WO2025242592A2 - Neuartige enzyme zur spaltung aromatischer carbonate - Google Patents

Neuartige enzyme zur spaltung aromatischer carbonate

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WO2025242592A2
WO2025242592A2 PCT/EP2025/063664 EP2025063664W WO2025242592A2 WO 2025242592 A2 WO2025242592 A2 WO 2025242592A2 EP 2025063664 W EP2025063664 W EP 2025063664W WO 2025242592 A2 WO2025242592 A2 WO 2025242592A2
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seq
amino acid
enzyme
acid sequence
formula
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PCT/EP2025/063664
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Kristina Schell
Lukas REISKY
Simone Goebbels
Daniela KNOPP
Gernot Jaeger
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Covestro Deutschland AG
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Covestro Deutschland AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Definitions

  • the present invention describes enzymes and enzyme-based processes for the cleavage of aromatic carbonates.
  • the enzymes are particularly well suited for the cleavage of carbonates based on bisphenol A and can therefore be used for the recovery of bisphenol A from polymers.
  • Polycarbonates characterized by high transparency and impact strength can be obtained through the reaction of phosgene and bisphenol A. Because of these properties, such polycarbonates have found widespread use as glass substitutes, in vehicle construction, and as casings for electronic devices, such as mobile phones. Accordingly, the annual production of these polymers is very high.
  • polycarbonates are thermoplastic, recycling by melting is generally possible. However, this is complicated by the fact that polycarbonates are often mixed with additives to improve their application properties. Separating these additives may be desirable, but is technically challenging. Furthermore, repeated melting of a polycarbonate leads to partial depolymerization, which can release bisphenol A. Due to the harmful properties of bisphenol A, this is undesirable and limits the number of recycling cycles for the polymer. If polycarbonates are used in mixtures with other thermoplastics, the additional problem of separating these mixtures arises during reuse if pure polymers are required.
  • a consensus sequence of the amino acid sequences of all investigated enzymes was generated. This sequence is defined by SEQ ID NO.: 1.
  • the threshold for generating the consensus sequence was set to 100%, meaning that the conserved positions represented in the consensus sequence contain the same amino acid in all investigated enzymes. Given the large number of enzymes tested, it can be assumed that these conserved positions are indeed responsible for the function according to the invention. In contrast, the positions marked with "X" as placeholders for arbitrary amino acids are considered functionally irrelevant.
  • the present invention relates to the use
  • the aromatic carbonate is preferably a compound according to formula (I)
  • RI is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, and any organic residues
  • R2 independently of RI, is selected from the group consisting of hydrogen, a compound according to formula (I) and any organic residues.
  • the carbonate group to which R2 is bonded is located in the para position; more preferably, both substituents, RI and the oxygen of the carbonate group, are located in the para position.
  • cleavage refers to the hydrolytic cleavage of the carbonate group shown in formula (I). This releases a diphenylmethane derivative as an alcohol and a carbonate derivative as a carboxylic acid. Cleavage of the carbonate group at the oxygen atom bearing R2 yields a primary alcohol derived from R2 and a carboxylic acid derived from diphenylmethane. If R2 is hydrogen, carbonic acid is released. If RI is a hydroxyl group, bisphenol A is released.
  • an “aqueous medium” is a solvent mixture that consists of at least 50 wt% water by weight of all solvents present.
  • the study underlying the present invention has shown that the addition of a polar organic solvent to the aqueous medium increases the degradation performance of the enzymes. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the aqueous medium contains between 10 and 50 wt% of at least one polar organic solvent, more preferably 30 to 50 wt%, wherein the mass fractions of all solvents present, including the polar organic solvent, add up to 100%.
  • the aqueous medium consists of 80 wt%, more preferably 90 wt%, and most preferably 95 wt% water and optionally the polar organic solvent, by weight of all solvents present.
  • a “polar organic solvent” is preferably an organic solvent that does not contain carbonate or ester groups and has a log P value of at most 1.3. Preferred polar organic solvents are acetone, acetonitrile, dichloromethane, ethyl acetate, THF and DMF. DMSO is particularly preferred as a polar organic solvent.
  • the enzyme used according to the invention is immobilized. All techniques known to those skilled in the art, such as adsoption, covalent bonding to carrier materials, affinity immobilization, and inclusion immobilization, are suitable for immobilization.
  • the concentration of the aromatic carbonate, in particular the aromatic polycarbonate, in the aqueous medium is preferably 1 mg/l to 1,000 g/l, more preferably 500 mg/l to 500 g/l, even more preferably 100 mg/l to 150 g/l and most preferably 2 g/l to 70 g/l.
  • the enzyme concentration during use is preferably 1 pg/ml to 2,000 pg/ml, more preferably 10 pg/ml to 1,500 pg/ml, even more preferably 30 pg/ml to 1,000 pg/ml and most preferably 70 pg/ml to 600 pg/ml. Concentrations of 120 pg/ml, 250 pg/ml and 500 pg/ml are also conceivable.
  • the compound according to formula (I) is preferably a polycarbonate.
  • polycarbonate preferably refers to polymers obtained by reacting at least one compound selected from the group consisting of bisphenol A, bisphenol S, dihydroxydiphenyl sulfide, tetramethylbisphenol A, 1,1-bis(4-hydroxyphenyl)-3,3,5-trimethylcyclohexane (BPTMC), and 1,1,1-tris(4-hydroxyphenyl)ethane (THPE) with phosgene or diphenyl carbonate.
  • BPTMC 1,1-bis(4-hydroxyphenyl)-3,3,5-trimethylcyclohexane
  • THPE 1,1,1-tris(4-hydroxyphenyl)ethane
  • Such polycarbonates preferably have a number-average molecular weight between 10,000 and 50,000 g/mol, more preferably between 18,000 and 40,000 g/mol.
  • such polycarbonates contain small amounts of tert-butylphenol and/or cumylphenol. These are used as chain terminators in the polymerization.
  • Preferred polycarbonates are those obtainable by reacting bisphenol A with phosgene or diphenyl carbonate. The presence of compounds other than those mentioned above is not excluded, but less preferred. It is preferred that bisphenol A constitutes at least 80 wt.%, preferably at least 90 wt.%, and particularly preferably at least 95 wt.% of the total weight of all hydroxy-functional components of the polycarbonate. Such polycarbonates are preferably defined by formula (II).
  • a compound according to formula (II) is typically obtained by the reaction of bisphenol A and phosgene or by a melt condensation of bisphenol A and diphenyl carbonate.
  • the aromatic polycarbonate is a copolymer of one of the aromatic polycarbonates defined above and at least one polyester.
  • it is a copolymer of a polycarbonate as defined in formula (II) and at least one polyester.
  • the enzymes used according to the invention are capable of degrading polyesters as well as polycarbonates, the degradation of a polycarbonate-polyester copolymer into its monomeric components is possible.
  • Preferred polyesters for the synthesis of such copolymers are polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polypentylene terephthalate, and polyhexylene terephthalate.
  • the compound is according to formula
  • (II) as a component of a mixture of at least two different polymers.
  • Different polymers are understood here to be those cross-linked by different functional groups.
  • the compound according to formula (I) or (II) is therefore present in this embodiment together with at least one polymer that is not a polycarbonate.
  • a polycarbonate as defined above is present as a mixture with at least one polymer selected from the group consisting of polyesters, styrene-acrylonitrile copolymer, and acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer.
  • Polyethylene terephthalate and/or polybutylene terephthalate are preferred as polyesters.
  • a bisphenol A-based polycarbonate is present as a mixture with at least one of the aforementioned polymers.
  • Aromatic polycarbonates can thus be selectively removed from polymer mixtures.
  • non-polycarbonate polymers can be purified in this way. This enables the recovery of pure polymers from polycarbonate-containing polymer mixtures.
  • Enzymes with sequence identities defined elsewhere in this application can be obtained by adding, exchanging, or deleting amino acids.
  • Such enzymes with amino acid sequences that differ from those of SEQ ID NO.: 1 to 10 are also referred to as "variants".
  • Each variant according to the invention is preferably characterized in that it can cleave the carbonate group shown in formula (1) or (1a). This is preferably demonstrated by the release of bisphenol from a polycarbonate obtained by the reaction of bisphenol A and phosgene or by melt condensation of bisphenol A and diphenyl carbonate.
  • an enzyme is used whose amino acid sequence is defined as follows: (i) The amino acid positions of the enzyme homologous to the conserved amino acid positions according to SEQ ID NO.: 1 exhibit at least 90%, more preferably at least 95%, sequence identity with the conserved amino acid positions from SEQ ID NO.: 1, and (ii) the amino acid positions homologous to any amino acid positions from SEQ ID NO.: 1 exhibit at least 70%, preferably at least 80%, sequence identity with the homologous amino acid positions of one of the amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, and 10.
  • the arbitrary amino acid positions exhibit the aforementioned sequence identities with SEQ ID NO.: 3 or 8.
  • the enzyme in this embodiment is characterized in that its functionally important amino acid positions have a high degree of similarity to the consensus sequence, while the non-conserved and functionally less relevant positions with greater sequence deviation are derived from one of the enzymes identified as active in the study underlying this application.
  • the variant defined above by SEQ ID NO.: 2 is characterized by a sequence identity of at least 74%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferably at least 90%, and most preferably at least 95%.
  • the variant defined above of an enzyme defined by SEQ ID NO.: 7 is characterized by a sequence identity of at least 90% and preferably at least 95%.
  • the present invention relates to the use of an enzyme having an amino acid sequence as defined in SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 29 or 30, or a variant of one of the aforementioned enzymes with at least 85% sequence identity to one of the aforementioned sequences, for the cleavage of an aromatic carbonate in an aqueous medium. All the definitions of aromatic carbonate given above also apply to this embodiment.
  • the present invention relates to the use of an enzyme having an amino acid sequence as defined in SEQ ID NO.: 3, 8, 7, 9, 5 or 27, or a variant of one of the aforementioned enzymes with at least 85% sequence identity to one of the aforementioned sequences, for the cleavage of an aromatic carbonate in an aqueous medium. All the above-mentioned definitions for the aromatic carbonate also apply to this embodiment.
  • the present invention relates to the use of an enzyme having an amino acid sequence as defined in SEQ ID NO. 3 or 8, or a variant of one of the aforementioned enzymes with at least 85% sequence identity to one of the aforementioned sequences, for the cleavage of an aromatic carbonate in an aqueous medium. All the above-mentioned definitions for the aromatic carbonate also apply to this embodiment.
  • a variant is preferably obtained from the amino acid sequences according to the invention by adding, deleting, or exchanging the respective defined proportion of the amino acids contained in the respective enzyme.
  • the basis for calculating the sequence identity is preferably the amino acid sequence defined by SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, TI, 29, or 30. It is known to those skilled in the art that fusion proteins are formed by enzymes with other proteins without this affecting the activity of the enzyme. Therefore, the term "variant” also includes amino acid sequences derived from the polypeptides defined by SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, TI, 29, or 30, which are fused at the N-terminus and/or the C-terminus with other proteins, e.g., the Green Fluorescent Protein.
  • Particularly preferred variants of the enzymes according to the invention are obtained by adding, deleting, or exchanging up to 20, preferably up to 10, and even more preferably up to 5 amino acids of the disclosed sequences.
  • the aforementioned modifications can be carried out continuously or discontinuously at any desired position of the polypeptide in question. Preferably, however, they are carried out only at the N-terminus and/or the C-terminus of the polypeptide.
  • the enzymes, together with the compound according to formula (I) are incubated in the aqueous medium defined above in this application, preferably at a temperature between 15 and 80 °C, more preferably between 20 and 75 °C, and particularly preferably between 30 and 70 °C.
  • the pH is preferably between 5 and 10.
  • the polypeptide defined by SEQ ID No. 3 and its variants exhibit two pH optima, one at pH 7 and one at pH 9. Further details regarding the reaction conditions particularly suitable for the enzymes used according to the invention are given in the exemplary embodiments.
  • the present invention relates to a method for cleaving a carbonate bond in a compound according to formula (I) comprising the process steps a) providing an aqueous medium containing a mixture containing at least one compound according to formula (I) and
  • This process is particularly suitable for the cleavage of the polycarbonates characterized by formula (II).
  • these compounds are cleaved into fragments with lower molecular weight. Preferably, they are degraded to carbonic acid and bisphenol A.
  • process step b) is carried out until at least 30 wt.%, preferably at least 50 wt.%, more preferably at least 70 wt.%, and most preferably at least 90 wt.% of the total mass of the compound present at the beginning of process step b) according to formula (II) has been degraded to bisphenol A and carbonic acid.
  • Bisphenol A is released during the degradation of a compound according to formula (II) by the process defined above. Therefore, in a further embodiment, the present invention relates to a process for the production of bisphenol A comprising the steps a) providing an aqueous medium containing a mixture containing at least one compound according to formula (I) and
  • process step b bisphenol A is released. Therefore, this is a process for recovering bisphenol A from polycarbonates, i.e., a recycling process.
  • Process step b) is preferably carried out until at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 50 and even more preferably at least 70 wt.% of the bisphenol A bound at the beginning in the total mass of the compound according to formula (II) used is released.
  • the above-defined process for the production of bisphenol A includes a further process step for separating bisphenol A from the mixture obtained by incubation in process step b). This can advantageously be achieved by extracting the released bisphenol A with an organic solvent, preferably toluene. After phase separation, the bisphenol A can then be easily crystallized by lowering the temperature.
  • the present invention relates to the use of an enzyme.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a)
  • the aromatic carbonate is preferably a compound according to formula (I) (I)
  • RI is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, and any organic residues
  • R2 independently of RI, is selected from the group consisting of hydrogen, a compound according to formula (I) and any organic residues.
  • the present invention relates to a kit containing a)
  • the kit additionally contains at least one aqueous medium.
  • the aromatic carbonate is preferably a compound according to formula (I)
  • RI is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, and any organic residues
  • R2 independently of RI, is selected from the group consisting of hydrogen, a compound according to formula (I) and any organic residues.
  • Figure 1 visualizes the sequence similarity of the enzymes investigated in the study underlying this invention.
  • E. coli Escherichia coli
  • E. coli BL21 (DE3) cells transformed with the plasmid construct 4.5 ml of LB medium containing 1% w/v glucose and 50 pg/ml kanamycin were inoculated from a glycerol stock culture and incubated overnight at 37 °C and 200 rpm.
  • 200 ml of ZYP-5052 autoinduction medium containing 50 pg/ml kanamycin were inoculated with 0.1% freshly grown cells and incubated at 37 °C and 200 rpm for 5 h in baffled flasks. Expression was performed overnight at 20 °C and 200 rpm. The cells were harvested at 4 °C for 10 min at 8000 x g.
  • the harvested cells for the initial screening were resuspended in 6 ml of ammonium acetate buffer (20 mM ammonium acetate, 0.4% w/v n-dodecyl- ⁇ -maltoside, 1% w/v lysozyme, and 1 pl/ml benzoase) and incubated for 30 min at room temperature with shaking to lyse the cells.
  • Harvested cells expressing BhrPETase, DuraPETase, ThcCutl-ACCG, SvCutl90*SS, LCC-ICCG, and LCC-WCCG for the initial screening were resuspended in 10 ml of 20 mM KPi buffer, pH 7.5.
  • Cells for enzyme purification were resuspended in 15 ml of lysis buffer (50 mM NaH2PO4 , 300 mM NaCl , and 10 mM imidazole).
  • the cells were lysis twice using ultrasound (Bandelin Sonoplus HD, Sonotrode MS73, Berlin, Germany) under constant cooling in an ice bath for 2 min (50% cycle).
  • the resulting suspension was centrifuged at 10,000 x g and 4 °C for 20 min.
  • the supernatant was filtered through a 0.2 pm PES filter.
  • Lyophilization of the cell lysate The supernatant of cells expressing BhrPETase, DuraPETase, ThcCutl-ACCG, SvCutl90*SS, LCC-ICCG, and LCC-WCCG, as well as the lysate of the other cells for the initial screening, containing all cell components, were frozen at -80 °C and lyophilized for 3 days at -68 °C and 0.1 mBar. The lyophilized cells were stored at -4 °C.
  • the His-tagged enzymes were purified by IMAC affinity chromatography.
  • the columns were packed with the required column volume of Ni-NTA (HisPurTM Ni-NTA Resin, Fisher Scientific, Rockford, USA) and equilibrated with 8 column volumes (CV) of lysis buffer.
  • the filtered lysate was loaded onto the column.
  • 10 CV of wash buffer 50 mM NaHjPC, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole
  • the specifically bound His-tagged enzyme was eluted in elution buffer (50 mM NaHjPC, 300 mM NaCl, and 250 mM imidazole, pH 8).
  • the proteins were concentrated to 2.5 ml using Amicon® ultracentrifugal filters (10 kDa MWCO).
  • the proteins were desalted using the Gravity protocol for PD-10 columns according to the manufacturer's instructions and stored in 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.5.
  • Enzyme expression and protein purity were investigated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). 14 ⁇ l of the lysed cell suspension, the supernatant after centrifugation, or the purified enzyme solution were mixed with 7 ⁇ l of 3x Reducing Blue Protein Loading Dye. The solutions were incubated for 5 min at 95 °C. 10 ⁇ l of the samples, along with 3 ⁇ l of EZ-Run® Prestained Rec Protein Ladder, were loaded onto a pre-poured NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel. The proteins were separated electrophoretically at a constant voltage of 200 V for 35–40 min. The gels were stained for 1 h with 30–50 ml of Roti BlueQuick ready-to-use staining solution.
  • Protein concentration was determined colorimetrically using the Bradford assay. A standard BSA curve of 125–1000 pg/ml was prepared. The enzyme was diluted with potassium phosphate buffer (pH 7.5) if necessary. 250 ml of Quick Start Bradford reagent (lx) were added to 5 ⁇ L of BSA and enzyme solution. After 5 min incubation, the absorbance was measured at 595 nm.
  • BPA-PC (Makrolon 2408, Covestro GmbH AG) was milled to 500 pm before use.
  • Initial screening for hydrolysis of BPA-PC was performed using a spatula tip of lyophilized enzyme (commercially or internally heterologously expressed) dissolved in 200 pl potassium phosphate buffer (50 mM KPi, 100 mM NaCl pH 7.5) and a spatula tip of BPA-PC.
  • the reactions were The reactions were incubated at 40 °C, 50 °C, 60 °C, and 70 °C at 800 rpm for 146 h.
  • purified enzyme was used for poorly expressed enzymes in the lyophilisate.
  • HPLC measurements were performed on an Agilent 1260 Infinity IL system (Santa Clara, USA).
  • the LC system was equipped with a multisampler (G7167A), a DAD (diode array detector) for UV and visible light, and a Zorbax Eclipse Plus C18 column (4.6 mm x 150 mm, 5 pm, Agilent, Santa Clara, USA).
  • a multisampler G7167A
  • DAD diode array detector
  • Zorbax Eclipse Plus C18 column 4.6 mm x 150 mm, 5 pm, Agilent, Santa Clara, USA.
  • 5 pl of sample was injected, and the column was heated to 40 °C.
  • the flow rate was 1.0 ml/min.
  • Table 2 The method developed for the analysis and quantification of the BPA-PC hydrolysis reaction is shown in Table 2.
  • the data were analyzed using Chromeeon Chromatography Data System 7.3.1 software (Thermo Scientific, Waltham, USA).
  • a ClustalW alignment of the amino acid sequences of BPA-PC hydrolyzing enzymes was used to calculate consensus sequences with 100% and 85% thresholds.
  • Two phylogenetic groups of BPA-PC hydrolyzing enzymes were used to determine sequence similarity.
  • BPA-PC The hydrolysis of BPA-PC to BPA was tested using the enzymes listed in the table. Of the 26 enzymes tested, 10 hydrolyzed BPA-PC. Enzymes numbered 15-27 are commercially available. Furthermore, the cutinase from Humicola insolens, obtained as Novozym® 51032, also demonstrated hydrolysis of BPA-PC. This enzyme has an amino acid sequence as defined by SEQ. ID NO.: 27 (Ternström et al. (2005) “Unfolding and inactivation of cutinases by AOT and guanidine hydrochloride”, Biochimica et Biophysika Acta, 1748: 74-83).
  • the BPA-PC hydrolyzing enzymes were purified and analyzed for BPA-PC conversion (Table 3). At 70 °C in 100 mM bis(tris(hydroxymethyl)methylamino)propane at pH 7 with ThcCutl-ACCG or pH 9 for LCC, LCC-ICCG, and LCC-WCCG, conversions of 16.8–33.2% were determined. The addition of DMSO was tested with the two best variants, ThcCutl-ACCG and LCC-ICCG. Adding 20–50% DMSO to the reaction with ThcCutl resulted in 100% conversion to BPA. With LCC-ICCG, the conversion to 92.9% BPA was highest with the addition of 30% DMSO.
  • the obtained phylogeny shows the close relationship of the enzymes.
  • the cluster of BPA-PC hydrolyzing enzymes shares a common ancestor with IsPETase, PET2, and PET6. No BPA-PC hydrolysis was detectable in the latter enzymes. Therefore, this function evolved later.
  • two groups can be distinguished. One group contains ThcCutl, ThcCutl-ACCG, TfCut2, SvCutl90*SS, and PesHl (Group 1).
  • the other group contains LCC, LCC-ICCG, LCC WGGC, and BhrPETase (Group 2).
  • the consensus sequence was calculated with a 100% threshold (SEQ ID NO: 1) and an 85% threshold (SEQ ID NO: 28).
  • the amino acid sequence shows higher sequence variability at the C-terminus compared to the N-terminus.
  • sequence similarity the number of identical and similar amino acid positions was added together. Then, the percentage of this sum was calculated relative to the total number of amino acid positions in the alignment.
  • Aromatic residues phenylalanine, tyrosine, tryptophan
  • Acidic, amide-containing residues and proline aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine,
  • the percentage of identical amino acid positions was calculated based on the total number of amino acid positions in the alignment.
  • Kubu-P M12 and the consensus sequence defined by SEQ ID NO.: 1 have a sequence similarity of 87% according to the criteria defined above.
  • the sequence identity determined according to the criteria defined above is 24%. After 120 hours at 70°C, a conversion of 10.1% was observed in a mixture of water and DMSO containing 30% DMSO by volume.
  • Mipa-P M19 and the consensus sequence defined by SEQ ID NO.: 1 have a sequence similarity of 87% according to the criteria defined above.
  • the sequence identity determined according to the criteria defined above is 26%. After 120 hours at 70°C, a conversion of 20.6% was observed in a mixture of water and DMSO containing 30% DMSO by volume (based on the total weight of the mixture).
  • lyophilized crude lysate (commercially acquired or heterologously expressed enzyme) was dissolved in 400 pl KPi buffer (50 mM potassium phosphate, 100 mM NaCl pH 7.5). 5 mg/ml substrate solutions of dimethyl carbonate (DMC), benzyl(4-nitrophenyl) carbonate (BNPC), and diphenyl carbonate (DPC) were prepared in DMSO.
  • DMC dimethyl carbonate
  • BNPC benzyl(4-nitrophenyl) carbonate
  • DPC diphenyl carbonate
  • BNPC and DPC The hydrolysis of BNPC and DPC was determined using 100 ⁇ L of the dissolved lysate mixed with 350 ⁇ L of KPi buffer and 50 ⁇ L of substrate solution. Approximately 0.1 mg/mL of phenol red was added for DPC. Samples were incubated for 20 h at 20 °C or at 20 °C followed by 40 °C, 800 rpm, for BNPC and DPC, respectively.
  • the hydrolysis product of BNPC is p-nitrophenol (pNP), which was determined spectrophotometrically at 410 nm. The presence of pNP was confirmed. A standard pNP curve was used as a reference.
  • a change in color was considered an indication of degradation, without quantifying it.
  • results show that the tested selection of enzymes was able to cleave even low-molecular-weight carbonates. This result is likely also applicable to all other enzymes that can degrade polycarbonate, since low-molecular-weight substrates are more readily accessible to the enzyme than polymers.
  • results show that the tested selection of enzymes was able to cleave even low-molecular-weight carbonates. This result is likely also applicable to all other enzymes that can degrade polycarbonate, since low-molecular-weight substrates are more accessible to the enzyme than polymers. ...

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt Enzyme und enzymbasierte Verfahren zur Spaltung von aromatischen Carbonaten. Die Enzyme sind besonders gut zur Spaltung von Carbonaten auf Basis von Bisphenol A geeignet und können deswegen zur Wiedergewinnung von Bisphenol A aus Polymeren genutzt werden.

Description

Neuartige Enzyme zur Spaltung aromatischer Carbonate
Die vorliegende Erfindung beschreibt Enzyme und enzymbasierte Verfahren zur Spaltung von aromatischen Carbonaten. Die Enzyme sind besonders gut zur Spaltung von Carbonaten auf Basis von Bisphenol A geeignet und können deswegen zur Wiedergewinnung von Bisphenol A aus Polymeren genutzt werden.
Durch die Reaktion von Phosgen und Bisphenol A können Polycarbonate erhalten werden, die sich durch hohe Transparenz und Schlagzähigkeit auszeichnen. Wegen dieser Eigenschaften haben derartige Polycarbonate weite Anwendung als Glasersatz, im Fahrzeugbau und als Hüllen von elektronischen Geräten, z.B. von Mobiltelefonen, gefunden. Entsprechend hoch ist die Jahresproduktion dieser Polymere.
Da Polycarbonate thermoplastisch sind, ist grundsätzlich ein Recycling durch Aufschmelzen möglich. Erschwert wird dies aber durch den Umstand, dass Polycarbonate häufig mit Additiven versetzt werden, um ihre anwendungstechnischen Eigenschaften zu verbessern. Eine Abtrennung dieser Additive kann wünschenswert sein, ist technisch aber schwierig. Zudem führt wiederholtes Aufschmelzen eines Polycarbonats zu einer teilweisen Depolymerisierung, wobei Bisphenol A freigesetzt werden kann. Wegen der gesundheitsschädlichen Eigenschaften von Bisphenol A ist dies unerwünscht und beschränkt die Anzahl der Recycling-Zyklen des Polymers. Wenn Polycarbonate in Mischungen mit anderen Thermoplasten verwendet werden, stellt sich bei der Wiederverwendung zusätzlich das Problem der Trennung dieser Gemische, wenn für die Weiterverwendung reine Polymere gewünscht sind.
Aus diesem Grund besteht ein erheblicher Bedarf nach weiteren Verfahren, mit denen Polycarbonate rezykliert werden können. Ein von anderen Polymeren gut bekannter Ansatz ist der gezielte Abbau des Polymers mit Hilfe von Enzymen, um unter schonenden Reaktionsbedingungen gut definierte Chemierohstoffe wiederzugewinnen. Dies ist z.B. bei Polyurethanen (EP 3 587 570) und Polyethylenterephthalat bereits gezeigt worden (Tournier (2020) „An engineered PET depolymerase to break down and recycle plastic bottles", Nature 580: 216-219. Auch für aliphatische Polycarbonate ist dies möglich (Suyama & Tokiwa (1997), „Enzymatic degradation of an aliphatic polycarbonate, poly(tetramethylene carbonate)", Enzyme and Microbial Technology, 20: 122-126").
Für die wegen ihrer umfangreichen Anwendung technisch und wirtschaftlich sehr wichtigen aromatischen Polycarbonate, insbesondere solche, die auf Bisphenol A basieren, sind technisch sinnvolle enzymatische Abbauverfahren bisher noch nicht beschrieben. Die Freisetzung von Bisphenol A aus solchen Verbindungen durch ein Bakterium, Pseudoxanthomonas sp., ist beschrieben worden (Yue et. al. (2021), „Biodegradation of bisphenol-A polycarbonate plastic by Pseudoxanthomonas sp. strain NY3600" Journal of Hazardous Materials, 416: 125775). Allerdings wurde nicht gezeigt, welche Enzyme für den Abbau verantwortlich sind. Es ist noch nicht einmal klar, ob es sich ein einziges Enzym oder um einen Enzymkomplex handelt. Für die technische Anwendung eines Recyclingverfahrens sind klar definierte und isolierte Enzyme aber wegen ihrer besser kontrollierbaren Eigenschaften vorzuziehen. Es wurde beschrieben (Artham et al. (2011), „Mechanistic investigations of lipase- catalyzed degradation of polycarbonate in organic solvents", Enzyme and Microbial Technology, 48: 71-79), dass Lipasen wie sie z.B. in Candidada rugosa oder Candida antarctica gefunden werden, Bisphenol A aus Polycarbonaten freisetzen. Es hat sich allerdings gezeigt, dass diese Reaktion von den dort eingesetzten Enzymen nicht in wässrigem Medium katalysiert wird. Der enzymatische Abbau von aromatischem Polycarbonat in organischen Lösungsmitteln wurde auch an anderer Stelle berichtet (Sivalingam & Madras (2004) „Dynamics of Lipase Catalyzed Enzymatic Degradation of Poly(bisphenol- A carbonate), Journal of Polymer Science, 91: 2391-2396).
In der der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Studie wurden erstmals Enzyme identifiziert, welche die Freisetzung von Bisphenol A aus aromatischen Polycarbonaten in wässrigen Medien ermöglichen. Alle Enzyme mit dieser katalytischen Fähigkeit weisen ein hohes Maß an Sequenzidentität auf. Alle getesteten Enzyme aus dieser Gruppe zeigten - wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß - die gewünschte Aktivität.
Um die Aminosäurepositionen zu identifizieren, die für die Aktivität entscheidend sind, wurde eine Konsensussequenz der Aminosäuresequenzen aller untersuchten Enzyme erstellt. Diese ist durch SEQ ID NO.: 1 definiert. Der Schwellenwert bei der Erstellung der Konsensussequenz wurde auf 100 % gesetzt, d.h. die in der Konsensussequenz dargestellten konservierten Positionen enthalten in allen untersuchten Enzymen dieselbe Aminosäure. Angesichts der großen Anzahl getesteter Enzyme ist davon auszugehen, dass es tatsächlich diese konservierten Positionen sind, die für die erfindungsgemäße Funktion verantwortlich sind. Demgegenüber wird davon ausgegangen, dass die mit „X" als Platzhalter für beliebige Aminosäuren gekennzeichneten Positionen funktionell irrelevant sind.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung
(a) eines Enzyms, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(b) eines Enzyms, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; zur Spaltung eines aromatischen Carbonats in einem wässrigen Medium.
Das aromatische Carbonat ist bevorzugt eine Verbindung gemäß Formel (I)
Wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und
R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Verbindung gemäß Formel (I) und beliebigen organischen Resten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung befindet sich die Carbonatgruppe, an die R2 gebunden ist, in der para-Position, stärker bevorzugt, befinden sich beide Substituenten, RI und der Sauerstoff der Carbonatgruppe, in der para-Position. Dies ist in Formel (la) gezeigt. Der Begriff „Spaltung" bezieht sich auf die hydrolytische Spaltung der in Formel (I) dargestellten Carbonatgruppe. Hierbei wird ein Diphenylmethan-Derivat als Alkohol und ein Derivat des Carbonats als Carbonsäure freigesetzt. Bei Spaltung der Carbonatgruppe am Sauerstoffatom, das R2 trägt, entsteht ein von R2 abgeleiteter primärer Alkohol und eine von Diphenylmethan abgeleitete Carbonsäure. Wenn R2 Wasserstoff ist, so wird Kohlensäure freigesetzt. Wenn RI eine Hydroxylgruppe ist, so wird Bisphenol A freigesetzt.
Ein „wässriges Medium" ist ein Lösungsmittelgemisch, das bezogen auf das Gesamtgewicht aller anwesenden Lösungsmittel zu wenigstens 50 Gew.-% aus Wasser besteht. Die Studie, die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, hat gezeigt, dass die Zugabe eines polaren organischen Lösungsmittels zum wässrigen Medium die Abbauleistung der Enzyme erhöht. Deswegen enthält das wässrige Medium in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zwischen 10 und 50 Gew.-% wenigstens eines polaren organischen Lösungsmittels, stärker bevorzugt 30 bis 50 Gew.-%, wobei sich die Massenanteile aller anwesenden Lösungsmittel inklusive des polaren organischen Lösungsmittels zu 100 % addieren. Es ist besonders bevorzugt, dass das wässrige Medium bezogen auf die Gesamtmasse aller anwesenden Lösungsmittel zu 80 Gew.-%, stärker bevorzugt zu 90 Gew.-% und am stärksten bevorzugt zu 95 Gew.-% aus Wasser und optional dem polaren organischen Lösungsmittel besteht. Ein „polares organisches Lösungsmittel" ist vorzugsweise ein organisches Lösungsmittel, das keine Carbonat- oder Estergruppen enthält und einen log P-Wert von höchstens 1,3 hat. Bevorzugte polare organische Lösungsmittel sind Aceton, Acetonitril, Dichlormethan, Ethylacetat, THF und DMF Besonders bevorzugt ist DMSO als polares organisches Lösungsmittel.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das erfindungsgemäß verwendete Enzym immobilisiert vor. Zur Immobilisierung sind alle dem Fachmann geläufigen Techniken wie Adsoption, kovalente Bindung and Trägermaterialien, Affinitätsimmobilisation und Einschlussimmobilisation geeignet.
Die Konzentration des aromatischen Carbonats, insbesondere des aromatischen Polycarbonats im wässrigen Medium beträgt vorzugsweise 1 mg/l bis 1.000 g/l, stärker bevorzugt 500 mg/l bis 500 g/l, noch stärker bevorzugt 100 mg/l bis 150 g/l und am stärksten bevorzugt 2 g/l bis 70 g/l.
Die Enzymkonzentration bei der Verwendung beträgt vorzugsweise 1 pg/ml bis 2.000 pg/ml, stärker bevorzugt 10 pg/ml bis 1.500 pg/ml, noch stärker bevorzugt 30 pg/ml bis 1.000 pg/ml und am stärksten bevorzugt 70 pg/ml bis 600 pg/ml. Konzentrationen von 120 pg/ml, 250 pg/ml und 500 pg/ml sind ebenfalls denkbar. Bevorzugt handelt es sich bei der Verbindung gemäß Formel (I) um ein Polycarbonat. Der Begriff „Polycarbonat" bezeichnet vorzugsweise Polymere, die durch Reaktion wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisphenol A, Bisphenol S, Dihydroxydiphenylsulfid, Tetramethylbisphenol A, l,l-Bis(4-hydroxyphenyl)-3,3,5-trimethylcyclohexan (BPTMC) und 1,1,1- Tris(4-hydroxyphenyl)-ethan (THPE) mit Phosgen oder Diphenylcarbonat erhältlich sind. Derartige Polycarbonate haben vorzugsweise ein zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 10.000 und 50.000 g/mol, bevorzugt zwischen 18.000 und 40.000 g/mol. Optional enthalten derartige Polycarbonate geringe Anteile von tert-Butylphenol und/oder Cumylphenol. Dieser werden in der Polymerisation als Kettenabbrecher verwendet.
Bevorzugte Polycarbonate sind solche, die durch Reaktion von Bisphenol A mit Phosgen oder Diphenylcarbonat erhältlich sind. Hierbei ist die Anwesenheit weiterer als der oben genannten Verbindungen nicht ausgeschlossen, aber weniger bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass Bisphenol A wenigstens 80 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% und besonders bevorzugt wenigstens 95 Gew.-% des Gesamtgewichts aller hydroxyfunktionellen Aufbaukomponenten des Polycarbonats ausmacht. Derartige Polycarbonate werden vorzugsweise durch Formel (II) definiert.
Eine Verbindung gemäß Formel (II) wird typischerweise durch die Reaktion von Bisphenol A und Phosgen oder durch eine Schmelzkondensation von Bisphenol A und Diphenylcarbonat erhalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das aromatische Polycarbonat ein Copolymer aus einem der oben definierten aromatischen Polycarbonate und wenigstens einem Polyester. Bevorzugt ist es ein Copolymer aus einem Polycarbonat wie in Formel (II) definiert und wenigstens einem Polyester. Da die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme in der Lage sind, Polyester ebenso abzubauen wie Polycarbonate, ist ein Abbau eines Polycarbonat-Polyester-Copolymers in seine monomeren Bestandteile möglich. Bevorzugte Polyester zum Aufbau derartiger Copolymere sind Polyethylenterephthalat, Polybutylenterephthalat, Polypentylenterephthalat und Polyhexylenterephthalat. Um die Zugänglichkeit der Verbindung gemäß Formel (I), (la) oder des aromatischen Polycarbonats, insbesondere des Polycarbonats gemäß Formel (II), für das Enzym zu erhöhen, wenn diese Verbindung als Feststoff vorliegt, können alle gängigen Verfahren eingesetzt werden, insbesondere das Mahlen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Verbindung gemäß Formel
(I), (la) oder das aromatische Polycarbonat, insbesondere das aromatische Polycarbonat gemäß Formel
(II) als Bestandteil einer Mischung aus wenigstens zwei unterschiedlichen Polymeren vor. Als unterschiedlich werden hier Polymere verstanden, die durch unterschiedliche funktionelle Gruppe vernetzt sind. Die Verbindung gemäß Formel (I) oder (II) liegt also in dieser Ausführungsform zusammen mit wenigstem einem Polymer vor, das kein Polycarbonat ist. Bevorzugt liegt in dieser Ausführungsform ein Polycarbonat wie oben definiert als Gemisch mit wenigstens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyestern, Styrol-Acrylnitril-Copolymer und Acrylnitril- Butadien-Styrol-Copolymer vor. Hierbei sind Polyethylenterephthalat und/oder Polybutylenterephthalat als Polyester bevorzugt. Es ist besonders bevorzugt, dass ein auf Bisphenol A basierendes Polycarbonat mit wenigstens einem der vorgenannten Polymeren als Gemisch vorliegt.
So ist es möglich, das Polycarbonat gezielt enzymatisch abzubauen, während das weitere oder die weiteren Polymere im Gemisch nicht angegriffen werden. Auf diese Art lassen sich aromatische Polycarbonate gezielt aus Polymergemischen entfernen. Umgekehrt werden auf diese Weise Polymere, die keine Polycarbonate sind, aufgereinigt. Dies ermöglicht die Rückgewinnung sortenreiner Polymere aus polycarbonathaltigen Polymergemischen.
Tabelle 1: Aminosäuresequenzen der genutzten Enzyme * Da die Enzyme von kommerziellen Anbietern bezogen wurden, ist nicht mit absoluter Sicherheit zu sagen, ob ihre Aminosäuresequenz zu den aus öffentlichen Datenbanken bezogenen Sequenzen identisch waren.
Enzyme mit den an anderer Stelle in dieser Anmeldung definierten Sequenzidentitäten zu den durch SEQ ID NO.: 2 bis SEQ ID NO.: 10 definierten Enzymen bzw. zu der durch SEQ ID NO.: 1 definierten Konsensussequenz können durch Hinzufügung, Austausch oder Deletion von Aminosäuren erhalten werden. Solche Enzyme mit Aminosäuresequenzen die von SEQ ID NO.: 1 bis 10 abweichen, werden auch als „Varianten" bezeichnet". Jede erfindungsgemäße Variante ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie die in Formel (I) oder (la) dargestellte Carbonatgruppe spalten kann. Dies wird vorzugsweise durch Freisetzung von Bisphenol aus einem durch die Reaktion von Bisphenol A und Phosgen oder durch Schmelzkondensation von Bisphenol A und Diphenylcarbonat erhaltenen Polycarbonats nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Enzym verwendet, dessen Aminosäuresequenz wie folgt definiert ist: (i) Die zu den konservierten Aminosäurepositionen gemäß SEQ ID NO.: 1 homologen Aminosäurepositionen des Enzyms weisen wenigstens 90 %, stärker bevorzugt wenigstens 95 % Sequenzidentität zu den konservierten Aminosäurepositionen aus SEQ ID NO.: 1 auf und (ii) die zu den beliebigen Aminosäurepositionen aus SEQ ID NO.: 1 homologen Aminosäurepositionen weisen wenigstens 70 %, bevorzugt wenigstens 80 % Sequenzidentität zu den homologen Aminosäurepositionen einer der Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9 und 10 auf. Bevorzugt weisen die beliebigen Aminosäurepositionen hierbei die vorgenannten Sequenzidentitäten zu SEQ ID NO.: 3 oder 8 auf.
Mit anderen Worten ist das Enzym in dieser Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, dass seine funktionell bedeutsamen Aminosäurepositionen eine hohe Übereinstimmung mit der Konsensussequenz aufweisen, während die nicht konservierten und funktionell weniger relevanten Positionen mit größerer Sequenzabweichung von einem der in der dieser Anmeldung zugrunde liegenden Studie als aktiv identifizierten Enzymen abgeleitet ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die weiter oben definierte Variante eines durch SEQ ID NO.: 2 definierten Enzyms durch eine Sequenzidentität von wenigstens 74 %, bevorzugt wenigstens 80 %, stärker bevorzugt wenigstens 85 %, noch stärker bevorzugt wenigstens 90 % und am stärksten bevorzugt wenigstens 95 % gekennzeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die weiter oben definierte Variante eines durch SEQ ID NO.: 7 definierten Enzyms durch eine Sequenzidentität von wenigstens 90 % und bevorzugt wenigstens 95 % gekennzeichnet. In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzyms, das eine Aminosäuresequenz hat wie in SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7 , 9, 10, TI, 29 oder 30 definiert oder einer Variante eines der vorgenannten Enzyme mit wenigstens 85 % Sequenzidentität zu einer der vorgenannten Sequenzen zur Spaltung eines aromatischen Carbonats in einem wässrigen Medium. Alle oben gegebenen Definitionen für das aromatische Carbonat gelten auch für diese Ausführungsform.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzyms, das eine Aminosäuresequenz hat wie in SEQ ID NO.: 3, 8, 7, 9, 5 oder 27 definiert oder einer Variante eines der vorgenannten Enzyme mit wenigstens 85 % Sequenzidentität zu einer der vorgenannten Sequenzen zur Spaltung eines aromatischen Carbonats in einem wässrigen Medium. Alle oben gegebenen Definitionen für das aromatische Carbonat gelten auch für diese Ausführungsform.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzyms, das eine Aminosäuresequenz hat wie in SEQ ID NO.: 3 oder 8 definiert oder einer Variante eines der vorgenannten Enzyme mit wenigstens 85 % Sequenzidentität zu einer der vorgenannten Sequenzen zur Spaltung eines aromatischen Carbonats in einem wässrigen Medium. Alle oben gegebenen Definitionen für das aromatische Carbonat gelten auch für diese Ausführungsform.
Eine Variante wird aus den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen bevorzugt durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch des jeweils definierten Anteils der im jeweiligen Enzym enthaltenen Aminosäuren erhalten. Basis für die Berechnung der Sequenzidentität ist bevorzugt jeweils die durch SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, TI, 29 oder 30 definierte Aminosäuresequenz. Dem Fachmann ist bewusst, dass Fusionsproteine von Enzymen mit anderen Proteinen gebildet werden, ohne dass dies die Aktivität des Enzyms beeinträchtigt. Deswegen umfasst der Begriff „Variante" auch solche von den durch SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, TI , 29 oder 30 definierten Polypeptiden abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die am N-Terminus und/oder am C-Terminus mit weiteren Proteinen, z.B. dem Green Fluorescent Protein, fusioniert sind.
Besonders bevorzugte Varianten der erfindungsgemäßen Enzyme werden durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 20, bevorzugt bis zu 10 und noch stärker bevorzugt bis zu 5 Aminosäuren der offenbarten Sequenzen erhalten. Grundsätzlich können die vorgenannten Modifikationen an jeder beliebigen Stelle des betreffenden Polypeptids kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Bevorzugt erfolgen sie aber nur am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Polypeptids. Um eine effektive Spaltung der Carbonatgruppe zu gewährleisten werden die Enzyme zusammen mit der Verbindung gemäß Formel (I) in dem weiter oben in dieser Anmeldung definierten wässrigen Medium vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 15 und 80 °C, stärker bevorzugt zwischen 20 und 75 °C und besonders bevorzugt zwischen 30 und 70 °C inkubiert. Der pH liegt dabei vorzugsweise zwischen 5 und 10. Das durch SEQ ID NO.: 3 definierte Polypeptid und seine Varianten zeigt zwei pH- Optima, eines bei pH 7 und eines bei pH 9. Nähere Details zu den für die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme besonders geeigneten Reaktionsbedingungen sind in den Ausführungsbeispielen angegeben.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Spaltung einer Carbonatbindung in einer Verbindung nach Formel (I) enthaltend die Verfahrensschritte a) Bereitstellung eines wässrigen Mediums enthaltend ein Gemisch, das wenigstens eine Verbindung gemäß Formel (I) enthält und
(i) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:
1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:
2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; und b) Inkubation des Gemisches unter Bedingungen, unter denen das Enzym aromatische Carbonate spaltet.
Dieses Verfahren ist besonders für die Spaltung der durch Formel (II) charakterisierten Polycarbonate geeignet. Hierbei werden diese Verbindungen in Fragmente mit geringerem Molekulargewicht gespalten. Vorzugsweise werden sie zu Kohlensäure und Bisphenol A abgebaut. Es ist besonders bevorzugt, dass Verfahrensschritt b) durchgeführt wird bis wenigstens 30 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 50 Gew.-%, stärker bevorzugt wenigstens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% der Gesamtmasse der zu Beginn des Verfahrensschritts b) vorliegenden Verbindung nach Formel (II) zu Bisphenol A und Kohlensäure abgebaut sind. Beim Abbau einer Verbindung gemäß Formel (II) durch das oben definierte Verfahren wird Bisphenol A freigesetzt. Deswegen betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Bisphenol A enthaltend die Schritte a) Bereitstellung eines wässrigen Mediums enthaltend ein Gemisch, das wenigstens eine Verbindung gemäß Formel (I) enthält und
(i) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:
1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:
2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; und b) Inkubation des Gemisches unter Bedingungen, unter denen das Enzym Esteraseaktivät zeigt.
Hierbei wird in Verfahrensschritt b) Bisphenol A freigesetzt. Somit handelt es sich um ein Verfahren zur Rückgewinnung von Bisphenol A aus Polycarbonaten, also ein Recyclingverfahren.
Der Verfahrensschritt b) wird vorzugsweise durchgeführt, bis wenigstens 5, bevorzugt wenigstens 10, stärker bevorzugt wenigstens 50 und noch stärker bevorzugt wenigstens 70 Gew.-% des zu Beginn in der eingesetzten Gesamtmasse der Verbindung gemäß Formel (II) gebundenen Bisphenol A freigesetzt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das oben definierte Verfahren zur Herstellung von Bisphenol A einen weiteren Verfahrensschritt der Abtrennung von Bisphenol A aus dem durch die Inkubation in Verfahrensschritt b) erhaltenen Stoffgemisch. Dies kann vorteilhaft durch die Extraktion des freigesetzten Bisphenol A mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Toluol erfolgen. Das Bisphenol A kann dann nach erfolgter Phasentrennung leicht durch Absenkung der Temperatur auskristallisiert werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzyms
(i) das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; zur Aktivierung einer Prodrug gemäß Formel (I) durch Spaltung der Carbonatgruppe.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung enthaltend a)
(i) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; b) wenigstens ein aromatisches Carbonat; und c) wenigstens ein wässriges Medium.
Das aromatische Carbonat ist bevorzugt eine Verbindung gemäß Formel (I) (I)
Wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und
R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Verbindung gemäß Formel (I) und beliebigen organischen Resten.
Alle weiteren oben für das Enzym und das aromatische Carbonat gegebenen Definitionen gelten auch für die Zusammensetzung.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit enthaltend a)
(i) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; und b) wenigstens ein aromatisches Carbonat.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Kit zusätzlich wenigstens ein wässriges Medium.
Das aromatische Carbonat ist bevorzugt eine Verbindung gemäß Formel (I)
Wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und
R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Verbindung gemäß Formel (I) und beliebigen organischen Resten.
Alle weiteren oben für das Enzym und das aromatische Carbonat gegebenen Definitionen gelten auch für das Kit.
Abbildungen
Abbildung 1 visualisiert die Sequenzähnlichkeit der in der dieser Erfindung zugrunde liegenden Studie untersuchten Enzyme.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen nur dazu, die Erfindung zu illustrieren. Sie sollen den Schutzbereich der Patentansprüche in keiner Weise beschränken.
Ausführungsbeispiele
Enzyme
Kommerziell erhältliche Enzyme mit den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ. ID NO.: 15 bis 27 wurden von Sigma-Aldrich (Steinheim, Deutschland), Strem Chemicals (Bischheim, Frankreich) oder Fisher Scientific, (Rockford, USA) bezogen.
Plasmid-Konstruktion
Gene von Interesse wurden von Eurofins Genomics (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und mittels Restriktionsklonierung mit Xhol und Ndel in den pET26b(+)-Vektor von Merck (Darmstadt, Deutschland) oder mit anderen geeigneten Restriktionsenzymen der multiple cloning site in geegnete Escherichia coli (E. coli) Vektoren kloniert. Für die Vermehrung des Plasmids wurde eine Transformation chemisch kompetenter E. coli DH5a-Zellen durchgeführt. Gewachsene Einzelkolonien wurden zur Inokulation von 4,5 ml LB-Medium mit 50 pg/ml Kanamycin verwendet und entweder in 25 % Glycerol-Stocks konserviert oder gemäß den Herstellerangaben für die Sequenzierung bei GeneWiz (Leipzig, Deutschland) vorbereitet.
Heterologe Proteinexpression
Die heterologe Expression der Enzyme erfolgte in mit dem Plasmid-Konstrukt transformierten E. coli BL21 (DE3)-Zellen. 4,5 ml LB-Medium mit 1 % (w/v) Glucose und 50 pg/ml Kanamycin wurden aus einer Glycerol-Stammkultur beimpft und über Nacht bei 37 °C und 200 rpm inkubiert. 200 ml ZYP-5052- Autoinduktionsmedium mit 50 pg/ml Kanamycin wurden mit 0,1 % frisch gewachsenen Zellen beimpft und bei 37 °C und 200 rpm für 5 h in Kolben mit Schikanen inkubiert. Die Expression erfolgte über Nacht bei 20 °C und 200 rpm. Die Zellen wurden bei 4 °C für 10 min bei 8000 x g geerntet.
Zelllyse
Die geernteten Zellen für das initiale Screening wurden in 6 ml Ammoniumacetatpuffer (20 mM Ammoniumacetat, 0,4 % (w/v) n-Dodecyl-ß-maltosid, 1 % (w/v) Lysozym und 1 pl/ml Benzonase) resuspendiert und 30 min unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Geerntete Zellen mit exprimierter BhrPETase, DuraPETase, ThcCutl-ACCG, SvCutl90*SS, LCC-ICCG und LCC-WCCG für das initiale Screening wurden in 10 ml 20 mM KPi-Puffer pH 7,5 resuspendiert. Zellen für die Enzymreinigung wurden in 15 ml Lysepuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI und 10 mM Imidazol) resuspendiert. Die Zellen wurden zweimal mit Ultraschall (Bandelin Sonoplus HD, Sonotrode MS73, Berlin, Deutschland) unter konstanter Kühlung in einem Eisbad für 2 min (Zyklus 50 %) aufgeschlossen. Die resultierende Suspension wurde bei 10.000 x g und 4 °C für 20 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einem 0,2 pm PES-Filter filtriert.
Lyophilisierung des Zelllysats Der Überstand der Zellen mit exprimierter BhrPETase, DuraPETase, ThcCutl-ACCG, SvCutl90*SS, LCC- ICCG und LCC-WCCG sowie das Lysat der anderen Zellen für das initiale Screening, das alle Zellbestandteile enthält, wurden bei -80 °C eingefroren und 3 Tage lang bei -68 °C und 0,1 mBar lyophilisiert. Die lyophilisierten Zellen wurden bei -4 °C gelagert.
Enzymreinigung
Die Enzyme mit His-Tag wurden mittels IMAC -Affinitätschromatographie gereinigt. Die Säulen wurden mit dem erforderlichen Säulenvolumen Ni-NTA (HisPurTM Ni-NTA Resin, Fisher Scientific, Rockford, USA) gepackt und mit 8 Säulenvolumina (CV) Lysepuffer äquilibriert. Das filtrierte Lysat wurde auf die Säule geladen. Nach dem Aufträgen des Lysats wurden 10 CV Waschpuffer (50 mM NaHjPC , 300 mM NaCI, 20 mM Imidazol) auf die Säule gegeben. Das spezifisch gebundene His-getaggte Enzym wurde im Elutionspuffer (50 mM NaHjPC , 300 mM NaCI und 250 mM Imidazol pH 8) eluiert. Falls erforderlich, wurden die Proteine mit Amicon® Ultra-Zentrifugalfiltern (10 kDa MWCO) auf 2,5 ml konzentriert. Die Proteine wurden unter Verwendung des Gravity-Protokolls für PD-10-Säulen nach Herstelleranweisungen entsalzt und in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 gelagert.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Enzymexpression und Proteinreinheit wurden mittels Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht. 14 pl der lysierten Zellsuspension, des Überstands nach der Zentrifugation oder der gereinigten Enzym-Lösung wurden mit 7 pl 3x Reducing Blue Protein Loading Dye gemischt. Die Lösungen wurden 5 min bei 95 °C inkubiert. 10 pl der Proben wurden zusammen mit 3 pl EZ-Run® Prestained Rec Protein Ladder auf ein vorgegossenes NuPAGE 4- 12% Bis-Tris-Gel aufgetragen. Die Proteine wurden bei konstanter Spannung von 200 V für 35-40 min elektrophoretisch aufgetrennt. Die Gele wurden 1 h mit 30-50 ml Roti BlueQuick gebrauchsfertiger Färbelösung angefärbt.
Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Proteinkonzentration wurde kolorimetrisch mit dem Bradford-Assay bestimmt. Dazu wurde eine BSA-Standardkurve von 125-1000 pg/ml hergestellt. Das Enzym wurde bei Bedarf mit Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 verdünnt. Zu 5 pl BSA- und Enzymlösung wurden 250 pl Quick Start Bradford Reagenz, lx, hinzugegeben. Nach 5 min Inkubation wurde die Absorption bei 595 nm gemessen.
Test der Enzymaktivität mit BPA-PC
BPA-PC (Makrolon 2408, Covestro Deutschland AG) wurde vor der Verwendung auf 500 pm gemahlen. Das initiale Screening auf Hydrolyse von BPA-PC wurde mit einer Spatelspitze lyophilisiertem Enzym (kommerziell oder intern heterolog exprimiert) durchgeführt, das in 200 pl Kaliumphosphatpuffer (50 mM KPi, 100 mM NaCI pH 7,5) und einer Spatelspitze BPA-PC gelöst wurde. Die Reaktionen wurden bei 40 °C, 50 °C, 60 °C und 70 °C und 800 rpm für 146 h inkubiert. Für schlecht exprimierte Enzyme im Lyophilisat wurde gereinigtes Enzym verwendet. Zu 10 mg/ml BPA-PC wurde 100 pg/ml Enzym bis zu einem Endvolumen von 200 pl in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 5-8 hinzugegeben. Die Reaktionen wurden bei 40-70 °C und 800 rpm für 384 h inkubiert.
Alle Enzyme mit detektierbarer BPA-PC-Hydrolyse wurden gereinigt. Die Reaktionsbedingungen mit höchster BPA-PC-Hydrolyse aus dem vorherigen Test für jedes Enzym wurden verwendet, um die Umwandlung zu BPA zu quantifizieren. Die 4 besten Enzyme wurden ausgewählt und die Umwandlung zu BPA wurde bei Zugabe von 50-600 pg/ml Enzym zu 1, 10 und 50 mg/ml BPA-PC in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, CHES-Puffer oder 1,3-Bis(tris(hydroxymethyl)methylamino)propan bei pH 5-10 gemessen. Die Reaktion lief bei 50-90 °C und 800 rpm für 72 h. Anschließend wurde DMSO im Verhältnis 1:1 zur Reaktion hinzugegeben. Die Proben wurden 10 s gevortext und 5 min bei 11.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde 1:10 verdünnt und mit einem PVDF-Filter (0,2 pm) filtriert.
HPLC-Messungen
Die HPLC-Messungen wurden an einem Agilent 1260 Infinity Il-System (Santa Clara, USA) durchgeführt. Die LC war mit einem Multisampler (G7167A), einem DAD (Diodenarray-Detektor) für UV und den sichtbaren Lichtbereich und einer Zorbax Eclipse Plus C18-Säule (4,6 mm x 150 mm, 5 pm, Agilent, Santa Clara, USA) ausgestattet. Für alle Methoden wurden 5 pl Probe injiziert und die Säule auf 40 °C beheizt. Der Fluss betrug 1,0 ml/min. Die für die Analyse und Quantifizierung der BPA-PC-Hydrolyse Reaktion entwickelte Methode ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die Daten wurden mit der Software Chromeieon Chromatography Data System 7.3.1 (Thermo Scientific, Waltham, USA) analysiert.
Tabelle 2: HPLC-Methode
Konstruktion des phylogenetischen Baums und Konsensussequenz
Sequenzen verschiedener Hydrolasen-Vertreter aus unterschiedlichen Organismen wurden aus der PDB- und Uniprot-Datenbank abgerufen und mit den für diese Arbeit interessanten Sequenzen kombiniert. Für Aspergillus niger und Burkholderia cepacia sind 3 Hydrolase-Sequenzen beschrieben, die aus der Uniprot-Datenbank stammen und in die Analyse einbezogen wurden. In der MEGA11- Software wurde eine ClustalW-Sequenzalignment durchgeführt. Die phylogenetische Analyse erfolgte durch Auswahl der Standardeinstellungen und der Maximum-Likelihood-Methode. Der Bootstrap- Konsensus-Baum repräsentiert die evolutionäre Geschichte der analysierten Taxa. Ursprüngliche Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch durch Anwendung der Neighbor-Join- und BioNJ-Algorithmen auf eine Matrix von paarweisen Distanzen erzeugt, die mit einem Jones-Taylor- Thornton (JTT)-Modell und derTopologie mit dem überlegenen Log-Likelihood-Wert geschätzt wurden. Die Analyse umfasste 25 Aminosäuresequenzen. Die Sequenz der alkalischen Phosphatase aus E. coli wurde als Ausreißer Sequenz verwendet.
Ein ClustalW-Alignment der Aminosäuresequenzen von BPA-PC-hydrolysierenden Enzymen wurde verwendet, um Konsensusssequenzen mit 100 % und 85 % Schwellenwert zu berechnen. Zwei phylogenetischen Gruppen von BPA-PC-hydrolysierenden Enzymen wurde verwendet, um die Sequenzähnlichkeit zu bestimmen.
Ergebnisse
Die Hydrolyse von BPA-PC zu BPA wurde mit den in der Tabelle aufgeführten Enzymen getestet. Von 26 getesteten Enzymen hydrolysierten 10 BPA-PC. Enzyme mit den Nummern 15-27 sind kommerzielle Enzyme. Weiterhin zeigte die Cutinase aus Humicola insolens, die als Novozym® 51032 bezogen wurde eine Hydrolyse von BPA-PC. Dieses Enzym hat eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ. ID NO.: 27 definiert (Ternström et al. (2005) „Unfolding and inactivation of cutinases by AOT and guanidine hydrochloride", Biochimica et Biophysika Acta, 1748: 74-83). Mit den Lipasen aus Candida antarctica (CAL), Candida rugosa (CRL) und der Pankreas-Lipase vom Schwein (PPL), die zuvor veröffentlicht wurden (Artham et al. (2011), „Mechanistic investigations of lipase-catalyzed degradation of polycarbonate in organic solvents", Enzyme and Microbial Technology, 48: 71-79), wurde keine Umwandlung zu BPA detektiert.
Tabelle 3: Überblick liber die verwendeten Enzyme und ihre Aktivität
*Die bei den Abbauversuchen eingesetzten Enzyme wurden von kommerziellen Anbietern bezogen, die im Sequenzprotokoll angeführten Aminosäuresequenzen sind öffentlichen Datenbanken entnommen und wurden für die Sequenzanalyse genutzt.
Die BPA-PC hydrolysierenden Enzyme wurden gereinigt und auf die Umwandlung von BPA-PC analysiert (Tabelle 3). Bei 70 °C in 100 mM Bis(tris(hydroxymethyl)methylamino)propan pH 7 mit ThcCutl-ACCG oder pH 9 für LCC, LCC-ICCG und LCC-WCCG wurden Umsetzungen von 16,8-33,2 % bestimmt. Die Zugabe von DMSO wurde mit den 2 besten Varianten ThcCutl-ACCG und LCC-ICCG getestet. Eine Zugabe von 20-50 % DMSO zur Reaktion mit ThcCutl führte zu 100 % Umwandlung zu BPA. Mit LCC-ICCG war die Umwandlung zu 92,9 % BPA bei Zugabe von 30 % DMSO am höchsten. Ohne DMSO-Zugabe führte das 4-malige Ersetzen der wässrigen Phase nach 72 h durch eine frische Enzym- Pufferlösung zu 94 % Umwandlung zu BPA mit ThcCutl-ACCG und 51 % mit LCC-ICCG. Dafür wurde nach 72 h die Reaktion 3 min bei 13300 rpm zentrifugiert, der Überstand in ein neues Gefäß überführt und das gleiche Volumen Enzym-Pufferlösung zum BPA-PC gegeben. Die Reaktion lief erneut bei 70 °C und 800 rpm für 72 h. Nach 3-maligem Ersetzen der Enzym-Pufferlösung wurde DMSO im Verhältnis 1:1 zur Reaktion oder zum Überstand gegeben. Die Messung der Proben erfolgte wie beschrieben.
Inkubationsbedingungen bei denen die höchste BPA-Freisetzung gemessen wurde sind in Klammern dargestellt.
Tabelle 4: Geeignete Reaktionsbedingungen Tabelle 5: Quantifizierung der BPA-Freisetzung bestimmt mit lyophilisiertem Lysat
Phylogenetische Analyse
Die erhaltene Phylogenie zeigt die enge Verwandtschaft der Enzyme. Der Cluster der BPA-PC hydrolysierenden Enzyme teilt sich einen gemeinsamen Vorfahren mit IsPETase, PET2 und PET6. Bei letzteren Enzymen war keine BPA-PC-Hydrolyse detektierbar. Daher hat sich diese Funktion später entwickelt. Innerhalb des Clusters der BPA-PC hydrolysierenden Enzyme können zwei Gruppen unterschieden werden. Eine Gruppe enthält ThcCutl, ThcCutl-ACCG, TfCut2, SvCutl90*SS und PesHl (Gruppe 1). Die andere Gruppe enthält LCC, LCC-ICCG, LCC WGGC und die BhrPETase (Gruppe 2).
Die kommerziellen Enzyme (Nr. 15-27) sind nur entfernt miteinander und dem Cluster der BPA- hydrolysierenden Enzyme verwandt, wie durch die längeren Äste angezeigt. Die Mehrheit der angegebenen Beziehungen innerhalb des Clusters der BPA-hydrolysierenden Enzyme wird durch die Bootstrap-Werte validiert. Für früh abzweigende Vorfahren deuten Bootstrap-Werte auf eine weniger ausgeprägte Beziehung zwischen den Sequenzen hin.
Basierend auf dem Alignment der Sequenzen von BPA-PC hydrolysierenden Enzymen wurde die Konsensussequenz mit 100 % (SEQ ID NO.: 1) und 85 % Schwellenwert (SEQ ID NO: 28) berechnet. Die Aminosäuresequenz zeigt im Vergleich zum N-Terminus eine höhere Sequenzvariabilität am C- Terminus.
Tabelle 6: Sequenzidentitäten der aktiven Enzyme
Für die Berechnung der Sequenzähnlichkeit wurde die Zahl der identischen und ähnlich Aminosäurepositionen addiert. Dann wurde der Prozentsatz dieser Summe bezogen auf die Gesamtzahl der Aminosäurepositionen des Alignments berechnet.
Folgende Aminosäuren wurden als ähnlich definiert:
Kleine/alipatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
Schwefelhaltige Reste Cystein, Methionin
OH-funktionelle oder basische Reste: Serin, Threonin, Lysin, Arginin, Histidin
Saure, amidhaltige Reste und Prolin: Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin,
Prolin
Für die Berechnung der Sequenzidentität wurde der Prozentsatz identischer Aminosäurepositionen auf die Gesamtzahl der Aminosäurepositionen des Alignments berechnet.
Test weiterer Enzyme
Um zu überprüfen, ob alle Aminosäurepositionen der durch SEQ ID NO.: 1 definierten Konsensussequenz essentiell für die Enzymfunktion sind, wurden zwei weitere Cutinasen getestet. Es handelt sich um Kubu-P M12 (SEQ ID NO.: 29 ) und Mipa-P M19 (SEQ ID NO.: 30). Diese Enzyme wurden in Seo et al. (2025), „Landscape profiling of PET depolymerases using a natural sequence cluster framework", Science, Vol. 387, eadp 5637 beschrieben. Die Enzyme wurden heterolog exprimiert wie oben beschrieben. Als Testsubstrat wurde das oben beschriebene Polycarbonat verwendet. Die Quantifizierung des Polycarbonats erfolgte durch Nachweis von BPA durch HPLC wie oben beschrieben.
Kubu-P M12 und die durch SEQ ID NO.: 1 definierte Konsensussequenz haben nach den oben definierten Kriterien eine Sequenzähnlichkeit von 87 %. Die nach den oben definierten Kriterien bestimmte Sequenzidentität liegt bei 24 %. Nach 120 Stunden bei 70° C wurde in einem Gemisch von Wasser und DMSO, das bezogen auf das Gesamtgewicht des Gemisches 30 Vol.-% DMSO enthielt, ein Umsatz 10,1 % beobachtet.
Mipa-P M19 und die durch SEQ ID NO.: 1 definierte Konsensussequenz haben nach den oben definierten Kriterien eine Sequenzähnlichkeit von 87 %. Die nach den oben definierten Kriterien bestimmte Sequenzidentität liegt bei 26 %. Nach 120 Stunden bei 70° C wurde in einem Gemisch von Wasser und DMSO, das bezogen auf das Gesamtgewicht des Gemisches 30 Vol.-% DMSO enthielt, ein Umsatz 20,6 % beobachtet.
Die Ergebnisse zeigen, dass auch Cutinasen mit sehr geringer Sequenzidentität zur Konsensussequenz in der Lage sind BPA-basiertes Polycarbonat zu depolymerisieren. Es kann also davon ausgegangen werden, dass ein Austausch von bis zu 15 % der durch SEQ ID NO.: 1 definierten Aminosäurepositionen möglich ist, ohne die erfindungsgemäße Enzymfunktion zu zerstören.
Nachweis des Abbaus niedermolekularer aromatischer Carbonate
0,4 mg lyophilisiertes Rohlysat (kommerziell erworben oder heterolog exprimiertes Enzym) wurde in 400 pl KPi-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCI pH 7,5) gelöst. 5 mg/ml Substratlösungen von Dimethylcarbonat (DMC), Benzyl-(4-nitrophenyl)-carbonat (BNPC) und Diphenylcarbonat (DPC) wurden in DMSO hergestellt.
Für die Reaktion mit DMC wurden 100 pl der Enzymlösung mit 250 pl 25 mM KPi-Puffer mit etwa 0,1 mg/ml Phenolrot, 100 pl H2O und 50 pl Substratlösung gemischt. Die Proben wurden für 22 h bei 40 °C und 800 rpm inkubiert. Bei der Hydrolyse von Dimethylcarbonat wird Kohlensäure gebildet. Die pH- Wert-Abnahme durch die Kohlensäurebildung wird mit Phenolrot nachgewiesen und ist durch einen Farbumschlag von rot nach gelb sichtbar.
Die BNPC- und DPC-Hydrolyse wurde mit 100 pl des gelösten Lysats bestimmt, gemischt mit 350 pl KPi- Puffer und 50 pl Substratlösung. Für DPC wurde etwa 0,1 mg/ml Phenolrot zugegeben. Die Proben wurden für 20 h bei 20 °C oder bei 20 °C gefolgt von 40 °C, 800 rpm, für BNPC bzw. DPC inkubiert. Das Hydrolyseprodukt von BNPC ist p-Nitrophenol (pNP) und wurde spektrophotometrisch bei 410 nm nachgewiesen. Eine Standardkurve von pNP wurde als Referenz verwendet. Für die Analyse der DPC Proben wurde 500 pl Acetonitril nach er Reaktion zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Proben wurden für HPLC-Messungen verwendet. Ein Phenol-Standard wurde als Referenz verwendet. Die gleiche HPLC-Methode wie für PC wurde zur Bestimmung von Phenol verwendet.
Eine Farbänderung wurde als Indiz für Abbau gewertet, ohne diesen zu quantifizieren.
Tabelle 7: Abbau niedermolekularer Substrate
Enzym Dimethylcarbonat Benzyl-(4- Diphenylcarbonat nitrophenyl)- carbonat
LCC + + +
Thc-Cutl + + +
TfCut2 + + +
PesHl + + +
Novozym®51032 + + +
ThcCutl-ACCG n.d. 1846.3 mgNp h 1 n.d.
Leervektor n.d.: nicht bestimmt
Das Ergebnis zeigt, dass die getestete Auswahl an Enzymen in der Lage war, auch niedermolekulare Carbonate zu spalten. Dieses Ergebnis ist vermutlich auch auf alle anderen Enzyme übertragbar, die Polycarbonat abbauen können, da die niedermolekulare Substrate für das Enzym besser zugänglich sind als Polymere.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Enzyms,
(a) das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(b) das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist. zur Spaltung eines aromatischen Carbonats in einem wässrigen Medium.
2. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Enzym wie folgt definiert ist:
(i) Die zu den konservierten Aminosäurepositionen gemäß SEQ ID NO.: 1 homologen Aminosäurepositionen des Enzyms weisen wenigstens 90 % Sequenzidentität zu den konservierten Aminosäurepositionen aus SEQ ID NO.: 1 auf; und
(ii) Die zu den beliebigen Aminosäurepositionen aus SEQ ID NO.: 1 homologen Aminosäurepositionen weisen wenigstens 70 % Sequenzidentität zu den homologen Aminosäurepositionen einer der Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9 und 10 auf.
3. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Enzym wenigstens 80 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 90 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 aufweist.
4. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das aromatische Carbonat durch Formel (I) definiert ist
Und wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und
R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Verbindung gemäß Formel (I) und beliebigen organischen Resten.
5. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das aromatische Carbonat ein Polycarbonat ist.
6. Die Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Polycarbonat erhalten oder erhältlich ist durch Reaktion wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisphenol A, Bisphenol S, Dihydroxyfephenylsulfid, Tetramethylbisphenol A, l,l-Bis(4-hydroxyphenyl)- 3,3,5-trimethylcyclohexan (BPTMC) und l,l,l-Tris(4-hydroxyphenyl)-ethan (THPE) mit Phosgen oder Diphenylcarbonat.
7. Die Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polycarbonat durch Formel (II) definiert ist
8. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 , wobei das aromatische Polycarbonat als Copolymer mit wenigstens einem Polyester vorliegt.
9. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 , wobei das Polycarbonat als Gemisch mit wenigstens einem weiteren Polymer vorliegt.
10. Verfahren zur Spaltung einer Esterbindung in einer Verbindung nach Formel (I) wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und
R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Verbindung gemäß Formel (I) und beliebigen organischen Resten; enthaltend die Verfahrensschritte a) Bereitstellung eines wässrigen Mediums enthaltend ein Gemisch, das wenigstens eine Verbindung gemäß Formel (I) enthält und
(i) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:
1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) wenigstens ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.:
2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; und - TI - b) Inkubation des Gemisches unter Bedingungen, unter denen das Enzym aromatische Carbonate spaltet.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Verbindung durch Formel (II) definiert ist.
12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verbindung gemäß Formel (II) als Gemisch mit wenigstens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyestern, Styrol- Acrylnitril-Copolymer und Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymer vorliegt.
13. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Polyester ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenterephthalat und Polybutylenterephthalat.
14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei Verfahrensschritt b) solange durchgeführt wird, bis wenigstens 5 Gew.-% der zu Beginn des Verfahrensschrittes b) vorliegenden Gesamtmasse der Verbindung nach Formel (II) abgebaut sind.
15. Verwendung eines Enzyms
(i) das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(ii) das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; zur Aktivierung einer Prodrug gemäß Formel (I) (I)
Und wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer
Verbindung gemäß Formel (I) und beliebigen organischen Resten; durch Spaltung der Carbonatgruppe.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3587570A1 (de) 2018-06-21 2020-01-01 Covestro Deutschland AG Neue urethanasen für den enzymatischen abbau von polyurethanen

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117304035A (zh) * 2022-06-22 2023-12-29 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高通量筛选聚酯降解酶的方法及其使用的化合物
CN115029332B (zh) * 2022-06-30 2024-02-02 北京化工大学 嗜热pet水解酶的突变体蛋白及其应用
WO2025242591A1 (de) * 2024-05-21 2025-11-27 Covestro Deutschland Ag Verfahren zum effizienten enzymatischen abbau aromatischer polycarbonate

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3587570A1 (de) 2018-06-21 2020-01-01 Covestro Deutschland AG Neue urethanasen für den enzymatischen abbau von polyurethanen

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARTHAM ET AL.: "Mechanistic investigations of lipase-catalyzed degradation of polycarbonate in organic solvents", ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, vol. 48, 2011, pages 71 - 79, XP027476952, DOI: 10.1016/j.enzmictec.2010.09.011
SEO ET AL.: "Landscape profiling of PET depolymerases using a natural sequence cluster framework", SCIENCE, vol. 387, 2025, pages 5637
SIVALINGAMMADRAS: "Dynamics of Lipase Catalyzed Enzymatic Degradation of Poly(bisphenol-A carbonate", JOURNAL OF POLYMER SCIENCE, vol. 91, 2004, pages 2391 - 2396, XP093221150, DOI: 10.1002/app.13394
SUYAMATOKIWA: "Enzymatic degradattion of an aliphatic polycarbonate, poly(tetramethylene carbonate", ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, vol. 20, 1997, pages 122 - 126, XP093221594, DOI: 10.1016/S0141-0229(96)00084-1
TERNSTRÖM ET AL.: "Unfolding and inactivation of cutinases by AOT and guanidine hydrochloride", BIOCHIMICA ET BIOPHYSIKA ACTA, vol. 1748, 2005, pages 74 - 83, XP004773899, DOI: 10.1016/j.bbapap.2004.12.014
TOURNIER: "An engineered PET depolymerase to break down and recycle plastic bottles", NATURE, vol. 580, 2020, pages 216 - 219, XP093139681, DOI: 10.1038/s41586-020-2149-4

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