WO2025229864A1 - 改変型ミトコンドリア及びその生産方法、並びにミトコンドリアの凝集抑制方法、ミトコンドリア用保存液、及びミトコンドリアの保存方法 - Google Patents

改変型ミトコンドリア及びその生産方法、並びにミトコンドリアの凝集抑制方法、ミトコンドリア用保存液、及びミトコンドリアの保存方法

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WO2025229864A1
WO2025229864A1 PCT/JP2025/014627 JP2025014627W WO2025229864A1 WO 2025229864 A1 WO2025229864 A1 WO 2025229864A1 JP 2025014627 W JP2025014627 W JP 2025014627W WO 2025229864 A1 WO2025229864 A1 WO 2025229864A1
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WO
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mitochondria
c3hmt
cells
modified
isolated
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French (fr)
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浩輔 草森
元也 西川
舞 金井
祥子 板倉
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Tokyo University of Science
Original Assignee
Tokyo University of Science
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to modified mitochondria and methods for producing them, as well as methods for inhibiting mitochondrial aggregation, mitochondrial preservation solutions, and methods for preserving mitochondria.
  • Mitochondria are intracellular organelles present within eukaryotic cells, and play an important role in supporting cellular life activities, such as energy production through aerobic respiration and regulating apoptosis.
  • Non-Patent Document 1 reports that a therapeutic effect was obtained by administering mitochondria isolated from hepatocytes intravenously to a mouse model of carbon tetrachloride-induced liver damage.
  • Non-Patent Document 2 reports that a therapeutic effect was obtained by administering mitochondria isolated from skeletal muscle cells or mesenchymal stem cells intravenously to a rat model of cecal slurry-induced sepsis.
  • the inventors conducted extensive research into the therapeutic effects of mitochondria isolated from various cells. As a result, they found that isolated mitochondria are prone to forming aggregates, and that mitochondria isolated from mesenchymal stem cells in particular are large in size and quantity from the beginning of isolation. They also found that mitochondria isolated from sources other than mesenchymal stem cells also increase in size and quantity during storage. Thus, when mitochondria containing aggregates are administered intravenously, there is a risk of embolism forming in the blood vessels. In fact, the inventors have confirmed that when mitochondria isolated from mesenchymal stem cells are administered intravenously to mice, embolism forms in the pulmonary blood vessels.
  • an objective of the present invention is to provide various technologies for suppressing aggregate formation in isolated mitochondria.
  • ⁇ 1> Modified mitochondria in which at least a portion of the surface protein of isolated mitochondria has been degraded, or the outer surface of isolated mitochondria has been modified with an aggregation inhibitor having a molecular mass of 1 kDa or more.
  • ⁇ 2> The modified mitochondria according to ⁇ 1>, wherein the mitochondria are derived from mesenchymal stem cells.
  • ⁇ 3> The modified mitochondria according to ⁇ 2>, wherein the proportion of mitochondrial particles with a particle size of 50 ⁇ m or less is 95% or more when the modified mitochondria is dispersed in phosphate-buffered saline (PBS) at 37°C, allowed to stand for 1 hour, and then the particle size distribution is measured by dynamic light scattering.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • ⁇ 4> The modified mitochondrion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the amount of proteins with a molecular mass of 60 kDa or more among the constituent proteins is 60% or less of the amount of proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in mitochondria of the same species as the modified mitochondrion.
  • ⁇ 5> The modified mitochondrion according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, which is obtained by treating isolated mitochondria with a protease.
  • ⁇ 6> The modified mitochondrion according to ⁇ 5>, wherein the protease is trypsin.
  • ⁇ 7> The modified mitochondria according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the aggregation inhibitor is a negatively charged compound.
  • ⁇ 8> The modified mitochondrion according to ⁇ 7>, wherein the negatively charged compound is heparin or a salt thereof, or dextran sulfate or a salt thereof.
  • a method for producing modified mitochondria comprising treating isolated mitochondria with a protease or an aggregation inhibitor having a molecular mass of 1 kDa or more.
  • ⁇ 10> The method for producing modified mitochondria according to ⁇ 9>, wherein the aggregation inhibitor is a negatively charged compound.
  • ⁇ 11> The method for producing modified mitochondria according to ⁇ 10>, wherein the negatively charged compound is heparin or a salt thereof, or dextran sulfate or a salt thereof.
  • ⁇ 12> A method for inhibiting mitochondrial aggregation, comprising treating isolated mitochondria with a protease or an aggregation inhibitor having a molecular mass of 1 kDa or more.
  • ⁇ 13> The method for inhibiting mitochondrial aggregation according to ⁇ 12>, wherein the aggregation inhibitor is a negatively charged compound.
  • ⁇ 14> The method for inhibiting mitochondrial aggregation according to ⁇ 13>, wherein the negatively charged compound is heparin or a salt thereof, or dextran sulfate or a salt thereof.
  • ⁇ 16> The mitochondrial preservation solution according to ⁇ 15>, wherein the negatively charged compound is heparin or a salt thereof, or dextran sulfate or a salt thereof.
  • a method for preserving mitochondria comprising preserving isolated mitochondria in the mitochondrial preservation solution according to ⁇ 15> or ⁇ 16>.
  • the present invention provides various techniques for suppressing aggregate formation in isolated mitochondria.
  • FIG. 1 shows the tissue distribution of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), mitochondria isolated from UE7T-13 cells (UEmt), or mitochondria isolated from m17.ASC cells (m17mt) after intravenous administration to mice.
  • This figure shows the tissue distribution of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), or mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin-EDTA (TE-C3Hmt) when administered intravenously to mice.
  • This figure shows the differences in aggregation properties among mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), and mitochondria obtained by treating C3Hmt with Tris-sucrose buffer or trypsin-EDTA (Tris-C3Hmt, TE-C3Hmt).
  • This figure shows the particle size distribution of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), and mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin or trypsin-EDTA (T-C3Hmt, TE-C3Hmt).
  • FIG. 1 shows the difference in aggregation when mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells are treated with Tris-sucrose buffer, EDTA, trypsin, or trypsin-EDTA.
  • FIG. 1 shows the particle size distribution of mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells when treated with Tris-sucrose buffer, EDTA, trypsin, or trypsin-EDTA.
  • This figure shows the cumulant particle size of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), and mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin (T-C3Hmt).
  • This figure shows the zeta potential of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), and mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin (T-C3Hmt).
  • HEKmt mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells
  • T-C3Hmt mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • This figure shows the difference in aggregation tendency of mitochondria isolated from UE7T-13 cells (UEmt), mitochondria isolated from m17.ASC cells (m17mt), mitochondria isolated from NIH3T3 cells (NIHmt), and mitochondria isolated from Hepa1-6 cells (Hepamt) when treated with Tris-sucrose buffer or trypsin-EDTA.
  • This figure shows the results of SDS-PAGE analysis of the differences in the constituent proteins when mitochondria isolated from UE7T-13 cells (UEmt), mitochondria isolated from m17.ASC cells (m17mt), mitochondria isolated from NIH3T3 cells (NIHmt), and mitochondria isolated from Hepa1-6 cells (Hepamt) were treated with Tris-sucrose buffer or trypsin-EDTA.
  • UEmt mitochondria isolated from UE7T-13 cells
  • m17mt mitochondria isolated from m17.ASC cells
  • NIHmt mitochondria isolated from Hepa1-6 cells
  • Hepamt mitochondria isolated from Hepa1-6 cells
  • FIG. 1 shows the amount of ATP produced by mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells treated with Tris-sucrose buffer or trypsin-EDTA (Tris-C3Hmt, TE-C3Hmt).
  • Tris-C3Hmt Tris-sucrose buffer or trypsin-EDTA
  • This figure shows the ALT concentration in the supernatant when liver injury model cells were cultured in the presence of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), or mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin (T-C3Hmt).
  • This figure shows the relative viable cell count when liver injury model cells were cultured in the presence of mitochondria isolated from HEK293 cells (HEKmt), mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells (C3Hmt), or mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin (T-C3Hmt).
  • HEKmt mitochondria isolated from HEK293 cells
  • C3Hmt mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells
  • T-C3Hmt mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin
  • This figure shows the results of Sirius Red staining of the caudate lobe when mitochondria (T-C3Hmt) obtained by treating mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells with trypsin were intravenously administered to chronic hepatitis model mice.
  • This figure shows the results of Masson's trichrome staining of the caudate lobe when mitochondria (T-C3Hmt) obtained by treating mitochondria isolated from C3H10T1/2 cells with trypsin were intravenously administered to chronic hepatitis model mice.
  • This figure shows the particle size distribution of mitochondria isolated from HEK293 cells (C3Hmt), mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin (T-C3Hmt), mitochondria isolated from Hepa1-6 cells (Hepamt), and mitochondria obtained by treating Hepamt with trypsin (T-Hepamt) when left standing in PBS at 37°C for 1 hour.
  • This figure shows the cumulant particle size of mitochondria isolated from HEK293 cells (C3Hmt), mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin (T-C3Hmt), mitochondria isolated from Hepa1-6 cells (Hepamt), and mitochondria obtained by treating Hepamt with trypsin (T-Hepamt) when left standing in PBS at 37°C for 1 hour.
  • C3Hmt mitochondria obtained by treating C3Hmt with trypsin
  • Hepamt mitochondria isolated from Hepa1-6 cells
  • T-Hepamt mitochondria obtained by treating Hepamt with trypsin
  • This figure shows the particle size distribution of mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells when treated with PBS, sodium heparin, or sodium dextran sulfate and then allowed to stand in PBS at 4°C for 30 minutes.
  • This figure shows the particle size distribution of mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells when resuspended in PBS or PBS containing sodium heparin and allowed to stand for 1 hour at 4°C, 15°C, or 37°C.
  • FIG. 1 shows tissue distribution of mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells when resuspended in PBS containing sodium heparin and then intravenously administered to mice.
  • This figure shows the amount of ATP produced when mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells were resuspended in PBS or PBS containing sodium heparin and left to stand at 4°C for 0.2 hours, 3 hours, or 24 hours.
  • FIG. 1 shows the relative viable cell count when C3H10T1/2 cells were cultured in the presence of a suspension obtained by resuspending mitochondria (C3Hmt) isolated from C3H10T1/2 cells in PBS or PBS containing sodium heparin.
  • the expression “x to y” using numerical values x and y means “greater than or equal to x and less than or equal to y.” In such expressions, when a unit is assigned only to the numerical value y, that unit also applies to the numerical value x.
  • the weight of mitochondria referred to in this specification refers to the amount of mitochondrial protein. For example, “X ( ⁇ g) mitochondria” means “mitochondria with a protein amount of X ( ⁇ g)."
  • the modified mitochondria of this embodiment are isolated mitochondria in which at least a portion of the surface proteins has been degraded, or the outer surface of isolated mitochondria has been modified with an aggregation inhibitor having a molecular mass of 1 kDa or more.
  • the inventors have confirmed that isolated mitochondria are prone to forming aggregates, and that mitochondria isolated from mesenchymal stem cells in particular form large aggregates in size and quantity from the beginning of isolation.
  • the inventors have also confirmed that mitochondria isolated from sources other than mesenchymal stem cells also increase in size and quantity during storage.
  • the inventors have conducted extensive research into methods for inhibiting mitochondrial aggregate formation. As a result, they have found that mitochondrial surface proteins are involved in mitochondrial aggregate formation, and that treating the mitochondrial surface with a protease or an aggregation inhibitor with a molecular mass of 1 kDa or more inhibits interactions between mitochondria and inhibits aggregate formation.
  • the modified mitochondria of this embodiment were completed based on these findings.
  • the biological species and cell species from which the modified mitochondria of this embodiment are derived are not particularly limited.
  • biological species include mice, rats, dogs, sheep, monkeys, and humans, and can be selected appropriately depending on the intended use of the modified mitochondria.
  • cell types include muscle cells, hepatocytes, fibroblasts, epithelial cells, nerve cells, adipocytes, and mesenchymal stem cells. Among these cell types, mesenchymal stem cells are preferred due to their high inhibitory effect on aggregate formation.
  • the tissue from which mesenchymal stem cells are derived is not particularly limited, and examples include bone marrow, dental pulp, fat, embryo, muscle, nerve, skin, synovium, amniotic membrane, placenta, umbilical cord, and umbilical cord blood.
  • the modified mitochondria of this embodiment are less likely to form aggregates can be confirmed, for example, by measuring the particle size distribution of the modified mitochondria using dynamic light scattering.
  • the proportion of mitochondrial particles with a particle size of 50 ⁇ m or less can be 95% or more, and preferably the proportion of mitochondrial particles with a particle size of 5 ⁇ m or less can be 95% or more.
  • the proportion of mitochondrial particles with a particle size of 50 ⁇ m or less does not reach 95% or more due to aggregates.
  • the proportion of mitochondrial particles with a particle size of 50 ⁇ m or less is less than 95%.
  • the modified mitochondria of this embodiment even when derived from mesenchymal stem cells, have a proportion of mitochondrial particles with a particle size of 50 ⁇ m or less when measured under the same conditions.
  • the type of surface protein to be degraded is not particularly limited, as long as it inhibits the formation of mitochondrial aggregates.
  • examples of surface proteins that can be degraded include proteins observed by SDS-PAGE to have a molecular mass of 60 kDa or more.
  • the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in the modified mitochondria is preferably 60% or less, more preferably 55% or less, and even more preferably 50% or less, of the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in mitochondria of the same species as the modified mitochondria.
  • the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more is preferably 20% or more of the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in mitochondria of the same species as the modified mitochondria.
  • the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in the modified mitochondria of this embodiment is 60% or less of the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in mitochondria of the same species as the modified mitochondria can be confirmed as in Test Examples 8 and 10 described below. That is, the constituent proteins of the modified mitochondria of this embodiment and mitochondria of the same species as the modified mitochondria are analyzed by SDS-PAGE, and the brightness of the bands with a molecular mass of 60 kDa or more is quantified using commercially available image editing software (Adobe PhotoShop, Adobe). The brightness of the bands with a molecular mass of 60 kDa or more is then subtracted from the brightness of the blank (background) to determine the value, and the two values are compared to confirm this.
  • Test Examples 8 and 10 described below. That is, the constituent proteins of the modified mitochondria of this embodiment and mitochondria of the same species as the modified mitochondria are analyzed by SDS-PAGE, and the brightness of the bands with a molecular
  • mitochondria of the same type as modified mitochondria means that they are derived from the same biological species and cell type; in the case where the cell type is mesenchymal stem cells, this means that the tissue from which the mesenchymal stem cells are derived is also the same.
  • modified mitochondria of this embodiment are modified mitochondria isolated from human hepatocytes, they can be compared with unmodified mitochondria isolated from human hepatocytes.
  • modified mitochondria of this embodiment are modified mitochondria isolated from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, they can be compared with unmodified mitochondria isolated from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the aggregation inhibitor is not particularly limited as long as it inhibits the formation of mitochondrial aggregates.
  • the molecular mass of the aggregation inhibitor is preferably 3 to 30 kDa, for example.
  • Specific examples of aggregation inhibitors include polymers and negatively charged compounds. Note that the mechanism by which negatively charged compounds inhibit aggregate formation is not entirely clear, but it is presumed that this is because positively charged molecules involved in aggregation are present on the outer surface of mitochondria, and the binding of these positively charged molecules to negatively charged compounds inhibits the interaction between mitochondria.
  • examples of the polymer include polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, polylactic acid, polylactic-glycolic acid, polystyrene, and polymethyl methacrylate.
  • examples of the negatively charged compound include heparin, dextran sulfate, dextran, polyglutamic acid, polyaspartic acid, glycosaminoglycan, polyethylene glycol, chondroitin sulfate, alginic acid, carrageenan, polyacrylic acid, polyglutamic acid, polymaleic acid, and polyvinyl phosphate.
  • the negatively charged compound may be in the form of a salt, such as a sodium salt or potassium salt.
  • a salt such as a sodium salt or potassium salt.
  • heparin or a salt thereof, and dextran sulfate or a salt thereof are preferred.
  • the molecular mass of heparin is preferably 1 to 30 kDa, more preferably 4 to 15 kDa.
  • the molecular mass of dextran sulfate is preferably 1 to 30 kDa, more preferably 4 to 8 kDa.
  • the modified mitochondria of this embodiment are isolated mitochondria whose outer surface has been modified with an aggregation inhibitor
  • the modified mitochondria preferably have surface proteins that have not been substantially degraded.
  • the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in the modified mitochondria is preferably 90-110%, and more preferably 95-105%, of the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or more in mitochondria of the same species as the modified mitochondria.
  • the modified mitochondria of this embodiment are less likely to form aggregates, they can be administered to living organisms and suitably used to treat a variety of diseases.
  • the diseases are not particularly limited, as long as they are expected to be improved by administering mitochondria, and examples include ischemia-related diseases, neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, metabolic diseases, age-related diseases, retinal dysfunction, cancer, diabetes, etc.
  • the method for producing modified mitochondria according to this embodiment includes treating isolated mitochondria with a protease or an aggregation inhibitor having a molecular mass of 1 kDa or more. Also, the method for inhibiting mitochondrial aggregation according to this embodiment includes treating isolated mitochondria with a protease or an aggregation inhibitor having a molecular mass of 1 kDa or more.
  • biological species and cell types that can serve as mitochondrial donors.
  • biological species include mice, rats, dogs, sheep, monkeys, and humans, and can be selected appropriately depending on the intended use of the modified mitochondria.
  • cell types include muscle cells, hepatocytes, fibroblasts, epithelial cells, nerve cells, adipocytes, and mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cells are preferred due to their high inhibitory effect on aggregate formation.
  • tissues from which mesenchymal stem cells are derived and examples include bone marrow, dental pulp, fat, embryo, muscle, nerve, skin, synovium, amniotic membrane, placenta, umbilical cord, and umbilical cord blood.
  • any method can be used to isolate mitochondria from cells, and commercially available kits can be used if necessary.
  • Known methods for isolating mitochondria from cells include disrupting cells and then isolating the mitochondrial fraction by centrifugation, and forming pores in the cell membrane and then isolating the mitochondrial fraction by centrifugation.
  • a method in which pores are formed in the cell membrane and then the mitochondrial fraction is isolated is preferred, and a method in which pores are formed in the cell membrane using streptolysin O (SLO) and then the mitochondrial fraction is isolated is particularly preferred (see, for example, Shibata, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 463, 563-568, 2015).
  • SLO streptolysin O
  • the protease used is not particularly limited as long as it is capable of degrading at least a portion of the mitochondrial surface proteins.
  • Specific examples of proteases include trypsin, protease K, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N, chymotrypsin, pepsin, carboxypeptidase, aminopeptidase, trypsin substitutes (e.g., TrypLE manufactured by Thermo Fisher Scientific), etc. Among these, trypsin is preferred.
  • protease solution is added to the mitochondria and incubated at 10 to 40°C for approximately 5 to 180 minutes.
  • concentration of the protease in the protease solution may be, for example, 0.001 to 10 g/L, or 0.001 to 1 g/L.
  • serum or a protease inhibitor may be added as needed to inactivate the protease, and the mitochondria (modified mitochondria) may then be collected by centrifugation.
  • the aggregation inhibitor used is not particularly limited as long as it inhibits the formation of mitochondrial aggregates.
  • Specific examples of aggregation inhibitors include the polymers and negatively charged compounds mentioned above.
  • aggregation inhibitors heparin or its salts, and dextran sulfate or its salts are preferred.
  • the method for treating isolated mitochondria with an aggregation inhibitor there are no particular limitations on the method for treating isolated mitochondria with an aggregation inhibitor.
  • One example is a method in which mitochondria are added to a solution containing an aggregation inhibitor and incubated at 4 to 40°C for approximately 5 to 180 minutes.
  • the concentration of the aggregation inhibitor in the solution containing the aggregation inhibitor may be, for example, 0.001 to 10 g/L, or 0.001 to 1 g/L.
  • the mitochondria modified mitochondria
  • the mitochondrial preservation solution according to this embodiment contains a negatively charged compound with a molecular mass of 1 kDa or more.
  • negatively charged compounds examples include the compounds described above. Among negatively charged compounds, heparin or a salt thereof, and dextran sulfate or a salt thereof are preferred.
  • the concentration of the negatively charged compound in the mitochondrial preservation solution of this embodiment is preferably 0.001 to 1 g/L, and more preferably 0.1 to 1 g/L.
  • Mitochondrial preservation solutions can be prepared by adding negatively charged compounds to various compositions.
  • compositions for preparing mitochondrial preservation solutions include cell culture media such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI-1640, MEM (Minimum Essential Medium), Ham's F-12, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), and ⁇ -MEM; bacterial culture media such as LB medium, nutrient broth, TSA (Trypticase Soy Agar) medium, and MRS (de Man-Rogosa-Sharpe) medium; buffer solutions such as PBS, HBSS (Hanks' Balance Salt Solution), Tris-HCl buffer, HEPES buffer, TBS (Tris-Buffered Saline), and SSC (Saline-Sodium Citrate); infusion solutions for administering mitochondria such as physiological saline, PBS, HBSS, Ringer's solution, 5% glucose solution, and DMSO dilution; and mitochondrial media.
  • mitochondrial media examples include the buffer included with the Mitochondria Isolation Kit (Sigma-Aldrich) (10 mM HEPES (pH 7.4), 250 mM sucrose, 1 mM ATP, 0.08 mM ADP, 5 mM sodium succinate, 2 mM K2HPO4 , 1 mM DTT), the buffer included with the MitoXpress (Agilent) (70 mM sucrose, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 5 mM K2HPO4 , 210 mM mannitol, 10 mM MOPS, 5 mM HEPES ( pH 7.4)), or buffers described in the papers listed below in 1) to 6).
  • Mitochondria Isolation Kit Sigma-Aldrich
  • the mitochondrial preservation method includes preserving isolated mitochondria in the mitochondrial preservation solution according to this embodiment.
  • preserving isolated mitochondria in the mitochondrial preservation solution according to this embodiment the formation of mitochondrial aggregates during preservation can be suppressed.
  • the organism species and cell species that can serve as mitochondrial donors are not particularly limited, and examples include the organism species and cell species exemplified in the above-mentioned method for producing modified mitochondria. Furthermore, the method for isolating mitochondria from cells is also not particularly limited, and any of the methods exemplified in the above-mentioned method for producing modified mitochondria can be used.
  • the mitochondrial content in the mitochondrial preservation solution is preferably 0.002 to 2 g/L, and more preferably 0.002 to 0.3 g/L.
  • the temperature at which mitochondria are stored is preferably 0 to 10°C, and more preferably 3 to 5°C.
  • the storage period is preferably 1 to 7 days, and more preferably 1 to 3 days.
  • the donor cells used to isolate mitochondria were the human embryonic kidney cell line HEK293 cells, the mouse embryonic mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 cells, the human bone marrow-derived mesenchymal stem cell line UE7T-13 cells, the mouse adipose-derived mesenchymal stem cell line m17.ASC cells, the mouse fibroblast cell line NIH3T3 cells, and the mouse hepatocarcinoma cell line Hepa1-6 cells.
  • Mitochondria isolated from HEK293 cells, C3H10T1/2 cells, UE7T-13 cells, m17.ASC cells, NIH3T3 cells, and Hepa1-6 cells are also referred to as “HEKmt,” “C3Hmt,” “UEmt,” “m17mt,” “NIHmt,” and “Hepamt,” respectively.
  • C3Hmt after treatment with trypsin-EDTA, trypsin, and Tris-sucrose buffer will also be referred to as "TE-C3Hmt,” “T-C3Hmt,” and “Tris-C3Hmt,” respectively.
  • SLO method ⁇ Method for isolating mitochondria (SLO method)>
  • SLO method ⁇ Method for isolating mitochondria
  • SLO Recombinant Solution, FUJIFILM
  • HEPES- CH3COOK buffer 115 mM CH3COOK , 2.5 mM MgCl2 , 1 mM Dithiothreitol, 25 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid, pH 7.4
  • various cells were suspended in the SLO-containing HEPES- CH3COOK buffer to a concentration of 0.5 ⁇ g/ 107 cells and incubated at 4°C for 10 minutes.
  • the mixture was then centrifuged at 500 ⁇ g for 3 minutes, and the precipitate was resuspended in Tris-sucrose buffer (250 mM sucrose, 0.5 mM EDTA, 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane, pH 7.4) and centrifuged again.
  • the precipitate is then resuspended in Tris-sucrose buffer to a concentration of 1 mL/ 10 cells and incubated at 37°C for 10 minutes.
  • the mixture is then pipetted 200 times per mL, centrifuged at 600 x g for 10 minutes, and the supernatant is centrifuged again. Finally, the supernatant is centrifuged at 7,000 x g for 10 minutes, and the precipitate (mitochondrial fraction) is resuspended in PBS.
  • Mitochondria (HEKmt, C3Hmt, UEmt, and m17mt) were isolated from HEK293, C3H10T1/2, UE7T-13, and m17.ASC cells by the SLO method. Mitochondria were labeled with DiR (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide), and mitochondrial protein content was measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific).
  • mice 50 ⁇ g of mitochondria were suspended in 200 ⁇ L of PBS and administered intravenously to ddy mice (5 weeks old). One minute after administration, the mice were perfused with PBS and all organs were collected. Ex vivo imaging was then performed using a chemiluminescence/fluorescence imaging system (iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific) (excitation wavelength 745-765 nm/emission wavelength 810-850 nm).
  • chemiluminescence/fluorescence imaging system iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific
  • Figure 1 shows the tissue distribution of HEKmt, C3Hmt, UEmt, and m17mt following intravenous administration. As shown in Figure 1, HEKmt was transferred to the liver in large quantities, and no mice died, whereas C3Hmt, UEmt, and m17mt accumulated in large quantities in the lungs, and most mice died.
  • ⁇ Test Example 2 Tissue distribution after intravenous administration of various mitochondria (2)> Using a transfection reagent (Lipofectamine 3000 Reagent, Thermo Fisher Scientific), HEK293 cells and C3H10T1/2 cells were transfected with a vector (MTSCOX8A-GGGGS-Nluc/pEBMulti-Hyg) encoding a protein (MTSCOX8A-GGGGS-Nluc) in which a mitochondrial targeting signal (MTSCOX8A) and luciferase (NanoLuc Luciferase) were fused via a GGGGS linker, and stable expression lines were generated.
  • MTSCOX8A-GGGGS-Nluc/pEBMulti-Hyg encoding a protein
  • MTSCOX8A mitochondrial targeting signal
  • luciferase NemoLuc Luciferase
  • mitochondria HEKmt and C3Hmt were isolated from various cell lines expressing MTSCOX8A-GGGGS-Nluc using the SLO method.
  • a portion of the isolated C3Hmt was added to 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes.
  • trypsin-EDTA-treated mitochondria TE-C3Hmt were collected.
  • the amount of mitochondrial protein was then measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific).
  • TE-C3Hmt was administered at the same relative luminescence intensity as before trypsin-EDTA treatment.
  • One minute after administration the mice were perfused with PBS and all organs were collected.
  • a 9-fold volume of cell lysis buffer (20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl , 0.05 w/v% NP-40 substitute) was added to the organ mass, and the organs were homogenized using a homogenizer (Physcotron, Microtec). The homogenate was centrifuged at 16,000 ⁇ g for 15 minutes at 4°C. Furimazine (substrate) was added to the supernatant, and the relative luminescence intensity was measured using a microplate reader (EnVision, PerkinElmer).
  • FIG. 2 shows the tissue distribution of HEKmt, C3Hmt, and TE-C3Hmt following intravenous administration.
  • HEKmt was distributed primarily to the liver, spleen, and kidneys, and no mice died.
  • C3Hmt accumulated primarily in the lungs, and most mice died.
  • TE-C3Hmt was distributed primarily to the liver, spleen, and kidneys, and no mice died.
  • Test Example 3 Evaluation of mitochondrial aggregation Mitochondria (HEKmt and C3Hmt) were isolated from HEK293 and C3H10T1/2 cells by the SLO method. The isolated mitochondria were labeled by adding 10 ⁇ M CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) and incubating at 37°C for 30 minutes. A portion of the C3Hmt was added to 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes.
  • CFSE fluorescein diacetate, succinimidyl ester
  • the trypsin was neutralized by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes. Trypsin-EDTA-treated mitochondria (TE-C3Hmt) were then collected. For comparison, mitochondria (Tris-C3Hmt) were collected in the same manner as above except that Tris-sucrose buffer was used instead of trypsin-EDTA solution.
  • Figure 3 shows fluorescence images of HEKmt, C3Hmt, Tris-C3Hmt, and TE-C3Hmt. As shown in Figure 3, both HEKmt and C3Hmt formed aggregates, but the aggregates of C3Hmt were larger and more abundant. C3Hmt aggregate formation could be inhibited by trypsin-EDTA treatment.
  • Test Example 4 Inhibition of C3Hmt aggregation by trypsin treatment or trypsin-EDTA treatment Mitochondria (HEKmt and C3Hmt) were isolated from HEK293 cells and C3H10T1/2 cells by the SLO method. A portion of the isolated C3Hmt was added to 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai) or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes.
  • Test Example 5 Effect of EDTA on inhibition of C3Hmt aggregation Mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells by the SLO method. Mitochondria were labeled by adding 10 ⁇ M CFSE to the isolated C3Hmt and incubating at 37°C for 30 minutes.
  • a portion of the isolated C3Hmt was added to Tris-sucrose buffer, EDTA solution (1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4 , 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 ), 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai), or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin with the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes, mitochondria were collected.
  • FBS FBS
  • Figure 5A shows fluorescence images of C3Hmt treated with Tris-sucrose buffer, EDTA, trypsin, or trypsin-EDTA
  • Figure 5B shows the particle size distribution. As shown in Figures 5A and 5B, treating C3Hmt with trypsin or trypsin-EDTA inhibited aggregate formation, but treating C3Hmt with EDTA did not.
  • Test Example 6 Particle size and surface charge of trypsin-treated C3Hmt Mitochondria (HEKmt and C3Hmt) were isolated from HEK293 cells and C3H10T1/2 cells by the SLO method. A portion of the isolated C3Hmt was added to a 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. The trypsin was neutralized by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes. Trypsin-treated mitochondria (T-C3Hmt) were then collected. The cumulant particle size and zeta potential of mitochondria (1 ⁇ 10 cells mt/1 mL PBS) were then measured using a zeta potential/particle size measurement system (ELSZ-2000Z, Otsuka).
  • ELSZ-2000Z zeta potential/particle size measurement system
  • the cumulant particle sizes of HEKmt, C3Hmt, and T-C3Hmt are shown in Figure 6A, and the zeta potentials are shown in Figure 6B.
  • the cumulant particle size of C3Hmt, which contains aggregates was larger than that of HEKmt, but trypsin treatment suppressed aggregate formation, resulting in a smaller cumulant particle size.
  • the mitochondrial zeta potential did not change with trypsin treatment.
  • Test Example 7 Particle size distribution of trypsin-treated C3Hmt Mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells by the SLO method. A portion of the isolated C3Hmt was added to a 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. The trypsin was neutralized by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes. Trypsin-treated mitochondria (T-C3Hmt) were then collected.
  • C3Hmt Mitochondria
  • T-C3Hmt was suspended in 1000 ⁇ L of PBS (pH 7.4) and left to stand at 37°C for 1 hour, after which a particle size distribution was similarly created.
  • PBS pH 7.4
  • Test Example 8 Changes in mitochondrial constituent proteins by trypsin treatment or trypsin-EDTA treatment Mitochondria (HEKmt and C3Hmt) were isolated from HEK293 and C3H10T1/2 cells by the SLO method. A portion of the isolated mitochondria was added to Tris-sucrose buffer, 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai), or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin with the addition of FBS (Capricorn) supernatant, which had been previously centrifuged at 7,000 ⁇ g for 10 minutes, the mitochondria were collected. Mitochondrial protein content was then measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific).
  • each type of mitochondria was dissolved in cell lysis buffer.
  • each sample was applied to a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel and electrophoresed at 200 V for 1 hour. The gel was then stained with CBB staining solution (0.25% Coomassie brilliant blue, 45% methanol, 10% acetic acid) and then destained with CBB destaining solution (45% methanol, 10% acetic acid).
  • Figure 7 shows the results of SDS-PAGE analysis of various mitochondrial proteins. As shown in Figure 7, treating HEKmt and C3Hmt with trypsin or trypsin-EDTA significantly reduced the amount of some proteins, with the effect being greater for C3Hmt.
  • the brightness of the region with a molecular mass of 60 kDa or greater in each lane in Figure 7 was quantified using commercially available image editing software (Adobe PhotoShop, Adobe), and the value of "blank (background) brightness - brightness of each lane" was calculated.
  • the results showed that the brightness values for HEKmt treated with trypsin or trypsin-EDTA were 54.5% and 59.0%, respectively, of the brightness values for HEKmt treated with Tris-sucrose buffer.
  • the brightness values for C3Hmt treated with trypsin or trypsin-EDTA were 48.4% and 49.5%, respectively, of the brightness values for C3Hmt treated with Tris-sucrose buffer.
  • treating HEKmt and C3Hmt with trypsin or trypsin-EDTA reduced the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or greater to less than 60% compared to the negative control.
  • Mitochondria (UEmt, m17mt, NIHmt, and Hepamt) were isolated from UE7T-13 cells, m17.ASC cells, NIH3T3 cells, and Hepa1-6 cells by the SLO method. Mitochondria were labeled by adding 10 ⁇ M CFSE to the isolated mitochondria and incubating at 37°C for 30 minutes. Alternatively, Tris-sucrose buffer or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) was added to a portion of the isolated mitochondria and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin, the mitochondria were collected by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes.
  • FBS FBS
  • Test Example 10 Changes in mitochondrial constituent proteins by trypsin-EDTA treatment Mitochondria (UEmt, m17mt, NIHmt, and Hepamt) were isolated from UE7T-13 cells, m17.ASC cells, NIH3T3 cells, and Hepa1-6 cells by the SLO method. A portion of the isolated mitochondria was added to Tris-sucrose buffer or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin with the addition of FBS (Capricorn) supernatant, which had been previously centrifuged at 7,000 ⁇ g for 10 minutes, the mitochondria were collected. Mitochondrial protein content was then measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific).
  • the various mitochondria were dissolved in cell lysis buffer.
  • 50 ⁇ g of mitochondria treated with Tris-sucrose buffer and trypsin-EDTA-treated mitochondria from the same number of cells were dissolved in loading buffer containing 100 mM DTT and reduced at 95°C for 3 minutes.
  • the various samples were then applied to a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel and electrophoresed at 200 V for 1 hour. The gel was then stained with CBB staining solution and then destained with CBB destaining solution.
  • the brightness of the region with a molecular mass of 60 kDa or greater in each lane in Figure 9 was quantified using commercially available image editing software (Adobe PhotoShop, Adobe), and the value of "blank (background) brightness - brightness of each lane" was calculated.
  • the results showed that the brightness values for UEmt, m17mt, NIHmt, and Hepamt treated with trypsin-EDTA were 28.9%, 28.6%, 27.0%, and 34.9%, respectively, compared to the brightness values for UEmt, m17mt, NIHmt, and Hepamt treated with Tris-sucrose buffer.
  • treating UEmt, m17mt, NIHmt, and Hepamt with trypsin-EDTA reduced the amount of constituent proteins with a molecular mass of 60 kDa or greater to less than 40% compared to the negative control.
  • Test Example 11 Cellular uptake of trypsin-EDTA-treated C3Hmt C3H10T1/2 cells were seeded in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells/well, and mouse macrophage-like cell line RAW264.7 cells were seeded in a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells/well.
  • mitochondria were isolated from C3H10T1/2 cells using the SLO method. Mitochondria were labeled by adding 10 ⁇ M CFSE to the isolated C3Hmt and incubating at 37°C for 30 minutes. A portion of the isolated C3Hmt was added to Tris-sucrose buffer or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin with the addition of FBS (Capricorn) supernatant, which had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes, mitochondria (Tris-C3Hmt and TE-C3Hmt) were collected.
  • Tris-sucrose buffer or 2.5 g/L trypsin-EDTA solution Nacalai
  • Tris-C3Hmt or TE-C3Hmt was seeded onto each plate at 5 x 10 6 cells/well. After culturing for 10 hours, the cells were washed twice with PBS and then detached and collected using a trypsin-EDTA solution.
  • Fluorescence images were then captured using a confocal laser scanning microscope (TCS SP8, Leica) (CFSE: excitation wavelength 488 nm/emission wavelength 495-550 nm, DAPI: excitation wavelength 405 nm/emission wavelength 415-480 nm).
  • TCS SP8, Leica confocal laser scanning microscope
  • Fluorescence images of C3H10T1/2 cells and RAW264.7 cells are shown in Figure 10. As shown in Figure 10, culturing C3H10T1/2 cells or RAW264.7 cells with the addition of Tris-C3Hmt or TE-C3Hmt resulted in the uptake of mitochondria into the cells.
  • ATP measurement reagent (“Lump” ATP Measurement Reagent Ver. 2.1, Toyo B-Net) was added to each mitochondria on a 96-well plate, and the amount of ATP produced per 1.7 ⁇ 10 cells was measured using a microplate reader (GloMax, Promega).
  • Test Example 13 Cell proliferation-promoting ability of trypsin-treated C3Hmt (liver injury model cells) Hepa1-6 cells were seeded in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells/well (100 ⁇ L/well), and the medium was replaced with DMEM containing 10 mM CCl 4 and 10% DMSO, followed by culturing for 3 hours.
  • mitochondria HEKmt and C3Hmt were isolated from HEK293 cells and C3H10T1/2 cells using the SLO method.
  • a 2.5 g/L trypsin solution Nacalai was added to a portion of the isolated C3Hmt and incubated at 37°C for 5 minutes.
  • the trypsin was neutralized by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 x g for 10 minutes, and mitochondria (T-C3Hmt) were then collected.
  • the amount of mitochondrial protein was then measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific), and the amount of mitochondrial phospholipids was measured using a phospholipid assay kit (Lab Assay Phospholipid, FUJIFILM).
  • ALT concentration in the supernatant is shown in Figure 12A
  • Figure 12B The ALT concentration in the supernatant is shown in Figure 12B
  • "**" and "***” indicate statistical significance (Dunnette's test, vs. CCl4 + mt - , ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • Figures 12A and 12B the introduction of mitochondria into liver injury model cells improved the increase in ALT concentration and the decrease in viable cell count in a mitochondria dose-dependent manner, with the greatest improvement effect in trypsin-treated C3Hmt.
  • Test Example 14 Therapeutic effect of trypsin-treated C3Hmt in liver damage model mice 1 ⁇ L/g body weight of 25% CCl 4 /olive oil was intraperitoneally administered to ddy mice to prepare liver damage model mice.
  • C3Hmt mitochondria
  • a 2.5 g/L trypsin solution Nacalai
  • the trypsin was neutralized by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 x g for 10 minutes, and mitochondria (T-C3Hmt) were then collected.
  • the amount of mitochondrial protein was then measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific), and the amount of mitochondrial phospholipids was measured using a phospholipid assay kit (Lab Assay Phospholipids, FUJIFILM).
  • T-C3Hmt containing the same amount of phospholipid as 280 ⁇ g of mitochondria, was administered intravenously to the ddY mice. 24 and 48 hours later, plasma AST and ALT concentrations were measured using a commercially available kit (Transaminase CII-Test Wako, FUJIFILM).
  • Plasma AST concentrations are shown in Figure 13A, and ALT concentrations are shown in Figure 13B.
  • intravenous administration of T-C3Hmt to liver injury model mice reduced AST and ALT concentrations.
  • Test Example 15 Therapeutic effect of trypsin-treated C3Hmt in chronic hepatitis model mice Ddy mice were intraperitoneally administered 0.1 ⁇ L/g body weight of 10% CCl 4 /olive oil three times a week for 4 weeks.
  • C3Hmt mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells using the SLO method, and the protein content of C3Hmt was measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific). 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai) was added to the isolated C3Hmt and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes, mitochondria (T-C3Hmt) were collected. T-C3Hmt obtained from 50 ⁇ g of C3Hmt was administered intravenously to ddY mice once a week for 3 weeks.
  • HEKmt and Hepamt Mitochondria (HEKmt and Hepamt) were isolated from HEK293 and Hepa1-6 cells by the SLO method.
  • a 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai) was added to a portion of the isolated mitochondria and incubated at 37°C for 5 minutes.
  • the trypsin was neutralized by adding the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes, and the mitochondria (T-HEKmt and T-Hepamt) were then collected.
  • HEKmt, T-HEKmt, Hepamt, and T-Hepamt 50 to 100 ⁇ g of mitochondria (HEKmt, T-HEKmt, Hepamt, and T-Hepamt) were suspended in 1000 ⁇ L of PBS (pH 7.4) and allowed to stand for 1 hour at 37° C. Then, using a zeta potential/particle size measurement system (ELSZ-2000Z, Otsuka), the scattering intensity distribution of the mitochondria (1 ⁇ 10 7 cells mt/1 mL PBS) was measured to create a particle size distribution and measure the cumulant particle size.
  • ELSZ-2000Z, Otsuka zeta potential/particle size measurement system
  • FIG. 15A The particle size distribution of various mitochondria is shown in Figure 15A, and the cumulant particle size is shown in Figure 15B.
  • Figures 15A and 15B when HEKmt and Hepamt were left to stand at 37°C for 1 hour, aggregates with particle sizes of 10 to 10 nm were observed. In contrast, when HEKmt and Hepamt were pre-treated with trypsin, no aggregates were observed even after leaving them to stand at 37°C for 1 hour, and the proportion of mitochondrial particles with a particle size of 50 ⁇ m or less was 95% or more, resulting in a smaller cumulant particle size.
  • Test Example 17 Inhibition of lung accumulation of HEKmt by trypsin treatment Mitochondria (HEKmt) were isolated from HEK293 cells by the SLO method. HEKmt was labeled with DiR (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide), and the protein content of HEKmt was measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific). A portion of the isolated HEKmt was added to 2.5 g/L trypsin solution (Nacalai) and incubated at 37°C for 5 minutes. After neutralizing the trypsin with the supernatant of FBS (Capricorn) that had been previously centrifuged at 7000 ⁇ g for 10 minutes, mitochondria (T-HEKmt) were collected.
  • DiR 1,1'-dioctadec
  • Figure 16 shows the tissue distribution of HEKmt and T-HEKmt following intravenous administration.
  • HEKmt that formed aggregates by standing at 37°C for 1 hour accumulated significantly in the lungs.
  • T-HEKmt that had been treated with trypsin before standing at 37°C for 1 hour showed reduced accumulation in the lungs.
  • Test Example 18 Inhibition of C3Hmt aggregation by heparin sodium treatment or dextran sulfate sodium treatment Mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells by the SLO method.
  • the isolated C3Hmt were suspended in PBS, PBS containing 467 mg/L sodium heparin (molecular mass of heparin: 12-15 kDa), or PBS containing 467 mg/L sodium dextran sulfate (molecular mass of dextran sulfate: 5 kDa), and then the mitochondria were collected.
  • FIG. 17 The particle size distribution of various mitochondria is shown in Figure 17. As shown in Figure 17, aggregates with diameters of 10 to 10 nm were observed in C3Hmt treated with PBS, but no aggregates were observed in C3Hmt treated with heparin sodium or dextran sulfate sodium, and the proportion of mitochondrial particles with diameters of 50 ⁇ m or less was 100%.
  • Test Example 19 Inhibition of C3Hmt aggregation by heparin sodium treatment Mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells by the SLO method. The isolated C3Hmt was suspended in PBS or PBS containing 0.5 g/L sodium heparin (molecular mass of heparin: 12-15 kDa) and allowed to stand at 4°C, 15°C, or 37°C for 1 hour.
  • PBS or PBS containing 0.5 g/L sodium heparin molecular mass of heparin: 12-15 kDa
  • the scattering intensity distribution of the mitochondria (1 x 107 cells mt/1 mL PBS or sodium heparin PBS) was measured using a zeta potential/particle size measurement system (ELSZ-2000Z, Otsuka), and a particle size distribution was generated, along with measuring the cumulant particle size.
  • ELSZ-2000Z, Otsuka zeta potential/particle size measurement system
  • FIG. 18A The particle size distribution of various mitochondria is shown in Figure 18A, and the cumulant particle size is shown in Figure 18B.
  • Figures 18A and 18B C3Hmt aggregated in a temperature-dependent manner, increasing the cumulant particle size, but aggregation was suppressed when suspended in PBS containing heparin sodium.
  • Test Example 20 Suppression of C3Hmt accumulation in the lung by heparin sodium treatment Mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells by the SLO method and suspended in PBS containing 0.5 g/L sodium heparin (molecular mass of heparin: 12-15 kDa).
  • C3Hmt was labeled with DiR (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide), and the protein content of C3Hmt was measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific).
  • heparin sodium-treated C3Hmt was suspended in 200 ⁇ L of PBS containing 0.5 g/L heparin sodium and administered intravenously to ddy mice (6 weeks old). One minute after administration, the mice were perfused with PBS and all organs were collected. Ex vivo imaging was then performed using a chemiluminescence/fluorescence imaging system (iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific) (excitation wavelength 745-765 nm/emission wavelength 810-850 nm).
  • a chemiluminescence/fluorescence imaging system iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific
  • Figure 19 shows the tissue distribution of heparin sodium-treated C3Hmt following intravenous administration. As shown in Figure 19, accumulation in the lungs was significantly suppressed compared to when it was not treated with heparin sodium (see Figure 1), and as a result, no mice died.
  • Test Example 21 ATP production ability of heparin sodium-treated C3Hmt Mitochondria (C3Hmt) were isolated from C3H10T1/2 cells by the SLO method.
  • the isolated C3Hmt were suspended in PBS or PBS containing 0.5 g/L sodium heparin (molecular mass of heparin: 12-15 kDa) and incubated at 4°C. After 0.2, 3, or 24 hours, mitochondria were collected by centrifugation at 7000 ⁇ g, resuspended in DMEM containing 15% FBS, and incubated at room temperature for 10 minutes.
  • An ATP assay reagent (“Lump" ATP assay reagent Ver. 2.1, Toyo B-Net) was added to each mitochondria in a 96-well plate, and the ATP production per 1.7 ⁇ 106 cells was measured using a microplate reader (GloMax, Promega).
  • Test Example 22 Cell proliferation-promoting ability of heparin sodium-treated C3Hmt C3H10T1/2 cells were seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 3 cells/well and cultured.
  • C3Hmt mitochondria
  • SLO method SLO method
  • protein content of C3Hmt was measured using a protein assay kit (Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific).
  • the isolated C3Hmt was resuspended in PBS or PBS containing 0.5 g/L sodium heparin (molecular mass of heparin: 12-15 kDa).
  • the mitochondrial suspension was added to a 96-well plate so that the mitochondria were 5 ⁇ g/well (final concentration of heparin sodium: 10%). After culturing for 24 hours, the relative number of viable cells was measured using a viable cell counting kit (Cell Counting Kit-8, DOJINDO).

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Abstract

単離されたミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部が分解され、又は単離されたミトコンドリアの外表面が分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で修飾された改変型ミトコンドリア、及びその生産方法を提供する。また、ミトコンドリアの凝集抑制方法、ミトコンドリア用保存液、及びミトコンドリアの保存方法を提供する。

Description

改変型ミトコンドリア及びその生産方法、並びにミトコンドリアの凝集抑制方法、ミトコンドリア用保存液、及びミトコンドリアの保存方法
　本発明は、改変型ミトコンドリア及びその生産方法、並びにミトコンドリアの凝集抑制方法、ミトコンドリア用保存液、及びミトコンドリアの保存方法に関する。
　ミトコンドリアは、真核細胞の細胞内に存在する細胞内小器官の１つであり、好気呼吸によるエネルギー産生やアポトーシス制御など、細胞の生命活動を支える重要な役割を担っている。
　近年、単離されたミトコンドリアを疾患モデル動物に投与することで疾患を治療し得ることが報告されており、ミトコンドリアを利用した治療方法の開発が注目されている。例えば、非特許文献１には、肝細胞から単離されたミトコンドリアを四塩化炭素誘発肝障害モデルマウスの静脈内に投与することで、治療効果が得られたことが報告されている。また、非特許文献２には、骨格筋細胞又は間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを盲腸スラリー誘発敗血症モデルラットの静脈内に投与することで、治療効果が得られたことが報告されている。
Zhao, Z., et al., Bioeng. Transl. Med., 6(2), e10209, 2020 Hwang, J.W. et al., Crit. Care, 25(20), 2021
　本発明者らは、各種細胞から単離されたミトコンドリアの治療効果について鋭意検討を行った。その結果、単離されたミトコンドリアは凝集体を形成しやすく、特に間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアは単離当初から凝集体のサイズが大きく、量も多いことが判明した。また、間葉系幹細胞以外から単離されたミトコンドリアについても、保存中に凝集体のサイズが大きくなり、量も増加することが判明した。このように凝集体を含むミトコンドリアを静脈内に投与した場合、血管内で塞栓が形成されるリスクがある。実際、本発明者らは、間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアをマウスの静脈内に投与した場合に、肺の血管で塞栓が形成されることを確認している。
　そこで、本発明は、単離されたミトコンドリアの凝集体形成を抑制する各種技術を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞　単離されたミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部が分解され、又は単離されたミトコンドリアの外表面が分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で修飾された改変型ミトコンドリア。
＜２＞　前記ミトコンドリアが間葉系幹細胞由来である、＜１＞に記載の改変型ミトコンドリア。
＜３＞　３７℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に分散させて１時間静置した後、動的光散乱法により粒度分布を測定したときの、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上である、＜２＞に記載の改変型ミトコンドリア。
＜４＞　構成タンパク質のうち分子質量６０ｋＤａ以上のタンパク質の量が、該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上のタンパク質の量に対して６０％以下である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の改変型ミトコンドリア。
＜５＞　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼで処理することにより得られる、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の改変型ミトコンドリア。
＜６＞　前記プロテアーゼがトリプシンである、＜５＞に記載の改変型ミトコンドリア。
＜７＞　前記凝集抑制剤が負電荷化合物である、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の改変型ミトコンドリア。
＜８＞　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、＜７＞に記載の改変型ミトコンドリア。
＜９＞　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することを含む改変型ミトコンドリアの生産方法。
＜１０＞　前記凝集抑制剤が負電荷化合物である、＜９＞に記載の改変型ミトコンドリアの生産方法。
＜１１＞　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、＜１０＞に記載の改変型ミトコンドリアの生産方法。
＜１２＞　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することを含むミトコンドリアの凝集抑制方法。
＜１３＞　前記凝集抑制剤が負電荷化合物である、＜１２＞に記載のミトコンドリアの凝集抑制方法。
＜１４＞　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、＜１３＞に記載のミトコンドリアの凝集抑制方法。
＜１５＞　分子質量１ｋＤａ以上の負電荷化合物を含有するミトコンドリア用保存液。
＜１６＞　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、＜１５＞に記載のミトコンドリア用保存液。
＜１７＞　単離されたミトコンドリアを＜１５＞又は＜１６＞に記載のミトコンドリア用保存液中で保存することを含むミトコンドリアの保存方法。
　本発明によれば、単離されたミトコンドリアの凝集体形成を抑制する各種技術を提供することができる。
ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、ＵＥ７Ｔ－１３細胞から単離されたミトコンドリア（ＵＥｍｔ）、又はｍ１７．ＡＳＣ細胞から単離されたミトコンドリア（ｍ１７ｍｔ）をマウスに静脈内投与したときの組織分布を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、又はＣ３Ｈｍｔをトリプシン－ＥＤＴＡで処理して得られたミトコンドリア（ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）をマウスに静脈内投与したときの組織分布を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、及びＣ３ＨｍｔをＴｒｉｓ－スクロース緩衝液又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理して得られたミトコンドリア（Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ、ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）の凝集性の違いを示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、及びＣ３Ｈｍｔをトリプシン又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ、ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）の粒度分布を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＴｒｉｓ－スクロース緩衝液、ＥＤＴＡ、トリプシン、又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したときの凝集性の違いを示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＴｒｉｓ－スクロース緩衝液、ＥＤＴＡ、トリプシン、又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したときの粒度分布を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、及びＣ３Ｈｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）のキュムラント粒径を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、及びＣ３Ｈｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）のゼータ電位を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液、トリプシン－ＥＤＴＡ、又はトリプシンで処理したときの構成タンパク質の違いをドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分析した結果を示す図である。 ＵＥ７Ｔ－１３細胞から単離されたミトコンドリア（ＵＥｍｔ）、ｍ１７．ＡＳＣ細胞から単離されたミトコンドリア（ｍ１７ｍｔ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離されたミトコンドリア（ＮＩＨｍｔ）、及びＨｅｐａ１－６細胞から単離されたミトコンドリア（Ｈｅｐａｍｔ）をＴｒｉｓ－スクロース緩衝液又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したときの凝集性の違いを示す図である。 ＵＥ７Ｔ－１３細胞から単離されたミトコンドリア（ＵＥｍｔ）、ｍ１７．ＡＳＣ細胞から単離されたミトコンドリア（ｍ１７ｍｔ）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離されたミトコンドリア（ＮＩＨｍｔ）、及びＨｅｐａ１－６細胞から単離されたミトコンドリア（Ｈｅｐａｍｔ）をＴｒｉｓ－スクロース緩衝液又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したときの構成タンパク質の違いをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した結果を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリアをＴｒｉｓ－スクロース緩衝液又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理して得られたミトコンドリア（Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ、ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）の存在下でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞又はＲＡＷ２６４．７細胞を培養したときの細胞内へのミトコンドリアの取り込みを示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリアをＴｒｉｓ－スクロース緩衝液又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理して得られたミトコンドリア（Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ、ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）のＡＴＰ産生量を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、又はＣ３Ｈｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）の存在下で肝障害モデル細胞を培養したときの上清中のＡＬＴ濃度を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、又はＣ３Ｈｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）の存在下で肝障害モデル細胞を培養したときの相対的生細胞数を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリアをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を肝障害モデルマウスに静脈内投与したときの血漿中のＡＳＴ濃度を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリアをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を肝障害モデルマウスに静脈内投与したときの血漿中のＡＬＴ濃度を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリアをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を慢性肝炎モデルマウスに静脈内投与したときの尾状葉のシリウスレッド染色結果を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリアをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を慢性肝炎モデルマウスに静脈内投与したときの尾状葉のマッソントリクローム染色結果を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、Ｃ３Ｈｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）、Ｈｅｐａ１－６細胞から単離されたミトコンドリア（Ｈｅｐａｍｔ）、及びＨｅｐａｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｈｅｐａｍｔ）を３７℃のＰＢＳ中で１時間静置したときの粒度分布を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）、Ｃ３Ｈｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）、Ｈｅｐａ１－６細胞から単離されたミトコンドリア（Ｈｅｐａｍｔ）、及びＨｅｐａｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－Ｈｅｐａｍｔ）を３７℃のＰＢＳ中で１時間静置したときのキュムラント粒径を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞から単離されたミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）又はＨＥＫｍｔをトリプシンで処理して得られたミトコンドリア（Ｔ－ＨＥＫｍｔ）を３７℃で１時間静置した後、マウスに静脈内投与したときの組織分布を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＰＢＳ、ヘパリンナトリウム、又はデキストラン硫酸ナトリウムで処理した後、４℃のＰＢＳ中で３０分間静置したときの粒度分布を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＰＢＳ又はヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁した後、４℃、１５℃、又は３７℃で１時間静置したときの粒度分布を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＰＢＳ又はヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁した後、４℃、１５℃、又は３７℃で１時間静置したときのキュムラント粒径を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁した後、マウスに静脈内投与したときの組織分布を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＰＢＳ又はヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁し、４℃で０．２時間、３時間、又は２４時間静置したときのＡＴＰ産生量を示す図である。 Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から単離されたミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）をＰＢＳ又はヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに再懸濁して得られた懸濁液の存在下でＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を培養したときの相対的生細胞数を示す図である。
　以下、本発明を適用した具体的な実施形態について説明する。本明細書においては特に断らない限り、数値ｘ及びｙを用いた「ｘ～ｙ」という表記は、「ｘ以上ｙ以下」を意味するものとする。かかる表記において数値ｙのみに単位を付した場合には、当該単位が数値ｘにも適用されるものとする。また、本明細書で言及するミトコンドリアの重量は、ミトコンドリアのタンパク質量を意味する。例えば、「Ｘ（μｇ）のミトコンドリア」とは、「タンパク質量がＸ（μｇ）であるミトコンドリア」を意味する。
＜改変型ミトコンドリア＞
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部が分解され、又は単離されたミトコンドリアの外表面が分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で修飾されたものである。
　前述したとおり、本発明者らは、単離されたミトコンドリアは凝集体を形成しやすく、特に間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアは単離当初から凝集体のサイズが大きく、量も多いことを確認している。また、本発明者らは、間葉系幹細胞以外から単離されたミトコンドリアについても、保存中に凝集体のサイズが大きくなり、量も増加することを確認している。本発明者らは、ミトコンドリアの凝集体形成を抑制する方法について鋭意検討を進めた。その結果、ミトコンドリアの凝集体形成にはミトコンドリアの表面タンパク質が関与していることを見出すとともに、ミトコンドリアの表面をプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することでミトコンドリア同士の相互作用が阻害され、凝集体形成が抑制されることを見出した。本実施形態に係る改変型ミトコンドリアは、このような知見に基づき完成されたものである。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが由来する生物種及び細胞種は特に制限されない。生物種としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、ヒツジ、サル、ヒト等が挙げられ、改変型ミトコンドリアの用途に応じて適宜選択することができる。細胞種としては、筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。これらの細胞種の中でも、凝集体形成の抑制効果が高い点から、間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞が由来する組織は特に制限されず、例えば、骨髄、歯髄、脂肪、胚、筋肉、神経、皮膚、滑膜、羊膜、胎盤、臍帯、臍帯血等が挙げられる。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが凝集体を形成し難いことは、例えば、動的光散乱法により該改変型ミトコンドリアの粒度分布を測定することによって確認することができる。本実施形態に係る改変型ミトコンドリアを３７℃のＰＢＳ中に分散させて１時間静置した後、動的光散乱法により粒度分布を測定した場合、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上、好ましくは粒径５μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上となり得る。これに対して、改変型ではない通常のミトコンドリアの粒度分布を同様に測定した場合、凝集体に起因し、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合は９５％以上とならない。
　なお、改変型ではない通常の間葉系幹細胞由来ミトコンドリアは、特に凝集体を形成しやすいため、４℃のＰＢＳ中で３０分間静置するという、上記よりも低温かつ短時間の静置条件とした場合にも、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％未満となる。これに対して、本実施形態に係る改変型ミトコンドリアは、間葉系幹細胞に由来する場合であっても、同条件で測定したときの粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合は９５％以上となる。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部が分解されたミトコンドリアである場合、分解される表面タンパク質の種類は、ミトコンドリアの凝集体形成が抑制されるものである限り特に制限されない。分解される表面タンパク質の例としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分子質量６０ｋＤａ以上として観察されるタンパク質が挙げられる。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部が分解されたミトコンドリアである場合、該改変型ミトコンドリアは、分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量が、該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量に対して、６０％以下となっていることが好ましく、５５％以下となっていることがより好ましく、５０％以下となっていることがさらに好ましい。分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量の下限値は特に制限されないが、該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量に対して、２０％以上となっていることが好ましい。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量が、該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量に対して６０％以下となっているか否かは、後述する試験例８及び試験例１０のようにして確認することができる。すなわち、本実施形態に係る改変型ミトコンドリア及び該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアの構成タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分析し、分子質量６０ｋＤａ以上のバンドの明度を市販の画像編集ソフトウェア（Adobe PhotoShop, Adobe）を用いて数値化する。そして、ブランク（背景）の明度から分子質量６０ｋＤａ以上のバンドの明度を減算した値をそれぞれ求め、両者の値を比較することにより確認することができる。
　なお、「改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリア」とは、由来する生物種及び細胞種が同じであることを意味し、細胞種が間葉系幹細胞である場合には、間葉系幹細胞が由来する組織も同じであることを意味する。例えば、本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが、ヒト肝細胞から単離されたミトコンドリアを改変したものである場合、ヒト肝細胞から単離された未改変のミトコンドリアと比較すればよい。また、本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを改変したものである場合、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から単離された未改変のミトコンドリアと比較すればよい。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアの外表面が分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で修飾されたミトコンドリアである場合、凝集抑制剤としては、ミトコンドリアの凝集体形成が抑制されるものである限り特に制限されない。凝集抑制剤の分子質量は、例えば、３～３０ｋＤａが好ましい。凝集抑制剤の具体例としては、例えば、ポリマーや負電荷化合物が挙げられる。なお、負電荷化合物により凝集体形成が抑制されるメカニズムは必ずしも明確ではないが、ミトコンドリアの外表面に凝集に関わる正電荷分子が存在し、この正電荷分子と負電荷化合物とが結合することにより、ミトコンドリア同士の相互作用が阻害されるためと推測される。
　凝集抑制剤がポリマーである場合、該ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリ乳酸－グリコール酸、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル等が挙げられる。また、凝集抑制剤が負電荷化合物である場合、該負電荷化合物としては、例えば、ヘパリン、デキストラン硫酸、デキストラン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、コンドロイチン硫酸、アルギン酸、カラギーナン、ポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、ポリマレイン酸、ポリビニルリン酸等が挙げられる。負電荷化合物は、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩の形態であってもよい。これらの凝集抑制剤の中でも、ヘパリン又はその塩、及びデキストラン硫酸又はその塩が好ましい。ヘパリンの分子質量は、１～３０ｋＤａであることが好ましく、４～１５ｋＤａであることがより好ましい。デキストラン硫酸の分子質量は、１～３０ｋＤａであることが好ましく、４～８ｋＤａであることがより好ましい。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアが、単離されたミトコンドリアの外表面が凝集抑制剤で修飾されたミトコンドリアである場合、該改変型ミトコンドリアは、表面タンパク質が実質的に分解されていないものであることが好ましい。例えば、該改変型ミトコンドリアは、分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量が、該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量に対して、９０～１１０％となっていることが好ましく、９５～１０５％となっていることがより好ましい。
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアは、凝集体を形成し難いため、生体に投与して種々の疾患を治療する用途に好適に使用することができる。疾患としては、ミトコンドリアの投与により改善が期待されるものであれば特に制限されず、例えば、虚血関連疾患、神経変性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、加齢性疾患、網膜機能障害、癌、糖尿病等が挙げられる。
＜改変型ミトコンドリアの生産方法及びミトコンドリアの凝集抑制方法＞
　本実施形態に係る改変型ミトコンドリアの生産方法は、単離されたミトコンドリアをプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することを含む。また、本実施形態に係るミトコンドリアの凝集抑制方法は、単離されたミトコンドリアをプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することを含む。
　ミトコンドリアのドナーとなる生物種及び細胞種は特に制限されない。生物種としては、例えば、マウス、ラット、イヌ、ヒツジ、サル、ヒト等が挙げられ、改変型ミトコンドリアの用途に応じて適宜選択することができる。細胞種としては、筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞等が挙げられる。これらの細胞種の中でも、凝集体形成の抑制効果が高い点から、間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞が由来する組織は特に制限されず、例えば、骨髄、歯髄、脂肪、胚、筋肉、神経、皮膚、滑膜、羊膜、胎盤、臍帯、臍帯血等が挙げられる。
　細胞からミトコンドリアを単離する方法としては、任意の方法を採用することができ、必要に応じて市販のキットを使用することもできる。細胞からミトコンドリアを単離する方法としては、細胞を破砕した後、遠心分離によりミトコンドリア画分を単離する方法；細胞膜に孔を形成した後、遠心分離によりミトコンドリア画分を単離する方法；等が知られている。その中でも、損傷の少ないミトコンドリアを単離する観点から、細胞膜に孔を形成した後、ミトコンドリア画分を単離する方法が好ましく、特に、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を用いて細胞膜に孔を形成した後、ミトコンドリア画分を単離する方法（例えば、Shibata, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 463, 563-568, 2015を参照）が好ましい。
　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼで処理する場合、使用するプロテアーゼとしては、ミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部を分解し得るものであれば特に制限されない。プロテアーゼの具体例としては、例えば、トリプシン、プロテアーゼＫ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、キモトリプシン、ペプシン、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシン代替物（例えば、Thermo Fisher Scientific製のTrypLE）等が挙げられる。これらの中でも、トリプシンが好ましい。
　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼで処理する方法は特に制限されない。一例としては、ミトコンドリアにプロテアーゼ溶液を添加し、１０～４０℃で５～１８０分間程度インキュベートする方法が挙げられる。プロテアーゼ溶液におけるプロテアーゼの濃度は、例えば、０．００１～１０ｇ／Ｌであってもよく、０．００１～１ｇ／Ｌであってもよい。プロテアーゼ処理後には、必要に応じて血清又はプロテアーゼインヒビターを添加してプロテアーゼを不活性化した後、遠心分離によりミトコンドリア（改変型ミトコンドリア）を回収すればよい。
　単離されたミトコンドリアを分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理する場合、使用する凝集抑制剤としては、ミトコンドリアの凝集体形成が抑制されるものである限り特に制限されない。凝集抑制剤の具体例としては、上述したポリマーや負電荷化合物が挙げられる。凝集抑制剤の中でも、ヘパリン又はその塩、及びデキストラン硫酸又はその塩が好ましい。
　単離されたミトコンドリアを凝集抑制剤で処理する方法は特に制限されない。一例としては、凝集抑制剤を含有する溶液にミトコンドリアを添加し、４～４０℃で５～１８０分間程度インキュベートする方法が挙げられる。凝集抑制剤を含有する溶液における凝集抑制剤の濃度は、例えば、０．００１～１０ｇ／Ｌであってもよく、０．００１～１ｇ／Ｌであってもよい。凝集抑制剤による処理後には、遠心分離によりミトコンドリア（改変型ミトコンドリア）を回収すればよい。
＜ミトコンドリア用保存液＞
　本実施形態に係るミトコンドリア用保存液は、分子質量１ｋＤａ以上の負電荷化合物を含有する。単離されたミトコンドリアを本実施形態に係るミトコンドリア用保存液中で保存することにより、保存中におけるミトコンドリアの凝集体形成を抑制することができる。
　負電荷化合物としては、上述した化合物が挙げられる。負電荷化合物の中でも、ヘパリン又はその塩、及びデキストラン硫酸又はその塩が好ましい。本実施形態に係るミトコンドリア用保存液中における負電荷化合物の濃度は、０．００１～１ｇ／Ｌであることが好ましく、０．１～１ｇ／Ｌであることがより好ましい。
　ミトコンドリア用保存液は、各種組成物に負電荷化合物を添加して調製することができる。ミトコンドリア用保存液を調製するための組成物としては、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ－１６４０、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、α－ＭＥＭ等の細胞培養用培地；ＬＢ培地、ニュートリエントブロス、ＴＳＡ（Trypticase Soy Agar）培地、ＭＲＳ（de Man-Rogosa-Sharpe）培地等の細菌培養用培地；ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（Hanks' Balance Salt Solution）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）、ＳＳＣ（Saline-Sodium Citrate）等の緩衝液；生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、リンゲル液、５％　ブドウ糖液、ＤＭＳＯ希釈液等のミトコンドリア投与用輸液；ミトコンドリア用培地；などが挙げられる。ミトコンドリア用培地としては、Mitochondria Isolation Kit（Sigma-Aldrich）に付属のバッファー（10 mM HEPES (pH 7.4), 250 mM sucrose, 1 mM ATP, 0.08 mM ADP, 5 mM sodium succinate, 2 mM K2HPO4, 1 mM DTT）、MitoXpress（Agilent）に付属のバッファー（70 mM Sucrose, 10mM MgCl2, 1 mM EGTA, 5 mM K2HPO4, 210 mM Mannitol, 10 mM MOPS, 5 mM HEPES (pH 7.4)）、或いは下記１）～６）の論文記載のバッファー等が挙げられる。
　１）0.25 M sucrose, 0.01 M Tris, adjusted to pH 7.4 with MOPS（Liao et al., Methods Cell Biol. 155: 3-31 (2019)）
　２）250 mM sucros, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, pH 7.4 using 2 mol/L Tris（Caldeira et al., Front Physiol. 12: 748261 (2021)）
　３）250 mM mannitol, 5 mM HEPES (pH 7.4), 0.5 mM EGTA（Wieckowski et al., Nature Protocols 4: 1582-90 (2009)）
　４）0.6 M Sorbitol、20 mM HEPES-KOH、pH 7.4, 2 mM MgCl2（Liao et al., PLoS One 13: e0196632 (2018)）
　５）210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 5 mM HEPES, 1 mM EGTA, 0.5% BSA pH 7.2、又はPBS supplemented with 10 mM EDTA（Franko et al., PLoS One 8: e82392 (2013)）
　６）0.4 M mannitol, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM KCl, 5% DMSO, pH 7.4（Xu et al., Plant Methods 16: 149 (2020)）
＜ミトコンドリアの保存方法＞
　本実施形態に係るミトコンドリアの保存方法は、単離されたミトコンドリアを、上述した本実施形態に係るミトコンドリア用保存液中で保存することを含む。単離されたミトコンドリアを本実施形態に係るミトコンドリア用保存液中で保存することにより、保存中におけるミトコンドリアの凝集体形成を抑制することができる。
　ミトコンドリアのドナーとなる生物種及び細胞種は特に制限されず、上述した改変型ミトコンドリアの生産方法にて例示した生物種及び細胞種が挙げられる。また、細胞からミトコンドリアを単離する方法も特に制限されず、上述した改変型ミトコンドリアの生産方法にて例示した方法を採用することができる。
　ミトコンドリア用保存液中におけるミトコンドリアの含有率は、０．００２～２ｇ／Ｌであることが好ましく、０．００２～０．３ｇ／Ｌであることがより好ましい。
　ミトコンドリアを保存する際の温度は、０～１０℃であることが好ましく、３～５℃であることがより好ましい。また、保存期間は、１～７日間であることが好ましく、１～３日間であることがより好ましい。
　以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
　以下の実施例では、ミトコンドリア（以下、「ｍｔ」とも記す。）を単離するドナー細胞として、ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞、マウス胚由来間葉系幹細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株ＵＥ７Ｔ－１３細胞、マウス脂肪由来間葉系幹細胞株ｍ１７．ＡＳＣ細胞、マウス線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びマウス肝がん細胞株Ｈｅｐａ１－６細胞を使用した。ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＵＥ７Ｔ－１３細胞、ｍ１７．ＡＳＣ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｅｐａ１－６細胞から単離されたミトコンドリアをそれぞれ「ＨＥＫｍｔ」、「Ｃ３Ｈｍｔ」、「ＵＥｍｔ」、「ｍ１７ｍｔ」、「ＮＩＨｍｔ」、「Ｈｅｐａｍｔ」とも記す。また、トリプシン－ＥＤＴＡ、トリプシン、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液で処理した後のＣ３Ｈｍｔをそれぞれ「ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ」、「Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ」、「Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ」とも記す。
＜ミトコンドリアの単離方法（ＳＬＯ法）＞
　後述する試験例では、以下のプロトコルに沿って、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を用いてミトコンドリアを単離する。以下、この単離方法を「ＳＬＯ法」と称する。
　まず、ＳＬＯ（Recombinant, Solution, FUJIFILM）を１μｇ／ｍＬとなるようにＨＥＰＥＳ－ＣＨ３ＣＯＯＫ緩衝液（115 mM CH3COOK, 2.5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol, 25 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid, pH 7.4）に溶解する。次いで、ＳＬＯが０．５μｇ／１０７ｃｅｌｌｓとなるように各種細胞をＳＬＯ含有ＨＥＰＥＳ－ＣＨ３ＣＯＯＫ緩衝液に懸濁し、４℃で１０分間インキュベートする。次いで、５００×ｇで３分間遠心し、沈殿をＴｒｉｓ－スクロース緩衝液（250 mM Sucrose, 0.5 mM EDTA, 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane, pH 7.4）で再懸濁し、再度遠心する。次いで、１ｍＬ／１０７ｃｅｌｌｓとなるようにＴｒｉｓ－スクロース緩衝液を加えて沈殿を再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートする。次いで、２００回／１ｍＬとなるようにピペッティングし、６００×ｇで１０分間遠心し、上清を再度遠心する。最後に、上清を７０００×ｇで１０分間遠心し、沈殿（ミトコンドリア画分）をＰＢＳで再懸濁する。
＜試験例１：各種ミトコンドリアの静脈内投与後の組織分布（１）＞
　ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＵＥ７Ｔ－１３細胞、及びｍ１７．ＡＳＣ細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ、Ｃ３Ｈｍｔ、ＵＥｍｔ、及びｍ１７ｍｔ）を単離した。ＤｉＲ（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide）を用いてミトコンドリアを標識し、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてミトコンドリアのタンパク質量を測定した。
　次いで、５０μｇのミトコンドリアを２００μＬのＰＢＳに懸濁し、ｄｄｙマウス（５週齢）に対して静脈内投与した。投与から１分後にＰＢＳを灌流し、全臓器を回収した。そして、化学発光・蛍光撮影装置（iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific）を用いてｅｘ　ｖｉｖｏイメージングを行った（励起波長７４５～７６５ｎｍ／蛍光波長８１０～８５０ｎｍ）。
　ＨＥＫｍｔ、Ｃ３Ｈｍｔ、ＵＥｍｔ、及びｍ１７ｍｔを静脈内投与したときの組織分布を図１に示す。図１に示すとおり、ＨＥＫｍｔは、肝臓に多く移行し、マウスは死亡しなかったが、Ｃ３Ｈｍｔ、ＵＥｍｔ、及びｍ１７ｍｔは、肺に多く集積し、殆どのマウスが死亡した。
＜試験例２：各種ミトコンドリアの静脈内投与後の組織分布（２）＞
　トランスフェクション試薬（Lipofectamine 3000 Reagent, Thermo Fisher Scientific）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に、ミトコンドリア移行シグナル（MTSCOX8A）とルシフェラーゼ（NanoLuc Luciferase）とをＧＧＧＧＳリンカーを介して融合させたタンパク質（MTSCOX8A-GGGGS-Nluc）をコードするベクター（MTSCOX8A-GGGGS-Nluc/pEBMulti-Hyg）を導入し、安定発現株を作製した。
　次いで、MTSCOX8A-GGGGS-Nlucを発現した各種細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔ）を単離した。また、単離したＣ３Ｈｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、トリプシン－ＥＤＴＡ処理後のミトコンドリア（ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。そして、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてミトコンドリアのタンパク質量を測定した。
　次いで、３５０μｇのミトコンドリアを２００μＬのＰＢＳに懸濁し、ｄｄｙマウス（７週齢）に対して静脈内投与した。その際、ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔについては、トリプシン－ＥＤＴＡ処理前と相対的発光量を揃えて投与した。投与から１分後にＰＢＳを灌流し、全臓器を回収した。そして、臓器質量に対して９倍量の細胞溶解バッファー（20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.05w/v% NP-40 substitute）を添加し、ホモジナイザー（Physcotron, Microtec）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを１６０００ｇ、１５分、４℃の条件で遠心した後、上清に基質としてのフリマジン（furimazine）を添加し、マイクロプレートリーダー（EnVision, PerkinElmer）を用いて相対的発光量を測定した。
　ＨＥＫｍｔ、Ｃ３Ｈｍｔ、及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔを静脈内投与したときの組織分布を図２に示す。図２に示すとおり、ＨＥＫｍｔは、肝臓、脾臓、及び腎臓に多く移行し、マウスは死亡しなかったが、Ｃ３Ｈｍｔは、肺に多く集積し、殆どのマウスが死亡した。これに対して、ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔは、肝臓、脾臓、及び腎臓に多く移行し、マウスは死亡しなかった。
＜試験例３：ミトコンドリアの凝集性評価＞
　ＨＥＫ２９３細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したミトコンドリアに１０μＭ　ＣＦＳＥ（5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester）を添加して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ミトコンドリアを標識した。また、Ｃ３Ｈｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、トリプシン－ＥＤＴＡ処理後のミトコンドリア（ＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。比較のため、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液の代わりにＴｒｉｓ－スクロース緩衝液を使用するほかは上記と同様にしてミトコンドリア（Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。
　次いで、５×１０５ｃｅｌｌｓ　ｍｔ（５×１０５ｃｅｌｌｓの細胞から単離されたミトコンドリア；以下同様）のミトコンドリアを５０μＬのＰＢＳに懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。そして、蛍光顕微鏡（BZ-X800, KEYENCE）を用いてミトコンドリアの蛍光画像を撮影した（励起波長４７０ｎｍ／蛍光波長５３５ｎｍ）。
　ＨＥＫｍｔ、Ｃ３Ｈｍｔ、Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ、及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔの蛍光画像を図３に示す。図３に示すとおり、ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔのいずれも凝集体を形成したが、Ｃ３Ｈｍｔの方が凝集体のサイズが大きく、量も多かった。Ｃ３Ｈｍｔの凝集体形成は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により抑制することができた。
＜試験例４：トリプシン処理又はトリプシン－ＥＤＴＡ処理によるＣ３Ｈｍｔの凝集抑制＞
　ＨＥＫ２９３細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。そして、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリア（１×１０７ｃｅｌｌｓ　ｍｔ／１ｍＬ　ＰＢＳ）の散乱強度分布を測定し、粒度分布を作成した。
　ＨＥＫｍｔ、Ｃ３Ｈｍｔ、Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ、及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔの粒度分布を図４に示す。図４に示すとおり、Ｃ３Ｈｍｔには粒径１０４～１０６ｎｍの凝集体が確認されたが、Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔには凝集体が確認されなかった。
＜試験例５：Ｃ３Ｈｍｔの凝集抑制に対するＥＤＴＡの作用＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔに１０μＭ　ＣＦＳＥを添加して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ミトコンドリアを標識した。また、単離したＣ３Ｈｍｔの一部に、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液、ＥＤＴＡ溶液（1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4）、２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）、又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリアを回収した。
　次いで、５×１０５ｃｅｌｌｓ　ｍｔのミトコンドリアを５０μＬのＰＢＳに懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。そして、蛍光顕微鏡（BZ-X800, KEYENCE）を用いてミトコンドリアの蛍光画像を撮影した（励起波長４７０ｎｍ／蛍光波長５３５ｎｍ）。また、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリア（５×１０６ｃｅｌｌｓ　ｍｔ／１ｍＬ　ＰＢＳ）の散乱強度分布を測定し、粒度分布を作成した。
　Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液、ＥＤＴＡ、トリプシン、又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したＣ３Ｈｍｔの蛍光画像を図５Ａに示し、粒度分布を図５Ｂに示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すとおり、Ｃ３Ｈｍｔをトリプシン又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理することで凝集体形成が抑制されたが、Ｃ３ＨｍｔをＥＤＴＡで処理しても凝集体形成は抑制されなかった。
＜試験例６：トリプシン処理Ｃ３Ｈｍｔの粒径及び表面電荷＞
　ＨＥＫ２９３細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、トリプシン処理後のミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。そして、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリア（１×１０７ｃｅｌｌｓ　ｍｔ／１ｍＬ　ＰＢＳ）のキュムラント粒径及びゼータ電位を測定した。
　ＨＥＫｍｔ、Ｃ３Ｈｍｔ、及びＴ－Ｃ３Ｈｍｔのキュムラント粒径を図６Ａに示し、ゼータ電位を図６Ｂに示す。図６Ａに示すとおり、凝集体を含むＣ３Ｈｍｔのキュムラント粒径はＨＥＫｍｔよりも大きかったが、トリプシン処理により凝集体形成が抑制され、キュムラント粒径は小さくなった。一方、図６Ｂに示すとおり、ミトコンドリアのゼータ電位はトリプシン処理によって変化しなかった。
＜試験例７：トリプシン処理Ｃ３Ｈｍｔの粒度分布＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、トリプシン処理後のミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。
　次いで、５０～１００μｇのミトコンドリアを１０００μＬのＰＢＳ（pH 7.4）に懸濁し、４℃で３０分間静置した。そして、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリアの散乱強度分布を測定し、粒度分布を作成した。結果を下記表１に示す。
　表１に示すとおり、Ｃ３Ｈｍｔでは、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が約７５％であったが、Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔでは、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が１００％であった。
　また、５０～１００μｇのＴ－Ｃ３Ｈｍｔを１０００μＬのＰＢＳ（pH 7.4）に懸濁し、３７℃で１時間静置した後、同様に粒度分布を作成した。その結果、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合は９５％以上であった。
＜試験例８：トリプシン処理又はトリプシン－ＥＤＴＡ処理によるミトコンドリアの構成タンパク質の変化＞
　ＨＥＫ２９３細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したミトコンドリアの一部に、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液、２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）、又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリアを回収した。そして、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてミトコンドリアのタンパク質量を測定した。
　次いで、各種ミトコンドリアに細胞溶解バッファーを添加して溶解した。そして、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液で処理したミトコンドリア５０μｇ、並びに由来する細胞数を揃えたトリプシン処理ミトコンドリア及びトリプシン－ＥＤＴＡ処理ミトコンドリアを、１００ｍＭ　ＤＴＴを含有するローディングバッファーに溶解し、９５℃で３分間還元した。次いで、各種サンプルをドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲルにアプライし、２００Ｖで１時間電気泳動した。そして、ゲルをＣＢＢ染色液（0.25% Coomassie brilliant blue, 45% Methanol, 10% Acetic acid）により染色した後、ＣＢＢ脱色液（45% Methanol, 10% Acetic acid）により脱色した。
　各種ミトコンドリアの構成タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分析した結果を図７に示す。図７に示すとおり、ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔをトリプシン又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理することにより一部のタンパク質の量が大きく減少し、その影響はＣ３Ｈｍｔの方が大きかった。
　図７の各レーンにおける分子質量６０ｋＤａ以上の領域の明度を市販の画像編集ソフトウェア（Adobe PhotoShop, Adobe）を用いて数値化し、「ブランク（背景）の明度－各レーンの明度」の値を求めた。その結果、トリプシン又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したＨＥＫｍｔにおける値は、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液で処理したＨＥＫｍｔにおける値に対して、それぞれ５４．５％、５９．０％であった。また、トリプシン又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理したＣ３Ｈｍｔにおける値は、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液で処理したＣ３Ｈｍｔにおける値に対して、それぞれ４８．４％、４９．５％であった。すなわち、ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔをトリプシン又はトリプシン－ＥＤＴＡで処理することにより、分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量が陰性対照に対して６０％以下に減少した。
＜試験例９：トリプシン－ＥＤＴＡ処理によるミトコンドリアの凝集抑制＞
　ＵＥ７Ｔ－１３細胞、ｍ１７．ＡＳＣ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びＨｅｐａ１－６細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、及びＨｅｐａｍｔ）を単離した。単離したミトコンドリアに１０μＭ　ＣＦＳＥを添加して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ミトコンドリアを標識した。また、単離したミトコンドリアの一部に、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリアを回収した。
　次いで、９６ウェルプレートに各種ミトコンドリア（ＵＥｍｔ；２．４×１０４ｃｅｌｌｓ　ｍｔ、ｍ１７ｍｔ：２．７×１０４ｃｅｌｌｓ　ｍｔ、ＮＩＨｍｔ：５．１×１０４ｃｅｌｌｓ　ｍｔ、Ｈｅｐａｍｔ：２．９×１０４ｃｅｌｌｓ　ｍｔ）を播種し、２０分後に蛍光顕微鏡（BZ-X800, KEYENCE）を用いてミトコンドリアの蛍光画像を撮影した（励起波長４７０ｎｍ／蛍光波長５３５ｎｍ）。
　各種ミトコンドリアの蛍光画像を図８に示す。図８に示すとおり、ＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、及びＨｅｐａｍｔのいずれも凝集体を形成したが、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により凝集体形成を抑制することができた。
＜試験例１０：トリプシン－ＥＤＴＡ処理によるミトコンドリアの構成タンパク質の変化＞
　ＵＥ７Ｔ－１３細胞、ｍ１７．ＡＳＣ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及びＨｅｐａ１－６細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、及びＨｅｐａｍｔ）を単離した。単離したミトコンドリアの一部に、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリアを回収した。そして、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてミトコンドリアのタンパク質量を測定した。
　次いで、各種ミトコンドリアに細胞溶解バッファーを添加して溶解した。そして、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液で処理したミトコンドリア５０μｇ、及び由来する細胞数を揃えたトリプシン－ＥＤＴＡ処理ミトコンドリアを、１００ｍＭ　ＤＴＴを含有するローディングバッファーに溶解し、９５℃で３分間還元した。次いで、各種サンプルをドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲルにアプライし、２００Ｖで１時間電気泳動した。そして、ゲルをＣＢＢ染色液により染色した後、ＣＢＢ脱色液により脱色した。
　各種ミトコンドリアの構成タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分析した結果を図９に示す。図９に示すとおり、ＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、及びＨｅｐａｍｔをトリプシン－ＥＤＴＡで処理することにより一部のタンパク質の量が大きく減少した。
　図９の各レーンにおける分子質量６０ｋＤａ以上の領域の明度を市販の画像編集ソフトウェア（Adobe PhotoShop, Adobe）を用いて数値化し、「ブランク（背景）の明度－各レーンの明度」の値を求めた。その結果、トリプシン－ＥＤＴＡで処理したＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、Ｈｅｐａｍｔにおける値は、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液で処理したＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、Ｈｅｐａｍｔにおける値に対して、それぞれ２８．９％、２８．６％、２７．０％、３４．９％であった。すなわち、ＵＥｍｔ、ｍ１７ｍｔ、ＮＩＨｍｔ、及びＨｅｐａｍｔをトリプシン－ＥＤＴＡで処理することにより、分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量が陰性対照に対して４０％以下に減少した。
＜試験例１１：トリプシン－ＥＤＴＡ処理Ｃ３Ｈｍｔの細胞取り込み＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を６ウェルプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種するとともに、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ウェルプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
　一方、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔに１０μＭ　ＣＦＳＥを添加して３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ミトコンドリアを標識した。また、単離したＣ３Ｈｍｔの一部に、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。
　次いで、各プレートにＴｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ又はＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔを５×１０６ｃｅｌｌｓ　ｍｔ／ｗｅｌｌとなるように播種した。１０時間培養した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥離して回収した。
　次いで、５×１０４ｃｅｌｌｓのＲＡＷ２６４．７細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種するとともに、２．５×１０４ｃｅｌｌｓのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種した。３時間培養した後、細胞を４％　パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤（VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI, Vector laboratories）を添加した。そして、共焦点レーザー顕微鏡（TCS SP8, Leica）を用いて蛍光画像を撮影した（ＣＦＳＥ：励起波長４８８ｎｍ／蛍光波長４９５～５５０ｎｍ、ＤＡＰＩ：励起波長４０５ｎｍ／蛍光波長４１５～４８０ｎｍ）。
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光画像を図１０に示す。図１０に示すとおり、Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ又はＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔを添加してＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞又はＲＡＷ２６４．７細胞を培養することにより、細胞内にミトコンドリアが取り込まれた。
＜試験例１２：トリプシン－ＥＤＴＡ処理Ｃ３ＨｍｔのＡＴＰ産生能＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔの一部に、Ｔｒｉｓ－スクロース緩衝液又は２．５ｇ／Ｌ　トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔｒｉｓ－Ｃ３Ｈｍｔ及びＴＥ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。
　次いで、各種ミトコンドリアを１０％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、４℃で０時間、３６時間、又は７２時間保管した。そして、９６ウェルプレート上で各種ミトコンドリアにＡＴＰ測定試薬（『塊の』ＡＴＰ測定試薬　Ver.2.1, 東洋ビーネット）を添加し、マイクロプレートリーダー（GloMax, Promega）を用いて１．７×１０６ｃｅｌｌｓ　ｍｔ当たりのＡＴＰ産生量を測定した。
　各種ミトコンドリアのＡＴＰ産生量を図１１に示す。図１１に示すとおり、トリプシン－ＥＤＴＡ処理によりＡＴＰ産生量が一時的に増大したが、その後は同程度に戻った。
＜試験例１３：トリプシン処理Ｃ３Ｈｍｔの細胞増殖促進能（肝障害モデル細胞）＞
　Ｈｅｐａ１－６細胞を９６ウェルプレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）となるように播種し、１０ｍＭ　ＣＣｌ４及び１０％　ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭに培地交換して３時間培養した。
　一方、ＨＥＫ２９３細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＣ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。そして、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてミトコンドリアのタンパク質量を測定するとともに、リン脂質測定キット（ラボアッセイ　りん脂質, FUJIFILM）を用いてミトコンドリアのリン脂質量を測定した。
　次いで、９６ウェルプレートに各種ミトコンドリアを１～５μｇ／ｗｅｌｌとなるように添加した。その際、Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔについては、トリプシン処理前とリン脂質量を揃えて添加した。そして、２４時間培養した後、市販のキット（トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー, FUJIFILM）を用いて上清中のＡＬＴ濃度を測定した。さらに、Ｈｅｐａ１－６細胞をＰＢＳで洗浄し、生細胞数測定キット（Cell Counting Kit-8, DOJINDO）を用いて相対的生細胞数を測定した。
　上清中のＡＬＴ濃度を図１２Ａに示し、相対的生細胞数を図１２Ｂに示す。図中の「＊＊」、「＊＊＊」は、統計学的に有意であることを示す（Dunnette's test, vs CCl4+ mt-, **p<0.01, ***p<0.001）。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すとおり、肝障害モデル細胞にミトコンドリアを取り込ませることにより、ＡＬＴ濃度の上昇と生細胞数の減少とがミトコンドリアの量依存的に改善し、その改善効果はトリプシン処理したＣ３Ｈｍｔにおいて最も高かった。
＜試験例１４：トリプシン処理Ｃ３Ｈｍｔの肝障害モデルマウスにおける治療効果＞
　ｄｄｙマウスに１μＬ／ｇ体重の２５％　ＣＣｌ４／オリーブ油を腹腔内投与し、肝障害モデルマウスを作製した。
　一方、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３Ｈｍｔに２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。そして、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてミトコンドリアのタンパク質量を測定するとともに、リン脂質測定キット（ラボアッセイ　りん脂質, FUJIFILM）を用いてミトコンドリアのリン脂質量を測定した。
　肝障害モデルマウスの作製から８時間後、２８０μｇのミトコンドリアと同等のリン脂質量をもつＴ－Ｃ３Ｈｍｔをｄｄｙマウスに静脈内投与した。そして、２４時間後及び４８時間後に、市販のキット（トランスアミナーゼＣＩＩ－テストワコー, FUJIFILM）を用いて血漿中のＡＳＴ濃度及びＡＬＴ濃度を測定した。
　血漿中のＡＳＴ濃度を図１３Ａに示し、ＡＬＴ濃度を図１３Ｂに示す。図１３Ａ及び図１３Ｂに示すとおり、肝障害モデルマウスにＴ－Ｃ３Ｈｍｔを静脈内投与することにより、ＡＳＴ濃度及びＡＬＴ濃度が低下した。
＜試験例１５：トリプシン処理Ｃ３Ｈｍｔの慢性肝炎モデルマウスにおける治療効果＞
　ｄｄｙマウスに０．１μＬ／ｇ体重の１０％　ＣＣｌ４／オリーブ油を週に３回、４週間に亘って腹腔内投与した。
　８日目以降に、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離し、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてＣ３Ｈｍｔのタンパク質量を測定した。単離したＣ３Ｈｍｔに２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔ）を回収した。５０μｇのＣ３Ｈｍｔから得られたＴ－Ｃ３Ｈｍｔを、週に１回、３週間に亘ってｄｄｙマウスに静脈内投与した。
　２９日目に肝臓を摘出し、尾状葉を４％　パラホルムアルデヒドにより固定し、（株）バイオ病理研究所にシリウスレッド染色及びマッソントリクローム染色を委託した。そして、蛍光顕微鏡（BZ-X800, KEYENCE）を用いて染色組織を明視野観察した。
　尾状葉のシリウスレッド染色結果を図１４Ａに示し、マッソントリクローム染色結果を図１４Ｂに示す。図１４Ａ及び図１４Ｂに示すとおり、Ｔ－Ｃ３Ｈｍｔを複数回投与することにより、慢性肝炎モデルマウスにおける肝線維化が抑制された。
＜試験例１６：トリプシン処理によるＨＥＫｍｔ及びＨｅｐａｍｔの凝集抑制＞
　ＨＥＫ２９３細胞及びＨｅｐａ１－６細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ及びＨｅｐａｍｔ）を単離した。単離したミトコンドリアの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔ－ＨＥＫｍｔ及びＴ－Ｈｅｐａｍｔ）を回収した。
　次いで、５０～１００μｇのミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ、Ｔ－ＨＥＫｍｔ、Ｈｅｐａｍｔ、及びＴ－Ｈｅｐａｍｔ）を１０００μＬのＰＢＳ（pH 7.4）に懸濁し、３７℃で１時間静置した。そして、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリア（１×１０７ｃｅｌｌｓ　ｍｔ／１ｍＬ　ＰＢＳ）の散乱強度分布を測定し、粒度分布を作成するとともに、キュムラント粒径を測定した。
　各種ミトコンドリアの粒度分布を図１５Ａに示し、キュムラント粒径を図１５Ｂに示す。図１５Ａ及び図１５Ｂに示すとおり、ＨＥＫｍｔ及びＨｅｐａｍｔを３７℃で１時間静置すると、粒径１０４～１０６ｎｍの凝集体が確認された。これに対して、ＨＥＫｍｔ及びＨｅｐａｍｔを予めトリプシンで処理した場合には、３７℃で１時間静置しても凝集体が確認されず、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上となり、その結果、キュムラント粒径が小さくなった。
＜試験例１７：トリプシン処理によるＨＥＫｍｔの肺集積抑制＞
　ＨＥＫ２９３細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（ＨＥＫｍｔ）を単離した。ＤｉＲ（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide）を用いてＨＥＫｍｔを標識し、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてＨＥＫｍｔのタンパク質量を測定した。単離したＨＥＫｍｔの一部に２．５ｇ／Ｌ　トリプシン溶液（Nacalai）を添加して３７℃で５分間インキュベートし、予め７０００×ｇで１０分間遠心しておいたＦＢＳ（Capricorn）の上清を加えてトリプシンを中和した後、ミトコンドリア（Ｔ－ＨＥＫｍｔ）を回収した。
　次いで、５０μｇのミトコンドリアを２００μＬのＰＢＳに懸濁し、３７℃で１時間静置した後、ｄｄｙマウス（１０週齢）に対して静脈内投与した。投与から１分後にＰＢＳを灌流し、全臓器を回収した。そして、化学発光・蛍光撮影装置（iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific）を用いてｅｘ　ｖｉｖｏイメージングを行った（励起波長７４５～７６５ｎｍ／蛍光波長８１０～８５０ｎｍ）。
　ＨＥＫｍｔ及びＴ－ＨＥＫｍｔを静脈内投与したときの組織分布を図１６に示す。図１６に示すとおり、３７℃で１時間静置することによって凝集体を形成したＨＥＫｍｔは、肺に多く集積した。これに対して、３７℃で１時間静置する前に予めトリプシンで処理したＴ－ＨＥＫｍｔは、肺への集積が抑制された。
＜試験例１８：ヘパリンナトリウム処理又はデキストラン硫酸ナトリウム処理によるＣ３Ｈｍｔの凝集抑制＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３ＨｍｔをＰＢＳ、４６７ｍｇ／Ｌ　ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳ（ヘパリンの分子質量：１２～１５ｋＤａ）、又は４６７ｍｇ／Ｌ　デキストラン硫酸ナトリウム含有ＰＢＳ（デキストラン硫酸の分子質量：５ｋＤａ）に懸濁した後、ミトコンドリアを回収した。
　次いで、５０～１００μｇのミトコンドリアを１０００μＬのＰＢＳ（pH 7.4）に再懸濁し、４℃で３０分間静置した。そして、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリアの散乱強度分布を測定し、粒度分布を作成した。
　各種ミトコンドリアの粒度分布を図１７に示す。図１７に示すとおり、ＰＢＳで処理したＣ３Ｈｍｔには粒径１０４～１０６ｎｍの凝集体が確認されたが、ヘパリンナトリウム又はデキストラン硫酸ナトリウムで処理したＣ３Ｈｍｔには凝集体が確認されず、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が１００％であった。
　なお、図示は省略するが、ヘパリンナトリウム又はデキストラン硫酸ナトリウムで処理したＣ３Ｈｍｔを１０００μＬのＰＢＳ（pH 7.4）に懸濁した後の静置条件を３７℃、１時間とした場合にも同様に凝集体形成が抑制され、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上となった。
　また、図示は省略するが、ヘパリンナトリウム及びデキストラン硫酸ナトリウムの濃度を１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、又は１０００ｍｇ／Ｌに変更した場合にも同様に凝集体形成が抑制され、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上となった。
＜試験例１９：ヘパリンナトリウム処理によるＣ３Ｈｍｔの凝集抑制＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３ＨｍｔをＰＢＳ又は０．５ｇ／Ｌ　ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳ（ヘパリンの分子質量：１２～１５ｋＤａ）に懸濁し、４℃、１５℃、又は３７℃で１時間静置した。そして、ゼータ電位・粒径測定システム（ELSZ-2000Z, Otsuka）を用いて、ミトコンドリア（１×１０７ｃｅｌｌｓ　ｍｔ／１ｍＬ　ＰＢＳ又はヘパリンナトリウム含有ＰＢＳ）の散乱強度分布を測定し、粒度分布を作成するとともに、キュムラント粒径を測定した。
　各種ミトコンドリアの粒度分布を図１８Ａに示し、キュムラント粒径を図１８Ｂに示す。図１８Ａ及び図１８Ｂに示すとおり、Ｃ３Ｈｍｔは温度依存的に凝集し、キュムラント粒径が増大したが、ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに懸濁した状態では、凝集が抑制された。
＜試験例２０：ヘパリンナトリウム処理によるＣ３Ｈｍｔの肺集積抑制＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離し、０．５ｇ／Ｌ　ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳ（ヘパリンの分子質量：１２～１５ｋＤａ）に懸濁した。ＤｉＲ（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide）を用いてＣ３Ｈｍｔを標識し、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてＣ３Ｈｍｔのタンパク質量を測定した。
　次いで、５０μｇのヘパリンナトリウム処理Ｃ３Ｈｍｔを２００μＬの０．５ｇ／Ｌ　ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳに懸濁し、ｄｄｙマウス（６週齢）に対して静脈内投与した。投与から１分後にＰＢＳを灌流し、全臓器を回収した。そして、化学発光・蛍光撮影装置（iBright FL1000, Thermo Fisher Scientific）を用いてｅｘ　ｖｉｖｏイメージングを行った（励起波長７４５～７６５ｎｍ／蛍光波長８１０～８５０ｎｍ）。
　ヘパリンナトリウム処理Ｃ３Ｈｍｔを静脈内投与したときの組織分布を図１９に示す。図１９に示すとおり、ヘパリンナトリウムで処理しない場合（図１参照）に比べて肺への集積が顕著に抑制され、その結果、マウスは死亡しなかった。
＜試験例２１：ヘパリンナトリウム処理Ｃ３ＨｍｔのＡＴＰ産生能＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離した。単離したＣ３ＨｍｔをＰＢＳ又は０．５ｇ／Ｌ　ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳ（ヘパリンの分子質量：１２～１５ｋＤａ）に懸濁し、４℃で静置した。０．２時間、３時間、又は２４時間後、７０００×ｇで遠心してミトコンドリアを回収し、１５％　ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに再懸濁し、常温で１０分間静置した。そして、９６ウェルプレート上で各種ミトコンドリアにＡＴＰ測定試薬（『塊の』ＡＴＰ測定試薬　Ver.2.1, 東洋ビーネット）を添加し、マイクロプレートリーダー（GloMax, Promega）を用いて１．７×１０６ｃｅｌｌｓ　ｍｔ当たりのＡＴＰ産生量を測定した。
　各種ミトコンドリアのＡＴＰ産生量を図２０に示す。図中の「ｎｓ」は、統計学的に有意差が認められなかったことを示す（Welch's t-test）。図２０に示すとおり、ヘパリンナトリウム処理はＣ３ＨｍｔのＡＴＰ産生に大きな影響を及ぼさなかった。
＜試験例２２：ヘパリンナトリウム処理Ｃ３Ｈｍｔの細胞増殖促進能＞
　Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を９６ウェルプレートに１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、培養した。
　一方、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞からＳＬＯ法によりミトコンドリア（Ｃ３Ｈｍｔ）を単離し、タンパク質アッセイキット（Pierce BCA Protein Assay Kits, Thermo Fisher Scientific）を用いてＣ３Ｈｍｔのタンパク質量を測定した。単離したＣ３ＨｍｔをＰＢＳ又は０．５ｇ／Ｌ　ヘパリンナトリウム含有ＰＢＳ（ヘパリンの分子質量：１２～１５ｋＤａ）に再懸濁した。
　次いで、９６ウェルプレートにミトコンドリアを含む懸濁液をミトコンドリアが５μｇ／ｗｅｌｌ（ヘパリンナトリウムの終濃度：１０％）となるように添加した。そして、２４時間培養した後、生細胞数測定キット（Cell Counting Kit-8, DOJINDO）を用いて相対的生細胞数を測定した。
　相対的生細胞数を図２１に示す。図中の「ｎｓ」は、統計学的に有意差が認められなかったことを示す（Tukey's test）。図２１に示すとおり、ミトコンドリア添加により細胞増殖性が促進されたところ、ヘパリンナトリウム処理はミトコンドリア添加による細胞増殖性に影響を及ぼさなかった。

Claims (17)

  1. 　単離されたミトコンドリアの表面タンパク質の少なくとも一部が分解され、又は単離されたミトコンドリアの外表面が分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で修飾された改変型ミトコンドリア。
  2. 　前記ミトコンドリアが間葉系幹細胞由来である、請求項１に記載の改変型ミトコンドリア。
  3. 　３７℃のリン酸緩衝生理食塩水中に分散させて１時間静置した後、動的光散乱法により粒度分布を測定したときの、粒径５０μｍ以下のミトコンドリア粒子の割合が９５％以上である、請求項１又は２に記載の改変型ミトコンドリア。
  4. 　分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量が、該改変型ミトコンドリアと同種のミトコンドリアにおける分子質量６０ｋＤａ以上の構成タンパク質の量に対して６０％以下である、請求項１又は２に記載の改変型ミトコンドリア。
  5. 　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼで処理することにより得られる、請求項１又は２に記載の改変型ミトコンドリア。
  6. 　前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項５に記載の改変型ミトコンドリア。
  7. 　前記凝集抑制剤が負電荷化合物である、請求項１又は２に記載の改変型ミトコンドリア。
  8. 　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、請求項７に記載の改変型ミトコンドリア。
  9. 　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することを含む改変型ミトコンドリアの生産方法。
  10. 　前記凝集抑制剤が負電荷化合物である、請求項９に記載の改変型ミトコンドリアの生産方法。
  11. 　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、請求項１０に記載の改変型ミトコンドリアの生産方法。
  12. 　単離されたミトコンドリアをプロテアーゼ又は分子質量１ｋＤａ以上の凝集抑制剤で処理することを含むミトコンドリアの凝集抑制方法。
  13. 　前記凝集抑制剤が負電荷化合物である、請求項１２に記載のミトコンドリアの凝集抑制方法。
  14. 　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、請求項１３に記載のミトコンドリアの凝集抑制方法。
  15. 　分子質量１ｋＤａ以上の負電荷化合物を含有するミトコンドリア用保存液。
  16. 　前記負電荷化合物が、ヘパリン若しくはその塩又はデキストラン硫酸若しくはその塩である、請求項１５に記載のミトコンドリア用保存液。
  17. 　単離されたミトコンドリアを請求項１５又は１６に記載のミトコンドリア用保存液中で保存することを含むミトコンドリアの保存方法。
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