WO2025249463A1 - 生物学的試料の分析方法 - Google Patents

生物学的試料の分析方法

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WO2025249463A1
WO2025249463A1 PCT/JP2025/019234 JP2025019234W WO2025249463A1 WO 2025249463 A1 WO2025249463 A1 WO 2025249463A1 JP 2025019234 W JP2025019234 W JP 2025019234W WO 2025249463 A1 WO2025249463 A1 WO 2025249463A1
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amino acids
fluorescence intensity
probe
probes
anc
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PCT/JP2025/019234
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French (fr)
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峻介 冨田
紗綾夏 石原
僚二 栗田
祥加 菅井
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing biological samples.
  • Biological samples such as cells, tissues, biofluids, and microbiota reflect a variety of information about an organism's health, constitution, and disease risk.
  • biological samples contain a wide variety of components and have extremely complex compositions, comprehensive analysis of them is difficult and unrealistic in terms of both labor and cost. For this reason, traditionally, only a very limited number of components are analyzed, but in this case, important information may be overlooked, leading to the risk of erroneous conclusions being drawn.
  • Serum is also used as an essential supplement for cell culture. Because serum has a significant impact on cell growth, characteristics, and differentiation, strict quality control is required. However, due to its complex composition, it is not fully understood which components in serum affect cell culture and how. As a result, end users must actually culture the desired cells to confirm the quality of the serum (known as lot-to-lot verification), which requires a great deal of time and effort. Furthermore, lot checks depend on the condition of the cells and the skill of the experimenter, making reliable and consistent quality control often difficult.
  • alcoholic beverages are produced through a fermentation process involving microorganisms, and therefore contain a wide variety of components, resulting in an extremely complex composition. Furthermore, it is largely unknown how each component affects the flavor. For example, in order to standardize the quality of sake, the National Tax Agency's analytical methods specify the analysis items of alcohol content, amino acid content, acidity, and sake meter value, and specify how to measure these. However, the evaluation indices based on these measurements (sweet/dry, rich/light) do not necessarily coincide with sensory evaluations. Therefore, currently, quality control of alcoholic beverages relies on the intuition of artisans and sensory tests by professional tasters, making objective and consistent quality evaluation extremely difficult.
  • Patent Documents 1 and 2 and pre-publication Japanese patent applications Nos. 2023-130004 and 2023-178769. These methods make it possible to analyze samples by simply obtaining a fluorescence intensity pattern that reflects the sum of non-specific interactions between all components and the probe, without the need for comprehensive analysis of the components in the sample.
  • these methods use probes with cationic polymer backbones, and expanding the probe repertoire requires chemical modifications to be introduced into the cationic polymer, which is time-consuming and labor-intensive.
  • the present invention aims to provide an analytical method based on cross-reactive sensing that can be easily optimized according to the target and purpose of analysis by preparing probes more cheaply and efficiently.
  • the inventors have discovered that by using probes with peptides possessing specific properties as backbones instead of conventional probes with cationic polymer backbones, biological samples can be identified with comparable accuracy.
  • the peptide preferably consists of 5 to 60 amino acid residues.
  • the absolute net charge score (ANC) is 0.20 to 1.0.
  • the sum of the absolute net charge score and the hydrophobicity score (ANC+H) is 0.40 to 1.0.
  • the environmentally responsive fluorophore is preferably selected from the group consisting of fluorophores having a naphthalenesulfonic acid skeleton, fluorophores having a benzofurazan skeleton, fluorophores having a xanthene skeleton, fluorophores having a pyrene skeleton, and aggregation-induced emission fluorophores.
  • step (3) it is preferable that the measurement of fluorescence intensity in step (3) is performed for multiple excitation wavelengths and fluorescence wavelengths.
  • the biological sample may contain cells or their culture supernatant.
  • the biological sample may contain serum or a serum substitute.
  • the biological sample may contain a microbiota.
  • the biological sample may contain alcoholic beverages.
  • the method of the present invention uses peptide probes, making it possible to easily and consistently determine the characteristics of biological samples with high accuracy, just as with conventional cationic polymer probes, by simply obtaining a fluorescence intensity pattern that reflects the sum of non-specific interactions between all components in the biological sample and the probe.
  • the probes used in the method of the present invention have a peptide backbone, they are easier to modify in design than conventional cationic polymer probes and can be prepared more inexpensively. This makes it easy to build a repertoire of probes optimized for each sample to be analyzed.
  • Figure 1 shows the change in fluorescence spectrum when various concentrations of ⁇ 1-antitrypsin were added to 500 nM of probe (Seq01, Seq03, Seq13)/20 mM MOPS (pH 7.0).
  • FIG. 3 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 6 measurements of 8 proteins x 1 solvent condition (pH 7.0 ) x 8 probes (Seq01 to Seq03, Seq05, Seq11 to Seq14) x 1 wavelength set.
  • FIG. 4 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 8 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 8 probes (Seq01 to Seq03, Seq05, Seq11 to Seq14) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 5 is a graph showing the coefficient of variation (CV) of the measurement results for the four proteins that showed positive responses overall from the data in FIG.
  • Figure 6 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data (Seq01/Seq02, Seq03/Seq05, Seq11/Seq12, and Seq13/Seq14) in Figure 4 using supervised linear discriminant analysis.
  • the amino acid sequences cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • 7 shows plots of the first and second discriminant scores and the second and third discriminant scores obtained by analyzing the data (Seq01 to Seq03, Seq05, or Seq11 to Seq14) of FIG. 4 by supervised linear discriminant analysis.
  • FIG. 8 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 6 measurements of 7 proteins, 1 solvent condition (pH 7.0), 4 probes (Seq01, Seq03, Seq19, Seq20), 1 wavelength set.
  • FIG. 9 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq01, Seq03, Seq19, Seq20) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 10 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Fig. 8 and Fig. 9 by supervised linear discriminant analysis.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks
  • anionic amino acids are underlined
  • hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 11 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 6 measurements of 7 proteins, 1 solvent condition (pH 7.0), 6 probes (Seq01, Seq02, Seq25 to Seq28), 1 wavelength set.
  • FIG. 11 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 6 measurements of 7 proteins, 1 solvent condition (pH 7.0), 6 probes (Seq01, Seq02, Seq25 to Seq28), 1 wavelength set.
  • Fig. 12 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 6 probes (Seq01, Seq02, Seq25 to Seq28) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Fig. 13 is a diagram plotting the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Fig. 11 and Fig. 12 by supervised linear discriminant analysis.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks
  • anionic amino acids are underlined
  • hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 14 is a graph showing the change (I-I 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by measuring 6 sets of 7 proteins, 1 solvent condition (pH 7.0 ), 8 probes (Seq02, Seq03, Seq26, Seq28, Seq29 to Seq32), and 1 wavelength set.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks
  • anionic amino acids are underlined
  • hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 15 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq21 to Seq24) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 16 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq21 to Seq24) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 17 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figures 15 and 16 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 18 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 6 measurements of 7 proteins, 1 solvent condition (pH 7.0), 6 probes (Seq01, Seq03, Seq33 to Seq36), 1 wavelength set.
  • FIG. 19 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 6 probes (Seq01, Seq03, Seq33 to Seq36) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 20 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figures 18 and 19 by supervised linear discriminant analysis.
  • FIG. 21 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq01, Seq02, Seq37, Seq38) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 22 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq01, Seq02, Seq37, Seq38) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 23 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figures 21 and 22 by supervised linear discriminant analysis.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 24 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 3 probes (Seq01, Seq39, Seq40) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 24 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 3 probes (Seq01, Seq39, Seq40) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 25 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 3 probes (Seq01, Seq39, Seq40) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 26 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figures 24 and 25 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 27 is a graph showing the change (II 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by 6 measurements of 7 proteins x 1 solvent condition (pH 7.0) x 6 probes (Seq01, Seq03, Seq41 to Seq44) x 1 wavelength set.
  • FIG. 28 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 7 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 6 probes (Seq01, Seq03, Seq41 to Seq44) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 29 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figures 27 and 28 by supervised linear discriminant analysis.
  • FIG. 30 is a graph showing the change (I-I 0 ) in fluorescence intensity (480 nm) obtained by repeating three independent trials of 7 proteins x 1 solvent condition (pH 7.0 ) x 3 probes (Seq01, Seq02, Seq03) x 2 wavelength sets x 6 measurements.
  • FIG. 31 is a graph of the CV values for the average values of each independent trial in FIG.
  • Figure 32 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 30 by supervised linear discriminant analysis.
  • FIG. 33 shows a plot showing the correlation between the change in fluorescence intensity (I-I 0 ) and ANC (top) and between the change in fluorescence intensity and ANC+H (bottom) obtained by measuring 4 proteins, 1 solvent condition (pH 7.0), 31 probes (Seq01 to Seq03 and Seq19 to Seq46), 1 wavelength set, and 6 measurements.
  • FIG. 34 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 8 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq47 to Seq50) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 35 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 34 by supervised linear discriminant analysis.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks
  • anionic amino acids are underlined
  • hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 36 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 8 proteins ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq03, Seq16 to Seq18) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 37 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 36 by supervised linear discriminant analysis (Seq03 alone, Seq16 alone, and Seq03/Seq16).
  • FIG. 38 shows plots of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 36 by supervised linear discriminant analysis (Seq03/Seq17 and Seq03/Seq18).
  • cationic amino acids are indicated by asterisks
  • anionic amino acids are underlined
  • hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • Figure 40 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 39 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • Figure 41 shows the change in fluorescence spectrum when conditioned medium from A549 cells diluted to various concentrations was added to 500 nM of probe (Seq01, Seq03)/20 mM MOPS (pH 7.0).
  • FIG. 43 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 6 media ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 3 probes (Seq01, Seq03, Seq05) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 44 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 43 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 45 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained from 8 bacteria ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq02, Seq07 to Seq09) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • Figure 46 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 45 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 47 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained from 8 intestinal microbiota samples ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 5 probes (Seq07 to Seq10, Seq15) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • Figure 48 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 47 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 49 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 5 cell suspensions ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 2 probes (Seq01, Seq03) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 50 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 49 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 51 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 4 sera ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 2 probes (Seq01, Seq03) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 52 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 51 by supervised linear discriminant analysis.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 53 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 5 media ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq01, Seq17, Seq23, Seq38) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 54 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 53 by supervised linear discriminant analysis.
  • FIG. 55 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 4 protein pharmaceutical samples ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq01, Seq17, Seq23, Seq38) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 56 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 55 by supervised linear discriminant analysis.
  • cationic amino acids are indicated by asterisks, anionic amino acids are underlined, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 57 is a heat map representation of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 5 broths ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 4 probes (Seq01, Seq17, Seq23, Seq38) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • Figure 58 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 57 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, anionic amino acids are underlined, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 59 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 8 sakes x 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) x 4 probes (Seq01, Seq17, Seq23, Seq38) x 2 wavelength sets x 6 measurements.
  • Figure 60 is a plot of the first and second discriminant scores obtained by analyzing the data in Figure 59 by supervised linear discriminant analysis. In the amino acid sequences, cationic amino acids are indicated by asterisks, anionic amino acids are underlined, and hydrophobic amino acids are indicated by bold.
  • FIG. 61 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 6 proteins ⁇ 1 solvent condition (pH 7.0) ⁇ 9 probes (Seq51 to Seq56, Seq03, Seq23, Seq35) ⁇ 1 wavelength set ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 62 is a diagram in which the first discriminant scores and second discriminant scores obtained by analyzing the data in FIG. 61 by supervised linear discriminant analysis are plotted.
  • FIG. 63 is a heat map display of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by 8 proteins ⁇ 2 solvent conditions (pH 5.0, pH 7.0) ⁇ 6 probes (Seq57 to Seq62) ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 64 is a plot of the first discriminant scores and second discriminant scores obtained by analyzing the data in FIG. 63 by supervised linear discriminant analysis.
  • the probe used in the method of this embodiment contains (a) a peptide and (b) an environmentally responsive fluorophore, and the fluorophore is covalently bound to the peptide.
  • the peptide (a) used in the probe in this embodiment consists of 3 to 100 amino acid residues.
  • peptide (a) preferably consists of 5 to 60 amino acid residues, and more preferably 10 to 40 amino acid residues.
  • the types of amino acids that make up peptide (a) are not particularly limited and may be either natural or unnatural, such as L-amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, or derivatives of these amino acids with modified side chains. Natural amino acids may include not only the 20 standard amino acids that make up proteins, but also non-proteinogenic amino acids (NPAAs).
  • peptide (a) is preferably made up of standard amino acids.
  • peptide (a) is defined by (i) an absolute net charge score (ANC), (ii) a hydrophobicity score (H), and (iii) the sum of the absolute net charge score and the hydrophobicity score (ANC + H).
  • the absolute net charge score (ANC) is a value calculated by dividing the absolute value of the net charge of the entire peptide by the total number of amino acids in the peptide, and indicates the degree of charge of the entire peptide.
  • AA positive is the number of amino acid residues whose side chains have a positive charge
  • AA negative is the number of amino acid residues whose side chains have a negative charge
  • AA total is the total number of amino acid residues in the peptide.
  • the hydrophobicity score (H) is a value calculated by dividing the number of hydrophobic amino acids in a peptide by the total number of amino acids in the peptide, and indicates the degree of hydrophobicity of the peptide as a whole.
  • AA hydrophobic is the number of hydrophobic amino acid residues
  • AA total is the total number of amino acid residues.
  • a "hydrophobic amino acid” refers to an amino acid having an octanol/water partition coefficient (log P) of 0.2 or more.
  • hydrophobic amino acids in this embodiment include, but are not limited to, isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), phenylalanine (F), tryptophan (W), tyrosine (Y), valine (V), cysteine (C), norvaline, norleucine, alloisoleucine, tert-leucine, cyclohexylalanine, phenylglycine, homophenylalanine, diphenylalanine, allylglycine, cyclobutylglycine, cyclopentylglycine, cyclohexylglycine, cycloheptylglycine, and cyclooctylglycine.
  • the log P value of an amino acid can be calculated using a fructics analysis tool such as the Percepta platform (ACD/Labs).
  • peptide (a) has (i) an absolute net charge score (ANC) of 0.15 to 1.0, (ii) a hydrophobicity score (H) of 0.0 to 0.85, and (iii) the sum of the absolute net charge score and the hydrophobicity score (ANC + H) of 0.30 to 1.0.
  • ANC absolute net charge score
  • H hydrophobicity score
  • ANC + H the sum of the absolute net charge score and the hydrophobicity score
  • peptides can be designed that cross-react with various affinities to any component in a biological sample.
  • the absolute net charge score (ANC) is preferably 0.15 to 1.0, more preferably 0.20 to 0.90, and most preferably 0.25 to 0.80;
  • the hydrophobicity score (H) is preferably 0.00 to 0.85, more preferably 0.00 to 0.70, and most preferably 0.10 to 0.55; and
  • the sum of the absolute net charge score and the hydrophobicity score (ANC+H) is preferably 0.30 to 1.0, more preferably 0.40 to 1.0, and most preferably 0.50 to 1.0.
  • the environmentally responsive fluorophore (b) of the probe in this embodiment may be any fluorophore whose fluorescence properties change depending on the environment around the fluorescent molecule.
  • fluorophores include, but are not limited to, fluorophores whose fluorescence properties change depending on the polarity around the fluorescent molecule, fluorophores whose fluorescence properties change depending on the pH around the fluorescent molecule, and fluorophores whose fluorescence properties change depending on the degree of crowding around the fluorescent molecule.
  • fluorescein fluorescein isothiocyanate
  • FAM carboxyfluorescein
  • BCECF 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein
  • SNARF seminaphthalodafluorescein
  • fluorophores with a pyrene skeleton such as 8
  • AIE aggregation-induced emission
  • TPE tetraphenylethylene
  • THBA 10,10',11,11'-tetrahydro-5,5'-bisibenzo[a,d][7]annulenylidene
  • HPS 1,1,2,3,4,5-hexaphenylsilole
  • Preferred environmentally responsive fluorophores in this embodiment may be dansyl, NBD, DBD, FITC, FAM, or TPE, or fluorescent derivatives thereof.
  • the probe in this embodiment comprises a peptide (a) and an environmentally responsive fluorophore (b) introduced via a covalent bond.
  • the environmentally responsive fluorophore may be introduced at any one or more positions of the polypeptide, for example, at either or both of the N-terminus and C-terminus, and/or at an amino group, hydroxyl group, carboxyl group, SH group, azide group, alkynyl group, etc. in the side chain of an amino acid residue in the polypeptide.
  • the environmentally responsive fluorophore may preferably be introduced at the N-terminus of the peptide and/or the ⁇ -amino group in the side chain of a lysine residue.
  • the probe in this embodiment may further include modifications at the N-terminus and/or C-terminus of peptide (a).
  • N-terminus modifications include, for example, acetylation, alkylation, formylation, pyruvylation, lipoylation, carboxylation, succinylation, maleylation, carbamylation, biotinylation, benzoylation, allylation, acrylate, PEGylation, and glycosylation.
  • C-terminus modifications include, for example, amidation, methyl esterification, prenylation, glycosylation, hydroxylation, phosphorylation, sulfonation, nedylation, and PEGylation.
  • the probe in this embodiment can be prepared by synthesizing a peptide and labeling it with a fluorophore using a conventionally known method.
  • the probe in this embodiment can be prepared by chemically or biosynthesizing a peptide and labeling the amino groups in the polypeptide with an environmentally responsive fluorophore activated by an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group or a pentafluorophenyl (PFP) ester group, an isothiocyanate group, or a halogenated alkyl group.
  • an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group or a pentafluorophenyl (PFP) ester group, an isothiocyanate group, or a halogenated alkyl group.
  • multiple probe solutions are used, each differing in one or more of the following: probe, ionic strength, and pH.
  • the multiple probe solutions in this embodiment may be prepared, for example, by dissolving one type of probe in multiple solvents with different ionic strengths and/or pHs, or by dissolving multiple types of probes in the same solvent.
  • solvents with two or more different ionic strengths and/or pH conditions can be used, preferably three or more, and particularly preferably six or more, different ionic strengths and/or pH conditions.
  • one type of probe may be used, but it is more preferable to use multiple types of probes; for example, two or more types, preferably three or more types, and particularly preferably six or more types of probes can be used.
  • two types of solvents and three types of probes are used, six types of probe solutions can be prepared, and as a result, six-dimensional data can be obtained for one analytical sample.
  • 15 types of probe solutions can be prepared, and as a result, 15-dimensional data can be obtained for one analytical sample. In this way, by increasing the number of solvent types and probe types, more multidimensional data can be obtained.
  • the solvent for dissolving the probe may be an aqueous solvent containing any buffer solution and/or salt.
  • buffer solutions include MES, MOPS, EPPS, HEPES, Tris, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, boric acid, and glycine.
  • salt solutions include NaCl, KCl, MgCl 2 , Na 2 SO 4 , K 2 SO 4 , MgSO 4 , NaI, and NaSCN.
  • the pH of the solvent is preferably 4.0 to 10.0, and particularly preferably 5.0 to 9.0.
  • the ionic strength of the solvent is preferably 10 to 500 mM.
  • concentration of the probe in the probe solution is preferably 0.1 to 100 ⁇ g/mL.
  • the multiple probe solutions are mixed with the biological sample to be analyzed (hereinafter also referred to as the "analytical sample”).
  • the probes interact nonspecifically with any molecules contained in the analytical sample.
  • the term "biological sample” refers to a sample containing a biological molecule. Therefore, the biological sample in this embodiment may be, for example, cells or tissues or their cultures, culture supernatants, body fluids (blood, serum, plasma, saliva, urine, sweat, feces, semen, cerebrospinal fluid, swabs, etc.), or extracts therefrom. Compositions such as pharmaceuticals containing purified biological molecules (e.g., proteins, peptides, nucleic acids, etc.) may also be included in the biological sample in this embodiment. The method of this embodiment is particularly suitable for analyzing biological samples containing cells or their culture supernatants, serum or serum substitutes, microbiota, or alcoholic beverages.
  • body fluids blood, serum, plasma, saliva, urine, sweat, feces, semen, cerebrospinal fluid, swabs, etc.
  • Compositions such as pharmaceuticals containing purified biological molecules (e.g., proteins, peptides, nucleic acids, etc.)
  • the "cells” may be derived from any living organism, may be derived from animals or plants, or may be microbial cells such as fungal cells or prokaryotic cells.
  • the cells may be primary cultured cells or established cell lines.
  • the animals from which the cells are derived are not particularly limited, but are preferably mammalian, such as mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, or humans, with human origin being particularly preferred.
  • the sample may be serially diluted as appropriate and added to the probe solution.
  • the "serum” may be derived from any animal, but is preferably derived from a mammal such as a cow, horse, sheep, goat, pig, rabbit, rat, mouse, or human.
  • the age of the animal from which the serum is derived is not particularly limited, and it may be of any age, including fetus, newborn, and adult.
  • the country/region of origin of the serum is also not particularly limited. Serum derived from a wide variety of animals produced in various countries/regions is commercially available, and the method of this embodiment can analyze any of them.
  • serum replacement is a general term for serum-free supplements used in place of serum in cell culture. Serum replacements generally contain several to several dozen factors selected from growth factors, cytokines, hormones, etc. Various serum replacements are commercially available, such as N2 supplement (Cell Cult. Neurosci. 1985; pp. 3-43) and its improved products, B27 supplement (J. Neurosci. Res. 1993; 35(5): 567-76) and its improved products, G5 supplement (Int. J. Dev. Neurosci.
  • serum replacements include, but are not limited to, KnockOutTM Serum Replacement (KSR) (Thermo Fisher Scientific), StemSureTM Serum Replacer (SSR) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries), XF212 XerumFree (TNC BIO BV), human platelet lysate, plant hydrolysate, corn extract, yeast extract, and soy extract. While the specific compositions of many commercially available serum replacements are not publicly known, the method of this embodiment can analyze any of them.
  • KSR KnockOutTM Serum Replacement
  • SSR StemSureTM Serum Replacer
  • TMC BIO BV XF212 XerumFree
  • the final concentration of serum or serum substitute in the mixture of the analytical sample and probe solution may be, for example, 0.001 vol% to 99.9 vol%, and preferably 0.01 vol% to 10 vol%. If the concentration of serum or serum substitute in the analytical sample is unknown, the sample may be serially diluted as appropriate and added to the probe solution.
  • Microbiota refers to a collection of multiple microorganisms that exist in a particular environment.
  • a microbiota may be composed of, for example, at least 100, 300, 500, 700, 1,000, or more types of microorganisms.
  • a microbiota may be composed of various classes and/or types of microorganisms, such as bacteria, fungi, protozoa, and viruses, and the method of this embodiment can target a microbiota composed of any class and/or type of microorganism. Examples of environments in which a microbiota exists include the surface or interior of individual animals or plants, soil, seawater, and river water.
  • the method of this embodiment can target any microbiota derived from any environment, but preferably targets microbiota derived from an animal body.
  • the animal body from which the microbiota is derived may be any vertebrate or invertebrate body, but is preferably a mammalian body such as a mouse, rat, rabbit, dog, non-human primate, or human, and is particularly preferably the human body.
  • the microbiota in an animal body is present in the epithelium of tissues (e.g., the digestive tract, oral cavity, nasal cavity, skin, respiratory tract, reproductive tract, etc.), and the microbiota analyzed in the method of this embodiment may be a microbiota derived from any tissue epithelium.
  • the microbiota derived from an animal body analyzed in the method of this embodiment is preferably an oral microbiota (oral flora) or intestinal microbiota (intestinal flora), and is particularly preferably an intestinal microbiota.
  • Microbiota samples derived from animal bodies can be prepared by conventionally known methods.
  • samples containing oral microbiota can be prepared from dental plaque or saliva, and samples containing intestinal microbiota can be prepared from feces.
  • the sample may be serially diluted as appropriate and added to the probe solution.
  • Alcohol beverages may be any beverage containing ethanol, may be produced from any raw materials, and there are no particular restrictions on their production method. Furthermore, there are no particular restrictions on the characteristics of alcoholic beverages (color, clarity, sparkling properties, etc.). Therefore, the alcoholic beverages targeted by the method of this embodiment may be brewed, distilled, or mixed alcoholic beverages. Examples of brewed alcoholic beverages include sake (Japanese rice wine), wine, beer, Shaoxing wine, and makgeolli; examples of distilled alcoholic beverages include shochu, awamori, whiskey, brandy, vodka, and tequila; and examples of mixed alcoholic beverages include, but are not limited to, liqueur, vermouth, sherry, and mirin. The country/region of origin of the alcoholic beverage is also not particularly limited. A wide variety of alcoholic beverages produced in various countries/regions are commercially available, and the method of this embodiment can analyze any of them.
  • the analysis sample in this embodiment may contain a single alcoholic beverage selected from any of the above alcoholic beverages, or a mixture of two or more alcoholic beverages, and the ratio of alcoholic beverages in a mixture of two or more alcoholic beverages may be arbitrary.
  • the analysis sample in this embodiment may consist solely of alcoholic beverages, or may be a beverage containing alcoholic beverages.
  • An example of a beverage containing alcoholic beverages may be a cocktail made by mixing alcoholic beverages with non-ethanolic beverages such as fruit juice, water, or carbonated water.
  • the final concentration of alcoholic beverages in the mixture of the analytical sample and probe solution may be, for example, 0.001 to 99.9 v/v%, preferably 0.01 to 95 v/v%, and more preferably 0.1 to 90 v/v%. If the concentration of alcoholic beverage components in the analytical sample is unknown, the sample may be diluted in stages as appropriate and added to the probe solution.
  • the analytical sample may be added to each of the multiple probe solutions, or multiple probe solutions may be added to the analytical sample simultaneously.
  • fluorescence intensity of the mixture of the probe solution and the analytical sample is measured.
  • fluorescence intensity can be measured at an excitation wavelength of 300 to 600 nm and a fluorescence wavelength of 400 to 800 nm.
  • it is preferable to measure fluorescence intensity for each measurement target at multiple excitation wavelength/fluorescence wavelength sets e.g., excitation wavelength (nm)/fluorescence wavelength (nm): 340/520, 330/480, 345/505, 360/530, etc.
  • fluorescence intensity can be measured using, for example, two, three, or four sets of excitation wavelength/fluorescence wavelength.
  • the fluorescence intensity of the probe solution varies depending on the type, amount, and state of the components in the sample, and also on the conditions of the solvent in which the probe is dissolved. Therefore, this step allows for the acquisition of a fluorescence intensity pattern specific to the sample.
  • the fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample is compared with the fluorescence intensity pattern obtained for the reference sample.
  • the fluorescence intensity pattern for the reference sample may be obtained by measuring fluorescence intensity in parallel with the analytical sample, or may be a predetermined fluorescence intensity pattern prepared in advance.
  • the comparison of fluorescence intensity patterns is preferably performed by reducing the number of dimensions using multivariate analysis such as principal component analysis, linear discriminant analysis, or hierarchical cluster analysis, and then compressing and converting the differences between the fluorescence intensity patterns into two or three dimensions for comparison.
  • machine learning methods such as support vector machines (SVMs), random forests, gradient boosting, k-nearest neighbors, neural networks, naive Bayes classifiers, and logistic regression may be used to compare fluorescence intensity patterns.
  • the method of this embodiment analyzes biological samples based solely on differences in fluorescence intensity patterns.
  • Biological samples such as culture supernatants, serum, microbiomes, and alcoholic beverages contain a vast variety of biomolecules, making it extremely difficult and impractical to comprehensively analyze their types, quantities, and states.
  • the method of this embodiment acquires a fluorescence intensity pattern that reflects the sum of non-specific interactions between a wide variety of components and probes, and can identify the overall characteristics of a biological sample simply by comparing it with the fluorescence intensity pattern of a reference sample.
  • a fluorescence intensity pattern obtained for a culture supernatant or lysate (reference sample) of undifferentiated or differentiated cells is compared with a fluorescence intensity pattern obtained for a culture supernatant or lysate (analytical sample) of cells whose differentiation state is unknown.
  • a fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample and the distribution of the fluorescence intensity pattern obtained for the culture supernatant or lysate of differentiated cells is probabilistically close, it is estimated or identified that the analytical sample is a culture supernatant of differentiated cells.
  • the fluorescence intensity pattern obtained for the serum or serum substitute currently being used for culture is compared with the fluorescence intensity pattern obtained for the serum or serum substitute (analytical sample) from a different origin/manufacturer A, B, or C.
  • the distance between the fluorescence intensity pattern obtained for the serum or serum substitute from origin/manufacturer A and the distribution of the fluorescence intensity pattern obtained for the reference sample is probabilistically closest, it can be estimated or identified that the serum or serum substitute from origin/manufacturer A can be used in place of the serum or serum substitute currently being used.
  • a fluorescence intensity pattern obtained for serum or serum substitute (reference sample) immediately after purchase is compared with a fluorescence intensity pattern obtained for serum or serum substitute (analytical sample) from the same origin/manufacturer/lot but stored under different conditions A, B, or C (e.g., different storage temperatures and/or periods).
  • A, B, or C e.g., different storage temperatures and/or periods
  • a fluorescence intensity pattern obtained for a fermented food sample (reference sample) containing different bacterial strains A, B, or C is compared with a fluorescence intensity pattern obtained for a fermented food sample (analytical sample) containing an unknown bacterial strain. If the distance between the fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample and the distribution of the fluorescence intensity pattern obtained for the fermented food sample containing bacterial strain A is probabilistically closest, it can be estimated or identified that the fermented food being analyzed contains bacterial strain A.
  • a fluorescence intensity pattern obtained for a bacterial flora (reference sample) derived from an obese individual or a non-obese individual is compared with a fluorescence intensity pattern obtained for a bacterial flora (analytical sample) derived from a subject whose health condition or constitution is unknown. If the fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample is probabilistically closest to the distribution of fluorescence intensity patterns obtained for an obese individual, the subject from whom the analytical sample was derived can be estimated or identified as an individual with obesity or a high risk of obesity.
  • the fluorescence intensity pattern obtained for different brands of sake A, B, or C is compared with the fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample. If the distance between the fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample and the distribution of the fluorescence intensity pattern obtained for sake A is probabilistically closest, it can be estimated or identified that the analytical sample is sake A.
  • the fluorescence intensity pattern obtained for sake X (reference sample) immediately after purchase is compared with the fluorescence intensity patterns obtained for sake X1, X2, and X3 (analytical samples) of the same brand/specific name classification but with different storage conditions (e.g., storage temperature and/or period).
  • storage conditions e.g., storage temperature and/or period.
  • the protein abbreviations used in this example are as follows: Lac: beta-lactoglobulin, Ant: alpha-1 antitrypsin, Lip: lipase, BSA: bovine serum albumin, Fib: fibrinogen, HSA: human serum albumin, Tra: transferrin, IgG: immunoglobulin G, Myo: myoglobin, Hem: hemoglobin, Lys: lysozyme, PSA: porcine serum albumin, Pro: proteinase K, Pap: papain, Try: trypsin.
  • fluorescence spectra fluorescence wavelengths 500-650 nm
  • fluorescence intensity fluorescence wavelength 520 nm
  • Figure 1 shows the changes in the fluorescence spectra of Seq01, Seq03, and Seq13 upon the addition of 0 to 1600 nM of Ant.
  • the fluorescence intensity of Seq01 and Seq03 increased in an Ant concentration-dependent manner, and their peaks shifted to shorter wavelengths (blue shift).
  • the fluorescence spectrum of Seq13 showed little change with increasing Ant concentration.
  • Figure 2 shows the changes in fluorescence intensity (520 nm).
  • the fluorescence intensity of Seq01 continued to increase up to an Ant concentration of 1600 nM, whereas the fluorescence intensity of Seq03 saturated at 800 nM Ant.
  • the fluorescence intensity of Seq13 showed little change.
  • the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at the following two sets of excitation wavelength (nm)/emission wavelength (nm): (Ch1) 320/560, (Ch2) 360/480. Then, using an automated pipetting device, various proteins with different charge and hydrophobicity (Lac, Ant, Lip, BSA, HSA, Tra, IgG, and Tyr; 3000 nM protein each in pure water) were added at 8 ⁇ L/well, and after incubation at 35°C for 10 minutes, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 500 nM probe, 500 nM protein, 20 mM MOPS (pH 7.0)). Each measurement (8 proteins x 1 solvent condition x 8 probes x 2 wavelength sets) was performed six times.
  • the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of protein is shown in Figures 3 and 4.
  • the responses of Seq01 to Seq03, Seq05, and Seq12 were greater than those of Seq11, Seq13, and Seq14.
  • Seq01-Seq03 and Seq05 in particular showed significantly different changes depending on the type of protein, resulting in unique fluorescence patterns for each different protein (Figure 4).
  • the data in Figure 4 was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score are plotted in Figure 6.
  • the clusters for each protein were distributed without overlapping, with only a few exceptions.
  • the jackknife method it was confirmed that each protein could be identified with high accuracy (92% and 96%).
  • the Seq11/Seq12 and Seq13/Seq14 combinations many of the clusters for each protein overlapped, and analysis using the jackknife method yielded low values (56% and 69%).
  • a graph of the measurement results (7 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 1 wavelength set) is shown in Figure 8, and a heat map (7 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 9.
  • Seq19 and Seq20 showed almost no response to any of the proteins.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the resulting first and second discriminant scores are plotted in Figure 10.
  • Seq19/Seq20 were paired, the clusters for each protein largely overlapped, and analysis using the jackknife method confirmed low identification accuracy (60%).
  • Figure 11 shows a graph of the measurement results (7 proteins ⁇ 1 solvent condition ⁇ 6 probes ⁇ 1 wavelength set), and Figure 12 shows a heat map (7 proteins ⁇ 1 solvent condition ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets).
  • Probe response consistently decreased with decreasing ANC (Seq01 > Seq25 > Seq27; Seq02 > Seq26 > Seq28). These results suggest that probe-protein interaction becomes less frequent with decreasing ANC.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the resulting first and second discriminant scores are plotted in Figure 13. Cluster overlap was greatest for the Seq27/Seq28 combination, with the contribution of the first discriminant score (95.2%) approximately 30% higher than for the other combinations. This indicates that the fluorescence pattern became simpler with decreasing ANC. Jackknife analysis of the results in Figure 13 revealed that the discrimination accuracy of Seq01/Seq02 was significantly higher than that of the other combinations. These results suggest that the higher the ANC of a peptide, the higher the accuracy of protein identification.
  • a graph of the measurement results (7 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 1 wavelength set) is shown in Figure 15, and a heat map (7 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 16. All of Seq21 to Seq24 responded to the proteins, with Seq23 and Seq24 exhibiting superior responsiveness compared to Seq21 and Seq22.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the resulting first and second discriminant scores are plotted in Figure 17. Clusters for each protein were distributed without overlapping, with some exceptions. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each protein could be identified with 100% accuracy.
  • Probes Seq33 to Seq36 were prepared in which the intermediate position of a 10-amino acid peptide containing 30% or more cationic amino acids (i.e., ANC ⁇ 0.3) and 15% or more hydrophobic amino acids (i.e., H ⁇ 0.15) was modified with a dansyl group.
  • the N-terminus of the peptide was acetylated, and the side chain amino group of the C-terminal lysine residue was modified with a dansyl group.
  • Seq35 and Seq36 the N-terminus of the peptide was unmodified, but the side chain amino group of the intermediate lysine residue was modified with a dansyl group.
  • Seq01 and Seq03 probes in which the N-terminus of a 10-amino acid peptide containing 40% or more cationic amino acids and 20% or more hydrophobic amino acids was modified with a dansyl group were used.
  • a graph of the measurement results (7 proteins x 1 solvent condition x 6 probes x 1 wavelength set) is shown in Figure 18, and a heat map (7 proteins x 1 solvent condition x 6 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 19. All probes responded to proteins regardless of the position of the dansyl group, and the responsiveness varied depending on the position of the dansyl group.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the results of plotting the first and second discriminant scores are shown in Figure 20.
  • the clusters for each protein were distributed without overlapping, with some exceptions.
  • these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each protein could be identified with 100% accuracy.
  • probes (Seq37 and Seq38) were prepared, each comprising a peptide with cationic amino acids located in the C-terminal region and hydrophobic amino acids located in the N-terminal region. The responsiveness of these probes was analyzed and compared using the same conditions and procedures as in 4 above. Seq01 and Seq02 were used as controls.
  • a graph of the measurement results (7 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 1 wavelength set) is shown in Figure 21, and a heat map (7 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 22.
  • All probes responded to the proteins, and the responsiveness varied depending on their arrangement.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the resulting first and second discriminant scores were plotted as shown in Figure 23.
  • the clusters for each protein were distributed without overlapping, with some exceptions.
  • these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each protein could be identified with an accuracy of 98% for Seq01/Seq02 and 100% for Seq37/Seq38.
  • Seq01 was used as a control.
  • a graph of the measurement results (7 proteins x 1 solvent condition x 3 probes x 1 wavelength set) is shown in Figure 24, and a heat map (7 proteins x 1 solvent condition x 3 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 25. All probes responded to proteins regardless of the amino acid residue arrangement, and the responsiveness varied depending on their arrangement.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the results of plotting the first and second discriminant scores are shown in Figure 26.
  • the clusters for each protein were distributed without overlapping with some exceptions, and the position of the clusters differed depending on the amino acid residue arrangement.
  • Figure 27 shows a graph of the measurement results (7 proteins ⁇ 1 solvent condition ⁇ 6 probes ⁇ 1 wavelength set), and Figure 28 shows a heat map (7 proteins ⁇ 1 solvent condition ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets). All probes responded to the proteins, but the response was similar as the amino acid sequence identity increased.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the resulting first and second discriminant scores were plotted.
  • Figure 29 shows the results. The contribution of the first discriminant score increased with increasing amino acid sequence identity (78.6% (Seq01/Seq03), 90.3% (Seq41/Seq42), and 91.7% (Seq43/Seq44)). These results indicate that the fluorescence pattern became simpler with increasing amino acid sequence identity.
  • Protein Identification Using Anionic Probes Four types of probes (Seq47 to Seq50) were prepared, each containing a peptide consisting of 14 to 19 amino acids, with anionic amino acids of 20% or more (i.e., ANC ⁇ 0.2) and anionic amino acids and hydrophobic amino acids of 50% or more (i.e., ANC + H ⁇ 0.5). The responsiveness of these probes was analyzed and compared under the same conditions and procedures as in Section 4 above, except that the type of protein used was changed (HSA, BSA, Hem, Lys, Pap, Pro, Tyr, and Myo).
  • a heat map of the measurement results (8 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 34. All probes responded to the proteins.
  • the above data obtained was analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the first and second discriminant scores obtained were plotted, as shown in Figure 35. The clusters for each protein were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each protein could be identified with 98% accuracy.
  • Figure 36 shows a heat map of the measurement results (8 proteins x 1 solvent condition x 4 probes x 2 wavelength sets). The probes responded to the proteins, resulting in unique fluorescence patterns for each protein.
  • the data obtained using Seq03 and Seq16 were analyzed using supervised linear discriminant analysis, and the resulting first and second discriminant scores are plotted in Figure 37.
  • the discrimination accuracy based on the jackknife method was low at 73% and 77%, respectively.
  • the fluorescence responses of Seq03 and Seq16 were combined, the clusters were separated extremely well, and the discrimination accuracy reached 100%.
  • Ten probe solutions were prepared by dissolving Seq01, Seq03, Seq21, Seq23, and Seq36 in 22.2 mM MOPS (pH 7.0) or 22.2 mM MES (pH 5.0). Each probe solution was dispensed into a 384-well microplate at 54 ⁇ L/well using an automated dispenser. After incubation at 35°C for 10 minutes, fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at excitation/emission wavelengths of 360 nm/480 nm. Subsequently, nucleotides (4 mM each in pure water) were added at 6 ⁇ L/well using an automated dispenser.
  • a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of nucleotides is shown in Figure 39.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the nucleotide, and a unique fluorescence pattern was obtained for each different nucleotide.
  • the above data was analyzed by linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted, as shown in Figure 40.
  • the clusters for each nucleotide were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed by the jackknife method, it was confirmed that each nucleotide could be identified with 100% accuracy.
  • the cells were suspended (2.5 x 10 /mL) in D-MEM (high glucose, L-glutamine, and phenol red) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) supplemented with 10% FBS (GE Life Sciences) and 1 % penicillin streptomycin neomycin antibiotic mixture (PSN) (Life Technologies), and seeded at 100 ⁇ L/well into a 96-well plate (Greiner Bio-One). After 24 hours of culture at 37°C in a 5% CO environment, the medium was removed and the cells were washed twice with 100 ⁇ L of phosphate-buffered saline (PBS) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries).
  • D-MEM high glucose, L-glutamine, and phenol red
  • FBS GE Life Sciences
  • PSN penicillin streptomycin neomycin antibiotic mixture
  • fluorescence spectra fluorescence wavelengths 500-650 nm
  • fluorescence intensity fluorescence wavelength 520 nm
  • a microplate reader final concentrations: 500 nM probe, 0-30 vol% conditioned medium, 20 mM MOPS (pH 7.0)
  • Figure 41 shows the changes in the fluorescence spectra of Seq01 and Seq03 when 0-30 vol% conditioned medium was added.
  • the fluorescence intensity of Seq01 and Seq03 increased and blue-shifted in a conditioned medium concentration-dependent manner.
  • Figure 42 shows the changes in fluorescence intensity (520 nm). The fluorescence intensity of Seq01 and Seq03 continued to increase until the conditioned medium concentration reached 30 vol%.
  • Seq01, Seq03, and Seq05 (10 amino acids long, ⁇ 40% cationic amino acids (i.e., ANC ⁇ 0.4), ⁇ 20% hydrophobic amino acids (i.e., H ⁇ 0.2)) were dissolved in 22.2 mM MOPS (pH 7.0) or 22.2 mM acetic acid (pH 5.0) to prepare six probe solutions (555 nM). Each probe solution was added to a low-volume 384-well microplate (Corning, 3820) at 22.5 ⁇ L/well using an automated pipetting device.
  • the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at the following two sets of excitation wavelength (nm)/emission wavelength (nm): (Ch1) 320/560, (Ch2) 360/480.
  • the conditioned medium (100 vol%) prepared above was then added at 2.5 ⁇ L/well using an automated dispenser, and after incubation at 35°C for 10 minutes, fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 500 nM probe, 10 vol% conditioned medium, 20 mM MOPS (pH 7.0) or 20 mM acetic acid (pH 5.0)).
  • As a control medium obtained by incubation under the same conditions as above without adding cells was used. Each measurement (6 medium ⁇ 3 probe ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 2 wavelength sets) was performed eight times.
  • FIG 43 A heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of medium is shown in Figure 43.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the medium, and a unique fluorescence pattern was obtained for each different conditioned medium.
  • the above data was analyzed by linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted, as shown in Figure 44.
  • the clusters for each conditioned medium were distributed without overlapping, with some exceptions. Furthermore, when these results were analyzed by the jackknife method, it was confirmed that each conditioned medium could be distinguished with 94% accuracy.
  • Enterobacteria other than E. coli were obtained from the culture collections of the Japan Collection of Microorganisms (JCM) and the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ).
  • JCM Japan Collection of Microorganisms
  • DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
  • the E. coli DH5 ⁇ strain was purchased from GM biolab.
  • the E. coli JM109 strain was purchased from Takara Bio.
  • Eight probe solutions (1200 nM) were prepared by dissolving Seq02 and Seq07-Seq09 (10 amino acids long, ⁇ 40% cationic amino acids (i.e., ANC ⁇ 0.4), ⁇ 20% hydrophobic amino acids (i.e., H ⁇ 0.2)) in 24 mM MOPS (pH 7.0) + 180 mM NaCl or 24 mM acetic acid (pH 5.0) + 180 mM NaCl. Each probe solution was dispensed into a 384-well microplate at 50 ⁇ L/well using an automated pipetting device.
  • Figure 45 shows a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after adding the bacterial suspension.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the type of bacteria and solvent conditions, resulting in a unique fluorescence pattern for each different bacterium.
  • the above data was analyzed using linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted, as shown in Figure 46.
  • the clusters for each bacterium were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each bacterium could be identified with 100% accuracy.
  • a locomotion measurement device (nano tag, KISSEI COMTEC) was implanted into each mouse's abdomen (day -34), and each mouse was transferred to an individual wheel cage (day -24) and housed with the wheel open (day -0). The mice were then housed for one week with the wheel fixed (days 1-8), again with the wheel open (days 9-21), and then housed for one week with the wheel fixed (days 22-29). The integrated value of the vibration frequency measured by the wheel measurement device was used as mouse behavioral data.
  • the sample was then centrifuged at 8000 x g for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was removed.
  • the resulting pellet was suspended in PBS and centrifuged again at 8000 x g for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was removed.
  • the resulting pellet was suspended in PBS and filtered through a pluriStrainerTM (mesh size 40 ⁇ m, manufactured by pluriSelect) to prepare an intestinal microbiota sample (0.16 mg/mL, 0.5 vol% PBS).
  • Seq07-Seq10 and Seq15 (10 amino acids long, ⁇ 40% cationic amino acids (i.e., ANC ⁇ 0.4), ⁇ 20% hydrophobic amino acids (i.e., H ⁇ 0.2)) were dissolved in 22.9 mM MOPS + 171.4 mM NaCl (pH 7.0) or 22.9 mM acetic acid + 171.4 mM NaCl (pH 5.0) to prepare 10 probe solutions (1143 nM). Each probe solution was dispensed into a 384-well microplate at 52.5 ⁇ L/well using an automated pipetting device.
  • the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at an excitation wavelength/emission wavelength of 360 nm/530 nm. Then, using an automated pipetting device, 7.5 ⁇ L/well of the prepared gut microbiota sample was added and incubated at 35°C for 10 minutes. After incubation, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 1000 nM probe, 20 ⁇ g/mL gut microbiota sample, 20 mM MOPS + 150 mM NaCl (pH 7.0) or 20 mM acetic acid + 150 mM NaCl (pH 5.0)). Each measurement (8 gut microbiota samples x 2 solvent conditions x 5 probes x 1 wavelength set) was performed six times.
  • Figure 47 shows a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of the gut microbiota sample.
  • the fluorescence intensity of each probe varied depending on the gut microbiota sample and solvent conditions, resulting in a unique fluorescence pattern for each sample.
  • the above data was analyzed using linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted.
  • Figure 48 shows the results. The clusters for each gut microbiota sample were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that individual mice and the presence or absence of their exercise restriction could be identified with 96% accuracy. These results demonstrate that the exercise habits of individual animals can be determined by analyzing gut microbiota suspensions using peptide probes.
  • Each probe solution was added to a 384-well microplate at 52 ⁇ L/well using an automated pipetting device. After 10 minutes of incubation at 35°C, the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at two excitation/emission wavelength (nm) sets: (Ch1) 320/560, (Ch2) 360/480. Cell suspensions (2.25 x 10 5 cells/mL each in pure water) were then added at 8 ⁇ L/well using an automated pipetting device.
  • Figure 49 shows a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of the cell suspension.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the cell type and solvent conditions, resulting in a unique fluorescence pattern for each different cell suspension.
  • the above data was analyzed using linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted.
  • Figure 50 shows the results. The clusters for each cell suspension were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each cell suspension could be identified with 97% accuracy.
  • Seq01 and Seq03 (10 amino acids long, ⁇ 40% cationic amino acids (i.e., ANC ⁇ 0.4), ⁇ 20% hydrophobic amino acids (i.e., H ⁇ 0.2)).
  • Seq01 and Seq03 were dissolved in 23.1 mM MOPS (pH 7.0) or 23.1 mM acetic acid (pH 5.0) to prepare four probe solutions (577 nM).
  • Each probe solution was dispensed into a 384-well microplate at 52 ⁇ L per well using an automated pipetting system. After 10 minutes of incubation at 35°C, the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at two excitation/emission wavelength (nm) sets: (Ch1) 320/560 and (Ch2) 360/480. Then, 8 ⁇ L of serum (0.75 vol% each in pure water) was added to each well using an automated pipetting device. After 10 minutes of incubation at 35°C, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 500 nM probe, 0.10 vol% serum, 20 mM MOPS (pH 7.0) or 20 mM acetic acid (pH 5.0)). Each measurement (4 sera ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 2 probe ⁇ 2 wavelength sets) was performed six times.
  • FIG 51 A heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of serum is shown in Figure 51.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the type of serum and solvent conditions, and unique fluorescence patterns were obtained for fetal bovine serum from different origins and lots.
  • the above data was analyzed by linear discriminant analysis, and the results obtained up to the second discriminant score are shown in Figure 52.
  • the clusters for each serum were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed by the jackknife method, it was confirmed that each fetal bovine serum could be distinguished with 96% accuracy.
  • Serum substitutes N-2 supplement (hereafter referred to as "N2") and B-27 supplement (hereafter referred to as “B27”) were dispensed into microtubes and treated in a sealed, light-protected state under the following conditions: 45°C, 55°C, 65°C, or 75°C for 30 minutes.
  • Untreated or heat-treated N2 and B27 were used to prepare cardiac differentiation induction medium 1 (DM/F-12 supplemented with 1% N2, 2% B27, 1% NEAA, 1% GlutaMAX, 1% PS, and 0.1 mM 2-ME) (hereafter referred to as "CDM1").
  • HCN4-EGFP_409B2 cells (Regen. Ther. 2022;21:239-249) (409B2 cells (human iPS cells) transfected with a BAC vector that knocked in EGFP at the HCN4 locus) were suspended in mouse embryonic fibroblast-conditioned medium (MEF-CM) and plated on Geltrex (Thermo Fisher Scientific, A1413302). The following day, the medium was replaced with CDM1 supplemented with 100 ng/mL Noggin and 3.3 ⁇ M CHIR99021, and then replaced with fresh CDM1 until day 3.
  • MEF-CM mouse embryonic fibroblast-conditioned medium
  • Geltrex Thermo Fisher Scientific, A1413302
  • CDM2 cardiac differentiation induction medium 2
  • RPMI 1640 supplemented with 1% pyruvate, 1% GlutaMAX, 1% ITS-G supplement, 2 mM L-ascorbic acid, 10 mM nicotinamide, 0.2 ⁇ M dexamethasone, 0.5% FBS, 10 ng/mL bFGF, 10 ng/mL BMP4, and 1% PS
  • CDM2 cardiac differentiation induction medium 2
  • the medium was then replaced with fresh CDM2 every 2-3 days. GFP fluorescence was observed on day 19 or 20 using a fluorescence microscope (Olympus, IX73). Then, 2 mg/mL collagenase II (Worthington, CLS2) was added to the cells and incubated overnight at room temperature. The cells were dispersed and collected, and GFP-positive (i.e., HCN4-positive) cells were counted using a FACSAriaTM III cell sorter (BD biosciences). The differentiation-inducing ability of CDM1 was evaluated based on the quantification of GFP-positive cells.
  • Each probe solution was dispensed into a 384-well microplate at 52 ⁇ L per well using an automated pipetting system. After 10 minutes of incubation at 35°C, the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at two excitation/emission wavelength (nm) sets: (Ch1) 320/560 and (Ch2) 360/480. Subsequently, 8 ⁇ L/well of CDM1 containing untreated or heat-treated N2 and B27 (3.75 vol% CDM1/pure water) was added using an automated pipetting device.
  • a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of CDM1 is shown in Figure 53.
  • the fluorescence intensity of each probe varied depending on the treatment conditions and solvent conditions of the serum substitute, resulting in a unique fluorescence pattern for each CDM1 containing serum substitute treated under different conditions.
  • CDM1 treated at 45°C which showed little change in differentiation-inducing ability or fluorescence pattern, was labeled "Good.”
  • CDM1 treated at 55°C which showed a significant change in fluorescence pattern but little change in differentiation-inducing ability, was labeled “Acceptable.”
  • CDM1 treated at 65°C and 75°C which almost completely lost differentiation-inducing ability, was labeled "Unacceptable.”
  • Linear discriminant analysis was performed, and the results, up to the second discriminant score, were plotted. The clusters for each performance were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed by the jackknife method, it was confirmed that the differentiation-inducing ability of CDM1 could be identified with 100% accuracy in all cases.
  • Each probe solution was added to a 384-well microplate at 52 ⁇ L/well using an automated pipetting device. After incubation at 35°C for 10 minutes, fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at the following two excitation wavelength (nm)/emission wavelength (nm) sets: (Ch1) 320/560, (Ch2) 360/480. Next, native or denatured protein drug samples (150 ⁇ g/mL each) were added at 8 ⁇ L/well using an automated pipetting device.
  • Figure 55 shows a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after the addition of the sample.
  • the fluorescence intensity of each probe varied depending on the type of protein drug, treatment conditions, or solvent conditions, resulting in a unique fluorescence pattern for each protein drug sample.
  • the above data was analyzed using linear discriminant analysis, and the results, up to the second discriminant score, are plotted in Figure 56.
  • the clusters for each sample were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each protein drug sample could be identified with 100% accuracy.
  • the broth prepared above was diluted with 24 mM MOPS (pH 7.0) or 24 mM acetic acid (pH 5.0) (1.2 vol% each) and added to a 384-well microplate at 50 ⁇ L/well using an automated pipetting device. After incubation at 35°C for 10 minutes, the fluorescence intensity (I 0 ) was measured using a microplate reader at two sets of excitation wavelength (nm)/emission wavelength (nm): (Ch1) 320/560, (Ch2) 360/480.
  • Figure 57 shows a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after adding the probe.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the type of broth and solvent conditions, resulting in a unique fluorescence pattern for each broth.
  • the above data was analyzed using linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted. The clusters for each broth were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each broth could be identified with 100% accuracy.
  • Figure 59 shows a heat map of the change in fluorescence intensity (fluorescence response) (I-I 0 ) before and after adding the probe.
  • the fluorescence intensity of each probe changed differently depending on the type of sake and solvent conditions, resulting in a unique fluorescence pattern for each sake.
  • the above data was analyzed using linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score were plotted, as shown in Figure 60.
  • the clusters for each sake were distributed without overlapping. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each sake could be identified with 100% accuracy.
  • Probe Characterization 25. Effect of the number of fluorophores on probe performance Probes Seq51-56 were prepared by modifying the N-terminal amino group and the side chain amino group of a lysine residue at the middle position of peptides consisting of 11 to 24 amino acids with an ANC of 0.22 and an H of 0.09 with dansyl groups. The responsiveness of these probes was measured under the same conditions and procedures as in 3 above, except that proteins (Ant, BSA, HSA, IgG, PSA, and Tra) were used at a final concentration of 1000 nM: (Ch1) 360/480.
  • FIG. 61 A heat map of the measurement results (6 proteins x 1 solvent condition x 9 probes x 1 wavelength set) is shown in Figure 61.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis for three probe combinations (combination 1: Seq51, Seq52, Seq53; combination 2: Seq54, Seq55, Seq56; combination 3 (control): Seq03, Seq23, Seq35).
  • the first and second discriminant scores are plotted in Figure 62.
  • combinations 1 and 2 the clusters for each protein were distributed without overlapping.
  • the BSA and PSA clusters partially overlapped, and the relative distance between the clusters tended to be close.
  • a heat map of the measurement results (8 proteins x 2 solvent conditions x 6 probes x 2 wavelength sets) is shown in Figure 63.
  • the above data was analyzed using supervised linear discriminant analysis for three probe combinations (combination 4: Seq57, Seq58; combination 5: Seq59, Seq60; combination 6: Seq61, Seq62).
  • the first and second discriminant scores were plotted and shown in Figure 64.
  • the clusters for each protein were distributed without overlapping, with some exceptions.
  • these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each protein could be identified with 100%, 96%, and 100% accuracy, respectively.

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Abstract

（１）プローブ、イオン強度またはｐＨの異なる複数のプローブ溶液を準備するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）３～１００アミノ酸残基からなるペプチドであって、絶対正味電荷スコアが０．１５以上であり、疎水性スコアが０．０以上であり、前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和が０．３０以上であるペプチドと（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、前記蛍光団が前記ペプチドに共有結合しているものであり、（２）前記複数のプローブ溶液と分析対象の生物学的試料とを混合するステップと、（３）ステップ（２）で調製された混合液の蛍光強度を測定するステップと、（４）ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、生物学的試料の分析方法を提供する。

Description

生物学的試料の分析方法
　本発明は、生物学的試料の分析方法に関する。
　細胞、組織、生体液、微生物叢などの生体試料には、生体の健康状態、体質、疾病リスクといった種々の情報が反映されている。しかし、生体試料は多種多様な成分を含み、極めて複雑な組成を有するため、それらを網羅的に解析することは、労力的にも費用的にも困難であり、現実的ではない。そのため、従来一般的には、ごく限られた成分のみを解析するが、その場合、重要な情報が見落とされ、誤った結論を導いてしまう虞がある。
　また、血清は、細胞培養のために不可欠なサプリメントとして使用される。血清は、細胞の増殖、形質、分化などを大きく左右するものであるため、厳密な品質管理が求められる。しかし、その組成の複雑さゆえに、血清中のどの成分がどのように細胞培養に影響するのかについては十分に理解されていない。そのため、エンドユーザーは、目的の細胞を実際に培養して血清の品質を確認（いわゆるロットチェック（ｌｏｔ－ｔｏ－ｌｏｔ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ））しなければならず、そのためには多大な時間と労力を要する。さらに、ロットチェックは細胞の状態や実験者のスキルに依存し、信頼に足る一貫性のある品質管理が困難である場合も多い。
　同様に、酒類も、微生物が関与する発酵プロセスを経て製造されるため多種多様な成分を含み、極めて複雑な組成を有する。その上、どの成分によりどのように味わいが変化するのか、ほとんど明らかにされていない。例えば清酒の品質を標準化するために、国税庁所定分析法は、アルコール度数、アミノ酸度、酸度および日本酒度を分析項目とし、それらの測定方法を定めているが、それらの測定値に基づいた評価指標（甘口／辛口、濃醇／淡麗）と官能評価は必ずしも一致しない。そのため、現状では、酒類の品質管理は職人の勘や専門のテイスターによる官能試験などに依存しており、客観的かつ一貫性のある品質評価は極めて困難である。
　本発明者らは、交差反応型センシング法により、培養上清、微生物叢、血清、酒類などの生物学的試料を高精度で判別することに成功している（特許文献１および２、ならびに公開前の日本特許出願である特願２０２３－１３０００４および特願２０２３－１７８７６９）。これらの方法によれば、試料中の成分を網羅的な分析する必要なしに、あらゆる成分とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターンを取得するのみにより、試料を分析することが可能である。しかし、これらの方法では、カチオン性ポリマーを骨格とするプローブが用いられており、プローブのレパートリーを拡充するためにはカチオン性ポリマーに化学修飾を導入する必要があることから、時間と労力を要するという問題があった。
国際公開第２０１８／０８８５１０号 国際公開第２０２０／２６２４１３号
　本発明は、より安価かつ効率的にプローブを調製することにより、分析の対象や目的に応じた最適化が容易な、交差反応型センシングに基づく分析方法を提供することを目的としてなされたものである。
　本発明者らは、従前のカチオン性ポリマーを骨格とするプローブに代えて、特定の特性を有するペプチドを骨格とするプローブを使用することにより、同等の精度で生物学的試料を識別できることを見出した。
　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、
　（１）プローブ、イオン強度またはｐＨの異なる複数のプローブ溶液を準備するステップと、ここで、前記プローブが、
　（ａ）３～１００アミノ酸残基からなるペプチドであって、前記ペプチドの（ｉ）絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が０．１５～１．０であり、（ｉｉ）疎水性スコア（Ｈ）が０．０～０．８５であり、かつ（ｉｉｉ）前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）が０．３０～１．０である、ペプチドと、
　ここで、前記絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が、式（Ｉ）：
　　ＡＮＣ＝｜ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅ－ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅ｜／ＡＡｔｏｔａｌ　（Ｉ）
（式中、
　ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅは、前記プローブ溶液のｐＨにおいて正電荷を有するアミノ酸残基数であり；
　ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅは、前記プローブ溶液のｐＨにおいて負電荷を有するアミノ酸残基数であり；
　ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である）
により算出され、
　前記疎水性スコア（Ｈ）が、式（ＩＩ）：
　　Ｈ＝ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ／ＡＡｔｏｔａｌ　（ＩＩ）
（式中、
　ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃは、疎水性アミノ酸残基数であり；
　ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である）
により算出され、
　（ｂ）環境応答性蛍光団と
を含み、かつ、前記蛍光団が、前記ペプチドに共有結合しているものであり、
　（２）前記複数のプローブ溶液と分析対象の生物学的試料とを混合するステップと、
　（３）前記ステップ（２）で調製された混合液の蛍光強度を測定するステップと、
　（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、生物学的試料の分析方法を提供するものである。
　前記ペプチドは、５～６０アミノ酸残基からなることが好ましい。
　前記絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が０．２０～１．０であることが好ましい。
　前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）が０．４０～１．０であることが好ましい。
　前記環境応答性蛍光団は、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団、キサンテン骨格を有する蛍光団、ピレン骨格を有する蛍光団および凝集誘起発光性蛍光団からなる群から選択されることが好ましい。
　前記ステップ（３）における蛍光強度の測定は、複数の励起波長および蛍光波長について行われることが好ましい。
　前記生物学的試料は、細胞またはその培養上清を含有するものであり得る。
　あるいは、前記生物学的試料は、血清または血清代替物を含有するものであり得る。
　あるいは、前記生物学的試料は、微生物叢を含有するものであり得る。
　あるいは、前記生物学的試料は、酒類を含有するものであり得る。
　本発明に係る方法によれば、ペプチドプローブを用いることにより、従前のカチオン性ポリマープローブを用いた場合と同様に、生物学的試料中のあらゆる成分とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターンを取得するのみにより、生物学的試料の特性を、高精度かつ容易に、一貫性をもって判別することができる。
　また、本発明に係る方法で用いるプローブはペプチドを骨格としているため、従前のカチオン性ポリマープローブよりも設計変更が容易であり、かつ、安価に調製することができる。そのため、分析対象の試料ごとに最適化されたプローブのレパートリーの構築が容易である。
図１は、５００ｎＭのプローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ１３）／２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度のα１アンチトリプシンを添加したときの蛍光スペクトルの変化を示す図である。 図２は、５００ｎＭのプローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ１３）／２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度のα１アンチトリプシンを添加したときの蛍光強度（５２０ｎｍ）の変化を示す図である（平均値±標準誤差、ｎ＝３）。 図３は、８タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×８プローブ（Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ０５、Ｓｅｑ１１～Ｓｅｑ１４）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図４は、８タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×８プローブ（Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ０５、Ｓｅｑ１１～Ｓｅｑ１４）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図５は、図４のデータのうち、応答が全体として正の値を示した４タンパク質についての測定結果の変動係数（ＣＶ）のグラフである。 図６は、図４のデータ（Ｓｅｑ０１／Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ０３／Ｓｅｑ０５、Ｓｅｑ１１／Ｓｅｑ１２、Ｓｅｑ１３／Ｓｅｑ１４）を教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図７は、図４のデータ（Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ０５またはＳｅｑ１１～Ｓｅｑ１４）を教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図および第二判別スコアおよび第三判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図８は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ１９、Ｓｅｑ２０）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図９は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ１９、Ｓｅｑ２０）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図１０は、図８および図９のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図１１は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ２５～Ｓｅｑ２８）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図１２は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ２５～Ｓｅｑ２８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図１３は、図１１および図１２のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図１４は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×８プローブ（Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ２６、Ｓｅｑ２８、Ｓｅｑ２９～Ｓｅｑ３２）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図１５は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ２１～Ｓｅｑ２４）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図１６は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ２１～Ｓｅｑ２４）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図１７は、図１５および図１６のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図１８は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ３３～Ｓｅｑ３６）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図１９は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ３３～Ｓｅｑ３６）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図２０は、図１８および図１９のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図２１は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ３７、Ｓｅｑ３８）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図２２は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ３７、Ｓｅｑ３８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図２３は、図２１および図２２のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図２４は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×３プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ３９、Ｓｅｑ４０）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図２５は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×３プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ３９、Ｓｅｑ４０）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図２６は、図２４および図２５のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図２７は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ４１～Ｓｅｑ４４）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図２８は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ４１～Ｓｅｑ４４）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図２９は、図２７および図２８のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図３０は、７タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×３プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ０３）×２波長セット×６測定の独立試行を３回繰り返して得られた蛍光強度（４８０ｎｍ）の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図３１は、図３０の各独立試行の平均値についてのＣＶ値のグラフである。 図３２は、図３０のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図３３は、４タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×３１プローブ（Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ１９～Ｓｅｑ４６）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）について、ＡＮＣとの相関を示すプロット（上段）およびＡＮＣ＋Ｈとの相関を示すプロット（下段）である。 図３４は、８タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ４７～Ｓｅｑ５０）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図３５は、図３４のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図３６は、８タンパク質×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ１６～Ｓｅｑ１８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図３７は、図３６のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である（Ｓｅｑ０３単独、Ｓｅｑ１６単独、およびＳｅｑ０３／Ｓｅｑ１６）。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図３８は、図３６のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である（Ｓｅｑ０３／Ｓｅｑ１７およびＳｅｑ０３／Ｓｅｑ１８）。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図３９は、６ヌクレオチド×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×５プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ２１、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３６）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図４０は、図３９のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図４１は、５００ｎＭのプローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３）／２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度に希釈したＡ５４９細胞の馴化培地を添加したときの蛍光スペクトルの変化を示す図である。 図４２は、５００ｎＭのプローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３）／２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度に希釈したＡ５４９細胞の馴化培地を添加したときの蛍光強度（５２０ｎｍ）の変化を示す図である（平均値±標準誤差、ｎ＝３）。 図４３は、６培地×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×３プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ０５）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図４４は、図４３のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図４５は、８細菌×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０２、Ｓｅｑ０７～Ｓｅｑ０９）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図４６は、図４５のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図４７は、８腸内微生物叢試料×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×５プローブ（Ｓｅｑ０７～Ｓｅｑ１０、Ｓｅｑ１５）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図４８は、図４７のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図４９は、５細胞懸濁液×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×２プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図５０は、図４９のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図５１は、４血清×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×２プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図５２は、図５１のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図５３は、５培地×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ１７、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図５４は、図５３のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図５５は、４タンパク質医薬品試料×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ１７、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図５６は、図５５のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図５７は、５ブロス×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ１７、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図５８は、図５７のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図５９は、８日本酒×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×４プローブ（Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ１７、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３８）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図６０は、図５９のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。アミノ酸配列中、カチオン性アミノ酸はアスタリスク、アニオン性アミノ酸は下線、疎水性アミノ酸は太字で示される。 図６１は、６タンパク質×１溶媒条件（ｐＨ７．０）×９プローブ（Ｓｅｑ５１～Ｓｅｑ５６、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３５）×１波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図６２は、図６１のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。 図６３は、８タンパク質×２溶媒条件（ｐＨ５．０、ｐＨ７．０）×６プローブ（Ｓｅｑ５７～Ｓｅｑ６２）×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップ表示である。 図６４は、図６４は、図６３のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした図である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、第一の実施形態によれば、（１）プローブ、イオン強度またはｐＨの異なる複数のプローブ溶液を準備するステップと、ここで、前記プローブが、
　（ａ）３～１００アミノ酸残基からなるペプチドであって、前記ペプチドの（ｉ）絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が０．１５～１．０であり、（ｉｉ）疎水性スコア（Ｈ）が０．０～０．８５であり、かつ（ｉｉｉ）前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）が０．３０～１．０である、ペプチドと、
　ここで、前記絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が、式（Ｉ）：
　　ＡＮＣ＝｜ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅ－ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅ｜／ＡＡｔｏｔａｌ　（Ｉ）
（式中、
　ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅは、前記プローブ溶液のｐＨにおいて正電荷を有するアミノ酸残基数であり；
　ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅは、前記プローブ溶液のｐＨにおいて負電荷を有するアミノ酸残基数であり；
　ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である）
により算出され、
　前記疎水性スコア（Ｈ）が、式（ＩＩ）：
　　Ｈ＝ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ／ＡＡｔｏｔａｌ　（ＩＩ）
（式中、
　ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃは、疎水性アミノ酸残基数であり；
　ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である）
により算出され、
　（ｂ）環境応答性蛍光団と
を含み、かつ、前記蛍光団が、前記ペプチドに共有結合しているものであり、
　（２）前記複数のプローブ溶液と分析対象の生物学的試料とを混合するステップと、
　（３）前記ステップ（２）で調製された混合液の蛍光強度を測定するステップと、
　（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、生物学的試料の分析方法である。
　最初に、本実施形態の方法において使用するプローブについて説明する。本実施形態の方法において使用するプローブは、（ａ）ペプチドと（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記ペプチドに共有結合しているものである。
　本実施形態におけるプローブに用いるペプチド（ａ）は、３～１００アミノ酸残基からなる。ペプチド合成の難易度およびコストを考慮すると、ペプチド（ａ）は、５～６０アミノ酸残基からなることが好ましく、１０～４０アミノ酸残基からなることがより好ましい。ペプチド（ａ）を構成するアミノ酸の種類は特に限定されず、天然または非天然のいずれであってもよく、例えば、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸またはそれらの側鎖が修飾された誘導体などであってよい。天然アミノ酸には、タンパク質を構成する２０種類の標準アミノ酸のみならず、タンパク質を構成しないアミノ酸（ＮＰＡＡｓ）も含まれ得る。ペプチド合成のコストを考慮すると、ペプチド（ａ）は標準アミノ酸からなることが好ましい。
　本実施形態におけるペプチド（ａ）は、（ｉ）絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）、（ｉｉ）疎水性スコア（Ｈ）、および（ｉｉｉ）前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）により定義される。
　本実施形態において、絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）とは、ペプチド全長の正味電荷の絶対値をペプチドの全アミノ酸数で割って算出される数値であり、ペプチド全体としての電荷の程度を示す。具体的には、絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）は、以下の式（Ｉ）により算出される数値である。
　　ＡＮＣ＝｜ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅ－ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅ｜／ＡＡｔｏｔａｌ　（Ｉ）
　式中、ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅは、側鎖が正電荷を有するアミノ酸残基数であり、ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅは、側鎖が負電荷を有するアミノ酸残基数であり、ＡＡｔｏｔａｌは、ペプチドの全アミノ酸残基数である。アミノ酸の電荷はｐＨによって変化するため、プローブ溶液のｐＨによってＡＮＣが変化することに留意する必要がある。ｐＨ＝７．０において正電荷を有するアミノ酸としては、例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、オルニチン、ホモリシン、ホモアルギニン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、ヒドロキシリジン、カナバニン、ヒプシン、チアリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＨ＝７．０において負電荷を有するアミノ酸としては、例えば、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ホモグルタミン酸、ホモアスパラギン酸、ホスホセリン、ホスホチロシン、アスパルチルリン酸、カルボキシグルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、アミノアジピン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本実施形態において、疎水性スコア（Ｈ）とは、ペプチド中の疎水性アミノ酸の数をペプチドの全アミノ酸数で割って算出される数値であり、ペプチド全体としての疎水性の程度を示す。具体的には、疎水性スコア（Ｈ）は、以下の式（ＩＩ）により算出される数値である。
　　Ｈ＝ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ／ＡＡｔｏｔａｌ　（ＩＩ）
　式中、ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃは、疎水性アミノ酸残基数であり、ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である。本実施形態における「疎水性アミノ酸」は、オクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ）が０．２以上のアミノ酸をいう。したがって、本実施形態における疎水性アミノ酸には、例えば、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、ノルバリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、ジフェニルアラニン、アリルグリシン、シクロブチルグリシン、シクロペンチルグリシン、シクロヘキシルグリシン、シクロヘプチルグリシン、シクロオクチルグリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸のｌｏｇＰ値は、Ｐｅｒｃｅｐｔａ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＡＣＤ／Ｌａｂｓ）などの化学情報解析ツールを用いて計算することができる。
　本実施形態におけるペプチド（ａ）は、（ｉ）絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が０．１５～１．０であり、（ｉｉ）疎水性スコア（Ｈ）が０．０～０．８５であり、かつ（ｉｉｉ）前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）が０．３０～１．０である。上で定義したペプチド長、かつ上記絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）および疎水性スコア（Ｈ）の範囲であれば、生物学的試料中のあらゆる成分に対して種々の親和性で交差反応するペプチドを設計することができる。より判別能力の高いプローブを調製するためには、（ｉ）絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）は、０．１５～１．０であることが好ましく、０．２０～０．９０であることがより好ましく、０．２５～０．８０であることが最も好ましく；（ｉｉ）疎水性スコア（Ｈ）は、０．００～０．８５であることが好ましく、０．００～０．７０であることがより好ましく、０．１０～０．５５であることが最も好ましく；（ｉｉｉ）前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）は、０．３０～１．０であることが好ましく、０．４０～１．０であることがより好ましく、０．５０～１．０であることが最も好ましい。
　本実施形態におけるプローブの環境応答性蛍光団（ｂ）は、蛍光分子周辺の環境に応じて蛍光特性が変化する蛍光団であれば、任意のものであってよい。そのような蛍光団としては、例えば、蛍光分子周辺の極性に応じて蛍光特性が変化する蛍光団や、蛍光分子周辺のｐＨに応じて蛍光特性が変化する蛍光団や、蛍光分子周辺の混雑度に応じて蛍光特性が変化する蛍光団などが挙げられるが、これらに限定されない。
　蛍光分子周辺の極性に応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル（ダンシル）、１－アニリノナフタレン－８－スルホン酸（ＡＮＳ）、Ｎ－メチル－２－アニリノナフタレン－６－スルホン酸（ＭＡＮＳ）、２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホン酸（ＴＮＳ）のような、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団；４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ）、７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）、４－（アミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＡＢＤ）、２，１，３－ベンゾキサジアゾール－４－スルホン酸アンモニウム（ＳＢＤ）のような、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
　蛍光分子周辺のｐＨに応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’－７’－ビス（カルボキシエチル）－５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）、セミナフタロダフルオレセイン（ＳＮＡＲＦ）のような、キサンテン骨格を有する蛍光団；８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム（ＨＴＰＳ）のような、ピレン骨格を有する蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
　蛍光分子周辺の混雑度に応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、テトラフェニルエチレン（ＴＰＥ）、１０，１０’ ，１１，１１’－テトラヒドロ－５，５’－ビジベンゾ［ａ，ｄ］［７］アヌレニリデン（ＴＨＢＡ）、１，１，２，３，４，５－ヘキサフェニルシロール（ＨＰＳ）などの凝集誘起発光性（ＡＩＥ）蛍光団；Ｎ，Ｎ－ジフェニル－４－（２－チエニル）アニリンのような、トリフェニルアミン骨格を有するＡＩＥ蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
　本実施形態における好ましい環境応答性蛍光団は、ダンシル、ＮＢＤ、ＤＢＤ、ＦＩＴＣ、ＦＡＭもしくはＴＰＥまたはそれらの蛍光性誘導体であってよい。
　本実施形態におけるプローブは、ペプチド（ａ）と環境応答性蛍光団（ｂ）が共有結合により導入されてなる。環境応答性蛍光団は、ポリペプチドの任意の１以上の位置に導入されてよく、例えば、Ｎ末端およびＣ末端のいずれか一方もしくは両方、ならびに／またはポリペプチド中のアミノ酸残基の側鎖におけるアミノ基、水酸基、カルボキシ基、ＳＨ基、アジド基、アルキニル基などに導入されてよい。本実施形態におけるプローブでは、環境応答性蛍光団は、好ましくはペプチドのＮ末端および／またはリジン残基側鎖のε－アミノ基に導入されてよい。
　本実施形態におけるプローブは、ペプチド（ａ）のＮ末端および／またはＣ末端に、さらに修飾を含んでもよい。Ｎ末端の修飾としては、例えば、アセチル化、アルキル化、ホルミル化、ピルビル化、リポイル化、カルボキシル化、スクシニル化、マレイル化、カルバミル化、ビオチン化、ベンゾイル化、アリル化、アクリル化、ＰＥＧ化、グリコシル化などが挙げられる。Ｃ末端の修飾としては、例えば、アミド化、メチルエステル化、プレニル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ホスホリル化、スルホン化、ネダイル化、ＰＥＧ化などが挙げられる。
　本実施形態におけるプローブは、従来公知の方法により、ペプチドを合成し、蛍光団により標識化することにより調製され得る。例えば、本実施形態におけるプローブは、ペプチドを化学合成または生合成し、ポリペプチド中のアミノ基を、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステル基やペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル基などの活性エステル基、イソチオシアネート基またはハロゲン化アルキル基などにより活性化された環境応答性蛍光団により標識化することにより調製されてよい。
　本実施形態の方法では、プローブ、イオン強度およびｐＨのいずれか１つ以上が異なる複数のプローブ溶液を使用する。本実施形態における複数のプローブ溶液は、例えば、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒により１種類のプローブを溶解して調製されてもよいし、同一の溶媒により複数種類のプローブを溶解して調製されてもよい。溶媒は、例えば２種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができ、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができる。
　本実施形態の方法では、１種類のプローブを用いてもよいが、多種類のプローブを用いることがより好ましく、例えば２種類以上、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上のプローブを用いることができる。例えば、２種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば、６種類のプローブ溶液を調製することができ、その結果、１つの分析試料について６次元のデータを得ることができる。例えば、５種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば、１５種類のプローブ溶液を調製することができ、その結果、１つの分析試料について１５次元のデータを得ることができる。このように、溶媒の種類とプローブの種類を増やすことにより、より多次元のデータを得ることができる。
　プローブを溶解するための溶媒は、任意の緩衝液および／または塩を含む水性溶媒であってよい。緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸、グリシンなどが挙げられる。塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮなどが挙げられる。本実施形態において、溶媒のｐＨは、好ましくは４．０～１０．０であり、特に好ましくは５．０～９．０である。また、本実施形態において、溶媒のイオン強度は、１０～５００ｍＭであることが好ましい。また、プローブ溶液におけるプローブの濃度は、０．１～１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。
　次いで、複数のプローブ溶液と分析対象の生物学的試料（以下、「分析試料」とも記載する）とを混合する。本ステップにおいて、プローブは、分析試料に含まれる任意の分子に対して、非特異的に相互作用する。
　本実施形態において「生物学的試料」とは、生体分子を含有する試料をいう。したがって、本実施形態における生物学的試料は、例えば、細胞もしくは組織もしくはそれらの培養物、培養上清、体液（血液、血清、血漿、唾液、尿、汗、糞便、精液、脳脊髄液、スワブなど）、またはそれらからの抽出物であってよい。精製された生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸など）を含有する医薬品などの組成物も、本実施形態における生物学的試料に含まれてよい。本実施形態の方法は、細胞もしくはその培養上清、血清もしくは血清代替物、微生物叢、または酒類を含有する生物学的試料の分析に特に好適である。
　「細胞」は、任意の生体由来であってよく、動物または植物に由来するものであってよく、真菌細胞または原核細胞などの微生物細胞であってもよい。細胞は、初代培養細胞であってもよいし、すでに樹立された株化細胞であってもよい。細胞が由来する動物は、特に限定されないが、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
　分析試料とプローブ溶液との混合液における細胞の最終濃度は、例えば１０～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたはＯＤ６００＝０．００２～０．５００であってよく、好ましくは１０２～１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたはＯＤ６００＝０．０１０～０．１００であってよい。分析試料中の細胞の濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈してプローブ溶液に添加してもよい。
　「血清」は、任意の動物由来のものであってよいが、好ましくは、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどの哺乳動物由来である。血清が由来する動物の年齢は特に限定されず、胎児、新生児および成体を含む任意の年齢であり得る。血清の原産国／地域も特に限定されない。様々な国／地域で生産された多種多様な動物由来の血清が市販されており、本実施形態の方法は、それらのいずれをも分析の対象とすることができる。
　「血清代替物」とは、細胞培養において血清に代えて用いられる無血清サプリメントの総称である。血清代替物は、一般的に、増殖因子、サイトカイン、ホルモンなどから選択される数種類～数十種類の因子を含む。種々の血清代替物が市販されており、例えば、Ｎ２サプリメント（Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９８５；ｐｐ．３－４３）およびその改良品、Ｂ２７サプリメント（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１９９３；３５（５）：５６７－７６）およびその改良品、Ｇ５サプリメント（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９８４；２（６）：５７５－８４）およびその改良品、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（商標）血清代替品（ＳＳＲ）（富士フイルム和光純薬）、ＸＦ２１２　ＸｅｒｕｍＦｒｅｅ（ＴＮＣ　ＢＩＯ　ＢＶ）、ヒト血小板溶解物、植物加水分解物、トウモロコシ抽出物、酵母抽出物、大豆抽出物などが挙げられるが、これらに限定されない。市販の血清代替物には具体的な組成が公表されていないものも多いが、本実施形態の方法は、それらのいずれをも分析の対象とすることができる。
　分析試料とプローブ溶液との混合液における血清または血清代替物の最終濃度は、例えば０．００１ｖｏｌ％～９９．９ｖｏｌ％であってよく、好ましくは０．０１ｖｏｌ％～１０ｖｏｌ％であってよい。分析試料中の血清または血清代替物の濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈してプローブ溶液に添加してもよい。
　「微生物叢」とは、ある特定の環境中に存在する複数の微生物の集まりを意味する。微生物叢は、例えば、少なくとも１００種類、３００種類、５００種類、７００種類、１，０００種類、またはそれ以上の種類の微生物から構成され得る。微生物叢は、細菌、真菌、原虫、ウイルスなどの、種々の分類および／または種類の微生物から構成されることができ、本実施形態の方法は、任意の分類および／または種類の微生物から構成される微生物叢を対象とすることができる。微生物叢が存在する環境としては、例えば、動植物個体の表面または内部、土壌、海水、河川水などが挙げられる。
　本実施形態の方法は、任意の環境に由来する任意の微生物叢を対象とすることができるが、好ましくは、動物体由来の微生物叢を対象とする。微生物叢が由来する動物体は、任意の脊椎動物体または無脊椎動物体であってよいが、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物体であり、特に好ましくは人体である。動物体における微生物叢は、組織（例えば、消化管、口腔、鼻腔、皮膚、呼吸器、生殖器など）の上皮に存在し、本実施形態の方法において分析される微生物叢は、いずれの組織上皮由来の微生物叢であってもよい。本実施形態の方法において分析される動物体由来の微生物叢は、好ましくは、口腔内微生物叢（口内フローラ）または腸内微生物叢（腸内フローラ）であり、特に好ましくは、腸内微生物叢である。
　動物体由来の微生物叢試料は、従来公知の方法により調製することができる。例えば、口腔内細菌叢を含有する試料であれば、歯垢や唾液などから調製することができ、腸内微生物叢を含有する試料であれば、糞便から調製することができる。分析試料とプローブ溶液との混合液における微生物の最終濃度は、例えばＯＤ６００＝０．００２～０．５００であってよく、好ましくはＯＤ６００＝０．０１０～０．１００であってよい。分析試料中の微生物濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈してプローブ溶液に添加してもよい。
　「酒類」は、エタノールが含まれる任意の飲料であってよく、任意の原料から製造されたものであってよく、その製法も限定されない。また、酒類の特性（色、透明度、発泡性など）も特に限定されない。したがって、本実施形態の方法が対象とする酒類は、醸造酒、蒸留酒または混成酒のいずれであってもよい。醸造酒としては、例えば、清酒（日本酒）、ワイン、ビール、紹興酒、マッコリなどが挙げられ；蒸留酒としては、例えば、焼酎、泡盛、ウイスキー、ブランデー、ウォッカ、テキーラなどが挙げられ；混成酒としては、例えば、リキュール、ベルモット、シェリー、みりんなどが挙げられるが、これらに限定されない。酒類の原産国／地域も特に限定されない。様々な国／地域で生産された多種多様な酒類が市販されており、本実施形態の方法は、それらのいずれをも分析の対象とすることができる。
　本実施形態における分析試料には、上記の任意の酒類から選択される単独または２種類以上の混合物が含まれてよく、２種類以上の混合物における酒類の比率は任意であってよい。また、本実施形態における分析試料は、酒類のみからなってもよいし、酒類を含有する飲料品などであってもよい。酒類を含有する飲料品は、例えば、果汁、水、炭酸水などのエタノールを含まない飲料と酒類とを混合したカクテルなどであってよい。
　分析試料とプローブ溶液との混合液における酒類の最終濃度は、例えば０．００１～９９．９ｖ／ｖ％であってよく、好ましくは０．０１～９５ｖ／ｖ％であってよく、より好ましくは０．１～９０ｖ／ｖ％であってよい。分析試料中の酒類成分の濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈してプローブ溶液に添加してもよい。
　本実施形態の方法では、複数のプローブ溶液のそれぞれに対して分析試料が添加されてもよいし、分析試料に対して複数のプローブ溶液が同時に添加されてもよい。
　次いで、プローブ溶液と分析試料と混合液の蛍光強度を測定する。本実施形態の方法では、励起波長３００～６００ｎｍ、蛍光波長４００～８００ｎｍにおいて蛍光強度を測定することができる。また、本実施形態の方法では、各測定対象につき、複数の励起波長／蛍光波長のセット（例えば、励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）：３４０／５２０、３３０／４８０、３４５／５０５、３６０／５３０など）における蛍光強度を測定することが好ましく、例えば２セット、３セット、または４セットの励起波長／蛍光波長により蛍光強度を測定することができる。
　プローブ溶液の蛍光強度は、試料中の成分の種類、量、状態などに応じて変化し、さらに、プローブを溶解する溶媒の条件によっても変化する。そのため、本ステップにより、試料に固有の蛍光強度のパターンを得ることができる。
　次いで、分析試料について得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較する。参照試料についての蛍光強度パターンは、分析試料と並行して蛍光強度の測定を行うことにより取得してもよいし、予め準備された所定の蛍光強度パターンであってもよい。蛍光強度パターンの比較は、好ましくは、主成分分析、線形判別分析、階層的クラスター分析などの多変量解析により次元数を圧縮し、蛍光強度パターン間の差異を２次元または３次元に圧縮変換して比較することができる。あるいは、蛍光強度パターンの比較には、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト、勾配ブースティング、ｋ－最近傍法、ニューラルネットワーク、ナイーブベイズ分類器、ロジスティック回帰などの機械学習法を使用してもよい。
　本実施形態の方法は、蛍光強度のパターンの違いのみに基づいて、生物学的試料を分析する。培養上清、血清、微生物叢、酒類などの生物学的試料には膨大な種類の生体分子が含まれ、それらの種類、量、状態を網羅的に解析することは極めて困難であり、実際的ではない。これに対し、本実施形態の方法では、多種多様な成分とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターンを取得し、参照試料についての蛍光強度パターンと比較することのみにより、生物学的試料の総合的な特性を特定することができる。
　したがって、特定の実施形態では、例えば、未分化細胞もしくは分化細胞の培養上清またはライセート（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、分化状態が不明である細胞の培養上清またはライセート（分析試料）について得られた蛍光強度パターンとを比較する。その結果、分析試料について得られた蛍光強度パターンと、分化細胞の培養上清またはライセートについて得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に近ければ、分析試料が分化細胞の培養上清であることが推定または特定される。
　特定の実施形態では、例えば、現在培養に使用している血清または血清代替物（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、異なる産地／製造元Ａ、ＢまたはＣの血清もしくは血清代替物（分析試料）について得られた蛍光強度パターンを比較する。その結果、産地／製造元Ａの血清または血清代替物について得られた蛍光強度パターンと、参照試料について得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に最も近ければ、現在使用中の血清または血清代替物に代えて産地／製造元Ａの血清または血清代替物を用いることができると推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、購入直後の血清または血清代替物（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、同じ産地／製造元／ロットであるが異なる保存状態（例えば保存の温度および／または期間が異なる）Ａ、ＢまたはＣの血清もしくは血清代替物（分析試料）について得られた蛍光強度パターンを比較する。その結果、保存状態Ａの血清または血清代替物について得られた蛍光強度パターンと、参照試料について得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に最も近ければ、保存状態Ａの血清または血清代替物の品質は劣化していないと推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、異なる菌株Ａ、ＢまたはＣを含有する発酵食品試料（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、不明の菌株を含有する発酵食品試料（分析試料）について得られた蛍光強度パターンを比較する。その結果、分析試料について得られた蛍光強度パターンと、菌株Ａを含有する発酵食品試料について得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に最も近ければ、分析対象の発酵食品が菌株Ａを含有するものであると推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、肥満体質の個体または非肥満体質の個体由来の細菌叢（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、健康状態や体質が不明である被験者由来の細菌叢（分析試料）について得られた蛍光強度パターンを比較する。その結果、分析試料について得られた蛍光強度パターンと、肥満体質の個体について得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に最も近ければ、その分析試料が由来する被験者を、肥満またはそのリスクが高い個体として推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、異なる銘柄の清酒Ａ、ＢまたはＣ（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、分析試料について得られた蛍光強度パターンとを比較する。その結果、分析試料について得られた蛍光強度パターンと、清酒Ａについて得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に最も近ければ、分析試料が清酒Ａであると推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、購入直後の清酒Ｘ（参照試料）について得られた蛍光強度パターンと、同じ銘柄／特定名称分類であるが保存状態（例えば保存の温度および／または期間）が異なる清酒Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３（分析試料）について得られた蛍光強度パターンを比較する。その結果、清酒Ｘ１について得られた蛍光強度パターンと、参照試料について得られた蛍光強度パターンの分布との距離が確率的に最も近ければ、清酒Ｘ１の品質は劣化していないと推定または特定することができる。
　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
［Ａ：プローブのキャラクタリゼーション］
＜１．材料＞
（１－１）プローブ
　以下の非特異的蛍光ペプチドプローブ（＞９５％純度）をバイオロジカ社に委託して合成し、さらなる精製を行わずに使用した。配列番号３３～３６のプローブは、ペプチド中のリジン残基の側鎖のアミノ基がダンシルにより修飾されている（「Ｋ＾」で示す）。「Ｃｏｄｅ」の数字は、左から順に、ペプチドに含まれるカチオン性アミノ酸の数、アニオン性アミノ酸の数、および疎水性アミノ酸の数を示す。以下の実施例では、「カチオン性アミノ酸」とは、ｐＨ＝７．０において正電荷を有するアミノ酸をいい、「アニオン性アミノ酸」とは、ｐＨ＝７．０において負電荷を有するアミノ酸をいう。また、以下の実施例における絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）および疎水性スコア（Ｈ）は、ｐＨ＝７．０における数値である。
　表１．プローブのアミノ酸配列および修飾
　表２．プローブの特性
（１－２）タンパク質
　プローブのキャラクタリゼーションには以下のタンパク質を用いた。
　表３．タンパク質のリスト
　本実施例におけるタンパク質の略称は以下の通り。Ｌａｃ：βラクトグロブリン、Ａｎｔ：α１アンチトリプシン、Ｌｉｐ：リパーゼ、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、Ｆｉｂ：フィブリノゲン、ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン、Ｔｒａ：トランスフェリン、ＩｇＧ：イムノグロブリンＧ、Ｍｙｏ：ミオグロビン、Ｈｅｍ：ヘモグロビン、Ｌｙｓ：リゾチーム、ＰＳＡ：ブタ血清アルブミン、Ｐｒｏ：プロテイナーゼＫ、Ｐａｐ：パパイン、Ｔｒｙ：トリプシン。
＜２．タンパク質によるカチオン性プローブの蛍光変化＞
　Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ１３を４０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、３種類のプローブ溶液（１０００ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に３０μＬ／ウェルで加えた。種々の濃度のＡｎｔ／純水溶液（３０μＬ）を各ウェルに加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、励起波長３４０ｎｍにおける蛍光スペクトル（蛍光波長５００～６５０ｎｍ）および蛍光強度（蛍光波長５２０ｎｍ）を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、０～１６００ｎＭ　Ａｎｔ、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。
　０～１６００ｎＭのＡｎｔを添加したときのＳｅｑ０１、Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ１３の蛍光スペクトル変化を図１に示す。Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３の蛍光強度はＡｎｔの濃度依存的に増大し、かつ、ピークがより短い波長にシフト（ブルーシフト）した。一方、Ｓｅｑ１３の蛍光スペクトルはＡｎｔの濃度が増加してもほとんど変化しなかった。図２は、蛍光強度（５２０ｎｍ）の変化を示す。Ｓｅｑ０１の蛍光強度はＡｎｔの濃度が１６００ｎＭに至るまで増加し続けたのに対して、Ｓｅｑ０３の蛍光強度は８００ｎＭのＡｎｔで飽和した。Ｓｅｑ１３の蛍光強度はほとんど変化しなかった。これらの結果から、非特異的蛍光ペプチドプローブが、アニオン性タンパク質であるα１アンチトリプシンに対し、ペプチド配列によって異なる応答性を示すことが確認された。ここで、Ｓｅｑ０１は荷電性であり疎水性アミノ酸を多く含み（ＡＮＣ＝０．４、Ｈ＝０．５）、Ｓｅｑ０３は荷電性ではあるが疎水性アミノ酸が少なく（ＡＮＣ＝０．７、Ｈ＝０．２）、Ｓｅｑ１３はｓｅｑ０３に比べて荷電性でも疎水性でもない（ＡＮＣ＝０．４、Ｈ＝０）。これらを考慮すると、ペプチドの荷電性および疎水性が高いほど、プローブの応答性が大きくなる可能性が示唆された。
＜３．プローブ性能に対するカチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の影響（１）＞
　１０アミノ酸からなり、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が異なる８種類のペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ０５、Ｓｅｑ１１～Ｓｅｑ１４）を、２３．１ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、８種類のプローブ溶液（５７７ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４ウェルマイクロプレートに５２μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、荷電性や疎水性の異なる種々のタンパク質（Ｌａｃ、Ａｎｔ、Ｌｉｐ、ＢＳＡ、ＨＳＡ、Ｔｒａ、ＩｇＧおよびＴｒｙ；各３０００ｎＭタンパク質／純水）を８μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、５００ｎＭタンパク質、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。各測定（８タンパク質×１溶媒条件×８プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　タンパク質を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）を図３および図４に示す。Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ０５およびＳｅｑ１２の応答は、Ｓｅｑ１１、Ｓｅｑ１３およびＳｅｑ１４の応答に比べて大きかった。Ｓｅｑ１１（ＡＮＣ＝０．２、Ｈ＝０．５）、Ｓｅｑ１３（ＡＮＣ＝０．４、Ｈ＝０．０）およびＳｅｑ１４（ＡＮＣ＝０．３、Ｈ＝０．０）の応答が低いという結果から、プローブとタンパク質との相互作用には、カチオン性アミノ酸と疎水性アミノ酸のいずれもが必要であることが示唆された。
　プローブ間の応答のばらつきを比較するために、応答が全体として正の値を示したＬａｃ、Ａｎｔ、ＢＳＡおよびＨＳＡについての測定結果の変動係数（ＣＶ）を計算した。結果を図５に示す。Ｓｅｑ１１～Ｓｅｑ１４のＣＶ値は、Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ０５のＣＶ値に比べて大きかった。これらの結果は、Ｓｅｑ１１、Ｓｅｑ１３およびＳｅｑ１４については応答（蛍光強度）が極めて小さいこと、Ｓｅｑ１２についてはカチオン性の低さと疎水性の高さによる溶解状態の不安定さに起因すると考えられた。プローブ間のばらつきの差異は、図４にも現れている。
　応答の多様性に着目すると、特にＳｅｑ０１～Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ０５は、タンパク質の種類に応じて大きく異なる変化を示し、異なるタンパク質ごとに固有の蛍光パターンが得られた（図４）。図４のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図６に示す。Ｓｅｑ０１／Ｓｅｑ０２およびＳｅｑ０３／Ｓｅｑ０５の組み合わせでは、各タンパク質についてのクラスターは、それぞれ一部を除き重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、高い精度（９２％および９６％）で各タンパク質を識別できることが確認された。これに対して、Ｓｅｑ１１／Ｓｅｑ１２およびＳｅｑ１３／Ｓｅｑ１４の組み合わせでは、各タンパク質についてのクラスターの多くが重なり、ジャックナイフ法によって解析したところ、低い値を示した（５６％および６９％）。
　Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ０５のデータセット、ならびにＳｅｑ１１～Ｓｅｑ１４のデータセットをまとめて線形判別分析により解析し、得られた第三判別スコアまでをプロットした結果を図７に示す。Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ０５の解析結果にはクラスターの重なりがなく、これらのプローブが高い識別精度を示すことが確認された（ジャックナイフ法で９８％）。一方、Ｓｅｑ１１～Ｓｅｑ１４の解析結果にはクラスターの大きな重なりが見られ、クラスター間の相対的な距離も小さく、識別精度も低かった（ジャックナイフ法で７９％）。これらの結果から、ペプチドプローブのカチオン性および疎水性の両方が高い方が、タンパク質の識別精度が高くなることが示唆された。
＜４．プローブ性能に対するカチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の影響（２）＞
　Ｓｅｑ１９およびＳｅｑ２０（１０アミノ酸からなり、ＡＮＣおよびＨがともに０．１以下のペプチドを含んでなる）の応答性を、終濃度１０００ｎＭのタンパク質（ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＰＳＡ、Ａｎｔ、Ｆｉｂ、ＴｒａおよびＩｇＧ）を用いた以外は上記３と同様の条件および手順により解析し、比較した。対照には、Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３を用いた。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×１波長セット）を図８に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を図９に示す。Ｓｅｑ１９およびＳｅｑ２０は、どのタンパク質に対してもほとんど応答しなかった。これらの結果から、荷電性および疎水性がともに低いプローブは、タンパク質とほとんど相互作用しないことが示唆された。上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図１０に示す。Ｓｅｑ１９／Ｓｅｑ２０をペアにした場合には、各タンパク質についてのクラスターは大きく重なり、ジャックナイフ法によって解析したところ、低い識別精度（６０％）であることが確認された。これらの結果から、ペプチドプローブのカチオン性および疎水性がともに低い場合には、タンパク質の識別精度が低くなることが示唆された。
＜５．プローブ性能に対する正味電荷の影響＞
　Ｓｅｑ０１（ＡＮＣ＝０．４、Ｈ＝０．５）およびＳｅｑ０２（ＡＮＣ＝０．５、Ｈ＝０．２）をベースとして、カチオン性アミノ酸の１つをアニオン性アミノ酸に置換したペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ２５およびＳｅｑ２６）ならびにカチオン性アミノ酸の２つをアニオン性アミノ酸に置換したペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ２７およびＳｅｑ２８）を調製した。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。対照には、Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０２を用いた。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×６プローブ×１波長セット）を図１１に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×６プローブ×２波長セット）を図１２に示す。ＡＮＣの減少にしたがってプローブの応答性が一貫して低下した（Ｓｅｑ０１＞Ｓｅｑ２５＞Ｓｅｑ２７；Ｓｅｑ０２＞Ｓｅｑ２６＞Ｓｅｑ２８）。これらの結果から、ＡＮＣの減少にしたがってプローブとタンパク質とが相互作用しにくくなることが示唆された。上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図１３に示す。クラスターの重なりはＳｅｑ２７／Ｓｅｑ２８の組み合わせで最も大きく、第一判別スコアの寄与率（９５．２％）が他の組み合わせよりも約３０％高かった。この結果は、ＡＮＣの減少に伴い、蛍光パターンが単純化したことを意味する。図１３の結果をジャックナイフ法によって解析したところ、Ｓｅｑ０１／Ｓｅｑ０２の識別精度が他の組み合わせよりも大幅に高いことが判明した。これらの結果から、ペプチドのＡＮＣが高い方が、タンパク質の識別精度が高くなることが示唆された。
＜６．プローブ性能に対する疎水性の影響＞
　Ｓｅｑ０２およびＳｅｑ０３（１０アミノ酸長、≧５０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．５）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））をベースとして、疎水性アミノ酸の１つを親水性アミノ酸であるグリシンに置換したペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ２９およびＳｅｑ３１）または２つをグリシンに置換したペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ３０およびＳｅｑ３２）を調製した。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。対照には、上記５で調製したＳｅｑ２６およびＳｅｑ２８を用いた。
　測定結果（７タンパク質×１溶媒条件×８プローブ×１波長セット）のグラフを図１４に示す。Ｓｅｑ０２（すなわち、ＡＮＣ≧０．５のプローブ）では、疎水性アミノ酸の割合の減少とともにプローブの応答が一貫して低下した（Ｓｅｑ０２＞Ｓｅｑ２９＞Ｓｅｑ３０）。疎水性アミノ酸を含まない（すなわち、Ｈ＝０．０）Ｓｅｑ３０は、Ｓｅｑ２６およびＳｅｑ２８と同程度の低い応答を示した。これに対し、ＡＮＣ＝０．７のプローブ（Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ３１、Ｓｅｑ３２）では、疎水性アミノ酸の割合が減少してもプローブの応答は大きく変化しなかった。これらの結果から、疎水性アミノ酸がプローブの応答性に与える影響が正味電荷に依存して変化することが示唆された。具体的には、以下のように考えられる：（１）ＡＮＣが高い場合、Ｈによらず十分なプローブ性能を達成でき、（２）ＡＮＣがそれほど高くない場合、Ｈが高ければ十分なプローブ性能を達成でき、（３）ＡＮＣが低い場合、Ｈが高くても十分なプローブ性能を達成できない。
＜７．プローブ性能に対するペプチド長の影響＞
　カチオン性アミノ酸が２２％以上（すなわち、ＡＮＣ≧０．２２）、疎水性アミノ酸が３０％以上（すなわち、Ｈ≧０．３）含まれる、１８アミノ酸からなるペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ２１およびＳｅｑ２２）ならびに２４アミノ酸からなるペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ２３およびＳｅｑ２４）を調製した。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×１波長セット）を図１５に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を図１６に示す。Ｓｅｑ２１～Ｓｅｑ２４のいずれもがタンパク質に対して応答し、応答性は、Ｓｅｑ２１およびＳｅｑ２２よりもＳｅｑ２３およびＳｅｑ２４の方が優れていた。得られた上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図１７に示す。各タンパク質についてのクラスターは、一部を除き重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、いずれも１００％の精度で各タンパク質を識別できることが確認された。これらの結果から、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が十分に高ければ、ペプチド長によらず、タンパク質の識別が可能な蛍光パターンを取得できることが示唆された。
＜８．プローブ性能に対する蛍光団の位置の影響＞
　カチオン性アミノ酸が３０％以上（すなわち、ＡＮＣ≧０．３）、疎水性アミノ酸が１５％以上（すなわち、Ｈ≧０．１５）含まれる、１０アミノ酸からなるペプチドの中間位置をダンシル基で修飾したプローブＳｅｑ３３～Ｓｅｑ３６を調製した。Ｓｅｑ３３およびＳｅｑ３４は、ペプチドのＮ末端がアセチル化され、Ｃ末端のリジン残基の側鎖アミノ基がダンシル基により修飾されている。Ｓｅｑ３５およびＳｅｑ３６は、ペプチドのＮ末端は修飾されておらず、ペプチドの中間位置のリジン残基の側鎖アミノ基がダンシル基により修飾されている。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。対照には、Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３（カチオン性アミノ酸が４０％以上、疎水性アミノ酸が２０％以上含まれる、１０アミノ酸からなるペプチドのＮ末端がダンシル基により修飾されているプローブ）を用いた。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×６プローブ×１波長セット）を図１８に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×６プローブ×２波長セット）を図１９に示す。ダンシル基の導入位置によらず、いずれのプローブもタンパク質に対して応答し、応答性は、ダンシル基の導入位置によって変化した。上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図２０に示す。各タンパク質についてのクラスターは、それぞれ一部を除き重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、いずれも１００％の精度で各タンパク質を識別できることが確認された。これらの結果から、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が十分に高ければ、蛍光団の導入位置によらず、タンパク質の識別が可能な蛍光パターンを取得できることが示唆された。
＜９．プローブ性能に対するカチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の配置の影響＞
　カチオン性アミノ酸が４０％以上（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、疎水性アミノ酸が２０％以上（すなわち、Ｈ≧０．２）含まれる、１０アミノ酸からなるペプチドを含んでなるＳｅｑ０１およびＳｅｑ０２をベースとして、カチオン性アミノ酸をＣ末端領域に、疎水性アミノ酸をＮ末端領域に局在させたペプチドを含んでなるプローブ（Ｓｅｑ３７およびＳｅｑ３８）を調製した。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。対照には、Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０２を用いた。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×１波長セット）を図２１に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を図２２に示す。カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の配置によらず、いずれのプローブもタンパク質に対して応答し、応答性は、それらの配置によって変化した。得られた上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図２３に示す。各タンパク質についてのクラスターは、それぞれ一部を除き重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、Ｓｅｑ０１／Ｓｅｑ０２は９８％、Ｓｅｑ３７／Ｓｅｑ３８は１００％の精度で各タンパク質を識別できることが確認された。
　次に、Ｓｅｑ０１をベースとして、アミノ酸の配列を１残基ずらしたプローブ（Ｓｅｑ３９）、および２残基ずらしたプローブ（Ｓｅｑ４０）を調製した。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。対照には、Ｓｅｑ０１を用いた。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×３プローブ×１波長セット）を図２４に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×３プローブ×２波長セット）を図２５に示す。アミノ酸残基の配置によらず、いずれのプローブもタンパク質に対して応答し、応答性は、それらの配置によって変化した。上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図２６に示す。各タンパク質についてのクラスターは、それぞれ一部を除き重なることなく分布し、アミノ酸残基の配置によってクラスターの位置が異なった。
　これらの結果から、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が十分に高ければ、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の配置によらず、タンパク質の識別が可能な蛍光パターンを取得できること、および、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の配置を変更することにより異なる蛍光パターンが取得できることが示唆された。
＜１０．プローブ性能に対するアミノ酸配列の類似性の影響＞
　カチオン性アミノ酸が４０％以上（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、疎水性アミノ酸が２０％以上（すなわち、Ｈ≧０．２）含まれる、１０アミノ酸からなるペプチドを含んでなるＳｅｑ０１およびＳｅｑ０３をベースとして、アミノ酸配列同一性を高めたプローブの組み合わせ（Ｓｅｑ４１／Ｓｅｑ４２、Ｓｅｑ４３／Ｓｅｑ４４）を調製した。Ｓｅｑ０１／Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ４１／Ｓｅｑ４２およびＳｅｑ４３／Ｓｅｑ４４のアミノ酸配列同一性は、それぞれ２０％、４０％および７０％である。これらのプローブの応答性を上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。
　測定結果のグラフ（７タンパク質×１溶媒条件×６プローブ×１波長セット）を図２７に、ヒートマップ（７タンパク質×１溶媒条件×６プローブ×２波長セット）を図２８に示す。いずれのプローブもタンパク質に対して応答したが、応答性は、アミノ酸配列の同一性の増加に従って類似した。得られた上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図２９に示す。アミノ酸配列の同一性の増加に伴い、第一判別スコアの寄与率が増加した（７８．６％（Ｓｅｑ０１／Ｓｅｑ０３）、９０．３％（Ｓｅｑ４１／Ｓｅｑ４２）および９１．７％（Ｓｅｑ４３／Ｓｅｑ４４））。これらの結果は、アミノ酸配列の同一性の増加に伴い、蛍光パターンが単純化したことを意味する。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、配列同一性によらず高い精度で各タンパク質を識別できることが確認された。これらの結果から、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が十分に高いとしても、ペプチドのアミノ酸配列同一性が高いプローブを組み合わせた場合には、蛍光パターンが単純化することが示唆された。
＜１１．再現性の確認＞
　Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０２およびＳｅｑ０３を用いて、上記４と同様の条件および手順による分析（７タンパク質×３プローブ×２波長セット（ｎ＝６））を３回繰り返した。測定結果のグラフを図３０に、３回の独立試行の平均値についてのＣＶ値のグラフを図３１に示す。ＣＶ値は０．００３～０．０６４の範囲内であった。上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図３２に示す。各タンパク質についてのクラスターは重なることなく分布し、クラスターの分布は３回の独立試行で一貫していた。これらの結果から、ペプチドプローブを用いた本方法が十分に高い再現性を示すことが確認された。
＜１２．カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合と応答性の相関＞
　３１種類のプローブ（Ｓｅｑ０１～Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ１９～Ｓｅｑ４６）を用いて、上記４と同様の条件および手順により４種類のタンパク質（ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＰＳＡおよびＡｎｔ）を分析した。測定結果とＡＮＣのプロットを図３３の上段に、測定結果とＡＮＣ＋Ｈのプロットを図３３の下段に示す。ＡＮＣに対する蛍光応答の相関係数は０．３２３～０．５８４（ＨＳＡおよびＰＳＡについてはｐ＞０．０１、ＢＳＡについてはｐ＞０．０５）であった。ＡＮＣ＋Ｈに対する蛍光応答の相関係数は０．５８２～０．６８１（全てについてｐ＞０．０１）であった。これらの結果は、カチオン性アミノ酸の割合と疎水性アミノ酸の割合の総和が大きいほど、タンパク質に対するプローブの蛍光応答性が高くなることを意味する。
＜１３．アニオン性プローブによるタンパク質の識別＞
　アニオン性アミノ酸が２０％以上（すなわち、ＡＮＣ≧０．２）、アニオン性アミノ酸と疎水性アミノ酸が５０％以上（すなわち、ＡＮＣ＋Ｈ≧０．５）含まれる、１４～１９アミノ酸からなるペプチドを含んでなる４種類のプローブ（Ｓｅｑ４７～Ｓｅｑ５０）を調製した。これらのプローブの応答性を、タンパク質の種類を変更（ＨＳＡ、ＢＳＡ、Ｈｅｍ、Ｌｙｓ、Ｐａｐ、Ｐｒｏ、ＴｒｙおよびＭｙｏ）した以外は上記４と同様の条件および手順により解析し、比較した。
　測定結果（８タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×２波長セット）のヒートマップを図３４に示す。いずれのプローブもタンパク質に対して応答した。得られた上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図３５に示す。各タンパク質についてのクラスターは、重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、９８％の精度で各タンパク質を識別できることが確認された。これらの結果から、アニオン性プローブでもタンパク質の識別が可能な蛍光パターンを取得できることが示唆された。
＜１４．アニオン性プローブおよびカチオン性プローブの併用＞
　Ｓｅｑ０３（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））およびＳｅｑ１６～Ｓｅｑ１８（１０アミノ酸長、５０％アニオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．５）、５０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．５））の応答性を上記２と同様の条件および手順により解析した。
　測定結果（８タンパク質×１溶媒条件×４プローブ×２波長セット）のヒートマップを図３６に示す。プローブはタンパク質に対して応答を示し、異なるタンパク質ごとに固有の蛍光パターンが得られた。Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ１６によって得られた上記データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図３７に示す。それぞれのプローブ単独の場合は、クラスターの重なりが大きく、ジャックナイフ法に基づく識別精度もそれぞれ７３％および７７％と低い数値を示した。これに対し、Ｓｅｑ０３とＳｅｑ１６の蛍光応答を組み合わせた場合には、クラスターは極めて良好に分離し、識別の精度も１００％に達した。同様に、Ｓｅｑ０３とＳｅｑ１７、Ｓｅｑ０３とＳｅｑ１８を組み合わせた場合にも、高い精度で各タンパク質を識別することができた（図３８）。これらの結果から、ＡＮＣおよびＨが十分に高いアニオン性プローブおよびカチオン性プローブを組み合わせて使用することにより、タンパク質の識別精度を向上させることができることが示唆された。
＜１５．ヌクレオチドの識別＞
　非特異的蛍光ペプチドプローブが６種類のヌクレオチド（ＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ，Ａ１７５２）、ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ，Ａ２７５４）、ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ，Ａ３３７７）、ＴＴＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｔ０２５１）、ＣＴＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｃ１５０６）およびＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ，Ｇ８８７７））を識別できるかを試験した。以下の５種類のプローブを用いた：Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ３６（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））；Ｓｅｑ２１（１８アミノ酸長、２８％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．２８）、３３％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．３３））；およびＳｅｑ２３（２４アミノ酸長、２５％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．２５）、３３％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．３３））。
　Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ２１、Ｓｅｑ２３およびＳｅｑ３６を、２２．２ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２２．２ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．０）に溶解し、１０種類のプローブ溶液（５５５ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４ウェルマイクロプレートに５４μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、励起波長／蛍光波長＝３６０ｎｍ／４８０ｎｍにて蛍光強度（Ｉ０）を測定した。その後、自動分注装置を用いて、ヌクレオチド（各４ｍＭ／純水）を６μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、０．４ｍＭヌクレオチド、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．０））。各測定（６ヌクレオチド×５プローブ×２溶媒条件×１波長セット）を６回反復して行った。
　ヌクレオチドを添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図３９に示す。各プローブの蛍光強度は、ヌクレオチドに応じて異なる変化を示し、異なるヌクレオチドごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図４０に示す。各ヌクレオチドについてのクラスターは、重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、１００％の精度で各ヌクレオチドを識別できることが確認された。
［Ｂ：生物学的試料の分析］
＜１６．馴化培地の分析＞
（１６－１）馴化培地の調製
　ヒト由来細胞株であるＡ５４９細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）、ＨｅＬａ細胞（Ｒｉｋｅｎ　ＢＲＣより分譲）、ＨｅｐＧ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）、ＨｕＨ７細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞（Ｒｉｋｅｎ　ＢＲＣより分譲）の馴化培地を以下の手順により調製した。１０％ＦＢＳ（ＧＥライフサイエンス）および１％のｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＳＮ）（ライフテクノロジーズ）を添加したＤ－ＭＥＭ （高グルコース、Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬）に細胞を懸濁し（２．５×１０４／ｍＬ）、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に１００μＬ／ウェルずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養後、培地を除去し、１００μＬのリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）（富士フイルム和光純薬）で２回洗浄した。８ｍＭのＬ－グルタミンを添加した１×ＣＤ　ＣＨＯ　Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を１００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した。その後、培地を回収し、３０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた培養上清を馴化培地とした。
（１６－２）馴化培地によるプローブの蛍光変化
　Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３（≧４０％カチオン性アミノ酸、≧２０％疎水性アミノ酸）を、４０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、２種類のプローブ溶液（１０００ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４穴マイクロプレートに３０μＬ／ウェルで加えた。その後、純水で種々の濃度に希釈したＡ５４９細胞の馴化培地（３０μＬ）を各ウェルに加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、励起波長３４０ｎｍにおける蛍光スペクトル（蛍光波長５００～６５０ｎｍ）および蛍光強度（蛍光波長５２０ｎｍ）を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、０～３０ｖｏｌ％馴化培地、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。
　０～３０ｖｏｌ％の馴化培地を添加したときのＳｅｑ０１およびＳｅｑ０３の蛍光スペクトル変化を図４１に示す。Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３の蛍光強度は馴化培地の濃度依存的に増大し、かつ、ブルーシフトした。図４２は、蛍光強度（５２０ｎｍ）の変化を示す。Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３の蛍光強度は馴化培地の濃度が３０ｖｏｌ％に至るまで増加し続けた。これらの結果から、非特異的蛍光ペプチドプローブが、馴化培地に応答することが示された。
（１６－３）異なる細胞由来の馴化培地の識別
　Ｓｅｑ０１、Ｓｅｑ０３およびＳｅｑ０５（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））を、２２．２ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２２．２ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、６種類のプローブ溶液（５５５ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、低容量３８４穴ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３８２０）に２２．５μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、上で調製した馴化培地（各１００ｖｏｌ％）を自動分注装置を用いて２．５μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、１０ｖｏｌ％馴化培地、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。対照として、細胞を加えずに上記と同条件にてインキュベートして得た培地を用いた。各測定（６培地×３プローブ×２溶媒条件×２波長セット）を８回反復して行った。
　培地を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図４３に示す。各プローブの蛍光強度は、培地に応じて異なる変化を示し、異なる馴化培地ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図４４に示す。各馴化培地についてのクラスターは、一部を除き重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、９４％の精度で各馴化培地を識別できることが確認された。
＜１７．異なる微生物の識別＞
　本実施例において解析した腸内細菌の情報を表４に示す。大腸菌以外の腸内細菌はＪａｐａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ）およびＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）のカルチャーコレクションから入手した。大腸菌ＤＨ５α株は、ＧＭｂｉｏｌａｂ社から購入した。大腸菌ＪＭ１０９株は、タカラバイオ社から購入した。
　表４．腸内細菌のリスト
　Ｓｅｑ０２およびＳｅｑ０７～Ｓｅｑ０９（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））を、２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１８０ｍＭのＮａＣｌまたは２４ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）＋１８０ｍＭのＮａＣｌに溶解し、８種類のプローブ溶液（１２００ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４ウェルマイクロプレートに５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、励起波長／蛍光波長＝３４０ｎｍ／５２０ｎｍにて蛍光強度（Ｉ０）を測定した。その後、自動分注装置を用いて、細菌懸濁液（各ＯＤ６００＝０．２４／純水）を１０μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：１０００ｎＭプローブ、ＯＤ６００＝０．０４細菌、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（８細菌×４プローブ×２溶媒条件×１波長セット）を６回反復して行った。
　細菌懸濁液を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図４５に示す。各プローブの蛍光強度は、細菌の種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる細菌ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図４６に示す。各細菌についてのクラスターは、重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、１００％の精度で各細菌を識別できることが確認された。
＜１８．腸内微生物叢試料の識別＞
（１８－１）運動不足モデルマウスの作製
　運動不足モデルマウスを作製した。Ｃ３Ｈ－ＨｅＮマウス（オス６週（約４０日）齢、計４匹）を回転輪ケージ（ＳＷ－１５、メルクエスト）において、２２℃、湿度５０％、明期：暗期＝１２時間：１２時間の条件下で、自由に通常の食物と水を与え、２週間にわたり馴化飼育した。その後、各マウスの腹部に運動量計測装置（ｎａｎｏ　ｔａｇ、ＫＩＳＳＥＩ　ＣＯＭＴＥＣ）を埋め込み（－３４日）、各マウスを個別の回転輪ケージに移し（－２４日）、回転輪を開放した状態で飼育した（～０日）。その後、回転輪を固定した状態で一週間飼育し（１～８日）、再び回転輪を開放した状態で飼育し（９～２１日）、その後、回転輪を固定した状態で一週間飼育した（２２～２９日）。運動量計測装置により測定された振動数の積算値をマウスの行動データとして得た。
（１８－２）腸内微生物叢試料の調製
　回転輪を開放してから１２日後（２０日時点）およびその後回転輪を固定してから５日後（２７日時点）に、排泄された糞便を速やかにマイクロチューブに回収し、液体窒素にて凍結した。その後、解析まで－８０℃で保管した。辨野らの報告（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１１，２：２３３）を基にした方法により、凍結糞便から腸内微生物叢試料を調製した。糞便試料を秤量し、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて４０ｍｇ／ｍＬの懸濁液を得た。この懸濁液について、１分間混合し、４℃で５分間静置する処理を複数回繰り返した。その後、８０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を除去した。得られたペレットをＰＢＳにより懸濁し、再度８０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を除去した。得られたペレットをＰＢＳにより懸濁し、ｐｌｕｒｉＳｔｒａｉｎｅｒ（商標）（メッシュサイズ４０μｍ、ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製）により濾過したものを腸内微生物叢試料（０．１６ｍｇ／ｍＬ、０．５ｖｏｌ％ＰＢＳ）とした。
（１８－３）腸内微生物叢試料の解析
　Ｓｅｑ０７～Ｓｅｑ１０およびＳｅｑ１５（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））を、２２．９ｍＭ　ＭＯＰＳ＋１７１．４ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）または２２．９ｍＭ酢酸＋１７１．４ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解し、１０種類プローブ溶液（１１４３ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５２．５μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、励起波長／蛍光波長＝３６０ｎｍ／５３０ｎｍにて蛍光強度（Ｉ０）を測定した。その後、自動分注装置を用いて、上で調製した腸内微生物叢試料を７．５μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：１０００ｎＭプローブ、２０μｇ／ｍＬ腸内微生物叢試料、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸＋１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ５．０））。各測定（８腸内微生物叢試料×２溶媒条件×５プローブ×１波長セット）を６回反復して行った。
　腸内微生物叢試料を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図４７に示す。各プローブの蛍光強度は、腸内微生物叢試料や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる試料ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図４８に示す。各腸内微生物叢試料についてのクラスターは、重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、９６％の精度でマウス個体ならびにそれらの運動制限の有無を識別できることが確認された。以上の結果から、ペプチドプローブを用いて腸内微生物叢懸濁液を解析することにより、動物個体の運動習慣を判定できることが示された。
＜１９．異なる細胞集団の識別＞
　ヒト細胞株であるＡ４３１細胞、ＨＬ６０細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ－７細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞（いずれもＲｉｋｅｎ　ＢＲＣより分譲）を、本発明者らの過去の報告（ＡＣＳ　Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１９；１１（７）：６７５１－６７５８）に基づいて培養し、細胞懸濁液を調製した。Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））を、２３．１ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２３．１ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、６種類のプローブ溶液（５７７ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５２μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、細胞懸濁液（各２．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ純水）を８μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、３００００ｃｅｌｌ／ｍＬ細胞懸濁液、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（５細胞懸濁液×２溶媒条件×２プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　細胞懸濁液を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図４９に示す。各プローブの蛍光強度は、細胞の種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる細胞懸濁液ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図５０に示す。各細胞懸濁液についてのクラスターは、重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、９７％の精度で各細胞懸濁液を識別できることが確認された。
＜２０．異なる産地およびロットのウシ胎児血清の識別＞
　Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））を用いて、オーストラリア産のウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５－０７６－ＣＶ）およびチリ産のウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ，ＦＢ－１３６５／５００）（各２ロット）を分析した。Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ０３を、２３．１ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２３．１ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、４種類のプローブ溶液（５７７ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５２μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、血清（各０．７５ｖｏｌ％／純水）を８μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、０．１０ｖｏｌ％血清、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（４血清×２溶媒条件×２プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　血清を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図５１に示す。各プローブの蛍光強度は、血清の種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる産地およびロットのウシ胎児血清ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図５２に示す。各血清についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、９６％の精度で各ウシ胎児血清を識別できることが確認された。
＜２１．異なる条件で熱処理された血清代替物を含有する培地の識別＞
（２１－１）血清代替物含有培地の調製
　本実施例で用いた培地および試薬を表５に示す。
　表５．培地および試薬
　血清代替物であるＮ－２サプリメント（以下、「Ｎ２」と記載する）およびＢ－２７サプリメント（以下、「Ｂ２７」と記載する）をそれぞれマイクロチューブに分注し、密閉・遮光した状態で、以下の条件にて処理した：４５℃、５５℃、６５℃または７５℃で３０分間。未処理または加熱処理されたＮ２およびＢ２７を用いて、心筋分化誘導培地１（１％のＮ２、２％のＢ２７、１％のＮＥＡＡ、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＰＳおよび０．１ｍＭの２－ＭＥが添加されたＤＭ／Ｆ－１２）（以下、「ＣＤＭ１」と記載する）を調製した。
（２１－２）血清代替物含有培地による分化誘導
　ＨＣＮ４－ＥＧＦＰ＿４０９Ｂ２細胞（Ｒｅｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２０２２；２１：２３９－２４９）（ＨＣＮ４遺伝子座にＥＧＦＰをノックインしたＢＡＣベクターを導入した４０９Ｂ２細胞（ヒトｉＰＳ細胞））をマウス胎児線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ－ＣＭ）に懸濁し、Ｇｅｌｔｒｅｘ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック，Ａ１４１３３０２）上に播種した。翌日、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎおよび３．３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加したＣＤＭ１に培地を交換し、３日目までフレッシュなＣＤＭ１に交換した。４日目に、３．３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および５μＭのＩＷＰ－２を添加したＣＤＭ１に培地を交換した。５日目に、トリプシン処理により細胞を分散して回収し、心筋分化誘導培地２（１％のピルビン酸、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＩＴＳ－Ｇ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭのＬ－アスコルビン酸、１０ｍＭのニコチンアミド、０．２μＭのデキサメサゾン、０．５％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、および１％のＰＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０）（以下、「ＣＤＭ２」と記載する）を用いてＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（商標）９６Ｕ低接着プレートに１×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。その後、２～３日ごとにフレッシュなＣＤＭ２に培地を交換した。１９または２０日目に蛍光顕微鏡（オリンパス，ＩＸ７３）によりＧＦＰ蛍光を観察した。その後、細胞に２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＣＬＳ２）を加え、室温で一晩インキュベートした。細胞を分散して回収し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩセルソーター（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＧＦＰ陽性（すなわちＨＣＮ４陽性）細胞を計測した。ＧＦＰ陽性細胞の定量結果に基づき、ＣＤＭ１の分化誘導性能を評価した。
（２１－３）血清代替物含有培地の識別
　Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ３８（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））、Ｓｅｑ２３（２４アミノ酸長、２５％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．２５）、３３％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．３３））、ならびにＳｅｑ１７（１０アミノ酸長、５０％アニオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．５）、５０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．５））を、２３．１ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２３．１ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、８種類のプローブ溶液（５７７ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５２μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、未処理または加熱処理されたＮ２およびＢ２７を含有するＣＤＭ１（各３．７５ｖｏｌ％ＣＤＭ１／純水）を８μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、０．５０ｖｏｌ％ＣＤＭ１、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（５培地×２溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　ＣＤＭ１を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図５３に示す。各プローブの蛍光強度は、血清代替物の処理条件や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる条件で処理された血清代替物を含有するＣＤＭ１ごとに固有の蛍光パターンが得られた。未処理のＮ２およびＢ２７を含有するＣＤＭ１と比較して、分化誘導性能および蛍光パターンともにほとんど変化しなかった４５℃処理のＣＤＭ１を「Ｇｏｏｄ」、蛍光パターンには大きな変化が見られたが分化誘導性能はほとんど変化しなかった５５℃処理のＣＤＭ１を「Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ」、分化誘導性能がほとんど消失した６５℃および７５℃処理のＣＤＭ１を「Ｕｎａｃｃｅｐｔａｂｌｅ」とラベルし、線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図５４に示す。各性能のクラスターはそれぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、いずれも１００％の精度でＣＤＭ１の分化誘導性能を識別できることが確認された。
＜２２．変性したタンパク質医薬品の識別＞
　アスパラギナーゼ大腸菌由来（シグマ・アルドリッチ）（ＭＷ＝１３８０００，ｐＩ＝４．７）およびコラゲナーゼＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来（シグマ・アルドリッチ）（ＭＷ＝１１００００，ｐＩ＝５．６）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した（０．５ｍｇ／ｍＬ）。アスパラギナーゼ溶液およびコラゲナーゼ溶液をマイクロ遠心チューブに分注し、サーモエレクトリックインキュベーター（Ｇｉｎｇｋｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて５５℃で４時間熱処理した。目視観察および遠紫外線ＣＤスペクトル（Ｊａｓｃｏ　Ｊ－７２０Ｗ分光光度計）に基づき、変性しているが凝集していないタンパク質医薬品試料を得た。
　上記（２１－３）で調製した８種類のプローブ溶液（５７７ｎＭ）を用いた。各プローブ溶液を、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５２μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、未変性または変性したタンパク質医薬品試料（各１５０μｇ／ｍＬ）を８μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、２０μｇ／ｍＬタンパク質、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（４タンパク質医薬品試料×２溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　試料を添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図５５に示す。各プローブの蛍光強度は、タンパク質医薬品の種類、処理条件または溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なるタンパク質医薬品試料ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図５６に示す。各試料についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、１００％の精度で各タンパク質医薬品試料を識別できることが確認された。
＜２３．微生物用ブロスの識別＞
　ＧＡＭ（アキュディアＴＭＧＡＭブイヨン（島津ダイアグノスティクス，０５４２２））、ＬＢ（ＬＢ　Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ（ナカライテスク，２００６８－０４））、ＮＢ（ＢＤ　ＤｉｆｃｏＴＭ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ（ＢＤ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，２３４０００））、およびＲ２Ａ（Ｒ２Ａ　Ｂｒｏｔｈ「ダイゴ」（富士フイルム和光純薬，３９５－０１６８１））を規定量の精製水（ＧＡＭは規定の５倍量の精製水）に溶解し、オートクレーブで滅菌した（１２０℃、１５分間）。
　Ｓｅｑ０１およびＳｅｑ３８（１０アミノ酸長、≧４０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４）、≧２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２））、Ｓｅｑ２３（２４アミノ酸長、２５％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．２５）、３３％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．３３））、ならびにＳｅｑ１７（１０アミノ酸長、５０％アニオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．５）、５０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．５））を精製水に溶解し、プローブ溶液（３０００ｎＭ）を調製した。上で調製したブロスを２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２４ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）で希釈し（各１．２ｖｏｌ％）、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、プローブ溶液を１０μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、１．０ｖｏｌ％ブロス、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（５ブロス×２溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　プローブを添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図５７に示す。各プローブの蛍光強度は、ブロスの種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、ブロスごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図５８に示す。各ブロスについてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、１００％の精度で各ブロスを識別できることが確認された。
＜２４．日本酒の分析＞
　本実施例において解析した日本酒の情報を表１に示す。Ｓ１～Ｓ１２の日本酒は、酒造元／銘柄がそれぞれ異なる。
　表１．日本酒（Ｓ１～Ｓ８）
　上記２３で調製した８種類のプローブ溶液（３０００ｎＭ）を調製した。日本酒を２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２４ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０）で希釈し（各９．６ｖｏｌ％）、自動分注装置を用いて、３８４穴ウェルマイクロプレートに５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーにより、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。その後、自動分注装置を用いて、プローブ溶液を１０μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：５００ｎＭプローブ、８．０ｖｏｌ％日本酒、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．０））。各測定（８日本酒×２溶媒条件×４プローブ×２波長セット）を６回反復して行った。
　プローブを添加する前後の蛍光強度の変化量（蛍光応答）（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップを図５９に示す。各プローブの蛍光強度は、日本酒の種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、日本酒ごとに固有の蛍光パターンが得られた。上記データを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図６０に示す。各日本酒についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、１００％の精度で各日本酒を識別できることが確認された。
［Ａ－２：プローブのキャラクタリゼーション］
＜２５．プローブ性能に対する蛍光団の数の影響＞
　１１～２４アミノ酸からなり、ＡＮＣ≧０．２２かつＨ≧０．０９であるペプチドのＮ末端のアミノ基および中間位置のリジン残基の側鎖アミノ基がダンシル基により修飾されたプローブＳｅｑ５１～５６を調製した。これらのプローブの応答性を、終濃度１０００ｎＭのタンパク質（Ａｎｔ、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＩｇＧ、ＰＳＡおよびＴｒａ）を用いた以外は上記３と同様の条件および手順により測定した：（Ｃｈ１）３６０／４８０。対照には、多様な応答が期待される以下の３つのプローブの組み合わせを用いた：Ｓｅｑ０３（１０アミノ酸長、７０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．７）、２０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．２）、Ｎ末端がダンシル基により修飾されている）；Ｓｅｑ２３（２４アミノ酸長、２５％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．２５）、３３％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．３３）、Ｎ末端がダンシル基により修飾されている）；およびＳｅｑ３５（１０アミノ酸長、３０％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ＝０．３）、５０％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ＝０．５）、Ｎ末端は修飾されておらず、ペプチドの中間位置のリジン残基の側鎖アミノ基がダンシル基により修飾されている）。
　表７．プローブのアミノ酸配列および修飾
　表８．プローブの特性
　測定結果のヒートマップ（６タンパク質×１溶媒条件×９プローブ×１波長セット）を図６１に示す。上記データを、３つのプローブ組み合わせ（組み合わせ１：Ｓｅｑ５１、Ｓｅｑ５２、Ｓｅｑ５３、組み合わせ２：Ｓｅｑ５４、Ｓｅｑ５５、Ｓｅｑ５６、組み合わせ３（対照）：Ｓｅｑ０３、Ｓｅｑ２３、Ｓｅｑ３５）について教師ありの線形判別分析により解析し、第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図６２に示す。組み合わせ１および２では、各タンパク質についてのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。これに対し、組み合わせ３では、ＢＳＡとＰＳＡのクラスターが部分的に重なっており、またクラスター間の相対的な距離も近い傾向があった。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、組み合わせ１および２では、いずれも１００％の精度で各タンパク質を識別できることが確認されたのに対し、組み合わせ３では低い識別精度（９７％）であることが確認された。これらの結果から、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が十分に高いとき、蛍光団の導入数によらずタンパク質の識別が可能な蛍光パターンを取得でき、蛍光団の導入数を増やすことによりタンパク質の識別精度が向上することが示唆された。
＜２６．プローブ性能に対するペプチド長の影響（２）＞
　Ｓｅｑ５７およびＳｅｑ５８（７アミノ酸長、≧４３％カチオン性アミノ酸（すなわち、ＡＮＣ≧０．４３）、≧２９％疎水性アミノ酸（すなわち、Ｈ≧０．２９）、Ｎ末端がダンシル基により修飾されている）をベースとして、Ｃ末端から１アミノ酸短縮したプローブ（Ｓｅｑ５９およびＳｅｑ６０）および２アミノ酸短縮したプローブ（Ｓｅｑ６１およびＳｅｑ６２）を調製した。Ｓｅｑ５９およびＳｅｑ６０：ＡＮＣ≧０．５０、Ｈ≧０．３３；Ｓｅｑ６１およびＳｅｑ６２：ＡＮＣ≧０．６０、Ｈ≧０．２０。これらのプローブの応答性を、終濃度２０００ｎＭのタンパク質（Ａｎｔ、ＢＳＡ、Ｆｉｂ、ＨＳＡ、Ｈｅｍ、Ｍｙｏ、ＰＳＡ、ＴｒｙＢ）を用いた以外は上記３と同様の条件および手順により測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３６０／４８０。
　表９．プローブのアミノ酸配列および修飾
　表１０．プローブの特性
　測定結果のヒートマップ（８タンパク質×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット）を図６３に示す。上記データを３つのプローブ組み合わせ（組み合わせ４：Ｓｅｑ５７、Ｓｅｑ５８、組み合わせ５：Ｓｅｑ５９、Ｓｅｑ６０、組み合わせ６：Ｓｅｑ６１、Ｓｅｑ６２）について教師ありの線形判別分析により解析し、第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果を図６４に示す。いずれの組み合わせにおいても、各タンパク質についてのクラスターは、それぞれ一部を除き重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、それぞれ１００％、９６％、１００％の精度で各タンパク質を識別できることが確認された。これらの結果から、カチオン性アミノ酸および疎水性アミノ酸の割合が十分に高いとき、アミノ酸長を５つまで短縮しても、タンパク質の識別が可能な蛍光パターンを取得できることが示唆された。

Claims (10)

  1. 　（１）プローブ、イオン強度またはｐＨの異なる複数のプローブ溶液を準備するステップと、ここで、前記プローブが、
    　（ａ）３～１００アミノ酸残基からなるペプチドであって、前記ペプチドの（ｉ）絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が０．１５～１．０であり、（ｉｉ）疎水性スコア（Ｈ）が０．０～０．８５であり、かつ（ｉｉｉ）前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）が０．３０～１．０である、ペプチドと、
    　ここで、前記絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が、式（Ｉ）：
    　　ＡＮＣ＝｜ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅ－ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅ｜／ＡＡｔｏｔａｌ　（Ｉ）
    （式中、
    　ＡＡｐｏｓｉｔｉｖｅは、前記プローブ溶液のｐＨにおいて正電荷を有するアミノ酸残基数であり；
    　ＡＡｎｅｇａｔｉｖｅは、前記プローブ溶液のｐＨにおいて負電荷を有するアミノ酸残基数であり；
    　ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である）
    により算出され、
    　前記疎水性スコア（Ｈ）が、式（ＩＩ）：
    　　Ｈ＝ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ／ＡＡｔｏｔａｌ　（ＩＩ）
    （式中、
    　ＡＡｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃは、疎水性アミノ酸残基数であり；
    　ＡＡｔｏｔａｌは、全アミノ酸残基数である）
    により算出され、
    　（ｂ）環境応答性蛍光団と
    を含み、かつ、前記蛍光団が、前記ペプチドに共有結合しているものであり、
    　（２）前記複数のプローブ溶液と分析対象の生物学的試料とを混合するステップと、
    　（３）前記ステップ（２）で調製された混合液の蛍光強度を測定するステップと、
    　（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップと
    を含む、生物学的試料の分析方法。
  2. 　前記ペプチドが５～６０アミノ酸残基からなる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記絶対正味電荷スコア（ＡＮＣ）が０．２０～１．０である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記絶対正味電荷スコアと前記疎水性スコアとの総和（ＡＮＣ＋Ｈ）が０．４０～１．０である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記環境応答性蛍光団が、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団、キサンテン骨格を有する蛍光団、ピレン骨格を有する蛍光団および凝集誘起発光性蛍光団からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記ステップ（３）における蛍光強度の測定が、複数の励起波長および蛍光波長について行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記生物学的試料が細胞またはその培養上清を含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記生物学的試料が血清または血清代替物を含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記生物学的試料が微生物叢を含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記生物学的試料が酒類を含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
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