WO2025258362A1 - アルギン酸リアーゼ - Google Patents

アルギン酸リアーゼ

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WO2025258362A1
WO2025258362A1 PCT/JP2025/018936 JP2025018936W WO2025258362A1 WO 2025258362 A1 WO2025258362 A1 WO 2025258362A1 JP 2025018936 W JP2025018936 W JP 2025018936W WO 2025258362 A1 WO2025258362 A1 WO 2025258362A1
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WO
WIPO (PCT)
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alginate lyase
alginate
amino acid
seq
present technology
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PCT/JP2025/018936
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English (en)
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翔 永木
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Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Enzyme Inc
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • This technology relates to alginate lyase. More specifically, this technology relates to a novel alginate lyase, DNA encoding the alginate lyase, an expression cassette or recombinant vector containing the DNA, a transformant, a method for producing alginate lyase, a method for producing alginate oligosaccharides, alginate oligosaccharides, and an enzyme preparation for producing alginate oligosaccharides.
  • Alginate lyase is an enzyme that belongs to the polysaccharide lyase family and catalyzes an elimination reaction that cleaves the glycosidic bond of the substrate.
  • the target substrate of alginate lyase is alginic acid, which is used as a thickening and gelling agent, and it is expected to be used in many industries, such as adjusting the texture of food and producing functional alginate oligosaccharides.
  • Alginate lyase is known to exist in microorganisms and marine mollusks.
  • Patent Document 1 discloses a novel alginate-degrading enzyme derived from Agarivorans sp. JAM-A1m strain that has an optimum reaction pH in the alkaline range.
  • Patent Document 2 discloses an alginate lyase derived from Nitratiruptor sp. SB155-2 strain that exhibits high enzymatic activity and stability under a wide range of conditions.
  • Patent Document 3 discloses a technique for easily producing alginate lyase on an industrial scale from Flavobacterium microorganisms.
  • Non-Patent Document 1 discloses a thermostable alginate lyase derived from Paenibacillus ehimensis.
  • Non-Patent Document 2 discloses a thermostable alginate lyase derived from Rhodothermus marinus.
  • Non-Patent Document 3 discloses an alginate lyase derived from Paenibacillus sp. str. FPU-7 strain.
  • alginate lyase is expected to be widely used in a variety of fields, and discovering a wide variety of alginate lyases will lead to development in industry.
  • the main objective of this technology is to provide a novel alginate lyase.
  • the present technology first provides an alginate lyase comprising a polypeptide shown in any one of (1) to (3) below: (1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, (2) A polypeptide having alginate lyase activity, in which one or more amino acid residues have been substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and (3) a polypeptide having alginate lyase activity, in which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 has a sequence identity of 70% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the alginate lyase according to the present technology may be derived from Paenibacillus elgii.
  • the present technology provides DNA containing a polynucleotide shown in any one of (1) to (3) below.
  • the present technology also provides an expression cassette or recombinant vector comprising the DNA of the present technology.
  • the present technology also provides a transformant obtained by transforming a host with the expression cassette of the present technology or the recombinant vector of the present technology.
  • the present technology also includes a culture step of culturing Paenibacillus elgii or the transformant of the present technology; a recovery step of recovering the alginate lyase according to the present technology from the culture obtained in the culture step;
  • the present invention provides a method for producing an alginate lyase having the formula:
  • the present technology further provides a method for producing alginate oligosaccharides, which comprises the step of reacting alginic acid and/or a salt thereof with the alginate lyase of the present technology.
  • the present technology also provides alginate oligosaccharides obtainable using the alginate lyase of the present technology.
  • the present technology also provides an enzyme preparation for producing alginate oligosaccharides, which contains the alginate lyase of the present technology.
  • G for glycine
  • A for alanine
  • V for valine
  • Leu L for leucine
  • I for isoleucine
  • F for phenylalanine
  • Phe Y
  • Tr tyrosine
  • Trp tryptophan
  • S serine
  • Ser serine
  • T threonine
  • C cysteine
  • M for methionine
  • D for aspartic acid
  • N for asparagine
  • Q for glutamine
  • Gln Q for glutamine
  • K for lysine
  • R for arginine
  • H histidine
  • His histidine
  • P proline
  • amino acid sequence displayed has the N-terminus at the left end and the C-terminus at the right end.
  • nonpolar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • modifications of amino acid sequences and/or nucleotide sequences include not only artificial modifications (substitutions, additions, insertions, deletions, inversions, etc.), but also naturally occurring modifications (substitutions, additions, insertions, deletions, inversions, etc.), i.e., modifications in which the sequences were originally different.
  • isolated is used interchangeably with “purified.”
  • isolated is used to distinguish it from the natural state, i.e., the state that exists in nature.
  • the artificial process of "isolating” results in an "isolated state,” which is a state different from the natural state.
  • An isolated item is clearly and decisively different from the natural product itself.
  • an "equivalent sequence” refers to an amino acid sequence or a nucleotide sequence that differs in part from a reference amino acid sequence (in the present technology, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2) or nucleotide sequence (in the present technology, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6), but the difference does not substantially affect the function of the protein (in the present technology, alginate lyase activity). Therefore, in the present technology, an enzyme having a polypeptide chain consisting of an equivalent amino acid sequence, or an enzyme encoded by a polynucleotide consisting of an equivalent nucleotide sequence, exhibits alginate lyase activity.
  • 1 is a graph showing the pH stability of alginate lyase obtained from a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 and a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2.
  • 1 is a graph showing the optimum pH of alginate lyase obtained from a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 and a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2.
  • 1 is a graph showing the temperature stability of alginate lyase obtained from a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 and a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2.
  • 1 is a graph showing the optimum temperatures of alginate lyase obtained from a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 and a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2.
  • 1 is a graph showing the optimal salt concentrations of alginate lyase obtained from a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 and a strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2.
  • Alginate lyase The alginate lyase according to the present technology will be described in detail below.
  • the alginate lyase according to the present technology includes a polypeptide shown in any one of (1) to (3) below.
  • (3) a polypeptide having alginate lyase activity in which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 has a sequence identity of 70% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the amino acid modification may include only one type of modification from substitution, addition, insertion, and deletion (e.g., substitution only), or may include two or more types of modification (e.g., substitution and insertion).
  • the number of amino acid differences at any difference site may be one or several, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, or 1 to 30, more preferably 1 to 20, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1, 2, or 1.
  • sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 may be 70% or more, but is preferably 75% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more, 93% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • sequence identity refers to the amino acid sequence identity value obtained using the bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, pp. 247-250, 1999) of BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)].
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • amino acid residues corresponding to positions 178 (tyrosine residue), 215 (lysine residue), and 246 (lysine residue) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are presumed to be highly likely to be active centers, and therefore it is desirable not to introduce substitutions or deletions at these positions.
  • polypeptides of the present invention may be part of a larger protein (e.g., a fusion protein).
  • Additional sequences in fusion proteins may include, for example, sequences that aid in purification, such as multiple histidine residues, or additional sequences that ensure stability during recombinant production.
  • a preferred embodiment of the amino acid substitution to be introduced is a conservative substitution. That is, examples of substitutions in the polypeptides of (2) and (3) include, if the amino acid before substitution is a nonpolar amino acid, substitution with another nonpolar amino acid; if the amino acid before substitution is an uncharged amino acid, substitution with another uncharged amino acid; if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, substitution with another acidic amino acid; and if the amino acid before substitution is a basic amino acid, substitution with another basic amino acid.
  • the alginate lyase containing the polypeptides (2) and (3) has alginate lyase activity equal to or greater than that of the alginate lyase containing the polypeptide (1).
  • the relative activity of the alginate lyase containing the polypeptides (2) and (3) is 0.7-fold or more, 0.8-fold or more, 0.9-fold or more, 1.0-fold or more, 1.1-fold or more, preferably 1.15-fold or more, more preferably 1.2-fold or more, and even more preferably 1.25-fold or more of the relative activity of the alginate lyase containing the polypeptide (1).
  • the origin of the alginate lyase according to the present technology is not particularly limited as long as it contains the aforementioned polypeptide.
  • alginate lyase derived from Paenibacillus elgii can be mentioned.
  • the Paenibacillus elgii strain used is not particularly limited as long as it does not impair the action and effect of the present technology, and strains generally available from biological resource organizations can be used.
  • an alginate lyase containing the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 was purified from Paenibacillus elgii.
  • alginate lyase containing the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 strain.
  • the amino acid sequence including the signal sequence and pro-sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the alginate lyase containing the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is derived from Paenibacillus elgii strain No. 2.
  • the amino acid sequence including the signal sequence and pro-sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the alginate lyase used in this technology may also be an artificial protein artificially designed based on the amino acid sequences (1) to (3) described above.
  • the alginate lyase according to the present technology has an optimum pH in the range of pH 7.5 to 9.0.
  • the optimum pH of the alginate lyase according to the present technology varies depending on the amino acid sequence, origin, etc., as described above, but is in the range of pH 7.5 to 9.0.
  • the optimum pH of an alginate lyase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 8.5.
  • the optimum pH of an alginate lyase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is 8.0.
  • the alginate lyase of this technology has 70% or more of its activity at the optimal pH at pH 7.5 to 9.5.
  • the optimum pH is measured using 50 mM acetate buffer (pH 4.0-5.5), 50 mM phosphate buffer (pH 5.5-8.0), 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.5), and 50 mM CAPS buffer (pH 9.5-11.0).
  • the alginate lyase according to the present technology is stable in the pH range of 4.0 to 10.5, and even in this range, 70% or more of its activity remains after treatment at 37°C for 30 minutes.
  • the residual activity at pH 4.0 is 85% or more, preferably 90% or more, when the activity at the optimal pH is taken as 100%.
  • the residual activity at pH 5.0 is 90% or more, preferably 95% or more, when the activity at the optimal pH is taken as 100%.
  • the alginate lyase according to the present technology has an optimum temperature in the range of 55 to 65°C.
  • the optimum temperature of the alginate lyase according to the present technology varies depending on the amino acid sequence, origin, etc., as described above, but is in the range of 55 to 65°C.
  • the optimum temperature of an alginate lyase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 65°C, and it exhibits 70% or more of its activity at the optimum temperature between 55 and 70°C.
  • the optimum temperature of an alginate lyase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is 60°C, and it exhibits 75% or more of its activity at the optimum temperature between 50 and 65°C.
  • alginate lyase is expected to be widely used in industry. This application also includes catalyzing decomposition reactions under high-temperature conditions.
  • the active temperature of alginate lyase currently produced on an industrial scale and put into practical use is between 30°C and 40°C, and it cannot be used above 50°C.
  • the optimal temperature for the alginate lyase used in this technology is in the 55-65°C range, and it is able to function satisfactorily even under high-temperature conditions.
  • the alginate lyase according to the present technology has a residual activity of 80% or more at 40°C and 40% or more at 50°C.
  • the alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 has a residual activity of approximately 100% at 40°C and 65% at 50°C.
  • alginate lyase 2 has a residual activity of approximately 95% at 40°C and 45% or more at 50°C. While conventional alginate lyases cannot be used at temperatures above 50°C, the alginate lyase according to the present technology is stable to a certain extent even at temperatures above 50°C, and therefore can be expected to be usable at temperatures above 50°C.
  • the molecular weight of the alginate lyase according to the present technology is 32 to 36 kDa. Specific examples include the molecular weight of the alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 1 strain and the alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2 strain, both of which have a molecular weight of 34 kDa.
  • the molecular weight was measured by SDS-PAGE.
  • the alginate lyase according to the present technology exhibits activity even without the addition of salt, and when comparing the activity at final salt concentrations of 0 (no addition), 50 mM, 100 mM, and 150 mM, it exhibits the maximum activity without the addition of salt.
  • alginate lyases exhibit maximum activity when salts such as sodium chloride are added.
  • salt can place a strain on factory equipment, and conventional alginate lyases to date have not always been able to fully meet the expected application needs of industry.
  • the alginate lyase of this technology exhibits high activity even without added salt, and exhibits maximum activity without added salt, thereby reducing the strain on factory equipment and enabling application in a variety of fields with sufficient activity.
  • DNA encoding alginate lyase includes a polynucleotide shown in any one of (1) to (3) below. (1) a polynucleotide encoding the alginate lyase of the present technology; (2) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6; (3) A polynucleotide comprising a sequence equivalent to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6 and encoding a polypeptide having alginate lyase activity.
  • polynucleotide encoding the alginate lyase of the present technology refers to a polynucleotide that, when expressed, yields the alginate lyase of the present technology, and includes not only polynucleotides having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the alginate lyase of the present technology, but also polynucleotides in which a sequence that does not encode an amino acid sequence has been added to such a polynucleotide. It also includes polynucleotides with degenerated codons.
  • SEQ ID NO: 5 genomic DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 7 cDNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 6 genomic DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 8 cDNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • the DNA of the present technology also includes DNA containing polynucleotides that, when compared with the base sequence of the polynucleotide encoding the alginate lyase of the present technology described in (1) above, have a partially different base sequence (hereinafter also referred to as an "equivalent sequence"), although the function of the protein they encode is equivalent.
  • equivalent sequences include polynucleotides that contain modifications such as substitution, addition, insertion, deletion, or inversion of one or more bases based on the base sequence of a polynucleotide encoding the alginate lyase of the present technology (e.g., SEQ ID NO: 5, 6, 7, or 8), and that encode a polypeptide with alginate lyase activity.
  • the base modifications may occur at multiple sites in the sequence.
  • “multiple” refers to, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, and more preferably 2 to 10 bases, although this varies depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein encoded by the DNA.
  • equivalent sequences include sequences that have, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, even more preferably about 90% or more, even more preferably 95% or more, and particularly preferably 99% or more sequence identity to the base sequence of the polynucleotide encoding the alginate lyase of the present technology (e.g., SEQ ID NO: 5, 6, 7, or 8).
  • sequence identity can be calculated using publicly available or commercially available software with an algorithm for comparing a reference sequence with a query sequence. Specifically, BLAST, FASTA, or GENETYX (Software Development Co., Ltd.) can be used, and these can be used with default parameters.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, 6, 7, or 8 is also included in the DNA used in this technology, as long as it encodes a polypeptide with alginate lyase activity.
  • under stringent conditions refers to incubation conditions of 6x SSC (1x SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0) containing 0.5% SDS, 5x Denhartz's (0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400), and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA at 50-65°C for 4 hours to overnight.
  • 6x SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0
  • SDS 0.5% SDS
  • 5x Denhartz's 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400
  • 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA at 50-65°C for 4 hours to overnight.
  • hybridization under stringent conditions is performed using the following method. Specifically, a nylon membrane is prepared onto which a DNA library or cDNA library is immobilized, and the nylon membrane is blocked at 65°C in a prehybridization solution containing 6x SSC, 0.5% SDS, 5x Denhardt's, and 100 ⁇ g/mL salmon sperm DNA. 32P-labeled probes are then added and incubated overnight at 65°C.
  • nylon membrane is then washed in 6x SSC at room temperature for 10 minutes, in 2x SSC containing 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes, and in 0.2x SSC containing 0.1% SDS at 45°C for 30 minutes, after which autoradiography is performed to detect DNA that has specifically hybridized with the probe.
  • the DNA of the present technology can be prepared in an isolated state by standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, chemical synthesis, PCR (e.g., overlap PCR), or a combination thereof, with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing.
  • the DNA used in this technology can also be isolated from microorganisms that produce polypeptides with alginate lyase activity.
  • the target DNA can be isolated from the genome of the microorganism by PCR or hybridization using primers or probes designed from known amino acid sequence information taking into account gene degeneracy, or primers or probes designed based on known nucleotide sequence information.
  • the DNA involved in this technology includes various types of DNA resulting from codon degeneracy.
  • Various types of DNA encoding the same amino acid sequence can be artificially created easily using known genetic engineering techniques. For example, in the production of a protein through genetic engineering, if the codons used in the original gene encoding the target protein are used infrequently in the host, the amount of protein expressed may be low. In such cases, high expression of the target protein can be achieved by optimizing codon usage for the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • codon usage frequency As an indicator of codon usage frequency, the sum of the host's optimal codon usage frequencies for each codon can be used.
  • An optimal codon is defined as the codon with the highest usage frequency among the codons corresponding to the same amino acid. There are no particular restrictions on codon usage frequencies as long as they are optimized for the host, but the following are examples of optimal codons for E.
  • coli F: phenylalanine (ttt), L: leucine (ctg), I: isoleucine (att), M: methionine (atg), V: valine (gtg), Y: tyrosine (tat), stop codon (taa), H: histidine (cat), Q: glutamine (cag), N: asparagine (aat), K: lysine (aaa), D: aspartic acid (gat), E: glutamic acid (gaa), S: serine (agc), P: proline (ccg), T: threonine (acc), A: alanine (gcg), C: cysteine (tgc), W: tryptophan (tgg), R: arginine (cgc), G: glycine (ggc).
  • Methods for introducing mutations into genes and artificially modifying amino acid sequences include well-known techniques such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, as well as mutation introduction kits that utilize site-directed mutagenesis, such as the QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), the GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), and the TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio).
  • the DNA base sequence can be confirmed by sequencing using conventional methods. For example, the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) can be used. Alternatively, the sequence can be analyzed using an appropriate DNA sequencer.
  • the obtained DNA encodes the desired polypeptide can be confirmed by comparing the determined nucleotide sequence with the nucleotide sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • the amino acid sequence deduced from the determined nucleotide sequence can be compared with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the DNA according to the present technology can be used as a probe for identifying the gene encoding the alginate lyase according to the present technology described above, the DNA encoding the alginate lyase according to the present technology, or a primer for amplifying or mutating the DNA encoding the alginate lyase according to the present technology.
  • the DNA of the present technology can be used to prepare the alginate lyase of the present technology.
  • a genetic engineering preparation method using the DNA of the present technology, it is possible to obtain a more homogeneous alginate lyase of the present technology.
  • This method is also suitable for preparing large quantities of the alginate lyase of the present technology.
  • the DNA of the present technology is DNA having a polynucleotide that does not contain an initiation codon
  • the alginate lyase of the present technology can be obtained by adding an initiation codon or a signal peptide containing an initiation codon and then expressing it.
  • the DNA involved in this technology can also be used as an experimental tool for purposes such as elucidating the mechanism of action of the alginate lyase involved in this technology, or as a tool for designing or creating mutants (modified forms) of the alginate lyase involved in this technology.
  • Expression Cassette, Recombinant Vector The expression cassette and the recombinant vector according to the present technology contain the above-described DNA according to the present technology.
  • the expression cassettes and recombinant vectors of the present technology may contain, as control elements, promoters and terminators, as well as transcription elements such as enhancers, CCAAT boxes, TATA boxes, and SPI sites, as necessary. These control elements may be operably linked to the DNA of the present invention. "Operably linked" means that the various control elements that regulate the DNA of the present invention are linked to the DNA of the present invention in a state that allows them to operate in a host cell.
  • expression vectors constructed for genetic recombination from phages, plasmids, or viruses capable of autonomously replicating within a host are preferred.
  • Such expression vectors are well known, and commercially available expression vectors include pQE-series vectors (Qiagen Inc.), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Biosciences), pET-series vectors (Merck Ltd.), and pBE-S (Takara Bio Inc.).
  • the expression vector can be used in an appropriate combination with the host cell; for example, when E. coli is used as the host cell, combinations of a pET-series vector and the DH5 ⁇ E. coli strain, a pET-series vector and the BL21(DE3) E. coli strain, or a pDR540 vector and the JM109 E. coli strain are examples.
  • Transformant The transformant according to the present technology can be obtained by transforming a host with the above-described expression cassette according to the present technology or the recombinant vector according to the present technology.
  • the host used for producing the transformant according to the present technology is not particularly limited as long as it has the following characteristics (1) to (4): (1) It is possible to introduce an expression cassette or a recombinant vector; (2) The expression cassette or the recombinant vector is stable; (3) It is capable of autonomous replication; and (4) The host can express the traits of the gene in the introduced expression cassette or recombinant vector. Suitable examples of such a host include bacteria belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli, the genus Bacillus, such as Bacillus subtilis, and the genus Pseudomonas, such as Pseudomonas putida; filamentous fungi; and yeast. Also suitable are animal cells, insect cells, and plants.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing DNA, an expression cassette, or a recombinant vector according to the present technology into a host.
  • the location where the DNA, etc. according to the present technology is introduced is not particularly limited as long as it allows the gene of interest to be expressed, and may be on a plasmid or on the genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette or recombinant vector of the present technology include, for example, recombinant vector methods and genome editing methods. Conditions for introducing the expression cassette or recombinant vector into the host may be set appropriately depending on the type of host, etc.
  • examples include a method using competent cells treated with calcium ions and electroporation.
  • examples include electroporation, the spheroplast method, and the lithium acetate method.
  • examples include electroporation, the calcium phosphate method, and lipofection.
  • examples include the calcium phosphate method, lipofection, and electroporation.
  • examples include electroporation, the Agrobacterium method, the particle gun method, and the PEG method.
  • the genomic DNA, expression cassette, or recombinant vector may be isolated and purified from a transformant.
  • the host is a bacterium
  • the isolation and purification of the genomic DNA, expression cassette, or recombinant vector is carried out using a lysate obtained by lysing the bacterium. Lysis may involve treatment with a lytic enzyme such as lysozyme, optionally in combination with a protease, other enzymes, and a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS).
  • a lytic enzyme such as lysozyme
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • DNA can be isolated and purified from the lysate by, for example, an appropriate combination of deproteinization treatments using phenol treatment and protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation, and commercially available kits.
  • DNA can be cleaved using standard methods, for example, restriction enzyme treatment.
  • restriction enzyme treatment for example, a type II restriction enzyme that acts on a specific nucleotide sequence is used as the restriction enzyme.
  • DNA can be linked to an expression cassette or expression vector using, for example, DNA ligase.
  • primers specific to the DNA involved in this technology are designed and PCR is performed.
  • the amplified products obtained by PCR are subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., and stained with ethidium bromide and SYBR Green solution, etc., and the amplified products are detected as bands, allowing for confirmation of transformation.
  • the method for producing alginate lyase according to the present technology involves at least a culture step and a recovery step. If necessary, various other steps commonly used in the production of enzymes can be freely combined. Each step will be described in detail below.
  • the culturing step is a step of culturing a microorganism that produces alginate lyase or a transformant according to the present technology.
  • microorganisms that produce alginate lyase include microorganisms of the genus Paenibacillus, such as Paenibacillus elgii.
  • the microorganisms used may be wild-type strains or mutant strains (e.g., mutant strains induced by ultraviolet irradiation, etc.).
  • the culture conditions in the culture step can be set appropriately, taking into consideration the properties of the microorganisms being cultured and the nutritional and physiological properties of the transformants being cultured.
  • the microorganisms or transformants can be cultured in solid or liquid media, with liquid culture being preferred. Furthermore, for industrial production, aerated and agitated culture is preferred.
  • Carbon sources can be any assimilable carbon compound, such as glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid.
  • Nitrogen sources can be any assimilable nitrogen compound, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolysate, and alkaline extract of soybean meal.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc, and alginates (such as sodium alginate), as well as certain amino acids and certain vitamins, may also be used as needed.
  • the culture temperature may be set appropriately within a range in which the microorganism or transformant being cultured can grow and the microorganism or transformant can produce alginate lyase.
  • the culture temperature can be set between 15 and 37°C.
  • the culture time can be, for example, about 12 to 48 hours.
  • the culture process can be terminated when the alginate lyase reaches its maximum yield.
  • the recovery step is a step of recovering the alginate lyase according to the present technology from the culture obtained in the culture step.
  • the recovery method in the recovery step is not particularly limited, and one or more recovery methods commonly used in enzyme production can be used in any combination.
  • the transformant when alginate lyase expressed using a transformant is present inside the transformant, the transformant is separated from the culture supernatant using a common separation method such as centrifugation. The culture supernatant is removed and the separated transformant is recovered. The separated transformant is treated using mechanical methods such as ultrasound or a French press, or enzymatic methods such as lysozyme, and if necessary, solubilized using an enzyme such as protease or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS), to obtain a water-soluble fraction containing alginate lyase. Furthermore, by selecting an appropriate expression cassette or expression vector and host, the expressed alginate lyase can be secreted into the culture medium.
  • a common separation method such as centrifugation.
  • the culture supernatant is removed and the separated transformant is recovered.
  • the separated transformant is treated using mechanical methods such as ultrasound or a French press, or enzymatic methods such as lys
  • the water-soluble fraction containing alginate lyase obtained in this manner may be subjected to purification treatment as is, or the desired alginate lyase in the water-soluble fraction may be concentrated and then subjected to purification treatment.
  • Concentration can be carried out, for example, by vacuum concentration, membrane concentration, salting out, or fractional precipitation using a hydrophilic organic solvent (e.g., methanol, ethanol, acetone, etc.).
  • Purification of alginate lyase can be carried out by an appropriate combination of methods such as gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • purified alginate lyase can be powdered by freeze-drying, vacuum drying, spray drying, etc., and then distributed commercially.
  • Alginate oligosaccharides are disaccharide-hexasaccharide oligosaccharides whose constituent monosaccharides are mannuronic acid and guluronic acid. They are used in plant growth promoters and cosmetics, and have recently attracted attention as prebiotics.
  • the method for producing alginate oligosaccharides according to the present technology includes a step of reacting alginic acid and/or a salt thereof with the alginate lyase according to the present technology (hereinafter also referred to as the "enzyme action step"). Furthermore, as necessary, a raw material preparation step, an enzyme inactivation step, a recovery step, etc. can also be performed. Each step is described in detail below.
  • the raw material preparation step is a step of preparing alginic acid and/or a salt thereof as a raw material.
  • the alginic acid and/or a salt thereof may be a mixture of two or more selected from alginic acid and its salts, or may be in the form of a composition mixed with other components as long as the action and effect of the present technology are not impaired.
  • alginic acid salts examples include sodium alginate.
  • the enzyme action step is a step in which the alginate lyase according to the present technology is allowed to act on alginic acid and/or a salt thereof.
  • the alginate lyase according to the present technology may be used alone or in combination with two or more types. Furthermore, as long as the action and effect of the present technology are not impaired, it may also be used in combination with enzymes other than the alginate lyase according to the present technology depending on the purpose.
  • the two or more types of enzymes may be added to alginic acid and/or a salt thereof simultaneously or separately.
  • the order in which they are added is not particularly limited. Note that the details of the alginate lyase according to the present technology are as described above, and therefore will not be described here.
  • the various conditions for the enzyme action step can be freely set as long as they do not impair the effects of this technology.
  • the pH, temperature, action time, etc. can be set depending on the physicochemical properties of the enzyme used, such as its optimal pH, stable pH range, optimal temperature, and temperature stability.
  • Optimal reaction conditions can be determined through preliminary experiments. Below are examples of conditions for the action of each enzyme.
  • the pH can be set to, for example, pH 4.0 to 11.5, preferably pH 4.0 to 10.5, more preferably pH 5.0 to 10.0, even more preferably pH 6.0 to 10.0, even more preferably pH 7.0 to 9.5, and particularly preferably pH 7.5 to 9.0.
  • the temperature can be set to, for example, 35°C to 70°C, preferably 40°C to 70°C, more preferably 45°C to 70°C, even more preferably 50°C to 70°C, and particularly preferably 55°C to 65°C.
  • the lower limit of the duration of the reaction is, for example, 10 minutes or more, 30 minutes or more, 1 hour or more, or 2 hours or more
  • the upper limit is, for example, 48 hours or less, 24 hours or less, 10 hours or less, 2 hours or less, or 1 hour or less.
  • the enzyme deactivation step is a step of deactivating an enzyme after the above-described enzyme action step.
  • the enzyme deactivation step is not an essential step and can be performed as needed.
  • enzyme deactivation can also be performed between the actions of the enzymes. For example, when multiple enzymes are acted on in the enzyme action step, the enzyme deactivation step can be appropriately performed during the enzyme action step.
  • the method for inactivating the enzyme is not particularly limited, and one or more common inactivation methods can be freely combined and used depending on the properties of the enzyme to be inactivated.
  • an example is a method in which the enzyme is inactivated by heating it to a temperature above the enzyme inactivation temperature.
  • the recovery step is a step of recovering the produced alginate oligosaccharide.
  • Specific recovery methods can be selected from one or a combination of two or more common recovery methods used in the production of alginate oligosaccharide, depending on the type of alginate oligosaccharide to be produced.
  • the recovered alginate oligosaccharides can be further processed depending on the form of the final product, as long as the action and effects of this technology are not impaired.
  • Enzyme preparation for producing alginate oligosaccharides is an enzymatic preparation containing the alginate lyase according to the present technology. Details of the alginate lyase according to the present technology are as described above, and therefore will not be described here.
  • the content of alginate lyase in the enzyme preparation for producing alginate oligosaccharides according to the present technology can be freely set as long as it does not impair the effects of the present technology.
  • the content of alginate lyase can be set to, for example, 0.006 U or more, 0.03 U or more, 0.06 U or more, 0.5 U or more, 1 U or more, 10 U or more, 20 U or more, 30 U or more, 40 U or more, 50 U or more, or 100 U or more per 1 g of alginic acid and/or a salt thereof used in the production of alginate oligosaccharides.
  • the upper limit of the alginate lyase content is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present technology, but can be set to, for example, 12,000 U or less, 10,000 U or less, 9,000 U or less, 8,000 U or less, 7,000 U or less, 6,000 U or less, 5,000 U or less, 4,000 U or less, 3,000 U or less, 2,400 U or less, 2,000 U or less, 1,500 U or less, 1,200 U or less, 1,000 U or less, 900 U or less, 800 U or less, 700 U or less, 600 U or less, 500 U or less, 400 U or less, 300 U or less, 200 U or less, 100 U or less, 50 U or less, 40 U or less, 30 U or less, 24 U or less, 20 U or less, 18 U or less, or 13 U or less per gram of alginic acid and/or its salts used in the production of alginate oligosaccharides.
  • the alginate lyase activity is measured using the method described in the Examples below.
  • the enzyme preparation for producing alginic acid oligosaccharides according to the present technology can be used in combination with other components as long as the action and effect of the present technology are not impaired.
  • examples of other components that can be used include excipients, pH adjusters, colorants, flavoring agents, disintegrants, lubricants, stabilizers, enzymes, and other components commonly used in formulations.
  • components with known or future functions can also be used in combination as appropriate depending on the purpose.
  • Expression system The target sequence was incorporated into a commercially available expression vector. PCR and infusion reactions were performed using primers.
  • Expression plasmids incorporating the target sequence were constructed using Escherichia coli strains JM109 and BL21 (DE3), and transformants (Paenibacillus elgii No. 1-derived alginate lyase heterologous expression strains and Paenibacillus elgii No. 2-derived alginate lyase heterologous expression strains) were obtained using the heat shock method. The obtained transformants were subjected to sequence analysis to confirm the integration of the target sequence.
  • the alginate lyase activity of a portion of each obtained fraction was confirmed using the method described below, and fractions with alginate lyase activity were collected, thereby obtaining a purified alginate lyase solution. Purification was confirmed by SDS-PAGE. The molecular weight was 34 kDa.
  • the purified enzyme solution was prepared by ultrafiltration (UF) and diafiltration (DF).
  • the optimal pH of the alginate lyase obtained from the strain heterologously expressing Paenibacillus elgii No. 1-derived alginate lyase was pH 8.5
  • the optimal pH of the alginate lyase obtained from the strain heterologously expressing Paenibacillus elgii No. 1-derived alginate lyase was pH 8.5
  • the optimum pH of the alginate lyase obtained from the strain heterologously expressing alginate lyase derived from Bacillus subtilis No. 2 was pH 8.0.
  • alginate lyase obtained from the strain heterologously expressing alginate lyase derived from Paenibacillus elgii No. 2 exhibited high stability below 45°C. Furthermore, all alginate lyases showed high stability, with residual activity of 80% or more up to 45°C, and also showed a certain level of stability, with residual activity of 40% or more even at 50°C.

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Abstract

新規なアルギン酸リアーゼを提供すること。 本技術では、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼを提供する。 （１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、 （２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド、及び （３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド

Description

アルギン酸リアーゼ
　本技術は、アルギン酸リアーゼに関する。より詳しくは、本技術は、新規なアルギン酸リアーゼ、該アルギン酸リアーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター、形質転換体、アルギン酸リアーゼの製造方法、アルギン酸オリゴ糖の製造方法、アルギン酸オリゴ糖、及びアルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤に関する。
　アルギン酸リアーゼは、多糖リアーゼに属する酵素であり、基質のグリコシド結合を切断する脱離反応を触媒する。アルギン酸リアーゼは対象基質が増粘剤やゲル化剤として使われているアルギン酸であり、食品の質感調整や機能性を有したアルギン酸オリゴ糖の生成など多くの産業界で利用できることが期待されている。アルギン酸リアーゼは、微生物や海産軟体動物において存在することが知られている。
　近年、種々の特徴を有するアルギン酸リアーゼが開発されている。例えば、特許文献１では、Agarivorans sp. JAM-A1m株由来のアルカリ領域に最適反応ｐＨを有する新規なアルギン酸分解酵素が開示されている。特許文献２では、Nitratiruptor sp. SB155-2株由来で広範な条件下で高い酵素活性および安定性を示すアルギン酸リアーゼが開示されている。特許文献３では、Flavobacterium属微生物から、工業的な規模で容易にアルギン酸リアーゼを製造する技術が開示されている。
　また、非特許文献1では、Paenibacillus ehimensis由来の熱安定性アルギン酸リアーゼが開示されている。非特許文献２では、Rhodothermus marinus由来の熱安定性アルギン酸リアーゼが開示されている。非特許文献３では、Paenibacillus sp. str. FPU-7株由来アルギン酸リアーゼが開示されている。
特開２００９－１９５２２２号公報 国際公開第２０１１／１１８５８２号 特開平０４－１４１０９０号公報
Enzyme and Microbial Technology 166 (2023) 110221 Frontiers in Plant Science Volume 13, 2022, 10.3389/fpls.2022.981602 SCIENTIFIC REPORTS (2019) 9:14870
　前述の通り、アルギン酸リアーゼは、様々な分野において、幅広く利用されることが期待されており、多種多様なアルギン酸リアーゼを見出すことは産業界の発展につながる。
　そこで、本技術では、新規なアルギン酸リアーゼを提供することを主目的とする。
　本技術では、まず、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼを提供する。
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、Paenibacillus elgii由来であってもよい。
　本技術では、次に、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリヌクレオチドを含むＤＮＡを提供する。
（１）請求項１に記載のアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号５又は６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号５又は６に示す塩基配列と等価の配列を含み、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
　本技術では、本技術に係るＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクターも提供する。
　本技術では、本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体も提供する。
　本技術では、また、Paenibacillus elgii又は本技術に係る形質転換体を培養する培養工程と、
　前記培養工程で得られた培養物から本技術に係るアルギン酸リアーゼを回収する回収工程と、
を有するアルギン酸リアーゼの製造方法を提供する。
　本技術では、更に、アルギン酸及び／又はその塩に、本技術に係るアルギン酸リアーゼを作用させる工程を含む、アルギン酸オリゴ糖の製造方法を提供する。
　本技術では、本技術に係るアルギン酸リアーゼを用いて得られる、アルギン酸オリゴ糖も提供する。
　本技術では、本技術に係るアルギン酸リアーゼを含む、アルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤も提供する。
　以下、本技術で用いる技術用語の説明を行う。
　＜アミノ酸表記＞
　アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰで表現する場合がある。
　＜アミノ酸配列＞
　本技術において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
　＜アミノ酸の種類＞
　本技術において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
　＜配列の改変（置換、付加、挿入、欠失、逆位等）＞
　本技術において、アミノ酸配列及び／又は塩基配列の改変は、人為的に行う改変（置換、付加、挿入、欠失、逆位等）のみならず、自然に発生した改変（置換、付加、挿入、欠失、逆位等）、即ち、もともと配列が相違していた場合も含まれる。
　＜単離・精製＞
　本技術において、用語「単離された」は、「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。「単離する」という人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
　＜等価な配列＞
　本技術において、「等価な配列」とは、基準となるアミノ酸配列（本技術では配列番号１、又は配列番号２）又は塩基配列（本技術では配列番号５、又は配列番号６）と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（本技術ではアルギン酸リアーゼ活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列又は塩基配列のことをいう。従って、本技術において、等価なアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を有する酵素、又は等価な塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされる酵素は、アルギン酸リアーゼ活性を示す。
Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。 Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適ｐＨを示すグラフである。 Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの温度安定性を示すグラフである。 Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適温度を示すグラフである。 Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適塩濃度を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　１．アルギン酸リアーゼ
　以下、本技術に係るアルギン酸リアーゼについて詳細に説明する。
　［アミノ酸配列］
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドを含む。
（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド
　前記（２）のポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（２）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～８０個、好ましくは１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、又は１～３０個、より好ましくは１～２０個、１～１０個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
　前記前（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、よりさらに好ましくは９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上が挙げられる。
　ここで、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２に示す各アミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７―２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　なお、前記（２）及び前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１７８位（チロシン残基）、第２１５位（リジン残基）及び第２４６位（リジン残基）に相当するアミノ酸残基は、活性中心である可能性が高いと推定されることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　本発明のポリペプチドは、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　前記（２）及び前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２に対してアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の好適な一態様として保存的置換が挙げられる。即ち前記（２）及び（３）のポリペプチドにおける置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　前記（２）及び前記（３）のポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼは、前記（１）のポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼと同等以上のアルギン酸リアーゼ活性を有することが好ましい。具体的には、前記（２）及び前記（３）のポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼの相対活性が、前記（１）のポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼの相対活性の０．７倍以上、０．８倍以上、０．９倍以上、１．０倍以上、１．１倍以上、好ましくは１．１５倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．２５倍以上が挙げられる。
　［由来］
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、前述したポリペプチドを含んでいれば、その由来は特に限定されない。例えば、パエニバチルス・エルジ（Paenibacillus elgii）由来アルギン酸リアーゼが挙げられる。用いるパエニバチルス・エルジ（Paenibacillus elgii）の菌株は、本技術の作用や効果を損なわない限り特に限定されず、生物遺伝資源機関等から一般に入手可能な菌株を用いることができる。本技術では、後述する実施例に示すように、パエニバチルス・エルジ（Paenibacillus elgii）から、前記（１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼを精製した。
　より具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼは、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１株由来のアルギン酸リアーゼである。シグナル配列やプロ配列を含むアミノ酸配列を、配列番号３に示す。
　配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼは、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２株由来のアルギン酸リアーゼである。シグナル配列やプロ配列を含むアミノ酸配列を、配列番号４に示す。
　なお、本技術に係るアルギン酸リアーゼは、前述した（１）～（３）のアミノ酸配列を基に人工的に設計した人工タンパク質であってもよい。
　［酵素化学的特性］
　（１）作用
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、アルギン酸を基質としてアルギン酸オリゴ糖を生成する。
　（２）至適ｐＨ
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、ｐＨ７．５～９．０の範囲に至適ｐＨを有する。本技術に係るアルギン酸リアーゼの至適ｐＨは、前述したアミノ酸配列や由来等によって異なるが、ｐＨ７．５～９．０の範囲に至適ｐＨを有する。具体的な例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるアルギン酸リアーゼの至適ｐＨは、８．５である。配列番号２のアミノ酸配列からなるアルギン酸リアーゼの至適ｐＨは、８．０である。
　また、本技術に係るアルギン酸リアーゼは、ｐＨ７．５～９．５において、至適ｐＨにおける活性の７０％以上の活性を有する。
　なお、至適ｐＨは、５０ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０～５．５）、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ５．５～８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０～９．５）、及び５０ｍＭ ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ９．５～１１．０）を用いて測定した場合の値である。
　（３）ｐＨ安定性
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、ｐＨ４．０～１０．５の範囲で安定であり、ｐＨ４．０～１０．５の範囲においても、３７℃３０分処理で７０％以上の活性が残存する。ｐＨ４．０における残存活性は、至適ｐＨにおける活性を１００％とした場合、８５％以上、好ましくは９０％以上である。また、ｐＨ５．０における残存活性は、至適ｐＨにおける活性を１００％とした場合、９０％以上、好ましくは９５％以上である。
　（４）至適温度
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、５５～６５℃の範囲に至適温度を有する。本技術に係るアルギン酸リアーゼの至適温度は、前述したアミノ酸配列や由来等によって異なるが、５５～６５℃の範囲に至適温度を有する。具体的な例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるアルギン酸リアーゼの至適温度は６５℃であり、５５～７０℃において至適温度における活性の７０％以上の活性を有する。配列番号２のアミノ酸配列からなるアルギン酸リアーゼの至適温度は６０℃であり、５０～６５℃において至適温度における活性の７５％以上の活性を有する。
　なお、至適温度は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーｐＨ８．０を用いて測定した場合の値である。
　前述のとおり、アルギン酸リアーゼは産業界で広く適用されることが期待されている。そして、その適用態様には、高温条件下での分解反応を触媒する場合も含まれる。しかしながら、現状、工業規模で生産され実用化されたアルギン酸リアーゼの作用温度は、３０℃から４０℃にあり、特に５０℃以上では使用不可である。これに対して、本技術に係るアルギン酸リアーゼの至適温度は、５５～６５℃の範囲にあり、高温条件下でも十分に機能を発揮することができる。
　（５）熱安定性
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、４０℃以上の高温条件で３０分処理した場合、４０℃における残存活性は８０％以上であり、５０℃における残存活性は４０％以上である。具体的な例としては、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１株由来アルギン酸リアーゼは、４０℃以上の高温条件で３０分処理した場合、４０℃における残存活性は約１００％であり、５０℃における残存活性は６５％である。Paenibacillus elgii Ｎｏ．２株由来アルギン酸リアーゼは、４０℃以上の高温条件で３０分処理した場合、４０℃における残存活性は約９５％であり、５０℃における残存活性は４５％以上である。従来のアルギン酸リアーゼは、５０℃以上で使用不可であるのに対し、本技術に係るアルギン酸リアーゼは、５０℃以上でもある程度安定であるため、５０℃以上の条件下においても使用可能と推察できる。
　（６）分子量
　本技術に係るアルギン酸リアーゼの分子量は、３２～３６ｋＤａである。具体的な例としては、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１株由来アルギン酸リアーゼ、及びPaenibacillus elgii Ｎｏ．２株由来アルギン酸リアーゼの分子量は、いずれも３４ｋＤａである。
　なお、分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した値である。
　（７）その他の特徴
　本技術に係るアルギン酸リアーゼは、塩添加無しでも活性を示し、塩の終濃度が０（無添加）、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭにおける活性を比較した場合、塩無添加において最大活性を示す。
　一般的なアルギン酸リアーゼの多くは塩化ナトリウムなどの塩を添加した状態で最大活性を呈する。塩の使用は工場設備に負荷を与える場合があり、これまでの一般的なアルギン酸リアーゼでは、産業界で期待される適用態様に十分追随できない場合があった。これに対して、本技術に係るアルギン酸リアーゼは、塩添加無しでも高い活性を示し、塩無添加において最大活性を示すため、工場設備等への負荷を低減することができ、様々な分野において十分な活性を有する態様にて適用可能である。
　２．アルギン酸リアーゼをコードするＤＮＡ
　本技術に係るＤＮＡは、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリヌクレオチドを含む。
（１）本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号５又は６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（３）配列番号５又は６に示す塩基配列と等価の配列を含み、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
　前記（１）の「本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド」とは、これを発現させた場合に本技術に係るアルギン酸リアーゼが得られるポリヌクレオチドのことをいい、本技術に係るアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するポリヌクレオチドは勿論のこと、そのようなポリヌクレオチドにアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなるポリヌクレオチドをも含む。また、コドンが縮重されたポリヌクレオチドをも含む。
　本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドの具体例として、配列番号５（配列番号１のアミノ酸配列をコードするゲノムＤＮＡ配列）、配列番号７（配列番号３のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列）、配列番号６（配列番号２のアミノ酸配列をコードするゲノムＤＮＡ配列）及び配列番号８（配列番号４のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列）に示す。
　本技術に係るＤＮＡには、前記（１）の本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列と比較した場合に、それがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する配列（以下、「等価の配列」ともいう。）を含むポリヌクレオチドを含むＤＮＡも包含する。
　等価の配列の具体例としては、本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号５、６、７、又は８）を基準として１若しくは複数の塩基の置換、付加、挿入、欠失、又は逆位等の改変を含む塩基配列からなり、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
　塩基の改変は、配列の複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該ＤＮＡがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、例えば２～４０塩基、好ましくは２～２０塩基、より好ましくは２～１０塩基である。
　また、等価の配列の具体例としては、本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号５、６、７、又は８）に対して、例えば６０％以上、好ましくは７０%以上、より好ましくは８０％以上、より一層好ましくは８５％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９%以上の配列同一性を有する配列が挙げられる。
　ここで、「配列同一性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
　本技術では、配列番号５、６、７、又は８に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、本技術に係るＤＮＡに含まれる。
　ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
　［本技術に係るＤＮＡの取得方法］
　本技術に係るＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成、ＰＣＲ法（例えばオーバーラップＰＣＲ）、或いはこれらの組合せによって、単離された状態に調製することができる。
　また、本技術に係るＤＮＡは、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドを産生する微生物から単離することもできる。例えば、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマー若しくはプローブ又は既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーション法により、前記微生物のゲノムから目的のＤＮＡを単離することができる。
　本技術に係るＤＮＡには、コドンの縮重に由来する多種のＤＮＡが包含される。同じアミノ酸配列をコードする多種のＤＮＡを人為的に作製することは、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に行うことができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドン利用頻度を宿主に最適化することにより、目的タンパク質の高発現を図ることができる。
　コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌の最適コドンの一例として以下のものが挙げられる。Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
　遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、及び部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ，Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
　ＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することができる。
　得られたＤＮＡが目的のポリペプチドをコードするＤＮＡであるかどうかの確認は、決定された塩基配列を、配列番号５～８のいずれかに記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号１～４のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。
　［本技術に係るＤＮＡの用途］
　本技術に係るＤＮＡは、前述した本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードする遺伝子、本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするＤＮＡを同定するためのプローブや、本技術に係るアルギン酸リアーゼをコードするＤＮＡを増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる。
　本技術に係るＤＮＡは、本技術に係るアルギン酸リアーゼの調製に利用することができる。本技術に係るＤＮＡを用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の本技術に係るアルギン酸リアーゼを得ることが可能である。また、当該方法は大量の本技術に係るアルギン酸リアーゼを調製する場合にも好適である。本技術に係るＤＮＡが、開始コドンを含まないポリヌクレオチドを有するＤＮＡである場合、開始コドン、又は開始コドンを含むシグナルペプチドを付加した上で発現することで、本技術に係るアルギン酸リアーゼを得ることができる。
　本技術に係るＤＮＡは、本技術に係るアルギン酸リアーゼの作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは本技術に係るアルギン酸リアーゼの変異体（改変体）をデザイン又は作製するためのツールとして、利用することもできる。
　３．発現カセット、組換えベクター
　本技術に係る発現カセット、及び本技術に係る組換えベクターは、前述した本技術に係るＤＮＡを含む。
　本技術に係る発現カセット、及び本技術に係る組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　本技術に係る組換えベクターについて、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）、ｐＢＥ-Ｓ（タカラバイオ株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＤＨ５α大腸菌株の組み合わせ、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が挙げられる。
　４．形質転換体
　本技術に係る形質転換体は、前述した本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる。
　本技術に係る形質転換体の製造に使用される宿主としては、以下の（１）～（４）の特徴を備えるものであれば、特に限定されない：
（１）発現カセット又は組換えベクターの導入が可能
（２）発現カセット又は組換えベクターが安定
（３）自律増殖可能、且つ、
（４）導入した発現カセット又は組換えベクター中の遺伝子の形質を発現できる。かかる宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属等に属する細菌；糸状菌、酵母等が好適な例として挙げられる。また、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。
　本発明の形質転換体は、宿主に、本技術に係るＤＮＡ、本技術に係る発現カセット、又は本技術に係る組換えベクターを導入することによって得ることができる。本技術に係るＤＮＡ等を導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。
　本技術に係る発現カセット又は本技術に係る組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
　本技術に係るＤＮＡ、本技術に係る発現カセット、又は本技術に係る組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
　ＰＣＲ法によって本技術に係るＤＮＡ、本技術に係る発現カセット、又は本技術に係る組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ、発現カセット、又は組換えベクターを分離・精製すればよい。ゲノムＤＮＡ、発現カセット、又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
　更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
　ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現カセット又は発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
　その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本技術に係るＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
　また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
　５．アルギン酸リアーゼの製造方法
　本技術に係るアルギン酸リアーゼの製造方法は、培養工程と、回収工程と、を少なくとも行う方法である。その他、必要に応じて、一般的な酵素の製造に行われる各種工程を自由に組み合わせることも可能である。以下、各工程について、詳細に説明する。
　（１）培養工程
　培養工程は、アルギン酸リアーゼを産生する微生物又は本技術に係る形質転換体を培養する培養する工程である。アルギン酸リアーゼを産生する微生物としては、例えば、Paenibacillus属微生物が挙げられ、Paenibacillus属微生物としては、Paenibacillus elgiiが挙げられる。用いる微生物としては、野生株であっても変異株（例えば紫外線照射による変異株等）であってもよい。
　培養工程における培養条件は、培養する微生物の性質や、培養する形質転換体の栄養生理的性質を考慮して適宜設定することができる。微生物又は形質転換体の培養は、固形培地又は液体培地を用いることができるが、好ましくは液体培養であり得る。また、工業的製造を行う場合は、通気攪拌培養が好ましい。
　培地の栄養源としては、微生物又は形質転換体の生育に必要とされる物質を適宜使用することができる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、及びアルギン酸塩（アルギン酸ナトリウム等）等の塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
　培養温度は、培養する微生物又は形質転換体が生育可能であり、且つ当該微生物又は形質転換体がアルギン酸リアーゼを産生し得る範囲で適宜設定すればよい。例えば、培養温度は１５～３７℃に設定することができる。
　培養時間は、例えば、１２～４８時間程度が挙げられる。培養工程を終了するタイミングとしては、アルギン酸リアーゼが最高収量に達するタイミングを見計らって完了することができる。
　（２）回収工程
　回収工程は、培養工程で得られた培養物から本技術に係るアルギン酸リアーゼを回収する工程である。回収工程における回収方法は特に限定されず、一般的な酵素の製造における回収方法を、１種または２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
　具体的には、例えば、形質転換体を用いて発現させたアルギン酸リアーゼが、形質転換体内部に存在する場合、遠心分離等の一般的な分離方法を用いて、形質転換体を培養上清から分離する。培養上清を除去し、分離された形質転換体を回収する。分離された形質転換体は、超音波やフレンチプレスといった機械的方法、或いはリゾチーム等の酵素的な方法を用いて処理し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化することで、アルギン酸リアーゼを含む水溶性画分を得ることができる。また、適当な発現カセット又は発現ベクターと宿主を選択することにより、発現したアルギン酸リアーゼを培養液中に分泌させることもできる。
　このようにして得られたアルギン酸リアーゼを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の所定のアルギン酸リアーゼを濃縮した後に精製処理に供してもよい。濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、及びアセトン等）による分別沈殿法等により行うことができる。また、アルギン酸リアーゼの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　精製されたアルギン酸リアーゼは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
　６．アルギン酸オリゴ糖の製造方法
　アルギン酸オリゴ糖は、マンヌロン酸、グルロン酸を構成単糖とする２－６糖のオリゴ糖である。植物成長促進剤や化粧品用途で使われており、最近ではプレバイオティクスとしても注目されている。本技術に係るアルギン酸オリゴ糖の製造方法は、アルギン酸及び／又はその塩に、本技術に係るアルギン酸リアーゼを作用させる工程（以下、「酵素作用工程」ともいう）を含む。また、必要に応じて、原料準備工程、酵素失活工程、回収工程等を行うことができる。以下、各工程について詳細に説明する。
　（１）原料準備工程
　原料準備工程は、原料となるアルギン酸及び／又はその塩を準備する工程である。アルギン酸及び／又はその塩は、アルギン酸、及びその塩から選択される２種以上を混合した混合物であってもよいし、本技術の作用や効果を損なわない限り、他の成分と混合した組成物の状態であってもよい。
　本技術に用いることができるアルギン酸の塩としては、例えば、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
　（２）酵素作用工程
　酵素作用工程は、アルギン酸及び／又はその塩に、本技術に係るアルギン酸リアーゼを作用させる工程である。本技術に係るアルギン酸リアーゼは、１種類単独で用いても良いし、２種以上組み合わせて用いてもよい。また、本技術の作用や効果を損なわない限り、目的に応じて、本技術に係るアルギン酸リアーゼ以外の他の酵素と組み合わせて用いることも可能である。２種以上の酵素を組み合わせて用いる場合、アルギン酸及び／又はその塩に、２種以上の酵素を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよい。２種以上の酵素を別々に添加する場合の順番は特に限定されない。なお、本技術に係るアルギン酸リアーゼの詳細は、前述の通りであるため、ここでは説明を割愛する。
　酵素作用工程の各種条件は、本技術の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。例えば、用いる酵素の至適ｐＨ、安定ｐＨ範囲、至適温度、温度安定性などの理化学的性質に応じて、ｐＨ、温度、作用時間等を設定することができる。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定することができる。以下、各酵素を作用させる場合の条件を例示する。
　アルギン酸及び／又はその塩に、本技術に係るアルギン酸リアーゼを作用させる場合のｐＨは、例えばｐＨ４．０～１１．５、好ましくはｐＨ４．０～１０．５、より好ましくはｐＨ５．０～１０．０、更に好ましくはｐＨ６．０～１０．０、より更に好ましくはｐＨ７．０～９．５、特に好ましくはｐＨ７．５～９．０に設定することができる。
　アルギン酸及び／又はその塩に、本技術に係るアルギン酸リアーゼを作用させる場合の温度は、例えば３５℃～７０℃、好ましくは４０℃～７０℃、より好ましくは４５℃～７０℃、更に好ましくは５０～７０℃、特に好ましくは５５～６５℃に設定することができる。
　アルギン酸及び／又はその塩に、本技術に係るアルギン酸リアーゼを作用させる場合の作用時間は、下限として、例えば、１０分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上が挙げられ、上限として、例えば４８時間以下、２４時間以下、１０時間以下、２時間以下、１時間以下が挙げられる。
　（３）酵素失活工程
　酵素失活工程は、前述した酵素作用工程を経た後に、酵素を失活させる工程である。酵素失活工程は、必須の工程ではなく、必要に応じて行うことが可能である。また、前述した酵素作用工程にて、複数の酵素を用いる場合、酵素と酵素の作用間に酵素失活を行うこともできる。例えば、酵素作用工程において複数の酵素を作用させる場合、酵素作用工程の途中で酵素失活工程を適宜行うことも可能である。
　酵素を失活させる方法は、特に限定されず、失活させる対象となる酵素の性質に応じて、一般的な失活方法を１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。例えば、酵素失活温度以上に加熱することにより酵素を失活させる方法等が挙げられる。
　（４）回収工程
　回収工程は、製造されたアルギン酸オリゴ糖を回収する工程である。具体的な回収方法は、製造するアルギン酸オリゴ糖の種類等に応じて、一般的なアルギン酸オリゴ糖の製造における回収方法を、１種または２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
　回収されたアルギン酸オリゴ糖は、本技術の作用や効果を損なわない範囲において、最終製品の形態に応じて、更なる加工等を行うことができる。
　７．アルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤
　本技術に係るアルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤は、本技術に係るアルギン酸リアーゼを含む酵素剤である。なお、本技術に係るアルギン酸リアーゼの詳細は、前述の通りであるため、ここでは説明を割愛する。
　（１）アルギン酸リアーゼの含有量
　本技術に係るアルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤中のアルギン酸リアーゼの含有量は、本技術の効果を損なわない限り自由に設定することができる。アルギン酸リアーゼの含有量は、製造するアルギン酸オリゴ糖の製造に用いるアルギン酸及び／又はその塩１ｇに対して、例えば０．００６Ｕ以上、０．０３Ｕ以上、０．０６Ｕ以上、０．５Ｕ以上、１Ｕ以上、１０Ｕ以上、２０Ｕ以上、３０Ｕ以上、４０Ｕ以上、５０Ｕ以上、１００Ｕ以上に設定することができる。
　アルギン酸リアーゼの含有量の上限も、本技術の効果を損なわない限り特に限定されないが、アルギン酸オリゴ糖の製造に用いるアルギン酸及び／又はその塩１ｇ当たり、例えば、１２０００Ｕ以下、１００００Ｕ以下、９０００Ｕ以下、８０００Ｕ以下、７０００Ｕ以下、６０００Ｕ以下、５０００Ｕ以下、４０００Ｕ以下、３０００Ｕ以下、２４００Ｕ以下、２０００Ｕ以下、１５００Ｕ以下、１２００Ｕ以下、１０００Ｕ以下、９００Ｕ以下、８００Ｕ以下、７００Ｕ以下、６００Ｕ以下、５００Ｕ以下、４００Ｕ以下、３００Ｕ以下、２００Ｕ以下、１００Ｕ以下、５０Ｕ以下、４０Ｕ以下、３０Ｕ以下、２４Ｕ以下、２０Ｕ以下、１８Ｕ以下、１３Ｕ以下に設定することができる。
　なお、本技術において、アルギン酸リアーゼの活性については、後述する実施例に記載の測定法で測定した値である。
　（２）その他の成分
　本技術に係るアルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤は、本技術の作用や効果を損なわない限り、その他の成分を併用することができる。他の成分としては、例えば、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、酵素等の成分を用いることができる。更に、公知の又は将来的に見出される機能を有する成分を、適宜目的に応じて併用することも可能である。
　以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　１．微生物の選出
　新規のアルギン酸リアーゼを見出すべく、１万株以上の菌株ライブラリーからアルギン酸リアーゼ活性を指標にスクリーニングを行った。その結果２株の微生物、即ち、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２株が有望な候補として選出された。
　２．配列確認
　次世代シーケンサーによるゲノムＤＮＡ解析にて判明したゲノムＤＮＡ情報からPaenibacillus elgii Ｎｏ．１株、及びPaenibacillus elgii Ｎｏ．２株由来のアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列（配列番号１、２）を決定した。
　３．発現系の構築
　市販の発現用ベクターを使用して、目的配列を組み込んだ。プライマーを用いてPCR、infusion反応を実施した。大腸菌JM109株とBL21株（DE3株）を用いて、目的配列が組み込まれた発現プラスミドを構築し、ヒートショック法を用いて形質転換体（Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、及びPaenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株）を取得した。取得した形質転換体のシーケンス解析を行い、目的の配列が組み込まれているか確認した。
　４．選出した微生物の培養
　水に、表１の成分を、表１に記載の濃度となるように溶解し、１２１℃、３０分間オートクレーブして、培地を調製した。選出したPaenibacillus elgii Ｎｏ．１株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２株を培地に接種し、３０℃、４８時間振とう培養を行った。培養後、培地を遠心分離して上清を採取した。上清に対しての珪藻土を添加してろ過を行い、さらに、限外ろ過膜を用いて培養ろ液の濃縮を行った。
 
　５．形質転換体の培養
　水に、下記の表２の成分を、表２に記載の濃度となるように溶解し、１２１℃、３０分間オートクレーブして、培地を調製した。前記で取得したPaenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株を培地に接種し、３７℃、４８時間振とう培養を行った。培養後、培地を遠心分離して上清を採取した。上清に対しての珪藻土を添加してろ過を行い、さらに、限外ろ過膜を用いて培養ろ液の濃縮を行った。
 
　６．アルギン酸リアーゼの精製
　粗酵素液を４０％硫安にて塩析を行い、夾雑タンパク質を除去し、水酸化ナトリウムにてｐＨ調整した粗精製液を得た。この粗精製液を、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　７．５）＋４０％飽和硫安で平衡化したカラム（「HitrapTM 5mL Butyl FF」Ｃｙｔｉｖａ社製）に供した。上記カラムを同緩衝液５０ｍＬで洗浄後、飽和硫安濃度のステップワイズグラジエント（４０％～０％、５０ｍＬ）により、カラムに吸着したアルギン酸リアーゼを溶出させ、分画した。得られた各画分の一部について、後述する方法にて、アルギン酸リアーゼ活性の確認を行い、アルギン酸リアーゼ活性を有する画分を回収し、これにより精製アルギン酸リアーゼ溶液を得た。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて、精製を確認した。分子量は３４ｋＤａであった。精製した酵素液を限外ろ過（ＵＦ）、及び透析ろ過（ＤＦ）で調製した。
　７．アルギン酸リアーゼ活性の測定
　基質として２％アルギン酸ナトリウム溶液１５０μＬと、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２６５０μＬキュベットに入れ、５０℃にて、５分恒温したのち、酵素液２００μＬを添加して混合し、５０℃で５分反応をおこない、反応中における２３５ｎｍでの吸光度の上昇を測定した。アルギン酸オリゴ糖の生成を確認することで、アルギン酸リアーゼ活性の存在を確認した。２３５ｎｍでの吸光度の測定値が１分間に１．０上昇する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
　８．アルギン酸リアーゼの特性評価
　（１）ｐＨ安定性
　Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、及びPaenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼを、ｐＨが異なる５０ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（ｐＨ２～１２）に溶解し、得られた酵素液を、３７℃にて、３０分インキュベートすることでｐＨ処理した。それぞれの酵素液について、酵素活性値を、上記活性測定方法で測定した。最も高い残存活性を示した処理ｐＨにおける酵素活性値を１００％とした場合のｐＨ処理後における酵素活性値の相対値を、残存活性（％）として導出した。結果を図１に示す。図１から明らかな通り、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼは、ｐＨ４．０～１０．５で高い安定性を示した。
　（２）至適ｐＨ
　基質溶液のｐＨを、５０ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０～５．５）、５０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ５．５～８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０～９．５）、及び５０ｍＭ ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ９．５～１１．０）でｐＨ４、５、６、７、８、９、１０、１１に調整し、各ｐＨ下で酵素反応を行ったことを除いて上記活性測定方法と同様の方法で活性測定を行い、精製酵素の最大活性を示したｐＨ条件における活性を１００％とした場合、各ｐＨ条件における活性の相対量を、相対活性（％）として算出した。結果を図２に示す。図２から明らかな通り、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適ｐＨは、ｐＨ８．５であり、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適ｐＨは、ｐＨ８．０であった。
　（３）温度安定性
　前記で精製したアルギン酸リアーゼを、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、得られた酵素液を、３０℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、７０℃にて３０分インキュベートすることで温度処理した。温度処理前と処理後におけるそれぞれの酵素液について、酵素活性値を、上記活性測定方法で測定した。温度処理前の酵素活性値を１００％とした場合の温度処理後における酵素活性値の相対値を、残存活性（％）として導出した。結果を図３に示す。図３から明らかな通り、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼは５０℃未満で高い安定性を示し、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼは４５℃未満で高い安定性を示した。また、いずれのアルギン酸リアーゼも、４５℃までは８０％以上の残存活性を示し、高い安定性を示すと共に、５０℃においても４０％以上の残存活性を示し、一定の安定性を示した。
　（４）至適温度
　酵素反応温度を、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃に変更したことを除いて上記活性測定方法と同様の方法で活性測定を行い、精製酵素の最大活性を示した温度条件における活性を１００％とした場合の、各温度条件における活性の相対量を、相対活性（％）として算出した。結果を図４に示す。図４に示すとおり、Paenibacillus elgii Ｎｏ．１由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適温度は６５℃であり、Paenibacillus elgii Ｎｏ．２由来アルギン酸リアーゼ異種発現株から得られたアルギン酸リアーゼの至適温度は６０℃であった。
　（５）至適塩濃度
　活性測定時、終濃度０、５０、１００、１５０ｍＭとなるようにＮａＣｌを添加し、上記活性測定方法と同様の方法で活性測定を行い、精製酵素の最大活性を示した塩濃度条件における活性を１００％とした場合の、各温度条件における活性の相対量を、相対活性（％）として算出した。結果を図５に示す。図５から明らかなとおり、両株ともＮａＣｌ添加に伴い、活性が低下した。即ち、両株ともＮａＣｌを添加しない条件下で最大活性を示した。

Claims (9)

  1. 　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドを含むアルギン酸リアーゼ：
    （１）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド、及び
    （３）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が７０％以上であり、且つアルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド。
  2. 　Paenibacillus elgii由来である、請求項１に記載のアルギン酸リアーゼ。
  3. 　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリヌクレオチドを含むＤＮＡ：
    （１）請求項１に記載のアルギン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド、
    （２）配列番号５又は６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （３）配列番号５又は６に示す塩基配列と等価の配列を含み、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 　請求項３に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
  5. 　請求項４に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  6. 　Paenibacillus elgii又は請求項５に記載の形質転換体を培養する培養工程と、
    　前記培養工程で得られた培養物から請求項１に記載のアルギン酸リアーゼを回収する回収工程と、
    を有するアルギン酸リアーゼの製造方法。
  7. 　アルギン酸及び／又はその塩に、請求項１に記載のアルギン酸リアーゼを作用させる工程を含む、アルギン酸オリゴ糖の製造方法。
  8. 　請求項１に記載のアルギン酸リアーゼを用いて得られる、アルギン酸オリゴ糖。
  9. 　請求項１に記載のアルギン酸リアーゼを含む、アルギン酸オリゴ糖生成用酵素剤。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114457062A (zh) * 2022-03-02 2022-05-10 山东海之宝海洋科技有限公司 用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114457062A (zh) * 2022-03-02 2022-05-10 山东海之宝海洋科技有限公司 用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Genbank 18 July 2018 (2018-07-18), ANONYMOUS C. S., TARANTILIS P. A., HARIZANIS P. C., POLISSIOU M. G.: "Genome sequence of Paenibacillus elgii strain AC13 an antimicrobial RT compound producing bacteria", XP093382214, Database accession no. A0A2T6FTX2 *
DATABASE Genbank 20 January 2016 (2016-01-20), ANONYMOUS: "Genome sequencing of Paenibacillus sp. strain A3", XP093382220, Database accession no. A0A0P9DQI9 *
DATABASE GenBank 24 January 2024 (2024-01-24), ANONYMOUS: "Draft genome of Chromobacterium sp. F49", XP093382207, Database accession no. A0A161S3W2 *

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