環状部を有してもよい。
　本開示において、環状ペプチドのうち、環構造を構成する部分を「環状部」、環構造を構成していない部分を「鎖状部」と記す。
　「環状部を構成する複数のアミノ酸残基」を、「環状部アミノ酸残基」とも記す。
　「環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基」を、「鎖状部アミノ酸残基」とも記す。
　「環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基」を、「環化アミノ酸残基」とも記す。
　「鎖状部アミノ酸残基のうち、上記一対のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基」（すなわち一対の環化アミノ酸残基に隣接する鎖状部のアミノ酸残基）を、「隣接アミノ酸残基」とも記す。
　本開示において、ペプチドとは、アミノ酸がペプチド結合により繋がった分子を指し、アミノ酸配列、アミノ酸残基数、アミノ酸の種類、及びペプチドをコードする塩基配列等に制限はない。ペプチドはタンパク質を包含する用語である。
　本開示において、アミノ酸は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びそれらの誘導体を包含する。
　本開示において天然アミノ酸とは、一般的なタンパク質を構成するアミノ酸を指し、アラニン（Ａｌａ，Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ，Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ，Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ，Ｖ）を指す。天然アミノ酸は、天然物であっても人工物であってもよい。
　本開示において非天然アミノ酸とは、上記の２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を指し、天然物であっても人工物であってもよい。非天然アミノ酸としては、ハロアセチル基を有するアミノ酸（例えば、クロロアセチル化リジン、クロロアセチルジアミノ酪酸等のクロロアセチル化アミノ酸）、Ｎ－メチルアミノ酸（例えば、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルフェニルアラニン）等が挙げられる。
　天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の誘導体としては、ヒドロキシ酸、メルカプト酸、及びカルボン酸が挙げられる。
　ペプチド中のアミノ酸は翻訳後修飾されていてもよい。アミノ酸の翻訳後修飾としては、リン酸化、メチル化、アセチル化、糖鎖付加、脂質付加等が挙げられる。
　ペプチド中のアミノ酸は他の様式で修飾されていてもよい。例えば、ペプチド中のアミノ酸は標識化合物と結合していてもよい。標識化合物は、生化学的、化学的、免疫化学的、又は電磁的な検出方法で検出可能な物質である。標識化合物としては、色素化合物、蛍光物質、化学発光物質、生物発光物質、放射性同位体標識物質、酵素基質、補酵素、抗原性物質、特定のタンパク質に結合する物質、磁性物質等が挙げられる。標識化アミノ酸としては、機能で分類すると、蛍光標識アミノ酸、光応答性アミノ酸、光スイッチアミノ酸、蛍光プローブアミノ酸等が挙げられる。
　標識化アミノ酸におけるアミノ酸と標識化合物とは、直接結合していてもよく、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン；ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール等のポリエーテル；ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリカーボネートなどが挙げられる。
　環状ペプチドのアミノ酸残基数は特に制限されず、標的物質に対する結合性の観点からは、８以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、１２以上であることがさらに好ましい。核酸－ペプチド連結体の形成効率及び環状ペプチドの製造コストの観点からは、環状ペプチドのアミノ酸残基数は、３００以下であることが好ましく、１５０以下であることがより好ましく、１００以下であることがさらに好ましい。かかる観点からは、環状ペプチドのアミノ酸残基数は、８～３００であることが好ましく、１０～１５０であることがより好ましく、１２～１００であることがさらに好ましい。ライブラリ内にアミノ酸残基数の異なる環状ペプチドが存在する場合は、上記範囲はライブラリ内に存在する環状ペプチドのアミノ酸残基数の平均値の範囲である。
　環状部アミノ酸残基は、一対の環化アミノ酸残基と、一対の環化アミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなる。ここで、環状部アミノ酸残基が「一対の環化アミノ酸残基と、一対の環化アミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなる」とは、環状部のアミノ酸残基が、一対の環化アミノ酸残基及び一対の環化アミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基のみで構成されることを意味し、アミノ酸残基以外の構成に特に制限はない。例えば、環状部には上述した翻訳後修飾により付加される構成（糖鎖、脂質等）、標識化合物等のアミノ酸残基以外の構成が含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。
　環状部アミノ酸残基の数は特に制限されず、ライブラリの多様性の観点、及び標的物質に対する結合性の観点からは、６以上であることが好ましく、８以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましく、１１以上であることが特に好ましく、１２以上であることが極めて好ましい。核酸－ペプチド連結体の形成効率及び製造コストの観点からは、環状部アミノ酸残基の数は、２００以下であることが好ましく、１００以下であることがより好ましく、５０以下であることがさらに好ましい。かかる観点からは、環状部アミノ酸残基の数は、６～２００であることが好ましく、８～２００であることがより好ましく、１０～２００であることがさらに好ましく、１１～１００であることが特に好ましく、１２～５０であることが極めて好ましい。ライブラリ内に環状部アミノ酸残基数の異なる環状ペプチドが存在する場合は、上記範囲はライブラリ内に存在する環状ペプチドの環状部アミノ酸残基数の平均値の範囲である。
　一対の環化アミノ酸残基は、環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基である。一対のアミノ酸残基が「一次構造において離間している」とは、かかる一対のアミノ酸残基が主鎖上のペプチド結合によって結合する隣接するアミノ酸どうしではないことを意味する。環化アミノ酸残基どうしは典型的には共有結合により結合しており、それぞれのアミノ酸残基が主鎖上のペプチド結合以外に互いに共有結合可能な官能基を有することによって、両アミノ酸残基が共有結合することが好ましい。
　環化のための官能基は、ペプチドの主鎖上に存在していてもよく、側鎖に存在していてもよい。環状部の外側に主鎖ペプチド結合によってアミノ酸残基を配置しやすい観点からは、官能基はペプチドの側鎖上に存在することが好ましい。
　環化のための官能基としては、チオール基、ハロアセチル基（クロロアセチル基等）、側鎖中のアミノ基、側鎖中のカルボキシ基等が挙げられる。
　一対の環化アミノ酸残基における官能基の組み合わせとしては、チオール基どうしの組み合わせ、チオール基とハロアセチル基（クロロアセチル基等）との組み合わせ、アミノ基とカルボキシ基との組み合わせ等が挙げられる。
　環化アミノ酸残基どうしの結合としては、チオエーテル結合、アミド結合、ジスルフィド結合等が挙げられ、化学的安定性の観点からは、チオエーテル結合又はアミド結合が好ましく、生理的条件下での環化効率の観点からは、チオエーテル結合がより好ましい。
　チオール基を有するアミノ酸としては、システインやホモシステイン等が挙げられる。　クロロアセチル基を有するアミノ酸としては、クロロアセチルジアミノ酪酸、クロロアセチル化リジン等が挙げられる。
　側鎖中にカルボキシ基を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
　側鎖中にアミノ基を有するアミノ酸としては、リジン、オルニチン、ジアミノ酪酸等が挙げられる。
　一態様において、一対の環化アミノ酸残基は、チオール基を有するアミノ酸（システイン等）と、クロロアセチル基を有するアミノ酸（クロロアセチルジアミノ酪酸、クロロアセチル化リジン等）と、の組み合わせであることが好ましい。かかる一対の環化アミノ酸残基を含むペプチドでは、チオール基とクロロアセチル基とが反応して環化し、環状ペプチドとなる。
　環状部アミノ酸残基のうち、一対の環化アミノ酸残基に挟まれるアミノ酸残基（すなわち、環状部アミノ酸残基のうち一対の環化アミノ酸残基以外のアミノ酸残基）の種類は特に制限されず、上述したいずれのアミノ酸であってもよい。
　環状部アミノ酸残基は、一部又は全部がランダム化されていてもよく、ランダム化されていなくてもよい。アミノ酸残基のランダム化については後述する。
　環状ペプチドは、環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基（すなわち、鎖状部アミノ酸残基）を有する。鎖状部は、環状部のＮ末端のみに存在していてもよく、Ｃ末端のみに存在していてもよく、Ｎ末端とＣ末端の両方に存在していてもよい。鎖状部アミノ酸残基のうち、環化アミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基が隣接アミノ酸残基である。鎖状部が環状部のＮ末端のみ又はＣ末端のみに存在する場合、隣接アミノ酸残基は１つであり、鎖状部が環状部のＮ末端及びＣ末端に存在する場合、隣接アミノ酸残基は２つである。
　鎖状部のアミノ酸残基の数（すなわち、環状部のＮ末端側及びＣ末端側の鎖状部の合計アミノ酸残基数）は、標的物質に対する結合性の観点からは、２つ以上であることが好ましい。鎖状部のアミノ酸残基の数（すなわち、環状部のＮ末端側及びＣ末端側の鎖状部の合計アミノ酸残基数）は、核酸－ペプチド連結体の形成効率及び環状ペプチドの製造コストの観点からは、１００以下であることが好ましく、５０以下であることがより好ましい。かかる観点からは、鎖状部のアミノ酸残基の数は、２～１００であることが好ましく、２～５０であることがより好ましい。ライブラリ内に鎖状部のアミノ酸残基数の異なる環状ペプチドが存在する場合は、上記範囲はライブラリ内に存在する環状ペプチドの鎖状部のアミノ酸残基数の平均値の範囲である。
　鎖状部アミノ酸残基において、隣接アミノ酸残基の少なくとも１つがランダム化されている限り、他の鎖状部アミノ酸残基の一部又は全部がランダム化されていてもよく、ランダム化されていなくてもよい。アミノ酸残基のランダム化については後述する。
＜環状ペプチドのライブラリ＞
　本開示の環状ペプチドのライブラリは、環状部を構成する複数のアミノ酸残基（すなわち、環状部アミノ酸残基）と、環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基（すなわち、鎖状部アミノ酸残基）と、を有する１０２種類以上の環状ペプチドのライブラリであって、環状部を構成する複数のアミノ酸残基（環状部アミノ酸残基）は、環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基（すなわち、環化アミノ酸残基）と、環状ペプチドの一次構造において上記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなり、鎖状部の少なくとも１つのアミノ酸残基のうち、上記一対のアミノ酸残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基（すなわち、隣接アミノ酸残基）がランダム化されている。
　また、環状ペプチドのそれぞれは核酸と連結することができる。環状ペプチドと核酸の連結体を「核酸－ペプチド連結体」とも記す。
　本開示の環状ペプチドのライブラリに含まれる環状ペプチドの一例を、図１を参照して説明する。なお、図１は説明のための概略図であり、本開示の環状ペプチドは図１の態様に限定されない。図１は、環状ペプチドの一例における、環状部１０及び鎖状部２０を含む一部の概略図である。ａ～ｒはそれぞれアルファベット順に主鎖ペプチド結合により繋がる任意のアミノ酸残基を表し、ａがＮ末端側、ｒがＣ末端側である。環状部１０を構成する複数のアミノ酸残基ｄ～ｏは、環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基ｄ（１２ａ）及びｏ（１２ｂ）と、環状ペプチドの一次構造において一対のアミノ酸残基ｄ（１２ａ）及びｏ（１２ｂ）に挟まれる複数のアミノ酸残基ｅ～ｎと、からなる。環状部１０に連結されるアミノ酸残基ａ～ｃ及びｐ～ｒのうち、上記一対のアミノ酸残基ｄ（１２ａ）及びｏ（１２ｂ）に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基ｃ（２２ａ）及び／又はｐ（２２ｂ）はランダム化されている。
　図１の例におけるアミノ酸残基ｄ～ｏは、「環状部を構成する複数のアミノ酸残基」、すなわち、「環状部アミノ酸残基」である。
　図１の例におけるアミノ酸残基ａ～ｃ及びｐ～ｒは、「環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基」、すなわち、「鎖状部アミノ酸残基」である。
　図１の例におけるアミノ酸残基ｄ（１２ａ）及びｏ（１２ｂ）は、「環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基」、すなわち、「環化アミノ酸残基」である。
　図１の例におけるアミノ酸ｃ（２２ａ）及びｐ（２２ｂ）は、「鎖状部アミノ酸残基のうち、上記一対のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基」、すなわち、「隣接アミノ酸残基」である。
　本開示の環状ペプチドのライブラリによれば、標的物質への高い結合性を有する環状ペプチドを取得できることが見出された。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のように推測される。本開示の環状ペプチドのライブラリでは、ペプチドの環状部に連結される隣接アミノ酸残基のうちの少なくとも１つがランダム化されている。かかる環状ペプチドのライブラリから標的物質への結合性に基づき好ましい環状ペプチドを選択することで、隣接アミノ酸残基を適切に選択でき、環状部の立体構造を安定的に形成及び保持できる環状ペプチドを好適に選択できると推測される。
　また、一態様において、本開示の環状ペプチドのライブラリによれば、他の機能性分子と連結しても結合性が低下しにくい環状ペプチドを取得できる。
　環状ペプチドの詳細は上述の通りである。
（核酸）
　環状ペプチドのそれぞれは、対応する核酸と関連付けられていることが好ましい。
　一態様において、環状ペプチドのそれぞれは核酸と連結して、核酸－ペプチド連結体を形成することができる。例えば、核酸－ペプチド連結体を用いて、ｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ｃＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリ等を作製することができる。核酸の連結位置は特に制限されず、環状ペプチドのＮ末端でもＣ末端でもよく、典型的には環状ペプチドのＣ末端に連結される。
　さらなる一態様において、例えばファージディスプレイライブラリを作製する場合、環状ペプチドはファージ表面に発現しており、対応する核酸がファージ内部に組み込まれていてもよい。
　核酸は、各環状ペプチドに固有の塩基配列、典型的には、環状ペプチドをコードする塩基配列を含み、核酸の塩基配列を解読することで、環状ペプチドを特定できる。
　本開示において、核酸とは、ペプチドを合成する情報を担う分子を指す。核酸は、あらゆる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体、天然物、人工物）、及びあらゆる核酸に低分子化合物、基、核酸以外の分子、構造物等が連結している核酸を含む用語である。核酸は、一本鎖の核酸であってもよく、二本鎖の核酸であってもよい。
　一態様において、核酸はｍＲＮＡを含んでもよい。一態様において、核酸－ペプチド連結体は、ｍＲＮＡ－ペプチド連結体であってもよい。
　一態様において、核酸はｃＤＮＡを含んでもよい。一態様において、核酸－ペプチド連結体は、ｃＤＮＡ－ペプチド連結体であってもよい。
　一態様において、核酸－ペプチド連結体は、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの二本鎖とペプチドとの連結体（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－ペプチド連結体）であってもよい。
　核酸の長さは、精製収率の観点からは、３０塩基以上であることが好ましく、７０塩基以上であることがより好ましく、１００塩基以上であることがさらに好ましい。核酸が二本鎖である場合は、「核酸の長さ」とは、片側鎖の核酸の長さを指す。ライブラリ内に長さの異なる核酸が存在する場合は、上記範囲はライブラリ内に存在する核酸の長さの平均値の範囲である。
　核酸は、例えば、ランダム配列を含むランダムプライマーセットを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行うことで作製された、二本鎖ＤＮＡ断片（「鋳型核酸」とも記す。）の集団の転写産物であってもよい。ランダム配列は、例えば、トリプレットの繰り返し配列［ＮＮＮ］ｍ又は［ＮＮＫ］ｍである（ここで、ｍは正の整数、Ｎはそれぞれ独立にＡ、Ｔ、Ｇ又はＣを表し、Ｋはそれぞれ独立にＴ又はＧを表す）。トリプレット［ＮＮＮ］又は［ＮＮＫ］の繰り返し数を任意の数に設定して、任意の長さのランダムなアミノ酸配列を有するペプチドを作製することができる。ランダム配列は、あるいは、１種類のアミノ酸に対して１種類のコドンを割り当てたトリマーオリゴヌクレオチドの等量混合物を繰り返し連結することで作製することもできる。ランダム配列は、終止コドンの出現が抑制できる観点からは、［ＮＮＫ］ｍ又はトリマーオリゴヌクレオチドが好ましく、トリマーオリゴヌクレオチドがより好ましい。
　核酸は、例えば、無細胞ペプチド合成システムによってペプチドを合成するのに必要な塩基配列を有する。ペプチド合成に必要な塩基配列は、コーディング領域の他、例えば、リボソーム結合配列を含む。鋳型核酸の塩基配列は、終止コドンを含んでもよく終止コドンを含まなくてもよい。ここで終止コドンとは、対合するｔＲＮＡが無細胞ペプチド合成システムの反応液中に存在しないコドンを意味する。鋳型核酸は、国際公開第２０２３／０４８２９０号に記載される翻訳促進のためのタグ（「翻訳促進配列」とも記す。）をコードする塩基配列を含んでもよい。
　鋳型核酸の３’末端側には、核酸のペプチドの作用に対する立体障害を低減する観点から、スペーサーをコードする塩基配列があることが好ましい。スペーサーは例えば、グリシン及びセリンから選ばれる１～１００個のアミノ酸残基又はペプチド残基である。
　核酸－ペプチド連結体において、核酸とペプチドは、リンカー、リボソーム等の構成体を介して連結されていることが好ましい。
　ペプチドが適切な高次構造を形成しやすい観点、及び核酸－ペプチド連結体の安定性が高くペプチドの機能を評価しやすい観点からは、核酸とペプチドとはリンカーを介して連結されていることが好ましい。本開示において、リンカーとは、核酸と対応するペプチドとを連結する連結部として機能する構造である。
　リンカーとしては、ピューロマイシン様化合物と、１０～１００塩基の一本鎖核酸とを含む化合物（以下、本化合物を「ピューロマイシンリンカー」とも記す。）が挙げられる。ピューロマイシンリンカーは、ピューロマイシン様化合物を介してペプチドと結合する。また、ピューロマイシンリンカーの一本鎖核酸は、核酸－ペプチド連結体を構成する核酸部の一部（例えばｍＲＮＡの３’末端）と相補的な配列（以下、「相補部」とも記す。）を有し、相補部において核酸部と結合する。これにより、核酸－ペプチド連結体が形成される。
　ピューロマイシンリンカーにおいて、ピューロマイシン様化合物とは、アミノアシルｔＲＮＡの３’末端に類似した化学構造骨格を有し、無細胞ペプチド合成システムでタンパク質の合成が行われた場合に、合成されたペプチドのＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。アミノアシルｔＲＮＡとは、ｔＲＮＡにアミノ酸が共有結合したｔＲＮＡである。ピューロマイシン様化合物としては、ピューロマイシンの他に、３’－Ｎ－アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ－アミノ酸；例えば、ＰＡＮＳ－Ｇｌｙ、ＰＡＮＳ－Ｖａｌ、ＰＡＮＳ－Ａｌａ等）；３’－アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシ基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３’－Ｎ－アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ－アミノ酸；例えば、ＡＡＮＳ－Ｇｌｙ、ＡＡＮＳ－Ｖａｌ、ＡＡＮＳ－Ａｌａ等）；ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸がエステル結合した化合物；リボシチジルピューロマイシン、デオキシジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどが挙げられる。
　ピューロマイシンリンカーにおいて、相補部とは、核酸－ペプチド連結体における核酸の一部と相補的な配列を有することにより核酸と結合する一本鎖核酸の部位を示す。核酸－ペプチド連結体の形成効率の観点から、相補部は核酸のペプチドをコードする領域の３’末端側に結合することが好ましい。
　ピューロマイシンリンカーは、ピューロマイシン様化合物と相補部の間にスペーサーを含んでもよい。スペーサーは、ピューロマイシン様化合物と相補部とを連結できる任意の構造であってよく、ポリヌクレオチド、ポリアルキレン（ポリエチレン等）、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール等）、ペプチド核酸、ポリスチレン、これらの組み合わせ等が挙げられる。上記の構造を組み合わせる場合、適当な連結基（－ＮＨ－、－ＣＯ－、－Ｏ－、－ＮＨＣＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＮＨ－、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは正の整数）、－Ｓ－、－ＳＯ－等）で化学的に連結することができる。
　ピューロマイシンリンカーとしては、国際公開第２００５／０１２９０２号に記載されるリンカーが挙げられる。
〔ライブラリ及びアミノ酸残基のランダム化〕
　環状ペプチドのライブラリは、ディスプレイライブラリに用いられ、本開示のライブラリには、１０２種類以上の環状ペプチドが含まれる。また、核酸と関連付けられた場合の環状ペプチドのライブラリは、核酸ディスプレイライブラリに用いられ、核酸と関連付けられた異なる複数種類の環状ペプチドの集合である。
　ここで、環状ペプチドの「種類」とは、アミノ酸配列の種類を表し、１０２種類以上の環状ペプチドとは、１０２種類以上の異なるアミノ酸配列を有する環状ペプチドを意味する。アミノ酸配列以外の条件（糖鎖の有無等）が異なっても、アミノ酸配列が同じである限り、同じ「種類」の環状ペプチドとみなすものとする。なお、アミノ酸配列に基づく標的物質に対する結合性を適切に評価する観点からは、ライブラリに含まれる環状ペプチドのアミノ酸配列以外の条件は同じであることが好ましい。
　ライブラリは、１０４種類以上の環状ペプチドを含むことが好ましく、１０６種類以上の環状ペプチドを含むことがより好ましく、１０８種類以上の環状ペプチドを含むことがさらに好ましく、１０１０種類以上の環状ペプチドを含むことが特に好ましい。
　環状ペプチドの種類数は、環状ペプチドに関連付けられた核酸を次世代シーケンスにて同定することで確認できる他、環状ペプチドをコードする核酸におけるランダム化部位数とアミノ酸種類数から算出することができる。
　ライブラリ中の環状ペプチドにおいて、１つ又は２つの隣接アミノ酸残基のうちの少なくとも１つはランダム化されている。隣接アミノ酸残基のうちＮ末端側の隣接アミノ酸残基がランダム化されていてもよく、Ｃ末端側の隣接アミノ酸残基がランダム化されていてもよく、両者がランダム化されていてもよい。標的物質への高い結合性を示しやすい観点からは、少なくともＣ末端側の隣接アミノ酸残基がランダム化されていることが好ましく、Ｎ末端側及びＣ末端側の隣接アミノ酸残基の両者がランダム化されていることがより好ましい。
　標的物質に対する結合性を有する環状ペプチドの探索効率の観点からは、隣接アミノ酸残基は、それぞれ独立に、１０種類以上のアミノ酸残基にランダム化されることが好ましく、１５種類以上のアミノ酸残基にランダム化されることがより好ましく、１９種以上のアミノ酸残基にランダム化されることがさらに好ましく、２０種以上のアミノ酸残基にランダム化されることが特に好ましい。ライブラリの作製効率の観点からは、隣接アミノ酸残基は、それぞれ独立に、２５種類以下のアミノ酸残基にランダム化されることが好ましく、２２種類以下のアミノ酸残基にランダム化されることがより好ましく、２０種以下のアミノ酸残基にランダム化されることがさらに好ましい。かかる観点からは、隣接アミノ酸残基は、それぞれ独立に、１０種類～２５種類のアミノ酸残基にランダム化されることが好ましく、１５種類～２２種類のアミノ酸残基にランダム化されることがより好ましく、１９種類～２０種類のアミノ酸残基にランダム化されることがさらに好ましい。
　隣接アミノ酸残基のうち少なくとも１つがランダム化されている限り、環状ペプチドのその他のアミノ酸残基はいずれも、ランダム化されていてもよく、ランダム化されていなくてもよい。環状ペプチドにおいて、隣接アミノ酸残基以外のアミノ酸残基がランダムされている場合、ランダム化されるアミノ酸残基の好ましい種類数は、それぞれ独立に、ランダム化される隣接アミノ酸残基の好ましい種類数と同様である。
　標的物質に対する結合性を有する環状ペプチドの探索効率の観点からは、一対の環化アミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基の一部又は全てがさらにランダム化されていることが好ましい。これにより、好適な隣接アミノ酸残基とともに、好適な環状部アミノ酸残基も探索することができる。一対の環化アミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基は全てランダム化されていてもよいが、一部のアミノ酸残基を固定して、残りのアミノ酸残基をランダム化してもよい。
　一対の環化アミノ酸残基は、設計の容易性の観点から、ランダム化されていないことが好ましい。
　隣接アミノ酸残基のうち少なくとも１つがランダム化されている限り、鎖状部アミノ酸残基の隣接アミノ酸残基以外のアミノ酸残基はランダム化されていてもよく、ランダム化されていなくてもよい。一態様において、ランダム化された隣接アミノ酸残基を起点とする連続した複数個のアミノ酸残基がランダム化されていてもよい。ランダム化された隣接アミノ酸残基を起点とする連続した複数個のアミノ酸残基の数は、ライブラリ作製効率の観点からは、片側当たり、それぞれ独立に、１０以下であることが好ましく、５以下であることがより好ましい。ランダム化された隣接アミノ酸残基を起点とする連続した複数個のアミノ酸残基の数は、片側当たり、それぞれ独立に、２以上であってもよく、３以上であってもよい。
　アミノ酸残基のランダム化とは、対応する所定の位置のアミノ酸残基が２種類以上存在するペプチドの集合を作製することをいう。本開示において、環状ペプチドの所定の位置のアミノ酸残基のランダム化とは、環状部アミノ酸残基の数が同じである（例えば、環状部アミノ酸残基の数が１０である）複数の環状ペプチドを含み、かかる複数の環状ペプチドにおいて、対応する位置のアミノ酸残基が２種類以上存在するペプチドの集合を作製することをいうものとする。ここで、「対応する位置」とは、Ｎ末端側又はＣ末端側の環化アミノ酸残基を基準とした距離（すなわちＮ末端側又はＣ末端側の環化アミノ酸残基からのアミノ酸残基数）が同じであることをいうものとする。
　標的物質に対する結合性を有する環状ペプチドの探索効率の観点からは、ライブラリは、環状部アミノ酸残基の数が異なる複数の環状ペプチドを含むことが好ましい。環状部アミノ酸残基の数が異なる複数の環状ペプチドを含むライブラリを用いて標的物質に対する結合能を評価することで、最適な環サイズを併せて選択でき、より結合性の高い環状ペプチドを取得しやすいと考えられる。
　環状ペプチド中のランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、ランダム化された全てのアミノ酸残基中の親水性残基数の割合は、０．４以上であることが好ましく、０．５以上であることがより好ましく、０．６以上であることがさらに好ましい。ランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、ランダム化された全てのアミノ酸残基中の親水性残基数の割合が上記範囲内であると、疎水性に起因する非特異吸着が少なく、また連結した他分子との疎水性相互作用による結合性低下が起こりにくい傾向にある。
　ここで、「親水性残基」とは、側鎖構造中に、芳香族性を有する構造も炭素数５以上のアルキル構造又はアルキレン構造を含まず、かつ親水基を有するアミノ酸残基を示す。
　親水性残基としては、荷電官能基、ヒドロキシ基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸残基が挙げられる。
　荷電官能基とは、ｐＨ７の水溶液中において正電荷又は負電荷を含む官能基を指し、側鎖のカルボキシ基、側鎖のアミノ基、イミダゾール基等が挙げられる。
　親水性残基数の割合は、ランダム化するアミノ酸残基の種類を鋳型核酸の塩基配列で指定することにより調整できる。
　環状ペプチド中のランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、ランダム化された全てのアミノ酸残基中の荷電残基数の割合は、０．２以上であることが好ましく、０．３以上であることがより好ましく、０．４以上であることがさらに好ましい。ランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、ランダム化された全てのアミノ酸残基中の荷電残基数の割合が上記範囲内であると、疎水性に起因する非特異吸着が少なく、また連結した他分子との疎水性相互作用による結合性低下が起こりにくい傾向にある。
　荷電残基とは、ｐＨ７の水溶液中において、側鎖構造の中に正電荷又は負電荷を一つ以上含むアミノ酸残基を指し、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。
　荷電残基数の割合は、ランダム化するアミノ酸残基の種類を鋳型核酸の塩基配列で指定することにより調整できる。
　環状ペプチドのＮ末端又はＣ末端を他の機能性分子と連結する場合に、副反応が発生する可能性を低減する観点からは、環状ペプチド中のランダム化されたいずれのアミノ酸残基も、アミノ基又はスルフヒドリル基を含まないことが好ましく、アミノ基及びスルフヒドリル基のいずれも含まないことがより好ましい。
　ライブラリは、ｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ｃＤＮＡディスプレイライブラリ、リボソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ等の各種ディスプレイライブラリであってよい。なかでも、非天然アミノ酸の導入効率が高い観点からは、ｍＲＮＡディスプレイライブラリ、ｃＤＮＡディスプレイライブラリ、又はリボソームディスプレイライブラリが好ましい。また、１試験で探索可能なライブラリサイズが大きい観点からは、ｍＲＮＡディスプレイライブラリ又はｃＤＮＡディスプレイライブラリがより好ましい。上記各種ディスプレイライブラリを用いることにより、結合性が高い環状ペプチドを選択することができる。
〔ライブラリの作製方法〕
　ライブラリの作製方法は特に制限されない。一態様において、ライブラリは、無細胞ペプチド合成システムによって作製される。無細胞ペプチド合成システムは、ペプチド合成のための反応システムであって、大腸菌等の細胞をそのまま使用せず、大腸菌等の細胞内に存在する成分を利用するペプチド合成システムである。無細胞ペプチド合成システムには、細胞抽出液を用いるものと、細胞抽出液の各成分を精製したもので再構成した反応液（再構成型無細胞ペプチド合成システム）を用いるものがある。
　細胞抽出液を用いるものとしては、例えば、大腸菌抽出液、コムギ胚芽抽出液、ウサギ赤血球抽出液、又は昆虫細胞抽出液を用いるものが挙げられる。
　再構成型無細胞ペプチド合成システムは、それぞれ精製したリボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）、伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、リボソーム再生因子、その他の無細胞ペプチド合成に必要な因子等で構築することができる。
　核酸－ペプチド連結体作製工程には、公知のあらゆる無細胞ペプチド合成システムが採用できる。無細胞ペプチド合成システムの市販品の例として、PUREfrex（ジーンフロンティア）、PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit（New England BioLabs）、S30 T7 High-Yield Protein Expression System（Promega）、Human Cell-Free Protein Expression System（タカラバイオ）、Rapid Translation System（ロシュ）、Expressway Cell-Free Expression System（インビトロジェン）等が挙げられる。
　リンカーとしてピューロマイシンリンカーを含む核酸－ペプチド連結体を作製する場合には、無細胞ペプチド合成システムに供される核酸は、３’末端にピューロマイシンリンカーが結合した核酸であることが好ましい。
　一態様において、無細胞ペプチド合成システムにより作製されたｍＲＮＡ－ペプチド連結体を逆転写して、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの二本鎖とペプチドとの連結体を作製してもよい。本態様によれば、核酸部が二本鎖核酸になるため、ｍＲＮＡの三次構造形成による諸影響を排除した核酸ディスプレイライブラリが得られる。
＜スクリーニング方法＞
　本開示のスクリーニング方法は、前述の本開示の環状ペプチドのライブラリを準備することと、環状ペプチドのライブラリから標的物質に対する結合活性を有する環状ペプチドを選択し、選択した環状ペプチドに関連付けられた核酸の塩基配列を同定することと、を含む。
　「標的物質」は、化合物、基、分子、タンパク質、核酸、脂質、糖質、これらの複合体などを含む用語である。標的物質としては、生理活性を示す化合物が好ましく、受容体、転写因子、酵素、補酵素、調節因子、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、エキソソーム、細胞、組織、これらの断片、これらの複合体、これらの修飾基等が挙げられる。
　標的物質に対する結合活性を有する環状ペプチドを選択する方法としては、各種ディスプレイ法が挙げられる。ディスプレイ法としては、ｍＲＮＡディスプレイ法、ｃＤＮＡディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ファージディスプレイ法等が挙げられ、非天然アミノ酸の導入効率が高い観点からは、ｍＲＮＡディスプレイ法、ｃＤＮＡディスプレイ法、又はリボソームディスプレイ法が好ましい。また、１試験で探索可能なライブラリサイズが大きい観点からは、ｍＲＮＡディスプレイ法又はｃＤＮＡディスプレイ法がより好ましい。上記各種ディスプレイ法を用いることにより、結合性が高い環状ペプチドを選択することができる。
　結合活性の評価方法は特に制限されず、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、等温滴定熱測定法（ＩＴＣ）等が挙げられる。
　一態様において、本開示のスクリーニング方法は、ライブラリと標的物質とを接触させてインキュベートすることを含む。例えば、ライブラリと標的物質とを緩衝液中で接触させ、緩衝液のｐＨ及び温度並びに接触時間を調節してインキュベートする。標的物質を固相担体に固定しておき、固定された標的物質にライブラリを接触させてもよい。固相担体は、標的物質を固定できる担体であれば制限はなく、マイクロタイタープレート、基板、ビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられる。標的物質は、固相担体に公知の技術によって固定される。
　上記の接触の後、標的物質に結合している環状ペプチドを抽出し、抽出した環状ペプチドに関連付けられた核酸の塩基配列を同定する。塩基配列の同定は、核酸増幅システム及びシーケンサーを用いて実施可能である。
　核酸増幅システムは、核酸を鋳型にして核酸を増幅するシステムを指す。核酸増幅システムの核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction；ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction；ＬＣＲ）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence-based amplification）等のいずれでもよい。
　本開示において「シーケンサー」は、第一世代シーケンサー（キャピラリーシーケンサー）、第二世代シーケンサー（次世代シーケンサー）、第三世代シーケンサー、第四世代シーケンサー、及び今後開発されるシーケンサーを含む用語である。シーケンサーは、キャピラリーシーケンサーでもよく、次世代シーケンサーでもよく、他のシーケンサーでもよい。シーケンサーとしては、解析の速さ、一度に処理可能な試料数の多さ等の観点から、次世代シーケンサーが好ましい。次世代シーケンサー（next generation sequencer，ＮＧＳ）とは、サンガー法を利用したキャピラリーシーケンサー（第一世代シーケンサーと呼ばれる。）に対比して分類されるシーケンサーを指す。現時点で最も普及している次世代シーケンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシーケンサーである。具体的には、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＭｉＳｅｑは登録商標）、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、ＨｉＳｅｑは登録商標）、Ｒｏｃｈｅ４５４（Ｒｏｃｈｅ社）等が挙げられる。
＜ペプチドの作製方法＞
　本開示のペプチドの作製方法は、前述の本開示のスクリーニング方法によって同定された塩基配列に基づき、標的物質に対する結合活性を有するペプチドを取得することを含む。スクリーニング方法及び塩基配列の同定方法は上述の通りである。ペプチドの取得は、同定された塩基配列に基づき、公知のペプチド合成システムを用いて行うことができる。ペプチド合成システムとしては、上記の無細胞ペプチド合成システムに加え、化学合成システム及び遺伝子工学的合成システムが挙げられる。純度等の観点からは、化学合成システムが好ましい。
　一態様において、作製されたペプチドを、他の機能性分子と連結してもよい。本開示の手法によれば、作製されたペプチドを他の機能性分子と連結しても結合性が低下しにくい傾向にある。機能性分子としては、細胞殺傷効果を有する化合物、標識用化合物、核酸、リポソーム、脂質ナノ粒子、抗体等が挙げられる。機能性分子がリポソーム、脂質ナノ粒子の場合には、作製されたペプチドをリポソームや脂質ナノ粒子に内包してもよい。
　本開示の環状ペプチドのライブラリ、スクリーニング方法、及びペプチドの作製方法は、治療薬開発、診断薬開発、研究用試薬開発、医薬品製造、バイオ材料製造等に広く利用可能である。
　次に本開示の実施形態を実施例により具体的に説明するが、本開示の実施形態はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：ｍＲＮＡディスプレイ＞　
　下表の条件でライブラリを作製し、各条件でＦＧＦＲ１ｃ（fibroblast growth factor receptor 1c；以下、単に「ＦＧＦＲ」とも記す。）に対して、ｍＲＮＡディスプレイを実施し、ＦＧＦＲ１ｃに結合するペプチド群を取得した。
　ＦＧＦＲに結合する環状ペプチドの候補配列を、ｍＲＮＡディスプレイ法を用いて取得した。
１．鋳型核酸の作製
　ｍＲＮＡディスプレイ法のライブラリとして配列番号１～７の配列を用いた。このライブラリは、５’末端から８６～８８番目が開始コドン（ＡＴＧ）であり、１０７番目以降の塩基群が一部アミノ酸残基がランダム化されたペプチドをコードする配列であり、ペプチド配列の３’末端側に位置する塩基群がピューロマイシンリンカーの結合部及び終止コドンである。５’末端から８５番目以前の塩基群は、Ｔ７プロモーター配列、シャイン・ダルガノ配列等の転写及び翻訳開始に必要な配列である。本ペプチド配列内部のトリプレットＴＡＧはクロロアセチル化リジンのコドンに当てているため、本ペプチドは、システインのチオール基とクロロアセチル化リジンのクロロアセチル基とが自発的にチオエーテル結合を形成し、環状ペプチドとなる。Ｎで表される塩基は、４種類の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を等量混合した混合塩基であり、Ｋで表される塩基は、２種類の塩基（Ｔ、Ｇ）を等量混合した混合塩基である。（Ｔｒｉ１９）の表記は、メチオニンを除く１９種の天然アミノ酸に対応するトリマーオリゴヌクレオチドを等量混合した混合塩基配列を表し、（Ｔｒｉ１８）の表記は、メチオニン及びシステインを除く１８種の天然アミノ酸に対応するトリマーオリゴヌクレオチドを等量混合した混合塩基配列を表す。配列番号１～１０のライブラリを作製し、これらを用いて、表１の条件に従い、計１１条件でｍＲＮＡディスプレイを実施した。
配列番号１：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１９）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１９）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号２：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号３：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号４：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号５：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号６：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号７：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号８：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１８）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１８）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号９：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１８）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１８）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
配列番号１０：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１８）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１８）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ
　配列番号１～１０のライブラリは、オーバーラップエクステンションＰＣＲを行うことで作製した。具体的には、配列番号１１のＤＮＡ、配列番号１２のＤＮＡ、及び配列番号１３～２２のいずれかのＤＮＡ、の３種のＤＮＡを、それぞれ３μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌとなるように混合した。Platinumtm SuperFi II DNA Polymerase（Thermo、12361010）存在下、９８℃／３０秒の後、９８℃／１０秒、６０℃／１０秒、７２℃／１０秒の３ステップを７サイクル繰り返し、最後に７２℃／５分の処理を行うことで、３つのＤＮＡを連結し、目的のライブラリを作製した。作製したライブラリを精製し、１０ｎｇ／μＬに希釈した。
　条件２については作製した２種類のライブラリを等量混合して次工程に供した。
配列番号１１：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣ
配列番号１２：ＡＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣ
配列番号１３：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１９）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）（Ｔｒｉ１９）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１９）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号１４：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号１５：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号１６：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号１７：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＮＮＫＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号１８：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＮＮＫＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号１９：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号２０：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１８）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１８）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号２１：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１８）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１８）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
配列番号２２：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ（Ｔｒｉ１８）ＴＧＴ（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）（Ｔｒｉ１８）ＴＡＧ（Ｔｒｉ１８）ＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣ
２．ＦＧＦＲに結合する環状ペプチドの同定
　ＦＧＦＲとしてRecombinant Human FGFR1 alpha (IIIc) Fc Chimera Protein, CF（R&D systems、658-FR-050）を用い、磁性ビーズ（NHS Mag Sepharose、Cytiva、28951380）にメーカー（Ｃｙｔｉｖａ）指定プロトコルにて固相化した（固相化時ＦＧＦＲ濃度：１μｇ／μＬ）。また磁性ビーズに結合する環状ペプチドを除くために、IgG1 Fc, Human, recombinant（富士フイルム和光純薬、098-07141）を上記同様に、磁性ビーズに固相化した。
　ライブラリと磁性ビーズ固相化ＦＧＦＲとを接触させてインキュベートする工程を計８ラウンド繰り返した後、シーケンサーを用いてＦＧＦＲに結合するペプチドの塩基配列を同定した。各ラウンドの具体的手順は下記の通りである。
　まず、作製したライブラリ（配列番号１～１０及びその混合物）をＴ７　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２５４０Ａ）存在下、３７℃で３０分間反応させることでライブラリ転写物を作製した。このＲＮＡ断片を精製し、１０μｍｏｌ／Ｌに希釈した。
　次にＴＢＳバッファー（１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で、ライブラリ転写物（終濃度５μｍｏｌ／Ｌ）、配列番号２３のピューロマイシンリンカー（終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ）を混合した後、９５℃で５分間加熱、その後、１０ＪのＵＶ（３６５ｎｍ）を氷上にて照射することで、ライブラリ転写物とピューロマイシンリンカーの複合体を作製した。
配列番号２３：（ＰｓｏｒａｌｅｎＣ６）－ＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＵＣＣＵ－（Ｓｐ１８）－（Ｓｐ１８）－（Ｓｐ１８）－（Ｓｐ１８）－ＣＣ－（Ｐｕｒｏ）（ＰｓｏｒａｌｅｎＣ６、Ｓｐ１８、Ｐｕｒｏの構造は下図参照。（ＰｓｏｒａｌｅｎＣ６）と（Ｓｐ１８）の間のヌクレオチドは２’位がＯＭｅ修飾されたＲＮＡであり、他のヌクレオチドは未修飾のＤＮＡを表す。）
　非天然アミノ酸であるクロロアセチル化リジンを翻訳するために、アンチコドンがＣＵＡであり、ｍＲＮＡのＵＡＧコドンに対合するｔＲＮＡを配列番号２４のＤＮＡを転写することで用意した。このｔＲＮＡをＮ－クロロアセチル化リジンｐｄＣｐＡ（5'-phospho-2'-deoxyribocytidylylriboadenosine）エステル体でアミノアシル化した。このアミノアシルｔＲＮＡを、アミノアシルｔＲＮＡ（１）という。
配列番号２４：ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＴＡＧＴＴＣＡＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＧＴＣＧＧＴＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＧＡＧＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣ
　ライブラリ転写物とピューロマイシンリンカーの複合体を、ＰＵＲＥｆｒｅｘ２．０（ジーンフロンティア、ＰＦ２０１－０．２５－５）及びアミノアシルｔＲＮＡを含む翻訳液中にて翻訳した。複合体５．２５μＬ、ＰＵＲＥｆｒｅｘ２．０　ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ　７．５μＬ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ　０．７５μＬ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ　１．５μＬ、アミノアシルｔＲＮＡ（１）の乾燥体（終濃度０．５μｇ／μＬ）を混合し、３７℃で６０分間反応させることでｍＲＮＡ－環状ペプチド連結体を作製した。
　翻訳産物１５μＬと配列番号２５のＤＮＡ（終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ）とをＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ、ＴＲＴ－１０１）存在下で混合し（反応体積３７．５μＬ）、３７℃で３０分間反応させることで逆転写を行い、ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ－環状ペプチド連結体を作製した。
配列番号２５：ＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣ
　次いで逆転写産物２２．５μＬを磁性ビーズ固相化ＩｇＧ１　Ｆｃ１０μＬと、ＴＢＳバッファー（２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．１％　ＢＳＡ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中で混合し（反応体積１００μＬ）、室温（約２５℃）で４５分間反応後、上清を回収することで、磁性ビーズに結合するｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ－環状ペプチド連結体を除去した。
　次いで上清を、磁性ビーズ固相化ＦＧＦＲ１０μＬと混合し（反応体積５０μＬ）、室温（約２５℃）で４５分間反応後、磁性ビーズをＴＢＳバッファー１００μＬで３度洗浄することで、ＦＧＦＲに結合するｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ－環状ペプチド連結体を抽出した。抽出したｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ－環状ペプチド連結体を下記２段階のＰＣＲにて増幅した。
　１段階目のＰＣＲでは、ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ－ペプチド連結体２５μＬを、配列番号２６のＤＮＡ（終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ）、及び配列番号２７のＤＮＡ（終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ）と混合し（反応体積５０μＬ）、Platinumtm SuperFi II DNA Polymerase（Thermo、12361010）存在下、９８℃／３０秒の後、９８℃／１０秒、６０℃／１０秒、７２℃／１０秒の３ステップを６～１５サイクル繰り返し、最後に７２℃／５分の処理を行うことで、増幅産物を得た。増幅産物を精製し、２０ｎｍｏｌ／Ｌに希釈した。
配列番号２６：ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣ
配列番号２７：ＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣ
　２段階目のＰＣＲでは、１段階目ＰＣＲ増幅産物（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を、配列番号１１のＤＮＡ（終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ）、及び配列番号１２のＤＮＡ（終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ）と混合し、Platinumtm SuperFi II DNA Polymerase（Thermo、12361010）存在下、９８℃／３０秒の後、９８℃／１０秒、６０℃／１０秒、７２℃／１０秒の３ステップを６サイクル繰り返し、最後に７２℃／５分の処理を行うことで、元のライブラリとランダム配列を除き同じ配列のＤＮＡを得た。作製したライブラリを精製し、２ｎｇ／μＬに希釈して、次ラウンドに用いた。
　８ラウンド目の１段階目ＰＣＲ産物の塩基配列を、ＭｉＳｅｑ（Illumina社製）とMiseq Reagent kit v2（300 cycle）（illumina社製、MS-102-2022）を用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社標準プロトコルにて同定した。
＜実施例２：ｍＲＮＡディスプレイで取得したペプチドの結合性評価＞
　実施例１で取得したペプチド群について、各条件において集団内の存在率が多い配列を６配列ずつ選抜し、ＦＧＦＲ１ｃに対する結合性をＥＬＩＳＡ法にて評価した。
　選抜したペプチドのアミノ酸配列を下表に示す。なお、太字下線のペプチドは後述の実施例３で用いたペプチドを表す。
　評価に用いるペプチドは、以下の方法で酵素合成した。
　まず翻訳促進配列（配列番号２８）、ペプチド、Ｍｙｃタグ（配列番号２９）及びＨｉＢｉＴタグ（配列番号３０）をこの順に連結した融合ペプチド（配列番号３１）を設計した。次いで、上記融合ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し、５’末端側にＴ７プロモーター配列、シャイン・ダルガノ配列、開始コドン（ＡＴＧ）等の転写及び翻訳開始に必要な配列、３’末端側に終止コドン群を付与した鋳型ＤＮＡ配列（配列番号３２）を設計した。本ペプチド配列中にトリプレットＴＡＧコドンが含まれる場合は、上記コドンをクロロアセチル化リジンのコドンに当てているため、上記ＤＮＡ配列がコードするペプチドはシステインのチオール基とクロロアセチル化リジンのクロロアセチル基とが自発的にチオエーテル結合を形成し、環状ペプチドとなる。
配列番号２８：ＶＫＫＴＫＴ
配列番号２９：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ
配列番号３０：ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
配列番号３１：ＭＶＫＫＴＫＴ［ＩＣＦＨＧＬＹＦＷＤＶＥＸＬ］ＧＳＧＳＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＧＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
（Ｘはクロロアセチル化リジン、［　］内は表２に記載の結合性評価に用いたペプチドのアミノ酸配列の一例である。［　］内のアミノ酸配列はペプチドごとに異なる。）
配列番号３２：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡ［ＣＡＴＴＧＣＴＣＴＴＡＣＧＡＡＣＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＣＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＴＴＡＧＧＴＴ］ＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＴＡＡＴＣＣ
（［　］内は評価したいペプチドをコードするＤＮＡ配列の例であり、［　］内はペプチドごとに異なる。）
　鋳型ＤＮＡは、２段階のオーバーラップエクステンションＰＣＲにより作製した。
　１段階目のＰＣＲは、配列番号３３のＤＮＡ、配列番号３４のＤＮＡ、配列番号３５のＤＮＡ、及び配列番号３６のＤＮＡ、の４種のＤＮＡを、それぞれ０．３μｍｏｌ／Ｌ、０．３μｍｏｌ／Ｌ、０．０５μｍｏｌ／Ｌ、０．０５μｍｏｌ／Ｌとなるように混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ、Ｒ０４５Ｂ）存在下、９８℃／１０秒、３９℃／５秒、７２℃／５秒、の後、９８℃／１０秒、５８℃／５秒、７２℃／５秒の３ステップを２７サイクル繰り返すことで、配列番号２８のＤＮＡと配列番号２９のＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡを精製し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。
配列番号３３：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
配列番号３４：ＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣ
配列番号３５：ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣ
配列番号３６：ＧＡＡＣＣＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣ［ＡＡＣＣＴＡＡＡＣＡＣＧＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＣＧＴＴＣＧＴＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧ］ＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣ
（［　］内は評価したいペプチドをコードするＤＮＡ配列の例であり、［　］内はペプチドごとに異なる。）
　２段階目のＰＣＲは、配列番号３３のＤＮＡ、配列番号３７のＤＮＡ、配列番号３８のＤＮＡ、及び１段階目の精製産物、の４種のＤＮＡを、それぞれ０．３μｍｏｌ／Ｌ、０．３μｍｏｌ／Ｌ、０．００２５μｍｏｌ／Ｌ、０．４ｎｇ／μＬとなるように混合し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ、Ｒ０４５Ｂ）存在下、９８℃／１０秒、５８℃／５秒、７２℃／５秒の３ステップを３０サイクル繰り返すことで、配列番号３８のＤＮＡと１段階目の精製産物を連結し、鋳型ＤＮＡ（配列番号３１）を得た。鋳型ＤＮＡを精製し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。
配列番号３７：ＧＧＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＣ
配列番号３８：ＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＴＡＡＴＣＣ
　ペプチドの無細胞酵素合成は、鋳型ＤＮＡ、ＰＵＲＥｆｒｅｘ２．０（ジーンフロンティア、ＰＦ２０１－０．２５－５）及びアミノアシルｔＲＮＡ（１）を含む翻訳液中にて実施した。５０ｎｇ／μＬに調製した鋳型ＤＮＡ１．７５μＬ（６２．５ｎｇ）、ＰＵＲＥｆｒｅｘ２．０　ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ　２．５μＬ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩ　０．２５μＬ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩ　０．５μＬ、及びアミノアシルｔＲＮＡ（１）の乾燥体（終濃度０．５μｇ／μＬ）を混合し、３７℃で１時間反応させた。
　酵素合成したペプチドの濃度は、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution I（TOYOBO、NKB-101）にて希釈したペプチドを用い、Nano Glo HiBiT Lytic Detection System（Promega、N3040）とHiBiT Control Protein（Promega、N3010）を用いて、Nano Glo HiBiT Lytic Detection Systemの標準プロトコルに則り測定した。
　酵素合成したペプチドのＦＧＦＲ結合性を、ＦＧＦＲへのペプチド結合量をＥＬＩＳＡ評価することで測定した。
　まず９６ウェルプレートの各ウェルに５ｎｇのRecombinant Human FGFR1 alpha (IIIc) Fc Chimera Protein, CF（R&D systems、658-FR-050）を固定化し、Pierce Protein-Free (PBS) Blocking Buffer（Thermo、37572）にてブロッキングした後、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution I（TOYOBO、NKB-101）にて希釈したペプチドを添加し、室温（約２５℃）で３時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（phosphate buffered saline）を用いて洗浄後、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer SolutionII（TOYOBO、NKB-101）にて希釈した抗Ｍｙｃ抗体（Cell Signaling、14038S）を添加し、室温（約２５℃）で２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを用いて洗浄後、SuperSignal ELISA Femto Substrate（Thermo、37075）を添加し、発光量を測定した。
　ＦＧＦＲを固定化したウェルの発光量とＦＧＦＲを固定化していないウェルの発光量の差分を結合量（Ａ）とし、結合量（Ａ）及び反応時のペプチド濃度から、用量反応関係を算出した。各ペプチドの添加濃度が１０ｎＭのときの、ＦＧＦＲ１ｃに対するペプチドの結合量（Ａ）を図２及び表３に記載する。結合量が最も高いペプチドの結合量（Ａ）を１００とし、規格化した結果を規格化結合量（Ｂ）とする。図２中、縦軸は規格化結合量（Ｂ）、横軸は各条件を表す。表３の「平均結合量」は、各条件における６ペプチドの規格化結合量（Ｂ）の平均値を表す。
　図２及び表３より、環状部の外側隣接部位にランダムアミノ酸を導入すると結合性が高いペプチドが取得可能なことが示された。
　ランダムアミノ酸を環状部のＮ末端の隣接部位に導入した条件（条件６）より、Ｃ末端の隣接部位に導入した条件（条件７）の方が平均結合量が多く、両部位に導入した条件（条件３）が特に平均結合量が多いことがわかった。
　また、環サイズ（環状部を構成するアミノ酸残基数）が大きい方が平均結合量が多いこと（条件３～５）がわかった。
　さらに、環サイズの異なる環状ペプチドが混合されている場合に特に平均結合量が多いこと（条件２）が示された。
　ランダム化に用いられるアミノ酸の種類数が多い方が平均結合量が多いこと（条件１、３、１１）が示された。
　なお、本実施例ではいずれも、環化アミノ酸残基に挟まれるアミノ酸残基がランダム化されているが、環化アミノ酸残基に挟まれるアミノ酸残基のランダム化の条件は同じであるため、結合能の差は表３に示される条件の違いに起因すると推測できる。そのため、環化アミノ酸残基に挟まれるアミノ酸残基がランダム化していない場合であっても、上記の結論が同様に当てはまると考えられる。
＜実施例３：ｍＲＮＡディスプレイ取得ペプチドと機能性分子の連結評価＞
　実施例２で取得したペプチドから、結合性が高いペプチドを条件３、６、７及び８で１種ずつ抜粋し、隣接アミノ酸残基のランダム化が、他の機能性分子と連結する場合の結合性に与える影響を調べた。具体的には、機能性分子を模した他のペプチド配列をＮ末端及びＣ末端に連結し、連結前後の結合性の変化を評価した。連結するペプチド配列としては、正電荷を帯びた分子の例としてアミノ酸配列ＲＲＲを、負電荷を帯びた分子の例としてアミノ酸配列ＥＥＥを用いた。連結前のペプチド配列を（Ｐｅｐｔｉｄｅ）と記載する場合、連結後のペプチド配列は順にＲＲＲ－（Ｐｅｐｔｉｄｅ）－ＲＲＲ、及びＥＥＥ－（Ｐｅｐｔｉｄｅ）－ＥＥＥとなる。
　各評価に使用するペプチドの調製及びＦＧＦＲ１ｃ結合性の評価は実施例１と同様に実施した。条件３、６、７、８のそれぞれで、連結前のペプチド配列、ＲＲＲを連結したペプチド配列、又はＥＥＥを連結したペプチド配列のＦＧＦＲ１ｃに対するペプチドの結合量を測定し、規格化結合量（Ｂ）を算出した。連結前のペプチド配列の規格化結合量（Ｂ）を分母に、連結後のペプチド配列の規格化結合量（Ｂ）を分子に取り、連結による結合量変化を算出した結果を表４に示す。
　Ｎ末端側及びＣ末端側の隣接アミノ酸残基の両者がランダム化されている条件３で取得されたペプチド配列では、正電荷分子及び負電荷分子の連結による結合性変化がそれぞれ８％低減及び１９％向上と、ほとんど低下しない。一方、Ｃ末端側の隣接アミノ酸残基がランダム化されていない条件６で取得されたペプチド配列では、負電荷分子の連結により２０％の結合性低下が確認された。またＮ末端側の隣接アミノ酸残基がランダム化されていない条件７、及び両隣接アミノ酸残基がランダム化されていない条件８では、他分子の連結により顕著に結合性が低下した。本結果より、隣接アミノ酸残基をランダム化することにより、他の機能性分子と連結しても結合性が低下しにくい環状ペプチドを取得できることが示された。
　２０２４年６月１０日に出願された日本国特許出願２０２４－０９３７７８号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
１０　　　　　　環状部
１２ａ、１２ｂ　環化アミノ酸残基
２０　　　　　　鎖状部
２２ａ、２２ｂ　隣接アミノ酸残基
ａ～ｒ　　　　　アミノ酸残基

Claims (15)

  1. 　環状部を構成する複数のアミノ酸残基と、前記環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基と、を有する１０２種類以上の環状ペプチドのライブラリであって、
    　前記環状部を構成する複数のアミノ酸残基は、前記環状ペプチドの一次構造において離間しており互いに結合して環を形成する一対のアミノ酸残基と、前記環状ペプチドの一次構造において前記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基と、からなり、
    　前記環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基のうち、前記一対のアミノ酸残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基がランダム化されている、
    環状ペプチドのライブラリ。
  2. 　前記環状ペプチドのそれぞれが、核酸と連結されている、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  3. 　前記一対のアミノ酸残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基が、１９種類以上のアミノ酸残基にランダム化されている、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  4. 　前記一対のアミノ酸残基がチオエーテル結合又はアミド結合により結合して環を形成している、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  5. 　前記環状部に連結される少なくとも１つのアミノ酸残基のうち、前記一対のアミノ酸残基のうちＣ末端側のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基がランダム化されている、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  6. 　さらに、前記一対のアミノ酸残基に挟まれる複数のアミノ酸残基の一部又は全てがランダム化されている、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  7. 　前記環状ペプチド中のランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、前記ランダム化された全てのアミノ酸残基中の親水性残基数の割合が０．４以上である、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  8. 　前記親水性残基が、荷電官能基、ヒドロキシ基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸残基である、請求項７に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  9. 　前記環状ペプチド中のランダム化された全てのアミノ酸残基数に対する、前記ランダム化された全てのアミノ酸残基中の荷電残基数の割合が０．２以上である、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  10. 　前記環状ペプチド中のランダム化されたいずれのアミノ酸残基も、アミノ基及びスルフヒドリル基のいずれも含まない、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  11. 　前記環状部を構成する複数のアミノ酸残基の数が異なる複数の環状ペプチドを含む、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  12. 　前記環状部を構成する複数のアミノ酸残基の平均個数が１１個以上である、請求項１に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  13. 　ｍＲＮＡディスプレイライブラリ又はｃＤＮＡディスプレイライブラリである、請求項２に記載の環状ペプチドのライブラリ。
  14. 　請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の環状ペプチドのライブラリを準備することと、
    　前記環状ペプチドのライブラリから標的物質に対する結合活性を有する環状ペプチドを選択し、選択した環状ペプチドと関連付けられた核酸の塩基配列を同定することと、
    を含む、スクリーニング方法。
  15. 　請求項１４に記載のスクリーニング方法によって同定された塩基配列に基づき、標的物質に対する結合活性を有するペプチドを取得することを含む、ペプチドの作製方法。 
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