WO2025239753A1 - 질화전이금속 나노자임을 포함하는 바이오센서 - Google Patents

질화전이금속 나노자임을 포함하는 바이오센서

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WO2025239753A1
WO2025239753A1 PCT/KR2025/095314 KR2025095314W WO2025239753A1 WO 2025239753 A1 WO2025239753 A1 WO 2025239753A1 KR 2025095314 W KR2025095314 W KR 2025095314W WO 2025239753 A1 WO2025239753 A1 WO 2025239753A1
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WO
WIPO (PCT)
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nanozyme
transition metal
substrate
nitride
biosensor
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PCT/KR2025/095314
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English (en)
French (fr)
Inventor
이혜진
물야수피안토
정성화
이규동
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Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
Original Assignee
Industry Academic Cooperation Foundation of KNU
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor comprising a transition metal nitride nanozyme, and more particularly, to a biosensor comprising a transition metal nanozyme in which a label comprising a transition metal nitride nanozyme acts like an enzyme and can generate a visual signal by reaction with a substrate.
  • a protein chip is a single chip that immobilizes capture molecules, such as antibodies, receptors, nucleic acids, and carbohydrates, capable of reacting with a specific target protein at high density. This allows for a range of protein analysis tasks, from protein separation and identification to quantification and functional analysis. Among these, protein chips immobilized with antibodies are the most common.
  • Protein chips can be used to generate data on the relationships between proteins, and in particular, they can be used to diagnose diseases by detecting specific proteins that are specifically overexpressed when a disease occurs. They are also expected to form a larger market than DNA chips due to their potential for environmental monitoring, toxicity screening, and other uses. Therefore, the development of protein chips is urgently needed.
  • a protein chip's structure is largely comprised of a sensor chip and a protein binding analysis device (detection system).
  • the sensor chip is the core component of the protein chip and is a key factor in determining its development speed.
  • the immobilization technology that binds capture molecules that can react with specific target proteins to the surface of the chip is a key technology that determines the sensitivity of the protein chip.
  • antibodies since the site that binds to the antigen in the Y-shaped structure exists in the Fab, it is absolutely important to immobilize the Fc portion of the antibody on the chip in order to effectively react with the antigen, and to secure the orientation of the antibody so that the Fab portion faces the target antigen.
  • MOFs metal-organic frameworks
  • the metal-organic framework itself is not suitable for use as an enzyme, and thus there is a need to develop a biosensor material through modification of the metal-organic framework.
  • the present invention aims to provide a biosensor that obtains information by measuring a visual signal formed by reacting a label composed of a transition metal nanozyme with a substrate.
  • a detection probe that specifically binds to the capture probe and the sample in a sandwich form
  • a biosensor comprising a label composed of a nitride transition metal nanozyme that is connected to the detection probe and reacts with a substrate;
  • the above-mentioned transition metal nanozyme acts as an enzyme and provides a biosensor characterized in that it generates a visual signal by reaction with a substrate.
  • the substrate preferably includes at least one selected from the group consisting of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine [TMB], 3-amino-9-ethylcarbazole, o-phenylenediamine, 3,3'-diaminobenzidine, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), and 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • 3-amino-9-ethylcarbazole o-phenylenediamine
  • 3,3'-diaminobenzidine 3,3'-diaminobenzidine
  • 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • the above transition metal nitride nanozyme is formed by combining a transition metal nitride and porous carbon.
  • the above nitride transition metal is preferably one selected from among tungsten nitride (W 2 N), vanadium nitride (VN), and chromium nitride (CrN).
  • the above sample is preferably one or more of human serum, plasma, blood, and urine samples.
  • the above nanozyme can change color to blue by reaction with a substrate.
  • the transition metal nitride nanozyme of the present invention can function like an enzyme and generate a visual signal by reacting with a substrate. This can be conjugated to an antibody and applied as a signaling property to a lateral flow immunoassay paper chip, enabling the early diagnosis of various diseases. Therefore, it can be utilized as a point-of-care diagnostic kit for four major serious diseases, including cancer. Furthermore, it boasts the advantages of simplicity, ease of miniaturization, and excellent selectivity and sensitivity.
  • Figure 1 shows the qualitative analysis results for the peroxidase activity of various nanozymes catalyzing TMB substrates according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2a illustrates the UV-Vis spectroscopy analysis results according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2b illustrates a specific activity represented by the slope of the linear relationship of catalytic activity to mass of a nanozyme according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3a illustrates Michaelis-Menten results of TMB substrates activated by different nanozymes according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3b illustrates a conversion of a nonlinear Michaelis-Menten curve into a linear Linewaver-Burk plot according to one embodiment of the present invention.
  • the present invention provides a biosensor comprising: a support; a capture probe fixed on the surface of the support; a detection probe that specifically binds to a sample in a sandwich form with the capture probe in between; and a label composed of a transition metal nitride nanozyme that is connected to the detection probe and reacts with a substrate; wherein the transition metal nitride nanozyme acts as an enzyme and generates a visual signal by reaction with the substrate.
  • the transition metal nitride nanozyme label is preferably formed by combining a transition metal nitride with porous carbon.
  • the transition metal nitride refers to a form in which nitrogen and a transition metal are combined, and is not limited thereto, but for example, at least one selected from tungsten nitride (W 2 N), vanadium nitride (VN), and chromium nitride (CrN) is preferable. Chromium nitride (CrN) is more preferable.
  • transition metal nitride nanozymes can react with substrates and perform the same function as enzymes, thereby inducing easy conjugation and a strong visual change, which are essential for sample detection.
  • the transition metal nitride nanozyme label exhibits a visual change resulting from the reaction with the substrate, for example, the substrate color can change to blue.
  • the nanozyme of the present invention refers to various nanomaterials with enzyme-like properties that can catalyze reactions similar to those catalyzed by natural enzymes.
  • Previous research has been conducted to use nanozymes as highly active and selective catalysts instead of enzymes. Despite the selective reaction of nanozymes, it is difficult to achieve reaction rates comparable to those of natural enzymes.
  • Many metal oxide nanomaterials and metal nanomaterials can function as nanozymes similar to peroxidase and oxidase enzymes in the presence of oxidants (H 2 O 2 , O 2 , etc.).
  • nanozymes offer advantages over natural enzymes, including stability, cost-effectiveness, and tunable catalytic properties, making them an attractive alternative in various research and applications.
  • biospecific binding can be achieved by immobilizing a capture probe on a substrate and linking a detection probe to a label, such that the capture probe and detection probe can bind specifically in a sandwich configuration with the sample interposed therebetween.
  • the capture probe can be immobilized on a substrate, and the sample and label can be linked, or the sample can competitively bind to the capture probe.
  • the substrate is characterized by generating a visual signal after reaction with a transition metal nitride nanozyme that acts as an enzyme. Since the generation of this visual signal depends on the substrate that reacts with the nanozyme, it can be appropriately utilized depending on the type of substrate.
  • a substrate that generates a visual signal in the present invention may be any one selected from the group consisting of, but not limited to, 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine [3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), 3-amino-9-ethylcarbazole, o-phenylenediamine, 3,3'diaminobenzidine, 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, etc.
  • the substrate is 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide.
  • the sample of the present invention can be extracted from human serum, plasma, blood, and urine, and there are no restrictions on its use as long as it is a sample used for disease diagnosis. As long as a biomarker representing various diseases exists, the type of disease is not limited.
  • the biosensor of the present invention may include organic biomolecules such as proteins, nucleic acids, lipids, glycolipids, and glycoproteins, which show an increase or decrease in the blood, tissues, or cells of a subject with a disease compared to a normal control group, and is preferably a protein.
  • a diagnostic kit using a biosensor is provided.
  • the kit of the present invention is largely composed of a diagnostic strip, a lower case, and an upper case, wherein the diagnostic strip includes a membrane, a sample pad, and an absorbent pad.
  • the lower case of the present invention supports one side of the diagnostic strip, and the upper case is coupled to the lower case and covers the other side of the analysis strip, and includes a sample input port corresponding to the sample pad, a result display window corresponding to the membrane, and a character display port corresponding to the absorbent pad.
  • the membrane is a part that shows the detection result, and a test line and a control line with a fixed composition are located thereon.
  • Materials used in conventional diagnostic strips can be used, and for example, it can be one selected from various synthetic polymers such as nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, and polyethylene.
  • the sample pad is positioned so as to overlap partially on one end of the membrane and absorbs the sample developing solution containing the transition metal nitride nanozyme label.
  • the sample developing solution is a mixture of the collected sample and the complex. If a disease is present, the biomarker in the sample and the transition metal nitride nanozyme label are present in the sample developing solution in a bound state. When this sample developing solution is dropped on the sample pad, the biomarker and the transition metal nitride nanozyme are bound and flow down the strip, forming an immune sandwich complex with the immobilized antibody that specifically binds to the biomarker located at the test line. This causes two brown lines to appear at both the control line and the test line on the membrane, which indicates the presence of the disease. At this time, the control line only binds to the transition metal nitride nanozyme label, and the type of the immobilized antibody on the control line that binds to the complex is not particularly limited as long as it does not cause cross-reaction.
  • W 2 N@PDC-1 was synthesized by thermal decomposition of phosphotungstic acid (PTA) added to nitrogen-containing polyaniline (PANI) as follows.
  • PTA phosphotungstic acid
  • PANI nitrogen-containing polyaniline
  • PANI was prepared by mixing a solution of 2.6 g of aniline hydrochloride in 100 ml of water and a solution of 11.4 g of ammonium persulfate in 100 ml of water, reacting at room temperature for 4 hours, filtering, and drying to obtain approximately 2 g.
  • 0.2 g of PTA was dissolved in 20 ml of ethanol, and 2 g of PANI was added. Ultrasonication was performed for 30 minutes to ensure the most homogeneous reaction product.
  • the ethanol was dried in an oven at 100°C for about 2 hours and pyrolyzed at 800°C for 12 hours to synthesize PANI-derived carbon (PDC) W 2 N@PDC-1 doped with tungsten nitride (W 2 N).
  • PDC PANI-derived carbon
  • W 2 N@PDC-2 was prepared in the same manner as W 2 N@PDC-1 of Example 1. 0.4 g of PTA was dissolved in 20 mL of ethanol, 2 g of PANI was added, and ultrasonication was performed for 30 minutes to ensure the most homogeneous reaction. After evaporating the ethanol using an evaporator, the mixture was dried in an oven at 100 °C for about 2 hours and pyrolyzed at 800 °C for 12 hours to synthesize PANI-derived carbon W 2 N@PDC-2 doped with tungsten nitride (W 2 N).
  • W 2 N tungsten nitride
  • VN@PDC-1 was synthesized by adding vanadium (V) oxide (V 2 O 5 ) to PANI and then pyrolyzing it, as follows. 0.2 g of V 2 O 5 was dissolved in distilled water with 2 ml of hydrochloric acid (HCl, 35%) added, 1 g of PANI was added, and the mixture was stirred for 3 hours. After evaporating the hydrochloric acid and distilled water using an evaporator, the mixture was dried at 100 °C for about 2 hours and pyrolyzed at 1100 °C for 5 hours to synthesize VN@PDC, a PANI-derived carbon doped with vanadium nitride (VN).
  • VN vanadium nitride
  • VN@PDC-2 was prepared in the same manner as VN@PDC-1, and the detailed description is as follows. 0.3 g of V2O5 was dissolved in distilled water with 2 ml of hydrochloric acid (HCl, 35%), 1 g of PANI was added, and the mixture was stirred for 3 hours. After evaporating the hydrochloric acid and distilled water using an evaporator, the mixture was dried at 100 °C for about 2 hours and pyrolyzed at 1100 °C for 5 hours to synthesize VN@PDC-2, a PANI-derived carbon doped with vanadium nitride (VN).
  • VN vanadium nitride
  • CrN@MDC was synthesized by pyrolysis of (Cr 2 O 3 -melamine)@MAF-6, which was prepared by doping chromium oxide (Cr 2 O 3 ) and melamine into Metal Azolate Framework-6 (MAF-6).
  • CrN@MDC-2 was prepared in the same manner as CrN@MDC-1, and the detailed description is as follows. 2 g of zinc hydroxide (Zn(OH) 2 ) dissolved in 400 mL of ammonium hydroxide (25%), 3.85 g of 2-ethylimidazole dissolved in 220 mL of ethanol-cyclohexane mixed solution (ethanol 200 mL, cyclohexane 20 mL), and 0.15 g of Cr2O3 and 0.9 g of melamine were added to two beakers each containing 20 mL of ethanol.
  • Zn(OH) 2 zinc hydroxide
  • ammonium hydroxide (25%) 3.85 g of 2-ethylimidazole dissolved in 220 mL of ethanol-cyclohexane mixed solution (ethanol 200 mL, cyclohexane 20 mL)
  • 0.15 g of Cr2O3 and 0.9 g of melamine were added to two bea
  • Pt@ZDC was synthesized by adding tetraamineplatinum (II) chloride (TAP) to Zeolitic imidazolate Frameworks-8 (ZIF-8) and then thermally decomposing it.
  • II tetraamineplatinum
  • ZIF-8 Zeolitic imidazolate Frameworks-8
  • ZIF-8 was prepared by mixing 2.9 g of zinc nitrate hydrate (Zn( NO3 ) 2 ⁇ 6H2O) in 100 mL of methanol and 6.9 g of 2-methylimidazole in 100 mL of methanol, reacting at 30°C for 2 h, followed by filtration and drying. 0.2 g of TAP was dissolved in 20 mL of distilled water, and 2 g of ZIF-8 was added. Ultrasonication was applied for 30 min. The distilled water was evaporated using an evaporator, dried at 100°C, and then pyrolyzed at 1100°C for 3 h to synthesize Pt@ZDC.
  • the activity of the synthesized transition metal nitride-based nanozymes was qualitatively investigated by reacting each nanozyme with the substrate 3,3 ⁇ ,5,5 ⁇ -tetramethylbenzidine (TMB) to determine whether it exhibited peroxidase-like activity. Initially, three vials each containing 1 mg of nanozyme dispersed in 1 mL of 0.2 M acetate buffer (pH 4.3) were prepared. Then, 0.2 mL of TMB, H 2 O 2 , and a TMB/H 2 O 2 mixture (1:1) were individually added to each tube.
  • TMB 3,3 ⁇ ,5,5 ⁇ -tetramethylbenzidine
  • b is the catalytic activity of the nanozyme expressed in units.
  • One unit is defined as the amount of nanozyme that catalytically produces 1 ⁇ mol of product per minute at 37°C, V is the total volume of the reaction solution ( ⁇ L), and ⁇ is the molar extinction coefficient of the colorimetric substrate, which typically has a maximum value of 39,000 M -1 cm -1 at 653 nm (for TMB).
  • l is the path length (cm) of light traveling in the cuvette
  • A is the absorbance after subtracting the background signal
  • ⁇ A/ ⁇ t is the initial rate of change in absorbance at 653 nm/min.
  • the specific activity (U/mg) of the nanozyme was then calculated in mg as the slope of the plot of activity ( b ) against the nanozyme weight [m] (see Fig. 2b).
  • the catalytic activity of a nanoenzyme ( b ) is linearly proportional to its mass
  • the catalytic activity of b can be plotted against [ m ] and the slope of the resulting straight line can be measured to determine the specific activity value using Equation 2.
  • Equation 3 ⁇ o is the initial reaction rate, and ⁇ max is the maximum reaction rate observed at saturating substrate concentration.
  • [S] is the substrate concentration
  • Km is the Michaelis constant.
  • Km reflects the affinity of the nanoenzyme for the substrate and is defined as the substrate concentration corresponding to half the maximum reaction rate.
  • Km and ⁇ max can be obtained from a double reciprocal plot (Linewaver-Burk plot - Equation 4). The results are shown in Figure 3b:
  • transition metal nitride-based nanozymes e.g., W 2 N@PDC (10%), W 2 N@PDC (20%), VN@PDC (20%), VN@PDC (30%), CrN-1@MDC, and CrN-2@MDC
  • W 2 N@PDC (10%), W 2 N@PDC (20%), VN@PDC (20%), VN@PDC (30%), CrN-1@MDC, and CrN-2@MDC were synthesized.
  • the enzymatic performance of the nanozymes that can mimic peroxydase activity was evaluated.
  • the above nanozymes were synthesized considering that peroxydase-type enzymes such as Horse radisch peroxidase (HRP) are the most widely used enzymes in biomedical applications.
  • HRP Horse radisch peroxidase
  • Figure 1 shows the qualitative analysis results for the peroxidase activity of various nanozymes catalyzing TMB substrate according to one embodiment of the present invention.
  • W 2 N@PDC induced a blue change when reacting with TMB.
  • the blue color did not appear when H 2 O 2 was added alone.
  • the evolution of the blue color was accelerated when both TMB and H 2 O 2 were added.
  • H 2 O 2 can play an important role in the enzymatic reaction by providing the oxygen atoms necessary for the oxidation of TMB.
  • the blue color formation was significantly faster when 5 mM TMB/H 2 O 2 was catalyzed by 1 mg of VN@PDC (20%), VN@PDC (30%), CrN-1@MDC, and CrN-2@MDC.
  • the faster the blue product is formed in the initial reaction indicates that the nanoenzyme is effective in catalyzing the oxidation of the substrate TMB, which is more essential for the readout of the assay.
  • UV-Vis spectroscopy was performed to investigate the absorption characteristics of blue TMB at 653 nm, which is produced as a result of the nanozyme reaction.
  • Figure 2a illustrates the UV-Vis spectroscopy results according to one embodiment of the present invention.
  • the highest absorption peak at 653 nm was observed when CrN-1@MDC and CrN-2@MDC were utilized, followed by VN@PDC (30%).
  • the absorbance peak at 653 nm showed a result similar to that of Pt@ZDC.
  • W 2 N@PDC (10%) and W 2 N@PDC (20%) showed lower abilities to react with TMB/H 2 O 2 .
  • Fig. 2b illustrates the specific activity, represented by the slope of the linear relationship between the catalytic activity and the mass of the nanozyme according to one embodiment of the present invention.
  • CrN-2@MDC is the most effective nanozyme in catalyzing a specific reaction among all synthetic materials in terms of specific activity. This comparison may include factors such as catalytic efficiency, substrate specificity, stability, and cost-effectiveness. Knowing the highest specific activity is essential for quality control purposes and is necessary to ensure consistent performance of nanozymes produced in large quantities for commercial use.
  • Figure 3a illustrates the Michaelis-Menten results of TMB substrate activated by different nanozymes according to one embodiment of the present invention.
  • a hyperbolic curve with an initial rapid increase in reaction rate followed by a plateau as the substrate concentration increases was achieved by W 2 N@PDC(10%), VN@PDC(30%), CrN-1@MDC, CrN-2@MDC, and Pt@ZDC.
  • the curves are linear and the initial rate is directly proportional to the substrate concentration.
  • the nanozyme becomes saturated and all nanozyme active sites are occupied, resulting in a constant maximum rate ( ⁇ max).
  • W 2 N@PDC(20%) and VN@PDC(20%) show linear plots, which do not conform to the Michaelis-Menten equation fitting.
  • Figure 3b illustrates the transformation of the nonlinear Michaelis-Menten curve into a linear Linewaver-Burk plot to more accurately analyze the kinetic parameters according to one embodiment of the present invention.
  • this linearization simplifies data analysis and allows for easier determination of parameters such as ⁇ max and Km.
  • the highest ⁇ max result was achieved for CrN-2@MDC at up to 44.25 ⁇ M/min, which represents the theoretical maximum reaction rate when all nanozyme active sites are saturated with TMB substrate.
  • Km represents the substrate concentration at which the reaction rate reaches half of ⁇ max.
  • a lower Km value indicates a higher affinity of the enzyme for the substrate.
  • the results vary from lowest to highest Km values in the following order: W 2 N@PDC(10%), Pt@ZDC, VN@PDC(30%), CrN-2@MDC, CrN-1@MD, VN@PDC(20%), W 2 N@PDC(20%).
  • W 2 N@PDC(10%) and Pt@ZDC showed the lowest Km values, their ⁇ max was still lower than that of CrN@C.
  • CrN-2@MDC showed the highest absorbance at 653 nm, the highest specific activity, the highest ⁇ max value, and a similar Km value, it can be confirmed that CrN-2@MDC is a superior nanoenzyme among all synthetic materials.

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Abstract

본 발명은 본 발명은 지지체; 상기 지지체 표면에서 고정된 포획 프로브; 상기 포획 프로브와 시료를 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합을 하는 검출 프로브; 및 상기 검출 프로브에 연결되어 기질과 반응하는 질화전이금속 나노자임으로 구성된 표지;를 포함하는 바이오센서로서, 상기 질화전이금속 나노자임은 효소로서 작용하며 기질과의 반응에 의하여 전기화학 신호 또는 시각적 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다. 본 발명의 질화전이금속 나노자임을 활용하여 효소와 같은 역할을 할 수 있으며, 기질과의 반응에 의하여 전기화학 신호 또는 시각적 신호를 발생하게 할 수 있다.

Description

질화전이금속 나노자임을 포함하는 바이오센서
본 발명은 질화전이금속 나노자임을 포함하는 바이오센서에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질화전이금속 나노자임을 포함한 표지가 효소와 같은 역할을 하여, 기질과의 반응에 의하여 시각적 신호를 발생할 수 있는 전이금속 나노자임을 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
단백질칩이란, 특정 표적 단백질과 반응할 수 있는 항체, 수용체, 핵산, 탄수화물 등의 포획분자를 단일칩 상에 고밀도로 고정화한 것으로서, 단백질의 분리, 확인, 정량 및 기능 해석에 이르는 일련의 단백질 분석 작업을 수행할 수 있다. 그 중 항체를 칩상에 고정화한 단백질칩이 가장 일반적이다.
단백질칩을 이용하면 단백질-단백질 간의 상호관계에 관한 데이터 생성이 가능하며, 특히 질병발생시 특이적으로 과발현되는 특정 단백질을 검출하여 질병을 진단할 수도 있고, 환경 감시, 유해성 검진 등 잠재 수요가 대단히 크기 때문에 DNA칩보다 더 큰 시장을 형성할 것으로 예상되고 있어, 단백질칩에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.
단백질칩의 구성을 보면, 크게 센서칩(sensor chip)과 단백질 결합 분석장치(detection system)로 구성된다. 이 중 센서칩이 단백질칩의 핵심 구성으로 단백질칩의 발전속도를 결정하고 있는 주요 요인이 되고 있는 부분이다.
센서칩 제작에서 단백질칩의 표면 작용기 도입, 포획 분자의 고정화, 표적 단백질과의 반응, 표지물질과의 반응, 표지물질 준비공정, 측정 장비의 상태 등 다양하고 복잡한 공정 기술이 사용되고, 특히 특정 표적 단백질과 반응할 수 있는 포획분자를 칩의 표면에 결합시키는 고정화 기술이 단백질칩의 민감도를 결정하는 핵심기술이다. 특히 항체를 포획분자로 사용하는 경우, Y 모양의 구조에서 항원과 결합하는 부위가 Fab에 존재하기 때문에 효과적으로 항원과 반응시키기 위해서는 항체의 Fc부위가 칩 상에 고정화되고, Fab 부위가 표적 항원을 향하도록 항체의 방향성(orientation)을 확보하면서 고정화하는 것이 절대적으로 중요하다.
최근에는 무기-유기물이 결합된 형태의 효소 모방 센서물질이 보고되었고, 특히 금속-유기 골격체(metal-organic framework; MOF)는 구조적인 특성으로 인해 합성 후 개질(post synthetic modification)을 통해 기능화 및/또는 기공도를 조절하여 촉매 활성을 부여하거나 조절할 수 있다.
따라서 금속-유기 골격체 자체만으로는 효소로 활용하기에 적절치 못한 문제점이 있어서 금속-유기 골격체의 개질을 통한 바이오센서 물질의 개발을 필요로 하는 실정이다.
[선행문헌]
대한민국 등록특허 제10-1204874호
대한민국 공개특허 제10-2022-0071671호
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 전이금속 나노자임으로 구성된 표지를 기질과 반응하여 형성된 시각적 신호를 측정하여 정보를 얻게 되는 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,
지지체;
상기 지지체 표면에서 고정된 포획 프로브;
상기 포획 프로브와 시료를 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합을 하는 검출 프로브; 및
상기 검출 프로브에 연결되어 기질과 반응하는 질화전이금속 나노자임으로 구성된 표지;를 포함하는 바이오센서로서,
상기 질화전이금속 나노자임은 효소로서 작용하며 기질과의 반응에 의하여 시각적 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
상기 기질은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘[3,3',5,5'-tetramethylbenzidine: TMB], 3-아미노-9-에틸카바졸[3-amino-9-ethylcarbazole], o-페닐렌디아민[o-phenylenediamine], 3,3'-디아미노벤지딘[3,3'-diaminobenzidine], 2,2'-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], 및 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진[10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 질화전이금속 나노자임은 질화전이금속과 다공성 탄소를 결합하여 형성되는 것이 바람직하다.
상기 질화전이금속은 질화텅스텐(W2N), 질화바나듐(VN), 및 질화크롬(CrN) 중에서 선택된 하나인 것이 바람직하다.
상기 시료는 인간 세럼, 플라즈마, 혈액 및 소변 시료 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 나노자임은 기질과의 반응에 의하여 색상이 파란색으로 변경될 수 있다.
본 발명의 질화전이금속 나노자임을 활용하여 효소와 같은 역할을 할 수 있으며, 기질과의 반응에 의하여 시각적 신호를 발생하게 할 수 있다. 이를 항체와 콘쥬게이션하여 lateral flow immunoassay 종이칩에 신호형질로 적용하여 다양한 질병을 조기에 진단할 수 있다. 따라서 암 등을 포함한 4대 중증 질환의 Point of care 진단 키트로 활용가능하다. 또한 단순성, 소형화의 용이성, 뛰어난 선택성 및 감도를 가진다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 TMB 기질을 촉매하는 다양한 나노자임의 peroxidase 활성에 대한 정성적 분석결과를 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 UV-Vis 분광분석결과를 도시한 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노자임의 질량에 대한 촉매 활성의 선형 관계의 기울기로 표시되는 특정 활성을 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 상이한 나노자임에 의하여 활성화된 TMB 기질의 Michaelis-Menten 결과를 도시한 것이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비선형 Michaelis-Menten 곡선을 선형인 Linewaver-Burk 플롯으로 변환한 것을 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 지지체; 상기 지지체 표면에서 고정된 포획 프로브; 상기 포획 프로브와 시료를 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합을 하는 검출 프로브; 및 상기 검출 프로브에 연결되어 기질과 반응하는 질화전이금속 나노자임으로 구성된 표지;를 포함하는 바이오센서로서, 상기 질화전이금속 나노자임은 효소로서 작용하며 기질과의 반응에 의하여 시각적 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명에서 질화전이금속 나노자임 표지는 질화전이금속과 다공성 탄소를 결합하여 형성되는 것이 바람직하다. 또한 질화전이금속은 질소와 전이금속이 결합된 형태를 나타내고 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, 질화텅스텐(W2N), 질화바나듐(VN), 및 질화크롬(CrN) 중에서 선택된 하나 이상이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 질화크롬(CrN)이다.
이러한 질화전이금속 나노자임은 기질과 반응하여 효소와 동일한 역할을 함으로써 시료의 검출에 필요한 요소인 용이한 콘쥬게이트와 강한 시각적 변화를 도출할 수 있다. 구체적으로는 본 발명에서 질화전이금속 나노자임 표지는 기질과의 반응에 의하여 나타나는 시각적 변화를 나타내는데 예를 들어, 기질 색상이 파란색으로 변화될 수 있다.
본 발명의 나노자임(nanozyme)은 천연 효소가 촉진하는 반응과 유사한 반응을 촉매할 수 있는 효소와 유사한 특성을 지닌 다양한 나노 물질을 의미한다. 기존에도 나노자임(nanozyme)을 효소 대신에 활성이 높고 선택적인 촉매로 사용하기 위한 연구가 진행되었다. 나노자임의 선택적인 반응에도 불구하고 천연 효소만큼의 반응 속도를 달성하는 것은 어려운 일이다. 많은 금속산화물 나노물질과 금속 나노물질은 산화제(H2O2, O2 등)의 존재 하에서 퍼옥시데이즈(peroxidase)와 옥시데이즈(oxidase) 효소와 유사한 나노자임으로 작용할 수 있다.
나노자임에 비해 천연 효소의 한 가지 단점은 가혹한 조건에서 안정성이 제한된다는 점이다. 효소는 종종 pH, 온도 및 화학적 환경의 변화에 민감하여 활성과 효과가 저하될 수 있다. 반면 나노자임은 안정성, 비용 효율성, 조정 가능한 촉매 특성 등 천연 효소에 비해 장점이 있어 다양한 연구 및 응용 분야에서 매력적인 대안이 되고 있다.
본 발명에서 생체특이적 결합은 포획 프로브(prob)가 지지체(substrate)에 고정되고, 검출 프로브가 표지와 연결되어, 포획 프로브와 검출 프로브가 시료를 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합할 수 있다. 또는 포획 프로브가 지지체에 고정되고, 시료와 표지가 결합되거나 시료가 포획 프로브에 경쟁적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 시료 검출 바이오센서에 있어서, 기질은 효소 역할을 하는 질화전이금속 나노자임과의 반응 후 시각적 신호를 발생하는 것이 특징이다. 이러한 시각적 신호를 발생하도록 하는 것은 나노자임과 반응하게 되는 기질에 따른 것이므로 기질의 종류에 따라서 적절하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 시각적 신호를 발생시키는 기질의 예로서, 이에 한정되는 것은 아니지만 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘[3,3',5,5'-tetramethylbenzidine: TMB], 3-아미노9-에틸카바졸[3-amino-9-ethylcarbazole], o-페닐렌디아민[o-phenylenediamine], 3,3'디아미노벤지딘[3,3' diaminobenzidine], 2,2'-아지노비즈[3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산][2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진[10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 기질은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 과산화수소인 것이다.
본 발명의 시료는 인간 세럼, 플라즈마, 혈액 및 소변에서 추출할 수 있으며, 질병 진단에 사용되는 시료라면 사용에 제한이 없다. 각종 질환을 대표할 수 있는 바이오마커가 존재한다면 질환의 종류를 제한하지 않는다. 본 발명의 바이오센서는 정상 대조군에 비하여 질환이 발생한 대상체의 혈액, 조직 또는 세포에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단백질이다.
본 발명의 다른 일측면에 따르면, 바이오센서를 적용한 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 크게 진단 스트립, 하부 케이스, 상부 케이스로 구성되며, 진단 스트립은 멤브레인, 검체 패드, 및 흡수패드를 포함한다. 본 발명의 하부 케이스는 진단 스트립의 일면을 지지하며, 상부 케이스는 하부 케이스에 결합되어 분석 스트립의 다른 일면을 덮으며, 검체 패드에 대응하는 검체 투입구와 멤브레인에 대응하는 결과 표시창 및 상기 흡수 패드에 대응하는 문자 표시구를 포함한다.
멤브레인은 검출 결과를 나타내는 부분으로서 조성물이 고정된 검사선 및 대조선이 위치하는데, 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.
검체 패드는 멤브레인 한쪽 끝 상부에 일부 중첩되게 위치하여 질화전이금속 나노자임 표지를 포함하는 검체 전개액을 흡수한다. 검체 전개액은 채취한 시료, 복합체가 혼합된 것으로, 질환이 있다면 검체 전개액에는 시료 내의 바이오마커와 질화전이금속 나노자임 표지가 결합한 상태로 존재한다. 이 검체 전개액을 검체 패드 상에 떨어트리면 바이오마커와 질화전이금속 나노자임이 결합한 채로 스트립 상에서 흘러 검사선(test line)에 위치하는 상기 바이오마커와 특이적으로 결합하는 고정 항체와 면역 샌드위치 복합체를 형성한다. 이로써 멤브레인 상의 대조선(control line)과 검사선(test line)에 모두 두 줄의 갈색선이 나타나고, 이는 질병이 있다고 판단한다. 이때 대조선은 질화전이금속 나노자임 표지만 결합하며, 복합체와 결합하는 대조선 상의 고정 항체는 교차 반응을 유발하지 않으면, 그 종류가 특별히 제한되지는 않는다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
어느 하나의 실시예에 포함된 구성요소와, 공통적인 기능을 포함하는 구성요소는, 다른 실시예에서 동일한 명칭을 사용하여 설명하기로 한다. 반대되는 기재가 없는 이상, 어느 하나의 실시예에 기재한 설명은 다른 실시예에도 적용될 수 있으며, 중복되는 범위에서 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
<실시예>
1.1. 질화전이금속기반 나노자임 합성법
실시예 1
W2N@PDC-1의 제조
W2N@PDC-1은 질소를 함유하는 폴리아닐린(polyanilnine, PANI)에 포스포텅스텐산(Phosphotungstic acid, PTA)을 첨가한 후 열분해하여 합성하였으며 그 방법은 다음과 같다. PANI는 2.6 g의 염화 아닐리늄(aniline hydrochloride)을 100 ml의 물에 첨가한 용액과 11.4 g의 과황산암모늄(ammonium persulfate)을 100 ml의 물에 녹인 용액을 혼합하고 4시간 실온에서 반응 후 여과와 건조를 거쳐 약 2 g을 준비하였다. 0.2 g의 PTA를 20 ml의 에탄올에 녹이고 2 g의 PANI를 첨가한 후 30분간 초음파를 조사하여 최대한 균일한 반응물이 되도록 하였다. 증발기로 에탄올을 증발시킨 후 100 ℃ 오븐에서 약 2시간 건조하고 800 ℃에서 12시간 열분해하여 질화텅스텐(W2N)이 도핑된 PANI 유래 카본 (PANI-derived carbon, PDC) W2N@PDC-1를 합성하였다.
실시예 2
W2N@PDC-1의 제조
W2N@PDC-2는 실시예 1의 W2N@PDC-1과 동일한 방법으로 준비하였다. 0.4 g의 PTA를 20 mL의 에탄올에 녹이고 2 g의 PANI를 첨가한 후 30분간 초음파를 조사하여 최대한 균일한 반응물이 되도록 하였다. 증발기로 에탄올을 증발시킨 후 100 ℃ 오븐에서 약 2시간 건조하고, 800 ℃에서 12시간 열분해하여 질화텅스텐(W2N)이 도핑된 PANI 유래 카본 W2N@PDC-2를 합성하였다.
실시예 3
VN@PDC-1의 제조
VN@PDC-1는 PANI에 바나듐(V) 산화물 (Vanadium pentoxide, V2O5)를 첨가한 후 열분해하여 합성하였으며 그 방법은 다음과 같다. 2 ml의 염산 (HCl, 35%)을 첨가한 증류수에 0.2 g의 V2O5를 녹인 후 1 g의 PANI를 첨가하고 3시간 교반하였다. 증발기를 이용하여 염산과 증류수를 증발시킨 후 100 ℃에서 약 2시간 건조하고 1100 ℃에서 5시간 열분해하여 질화바나듐(VN)이 도핑된 PANI 유래 카본 VN@PDC를 합성하였다.
실시예 4
VN@PDC-1의 제조
VN@PDC-2는 VN@PDC-1과 같은 방법으로 준비하였으며 자세한 설명은 다음과 같다. 2 ml의 염산 (HCl, 35%)을 첨가한 증류수에 0.3 g의 V2O5를 녹인 후 1 g의 PANI를 첨가하고 3시간 교반하였다. 증발기를 이용하여 염산과 증류수를 증발시킨 후 100 ℃에서 약 2시간 건조하고 1100 ℃에서 5시간 열분해하여 질화바나듐(VN)이 도핑된 PANI 유래 카본 VN@PDC-2를 합성하였다.
실시예 5
CrN@MDC-1의 제조
CrN@MDC는 Metal Azolate Framework-6 (MAF-6)에 산화크롬(Cr2O3)과 멜라민(Melamine)을 도핑하여 준비한(Cr2O3-melamine)@MAF-6를 열분해하여 합성하였다. 수산화아연(Zn(OH)2) 2 g을 녹인 400 mL의 수산화암모늄(aqueous ammonia solution 25%), 2-에틸이미다졸(2-ethylimidazole) 3.85g을 녹인 220 mL의 에탄올(ethanol)-사이클로헥세인(cyclohexane) 혼합용액(에탄올 200 mL, 사이클로헥세인 20 mL), 그리고 에탄올 20 mL씩 담겨 있는 두 비커에 0.1 g의 Cr2O3와 0.6 g의 멜라민을 각각 첨가한 용액들을 혼합하고 30분간 실온에서 교반 후 여과와 건조(80 ℃)를 거쳐 (Cr2O3-melamine)@MAF-6를 준비하였다. 그 후 1000 ℃에서 6시간 열분해하여 CrN@MDC-1를 합성하였다.
실시예 6
CrN@MDC-2의 제조
CrN@MDC-2은 CrN@MDC-1과 같은 방법으로 준비하였으며 상세한 설명은 다음과 같다. 수산화아연(Zn(OH)2) 2 g을 녹인 400 mL의 수산화암모늄(aqueous ammonia solution 25%), 2-에틸이미다졸(2-ethylimidazole) 3.85 g을 녹인 220 mL의 에탄올(ethanol)-사이클로헥세인(cyclohexane) 혼합용액(에탄올 200 mL, 사이클로헥세인 20 mL), 그리고 에탄올 20 mL씩 담겨 있는 두 비커에 0.15 g의 Cr2O3와 0.9 g의 멜라민을 각각 첨가한 용액들을 혼합하고 30분간 실온에서 교반 후 여과와 건조(80 ℃)를 거쳐 (Cr2O3-melamine)@MAF-6를 준비하였다. 그 후 1000 ℃에서 6시간 열분해하여 CrN@MDC-2를 합성하였다.
비교예 1
Pt@ZDC의 제조
Pt@ZDC는 Zeolitic imidazolate Frameworks-8 (ZIF-8)에 염화테트라아민플래티넘(II)(Tetraamineplatinum (II) chloride, TAP)을 첨가한 후 열분해하여 합성하였다.
질산아연 수화물(Zn(NO3)2·6H2O) 2.9 g을 녹인 100 mL의 메탄올(methanol)과 2-메틸이미다졸(2-methyl-imidazole) 6.9 g을 녹인 100 mL의 메탄올을 혼합하고 2시간 동안 30 ℃에서 반응시킨 후 여과와 건조를 거쳐 ZIF-8을 준비하였다. 20 mL의 증류수에 0.2 g의 TAP을 녹이고 2 g의 ZIF-8을 첨가한 후 초음파를 30분 조사하였다. 증발기를 이용하여 증류수를 증발시키고 100 ℃에서 건조한다음 1100 ℃에서 3시간 동안 열분해하여 Pt@ZDC를 합성하였다.
<효소활성 측정방법>
합성한 질화전이금속 기반 나노자임의 활성은 각 나노자임을 기질인 3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine (TMB)와 반응시켜 peroxidase와 유사한 활성을 나타내는지를 정성적으로 조사하였다. 처음에는 각각 1mg의 나노 효소를 0.2 M 아세테이트 완충액 1mL(pH 4.3)에 분산시킨 3병의 바이알을 준비하였다. 그 후, 0.2 mL의 TMB, H2O2 및 TMB/ H2O2 혼합물(1:1)을 각 튜브에 개별적으로 첨가하였다. 그런 다음 pH 4.3의 아세테이트 완충액을 추가하여 최종 부피가 2mL가 되도록 하여 TMB와 H2O2모두 최종 농도가 5 mM가 되도록 하였다. 나노자임이 TMB를 촉매하는 데 성공했다는 것은 TMB의 산화를 나타내는 푸른색 용액이 형성됨으로써 입증되었다. 이 TMB 산화반응은 매분마다 기록되었다.
<특정활성도 (Specific activity) 결정방법>
0.2M 아세테이트 완충액, pH 4.3에 다양한 양(0~50㎍)의 퍼옥시다아제 효소역할을 모방하는 각 나노자임이 포함된 용액 1040μL를 큐벳에 넣었다. 그 후, 100μL의 TMB(50mM)와 100μL의 H2O2 (50mM) 용액을 추가하고 완전히 혼합하였다. 비색 반응은 최대 400초 동안 6초마다 653nm에서 흡광도를 측정하는 동적 모드에서 UV-Vis로 순차적으로 측정했으며, TMB와 H2O2를 첨가하지 않은 샘플은 백그라운드(바탕신호) 흡광도 측정으로 사용하였다. 653nm에서의 결과 흡광도를 반응 시간에 대해 플롯하여 흡광도 대 시간 곡선을 얻었다. 653nm에서 얻어진 결과 흡광도값에서 바탕 신호 흡광도를 뺀 후 그 값을 다음의 수학식 1에 대입하여 나노 효소 활성을 계산하였다:
[수학식 1]
b = V/(εХl) Х (ΔA/Δt)
여기서, b 는 단위로 표시된 나노자임의 촉매 활성이다.
1 단위(unit)는 37℃에서 분당 1 μmol의 생성물을 촉매적으로 생성하는 나노자임의 양으로 정의되며, V 는 반응 용액의 총 부피(μL), ε는 비색 기질의 몰 흡광 계수로, 일반적으로 653nm에서 39,000 M-1 cm-1 의 최대값을 갖는다(TMB 경우).
l 은 큐벳에서 이동하는 빛의 경로 길이(cm), A는 바탕신호값을 뺀 후의 흡광도, ΔA/Δt는 653nm/분에서 흡광도의 초기 변화율입니다. 그런 다음 나노자임의 특정 활성(U/mg)은 나노자임 무게[m]에 대한 플롯 활성(b)의 기울기로서 mg 단위로 구했다(도 2b 참조).
[수학식 2]
Specific activity (a) = b/[m]
나노 효소(b)의 촉매 활성은 질량에 선형적으로 비례하므로, [m]에 대한 b의 촉매 활성을 플롯하고 결과 직선의 기울기를 측정하여 특정 활성도 값을 수학식 2를 이용하여 결정할 수 있다.
<Steady-state kinetic 상수 측정>
각 나노자임 50μg을 아세테이트 완충액 0.2 M, pH 4.3의 1440 μL에 튜브안에 넣어서 녹인후 이에 다양한 양(0~72 μL)의 TMB 스톡 용액(DMSO 50 mM)을 첨가하였다. 그 후 최종 농도 5mM에 도달하도록 200μL의 H2O2를 혼합하였다. 혼합한 전체 샘플을 UV-Vis 큐벳에 넣고 UV-Vis 분광기로 측정하였다. 653nm에서 흡광도의 초기 변화율을 3분 동안 기록하였다(간격= 6초).
다음으로 "흡광도 대 시간" 플롯을 사용하여 각 반응의 초기 시점(초기 기울기)에서의 기울기를 구했다. 기질 농도에 대한 흡광도 증가율을 μM/분 단위로 변환하고 이를 기질 농도에 대해 플롯하였다. 그 다음 Michaelis Menten의 비선형 방정식 (수학식 3)에 핏팅하여 νmax 및 Km과 같은 knetic 파라미터를 구하였다.
[수학식 3]
νo= νmax[S] / (Km+[S])
수학식 3에서, νo는 초기 반응 속도이고, νmax는 포화 기질 농도에서 관찰되는 최대 반응 속도이다. [S]는 기질의 농도이고, Km은 Michaelis 상수이다. Km은 나노 효소의 기질에 대한 친화도를 반영하며 최대 속도의 절반에 해당하는 기질 농도로 정의된다. 다른 방법으로 이중 상호 플롯(Linewaver-Burk 플롯- 수학식 4)에서 Km과 νmax를 구할 수 있다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다:
[수학식 4]
1/νo= (Km / νmax) (1/[S]) + (1/νmax)
결과 및 평가
Mimicking enzyme-like activity
Fe3O4 NPs에 내재된 peroxydase활성이 처음 발견된 이후 resembling peroxidase, oxidase, haloperoxidase, 또는 superoxide dismutase와 유사한 촉매 활성을 보이는 다양한 종류의 나노자임이 개발되었다.
본 발명에서는 질화전이금속 기반 나노자임(예: W2N@PDC(10%), W2N@PDC(20%), VN@PDC (20%), VN@PDC (30%), CrN-1@MDC, 및 CrN-2@MDC) 5가지를 합성하였다. peroxydase 활성을 모방할 수 있는 나노자임의 효소 성능을 평가하였다. Horse radisch peroxidase (HRP)와 같은 peroxydase 유형 효소가 생의학 응용 분야에서 가장 널리 사용되는 효소라는 점을 고려해서 상기 나노자임을 합성하였다.
그 결과 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 6에 따른 질화전이금속 나노자임은 비교예 1에 따른 Pt@ZDC와 비교되었다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 TMB 기질을 촉매하는 다양한 나노자임의 peroxidase 활성에 대한 정성적 분석결과를 나타낸다. 일반적으로 W2N@PDC를 제외한 거의 모든 물질이 TMB와 반응할 때 파란색 변화를 유도하였다. H2O2만 첨가하면 파란색이 나타나지 않았다. 그러나 TMB와 H2O2를 모두 첨가하면 파란색의 진화가 가속화되었다. 이 경우 H2O2는 TMB의 산화에 필요한 산소 원자를 제공함으로써 효소 반응에서 중요한 역할을 할 수 있다.
초기 반응 시간(1~3분)에서 알 수 있듯이 5mM의 TMB/H2O2를 1mg의 VN@PDC (20%), VN@PDC (30%), CrN-1@MDC, 및 CrN-2@MDC로 촉매 처리했을 때 파란색 생성은 현저히 빨랐다. 초기 반응에서 파란색 생성물이 더 빨리 생성될수록 나노 효소가 기질 TMB의 산화를 촉진하는 데 효과적이라는 것을 나타내며, 이는 분석의 판독에 더욱 필수적이다.
나노자임의 정량적 정보를 얻기 위해 나노자임 반응의 결과로 생성되는 653nm의 청색 TMB의 흡수 특성을 조사하기 위해 UV-Vis 분광분석을 하였다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 UV-Vis 분광분석결과를 도시한 것이다. 도 2a를 참조하면, 모든 합성 나노효소 중 653nm에서 가장 높은 흡수 피크는 CrN-1@MDC와 CrN-2@MDC를 활용했을 때 관찰되었으며, 그 다음으로는 VN@PDC(30%)가 그 뒤를 이었다. 또한 VN@PDC(20%)의 경우 653nm에서 흡광도 피크가 Pt@ZDC와 유사한 결과를 나타냈다. 반면, W2N@PDC(10%) 및 W2N@PDC(20%)는 TMB/H2O2와 반응하는 능력이 더 낮게 나타났다.
또한, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노자임의 질량에 대한 촉매 활성의 선형 관계의 기울기로 표시되는 특정 활성을 도시한 것이다. 도 2b를 참조하면, CrN-2@MDC는 특정 활성의 면에서 모든 합성 물질 중 특정 반응을 촉매하는 데 가장 효과적인 나노자임이라는 것을 확인할 수 있다. 이 비교에는 촉매 효율, 기질 특이성, 안정성 및 비용 효율성과 같은 요소가 포함될 수 있다. 가장 높은 특정 활성을 아는 것은 품질 관리 목적에 필수적이며, 상업적 사용을 위해 대량으로 생산되는 나노 효소의 성능의 일관성을 보장하는 것이 필요하다.
또한 Michaelis-Menten 방정식에 따라 반응 속도와 기질 농도를 연관시키는 나노 효소의 steady-state kinetics을 입증하는 것도 중요하다. 촉매 kinetic 상수를 구하기 위해서는 다양한 TMB 농도([S])에서의 초기 반응 속도(νo)를 미카엘리스-멘텐 방정식에 맞춰야 한다. 이렇게 얻은 동역학 파라미터를 사용하여 특정 기질에 대한 나노 효소의 기질 특이성(Km), 촉매 속도 상수(kcat) 및 최대 반응 속도(νmax)를 정량적으로 비교할 수 있다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 상이한 나노자임에 의하여 활성화된 TMB 기질의 Michaelis-Menten 결과를 도시한 것이다. 도 3a를 참조하면, 반응 속도의 초기 급격한 증가와 기질 농도가 증가함에 따라 정체되는 쌍곡선 곡선은 W2N@PDC(10%), VN@PDC(30%), CrN-1@MDC, CrN-2@MDC, 및 Pt@ZDC에 의해 달성되었다. 매우 낮은 기판 농도에서는 곡선이 선형으로 나타나고 초기 속도는 기판 농도에 정비례한다. 기질 농도가 높으면 나노자임이 포화 상태가 되어 모든 나노자임 활성 부위가 점유되면서 최대 속도(νmax)가 일정해 진다. 그러나 W2N@PDC(20%)와 VN@PDC(20%)는 선형 플롯을 보여줌으로써 Michaelis-Menten 방정식 피팅에 부합하지 않는다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 kinetic 변수를 보다 정확하게 분석하기 위해 비선형 Michaelis-Menten 곡선을 선형인 Linewaver-Burk 플롯으로 변환한 것을 도시한 것이다. 도 3b를 참조하면, 이러한 선형화는 데이터 분석을 간소화하고 νmax 및 Km와 같은 매개변수를 더 쉽게 결정할 수 있게 해 준다. 가장 높은 νmax 결과는 최대 44.25 μM/min의 CrN-2@MDC에 도달했으며, 이는 모든 나노자임 활성 부위가 TMB 기질로 포화되었을 때 반응의 이론적 최대 속도를 나타낸다.
CrN-2@MDC의 νmax값은 대조군 Pt@ZDC보다 6배 높았다. 이는 또한 CrN-2@MDC 나노 효소가 TMB 기질을 파란색으로 전환하는 촉매 작용에 매우 효율적이라는 것을 시사한다. 이는 회전율이 높아 단위 시간당 나노자임이 기질 분자를 처리할 수 있는 용량이 더 크다는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 표지 물질로서 질화전이금속을 사용한 결과에 기인하는 것이라는 것을 알 수 있다.
νmax는 매개변수로서 중요한 의미를 갖지만, 일반적으로 Km와 같은 다른 동역학 인자와 함께 평가될 수 있다. Km은 반응 속도가 νmax의 절반에 도달하는 기질 농도를 나타낸다. Km 값이 낮을수록 효소의 기질에 대한 친화력이 높다는 것을 나타낸다.
결과는 다음과 같은 순서로 Km 값이 가장 낮은 것부터 가장 높은 것까지 다양하다. W2N@PDC(10%), Pt@ZDC, VN@PDC(30%), CrN-2@MDC, CrN-1@MD, VN@PDC(20%), W2N@PDC(20%) 순이다. W2N@PDC(10%) 및 Pt@ZDC가 가장 낮은 Km 값을 보였지만, νmax는 여전히 CrN@C보다 낮다.
CrN-2@MDC가 653nm에서 가장 높은 흡광도, 가장 높은 비활성도, 가장 높은 νmax 값을 보였고, 비슷한 Km 값을 보인다는 점을 고려하면 CrN-2@MDC가 모든 합성 물질 중에서 우수한 나노 효소라는 것을 확인할 수 있다.
전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (4)

  1. 지지체;
    상기 지지체 표면에서 고정된 포획 프로브;
    상기 포획 프로브와 시료를 사이에 두고 샌드위치 형태로 특이적 결합을 하는 검출 프로브; 및
    상기 검출 프로브에 연결되어 기질과 반응하는 질화전이금속 나노자임으로 구성된 표지;를 포함하는 바이오센서로서,
    상기 질화전이금속은 질화텅스텐(W2N), 질화바나듐(VN), 및 질화크롬(CrN) 중에서 선택된 하나이고,
    상기 질화전이금속 나노자임은 질화전이금속과 탄소를 결합하여 형성되고, 효소로서 작용하며 기질과의 반응에 의하여 시각적 신호를 발생하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 기질은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘[3,3',5,5'-tetramethylbenzidine: TMB], 3-아미노-9-에틸카바졸[3-amino-9-ethylcarbazole], o-페닐렌디아민[o-phenylenediamine], 3,3'-디아미노벤지딘[3,3'-diaminobenzidine], 2,2'-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], 및 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진[10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine] 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 인간 세럼, 플라즈마, 혈액 및 소변 시료 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 나노자임은 기질과의 반응에 의하여 색상이 파란색으로 변경되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190006347A (ko) * 2017-07-10 2019-01-18 부산대학교 산학협력단 산화환원 효소를 이용한 바이오센서
KR20220029016A (ko) * 2020-09-01 2022-03-08 부산대학교 산학협력단 가수분해 활성을 갖는 금속 나노자임을 이용한 바이오센서

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101204874B1 (ko) 2010-08-11 2012-11-26 한국세라믹기술원 단백질칩 기판 상에 포획항체를 고정하기 위한 최적 조건을 스크리닝 하는 방법 및 키트
KR102758127B1 (ko) 2020-11-24 2025-01-22 한국전자기술연구원 금속 나노 입자를 포함하는 바이오센서용 작업 전극의 제조 방법, 이에 의해 제조된 전극 및 제조된 전극을 사용한 시료 내 바이오마커의 농도 측정 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190006347A (ko) * 2017-07-10 2019-01-18 부산대학교 산학협력단 산화환원 효소를 이용한 바이오센서
KR20220029016A (ko) * 2020-09-01 2022-03-08 부산대학교 산학협력단 가수분해 활성을 갖는 금속 나노자임을 이용한 바이오센서

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DING LONGHUA, WANG LONGWEI, ZHANG JIAN, REN NA, WANG AIZHU, LIU HONG, YU XIN: "Nanozymes regulated by nitrogen element: Mechanism, design, and application", ADVANCED POWDER MATERIALS, vol. 3, no. 4, 1 August 2024 (2024-08-01), pages 100191 (1) - 100191 (19), XP093373525, ISSN: 2772-834X, DOI: 10.1016/j.apmate.2024.100191 *
GU CHENGLU, WANG ZHIQIANG, PAN YAWEN, ZHU SHUANG, GU ZHANJUN: "Tungsten‐based Nanomaterials in the Biomedical Field: A Bibliometric Analysis of Research Progress and Prospects", ADVANCED MATERIALS, vol. 35, no. 1, 1 January 2023 (2023-01-01), DE , pages 2204397 (1) - 2204397 (26), XP093373536, ISSN: 0935-9648, DOI: 10.1002/adma.202204397 *
MAHMUDUNNABI RABBEE G., FARHANA FATEMA ZERIN, KASHANINEJAD NAVID, FIROZ SHAKHAWAT H., SHIM YOON-BO, SHIDDIKY MUHAMMAD J. A.: "Nanozyme-based electrochemical biosensors for disease biomarker detection", ANALYST, vol. 145, no. 13, 29 June 2020 (2020-06-29), UK , pages 4398 - 4420, XP093373546, ISSN: 0003-2654, DOI: 10.1039/D0AN00558D *
MISHRA PURANJAN, LEE JUNSANG, KUMAR DEEPAK, LOURO RICARDO O., COSTA NAZUA, PATHANIA DEEPAK, KUMAR SMITA, LEE JINWOO, SINGH LAKHVEE: "Engineered Nanoenzymes with Multifunctional Properties for Next‐Generation Biological and Environmental Applications", ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS, vol. 32, no. 8, 1 February 2022 (2022-02-01), USA, pages 1 - 21, XP093373529, ISSN: 1616-301X, DOI: 10.1002/adfm.202108650 *
XIAO XUEQIAN, HU XIAO, LIU QIMING, ZHANG YULING, ZHANG GUO-JUN, CHEN SHAOWEI: "Single-atom nanozymes as promising catalysts for biosensing and biomedical applications", INORGANIC CHEMISTRY FRONTIERS, vol. 10, no. 15, 25 July 2023 (2023-07-25), pages 4289 - 4312, XP093373551, ISSN: 2052-1553, DOI: 10.1039/D3QI00430A *

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