WO2025239456A1 - 複合型プロテイングルタミナーゼ - Google Patents

複合型プロテイングルタミナーゼ

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WO2025239456A1
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WO
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amino acid
protein
protein glutaminase
glutaminase
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禎亮 滝田
清 保川
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Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Enzyme Inc
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Publication date
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a complex protein glutaminase. More specifically, the present invention relates to a complex protein glutaminase with an improved thermal denaturation temperature.
  • Protein glutaminase is an enzyme that acts on proteins, which are high molecular weight molecules, catalyzing the decomposition (deamidation) of amide-containing side chains without cleaving peptide bonds or cross-linking proteins. Protein glutaminase deamidates glutamine residues in proteins, generating negatively charged carboxyl groups, thereby changing various protein properties. For example, increasing hydration force and electrostatic repulsion due to a decrease in the isoelectric point of proteins reduces protein-protein interactions (i.e., reduces association), thereby increasing the protein's solubility and water dispersibility.
  • protein glutaminase can significantly change protein properties in this way, it has dramatically expanded the applications of proteins. For this reason, protein glutaminase is highly useful and has attracted great interest in the field.
  • Protein glutaminase is produced in a pro-form, in which the pro-sequence and mature sequence are fused together.
  • This pro-form has inactive protein glutaminase activity to protect the viability of the host cell.
  • the propeptide is cleaved from the pro-form and released outside the cell as a mature protein glutaminase.
  • the fused pro-form is released outside the cell.
  • pro-forms produced in recombinant expression systems have a strong bond between the mature sequence and the pro-sequence, making it difficult to separate the mature form by simple cleavage. While it is sometimes possible to produce a pro-form in which the propeptide binds weakly to the mature form, in this case the pro-form is degraded, making the protein glutaminase more likely to be activated, resulting in a decrease in the viability of the recombinant host cell.
  • Patent Document 1 discloses a method for heterologous expression in Bacillus subtilis as a host, in which the binding strength of the pro-sequence to the mature sequence is adjusted to enable recombinant expression and secretion without reducing the viability of the host cell, and mutations in the propeptide that can regulate the separation of the propeptide and mature form are identified, with the aim of enabling the separation of the propeptide and mature form outside the cell.
  • the method disclosed in Patent Document 1 also discloses that the thermal unfolding temperature is lower than that of the wild type due to the introduction of mutations into the pro-sequence.
  • introducing a mutation into the pro sequence reduces the thermal unfolding temperature compared to the wild type.
  • a lower thermal unfolding temperature means a decrease in thermal stability.
  • the present invention therefore aims to provide a recombinant expression technology for producing protein glutaminase with reduced loss of thermostability.
  • the inventors discovered that by introducing a thrombin recognition site into the pro-sequence upstream of the mature sequence of protein glutaminase and expressing it, the pro-form can be obtained outside of bacterial cells, and that the pro-form can be easily degraded by cleaving the recognition sequence with thrombin, while the mature form remains active even when it forms a complex with the propeptide. Furthermore, despite this complex being a product of introducing a mutation into the pro-sequence, they discovered that not only is the decrease in thermal denaturation temperature suppressed, but unexpectedly, the thermal denaturation temperature is also improved. The present invention was completed based on this finding.
  • Item 1 A thrombin-cleaved product of a mutant propolypeptide comprising a propolypeptide sequence containing a pro-sequence and a mature sequence of protein glutaminase, wherein a thrombin recognition sequence is introduced into the C-terminal region of the pro-sequence, (A) a prosequence peptide having an N-terminal truncated fragment of the thrombin recognition sequence at its C-terminus; (B) a mature protein glutaminase having a C-terminal truncated fragment of the thrombin recognition sequence at its N-terminus.
  • the complex protein-glutaminase according to Item 1 wherein the thrombin recognition sequence is introduced into a C-terminal region within 15 amino acid residues from the C-terminus of the pro-sequence so as to replace a part or all of the sequence of the C-terminal region.
  • Item 3 The complex protein-glutaminase according to Item 1, wherein the thrombin recognition sequence is introduced into a C-terminal region within 15 amino acid residues from the C-terminus of the pro-sequence so as to replace a part or all of the sequence of the C-terminal region.
  • Item 4 The conjugated protein-glutaminase according to any one of Items 1 to 3, wherein the thrombin recognition sequence is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Item 5. The complex protein-glutaminase according to any one of Items 1 to 4, wherein the pro-sequence peptide (A) comprises a polypeptide shown in any one of (A1) to (A3) below, and the mature protein glutaminase (B) comprises a polypeptide shown in any one of (B1) to (B3) below: (A1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, in which the amino acid sequence at positions 106 to 109 has been substituted with the N-terminal truncated fragment consisting of leucine residue-valine residue-proline residue-arginine residue.
  • Item 6 A DNA encoding a mutant propolypeptide comprising a propolypeptide sequence containing a pro-sequence and a mature sequence of protein glutaminase, wherein a thrombin recognition sequence is introduced into the C-terminal region of the pro-sequence, Item 6.
  • Item 7. An expression cassette or recombinant vector comprising the DNA according to Item 6.
  • Item 8. A transformant obtained by transforming a host with the expression cassette or recombinant vector according to Item 7.
  • a method for producing a complex protein glutaminase which does not include a step of removing the prosequence peptide generated in the activation step.
  • Item 10. An enzyme preparation comprising the conjugated protein glutaminase according to any one of Items 1 to 5.
  • Item 11 A modifier for a protein material, comprising the conjugated protein glutaminase according to any one of Items 1 to 5.
  • the present invention provides a recombinant expression technology for producing protein glutaminase with reduced loss of thermostability.
  • 1 shows a comparison of the secondary structural changes during the temperature rise process, measured by CD, between the conjugated protein glutaminase of the present invention (conjugated PG) and the non-conjugated protein glutaminase (PG). 1 shows a comparison of oxidation resistance between the conjugated protein glutaminase of the present invention (conjugated PG) and non-conjugated protein glutaminase (PG).
  • glycine G
  • alanine A
  • valine Val
  • Leu L
  • isoleucine I
  • phenylalanine Phe
  • tyrosine Tyr
  • tryptophan Trp
  • serine S
  • Thr threonine
  • cysteine C
  • methionine Met
  • aspartic acid Asp
  • glutamic acid Glu
  • Glu glutamine
  • Gln glutamine
  • lysine L
  • arginine Arg
  • Histidine His
  • proline Pro
  • amino acid sequences shown have the N-terminus at the left and the C-terminus at the right.
  • nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • substitution refers not only to cases where amino acid residue substitutions are artificially introduced, but also to cases where amino acid residue substitutions are introduced naturally, i.e., cases where the amino acid residues are originally different.
  • amino acid residue substitutions may be artificial or natural, with artificial substitutions being preferred.
  • the complex protein glutaminase of the present invention is a thrombin cleavage product of a mutant propolypeptide comprising a propolypeptide sequence containing a prosequence and a mature sequence of a protein glutaminase, with a thrombin recognition sequence introduced into the C-terminal region of the prosequence.
  • the complex protein glutaminase of the present invention comprises (A) a prosequence peptide having an N-terminal truncated fragment of the thrombin recognition sequence at its C-terminus, and (B) a mature protein glutaminase having a C-terminal truncated fragment of the thrombin recognition sequence at its N-terminus.
  • the mature protein glutaminase (B) is bound to the prosequence peptide (A) by a non-covalent bond.
  • the complex protein glutaminase of the present invention has a higher thermal denaturation temperature than non-complex mature protein glutaminase not having a prosequence (specifically, a protein glutaminase consisting of a mature sequence, mature protein glutaminase (B)).
  • a protein glutaminase consisting of a mature sequence, mature protein glutaminase (B)
  • oxidation resistance is also improved.
  • the conjugated protein glutaminase when the mature sequence used in the conjugated protein glutaminase is a complex of a pro-sequence peptide (A) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a mature protein glutaminase (B) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, the conjugated protein glutaminase has a higher thermal denaturation temperature and improved oxidation resistance than non-conjugated mature protein glutaminase (specifically, a protein glutaminase consisting of the amino acid sequence of positions 115 to 299 of SEQ ID NO: 1 and a mature protein glutaminase (B) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11).
  • A pro-sequence peptide
  • B mature protein glutaminase
  • protein glutaminase is an enzyme that can be classified as EC 3.5.1.44 and has the action of deamidating glutamine residues in proteins, converting them to glutamic acid, without cleaving peptide bonds or cross-linking proteins.
  • the propolypeptide sequence may include the prosequence and mature sequence of the protein glutaminase.
  • the prosequence is preferably located at the N-terminus of the mature sequence.
  • a thrombin recognition sequence is introduced into the prosequence.
  • the thrombin recognition sequence is introduced at the C-terminal region of the prosequence.
  • the C-terminal region of the prosequence may be a region in the prosequence that includes the C-terminus (i.e., the C-terminal amino acid residue) or a region in the vicinity of the C-terminus.
  • the thrombin recognition sequence can be introduced in a C-terminal region within 15 amino acid residues from the C-terminus (i.e., counting the C-terminal amino acid residue as the first, within 15 amino acid residues in the N-terminal direction, preferably within 13 amino acid residues, more preferably within 12 amino acid residues, even more preferably within 11 amino acid residues, even more preferably within 10 amino acid residues, and particularly preferably within 9 amino acid residues), so as to replace part or all of the sequence of the C-terminal region.
  • thrombin recognition sequence is not particularly limited. Specific examples of thrombin recognition sequences include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (LVPRGS) or SEQ ID NO: 3 (LVPRES), preferably the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the origin of the pro-sequence (other than the portion where the thrombin recognition sequence has been introduced) and the origin of the mature sequence are not particularly limited.
  • the origin of the pro-sequence (other than the portion where the thrombin recognition sequence has been introduced) and the origin of the mature sequence may be the same or different, but preferably they are the same.
  • the pro-sequence (other than the portion into which the thrombin recognition sequence has been introduced) and the mature sequence are preferably derived from microorganisms.
  • microorganisms include the genus Chryseobacterium (more specifically, Chryseobacterium proteolyticum, Chryseobacterium gleum JCM2410, Chryseobacterium indologenes IFO14944, Chryseobacterium meningosepticum JCM2410, Chryseobacterium indologenes IFO14944, Chryseobacterium meningosepticum JCM2410, Chryseobacterium indologenes IFO14944, Chryseobacterium meningosepticum JCM2410, Chryseobacterium indologenes IFO14944, Chryseobacterium meningosepticum JCM2410, Chryseobacterium indologenes I
  • the pro-sequence (other than the portion where the thrombin recognition sequence has been introduced) and the mature sequence may each be the wild-type sequence of the above-mentioned microorganism, or a sequence similar to the wild-type sequence.
  • the pro-sequence (other than the portion where the thrombin recognition sequence has been introduced) and the mature sequence are both wild-type sequences derived from Chryseobacterium proteolyticum, the pro-polypeptide sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 is a propolypeptide sequence comprising the pro sequence and mature sequence of wild-type protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum, with positions 1 to 114 being the pro sequence and positions 115 to 299 being the mature sequence.
  • the thrombin recognition sequence in the pro sequence can be substituted, for example, in the region of positions 100 to 114, preferably positions 102 to 114, more preferably positions 103 to 114, even more preferably positions 104 to 114, even more preferably positions 105 to 114, and particularly preferably positions 106 to 114 (C-terminal region).
  • the thrombin recognition sequence can replace the amino acid sequence consisting of positions 106 to 111.
  • Preferred mutant propolypeptides of the present invention are mutant polypeptides in which a thrombin recognition sequence has been introduced into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and polypeptides with sequences similar thereto.
  • Specific examples include the following polypeptide (I) (a mutant polypeptide in which a thrombin recognition sequence has been introduced into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1), as well as polypeptides (II) and (III) (polypeptides with sequences similar to polypeptide (I)).
  • the polypeptide generates, as a thrombin cleavage product, a complex protein glutaminase in which the sequence identity of the amino acid sequence into which the substitution has been introduced, excluding the thrombin recognition sequence, is 70% or more, and that has a higher thermal denaturation temperature and higher oxidation resistance than that of a protein glutaminase consisting of the mature sequence from positions 115 to 299 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid modification introduced into the portion of the polypeptide (II) other than the thrombin recognition sequence may include only one type of modification (e.g., substitution only) from the group consisting of substitution, addition, insertion, and deletion, or may include two or more types of modifications (e.g., substitution and insertion).
  • the number of amino acid differences in the portion other than the thrombin recognition sequence may be one or several, for example, 1 to 60, 1 to 40, or 1 to 30, preferably 1 to 25, 1 to 20, or 1 to 15, more preferably 1 to 10, even more preferably 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2, or 1.
  • the sequence identity of the portion other than the thrombin recognition sequence to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be 70% or more, preferably 80% or more, or 85% or more, more preferably 90% or more, 91% or more, 92% or more, or 93% or more, even more preferably 94% or more, 95% or more, 96% or more, or 97% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 98.5% or more, or 98.9% or more, and particularly preferably 99.3% or more, or 99.5% or more.
  • sequence identity refers to the amino acid sequence identity value obtained using the bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, pp. 247-250, 1999) of BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)].
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • amino acid residues corresponding to positions 156 (cysteine residue), 197 (histidine residue), and 217 (aspartic acid residue) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are considered to be active catalytic residues, and therefore it is desirable not to introduce substitutions or deletions at these positions.
  • a preferred embodiment of the amino acid substitution introduced is a conservative substitution. That is, examples of substitutions in the polypeptides (II) and (III) include substitution of a nonpolar amino acid with another nonpolar amino acid before substitution, substitution of an uncharged amino acid with another uncharged amino acid before substitution, substitution of an acidic amino acid with another acidic amino acid before substitution, and substitution of a basic amino acid with another basic amino acid before substitution.
  • the thermal denaturation temperature refers to the thermal denaturation midpoint temperature (Tm) at which the rate of change in ellipticity at 222 nm in the circular dichroism (CD) spectrum of the protein with temperature (thermal stability of the protein) is measured and the rate of change is 50% or more (half of the protein is denatured).
  • the thermal denaturation temperature of the polypeptides (II) and (III) need only be higher than the thermal denaturation temperature of protein glutaminase, which is a polypeptide consisting of the mature sequence from positions 115 to 299 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (i.e., wild-type mature protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum), but is preferably 2°C or higher or 2.5°C or higher, more preferably 3°C or higher or 3.5°C or higher, even more preferably 4°C or higher or 4.5°C or higher, and even more preferably 5°C or higher.
  • the upper limit of this temperature range is not particularly limited, and examples include 8°C or less, 7.5°C or less, 7°C or less, 6.5°C or less, 6°C or less, or 5.5°C or less.
  • the thermal denaturation temperature of the polypeptides (II) and (III) is preferably 2 to 8°C or 2.5 to 8°C, more preferably 3 to 8°C or 3.5 to 8°C, even more preferably 4 to 8°C or 4.5 to 8°C, and even more preferably 5 to 8°C, 5 to 7.5°C, 5 to 7°C, 5 to 6.5°C, 5 to 6°C, or 5 to 5.5°C higher than the thermal denaturation temperature of the wild-type protein glutaminase mature form derived from Chryseobacterium proteolyticum.
  • the oxidation resistance of the preferred polypeptides (II) and (III) can be confirmed by the residual protein glutaminase activity after oxidation with hydrogen peroxide (e.g., at 25°C for 10 minutes).
  • the oxidation resistance of the preferred polypeptides (II) and (III) is not particularly limited, as long as the residual activity after oxidation with hydrogen peroxide is higher than the residual activity of protein glutaminase, a polypeptide consisting of the mature sequence from positions 115 to 299 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (i.e., wild-type protein glutaminase mature form derived from Chryseobacterium proteolyticum), after oxidation with hydrogen peroxide.
  • the degree of oxidation resistance of the preferred polypeptides (II) and (III) above can be expressed as the ratio of the concentration (wt %) of hydrogen peroxide that causes the residual activity of the wild-type protein-glutaminase mature form to the concentration (wt %) of hydrogen peroxide that causes the residual activity of the preferred polypeptide to be lost by oxidation treatment under the same conditions at 25° C. for 10 minutes, to the concentration (wt %) of hydrogen peroxide that causes the residual activity of the preferred polypeptide to be lost by oxidation treatment under the same conditions, and can be, for example, 5 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, and even more preferably 30 times or more.
  • the upper limit of this ratio range is not particularly limited, and can be, for example, 100 times or less, 70 times or less, or 50 times or less.
  • the degree of oxidation resistance of the preferred polypeptides (II) and (III) above is, in terms of the ratio of the concentration (wt %) of hydrogen peroxide that causes the residual activity of the wild-type protein-glutaminase mature form to the concentration (wt %) of hydrogen peroxide that causes the residual activity of the preferred polypeptide to be lost by oxidation treatment under the above conditions, 5 to 100 times, preferably 10 to 100 times, more preferably 20 to 100 times, and even more preferably 30 to 100 times, 30 to 70 times, or 30 to 50 times.
  • polypeptide (I) As more specific examples of preferred mutant propolypeptides of the present invention, the sequence of polypeptide (I) and sequences of exemplary polypeptides (II) and (III) are shown below.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 above is a sequence in which positions 106 to 111 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are replaced with the thrombin recognition sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 above is a sequence in which methionine has been added to the N-terminus of SEQ ID NO: 6, and a purification tag (polyhistidine sequence) has been added to the C-terminus via a sequence for genetic recombination (a sequence derived from the restriction enzyme XhoI site).
  • pro-sequence peptide (A) and the mature protein glutaminase (B) constituting a preferred multi-type protein glutaminase of the present invention include the following (A1) to (A3) and (B1) to (B3), respectively.
  • SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 are the sequences of positions 1 to 109 and positions 110 to 299, respectively, of SEQ ID NO: 1 (the wild-type pro-polypeptide sequence derived from Chryseobacterium proteolyticum).
  • a polypeptide in which the sequence identity of the portion excluding the substituted sequence in the amino acid sequence into which the N-terminal truncated fragment has been introduced is 70% or more, and which, when it forms a complex with the mature protein glutaminase of (B), improves the thermal denaturation temperature compared to a protein glutaminase that is a polypeptide consisting of the mature sequence of positions 115 to 299 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence identity of the portion excluding the substituted sequence in the amino acid sequence into which the N-terminal truncated fragment has been introduced is 70% or more, and which, when it forms a complex with the mature protein glutaminase of (B), improves the thermal denaturation temperature and oxidation resistance compared to a protein glutaminase that is a polypeptide consisting of the mature sequence of positions 115 to 299 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • (B1) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the sequence consisting of the first and second amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 has been substituted with a C-terminal truncated fragment consisting of a glycine residue-serine residue or a glutamic acid residue-serine residue.
  • (B2) A polypeptide in which one or several amino acid residues other than the substituted sequence have been substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence into which a substitution has been introduced into the C-terminal truncated fragment, and which has protein glutaminase activity.
  • (B3) A polypeptide in which the amino acid sequence into which a substitution has been introduced into the C-terminal truncated fragment has a sequence identity of 70% or more excluding the substituted sequence, and which has protein glutaminase activity.
  • pro-sequence peptide (A) and mature protein glutaminase (B) constituting the preferred multi-type protein glutaminase of the present invention the sequence of the polypeptide (A1), the sequences of example polypeptides (A2) and (A3), the sequence of a preferred example polypeptide (B1), and the sequences of preferred example polypeptides (B2) and (B3) are shown below.
  • a hybrid protein glutaminase containing a combination of the pro-sequence peptide shown in SEQ ID NO: 8 and the mature protein glutaminase shown in SEQ ID NO: 10 is a thrombin cleavage product of the mutant pro-polypeptide shown in SEQ ID NO: 6
  • a hybrid protein glutaminase containing a combination of the pro-sequence peptide shown in SEQ ID NO: 9 and the mature protein glutaminase shown in SEQ ID NO: 11 is a thrombin cleavage product of the mutant pro-polypeptide shown in SEQ ID NO: 7.
  • the DNA of the present invention is a DNA used for producing the complex protein glutaminase described above in "1. Complex Protein Glutaminase,” and is a DNA encoding the mutant propolypeptide.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding a mutant propolypeptide consisting of a propolypeptide sequence comprising a prosequence and a mature sequence of protein glutaminase, with a thrombin recognition sequence introduced into the C-terminal region of the prosequence.
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it has a base sequence encoding a mutant propolypeptide consisting of the polypeptides shown in (I) to (III) described above in "1. Complex Protein Glutaminase.”
  • DNA of the present invention examples include the DNAs shown in [i] and [ii] below.
  • DNA that encodes SEQ ID NO:6 is SEQ ID NO:13.
  • SEQ ID NO:14 is SEQ ID NO:14.
  • under stringent conditions refers to incubation conditions of 6x SSC (1x SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0) containing 0.5% SDS, 5x Denhartz's (0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400), and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA at 50°C to 65°C for 4 hours to overnight.
  • Hybridization under stringent conditions is specifically performed as follows: A nylon membrane onto which a DNA library or cDNA library is immobilized is prepared, and the nylon membrane is blocked at 65°C in a prehybridization solution containing 6xSSC, 0.5% SDS, 5x Denhardt's buffer, and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA. Subsequently, each 32P -labeled probe is added, and the membrane is incubated overnight at 65°C.
  • the nylon membrane is washed in 6xSSC at room temperature for 10 minutes, in 2xSSC containing 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes, and in 0.2xSSC containing 0.1% SDS at 45°C for 30 minutes, and then autoradiography is performed to detect DNA that specifically hybridizes with the probe.
  • the DNA of the present invention can be obtained, for example, by substituting the base sequence encoding the thrombin recognition sequence in DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (the wild-type propolypeptide sequence derived from Chryseobacterium proteolyticum) and, if necessary, by introducing other base sequences (for example, a sequence for genetic recombination [such as a restriction enzyme XhoI site] and a sequence encoding a purification tag [such as polyhistidine]).
  • the DNA of the present invention can also be artificially synthesized by total gene synthesis.
  • the base sequence portion can be obtained by standard PCR methods from a nucleic acid construct such as a plasmid incorporating the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • Methods for introducing a mutation into a gene and artificially modifying the amino acid sequence include known techniques such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, and mutation introduction kits using site-directed mutagenesis, such as QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio Inc.).
  • site-directed mutagenesis such as QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio Inc.).
  • the DNA of the present invention includes various types of DNA resulting from codon degeneracy.
  • Various types of DNA encoding the same amino acid sequence can be artificially produced easily using known genetic engineering techniques. For example, in the production of a protein through genetic engineering, if the codons used in the original gene encoding the target protein are used infrequently in the host, the amount of protein expressed may be low. In such cases, high expression of the target protein can be achieved by optimizing the codon usage frequency for the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • codon usage frequency As an indicator of codon usage frequency, the sum of the host's optimal codon usage frequencies for each codon can be used.
  • An optimal codon is defined as the codon with the highest usage frequency among the codons corresponding to the same amino acid. There are no particular restrictions on codon usage frequencies as long as they are optimized for the host, but the following are examples of optimal codons for E.
  • coli F: phenylalanine (ttt), L: leucine (ctg), I: isoleucine (att), M: methionine (atg), V: valine (gtg), Y: tyrosine (tat), stop codon (taa), H: histidine (cat), Q: glutamine (cag), N: asparagine (aat), K: lysine (aaa), D: aspartic acid (gat), E: glutamic acid (gaa), S: serine (agc), P: proline (ccg), T: threonine (acc), A: alanine (gcg), C: cysteine (tgc), W: tryptophan (tgg), R: arginine (cgc), G: glycine (ggc).
  • the base sequence of DNA into which mutations have been introduced can be confirmed by sequencing using conventional methods. Specific sequencing methods include the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) or sequence analysis using an appropriate DNA sequencer. Methods for confirming whether the DNA encodes the desired polypeptide include comparing the determined base sequence with an unsubstituted base sequence such as the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, or comparing the amino acid sequence deduced from the determined base sequence with an unsubstituted amino acid sequence such as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention comprises the DNA of the present invention described above in "2. DNA.”
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention can be obtained by linking a promoter and a terminator to the DNA of the present invention, or by inserting the expression cassette of the present invention or the DNA of the present invention into an expression vector.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention may contain, as control elements, a promoter and a terminator, as well as transcription elements such as an enhancer, CCAAT box, TATA box, or SPI site, as necessary. These control elements may be operably linked to the DNA of the present invention. "Operably linked" means that the various control elements that regulate the DNA of the present invention are linked to the DNA of the present invention in a state that allows them to operate in a host cell.
  • expression vectors constructed for genetic recombination from phages, plasmids, or viruses capable of autonomously replicating within a host are preferred.
  • Such expression vectors are well known, and commercially available expression vectors include pQE-series vectors (Qiagen, Inc.), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Biosciences, Inc.), and pET-series vectors (Merck & Co., Ltd.).
  • the expression vector can be used in an appropriate combination with the host cell; for example, when E. coli is used as the host cell, examples include a combination of a pET-series vector and the DH5 ⁇ E. coli strain, a combination of a pET-series vector and the BL21 (DE3) E. coli strain, or a combination of a pDR540 vector and the JM109 E. coli strain.
  • Transformant of the present invention is obtained by transforming a host with the expression cassette or recombinant vector of the present invention described above in "3. Expression cassette or recombinant vector.”
  • the host used to produce the transformant of the present invention is not particularly limited, as long as it allows the introduction of a gene, the expression cassette or recombinant vector is stable, is capable of autonomous replication, and is capable of expressing the traits of the gene containing the DNA of the present invention.
  • Suitable examples include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida, and the genus Chryseobacterium such as Chryseobacterium proteolyticum; actinomycetes, filamentous fungi, yeast, etc., but other examples include animal cells, insect cells, plants, etc. Among these hosts, Escherichia coli is preferred.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention into a host.
  • the location of introduction of the DNA of the present invention is not particularly limited as long as the gene of interest can be expressed, and it may be on a plasmid or on the genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention include, for example, recombinant vector methods and genome editing methods.
  • Conditions for introducing the expression cassette or recombinant vector into the host can be set appropriately depending on the type of host, etc. When the host is a bacterium, examples of methods include a method using competent cells treated with calcium ions and electroporation.
  • examples of methods include electroporation, the spheroplast method, and the lithium acetate method.
  • examples of methods include electroporation, the calcium phosphate method, and the lipofection method.
  • examples of methods include the calcium phosphate method, the lipofection method, and the electroporation method.
  • examples of methods include electroporation, the Agrobacterium method, the particle gun method, and the PEG method.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention When using PCR to confirm whether the expression cassette or recombinant vector of the present invention has been incorporated into a host, for example, genomic DNA, the expression cassette, or the recombinant vector may be isolated and purified from the transformant.
  • lysate obtained by lysing the bacteria. Lysis can be achieved by treating the bacteria with a lytic enzyme such as lysozyme, and if necessary, using proteases, other enzymes, and surfactants such as sodium lauryl sulfate (SDS).
  • a lytic enzyme such as lysozyme
  • proteases other enzymes
  • surfactants such as sodium lauryl sulfate (SDS).
  • DNA can be isolated and purified from the lysate by, for example, an appropriate combination of deproteinization treatments using phenol treatment and protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation, and commercially available kits.
  • DNA can be cleaved using standard methods, for example, restriction enzyme treatment.
  • restriction enzyme treatment for example, a type II restriction enzyme that acts on a specific nucleotide sequence is used as the restriction enzyme.
  • DNA can be linked to an expression cassette or expression vector using, for example, DNA ligase.
  • primers specific to the DNA of the present invention are designed and PCR is performed.
  • the amplified products obtained by PCR are subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., and stained with ethidium bromide and SYBR Green solution, etc., and the amplified products are detected as bands, allowing for confirmation of transformation.
  • the method for producing the complex protein glutaminase of the present invention is a method for producing the enzyme described above in "1. Complex Protein Glutaminase.” Specifically, the method for producing the complex protein glutaminase of the present invention comprises a production step of culturing the transformant described above in "4. Transformant" to produce a mutant propolypeptide, and an activation step of treating the mutant propolypeptide with thrombin to obtain a thrombin-cleaved product, but does not include a step of removing the pro-sequence peptide produced in the activation step.
  • culture conditions may be appropriately set taking into consideration the nutritional and physiological properties of the transformant, but liquid culture is preferred.
  • the nutrient sources used in the medium may be those required for the growth of the transformant.
  • the carbon source may be any assimilable carbon compound, such as glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, or pyruvic acid.
  • the nitrogen source may be any assimilable nitrogen compound, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolysate, or alkaline extract of soybean meal.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, as well as specific amino acids and specific vitamins, may also be used as needed.
  • the culture temperature can be set as appropriate within a range in which the transformant of the present invention can grow and the transformant can produce the mutant propolypeptide, but is preferably approximately 15 to 37°C. Culture can be completed at an appropriate time when the mutant propolypeptide reaches its maximum yield, and the culture time is usually approximately 12 to 48 hours.
  • the culture medium After culturing the transformant, the culture medium is centrifuged or otherwise subjected to a method to recover the culture supernatant and/or bacterial cells.
  • the bacterial cells can be solubilized by mechanical methods such as ultrasound or French press, or by treatment with a lytic enzyme such as lysozyme, and if necessary, by using an enzyme such as protease or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS), to obtain a water-soluble fraction containing the mutant propolypeptide.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • the expressed mutant propolypeptide can be secreted into the culture medium, thereby obtaining a culture medium containing the mutant propolypeptide.
  • the water-soluble fraction or culture medium containing the mutant propolypeptide obtained as described above may be subjected to the activation step as is, or the mutant propolypeptide in the water-soluble fraction or culture medium may be concentrated and/or purified before being subjected to the activation step.
  • the mutant propolypeptide obtained in the production step is treated with thrombin. Since it is sufficient that the mutant propolypeptide to be treated with thrombin is present, this activation step can be carried out, for example, by contacting the mutant propolypeptide with thrombin after the completion of the above-mentioned production step, or by adding thrombin to the culture medium simultaneously with the start of the production step or after the start of the production step (and before the end of the production step).
  • the mutant propolypeptide has a thrombin recognition sequence substitution introduced into the pro sequence, and when the thrombin recognition sequence is cleaved by thrombin, it is cleaved into the pro sequence peptide (A) and the mature protein glutaminase (B). This results in protein glutaminase activity.
  • the pro sequence peptide (A) and the mature protein glutaminase (B) are non-covalently bound to each other in the form of a complex (complex protein glutaminase), which exhibits protein glutaminase activity.
  • the complex protein glutaminase can be concentrated and/or purified as necessary. Concentration can be achieved, for example, by vacuum concentration, membrane concentration, salting out, or fractional precipitation using a hydrophilic organic solvent (e.g., methanol, ethanol, or acetone). Purification can be achieved, for example, by an appropriate combination of methods such as gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • a hydrophilic organic solvent e.g., methanol, ethanol, or acetone
  • the purified complex protein glutaminase may be powdered by freeze-drying, vacuum drying, spray drying, etc., if necessary.
  • the complex-type protein glutaminase can be provided in the form of an enzyme preparation. Accordingly, the present invention also provides an enzyme preparation containing the complex-type protein glutaminase described above in "1. Complex-type protein glutaminase" as an active ingredient.
  • the content of conjugated protein glutaminase in the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, but the lower limit of the content can be, for example, 1 U/g or more, 5 U/g or more, or 10 U/g or more, preferably 50 U/g or more, 100 U/g or more, 500 U/g or more, or 800 U/g or more.
  • the upper limit of the content can be, for example, 10,000 U/g or less, 5,000 U/g or less, 2,000 U/g or less, 1,500 U/g or less, or 1,000 U/g or less.
  • Specific contents of conjugated protein glutaminase in the enzyme preparation of the present invention can be, for example, 1 to 10,000 U/g, 5 to 10,000 U/g, or 10 to 10,000 U/g, preferably 50 to 5,000 U/g, 100 to 2,000 U/g, 500 to 1,500 U/g, or 800 to 1,000 U/g.
  • One unit (1U) of protein glutaminase activity is the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ammonia per minute using Z-Gln-Gly (benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine) as a substrate.
  • the enzyme preparation of the present invention may contain other components in addition to the complex protein glutaminase, to the extent that the effects of the present invention are not affected.
  • examples of other components include enzymes other than the complex protein glutaminase, additives, and culture residues generated in the above-mentioned production method.
  • Examples of other enzymes include amylases ( ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase), glucosidases ( ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase), galactosidases ( ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase), proteases (acid proteases, neutral proteases, alkaline proteases), peptidases (leucine peptidase, aminopeptidase), lipase, esterase, cellulase, phosphatases (acid phosphatases, alkaline phosphatases), nucleases, deaminases, oxidases, dehydrogenases, glutaminase, pectinases, catalases, dextranases, transglutaminases, protein deamidase (other than the above-mentioned complex protein glutaminases), pullulanases, etc. These other enzymes
  • Additives include excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, antiseptics, and physiological saline.
  • Excipients include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, and glycerol.
  • Buffers include phosphates, citrates, and acetates.
  • Stabilizers include propylene glycol and ascorbic acid.
  • Preservatives include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, and methylparaben.
  • Preservatives include ethanol, benzalkonium chloride, parahydroxybenzoic acid, and chlorobutanol. These additives may be used alone or in combination.
  • Culture residues include components derived from the culture medium, contaminating proteins, bacterial components, etc.
  • the form of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and examples include liquid and solid forms (powder, granules, etc.).
  • the composition can be prepared by generally known methods.
  • the above-mentioned complex protein glutaminase can be used for known uses of protein glutaminase.
  • the complex protein glutaminase can be used for the purpose of modifying protein materials. Therefore, the present invention also provides a protein material modifier containing the complex protein glutaminase.
  • a protein material may be modified is not particularly limited, and any change in the properties of the protein may be brought about by the generation of a carboxyl group through the deamidation of the gamma-amide group in the glutamine residue of the protein.
  • Specific modifications to protein materials include increased protein solubility, increased water dispersibility, improved emulsifying power, improved emulsion stability, improved foaming properties, and improved foam stability.
  • conjugated protein glutaminase can be used for the purpose of modifying a protein material. Therefore, the present invention also provides a method for producing a modified protein material, which includes an enzymatic treatment step in which the conjugated protein glutaminase acts on a protein material.
  • a mixture containing a protein material and a complex protein glutaminase can be subjected to conditions for the action of the complex protein glutaminase, thereby allowing the reaction to modify the protein to proceed.
  • Protein materials are not particularly limited as long as they contain protein, and may be either edible or non-edible.
  • Edible protein materials can be used as food or beverages, or as ingredients for producing food or beverages.
  • Non-edible protein materials can be used as materials for protein experiments, medical materials, textile materials, cosmetic materials, etc.
  • protein materials include the protein source itself (i.e., an organ or part thereof of an organism, or a body fluid of an organism, etc.), and preparations obtained by treating a protein source using a known method to concentrate the protein by removing at least one component other than the protein, and these can be selected appropriately by those skilled in the art.
  • the protein when the protein is a vegetable protein, examples of the vegetable protein include proteins from cereals such as soybeans, peas, lentils, chickpeas, black beans, broad beans, mung beans, lupin beans, and kidney beans; proteins from cereals such as wheat, barley, oats, sorghum, rice, rye, buckwheat, barnyard millet, foxtail millet, teff, corn, and potato; proteins from nuts and seeds such as almonds, coconuts, peanuts, cashew nuts, hazelnuts, pecan nuts, macadamia nuts, pistachios, walnuts, Brazil nuts, pili nuts, chestnuts, sesame seeds, pine nuts, hemp seeds (hemp refers to industrial hemp containing less than 0.3% by weight, preferably less than 0.2% by weight, more preferably less than 0.01% by weight, of tetrahydrocannabinol per dry weight, and most preferably containing no tetrahydrocanna
  • animal proteins include proteins from meat, fish, eggs, milk, serum, hair, insects, etc., such as casein ( ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, etc.), whey, albumin ( ⁇ -lactalbumin, serum albumin, etc.), globulins ( ⁇ -lactoglobulin, immunoglobulin, etc.), lactoferrin, wool, silk, myofibrillar proteins (myosin, actin, troponin, tropomyosin, etc.), muscle matrix proteins (collagen, etc.), etc.
  • casein ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, etc.
  • albumin ⁇ -lactalbumin, serum albumin, etc.
  • globulins ⁇ -lactoglobulin, immunoglobulin, etc.
  • lactoferrin wool, silk, myofibrillar proteins (myosin, actin, troponin, tropomyosin, etc.), muscle matrix proteins (collagen
  • the protein material may be in an unstructured or structured form. If the protein material is in an unstructured form, its form may be fluid, such as a liquid, slurry, or paste.
  • the conditions for the action of the complex protein glutaminase are determined appropriately based on the optimal temperature, optimal pH, etc. of the complex protein glutaminase used.
  • enzymatic treatment can be performed at a higher temperature in the enzymatic treatment step than with a non-conjugated mature protein glutaminase that does not have a pro sequence.
  • temperature conditions include 55°C or higher, 58°C or higher, or 60°C or higher, preferably 62°C or higher, 63°C or higher, more preferably 64°C or higher, or 65°C or higher, with upper limits of, for example, 70°C or lower, 68°C or lower, 66°C or lower, 64°C or lower, 62°C or lower, or 60°C or lower.
  • temperature conditions include, for example, 55-70°C, 58-70°C, 58-68°C, 58-66°C, 58-64°C, 58-62°C, 58-60°C, or 60-70°C, preferably 62-70°C, 63-70°C, more preferably 64-68°C, or 65-66°C.
  • the mixture is cooled and, if necessary, post-processed to obtain the modified protein material.
  • modified protein materials include those obtained from materials containing animal protein, such as milk, cream (e.g., coffee creamer), dried milk or cream (e.g., skim milk powder), fermented milk products (e.g., cheese, yogurt), and processed meat foods (e.g., processed meat, poultry, and fish paste foods, more specifically, hamburgers, meatballs, patties, meatloaf, minced meat cutlets, and dim sum).
  • milk cream
  • cream e.g., coffee creamer
  • skim milk powder e.g., skim milk powder
  • fermented milk products e.g., cheese, yogurt
  • processed meat foods e.g., processed meat, poultry, and fish paste foods, more specifically, hamburgers, meatballs, patties, meatloaf, minced meat cutlets, and dim sum.
  • modified protein materials include those obtained from materials containing plant protein, such as plant-based milk, plant-based cream (e.g., plant-based coffee creamer), dried plant-based milk or plant-based cream (e.g., powdered plant-based milk), fermented plant-based milk (e.g., cheese substitutes, yogurt substitutes), and meat-like processed foods (foods that imitate processed meat, poultry, and/or minced fish foods using meat substitutes, such as foods that imitate hamburgers, meatballs, patties, meatloaf, minced meat cutlets, and dim sum using meat substitutes).
  • plant-based milk e.g., plant-based coffee creamer
  • dried plant-based milk or plant-based cream e.g., powdered plant-based milk
  • fermented plant-based milk e.g., cheese substitutes, yogurt substitutes
  • meat-like processed foods foods that imitate processed meat, poultry, and/or minced fish foods using meat substitutes, such as foods that imitate hamburgers, meatballs,
  • Example 1 (1) Preparation of Complex Protein Glutaminase A gene was synthesized consisting of a sequence (SEQ ID NO: 15) in which an NdeI site was added to the 5'-end and an XhoI site was added to the 3'-end of a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 12) encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the propolypeptide of protein glutaminase derived from Chryseobacterium proteolyticum.
  • the gene was cleaved with NdeI and XhoI and introduced into the corresponding sites of the pET22 vector to obtain pET22b-CpPGPro-(His) 6.
  • the thrombin recognition sequence was introduced into pET22b-CpPGPro-(His) 6 by the QuikChange method using the following primers for introducing the thrombin recognition sequence, thereby constructing a recombinant vector incorporating the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • PcPG-Thro-1-(+) AACCATTCTGACCCTGGTACCGCGTGGTAGCACCAATAAACTGG (SEQ ID NO: 16)
  • PcPG-Thro-1-(-) CCAGTTTATTGGTGCTACCACGCGGTACCAGGGTCAGAATGGTT (SEQ ID NO: 17)
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the resulting recombinant vector.
  • the resulting transformant was cultured at 37°C in LB medium (50 ml) containing a final concentration of 100 ⁇ g/mL ampicillin, then added to LB medium (350 ml). When the OD600 reached 0.5-1.0, IPTG was added (final concentration 1 mM).
  • the culture was then cultured at 20°C for 24 hours, and the cells were collected by centrifugation. The cells were suspended in buffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 ml), disrupted by sonication, and the soluble fraction was collected by centrifugation. This soluble fraction contained the mutant propolypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7.
  • the soluble fraction was treated with thrombin to cleave the thrombin recognition sequence. Specifically, 880 ⁇ l of 250 U/ml thrombin solution was added to 33 ml of the soluble bacterial fraction, and the mixture was left to stand (treated) at 10°C for 19 hours. The treated product was applied to an affinity column (4 ml of IMAC Ni-Charged Resin (BIO-RAD)) and washed with a buffer solution (20 mM potassium phosphate (pH 7.4) containing 0.5 M NaCl). The complex protein glutaminase was then eluted and recovered using a buffer solution (20 mM potassium phosphate (pH 7.4) containing 0.5 M NaCl) containing 100 mM imidazole.
  • a buffer solution (20 mM potassium phosphate (pH 7.4) containing 0.5 M NaCl) containing 100 mM imidazole.
  • the resulting complex protein glutaminase was a complex of a pro-sequence peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9 and a mature protein glutaminase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:11 non-covalently bound to the pro-sequence peptide.
  • the amount of ammonia generated in the reaction solution was measured using an Ammonia Test Wako (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the ammonia concentration in the reaction solution was determined from a calibration curve showing the relationship between ammonia concentration and absorbance (630 nm) prepared using an ammonia standard solution (ammonium chloride).
  • the activity of complex protein glutaminase was calculated using the following formula, where 1 unit (1 U) is the amount of enzyme required to produce 1 ⁇ mol of ammonia per minute.
  • the reaction solution volume is 2.1
  • the enzyme solution volume is 0.1
  • Df is the dilution factor of the enzyme solution
  • 17.03 is the molecular weight of ammonia.
  • conjugated protein glutaminase conjugated protein glutaminase
  • PG protein glutaminase consisting of the amino acid sequence of positions 115 to 229 of SEQ ID NO: 1
  • Figure 1 shows a graph depicting the secondary structure changes during the heating process as measured by CD, with temperature on the horizontal axis and the rate of change on the vertical axis.
  • Tm value thermal denaturation midpoint temperature
  • conjugated protein glutaminase had improved thermal stability compared to non-conjugated protein glutaminase.
  • Example 2 The oxidation resistance of the conjugated protein glutaminase (conjugated PG) prepared in Example 1 was evaluated in comparison with a non-conjugated protein glutaminase having no prosequence (PG, specifically, a protein glutaminase consisting of the amino acid sequence of positions 115 to 229 of SEQ ID NO: 1).
  • PG specifically, a protein glutaminase consisting of the amino acid sequence of positions 115 to 229 of SEQ ID NO: 1.
  • non-conjugated protein glutaminase without a pro sequence lost its residual activity when the final concentration of hydrogen peroxide used in the oxidation was 0.03 wt%, while conjugated protein glutaminase exhibited significantly improved oxidation resistance, such that it did not lose its residual activity even when hydrogen peroxide was used in the oxidation at a final concentration of 1 wt%.

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Abstract

本発明は、熱安定性の低下が抑制されたプロテイングルタミナーゼを産生する組換え発現技術を提供することを目的とする。プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドの、トロンビン切断物であって、（Ａ）前記トロンビン認識配列のＮ末端側切断片をＣ末端に有するプロ配列ペプチドと、（Ｂ）前記トロンビン認識配列のＣ末端側切断片をＮ末端に有する成熟プロテイングルタミナーゼと、を含む複合型プロテイングルタミナーゼは、非複合型プロテイングルタミナーゼに比べて熱変性温度が向上している。

Description

複合型プロテイングルタミナーゼ
　本発明は、複合型プロテイングルタミナーゼに関する。より具体的には、本発明は、熱変性温度が向上した複合型プロテイングルタミナーゼに関する。
　プロテイングルタミナーゼは、高分子であるタンパク質に作用し、ペプチド結合の切断もタンパク質の架橋も伴わず、アミド基含有側鎖を分解する（つまり脱アミド化する）反応を触媒する酵素である。プロテイングルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基を脱アミド化することで負電荷のカルボキシル基を生じるため、タンパク質に対し様々な特性変化をもたらす。例えば、タンパク質の等電点が低下することによる水和力の増加及び静電反撥力の上昇は、蛋白質間の相互作用を低下させ（すなわち会合性を低下させ）るため、タンパク質の可溶性及び水分散性を増大させる。また、タンパク質の高次構造が変化することによる内部疎水性領域の表出は、タンパク質に界面活性を付与するため、タンパク質の乳化力、乳化安定性、起泡性、泡沫安定性を向上させる。プロテイングルタミナーゼは、このようにタンパク質の特性を大きく変化させることができるため、タンパク質の用途を飛躍的に増大させてきた。このため、プロテイングルタミナーゼは非常に有用性が高く、当該技術分野で高い関心が寄せられてきた。
　このような有用性の高いプロテイングルタミナーゼの商業的生産のため、組換え発現系を用いて効率的に産生させる技術が検討されている。プロテイングルタミナーゼは、プロ配列と成熟体配列とが融合したプロ体で産生され、このプロ体は、宿主細胞の生存能力を保護するためにプロテイングルタミナーゼ活性が不活性状態となっている。Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物のような生産菌で産生される場合は、プロ体からプロペプチドが切断され、プロテイングルタミナーゼ成熟体として菌体外に放出される一方、組換え発現系では融合状態のプロ体として菌体外に放出される。組換え発現系による多くのプロ体では、成熟体配列とプロ配列との結合が強いため、単純な切断では成熟体を分離することができないという問題がある。成熟体に対するプロペプチドの結合力が弱いプロ体を産生できる場合もあるが、この場合は、プロ体が分解されてプロテイングルタミナーゼが活性化されやすく、組換え宿主細胞の生存率が低下する。
　特許文献１では、成熟体配列に対するプロ配列の結合力が、宿主細胞の生存率を低下させることなく組換え発現および分泌を可能にするように調整され、且つ、細胞外でプロペプチドと成熟体との分離を可能にすることを目的として、プロペプチドと成熟体の分離を調節可能なプロペプチドの変異点を見出し、枯草菌を宿主として異種発現させる方法が開示されている。また、特許文献１の方法では、プロ配列への変異導入により、野生型よりも熱アンフォールディング温度が低下することも記載されている。
国際公開第２０２３／１７０１７７号
　上述の通り、特許文献１の記載によれば、プロ配列への変異導入によって、野生型よりも熱アンフォールディング温度が低下する。熱アンフォールディング温度が低下することは、熱安定性が低下することを意味する。プロテイングルタミナーゼの高い有用性から期待される用途の更なる拡大可能性に鑑みると、組換え発現系により産生するプロテイングルタミナーゼであっても、熱安定性の低下が抑制されたものであることが望まれる。
　そこで、本発明は、熱安定性の低下が抑制されたプロテイングルタミナーゼを産生する組換え発現技術を提供することを目的とする。
　本発明者は、鋭意検討の結果、プロテイングルタミナーゼの成熟体配列上流のプロ配列にトロンビン認識部位を導入して発現させることにより、プロ体を菌体外にて取得可能で、トロンビンによる認識配列の切断処理によりプロ体を容易に分解可能でありながら、成熟体がプロペプチドと共に複合体を形成した状態でも活性を呈することを見出した。さらに、当該複合体が、プロ配列へ変異を導入した産生物でありながら、熱変性温度の低下が抑制されるにとどまらず、予想外にも、熱変性温度が向上することも見出した。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドの、トロンビン切断物であって、
　（Ａ）前記トロンビン認識配列のＮ末端側切断片をＣ末端に有するプロ配列ペプチドと、
　（Ｂ）前記トロンビン認識配列のＣ末端側切断片をＮ末端に有する成熟プロテイングルタミナーゼと、を含む、複合型プロテイングルタミナーゼ。
項２．　前記トロンビン認識配列が、前記プロ配列のＣ末端から１５アミノ酸残基長以内のＣ末端領域において、前記Ｃ末端領域の一部又は全部の配列を置換するように導入されている、項１に記載の複合型プロテイングルタミナーゼ。
項３．　前記変異プロポリペプチドが、以下の（I）～（III）のいずれかに示すポリペプチドからなる、項１又は２に記載の複合型プロテイングルタミナーゼ：
　（I）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第１０６位～第１１１位アミノ酸配列の、トロンビン認識配列への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　（II）前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド、及び
　（III）前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド。
項４．　前記トロンビン認識配列が、配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列である、項１～３のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼ。
項５．　前記（Ａ）のプロ配列ペプチドが、以下の（Ａ１）から（Ａ３）のいずれかに示すポリペプチドからなり、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼが、以下の（Ｂ１）から（Ｂ３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、項１～４のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼ：
　（Ａ１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、第１０６位～第１０９位アミノ酸配列の、ロイシン残基－バリン残基－プロリン残基－アルギニン残基からなる前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　（Ａ２）前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度を向上させる、ポリペプチド、及び
　（Ａ３）前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度を向上させる、ポリペプチド、並びに
　（Ｂ１）配列番号５に示すアミノ酸配列において、第１位～第２位アミノ酸残基からなる配列の、グリシン残基－セリン残基、又はグルタミン酸残基－セリン残基からなる前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
　（Ｂ２）前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、プロテイングルタミナーゼ活性を有するポリペプチド、及び
　（Ｂ３）前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、プロテイングルタミナーゼ活性を有するポリペプチド。
項６．　プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドをコードしているＤＮＡであって、
　項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼの製造に用いられる、ＤＮＡ。
項７．　項６に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
項８．　項７に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項９．　項８に記載の形質転換体を培養し、変異プロポリペプチドを産生する産生工程と、
　前記変異プロポリペプチドをトロンビン処理し、トロンビン切断物を得る活性化工程とを含み、
　前記活性化工程で生じたプロ配列ペプチドを除去する工程を含まない、複合型プロテイングルタミナーゼの製造方法。
項１０．　項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼを含む酵素剤。
項１１．　項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼを含む、タンパク質材料の改質剤。
項１２．　項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼをタンパク質材料に作用させる酵素処理工程を含む、改質されたタンパク質材料の製造方法。
　本発明によれば、熱安定性の低下が抑制されたプロテイングルタミナーゼを産生する組換え発現技術が提供される。
本発明の複合型のプロテイングルタミナーゼ（複合型ＰＧ）と非複合型のプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）との、ＣＤ測定による昇温過程の二次構造変化の対比を示す。 本発明の複合型のプロテイングルタミナーゼ（複合型ＰＧ）と非複合型のプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）との、酸化耐性の対比を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、トレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リシン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
　本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷性アミノ酸」には、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
　本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
１．複合型プロテイングルタミナーゼ
　本発明の複合型プロテイングルタミナーゼは、プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドの、トロンビン切断物である。具体的には、本発明の複合型プロテイングルタミナーゼは、（Ａ）前記トロンビン認識配列のＮ末端側切断片をＣ末端に有するプロ配列ペプチドと、（Ｂ）前記トロンビン認識配列のＣ末端側切断片をＮ末端に有する成熟プロテイングルタミナーゼと、を含む。本発明の複合型プロテイングルタミナーゼは、成熟プロテイングルタミナーゼ（Ｂ）が、非共有結合によりプロ配列ペプチド（Ａ）と結合している。本発明の複合型プロテイングルタミナーゼは、このような複合型の形態をとることにより、プロ配列を有しない非複合型の成熟プロテイングルタミナーゼ（具体的には、成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼ、成熟プロテイングルタミナーゼ（Ｂ））よりも、熱変性温度が向上している。本発明の複合型プロテイングルタミナーゼの好ましい実施形態においては、さらに、酸化耐性も向上している。例えば、複合型プロテイングルタミナーゼに採用される成熟体配列が、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるプロ配列ペプチド（Ａ）と配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる成熟プロテイングルタミナーゼ（Ｂ）との複合体である場合、当該複合型プロテイングルタミナーゼは、非複合型の成熟プロテイングルタミナーゼ（具体的には、配列番号１の第１１５～２９９位のアミノ酸配列からなるプロテイングルタミナーゼ、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる成熟プロテイングルタミナーゼ（Ｂ））よりも、熱変性温度が向上し且つ酸化耐性も向上している。
　本発明において、プロテイングルタミナーゼは、ＥＣ３．５．１．４４に分類できる酵素であり、ペプチド結合の切断を伴わず且つタンパク質の架橋も伴わず、タンパク質のグルタミン残基を脱アミド化し、グルタミン酸に変換する作用を示す。
　プロポリペプチド配列は、プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含んでいればよい。プロポリペプチド配列において、プロ配列は、好ましくは成熟体配列のＮ末端に位置する。
　プロポリペプチド配列においては、プロ配列にトロンビン認識配列が導入されている。トロンビン認識配列が導入される位置は、プロ配列のＣ末端領域である。プロ配列のＣ末端領域は、プロ配列中の、Ｃ末端（つまりＣ末端アミノ酸残基）を含む領域又はＣ末端の近傍の領域であればよい。好ましくは、トロンビン認識配列は、Ｃ末端から１５アミノ酸残基長以内（つまり、Ｃ末端アミノ酸残基を１番目として数えて、Ｎ末端方向に１５アミノ酸残基長以内、好ましくは１３アミノ酸残基長以内、より好ましくは１２アミノ酸残基長以内、さらに好ましくは１１アミノ酸残基長以内、一層好ましくは１０アミノ酸残基長以内、特に好ましくは９アミノ酸残基長以内）のＣ末端領域において、Ｃ末端領域の一部又は全部の配列を置換するように導入することができる。
　トロンビン認識配列として用いる配列は、特に限定されない。トロンビン認識配列の具体例としては、配列番号２（LVPRGS）又は配列番号３（LVPRES）に示すアミノ酸配列が挙げられ、好ましくは配列番号２に示すアミノ酸配列が挙げられる。
　プロ配列（トロンビン認識配列が導入された部分以外）の由来、及び成熟体配列の由来は特に限定されない。プロ配列（トロンビン認識配列が導入された部分以外）の由来と成熟体配列の由来とは、同じであってもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは、同じである。
　プロ配列（トロンビン認識配列が導入された部分以外）の由来、及び成熟体配列の由来としては、好ましくは微生物が挙げられる。微生物の具体例としては、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属［より具体的には、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クリセオバクテリウム・グレウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｅｕｍ）ＪＣＭ２４１０、クリセオバクテリウム・インドロゲネス（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ１４９４４、クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ１２５３５、クリセオバクテリウム・バラスチナム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｌｕｓｔｉｎｕｍ）ＩＦＯ１５０５３、クリセオバクテリウム・インドルセティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｄｏｌｔｈｅｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ２７９５０、クリセオバクテリウム・スコフサルナム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｍ）ＣＣＭ４１０９等］、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属［より具体的には、フラボバクテリウム・アクアティレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｑｕａｔｉｌｅ）ＩＦＯ１５０５２等］、エンペドバクター（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属［より具体的には、エンペドバクター・ブレビス（Ｅｍｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｂｒｅｖｉｓ）ＩＦＯ１４９４３等］、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属［より具体的には、スフィンゴバクテリウム・スピリチボラム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）ＩＦＯ１４９４８、スフィンゴバクテリウム・ヘパリナム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）ＩＦＯ１２０１７等］、アウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属［より具体的には、アウレオバクテリウム・エステロアロマティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ３７５１等］、及びミロイデス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ）属［より具体的には、ミロイデス・オドラタス（Ｍｙｒｏｉｄｅｓ ｏｄｏｒａｔｕｓ）ＩＦＯ１４９４５等］が挙げられる。これらの微生物の中でも、好ましくはクリセオバクテリウム属が挙げられ、より好ましくはクリセオバクテリウム・プロテオリティカムが挙げられる。
　プロ配列（トロンビン認識配列が導入された部分以外）、及び成熟体配列は、それぞれ、上記微生物の野生型配列であってもよいし、野生型配列と類似の配列であってもよい。例えば、プロ配列（トロンビン認識配列が導入された部分以外）及び成熟体配列がいずれもクリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型配列である場合、プロポリペプチド配列は配列番号１で示される。
　すなわち、配列番号１は、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列であり、１～１１４位がプロ配列であり、１１５～２９９位が成熟体配列である。プロ配列におけるトロンビン認識配列の置換は、例えば、１００～１１４位、好ましくは１０２～１１４位、より好ましくは１０３～１１４位、さらに好ましくは１０４～１１４位、一層好ましくは１０５～１１４位、特に好ましくは１０６～１１４位の領域（Ｃ末端領域）に導入でき、具体的には、トロンビン認識配列は１０６～１１１位からなるアミノ酸配列を置換することができる。
　本発明における好ましい変異プロポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列にトロンビン認識配列が導入された変異ポリペプチド及びそれと配列類似のポリペプチドであり、具体的には、以下の（I）のポリペプチド（配列番号１に示すアミノ酸配列にトロンビン認識配列が導入された変異ポリペプチド）、並びに（II）及び（III）のポリペプチド（（I）のポリペプチドと配列類似のポリペプチド）が挙げられる。
　（I）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第１０６位～第１１１位アミノ酸配列のトロンビン認識配列への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　（II）前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド。好ましくは、前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼよりも高い熱変性温度及び高い酸化耐性を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド。
　（III）前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド。好ましくは、前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼよりも高い熱変性温度及び高い酸化耐性を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド。
　前記（II）のポリペプチドのトロンビン認識配列以外の部分において導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（II）のポリペプチドにおいて、トロンビン認識配列以外の部分におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～６０個、１～４０個、又は１～３０個、好ましくは１～２５個、１～２０個、又は１～１５個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は１～４個、一層好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個、若しくは１個が挙げられる。
　また、前記（III）のポリペプチドにおいて、トロンビン認識配列以外の部分の、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、又は８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、又は９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、９５％以上、９６％以上、又は９７％以上、一層好ましくは９８％以上、より一層好ましくは９８．５％以上、又は９８．９％以上、特に好ましくは９９．３％以上、又は９９．５％以上が挙げられる。
　ここで、前記（III）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記（II）及び（III）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１５６位（システイン残基）、第１９７位（ヒスチジン残基）及び第２１７位（アスパラギン酸残基）に相当するアミノ酸残基は、活性触媒残基と考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　前記（II）及び（III）のポリペプチドのトロンビン認識配列以外の部分において、配列番号１に対してアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の好適な一態様として保存的置換が挙げられる。即ち前記（II）及び（III）のポリペプチドにおける置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　前記（II）及び（III）のポリペプチドにおいて、熱変性温度は、温度変化に伴うタンパク質の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルにおける２２２ｎｍの楕円率の変化率（熱に対するタンパク質の安定性）を測定した際、変化率が５０％以上となる（半分のタンパク質が変性する）熱変性中点温度（Ｔｍ）を指す。前記（II）及び（III）のポリペプチドにおける熱変性温度は、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼ（つまり、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼ成熟体）の熱変性温度よりも高ければよいが、好ましくは２℃以上又は２．５℃以上、より好ましくは３℃以上又は３．５℃以上、さらに好ましくは４℃以上又は４．５℃以上、一層好ましくは５℃以上高い。当該温度範囲の上限については特に限定されないが、例えば８℃以下、７．５℃以下、７℃以下、６．５℃以下、６℃以下、又は５．５℃以下が挙げられる。具体的には、前記（II）及び（III）のポリペプチドにおける熱変性温度は、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼ成熟体の熱変性温度よりも、好ましくは２～８℃又は２．５～８℃、より好ましくは３～８℃又は３．５～８℃、さらに好ましくは４～８℃又は４．５～８℃、一層好ましくは５～８℃、５～７．５℃、５～７℃、５～６．５℃、５～６℃、又は５～５．５℃高い。
　前記（II）及び（III）の好ましいポリペプチドにおける酸化耐性は、過酸化水素による酸化処理（例えば２５℃で１０分間の条件下）を受けた後のプロテイングルタミナーゼ残存活性により確認できる。例えば、前記（II）及び（III）の好ましいポリペプチドにおける酸化耐性については、過酸化水素による酸化処理を受けた後の残存活性が、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼ（つまり、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロテイングルタミナーゼ成熟体）が過酸化水素による酸化処理を受けた後の残存活性よりも高ければ特に限定されない。この場合、前記（II）及び（III）の好ましいポリペプチドにおける酸化耐性の程度としては、２５℃で１０分間の条件下での酸化処理により当該野生型プロテイングルタミナーゼ成熟体の残存活性を喪失させる過酸化水素の濃度（重量％）に対する、当該条件下での酸化処理により当該好ましいポリペプチドの残存活性を喪失させる過酸化水素の濃度（重量％）の比で、例えば５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上が挙げられる。当該比の範囲の上限については特に限定されないが、例えば１００倍以下、７０倍以下、又は５０倍以下が挙げられる。具体的には、前記（II）及び（III）の好ましいポリペプチドにおける酸化耐性の程度としては、上記条件下での酸化処理により当該野生型プロテイングルタミナーゼ成熟体の残存活性を喪失させる過酸化水素の濃度（重量％）に対する、当該条件下での酸化処理により当該好ましいポリペプチドの残存活性を喪失させる過酸化水素の濃度（重量％）の比で、例えば５～１００倍、好ましくは１０～１００倍、より好ましくは２０～１００倍、さらに好ましくは３０～１００倍、３０～７０倍、又は３０～５０倍が挙げられる。
　本発明における好ましい変異プロポリペプチドのより具体的な例として、（I）のポリペプチドの配列と、（II）、（III）のポリペプチドの例の配列とを以下に示す。
　すなわち、上記配列番号６に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１０６位～第１１１位が、配列番号２に示すトロンビン認識配列で置換された配列である。また、上記配列番号７に示すアミノ酸配列は、配列番号６のＮ末端にメチオニンが付加し、Ｃ末端に、遺伝子組換えのための配列（制限酵素ＸｈｏＩサイト由来配列）を介して精製タグ（ポリヒスチジン配列）が付加した配列である。
　本発明の好ましい複合型プロテイングルタミナーゼを構成する（Ａ）のプロ配列ペプチド及び（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼの具体例としては、それぞれ、以下の（Ａ１）～（Ａ３）及び以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）が挙げられる。以下において、配列番号４及び配列番号５は、それぞれ、上記配列番号１（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロポリペプチド配列）の第１位～第１０９位及び第１１０位～第２９９位の配列である。
　（Ａ１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、第１０６位～第１０９位アミノ酸配列の、ロイシン残基－バリン残基－プロリン残基－アルギニン残基からなる前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　（Ａ２）前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度を向上させる、ポリペプチド。好ましくは、前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度及び酸化耐性を向上させる、ポリペプチド。
　（Ａ３）前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度を向上させる、ポリペプチド。好ましくは、前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度及び酸化耐性を向上させる、ポリペプチド。
　（Ｂ１）配列番号５に示すアミノ酸配列において、第１位～第２位アミノ酸残基からなる配列の、グリシン残基－セリン残基、又はグルタミン酸残基－セリン残基からなる前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　（Ｂ２）前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、プロテイングルタミナーゼ活性を有するポリペプチド。
　（Ｂ３）前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、プロテイングルタミナーゼ活性を有するポリペプチド。
　本発明の好ましい複合型プロテイングルタミナーゼを構成する（Ａ）のプロ配列ペプチド及び（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼのより具体的な例として、（Ａ１）のポリペプチドの配列と、（Ａ２）、（Ａ３）のポリペプチドの例の配列と、（Ｂ１）のポリペプチドの好ましい例の配列と、（Ｂ２）、（Ｂ３）のポリペプチドの好ましい例の配列とを以下に示す。
　すなわち、配列番号８に示すプロ配列ペプチド及び配列番号１０に示す成熟プロテイングルタミナーゼの組み合わせを含む複合型プロテイングルタミナーゼは、配列番号６に示す変異プロポリペプチドのトロンビン切断物であり、配列番号９に示すプロ配列ペプチド及び配列番号１１に示す成熟プロテイングルタミナーゼの組み合わせを含む複合型プロテイングルタミナーゼは、配列番号７に示す変異プロポリペプチドのトロンビン切断物である。
２．ＤＮＡ
　本発明のＤＮＡは、上記「１．複合型プロテイングルタミナーゼ」で述べた複合型プロテイングルタミナーゼの製造に用いられるＤＮＡであり、上記変異プロポリペプチドをコードするＤＮＡである。つまり、本発明のＤＮＡは、プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドをコードしているＤＮＡである。
　好ましくは、本発明のＤＮＡは、上記「１．複合型プロテイングルタミナーゼ」で述べた（I）～（III）に示すポリペプチドからなる変異プロポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡであれば特に限定されない。（I）～（III）に示すポリペプチドの基準配列である配列番号１に示すアミノ酸配列（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロポリペプチド配列）をコードするＤＮＡの塩基配列としては、配列番号１２が挙げられる。従って、本発明のＤＮＡは、配列番号１２を基準配列として当業者が適宜設計することができる。
　本発明のＤＮＡの例として、以下の［i］、［ii］に示すＤＮＡが挙げられる。
［i］配列番号１２に示す塩基配列において、第３１６位～第３３３位塩基配列の、トロンビン認識配列をコードする塩基配列への置換が導入された塩基配列からなるＤＮＡ。
［ii］上記［i］に示すＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる変異プロポリペプチドをコードするＤＮＡ、好ましくは、上記［i］に示すＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼよりも高い熱変性温度及び高い酸化耐性を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる変異プロポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　本発明のＤＮＡの具体的な配列は当業者により容易に決定される。例えば、配列番号６をコードするＤＮＡとして配列番号１３が挙げられる。また、配列番号７をコードするＤＮＡとして配列番号１４が挙げられる。
　前記［ii］のＤＮＡについて、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
　本発明のＤＮＡの取得については、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列（クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来の野生型プロポリペプチド配列）をコードしているＤＮＡをベースに、トロンビン認識配列をコードする塩基配列の置換、及び必要に応じて他の塩基配列（例えば、遺伝子組換えのための配列［例えば制限酵素ＸｈｏＩサイト等］、及び精製タグ［例えばポリヒスチジン等］をコードする配列等）を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。
　配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの取得については、配列番号１２に示される塩基配列が組み込まれたプラスミド等の核酸構築物からＰＣＲを用いた常法により当該塩基配列部分を取得することができる。
　遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、及び部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTMＳｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒTMＳｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ，Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
　本発明のＤＮＡには、コドンの縮重に由来する多種のＤＮＡが包含される。同じアミノ酸配列をコードする多種のＤＮＡを人為的に作製することは、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に行うことができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドン利用頻度を宿主に最適化することにより、目的タンパク質の高発現を図ることができる。
　コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌の最適コドンの一例として以下のものが挙げられる。Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リシン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：トレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
　塩基配列に変異を導入したＤＮＡの塩基配列は、慣用の方法を用いて配列決定することにより確認できる。具体的な配列決定法としては、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）、又は適当なＤＮＡシークエンサーを利用した配列解析法等が挙げられる。また、ＤＮＡが目的のポリペプチドをコードするＤＮＡであるかどうかの確認方法としては、決定された塩基配列を配列番号１２に示す塩基配列等の無置換塩基配列と比較する方法、又は、決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示すアミノ酸配列等の無置換アミノ酸配列と比較する方法が挙げられる。
３．発現カセット又は組換えベクター
　本発明の発現カセット又は組換えベクターは、上記「２．ＤＮＡ」に記載の本発明のＤＮＡを含む。本発明の発現カセット又は組換えベクターは、本発明のＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、又は、発現ベクターに本発明の発現カセット又は本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　本発明の組換えベクターについて、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＤＨ５α大腸菌株の組み合わせ、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が挙げられる。
４．形質転換体
　本発明の形質転換体は、上記「３．発現カセット又は組換えベクター」に記載の本発明の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られるものである。
　本発明の形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能で、発現カセット又は組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で本発明のＤＮＡを含む遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、クリセオバクテリウム・プロテオリティカム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｍ）等のクリセオバクテリウム属等に属する細菌、；放線菌、糸状菌、酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの宿主の中でも、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。
　本発明の形質転換体は、宿主に本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
　本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
　ＰＣＲ法によって本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ又は発現カセット又は組換えベクターを分離・精製すればよい。
　発現カセット又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
　更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
　ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現カセット又は発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
　その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
　また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
５．複合型プロテイングルタミナーゼの製造方法
　本発明の複合型プロテイングルタミナーゼの製造方法は、上記「１．複合型プロテイングルタミナーゼ」に記載の酵素を製造する方法である。具体的には、本発明の複合型プロテイングルタミナーゼの製造方法は、上記「４．形質転換体」に記載の形質転換体を培養し、変異プロポリペプチドを産生する産生工程と、前記変異プロポリペプチドをトロンビン処理し、トロンビン切断物を得る活性化工程とを含み、前記活性化工程で生じたプロ配列ペプチドを除去する工程を含まない。
　産生工程において、培養条件は、上記形質転換体の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。培地の栄養源としては、上記形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
　培養温度は、本発明の上記形質転換体が生育可能であり、且つ上記形質転換体が変異プロポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５～３７℃程度である。培養は、変異プロポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２～４８時間程度が挙げられる。
　上記形質転換体の培養後は、培養液を遠心分離などの方法に供し、培養上清及び／又は菌体を回収する。菌体には、超音波やフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素による処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、変異プロポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。また、適当な発現カセット又は発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した変異プロポリペプチドを培養液中に分泌させ、変異プロポリペプチドを含む培養液を得ることもできる。
　上記のようにして得られた変異プロポリペプチドを含む水溶性画分又は培養液は、そのまま活性化工程に供してもよいが、該水溶性画分又は培養液中の変異プロポリペプチドを濃縮及び／又は精製した後に活性化工程に供してもよい。
　活性化工程では、産生工程で得られた変異プロポリペプチドをトロンビン処理する。トロンビン処理対象である変異プロポリペプチドが存在していればよいため、例えば、上記の産生工程が完了した後に、変異プロポリペプチドにトロンビンを接触させることで本活性化工程を行ってもよいし、産生工程の開始と同時、又は産生工程の開始後（且つ産生工程の終了前に）、培養液にトロンビンを添加することで本活性化工程を行ってもよい。
　上記「１．複合型プロテイングルタミナーゼ」で述べたとおり、変異プロポリペプチドはプロ配列中にトロンビン認識配列の置換が導入されているため、トロンビンでトロンビン認識配列が切断されることにより、（Ａ）のプロ配列ペプチドと（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼとに切断される。これにより、プロテイングルタミナーゼ活性を生じさせる。（Ａ）のプロ配列ペプチドと（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼとは、非共有結合で結合した複合体（複合型プロテイングルタミナーゼ）の形態で、プロテイングルタミナーゼ活性を呈する。
　複合型プロテイングルタミナーゼは、必要に応じて、濃縮及び／又は精製することができる。濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール及びアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。精製は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　精製された複合型プロテイングルタミナーゼは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．酵素剤
　複合型プロテイングルタミナーゼは、酵素剤の形態で提供されることができる。したがって、本発明は、上記「１．複合型プロテイングルタミナーゼ」に記載の複合型プロテイングルタミナーゼを有効成分として含む酵素剤も提供する。
　本発明の酵素剤における複合型プロテイングルタミナーゼの含有量としては特に限定されないが、含有量の下限としては、例えば１Ｕ／ｇ以上、５Ｕ／ｇ以上、又は１０Ｕ／ｇ以上、好ましくは５０Ｕ／ｇ以上、１００Ｕ／ｇ以上、５００Ｕ／ｇ以上、又は８００Ｕ／ｇ以上が挙げられる。含有量の上限としては、例えば１００００Ｕ／ｇ以下、５０００Ｕ／ｇ以下、２０００Ｕ／ｇ以下、１５００Ｕ／ｇ以下、又は１０００Ｕ／ｇ以下が挙げられる。本発明の酵素剤における複合型プロテイングルタミナーゼの具体的な含有量としては、例えば１～１００００Ｕ／ｇ、５～１００００Ｕ／ｇ、又は１０～１００００Ｕ／ｇ、好ましくは５０～５０００Ｕ／ｇ、１００～２０００Ｕ／ｇ、５００～１５００Ｕ／ｇ、又は８００～１０００Ｕ／ｇが挙げられる。
　なお、プロテイングルタミナーゼ活性は、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ（ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－グルタミニルグリシン）を基質とし、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素活性を１単位（１Ｕ）とする。
　本発明の酵素剤は、複合型プロテイングルタミナーゼ以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、複合型プロテイングルタミナーゼ以外の他の酵素、添加剤、上記製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。
　他の酵素としては、例えば、アミラーゼ（α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素（上記複合型プロテイングルタミナーゼ以外）、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　添加剤としては、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分等が挙げられる。
　本発明の酵素剤の形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）等が挙げられる。前記組成物は、一般的に公知の方法で調製することができる。
７．タンパク質材料の改質剤
　上記複合型プロテイングルタミナーゼは、プロテイングルタミナーゼの公知の用途に用いることができる。例えば、複合型プロテイングルタミナーゼは、タンパク質材料の改質を目的として用いることができる。従って、本発明は、複合型プロテイングルタミナーゼを含むタンパク質材料の改質剤も提供する。
　タンパク質材料の改質の具体的な態様としては特に限定されず、タンパク質のグルタミン残基においてγ－アミド基の脱アミド化によりカルボキシル基が生じることでもたらされるタンパク質の特性変化であればよい。具体的には、タンパク質材料の改質としては、タンパク質の可溶性の増大、水分散性の増大、乳化力の向上、乳化安定性の向上、起泡性の向上、及び泡沫安定性の向上等が挙げられる。
８．改質されたタンパク質材料の製造方法
　上述のとおり、複合型プロテイングルタミナーゼは、タンパク質材料の改質を目的として用いることができる。従って、本発明は、上記複合型プロテイングルタミナーゼをタンパク質材料に作用させる酵素処理工程を含む、改質されたタンパク質材料の製造方法も提供する。
　酵素処理工程においては、例えば、タンパク質材料と複合型プロテイングルタミナーゼとを含む混合物を、複合型プロテイングルタミナーゼの作用条件下に供することで、タンパク質を改質する反応を進行させることができる。
　タンパク質材料としては、タンパク質を含んでいる材料であれば特に限定されず、食用及び非食用のいずれであってもよい。食用のタンパク質材料は、飲食品として、又は、飲食品を製造するための素材として用いることができるものである。非食用のタンパク質材料は、タンパク質実験用の材料、医療材料、繊維材料、香粧品材料等として用いることができるものである。
　タンパク質材料の具体例としては、タンパク質源そのもの（つまり、生物の器官又はその一部若しくは生物の体液等）、及びタンパク質源から公知の方法でタンパク質以外の少なくともいずれかの成分を除去することでタンパク質を濃縮する処理を行って得られる調製物が挙げられ、これらは当業者によって適宜選択される。
　タンパク質が植物性タンパク質である場合、植物性タンパク質の例としては、大豆、エンドウ、レンズ豆、ひよこ豆、黒豆、空豆、緑豆、ルピン豆、インゲン豆等の菽穀類のタンパク質；小麦、大麦、燕麦（オート麦）、ソルガム、米、ライムギ、そば、ひえ、あわ、テフ、トウモロコシ、ポテト等の禾穀類のタンパク質；アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、ペカンナッツ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、クルミ、ブラジルナッツ、ピリナッツ、栗、ゴマ、松の実、ヘンプシード（ヘンプとは、乾燥重量当たりテトラヒドロカンナビノールが０．３重量％未満、好ましくは０．２重量％未満、より好ましくは０．０１重量％未満の、最も好ましくはテトラヒドロカンナビノールを含まない産業用ヘンプを指す）、チア種子、キア、アマランサス、カナリーシード、アマニ等の種実類のタンパク質が挙げられる。
　タンパク質が動物性タンパク質である場合、動物性タンパク質の例としては、畜肉、魚肉、卵、乳汁、血清、毛、昆虫等のタンパク質、例えば、カゼイン（α－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン等）、ホエイ、アルブミン（α－ラクトアルブミン、血清アルブミン等）、グロブリン（β－ラクトグロブリン、免疫グロブリン等）、ラクトフェリン、ウール、シルク、筋原線維タンパク質（ミオシン、アクチン、トロポニン、トロポミオシン等）、筋基質タンパク質（コラーゲン等）等が挙げられる。
　タンパク質材料の形態としては、非組織化状であってもよいし、組織化状であってもよい。タンパク質材料の形態が非組織化状である場合、その形態としては、液状、スラリー状、ペースト状等の流動性がある形態が挙げられる。
　複合型プロテイングルタミナーゼの作用条件（温度条件、ｐＨ条件等）としては、使用する複合型プロテイングルタミナーゼの至適温度及び至適ｐＨ等に基づいて適宜決定される。
　本発明の複合型プロテイングルタミナーゼは熱変性温度が向上しているため、酵素処理工程においては、プロ配列を有しない非複合型の成熟プロテイングルタミナーゼよりも高い温度での酵素処理を行うこともできる。例えば、温度条件としては、５５℃以上、５８℃以上、又は６０℃以上、好ましくは６２℃以上、６３℃以上、より好ましくは６４℃以上、又は６５℃以上が挙げられ、その上限としては、例えば、７０℃以下、６８℃以下、６６℃以下、６４℃以下、６２℃以下、又は６０℃以下が挙げられる。当該温度条件の具体的な範囲としては、例えば、５５～７０℃、５８～７０℃、５８～６８℃、５８～６６℃、５８～６４℃、５８～６２℃、５８～６０℃、又は６０～７０℃、好ましくは６２～７０℃、６３～７０℃、より好ましくは６４～６８℃、又は６５～６６℃が挙げられる。
　反応終了後は冷却を行い、必要に応じて後処理を行うことで、改質タンパク質材料が得られる。
　改質タンパク質材料の具体例としては、動物性タンパク質を含む材料から得られるものとして、乳、クリーム（例えばコーヒークリーマー等）、乳又はクリームの乾燥物（例えば脱脂粉乳等）、乳発酵物（例えば、チーズ、ヨーグルト等）、食肉加工食品（例えば、畜肉、鳥肉、魚すり身加工食品等、より具体的には、ハンバーグ、ミートボール、パティ、ミートローフ、ミンチカツ、点心等）等が挙げられ、植物性タンパク質を含む材料から得られるものとして、植物性ミルク、植物性クリーム（例えば植物性コーヒークリーマー等）、植物性ミルク又は植物性クリームの乾燥物(例えば粉末植物性ミルク等)、植物性ミルクの発酵物（例えば、代替チーズ、代替ヨーグルト等）、肉様加工食品（畜肉、鳥肉、及び／又は魚すり身加工食品を代替肉によって模した食品をいい、例えば、ハンバーグ、ミートボール、パティ、ミートローフ、ミンチカツ、点心等を代替肉によって模した食品が挙げられる）等が挙げられる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
［実施例１］
（１）複合型プロテイングルタミナーゼの作製
　クリセオバクテリウム・プロテオリティカム由来プロテイングルタミナーゼのプロポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）をコードする塩基配列（配列番号１２）に、５’末端側にＮｄｅＩサイト、３’末端にＸｈｏＩサイトを付加した配列（配列番号１５）からなる遺伝子を合成した。
　当該遺伝子をＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ２２ベクターの対応サイトに導入することで、ｐＥＴ２２ｂ－ＣｐＰＧＰｒｏ－（Ｈｉｓ）6を得た。ｐＥＴ２２ｂ－ＣｐＰＧＰｒｏ－（Ｈｉｓ）6に、以下のトロンビン認識配列導入用プライマーを用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法によりトロンビン認識配列を導入し、配列番号１４に示す塩基配列が組み込まれた組換えベクターを構築した。
（トロンビン認識配列導入用プライマー）
PcPG-Thro-1-(+):AACCATTCTGACCCTGGTACCGCGTGGTAGCACCAATAAACTGG（配列番号１６）
PcPG-Thro-1-(-):CCAGTTTATTGGTGCTACCACGCGGTACCAGGGTCAGAATGGTT（配列番号１７）
　得られた組換えベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（５０ｍｌ）にて３７℃で培養し、ＬＢ培地（３５０ｍｌ）に加え、ＯＤ６００が０．５～１．０の時にＩＰＴＧを添加（終濃度１ｍＭ）し、２０℃で２４時間培養し、菌体を遠心分離により回収した。菌体を緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍｌ）に懸濁し、超音波破砕したのちに、遠心分離により可溶性画分を回収した。この可溶性画分には、配列番号７に示すアミノ酸配列からなる変異プロポリペプチドが含まれていた。
　可溶性画分をトロンビン処理し、トロンビン認識配列の切断を行った。具体的には、３３ｍｌの菌体可溶性画分に対して２５０Ｕ／ｍｌのトロンビン溶液を８８０μｌ加え、１０℃で１９時間静置（処理）した。処理物をアフィニティカラム（ＩＭＡＣ　Ｎｉ－Ｃｈａｒｇｅｄ　Ｒｅｓｉｎ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）４ｍｌ）にアプライし、緩衝液（０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４））で洗浄し、その後、１００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液（０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４））を用いて、複合型プロテイングルタミナーゼを溶出し、回収した。得られた複合型プロテイングルタミナーゼは、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるプロ配列ペプチドと、当該プロ配列ペプチドと非共有結合的に結合した配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる成熟プロテイングルタミナーゼとの複合体であった。
（２）活性測定方法
　得られた複合型プロテイングルタミナーゼについて、以下の方法により、プロテイングルタミナーゼ活性を確認した。
　３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬに、複合型プロテイングルタミナーゼを含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃、１０分間放置した後、０．４Ｍ　ＴＣＡ溶液を１ｍＬ加えて反応を停止した。ブランクとして、３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．５）１ｍＬに０．４Ｍ　ＴＣＡ溶液を１ｍＬ加え、さらに複合型プロテイングルタミナーゼを含む試料溶液０．１ｍＬを添加して、３７℃で１０分間放置した。
　前記で得られた溶液についてアンモニアテストワコー（富士フイルム和光純薬）を用い、反応液中に生じたアンモニア量の測定を行った。アンモニア標準液（塩化アンモニウム）を用いて作成したアンモニア濃度と吸光度（６３０ｎｍ）との関係を表す検量線より、反応液中のアンモニア濃度を求めた。
　複合型プロテイングルタミナーゼの活性を、１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とし、以下の式から算出した。式中、反応液量は２．１、酵素溶液量は０．１、Ｄｆは酵素溶液の希釈倍率である。また、１７．０３はアンモニアの分子量である。
（３）熱安定性評価
　ＪＡＳＣＯ　Ｃｏｒｐ．Ｊ－８２０を使用し、ＣＤスペクトルを取得した。酵素濃度は、２５℃での２２２ｎｍの楕円率が－１０～－２０ｍｄｅｇの範囲になるように調整し、測定波長は２２２ｎｍ、温度区間は２５．０℃～９０．０℃、測定間隔は０．２℃、温度勾配は１℃／分とし、以下の式に基づいて変化率を導出した。変化率は、複合型のプロテイングルタミナーゼ（複合型ＰＧ）と、プロ配列を有しない非複合型のプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ、具体的には、配列番号１の第１１５位～第２２９位のアミノ酸配列からなるプロテイングルタミナーゼ）との両方について導出した。
　ＣＤ測定による昇温過程の二次構造変化を、横軸に温度、縦軸に変化率をとって表したグラフを図１に示す。図１に示される通り、変化率が５０％以上となる熱変性中点温度（Ｔｍ値）は、非複合型のプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ）で６８．０℃であったことに対し、複合型のプロテイングルタミナーゼ（複合型ＰＧ）では７３．２℃と向上した。つまり、複合型のプロテイングルタミナーゼは、非複合型のプロテイングルタミナーゼよりも熱安定性が向上していた。
　以上より、トロンビンによる特異的な切断により、意図した部位のみで切断された複合型のプロテイングルタミナーゼを得ることができた。切断箇所が１か所であるため、複合型プロテイングルタミナーゼは、その結晶化が容易であった。また、複合型のプロテイングルタミナーゼは、プロ配列ペプチドと成熟プロテイングルタミナーゼとが非共有結合的に結合しているにもかかわらず、プロテイングルタミナーゼ活性を呈した。さらに、複合型のプロテイングルタミナーゼは、プロ配列に変異を導入することで得られたものであるにも関わらず、熱安定性の低下が抑制されていただけでなく、非複合型に比べて熱安定性が向上していた。
［実施例２］
　実施例１で作製した複合型のプロテイングルタミナーゼ（複合型ＰＧ）の酸化耐性を、プロ配列を有しない非複合型のプロテイングルタミナーゼ（ＰＧ、具体的には、配列番号１の第１１５位～第２２９位のアミノ酸配列からなるプロテイングルタミナーゼ）との対比により評価した。
　複合型のプロテイングルタミナーゼ及び非複合型のプロテイングルタミナーゼのそれぞれを５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させた。図２に示す所定終濃度となる過酸化水素を添加し、よく攪拌した後２５℃で１０分間酸化処理を行った。その後、終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにカタラーゼを添加し、よく攪拌することで酸化処理済酵素を得た。得られた酸化処理済酵素それぞれのプロテイングルタミナーゼ活性を測定し、酸化処理前のプロテイングルタミナーゼ活性を１００％とした場合の残存活性（％）を算出した。酸化処理に用いた過酸化水素の濃度（重量％）と残存活性との関係を図２に示す。図２に示す通り、プロ配列を有しない非複合型のプロテイングルタミナーゼは、酸化処理に用いられた過酸化水素の終濃度が０．０３重量％で残存活性を失ったが、複合型のプロテイングルタミナーゼは、酸化処理に用いられた過酸化水素が１重量％であっても残存活性を失わないほどに、酸化耐性が顕著に向上していた。

Claims (12)

  1. 　プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドの、トロンビン切断物であって、
    　（Ａ）前記トロンビン認識配列のＮ末端側切断片をＣ末端に有するプロ配列ペプチドと、
    　（Ｂ）前記トロンビン認識配列のＣ末端側切断片をＮ末端に有する成熟プロテイングルタミナーゼと、を含む、複合型プロテイングルタミナーゼ。
  2. 　前記トロンビン認識配列が、前記プロ配列のＣ末端から１５アミノ酸残基長以内のＣ末端領域において、前記Ｃ末端領域の一部又は全部の配列を置換するように導入されている、請求項１に記載の複合型プロテイングルタミナーゼ。
  3. 　前記変異プロポリペプチドが、以下の（I）～（III）のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の複合型プロテイングルタミナーゼ：
    　（I）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第１０６位～第１１１位アミノ酸配列のトロンビン認識配列への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（II）前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド、及び
    　（III）前記置換が導入されたアミノ酸配列において、前記トロンビン認識配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるプロテイングルタミナーゼの熱変性温度よりも高い熱変性温度を備える複合型プロテイングルタミナーゼをトロンビン切断物として生じさせる、ポリペプチド。
  4. 　前記トロンビン認識配列が、配列番号２又は配列番号３に示すアミノ酸配列である、請求項１に記載の複合型プロテイングルタミナーゼ。
  5. 　前記（Ａ）のプロ配列ペプチドが、以下の（Ａ１）から（Ａ３）のいずれかに示すポリペプチドからなり、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼが、以下の（Ｂ１）から（Ｂ３）のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の複合型プロテイングルタミナーゼ：
    　（Ａ１）配列番号４に示すアミノ酸配列において、第１０６位～第１０９位アミノ酸配列の、ロイシン残基－バリン残基－プロリン残基－アルギニン残基からなる前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（Ａ２）前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度を向上させる、ポリペプチド、及び
    　（Ａ３）前記Ｎ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、前記（Ｂ）の成熟プロテイングルタミナーゼと複合体を構成することで、配列番号１に示すアミノ酸配列の第１１５位～第２９９位の成熟体配列からなるポリペプチドであるプロテイングルタミナーゼよりも熱変性温度を向上させる、ポリペプチド、並びに
    　（Ｂ１）配列番号５に示すアミノ酸配列において、第１位～第２位アミノ酸残基からなる配列の、グリシン残基－セリン残基、又はグルタミン酸残基－セリン残基からなる前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    　（Ｂ２）前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列以外の１個又は数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、プロテイングルタミナーゼ活性を有するポリペプチド、及び
    　（Ｂ３）前記Ｃ末端側切断片への置換が導入されたアミノ酸配列において、前記置換された配列を除いた部分の配列同一性が７０％以上であり、且つ、プロテイングルタミナーゼ活性を有するポリペプチド。
  6. 　プロテイングルタミナーゼのプロ配列及び成熟体配列を含むプロポリペプチド配列において、前記プロ配列のＣ末端領域にトロンビン認識配列が導入された配列からなる変異プロポリペプチドをコードしているＤＮＡであって、
    　請求項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼの製造に用いられる、ＤＮＡ。
  7. 　請求項６に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
  8. 　請求項７に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  9. 　請求項８に記載の形質転換体を培養し、変異プロポリペプチドを産生する産生工程と、
    　前記変異プロポリペプチドをトロンビン処理し、トロンビン切断物を得る活性化工程とを含み、
    　前記活性化工程で生じたプロ配列ペプチドを除去する工程を含まない、複合型プロテイングルタミナーゼの製造方法。
  10. 　請求項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼを含む酵素剤。
  11. 　請求項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼを含む、タンパク質材料の改質剤。
  12. 　請求項１～５のいずれかに記載の複合型プロテイングルタミナーゼをタンパク質材料に作用させる酵素処理工程を含む、改質されたタンパク質材料の製造方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023171778A1 (ja) * 2022-03-09 2023-09-14 天野エンザイム株式会社 改変型プロテイングルタミナーゼ
WO2023176943A1 (ja) * 2022-03-16 2023-09-21 天野エンザイム株式会社 改変型プロテイングルタミナーゼ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023171778A1 (ja) * 2022-03-09 2023-09-14 天野エンザイム株式会社 改変型プロテイングルタミナーゼ
WO2023176943A1 (ja) * 2022-03-16 2023-09-21 天野エンザイム株式会社 改変型プロテイングルタミナーゼ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU XIN, POON TERENCE CHUEN WAI, ZHANG HONGMIN: "Mass production of active recombinant Chryseobacterium proteolyticum protein glutaminase in Escherichia coli using a sequential dual expression system and one-step purification", IUBMB LIFE, JOHN WILEY & SONS, INC., HOBOKEN, USA, vol. 72, no. 11, 1 November 2020 (2020-11-01), Hoboken, USA, pages 2391 - 2399, XP093013114, ISSN: 1521-6543, DOI: 10.1002/iub.2358 *

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