WO2025225645A1 - Ｎｋｇ２ａアゴニストを用いた免疫拒絶の回避方法 - Google Patents

Ｎｋｇ２ａアゴニストを用いた免疫拒絶の回避方法

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WO2025225645A1
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seq
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勇人 桑崎
傑 上野
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a substance that specifically binds to NKG2A and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells, which is useful in allogeneic techniques related to organ transplantation and cell therapy, as well as a method for producing the substance and a method for using the substance. Furthermore, the present invention relates to a substance that binds to inhibitory KIR and inhibits the cytocidal activity of NK cells, which is useful in allogeneic techniques related to organ transplantation and cell therapy, as well as a method for producing the substance and a method for using the substance.
  • Immunity is classified into innate immunity and adaptive immunity. Innate immunity is a rapid immune response against a wide range of pathogens, centered on immune cells such as natural killer cells (NK cells), macrophages, and granulocytes.
  • NK cells natural killer cells
  • adaptive immunity is a selective and effective immune response centered on immune cells such as T cells, B cells, and dendritic cells.
  • Human pluripotent stem cells have the potential to treat a variety of diseases, but their clinical use faces a major limitation: rejection of transplanted cells by the recipient due to differences in the major histocompatibility complex (MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • MHCs are cell surface multicomponent molecules found in all vertebrates that mediate leukocyte interactions with other cells.
  • the MHC gene family is divided into three groups: Class I, Class II, and Class III. In humans, they are called human leukocyte antigens (HLA).
  • HLA human leukocyte antigens
  • Class I HLA proteins are expressed on all nucleated cells and consist of an HLA Class I heavy chain (or ⁇ chain) and ⁇ -2 microglobulin (B2M).
  • Class I HLA proteins present peptides to CD8+ cytotoxic T cells.
  • Six Class I HLA ⁇ chains have been identified to date, including three classical (HLA-A, HLA-B, and HLA-C) and three non-classical (HLA-E, HLA-F, and HLA-G) ⁇ chains. The specificity of peptide binding to the peptide-binding cleft of Class I HLA molecules is determined by the ⁇ chain. Recognition of peptides presented by Class I HLA molecules
  • HLA-matched or partially matched cells from stem cell banks or pluripotent stem cell (iPSC) lines derived from individual patients are developed for transplantation, but developing individually matched cell lines requires significant costs, months of cell culture, highly trained personnel, and extensive validation of the final product, all of which must be approved by regulatory authorities.
  • iPSC pluripotent stem cell
  • T cells recognize HLA molecules on the cell surface via the T cell receptor (TCR).
  • TCR T cell receptor
  • HLA regulates immune responses and maintains homeostasis by presenting endogenous self-peptides in normal cells and virus-derived non-self-peptides in infected cells.
  • NK (Natural Killer) cells have a self-non-self recognition function known as "missing self,” which recognizes the self's HLA type and exhibits cytocidal activity against cells that do not express the same type of HLA (Non-Patent Document 1).
  • missing self function receptors such as NKG2 and KIR expressed on the surface of NK cells are responsible for recognizing the self's HLA type. These receptors include inhibitory receptors and activating receptors.
  • NK cells that express multiple inhibitory receptors.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CD56-positive and CD3-negative are NKG2A-positive, while the other half are NKG2A-negative, representing an NK cell population that expresses other inhibitory receptors such as KIR and LILB.
  • NKG2 (CD159) belongs to the C-type lectin superfamily and is composed of seven isoforms: NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, and NKG2H.
  • NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, and NKG2H form heterodimers with CD94 (KLRD1), a type II transmembrane glycoprotein also belonging to the C-type lectin family, and use HLA-E, which presents peptides derived from Class I HLA, as its ligand.
  • NKG2 is involved in regulating NK cell activation and is classified into activating and inhibitory isoforms.
  • NKG2C, NKG2E, and NKG2H have charged residues in their transmembrane domains and bind to DAP12, an adaptor protein with an ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) motif, transmitting activating signals.
  • ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
  • NKG2A and NKG2B have an ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitor Motif) motif in the cytoplasm and transmit inhibitory signals.
  • NKG2D does not form a heterodimer with CD94 and is an NK receptor whose ligands are MICA and MICB, not HLA-E. It binds to DAP10, an adaptor protein with an ITAM motif, and transmits activating signals (Non-Patent Document 3).
  • KIR Insert cell immunoglobulin-like receptor
  • NK cells derived from humans with HLA-C1/C1 (HLA-C with S at amino acid 77 and N at amino acid 80 is called the C1 type) will attack HLA-C2 (HLA-C with N at amino acid 77 and K at amino acid 80 is called the C2 type) upon detection, and vice versa, exhibiting cytocidal activity by the same mechanism (Non-Patent Document 1).
  • KIR2DL2/3 which function as inhibitory receptors if the host is HLA-C1-derived
  • KIR2DL1 which functions as an inhibitory receptor if the host is HLA-C2-derived
  • ITIM Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitor Motif
  • NK cells are characterized as CD56-positive and CD3-negative cells. NK cells are further broadly classified into CD56bright NK cells and CD56dim NK cells based on differences in their function and phenotype.
  • CD56bright NK cells which are highly responsive to cytokine stimulation, play an immunoregulatory role in T cells and other immune cells, and migrate to secondary lymphoid organs, the liver, skin, and bone marrow, where they become the predominant NK cell subset.
  • Cytotoxic CD56dim NK cells prioritize input from activating and inhibitory receptors and are known to produce the majority of NK cells in peripheral blood.
  • CD56bright NK cells predominantly express NKG2A
  • cytotoxic CD56dim NK cells generally have low NKG2A expression and tend to predominantly express NKG2C and activating or inhibitory KIR (Non-Patent Document 5).
  • Antibodies against KIR2DL1/2/3 include Lirilumab (BMS-986015, Human IgG4), which is currently undergoing clinical trials as an anticancer agent, and the murine antibody Pan2D (NKVFS1, Mouse IgG1).
  • Cancer cells have mechanisms to avoid cytocidal activity by reducing the expression of activating ligands for immune cell receptors and enhancing the expression of inhibitory ligands.
  • HLA expressed on the surface of cancer cells also acts on inhibitory receptors on NK cells, utilizing the missing-self function to avoid attack by NK cells.
  • An antibody against human NKG2A is monalizumab (IPH2201, Human IgG4, Patent Document 4), which is currently undergoing clinical trials as an anticancer agent. Additionally, antibodies described in several patent documents (Patent Document 5, US 2015/0125464 A1, WO2016/041947 A1) have also been reported as candidate anticancer drugs. Cancer cells have mechanisms to avoid cytocidal activity by reducing the expression of activating ligands for immune cell receptors or increasing the expression of inhibitory ligands. HLA expressed on the surface of cancer cells also acts on inhibitory receptors on NK cells, utilizing their "missing self" function to suppress attacks from NK cells.
  • NK cell receptors of missing sugar and missing self. , P Parham et al. , Curr Biol. 2000 Mar 9;10(5):R195-7. MHC class I-specific inhibition receptors and their ligands structure diversity hu man NK-cell repertoires tower a balance of missing self-response, Yawata et al. , Blood. 2008 Sep 15;112(6):2369-80.
  • the CD94/NKG2 family of receptors from molecules and cells to clinical relevance.
  • F. Borrego et al. Immunol Res. 2006;35(3):263-78.
  • Negative signaling by inhibitory receptors the NK cell paradigm. E O Long et al. , Immunol Rev.
  • NK cells possessed by a human individual express NKG2A.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CD56bright NK cells tend to predominantly express NKG2A
  • CD56dim NK cells have low NKG2A expression and tend to express other NK receptors such as NKG2C and KIR.
  • HLA-E-transfected cells equipped with universal cell technology may be attacked by NKG2C-positive NK cells that express low or no NKG2A, such as CD56dim NK cells with high cytotoxic activity, as HLA-E binds to NKG2C and activates the cytotoxic activity of the NK cells.
  • NKG2C-positive NK cells that express low or no NKG2A, such as CD56dim NK cells with high cytotoxic activity, as HLA-E binds to NKG2C and activates the cytotoxic activity of the NK cells.
  • Non-patent document 7 shows that when CAR-T cells equipped with universal technology are co-cultured with NK cells obtained from a donor with a higher proportion of NKG2C-positive NK cells than NKG2A-positive NK cells, the CAR-T cells equipped with universal technology are attacked by the NKG2C-positive NK cells, resulting in a significant decrease in cell viability.
  • Non-Patent Document 2 The expression distribution of NKG2A and KIR on the surface of NK cells is inversely correlated (Non-Patent Document 2), with NK cells with low NKG2A expression having high KIR expression. This suggests that while HLA-E-introduced cells in universal cell technology are effective in cells with high NKG2A expression, they are not effective in NK cells with low or no NKG2A expression and inhibitory KIR expression.
  • the ligands for inhibitory KIR are HLA-A, HLA-B, and HLA-C, direct introduction of these is incompatible with avoiding TCR-mediated rejection of recipient T cells, and therefore a substance with HLA-like agonist activity is required.
  • Monalizumab a known antibody against NKG2A, and other antibodies against NKG2A used as anti-cancer drugs have been reported to inhibit the inhibitory signaling caused by natural ligand binding to NKG2A. However, it was unclear whether these antibodies exhibited agonist activity against NKG2A. It was also unclear whether these antibodies did not exhibit agonist activity against NKG2C.
  • Lirilumab (BMS-986015, human IgG4), a known antibody against KIR, and the mouse antibody Pan2D (NKVFS1, mouse IgG1) have been reported to block the inhibitory signal induced by natural ligand binding to inhibitory KIR, but their effects in the absence of ligand were unknown.
  • scFvs single chain Fvs
  • HLA-E also has the ability to bind to NKG2C
  • one of the scFvs is an NKG2A-specific scFv that exhibits high binding affinity to NKG2A but no binding affinity to NKG2C.
  • the inventors found that when cells co-expressing an scFv with specific agonistic activity against NKG2A and an scFv that binds to an inhibitory KIR and exhibits agonistic activity were co-cultured with NKG2A-positive NK cells or NKG2C-positive and inhibitory KIR-positive NK cells, the cytocidal activity of the NKG2A-positive NK cells and the NKG2C-positive and inhibitory KIR-positive NK cells was suppressed.
  • lirilumab exhibits agonist activity against inhibitory KIR on NK cells in the absence of a ligand. It was also discovered that cells expressing an scFv incorporating this gene sequence on the cell membrane surface can avoid attack from NK cells. It was also discovered that Pan2D (NKVSF1), which acts against KIR, also exhibits agonist activity against inhibitory KIR both in soluble form and on the cell surface. However, it was confirmed that lirilumab and Pan2D bind not only to inhibitory KIR but also to activating KIR, and enhance the activity of NK cells through their agonistic action against activating KIR (KIR2DS1, 2, 4, etc.).
  • the present invention provides the following.
  • [1] A substance that binds to human inhibitory KIR and inhibits the cytotoxic activity of NK cells.
  • the substance of [1] which is a polypeptide containing a binding site for human inhibitory KIR.
  • the substance of [1] which has a higher binding activity to a human inhibitory KIR than to the corresponding human activating KIR.
  • polypeptide is any one of the following (1) to (3): (1) A polypeptide whose binding site to KIR2DL2 and/or KIR2DL3 contains a C1 epitope motif sequence (in which the 77th amino acid is S and the 80th amino acid is N) contained in HLA-Cw1, Cw3, Cw7, Cw8, Cw9, Cw10, Cw12, Cw14, Cw16, HLA-B46, or B73 belonging to the HLA-C1 type, and whose binding ability to TCR is deleted or weakened; (2) A polypeptide whose binding site to KIR2DL1 contains a C2 epitope motif sequence (in which the 77th amino acid is N and the 80th amino acid is K) contained in HLA-Cw2, Cw4, Cw5, Cw6, Cw15, or Cw17 belonging to the HLA-C2 type, and whose binding ability to TCR is deleted or weakened; (3) A polypeptide whose binding site to K
  • the binding site for KIR2DL2 and/or KIR2DL3 comprises a variable region including amino acids positioned adjacent to 1 to 6 amino acids including Asp at position 47 in the region of amino acids 44 to 49, 2 to 4 amino acids including Gly at position 67 and Pro at position 68 in the region of amino acids 65 to 68, and 1 to 4 amino acids including Asp at position 72 in the region of amino acids 70 to 73 in the amino acid sequence of KIR2DL2 of SEQ ID NO: 6, in a model structural analysis based on the X-ray crystal structure of the binding complex with KIR2DL2.
  • [13-2] The substance of [13], which is a polypeptide comprising a binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: 51 and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2, and CDR3 of SEQ ID NO: 52.
  • the substance of [13] which may have one or two amino acid mutations on the C- and/or N-terminal side of each CDR.
  • [15-2] The substance of [15], which is a polypeptide comprising a binding site comprising a combination of a first variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and a second variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.
  • [16] The substance according to [8], characterized in that its binding activity to KIR2DL2 and/or KIR2DL3 is higher than its binding activity to KIR2DS1, KIR2DS2 and/or KIR2DS4.
  • the substance according to [8] which has higher agonistic activity against KIR2DL2 and/or KIR2DL3 than against KIR2DS1, KIR2DS2 and/or KIR2DS4.
  • Step A mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of KIR2DL2 or KIR2DL3 with a suspension containing a polyclonal population of presenters including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to KIR2DL2 or KIR2DL3, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion is immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to KIR2DL2 or KIR2DL3;
  • Step B A step of mixing labeled solubilized proteins containing the extracellular domains of KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 into the suspension containing the presenter population obtained in Step A, bringing the suspension into contact with a carrier on which a substance that
  • Step A mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of KIR2DL2 or KIR2DL3 and unlabeled solubilized proteins containing the extracellular domains of KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 with a suspension containing a polyclonal population of presenters, including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to KIR2DL2 or KIR2DL3, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that specifically binds to KIR2DL2 or KIR2DL3; Step B: performing genetic analysis of the display body obtained by the method comprising the above steps to identify the gene sequence encoding the antigen-binding
  • the substance according to [20] or [21], wherein the combination of the label and the substance that binds to the label is a biotin-avidin combination.
  • polypeptide is a membrane protein having an extracellular domain containing a binding site for KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and a transmembrane domain.
  • the inhibitory KIR is KIR3DL1
  • the binding site comprises amino acid sequences derived from the heavy chain variable region and the light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that binds to KIR3DL1.
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of KIR3DL1 with a suspension containing a polyclonal population of presenters including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to KIR3DL1, then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to KIR3DL1;
  • Step B A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of KIR3DS1 with the suspension containing the presenter population obtained in Step A, bringing the mixture into contact with a carrier on which a substance that binds to the label is immobilized, and recovering presenters that do not bind to
  • Step A a step of mixing a labeled solubilized protein comprising the extracellular domain of KIR3DL1 and an unlabeled solubilized protein comprising the extracellular domain of KIR3DS1 with a suspension containing a polyclonal population of presenters including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to KIR3DL1, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that specifically binds to KIR3DL1;
  • Step B performing genetic analysis of the display body obtained by the method comprising the steps above to identify the gene sequence encoding the antigen-binding site; and Step C: expressing the gene comprising the identified antigen-binding site in a cell.
  • the substance according to [36] or [37], wherein the combination of the label and the substance that binds to the label is a biotin-avidin combination.
  • the substance of [40] which is a single-chain antibody or scFv, characterized in that the first variable region and the second variable region are linked via a GS linker or a G4S linker.
  • polypeptide is a membrane protein having an extracellular domain containing a binding site for KIR3DL1 and a transmembrane domain.
  • the inhibitory KIR is KIR2DL1
  • the binding site comprises amino acid sequences derived from the heavy chain variable region and the light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that binds to KIR2DL1.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment that binds to KIR2DL1 competes with Pan2D in binding to KIR2DL1.
  • the substance of [46] which is a polypeptide comprising any one of the following binding sites (CI) to (CXV) as a binding site for KIR2DL1:
  • CIII A binding site comprising a combination of a first variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 111 and a second variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 112;
  • Step A mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of KIR2DL1 with a suspension containing a polyclonal population of presenters including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to KIR2DL1, then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion is immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to KIR2DL1;
  • Step B A step of mixing labeled solubilized proteins containing the extracellular domains of KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 with the suspension containing the presenter population obtained in Step A, bringing the mixture into contact with a carrier on which a substance that binds to the labeled portion is immobilized, and recovering presenters that do
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein comprising the extracellular domain of KIR2DL1 and unlabeled solubilized proteins comprising the extracellular domains of KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 with a suspension containing a polyclonal population of presenters, including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to KIR2DL1, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that specifically binds to KIR2DL1;
  • Step B performing genetic analysis of the display body obtained by the method comprising the above steps to identify the gene sequence encoding the antigen-binding site; and Step C: expressing the identified
  • [55] The substance according to [53] or [54], wherein the combination of the label and the substance that binds to the label is a biotin-avidin combination.
  • the substance of [57] which is a single-chain antibody or scFv, characterized in that the first variable region and the second variable region are linked via a GS linker.
  • a pharmaceutical composition comprising any one of the substances according to [1] to [59] as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of [60] which is an immunosuppressant.
  • a cell expressing on its cell surface a substance that binds to any of the inhibitory KIRs [1] to [59] and inhibits the cytotoxic activity of NK cells.
  • the cells of [62] further express a ligand substance for NKG2A on the cell surface.
  • the cells of [65] which are a cell line established from an individual with genetic loss of HLA expression.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • mesenchymal stem cell a cardiomyocyte, a chondrocyte, a retinal cell, a liver cell, a kidney cell, or a pancreatic cell.
  • [71] The cell of any one of [62] to [70], further expressing a chimeric receptor on the cell surface.
  • [72] The cell of [62], wherein the inhibitory KIR is KIR2DL2 and/or KIR2DL3, and the substance that binds to KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and has the activity of inhibiting the cytotoxic activity of NK cells is the membrane protein of [26].
  • the membrane protein that binds to KIR2DL2 and/or KIR2DL3 comprises a binding site that competes with Lirilumab, Pan2D, or an scFv consisting of any of the following amino acid sequences (i) to (xii) in binding to KIR2DL2 and/or KIR2DL3; (i) an amino acid sequence comprising a combination of the amino acid sequence of a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 33 and the amino acid sequence of a light chain variable region of SEQ ID NO: 34; (ii) an amino acid sequence comprising a combination of the amino acid sequence of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 35 and the amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 36; (iii) an amino acid sequence comprising a combination of the amino acid sequence of a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 37 and the amino acid sequence of a light chain variable region of SEQ ID NO: 38; (iv)
  • a binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 61 and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 62, and (XII) a binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 63 and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 64.
  • the cells of [62], wherein the inhibitory KIR is KIR3DL1, and the substance that binds to KIR3DL1 and has the activity of inhibiting the cytotoxic activity of NK cells is the membrane protein of [42].
  • the cell of [62], wherein the inhibitory KIR is KIR2DL1, and the substance that binds to KIR2DL1 and has the activity of inhibiting the cytotoxic activity of NK cells is the membrane protein of [59].
  • the cell according to [80], wherein the membrane protein that binds to KIR2DL1 contains a binding site that competes with Pan2D for binding to KIR2DL1.
  • the cell of [78] which expresses on its cell surface a membrane protein comprising the binding site (P) below as a binding site for KIR2DL1, and which may have one or two amino acid mutations in each CDR: (P) A binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 31 and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 32.
  • the cell of [82] which may have one or two amino acid mutations on the C- and/or N-terminal side of each CDR.
  • the cell of [85] which may have one or two amino acid mutations on the C- and/or N-terminal side of each CDR.
  • a pharmaceutical composition comprising any one of the cells of [62] to [86] as an active ingredient, which reduces the risk of immune rejection in a recipient of administration or transplantation.
  • a method for reducing or suppressing immune rejection of therapeutic cells by a subject comprising the step of expressing any of the substances [1] to [59] on the cell surface of the therapeutic cells.
  • a method for producing therapeutic cells with reduced or suppressed risk of immune rejection by a subject comprising a step of expressing any of the substances [1] to [59] on the cell surface of the therapeutic cells.
  • a method for evaluating the immune rejection avoidance activity of a test substance due to its agonistic activity against inhibitory KIR2DL2 or KIR2DL3, comprising the steps of: (A) contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous in the presence of a test substance that binds to KIR2DL2 or KIR2DL3 (wherein the NK cell donor and the target cell donor have the same phenotype of Bw4 motif-containing HLA); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • a method for evaluating the immune rejection avoidance activity of a test substance due to its agonistic activity against inhibitory KIR2DL1, comprising the steps of: (A) contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous in the presence of a test substance that binds to KIR2DL1 (wherein the NK cell donor and the target cell donor have the same phenotype of Bw4 motif-containing HLA); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • a method for evaluating the immune rejection avoidance activity of a test substance due to its agonistic activity against inhibitory KIR3DL1, comprising the steps of: (A) contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-Bw4 type is positive/homopositive or heteropositive/negative with target cells derived from a subject whose HLA-Bw4 type is negative/homonegative in the presence of a test substance that binds to KIR3DL1 (wherein the HLA-C type phenotype of the NK cell donor and that of the target cell donor are identical); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • a method for screening for a substance having immune rejection evasion activity comprising the step of selecting a test substance that has a high survival rate of target cells in step B as a substance having immune rejection evasion activity in any of the methods [91] to [93].
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of an inhibitory KIR with a suspension containing a polyclonal population of presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to the inhibitory KIR, contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to the KIR;
  • Step B A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of an activating KIR corresponding to the inhibitory KIR with a suspension containing the presenter population obtained in Step A, bringing the mixture into contact with a carrier on which a substance that binds to the label is immobilized, and recovering presenters
  • a method for producing a substance that binds to human inhibitory KIR and has activity of inhibiting NK cells comprising the steps of: Step A: A step of mixing a labeled solubilized protein comprising the extracellular domain of an inhibitory KIR and an unlabeled solubilized protein comprising the extracellular domain of an active KIR corresponding to the inhibitory form with a suspension containing a polyclonal presenter population including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to the inhibitory KIR, then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a presenter population that presents an antigen-binding site that specifically binds to the inhibitory KIR; Step B: performing genetic analysis of the display body obtained by the method comprising the steps above to identify the gene sequence encoding the antigen-binding site; and Step C: expressing the gene comprising the identified antigen
  • the present invention provides the following: ⁇ 1> A polypeptide that is a membrane protein having an extracellular domain containing a binding site for NKG2A and a transmembrane domain, the polypeptide (1) having activity of binding to NKG2A on the surface of an NK cell and suppressing the NK cell, and (2) having substantially no agonist activity against NKG2C.
  • ⁇ 4> The polypeptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the binding site comprises an amino acid sequence derived from one or two variable regions of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that binds to NKG2A.
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of NKG2A with a suspension containing a polyclonal population of presenters, including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to NKG2A, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to NKG2A;
  • Step B A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of NKG2C with the suspension containing the presenter population obtained in Step A, bringing the suspension into contact with a carrier on which a substance that binds to the labeled
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein comprising the extracellular domain of NKG2A and an unlabeled solubilized protein comprising the extracellular domain of NKG2C with a suspension containing a polyclonal population of presenters, including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to NKG2A, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that specifically binds to NKG2A;
  • Step B performing genetic analysis of the display body obtained by the method comprising the above steps to identify the gene sequence encoding the antigen-binding site; and Step C: expressing the identified gene
  • ⁇ 7> The polypeptide according to ⁇ 5> or ⁇ 6>, wherein the combination of the label and the substance that binds to the label is a combination of biotin and avidin.
  • ⁇ 8> The polypeptide according to ⁇ 5> or ⁇ 6>, which is obtained by a method further comprising a step of selecting an antigen-binding fragment having agonistic activity against NKG2A.
  • ⁇ 9> The polypeptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the binding site is a single-chain antibody or scFv, wherein the first variable region and the second variable region are linked via a GS linker or a G4S linker.
  • the polypeptide of ⁇ 1> which comprises the following binding site as the binding site, and which may have one or two amino acid mutations in each CDR: (N-I) A binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 163 and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 164.
  • N-I A binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 163 and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 164.
  • ⁇ 12> The polypeptide of ⁇ 11>, which may have one or two amino acid mutations on the C- and/or N-terminal side of each CDR.
  • the polypeptide of ⁇ 11> which is a polypeptide comprising the following binding site as the binding site: (NI) A binding site comprising a combination of a first variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 163 and a second variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164.
  • NI A binding site comprising a combination of a first variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 163 and a second variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164.
  • ⁇ 14> A polynucleotide encoding any one of the polypeptides described in ⁇ 1> to ⁇ 13>.
  • ⁇ 15> A cell on the cell surface of which the polypeptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13> is expressed.
  • ⁇ 16> The cell according to ⁇ 15>, further expressing on the cell surface a membrane-type protein exhibiting specific agonistic activity against an inhibitory KIR.
  • the membrane-type protein exhibiting specific agonistic activity against an inhibitory KIR is preferably the membrane-type protein against KIR2DL2/3 described in [26], the membrane-type protein against KIR3DL1 described in [42], or the membrane-type protein against KIR2DL1 described in [59].
  • the inhibitory KIR is at least one of KIR2DL2/3, KIR3DL1 and KIR2DL1 (preferably KIR2DL2/3).
  • More preferred such cells are those that satisfy all of the following conditions: ⁇ i>
  • the polypeptide according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13> above is expressed on the cell surface;
  • ⁇ ii> A membrane-type protein exhibiting specific agonist activity against an inhibitory KIR (preferably at least one selected from the group consisting of the membrane-type protein against KIR2DL2/3 described in [26], the membrane-type protein against KIR3DL1 described in [42], and the membrane-type protein against KIR2DL1 described in [59]) is expressed on the cell surface, and ⁇ iii> the expression of at least one (preferably all) Class I HLA on the cell surface has been eliminated or attenuated due to modification (preferably deletion) of the B2M gene on the genome by gene editing.
  • ⁇ 20> The cell according to ⁇ 18>, which is a cell line established from an individual whose HLA expression has been genetically lost.
  • ⁇ 21> The cell according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 20>, wherein the cell is a pluripotent stem cell, a T cell, a NK cell, a peripheral blood mononuclear cell (PBMC), a mesenchymal stem cell, a cardiomyocyte, a chondrocyte, a retinal cell, a liver cell, a kidney cell, or a pancreatic cell.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • mesenchymal stem cell a cardiomyocyte
  • chondrocyte chondrocyte
  • retinal cell a liver cell
  • a kidney cell or a pancreatic cell.
  • the pluripotent stem cell is an iPS cell or an ES cell.
  • ⁇ 23> The cell of any one of ⁇ 15> to ⁇ 22>, further expressing a chimeric receptor on the cell surface.
  • a pharmaceutical composition comprising any one of the cells of ⁇ 15> to ⁇ 23> as an active ingredient, which reduces the risk of immune rejection in a subject of administration or transplantation.
  • a method for reducing or suppressing immune rejection of therapeutic cells by a subject to be treated comprising the step of expressing on the cell surface of therapeutic cells any one of the polypeptides of ⁇ 1> to ⁇ 13>.
  • the method further comprises the step of expressing on the cell surface of therapeutic cells a membrane-type protein exhibiting specific agonist activity against inhibitory KIR (preferably at least one selected from the group consisting of the membrane-type protein for KIR2DL2/3 described in [26], the membrane-type protein for KIR3DL1 described in [42], and the membrane-type protein for KIR2DL1 described in [59]), and/or the step of modifying at least one gene selected from the Class I HLA, B2M, TAP1, TAP2, and TAPBP regions in the genome (preferably modifying the B2M gene, more preferably deleting the B2M gene) to eliminate or attenuate the expression of at least one (preferably all) Class I HLA on the cell surface by gene editing.
  • a membrane-type protein exhibiting specific agonist activity against inhibitory KIR preferably at least one selected from the group consisting of the membrane-type protein for KIR2DL2/3 described in [26], the membrane-type protein for KIR3DL1 described in [42], and the membrane-type protein
  • a method for producing therapeutic cells with reduced or suppressed risk of immune rejection by a subject to be treated comprising a step of expressing any one of the polypeptides ⁇ 1> to ⁇ 13> on the cell surface of the therapeutic cells.
  • the method further comprises the steps of: expressing a membrane-type protein that exhibits specific agonist activity against inhibitory KIR (preferably at least one selected from the group consisting of the membrane-type protein against KIR2DL2/3 described in [26], the membrane-type protein against KIR3DL1 described in [42], and the membrane-type protein against KIR2DL1 described in [59]) on the cell surface of the therapeutic cells; and/or modifying at least one gene selected from Class I HLA, B2M, TAP1, TAP2, and TAPBP regions on the genome (preferably modifying the B2M gene, more preferably deleting the B2M gene) to eliminate or attenuate the expression of at least one (preferably all) Class I HLA on the cell surface by gene editing.
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of NKG2A with a suspension containing a polyclonal population of presenters that includes presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to NKG2A, contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to NKG2A;
  • Step B A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of NKG2C with a suspension containing the presenter population obtained in Step A, bringing the mixture into contact with a carrier on which a substance that binds to the labeled portion is immobilized, and recovering presenters that do not bind to the carrier, thereby removing presenters that present
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein comprising the extracellular domain of NKG2C and an unlabeled solubilized protein comprising the extracellular domain of NKG2C with a suspension containing a polyclonal population of presenters, including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to NKG2A, and then contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that specifically binds to NKG2A;
  • Step B performing genetic analysis of the presenter obtained by the method including the above steps to identify the gene sequence encoding the antigen-binding site;
  • Step C expressing in a cell a gene encoding the polypeptide of ⁇ 1> that contains the identified antigen-binding site
  • ⁇ 29> The method according to ⁇ 27> or ⁇ 28>, wherein the combination of the label and the substance that binds to the label is a combination of biotin and avidin.
  • ⁇ 30> The method according to any one of ⁇ 27> to ⁇ 29>, further comprising the step of selecting cells having agonistic activity against NKG2A.
  • Substances that bind to NKG2A and inhibit the cytocidal activity of NK cells, or cells that express such substances can suppress the rejection reaction during organ or therapeutic cell transplantation by inhibiting the cytocidal activity of NK cells. Therefore, substances that bind to NKG2A and inhibit the cytocidal activity of NK cells, or cells that express such substances, can be used as a new allogeneic technology that will greatly change the versatility of organ transplantation and cell therapy.
  • substances that bind to inhibitory KIR and have the ability to inhibit the cytocidal activity of NK cells, or cells that express such substances can suppress the rejection reaction during organ or therapeutic cell transplantation by inhibiting the cytocidal activity of NK cells. Therefore, substances that bind to inhibitory KIR and have the ability to inhibit the cytocidal activity of NK cells, or cells that express such substances, can be used as a new allogeneic technology that will greatly change the versatility of organ transplantation and cell therapy.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against K562, and shows the agonistic activity of Lirilumab against inhibitory KIR2DL2.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against HLA-Cw3-K562, and shows the inhibitory activity of Lirilumab against an agonist for inhibitory KIR2DL2.
  • FIG. 1 shows that when anti-KIR antibodies Lirilumab and Pan2D are expressed as scFv membrane proteins, their cytocidal activity against the KIR2DL2-NK92 cell line is attenuated.
  • FIG. 1 shows that when anti-KIR antibodies Lirilumab and Pan2D are expressed as scFv membrane proteins, their cytocidal activity against the KIR2DL2-NK92 cell line is attenuated.
  • FIG. 1 shows that binders that bind to activating KIR enhance the activity of NK cell lines that express activating KIR.
  • This figure shows the binding affinity of KIR2DL2/3-specific binders newly obtained by phage panning to inhibitory and activating KIRs.
  • This figure shows the agonistic activity of KIR2DL2/3-specific binders newly obtained by phage panning against inhibitory KIR.
  • 6A and 6B show the results of evaluating the agonistic activity of KIR2DL2/3-specific binders using primary NK cells, in which NK cells carrying KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, and KIR2DS2 genes were used, and NK cells carrying KIR2DL3 genes were used, respectively.
  • FIG. 1 shows that the newly obtained binders bind to 2DL2 or 3 and suppress the activation of NK cells.
  • FIG. 1 shows the results of evaluating whether binders (scFv) that exhibit binding to KIR2DL1 and KIR3DL1 change the cytocidal activity of NK cell lines expressing each receptor.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a membrane-type scFv binder.
  • FIG. 1 shows an alignment of the full-length amino acid sequences of KIR2DL2*001 (SEQ ID NO: 6, extracellular regions 1-224), KIR2DL2*003 (SEQ ID NO: 57, extracellular regions 1-224), KIR2DL3*001 (SEQ ID NO: 8, extracellular regions 1-224), KIR2DS1*002 (SEQ ID NO: 10, extracellular regions 1-224), KIR2DS2*001 (SEQ ID NO: 12, extracellular regions 1-224), and KIR2DS4*001 (SEQ ID NO: 14, extracellular regions 1-224) relative to KIR2DL1*003 (SEQ ID NO: 4, extracellular regions 1-222).
  • KIR2DL2*003 shows an alignment of the full-length amino acid sequences of KIR2DL2*003 (SEQ ID NO: 57, extracellular regions 1-224), KIR2DL1*003 (SEQ ID NO: 4, extracellular regions 1-224), KIR2DL3*001 (SEQ ID NO: 8, extracellular regions 1-224), KIR2DS1*002 (SEQ ID NO: 10, extracellular regions 1-224), KIR2DS2*001 (SEQ ID NO: 12, extracellular regions 1-224), and KIR2DS4*001 (SEQ ID NO: 14, extracellular regions 1-224) based on KIR2DL2*001 (SEQ ID NO: 6, extracellular regions 1-224).
  • KIR3DL1*015 SEQ ID NO: 16, extracellular regions 1-319
  • KIR3DL2*002 SEQ ID NO: 59, extracellular regions 1-319
  • KIR3DS1*013 SEQ ID NO: 60, extracellular regions 1-319
  • This figure shows the amino acid sequences of the CD8-derived signal peptide (SEQ ID NO: 23), CD8-derived hinge (SEQ ID NO: 24), G4S linker (SEQ ID NO: 25), CD8-derived hinge (SEQ ID NO: 26), CD8-derived membrane domain (SEQ ID NO: 27), and CD8-derived intracellular domain (SEQ ID NO: 28), as well as the amino acid sequence of Lirilumab (1-7F9) VH (SEQ ID NO: 29) and the amino acid sequence of Lirilumab (1-7F9) VL (SEQ ID NO: 30).
  • the underlined sequences show the sequences of CDRs 1 to 3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of Pan2D VH (SEQ ID NO: 31) and Pan2D VL (SEQ ID NO: 32), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS1 VH (SEQ ID NO: 33) and a2DL2/3-DS1 VL (SEQ ID NO: 34).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS2 VH (SEQ ID NO: 35) and a2DL2/3-DS2 VL (SEQ ID NO: 36), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS3 VH (SEQ ID NO: 37) and a2DL2/3-DS3 VL (SEQ ID NO: 38).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS4 VH (SEQ ID NO: 39) and a2DL2/3-DS4 VL (SEQ ID NO: 40), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS5 VH (SEQ ID NO: 41) and a2DL2/3-DS5 VL (SEQ ID NO: 42).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS6 VH (SEQ ID NO: 43) and a2DL2/3-DS6 VL (SEQ ID NO: 44), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS7 VH (SEQ ID NO: 45) and a2DL2/3-DS7 VL (SEQ ID NO: 46).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS8 VH (SEQ ID NO: 47) and a2DL2/3-DS8 VL (SEQ ID NO: 48), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS9 VH (SEQ ID NO: 49) and a2DL2/3-DS9 VL (SEQ ID NO: 50).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS10 VH (SEQ ID NO: 51) and a2DL2/3-DS10 VL (SEQ ID NO: 52), as well as the amino acid sequences of a3DL1-DS1 VL (SEQ ID NO: 55) and a3DL1-DS1 VH (SEQ ID NO: 56).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 20A shows the cytocidal activity of CAR-T cells in wells to which NK cells were not added
  • Figure 20B shows the cytocidal activity of CAR-T cells in wells to which NK cells were added, demonstrating that expression of a KIR2DL2/3-specific binder by CAR-T cells suppresses the cytocidal activity of CAR-T cells against target cells, thereby maintaining the cytocidal activity of CAR-T cells against target cells.
  • FIG. 1 shows the number of PBMC-C-derived T cells in wells in which PBMC-A-derived NK cells were co-cultured.
  • FIG. 1 shows the agonistic activity against inhibitory KIR of mutants in which every other amino acid in CDR3 of the variable region (VH) of a2DL2/3-DS10, a KIR2DL2/3-specific binder, is substituted with alanine.
  • FIG. 1 shows the agonistic activity of CDR-grafts, in which the CDRs of a KIR2DL2/3-specific binder are grafted onto the constant regions of different scFvs, against inhibitory KIRs.
  • FIG. 1 shows the additive inhibitory effect of cells co-expressing a KIR2DL2/3-specific binder and HLA-E on the cytotoxic activity of NK cells expressing an inhibitory KIR and NKG2A.
  • FIG. 1 shows a binding model diagram of a Fab fragment of a2DL2/3-DS10, a KIR2DL2/3-specific binder identified by X-ray crystal structure analysis, and KIR2DL2.
  • FIG. 1 shows the mapping of the epitope site on KIR2DL2 of a2DL2/3-DS10, a KIR2DL2/3-specific binder identified by X-ray crystal structure analysis.
  • FIG. 1 shows the results of examining the competition between a2DL2/3-DS10 and each KIR2DL2/3-specific binder in an antigen binding test.
  • This figure shows the binding affinity of KIR2DL1-specific binders or KIR3DL1-specific binders newly obtained by phage panning to inhibitory and activating KIRs.
  • This figure shows the agonistic activity of KIR2DL1-specific binders newly obtained by phage panning against inhibitory KIR.
  • This figure shows the agonistic activity of KIR3DL1-specific binders newly obtained by phage panning against inhibitory KIR.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS11 VH (SEQ ID NO: 61) and a2DL2/3-DS11 VL (SEQ ID NO: 62), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS12 VH (SEQ ID NO: 63) and a2DL2/3-DS12 VL (SEQ ID NO: 64).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • FIG. 7 shows the amino acid sequence of the 3DL2 signal peptide (SEQ ID NO:65) and the amino acid sequence of the 3DS1 signal peptide (SEQ ID NO:66), as well as the amino acid sequence of R99A (SEQ ID NO:67), the amino acid sequence of V99A (SEQ ID NO:68), the amino acid sequence of S100A (SEQ ID NO:69), the amino acid sequence of G101A (SEQ ID NO:70), the amino acid sequence of T102A (SEQ ID NO:71), the amino acid sequence of T103A (SEQ ID NO:72), the amino acid sequence of G104A (SEQ ID NO:73), the amino acid sequence of G105A (SEQ ID NO:74), the amino acid sequence of Y106A (SEQ ID NO:75), the amino acid sequence of Y107A (SEQ ID NO:76), the amino acid sequence of T108A (SEQ ID NO:77), the amino acid sequence of G109A (SEQ ID NO:78), the amino acid sequence of M110A (S
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL2/3-DS1-2 VH (SEQ ID NO: 82) and a2DL2/3-DS1-2 VL (SEQ ID NO: 83), as well as the amino acid sequences of a2DL2/3-DS2-2 VH (SEQ ID NO: 84) and a2DL2/3-DS2-2 VL (SEQ ID NO: 85).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence of a2DL2/3-DS3-2 VH (SEQ ID NO: 86) and the amino acid sequence of a2DL2/3-DS3-2 VL (SEQ ID NO: 87) (the underlined sequences indicate the sequences of CDR1 to 3), as well as the amino acid sequence of a peptide derived from the HLA-G signal peptide (SEQ ID NO: 88), the amino acid sequence of the G4S linker (SEQ ID NO: 89), the amino acid sequence of HLA-E (SEQ ID NO: 90), the amino acid sequence of the IL-2 signal peptide (SEQ ID NO: 91), the amino acid sequence of the His tag (SEQ ID NO: 92), and the amino acid sequence of the VH signal peptide (SEQ ID NO: 93).
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the Fab fragment H-chain constant region (SEQ ID NO: 94), the amino acid sequence of the Vl signal peptide (SEQ ID NO: 95), the amino acid sequence of the Fab fragment L-chain constant region (SEQ ID NO: 96), the amino acid sequence of the GGGS linker (SEQ ID NO: 97), the amino acid sequence of the IgG Fc domain (SEQ ID NO: 98), the amino acid sequence of the GAA linker (GAA), the amino acid sequence of the Avi tag (SEQ ID NO: 99), the amino acid sequence of the CA19CAR VL (SEQ ID NO: 100), and the amino acid sequence of the CA19CAR VH (SEQ ID NO: 101).
  • This figure shows the amino acid sequences of the CD8-derived membrane domain and intracellular domain (SEQ ID NO: 102), the amino acid sequence of the intracellular costimulatory molecule (SEQ ID NO: 103), the amino acid sequence of the blue fluorescent protein (SEQ ID NO: 104), the amino acid sequence of the IL-21 fragment (SEQ ID NO: 105), and the amino acid sequence of the CD8 hinge (62 aa) (SEQ ID NO: 106).
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS1 VH (SEQ ID NO: 107) and a2DL1-DS1 VL (SEQ ID NO: 108), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS2 VH (SEQ ID NO: 109) and a2DL1-DS2 VL (SEQ ID NO: 110).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS3 VH (SEQ ID NO: 111) and a2DL1-DS1 VL (SEQ ID NO: 112), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS4 VH (SEQ ID NO: 113) and a2DL1-DS4 VL (SEQ ID NO: 114).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS5 VH (SEQ ID NO: 115) and a2DL1-DS5 VL (SEQ ID NO: 116), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS6 VH (SEQ ID NO: 117) and a2DL1-DS6 VL (SEQ ID NO: 118).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS7 VH (SEQ ID NO: 119) and a2DL1-DS7 VL (SEQ ID NO: 120), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS8 VH (SEQ ID NO: 121) and a2DL1-DS8 VL (SEQ ID NO: 122).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS9 VH (SEQ ID NO: 123) and a2DL1-DS9 VL (SEQ ID NO: 124), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS10 VH (SEQ ID NO: 125) and a2DL1-DS10 VL (SEQ ID NO: 126).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS11 VH (SEQ ID NO: 127) and a2DL1-DS11 VL (SEQ ID NO: 128), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS12 VH (SEQ ID NO: 129) and a2DL1-DS12 VL (SEQ ID NO: 130).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS13 VH (SEQ ID NO: 131) and a2DL1-DS13 VL (SEQ ID NO: 132), as well as the amino acid sequences of a2DL1-DS14 VH (SEQ ID NO: 133) and a2DL1-DS14 VL (SEQ ID NO: 134).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a2DL1-DS15 VH (SEQ ID NO: 135) and a2DL1-DS15 VL (SEQ ID NO: 136), as well as the amino acid sequences of a3DL1-DS2 VH (SEQ ID NO: 137) and a3DL1-DS2 VL (SEQ ID NO: 138).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • Figure 1 shows the amino acid sequences of a3DL1-DS3 VH (SEQ ID NO: 139) and a3DL1-DS3 VL (SEQ ID NO: 140), as well as the amino acid sequences of a3DL1-DS4 VH (SEQ ID NO: 141) and a3DL1-DS4 VL (SEQ ID NO: 142).
  • the underlined sequences indicate the sequences of CDR1 to CDR3.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a3DL1-DS5 VH (sequence number 143) and the amino acid sequence of a3DL1-DS5 VL (sequence number 144), as well as the amino acid sequence of a3DL1-DS6 VH (sequence number 145) and the amino acid sequence of a3DL1-DS6 VL (sequence number 146).
  • FIG. 1 shows the results of evaluating the cytocidal activity of NK92 cells against membrane-type anti-NKG2A-scFv-expressing K562 cell line.
  • FIG. 1 shows the expression of cell surface markers in NK92 cells confirmed by flow cytometry, and shows that the cells are NKG2A-positive and NKG2C-negative.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence of aNKG2A-DS11 VH (SEQ ID NO: 163) and the amino acid sequence of aNKG2A-DS11 VL (SEQ ID NO: 164).
  • the underlined sequences represent the sequences of CDR1 to CDR3.
  • This figure shows that among the membrane-type anti-NKG2A-scFvs that exhibited agonistic activity against NKG2A, aNKG2A-DS11 exhibited binding to NKG2A-CD94 recombinant protein, but did not exhibit binding to NKG2C-CD94 recombinant protein.
  • FIG. 10 shows the results of flow cytometry analysis of the expression of cell surface markers of each PBMC-derived NK cell used in Example 21.
  • FIG. 1 is a diagram (part 1) showing the expression of cell surface markers of each PBMC-derived NK cell used in Example 22, confirmed by flow cytometry.
  • FIG. 1 is a diagram (part 1) showing the expression of cell surface markers of each PBMC-derived NK cell used in Example 22, confirmed by flow cytometry.
  • FIG. 2 is a diagram (part 2) showing the results of flow cytometry to confirm the expression of cell surface markers of each PBMC-derived NK cell used in Example 22.
  • This figure shows the cytocidal activity of each PBMC-derived NK cell line that co-expressed tHLA-E and membrane-type aNKG2A-DS11 against iPS cells that did not express Class I HLA.
  • Figure 53-3A shows the cytocidal activity of PBMC-derived NK cells in which NKG2A-positive NK cells were dominant over NKG2C-positive NK cells
  • Figure 53-3B shows the cytocidal activity of PBMC-derived NK cells in which NKG2C-positive NK cells were dominant over NKG2A-positive NK cells.
  • the present invention will be described in detail below. 1. Substances Having the Activity of Binding to Inhibitory Receptors on the Surface of NK Cells and Inhibiting the Cytocidal Activity of NK Cells
  • the present invention provides substances having the activity of binding to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibiting the cytocidal activity of NK cells. Such substances are sometimes referred to as substances having agonistic activity for inhibitory receptors on the surface of NK cells. That is, the activity of binding to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibiting the cytocidal activity of NK cells is sometimes referred to as agonistic activity for inhibitory receptors on the surface of NK cells.
  • a substance that binds to a receptor on the surface of NK cells is called a binder
  • a substance that binds to a receptor on the surface of NK cells and has the ability to activate signals from the receptor to NK cells is called an agonist binder for the receptor. That is, agonist binders for inhibitory receptors on the surface of NK cells exhibit the ability to inhibit NK cell activity, and agonist binders for activating receptors on the surface of NK cells exhibit the ability to activate NK cells.
  • Inhibitory receptors on the surface of NK cells include NKG2A and inhibitory KIR.
  • NKG2 is expressed on the surface of NK cells and some T cells, and is involved in the NK cell function of "missing self," which is the self-versus-nonself recognition.
  • NKG2 includes inhibitory NKG2A and NKG2B, and activating NKG2C, NKG2D, NKG2E, NKG2F, and NKG2H.
  • HLA-E and HLA-G have been reported as ligands for NKG2A, and the ligand HLA-E also binds to NKG2C.
  • KIRs are expressed on the surface of NK cells and are involved in the NK cell's "missing self" function, which distinguishes self from non-self.
  • the target cell expresses the same type of HLA as the NK cell
  • the cell's HLA binds to the inhibitory KIR on the NK cell, transmitting an inhibitory signal into the NK cell and suppressing the cytocidal activity of the NK cell.
  • cells expressing the same type of HLA as the NK cell can avoid being eliminated by the NK cell.
  • activating KIRs recognize HLA presenting virus-derived peptides on cells expressing the same type of HLA as NK cells, and the peptides carried by them; an activation signal is transmitted into the NK cells, activating the cytotoxic activity of the NK cells. Unlike inhibitory KIRs, activating KIRs function to recognize and eliminate viral peptides presented on HLA.
  • binding is also referred to as “recognition.”
  • “recognition” i.e., “binding” means binding that is not nonspecific adsorption.
  • the dissociation constant (hereinafter referred to as "KD") can be used as a criterion for determining whether or not recognition has occurred, i.e., whether or not binding has occurred.
  • KD dissociation constant
  • the KD value of the preferred antibodies of the present invention for an antigen protein is 1 x 10 -5 M or less, 5 x 10 -6 M or less, 2 x 10 -6 M or less, or 1 x 10 -6 M or less.
  • Binding in the present invention can be measured or determined by a biomolecular interaction analysis system such as the SPR method or the BLI method, or by an ELISA method, an RIA method, or the like.
  • the binding between a substance expressed on the cell surface and a recombinant protein of an inhibitory KIR can be measured by flow cytometry, or the like.
  • Substances that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells and have the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells are substances that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells, activate the inhibitory receptors on the surface of NK cells, transmit inhibitory signals into the NK cells, and inhibit the cytocidal activity of NK cells.
  • NKG2s include NKG2A and NKG2B.
  • Activating NKG2s include NKG2C.
  • Ligands for NKG2A include HLA-E and HLA-G, and the ligand HLA-E also binds to NKG2C.
  • the substance of the present invention that binds to NKG2A and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells is a substance that binds to NKG2A and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells that express the NKG2A to which it binds. In other words, it is a substance that binds to NKG2A and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells.
  • the substance binds to NKG2A and exerts agonist activity.
  • Substances of the present invention that bind to NKG2A and inhibit the cytocidal activity of NK cells have low activity in activating the cytocidal activity of NK cells.
  • the activity of a substance of the present invention that binds to NKG2A and inhibits the cytocidal activity of NK cells is higher than the activity of the substance that binds to the corresponding NKG2C and activates the cytocidal activity of NK cells.
  • Substances of the present invention that bind to NKG2A and inhibit the cytocidal activity of NK cells preferably do not bind to NKG2C. In other words, they do not substantially exhibit agonist activity against NKG2C.
  • Inhibitory KIRs include those belonging to the KIR2DL subclass and KIR3DL subclass. Those belonging to the KIR2DL subclass include KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, and KIR2DL5, while those belonging to the KIR3DL subclass include KIR3DL1, KIR3DL2, and KIR3DL3.
  • Activating KIR subtypes include KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, and KIR3DS1.
  • KIR2DL4 exists as a subtype that possesses both inhibitory and activating properties.
  • the ligands (HLA) that bind to these inhibitory and activating KIRs are shown in Table 1.
  • variants of the inhibitory and activating KIRs of the present invention there are various variants of the inhibitory and activating KIRs of the present invention, but in the examples of the present invention, variants with amino acid sequences that are frequently expressed were selected and used. Therefore, the actions and effects of the present invention are not limited to individual variants, but are applicable to KIRs belonging to each subtype, and to cells, hosts, etc. that have the HLA type corresponding to the KIR.
  • KIR2DL1*003 SEQ ID NO: 4, IPD Accession No.: KIR00003
  • KIR2DL2*001 SEQ ID NO: 6, IPD Accession No.: KIR00010
  • KIR2DL2*003 SEQ ID NO: 57, IPD Accession No.: KIR00012
  • KIR2DL3, KIR2DL3*001 SEQ ID NO: 8, IPD Accession No.: KIR00014
  • KIR2DS1DS1*002 SEQ ID NO: 10, IPD accession number: KIR00034
  • KIR2DS2*001 SEQ ID NO: 12, IPD accession number: KIR00037
  • KIR2DS4, KIR2DS4*001 SEQ ID NO: 14, IPD accession number: KIR00045
  • KIR3DL1, KIR3DL1*015 SEQ ID NO: 4
  • amino acid sequences of KIR2DL2*003 and KIR2DL3*001 are highly identical to each other (the amino acid sequence identity of the extracellular domains is particularly high), and are also highly identical to the amino acid sequences of the active KIRs KIR2DS1*002, KIR2DS2*001, and KIR2DS4*001.
  • the substance of the present invention that binds to an inhibitory KIR and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells is a substance that binds to at least one of the above-mentioned inhibitory KIR subclasses and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells expressing the KIR to which it binds.
  • the inhibitory KIR that it binds to but it is preferably a substance that binds to KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, and/or KIR3DL1, more preferably KIR2DL1, KIR2DL2, and/or KIR2DL3, and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells.
  • the substance binds to an inhibitory KIR and exerts agonist activity.
  • KIR2DL1 recognizes the C2 epitope (Cw2, Cw4, Cw5, Cw6, Cw15, Cw17) of HLA-C type, a Class I MHC molecule.
  • KIR2DL2 and KIR2DL3 recognize the C1 epitopes (Cw1, Cw3, Cw7, Cw8, Cw9, Cw10, Cw12, Cw14, and Cw16) of HLA-C class I MHC molecules and the C1 epitopes (B46 and B73) of HLA-B class I MHC molecules.
  • KIR3DL1 recognizes the Bw4 epitope (A23, A24, A25, A32, B5, B27, B37, B38, B44, B49, B51, B52, B53, B57, B58, B59, B77) of HLA-B type, a Class I MHC molecule.
  • KIR3DL2 recognizes Class I MHC molecules, HLA-A types A3 and A11.
  • Substances that bind to the inhibitory KIR of the present invention and have the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells have low activity of activating the cytocidal activity of NK cells.
  • the activity of a substance that binds to the inhibitory KIR of the present invention and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of NK cells is higher than the activity of the substance that binds to the corresponding activating KIR and activates the cytocidal activity of NK cells.
  • the corresponding activating KIR for an inhibitory KIR is KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, and KIR2DS4, with KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 being particularly important.
  • the activating KIR for KIR3DL1 is KIR3DS1.
  • Substances of the present invention that bind to inhibitory KIR and inhibit the cytocidal activity of NK cells preferably do not bind to activating KIR. That is, they do not exhibit substantial agonist activity against activating KIR. Therefore, substances that bind to inhibitory KIR and inhibit the cytocidal activity of NK cells are preferably substances that have few identical sequences or that bind to partial sequences that have different accessibility when the proteins assume a three-dimensional structure in the alignment of the amino acid sequences of KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 shown in Figure 10.
  • NK cells whose activation is inhibited by the substance of the present invention refer to NK cells expressing an inhibitory receptor on the cell surface that is the target.
  • the inhibitory receptor is NKG2A
  • blood samples from subjects containing an NKG2A-positive NK cell population, or NK cell populations isolated from the blood can be used as such NK cells.
  • the inhibitory receptor is an inhibitory KIR
  • blood samples from subjects with an HLA type corresponding to the inhibitory KIR, or NK cell populations isolated from the blood can be used.
  • NK cells obtained by genetically engineering commercially available NK cell lines to express an inhibitory receptor on the surface of the target NK cells can also be used.
  • the agonist activity of the substances of the present invention against inhibitory receptors on the surface of NK cells can be evaluated by measuring the cytocidal activity of the effector cells listed below against the target cells listed below in the presence and absence of a test substance, and calculating the percentage of inhibition of cytocidal activity in the presence of the test substance.
  • NK cells that express the inhibitory receptor on the surface of the target NK cells listed above are used as effector cells.
  • Cells that do not express HLA corresponding to the inhibitory receptor on the surface of the target NK cells are used as target cells.
  • the test substance may be added to the culture medium in a soluble form, or may be expressed on the surface of the target cells in the form of a membrane protein as described below.
  • NK cells that express NKG2A are used as effector cells, and cells that do not express Class I HLA (for example, cells lacking the B2M gene) or cells that barely express Class I HLA are used as target cells.
  • the agonist activity of the test substance against NKG2C can be evaluated, and substances with agonist activity specific to NKG2A can be selected.
  • NK cells derived from HLA-C1 homotype or HLA-C1/C2 heterotype and expressing KIR2DL2 and/or KIR2DL3 are used as effector cells, and cells that do not express HLA-C1 type (for example, cells collected from a subject with a C2/C2 homotype) are used as target cells. It is preferable that both effector and target cells be of the same Bw4 type (both negative homotypes or both positive homotypes).
  • NK cells derived from HLA-C2 homotype or HLA-C1/C2 heterotype and expressing KIR2DL1 are used as effector cells, and cells that do not express HLA-C2 type (for example, cells collected from a subject with a C1/C1 homotype) are used as target cells. It is preferable that both effector cells and target cells be of the same BW4 type (both negative homotypes or both positive homotypes).
  • NK cells derived from the HLA-Bw4 type and expressing KIR3DL1 are used as effector cells, and cells that do not express the HLA-Bw4 type (for example, cells collected from a subject with a Bw4-positive/Bw4-negative homozygous HLA type) are used as target cells.
  • the HLA-C types of both the effector cells and target cells are the same (both C1/C1 homozygous, both C2/C2 homozygous, or both C1/C2 heterozygous).
  • NK cells derived from HLA-A03, A11 types and expressing KIR3DL2 are used as effector cells, and cells that do not express HLA-A03, A11 types are used as target cells. It is preferable that both effector and target cells be matched in terms of HLA-C type (both C1/C1 homozygous, both C2/C2 homozygous, or both C1/C2 heterozygous), and both be matched in terms of BW4 type (both negative homozygous, both positive homozygous, or both positive/negative heterozygous).
  • Substances that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibit the cytocidal activity of NK cells include substances that have a binding site for inhibitory receptors on the surface of NK cells. Examples of such substances include polypeptides that have a binding site for inhibitory KIR and bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells.
  • polypeptides that have a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and bind to the inhibitory receptor on the surface of NK cells include the following polypeptides (A) and (C).
  • antibodies against NKG2A include monalizumab, a monoclonal antibody into which a CDR or variable region contained in the scFv (aNKG2A-DS11) described below has been grafted, and the like.
  • examples of antibodies against inhibitory KIR include lirilumab, Pan2D, and a monoclonal antibody into which a CDR or variable region contained in scFv (i) to (x) described below has been grafted.
  • the present invention is not limited to these antibodies, and includes all antibodies that have the activity of binding to an inhibitory receptor expressed on the surface of NK cells and inhibiting the cytocidal activity of NK cells.
  • Antibodies and antigen-binding fragments that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibit the cytocidal activity of NK cells may be either monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the isotype of the monoclonal antibodies of the present invention is not particularly limited, and examples include IgGs such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4; IgA such as IgM, IgA1 and IgA2; IgD; and Ig.
  • the isotype and subclass of monoclonal antibodies can be determined, for example, by the Ouchterlony method, ELISA, or RIA.
  • monoclonal antibodies of the present invention include antibodies derived from non-human animals (non-human animal antibodies), human antibodies, chimeric antibodies (also referred to as “chimeric antibodies”), and humanized antibodies. Preferably, human antibodies are used. Antibody mutants are also included within the scope of the antibodies of the present invention; for example, human antibodies also include human mutant antibodies.
  • Non-human animal antibodies include antibodies derived from vertebrates such as mammals and birds.
  • Mammal-derived antibodies include rodent-derived antibodies such as mouse antibodies and rat antibodies, and single-chain antibodies having only one variable region derived from camels, alpacas, llamas, etc.
  • Avian-derived antibodies include chicken antibodies, etc.
  • Chimeric antibodies include, but are not limited to, antibodies that combine a variable region derived from a non-human animal antibody with a human antibody (human immunoglobulin) constant region.
  • Humanized antibodies include, but are not limited to, antibodies in which the CDRs in the variable region of a non-human animal antibody have been grafted onto a human antibody (the variable region of a human immunoglobulin), antibodies in which the CDRs as well as the sequence of the framework region of a non-human animal antibody have been partially grafted onto a human antibody, and antibodies in which one or more amino acids from any of these non-human animal antibodies have been replaced with human amino acids.
  • CDR-grafted antibodies include, but are not limited to, antibodies or antigen-binding fragments in which the CDRs in the variable region of one antibody or antigen-binding fragment have been grafted onto the variable region of another immunoglobulin; antibodies in which not only the CDRs but also part of the framework region sequence of the original antibody or antigen-binding fragment have been grafted onto the variable region of the other antibody or antigen-binding fragment; and antibodies in which one or more amino acids from either of these antibodies or antigen-binding fragments have been replaced with other amino acids.
  • 1 to 6 amino acids selected from 1, 2, or 3 amino acids on the N-terminal and/or C-terminal side of the CDR region may be replaced, more preferably 1 to 4 amino acids selected from 2 amino acids on the N-terminal and/or C-terminal side, and even more preferably 1 or 2 amino acids selected from 1 amino acid on the N-terminal and/or C-terminal side.
  • Antibodies can be produced by a variety of known methods. Known methods include those using hybridomas and cell immunization, and they can be produced by genetic recombination techniques. Methods for obtaining human antibodies selected from a human antibody phage library are also known. For example, a phage display method can be used in which the variable region of a human antibody is expressed on the surface of a phage as an scFv and phages that bind to the antigen are selected. By analyzing the genes of phages selected by binding to the antigen, the DNA sequence encoding the variable region of a human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • an expression vector containing that sequence can be constructed and introduced into an appropriate host for expression, thereby enabling the production of a human antibody (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 433-455).
  • single-chain antibodies consisting only of heavy chains are antibodies possessed by camels, alpacas, llamas, etc., and can be obtained by immunizing these animals or using phage libraries derived from these animals (see, for example, David R. Maass et al. J Immunol Methods, (2007 Jul 31); 324(1-2): 13-25; Lukas Roth et al., Methods Mol Biol., (2020); 2070: 173-189, etc.).
  • antigen-binding fragment refers to a peptide that is composed of one or two variable regions and has antigen-binding activity.
  • antigen-binding fragments include, but are not limited to, scFv, Fab, F(ab') 2 , Fab', Fv, and single-domain antibodies (sdAbs).
  • sdAbs single-domain antibodies
  • Such antigen-binding fragments may be obtained by treating full-length antibody protein molecules with enzymes such as papain and pepsin, as well as recombinant proteins produced in suitable host cells using recombinant genes.
  • the heavy chain variable region and light chain variable region contained in a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that binds to a target antigen, or the CDR1, CDR2, and CDR3 contained therein may be grafted onto the framework sequence of the desired antigen-binding fragment.
  • Antigen-binding fragments derived from single-chain antibodies consisting only of heavy chains can be produced by using displayer libraries such as phage or yeast that contain genes encoding the variable regions of single-chain antibodies derived from camels, alpacas, llamas, etc.
  • variable region or CDR examples include, but are not limited to, substitution of one or more amino acids in the sequence of the original antibody or the like with amino acids of the desired antigen-binding fragment.
  • the antigen-binding fragment of the present invention is a single chain such as an scFv
  • the present invention includes those in which the heavy chain variable region and light chain variable region are swapped in this manner (Effects of variable domain orientation on anti-HER2 single-chain variable fragment antibody expressed in the Escherichia coli cytoplasm, Ilkay Kocer et al., Biotechnol Prog. 2021 Mar; 37(2): 33102).
  • scFv is preferred.
  • scFv is an antigen-binding fragment obtained by linking a heavy chain variable region and a light chain variable region with a polypeptide linker (Pluckthun A., The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, edited by Rosenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Nature Biotechnology (2005), 23, 1126-1136).
  • linker sequences for single-chain antibodies and scFv including artificial sequences, can be used as the linker sequence.
  • Known artificial linker sequences are amino acid sequences rich in glycine and serine.
  • Examples include a GS linker consisting of three GSG amino acids or four GSGS amino acids (SEQ ID NO: 3), and a linker sequence represented by the formula (G4S)n.
  • Linker domains are also called peptide linkers, and known peptide linkers can be used as extracellular linker domains.
  • the sequence represented by the above formula (G4S)n is called a G4S linker.
  • scFv that bind to a target antigen can be obtained using the phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116), in which a library of variable regions is expressed on the surface of a phage as single-chain antibodies (scFv), and phages that bind to the antigen are selected.
  • scFv single-chain antibodies
  • the DNA sequence encoding the variable regions that bind to the antigen can be determined. Once the sequences of these heavy and light chain variable regions are known, the sequences of the CDRs contained in the variable regions can also be identified.
  • CDR and variable region sequences can be incorporated into the sequence format of a desired antibody or antigen-binding fragment to create an expression vector containing the sequence, which can then be introduced into an appropriate host for expression, thereby obtaining an antibody or antigen-binding fragment with the desired antigen-binding properties (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), pp. 1105-1116).
  • CDRs can be modified to the extent that the agonist activity of the polypeptide of the present invention is not altered. That is, a specific amino acid residue in the CDR of a polypeptide of the present invention can be substituted with alanine to confirm whether agonist activity against inhibitory KIR is maintained. Amino acids that maintain agonist activity against inhibitory KIR even after substitution with alanine can be determined to be unimportant for agonist activity, and such amino acids in the CDR can be substituted with other amino acids. The polypeptide with the substituted amino acids will have the same reactivity as the polypeptide before the amino acid substitution.
  • amino acids in a CDR When substituting amino acids in a CDR with other amino acids, it is preferable to substitute 1 to 6 amino acids selected from 1, 2, or 3 amino acids on the N-terminus and/or C-terminus of the CDR region, more preferably 1 to 4 amino acids selected from 2 amino acids on the N-terminus and/or C-terminus, and even more preferably 1 or 2 amino acids selected from 1 amino acid on the N-terminus and/or C-terminus.
  • Examples of the scFv against NKG2A of the present invention include scFv consisting of the amino acid sequence (Ni) below, where the heavy chain variable region and light chain variable region can be linked by, for example, a GS linker, a G4S linker, or the like.
  • Ni An amino acid sequence comprising a combination of the amino acid sequence of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 163 and the amino acid sequence of the light chain variable region of SEQ ID NO: 164.
  • scFv against inhibitory KIR2DL2 or KIR2DL3 of the present invention examples include scFvs consisting of any of the amino acid sequences (i) to (xii) below, where the heavy chain variable region and light chain variable region can be linked by, for example, a GS linker, a G4S linker, or the like.
  • examples of the scFv against inhibitory KIR3DL1 of the present invention include scFvs consisting of any of the amino acid sequences (xiii) to (xviii) below, where the heavy chain variable region and light chain variable region can be linked by, for example, a GS linker, a G4S linker, or the like.
  • scFv against inhibitory KIR2DL1 of the present invention examples include scFvs consisting of any of the amino acid sequences (ci) to (cxv) below, where the heavy chain variable region and light chain variable region can be linked by, for example, a GS linker, a G4S linker, or the like.
  • polypeptides that have a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and bind to the inhibitory receptor on the surface of NK cells include antibodies that recognize and bind to the inhibitory receptor on the surface of NK cells, or polypeptides that have a binding site consisting of an amino acid sequence derived from scFv.
  • Such polypeptides can take various forms, but preferred examples include monoclonal antibodies, antigen-binding fragments such as scFv, or membrane-type proteins that have the amino acid sequence of an antigen-binding fragment on the outside of the cell.
  • An amino acid sequence derived from an antibody that recognizes and binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells or an scFv includes the amino acid sequence of the site in an antibody that recognizes and binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells or the NK cell variable region in an scFv that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and further includes an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, or added (addition includes insertion) (hereinafter collectively referred to as "mutation") in the amino acid sequence of an antibody that recognizes and binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells or the amino acid sequence of the site in an scFv that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and which has the activity of binding to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibiting the cytocidal activity of NK cells.
  • “several” in “one or several” refers to 2 to 10, preferably
  • binding sites to inhibitory receptors on the surface of NK cells include sites containing amino acid sequences derived from CDR1, CDR2, and CDR3 contained in the light chain variable region and heavy chain variable region of a monoclonal antibody or scFv that binds to inhibitory receptors on the surface of NK cells, amino acid sequences derived from variable regions containing the respective CDR1, CDR2, and CDR3, or amino acid sequences derived from the light chain variable region and heavy chain variable region.
  • An amino acid sequence derived from an antibody or scFv that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells has the same meaning as above.
  • a polypeptide that has a binding site for NKG2A and binds to NKG2A has the combination of heavy chain variable region and light chain variable region shown in aNKG2A-DS11 in Table 21.
  • polypeptide of the present invention that has a binding site for NKG2A and binds to NKG2A is, for example, a polypeptide comprising the amino acid sequence of (NI) below (preferably a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment, an scFv consisting of the amino acid sequence, or a membrane protein comprising the scFv in its extracellular domain).
  • NI amino acid sequence of
  • a binding site comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 163 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 163) and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 164 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 164);
  • a polypeptide that has a binding site for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and binds to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 has a combination of heavy chain variable regions and light chain variable regions shown in Table 2.
  • "a2DL2/3" indicates that the binder binds to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 regions in the table are indicated by the range of amino acid numbers in the amino acid sequence of each variable region.
  • the amino acid numbers are specified according to the IMGT definition.
  • polypeptides that have a binding site for inhibitory KIR2DL1 and bind to inhibitory KIR2DL1 have the combination of heavy chain variable regions and light chain variable regions shown in Table 3.
  • "a2DL1" indicates that the binder binds to inhibitory KIR2DL1.
  • polypeptides that have a binding site for inhibitory KIR3DL1 and bind to inhibitory KIR3DL1 have the combination of heavy chain variable region and light chain variable region shown in Table 4.
  • "a3DL1" indicates that the binder binds to inhibitory KIR3DL1.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 regions in the table are indicated by the range of amino acid numbers in the amino acid sequence of each variable region.
  • the amino acid numbers are specified according to the IMGT definition.
  • polypeptide of the present invention that has a binding site for inhibitory KIR2DL2 or KIR2DL3 and binds to inhibitory KIR is, for example, a polypeptide comprising any of the following amino acid sequences (I) to (XII) (preferably a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment, an scFv consisting of the amino acid sequence, or a membrane-type protein comprising the scFv in its extracellular domain).
  • an amino acid sequence comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 33 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33) and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 34 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34);
  • an amino acid sequence comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 35 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35) and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 36 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36);
  • An amino acid sequence comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from
  • polypeptide of the present invention that has a binding site for inhibitory KIR3DL1 and binds to inhibitory KIR3DL1 includes, for example, a polypeptide comprising any of the amino acid sequences of (XIII) to (XVIII) below (preferably, a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment, an scFv consisting of the amino acid sequence, or a membrane protein comprising the scFv in its extracellular domain).
  • polypeptide of the present invention that has a binding site for inhibitory KIR2DL1 and binds to inhibitory KIR2DL1 includes, for example, a polypeptide comprising the amino acid sequence of the following (P) (preferably, a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment, an scFv consisting of the amino acid sequence, or a membrane-type protein comprising the scFv in its extracellular domain):
  • P An amino acid sequence comprising a combination of a first variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 31 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31) and a second variable region comprising an amino acid sequence derived from CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 32 (preferably a variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32).
  • one embodiment of the polypeptide of the present invention has a binding site for inhibitory KIR2DL1 and binds to inhibitory KIR2DL1, and includes, for example, a polypeptide comprising any of the amino acid sequences (CI) to (CXV) below (preferably, a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment, an scFv consisting of the amino acid sequence, or a membrane protein comprising the scFv in its extracellular domain).
  • CI amino acid sequences
  • CXV a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment, an scFv consisting of the amino acid sequence, or a membrane protein comprising the scFv in its extracellular domain.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region and the CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region may have amino acid mutations that do not abolish reactivity with the antigen.
  • Such mutations include, for example, substitution of one or two amino acids in the CDR amino acid sequence, preferably substitution of one or two amino acids at the C- and/or N-terminus of the CDR amino acid sequence.
  • the structure other than the variable region can be selected appropriately depending on the form of the selected polypeptide (monoclonal antibody, antigen-binding fragment, etc.).
  • the first variable region may be arranged in the following order from the N-terminus: first variable region-linker sequence-second variable region, or the second variable region-linker sequence-first variable region.
  • the first variable region may be arranged in the heavy chain and the second variable region in the light chain, or the first variable region may be arranged in the light chain and the second variable region in the heavy chain.
  • a substance has agonist activity specific to an inhibitory receptor on the surface of an NK cell.
  • agonist activity specific to an inhibitory receptor on the surface of an NK cell refers to a substance that exhibits agonist activity against an inhibitory receptor on the surface of an NK cell, and whose agonist activity against an activating receptor on the surface of an NK cell corresponding to the inhibitory receptor on the surface of the NK cell is 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less of the agonist activity against the inhibitory receptor on the surface of the NK cell, and most preferably, exhibits substantially no agonist activity against the activating receptor on the surface of an NK cell.
  • an activating receptor on the surface of an NK cell corresponding to an inhibitory receptor on the surface of an NK cell refers to an activating receptor on the surface of an NK cell, the amino acid sequence of whose extracellular domain is highly homologous to the amino acid sequence of the extracellular domain of the inhibitory receptor on the surface of the target NK cell.
  • an activating receptor for NKG2A is NKG2C.
  • activating KIRs corresponding to KIR2DL2/3 include KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4.
  • the activating KIR corresponding to KIR2DL1 is KIR2DS1
  • the activating KIR corresponding to KIR2DL2/3 is KIR2DS2
  • the activating KIR corresponding to KIR3DL1 and KIR3DL2 is KIR3DS1.
  • Such antibodies can be obtained, for example, by contacting an antibody or antigen-binding fragment obtained by the above-mentioned method, which binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and exhibits agonist activity, with NK cells expressing the corresponding activating KIR, measuring the cytocidal activity of the NK cells against target cells, and selecting antibodies or antigen-binding fragments that exhibit a predetermined activity or less.
  • the antibody or antigen-binding fragment may be added as a soluble protein, or may be expressed on the surface of the target cells in the form of a membrane protein, as described below.
  • antibodies that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells but have low binding affinity to activating receptors on the surface of NK cells can be obtained, for example, by the phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116), in which the variable region of an antibody is expressed on the surface of a phage as a single-chain fragment (scFv), and phages that bind to the antigen are selected.
  • scFv single-chain fragment
  • a method for obtaining binders that specifically bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells using the phage display method involves, for example, recovering and concentrating phages that express scFv that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells from a human antibody phage library (positive selection), and then removing phages that express scFv that bind to activating receptors on the surface of NK cells from the resulting phage mixture (depletion), thereby selecting phages that express scFv that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells but not to activating receptors on the surface of NK cells.
  • the inhibitory or activating receptor on the surface of NK cells can be a recombinant protein/peptide consisting of the amino acid sequence of the extracellular region of each molecule, including a partial sequence important for the agonist activity of the inhibitory receptor on the surface of NK cells.
  • the phage recovery/concentration or removal process can employ various methods used to select substances with binding or affinity. For example, two molecules (e.g., a combination of biotin and avidin) that exhibit strong binding affinity can be bound to an NKG2 fragment or a KIR fragment (labeled NKG2 or KIR), and the other can be bound to a carrier (e.g., magnetic beads).
  • phages that bind to labeled NKG2 or KIR are recovered and concentrated on the carrier.
  • inhibitory receptors on the surface of NK cells are labeled, and phages that are concentrated and recovered on the carrier are obtained.
  • activating receptors on the surface of NK cells are labeled, and phages in solution that do not bind to the carrier are collected, making it possible to obtain phages that do not bind to activating receptors on the surface of NK cells.
  • an excess amount of unlabeled activating receptor fragments on the surface of NK cells can be added to recover and concentrate (deselect) phages with high binding specificity to labeled NKG2 or KIR.
  • a method including the steps shown in (1) or (2) below can produce antibodies that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells but do not bind to activating receptors on the surface of NK cells, and the present invention provides such a production method and substances produced by said production method.
  • a "display body” refers to a gene carrier for cells that has the function of displaying proteins or peptides encoded by genes incorporated by a vector on the surface of a lipid membrane, and examples include phages, yeast, and cells. When phages are used as display bodies, known techniques such as the phage display method or phage panning method described above can be used.
  • yeast display methods that use yeast as a display medium include those known as yeast display (see, for example, Lukas Roth, et al., Methods Mol Biol, 2020, Vol. 207, pp. 173-189, doi: 10.1007/978-1-4939-9853-1_10).
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of an inhibitory receptor on the surface of NK cells with a suspension containing a polyclonal population of presenters that includes presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to an inhibitory receptor on the surface of the NK cells, contacting the suspension with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a population of presenters that present an antigen-binding site that binds to an inhibitory receptor on the surface of the NK cells;
  • Step B A step of mixing a labeled solubilized protein containing the extracellular domain of an activating receptor on the surface of NK cells that corresponds to the inhibitory receptor on the surface of the NK cells with
  • Step A A step of mixing a labeled solubilized protein comprising the extracellular domain of an inhibitory receptor on the surface of NK cells and an unlabeled solubilized protein comprising the extracellular domain of an inhibitory receptor on the surface of NK cells corresponding to the inhibitory receptor with a suspension containing a polyclonal presenter population including presenters that present on their surface an antigen-binding site that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and then contacting the cell solution with a carrier on which a substance that specifically binds to the labeled portion has been immobilized, and recovering the presenters bound to the carrier, thereby obtaining a presenter population that presents an antigen-binding site that specifically binds to the inhibitory receptor on the surface of the NK cells; Step B: performing genetic analysis of the presenter obtained by a method including
  • Steps A-B of method (1) and step A of method (2) above may each be repeated multiple times, or both may be performed in combination.
  • the method may further include a step of selecting a substance having agonistic activity against the inhibitory KIR from the antibody or antigen-binding fragment (soluble or membrane protein) expressed by method (1) or method (2) according to the method described herein.
  • the inhibitory receptor on the surface of the NK cell may be NKG2A, and the corresponding activating receptor may be NKG2C.
  • the inhibitory receptor on the surface of the NK cell is an inhibitory KIR
  • the inhibitory KIR may be KIR2DL2 or KIR2DL3, and the corresponding activating KIR may be KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4.
  • the inhibitory KIR may be KIR3DL1, and the corresponding activating KIR may be KIR3DS1.
  • the inhibitory KIR may be KIR2DL1, and the corresponding activating KIR may be KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4.
  • a polyclonal population of presenters that presents antigen-binding sites that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells can be obtained or produced by known methods.
  • a phage library that displays diverse variable regions which is used in the phage display method to obtain antibodies
  • a yeast library used in the yeast display method can be used.
  • an animal can be immunized with an antigen protein containing the extracellular domain of an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and cells carrying antigen-specific antibody genes, such as B cells, can be collected from the spleen cells of the animal that produce antibodies or antigen-binding fragments against the antigen.
  • the gene sequence encoding the variable regions of the antibody genes of the cells can be amplified and inserted into a vector that displays the variable regions in a predetermined format on the surface of a lipid membrane, thereby producing a presenter library.
  • a method is described, for example, in David R. Maass et al. This is described in J Immunol Methods, (2007 Jul 31); 324(1-2): 13-25, Lukas Roth et al., Methods Mol Biol., (2020); 2070: 173-189, etc.
  • a phagemid vector is used as the vector.
  • a variety of cells such as animal cells or E. coli, can be used as cells for expressing the antibody or antigen-binding fragment, depending on the purpose.
  • target cells used in agonist activity measurement tests or transplant cells for cell transplantation examples include, but are not limited to, blood cells, T cells, and pluripotent stem cells
  • examples include, but are not limited to, blood cells, T cells, and pluripotent stem cells
  • substances with NKG2A-specific agonist activity include the above-mentioned (NI) polypeptide, scFv, and membrane-type proteins containing the scFv in their extracellular domains.
  • substances having agonistic activity specific to inhibitory KIR2DL2/3 include the polypeptides (I) to (XII) above, scFv, and membrane-type proteins containing the scFv in their extracellular domains.
  • substances having agonistic activity specific to inhibitory KIR3DL1 include the polypeptides (XIII) above, scFv, and membrane-type proteins containing the scFv in their extracellular domains, scFv, and membrane-type proteins containing the scFv in their extracellular domains.
  • Substances having agonistic activity specific to inhibitory KIR2DL1 include, for example, any of the polypeptides (CI) to (CXV) above, scFv, and membrane proteins containing the scFv in their extracellular domains.
  • a polypeptide comprising, as a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells, a binding site derived from a heavy chain variable region and a light chain variable region contained in a monoclonal antibody or antigen-binding fragment (e.g., a competitive-binding antibody) that competes with the monoclonal antibody or antigen-binding fragment that binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells in binding to the inhibitory receptor on the surface of NK cells.
  • a monoclonal antibody or antigen-binding fragment e.g., a competitive-binding antibody
  • Such competitive-binding antibodies recognize and bind to the same epitope as the monoclonal antibody or scFv, or an epitope that overlaps with or is located in the vicinity of the epitope, and are therefore likely to exhibit the same agonist activity as the monoclonal antibody or antigen-binding fragment for the inhibitory receptor on the surface of NK cells.
  • a polypeptide of the present invention containing a binding site for NKG2A contains binding sites derived from the heavy chain variable region and light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that competes with an scFv consisting of the amino acid sequence (N-i) above for binding to NKG2A.
  • a polypeptide of the present invention containing a binding site for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 contains binding sites derived from the heavy chain variable region and light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that competes with scFv, Lirilumab, or Pan2D, consisting of any of the amino acid sequences (i) to (xii) above, in binding to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3.
  • a polypeptide containing a binding site for KIR2DL1 contains binding sites derived from the heavy chain variable region and light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that competes with Pan2D or the above-mentioned (P) in binding to KIR2DL1.
  • a polypeptide containing a binding site for KIR2DL1 contains binding sites derived from the heavy chain variable region and light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that competes with an scFv consisting of any of the amino acid sequences (ci) to (cxv) above for binding to KIR2DL1.
  • a polypeptide of the present invention containing a binding site for inhibitory KIR3DL1 contains binding sites derived from the heavy chain variable region and light chain variable region of a monoclonal antibody or antigen-binding fragment that competes with an scFv consisting of any of the amino acid sequences (xiii) to (xviii) above for binding to inhibitory KIR3DL1.
  • the epitope of an inhibitory receptor on the surface of an NK cell recognized by a polypeptide of the present invention containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell can be analyzed by X-ray crystal structure analysis of a complex between the polypeptide containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell and the inhibitory receptor on the surface of an NK cell, i.e., model structural analysis based on the X-ray crystal structure.
  • Epitope analysis by X-ray crystal structure analysis can be performed, for example, by crystallizing a complex between a polypeptide of the present invention containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell and the inhibitory receptor on the surface of an NK cell and performing X-ray structural analysis.
  • a Fab fragment can be used as the polypeptide containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell.
  • a ribbon model can be obtained and amino acid residues located near the Fab fragment, for example, within 4 ⁇ , can be identified, and these amino acid residues can be determined to be amino acids that form the epitope.
  • the X-ray structural analysis can be used to calculate that specific amino acids in the binding site interact with other specific amino acids.
  • amino acids that constitute the epitope of inhibitory KIR2DL2 when binding to a2DL2/3-DS10 are Glu42 (amino acid number 21 of SEQ ID NO: 6), His61 (amino acid number 40 of SEQ ID NO: 6), Lys65 (amino acid number 44 of SEQ ID NO: 6), Phe66 (amino acid number 45 of SEQ ID NO: 6), Lys67 (amino acid number 46 of SEQ ID NO: 6), Asp68 (amino acid number 47 of SEQ ID NO: 6), Thr69 (amino acid number 48 of SEQ ID NO: 6), Leu70 (amino acid number 49 of SEQ ID NO: 6), and 6), Ser86 (amino acid number 65 of SEQ ID NO:6), Ile87 (amino acid number 66 of SEQ ID NO:6), Gly88 (amino acid number 67 of SEQ ID NO:6),
  • amino acids that differ from the amino acid sequence of the extracellular domain of active KIR2DS1 are Lys65, Lys67, Gly88, Pro89, and Met91
  • amino acid that differs from the amino acid sequence of the extracellular domain of KIR2DS2 is Phe66
  • amino acids that differ from the amino acid sequence of the extracellular domain of KIR2DS4 are Lys67, Asp68, Gln92, and Asp93, and therefore, interactions with these amino acids and their neighboring amino acids are important for a KIR2DL2/3-specific binder.
  • DS10-VH-Y107 107th Tyr of the VH chain of a2DL2/3-DS10 (amino acid number 107 of SEQ ID NO: 51, hereinafter referred to as "DS10-VH-Y107") forms a hydrogen bond with Asp68 on KIR2DL2 and is positioned in close proximity to Phe66.
  • the amino acids in the variable region adjacent to Phe66 and Asp68 in KIR2DL2 are sterically hindered and can form hydrogen bonds with Asp, but have weak or no hydrogen-bonding ability with Asn, preferably Tyr.
  • the amino acid in the variable region adjacent to Pro89 on KIR2DL2 is an amino acid that can form a hydrogen bond with Pro and has weak or no ability to form a hydrogen bond with Arg, preferably Tyr.
  • the amino acid in the variable region adjacent to Gly88 on KIR2DL2 is an amino acid that can form a hydrogen bond with the imino group in the main chain of Gly and has weak or no ability to form a hydrogen bond with the main chain imino group of Ser, preferably Gly.
  • Thr at position 94 of the VL chain of a2DL2/3-DS10 (Thr at amino acid number 94 in SEQ ID NO: 52, hereafter referred to as "DS10-VL-T94") forms a hydrogen bond with the side chain of Asp93 on KIR2DL2 via its main chain imino group.
  • the amino acid in the variable region adjacent to Asp93 on KIR2DL2 is capable of forming a hydrogen bond with the side chain of Asp and is an amino acid that has weak or no ability to form a hydrogen bond with Val, preferably Thr, Asn, Gly, His, Ile, Ser, Val, or Ala, and more preferably Thr.
  • KIR2DL2 or KIR2DL3-specific agonist binder of the present invention is a substance (antibody or antigen-binding fragment) comprising a variable region that interacts with 1 to 6 (preferably 3 to 6, more preferably 4 to 6, and even more preferably 5 or 6) amino acids, including amino acid 47, in the region of amino acid numbers 44 to 49 in the amino acid sequence of KIR2DL2 of SEQ ID NO: 6, 2 to 4 (preferably 2, 3, or 4) amino acids, including amino acids 67 and 68, in the region of amino acids 65 to 68, and 1 to 4 (preferably 2, 3, or 4) amino acids, including amino acid 72, in the region of amino acids 70 to 73.
  • 1 to 6 preferably 3 to 6, more preferably 4 to 6, and even more preferably 5 or 6
  • amino acids including amino acid 47, in the region of amino acid numbers 44 to 49 in the amino acid sequence of KIR2DL2 of SEQ ID NO: 6, 2 to 4 (preferably 2, 3, or 4) amino acids, including amino acids 67 and 68, in the region
  • Preferred such substances are binders that include a variable region that interacts with the amino acids in the 45th to 47th region, the 45th to 48th region, the 44th to 47th region, the 45th to 48th region, the 44th to 48th region, the 45th to 49th region, or the 44th to 49th region of the amino acid sequence of KIR2DL2 (SEQ ID NO: 6), the amino acids in the 67th to 68th region, the 66th to 68th region, or the 65th to 68th region of SEQ ID NO: 6, and the amino acids in the 72nd to 73rd region, the 71st to 73rd region, or the 70th to 73rd region of SEQ ID NO: 6.
  • one embodiment of the KIR2DL2-specific agonist of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment in which the amino acid in the variable region that interacts with Asp at position 47 of SEQ ID NO: 6 of KIR2DL2 is Tyr, the amino acid that interacts with Gly at position 67 of SEQ ID NO: 6 is Gly, the amino acid that interacts with Pro at position 68 of SEQ ID NO: 6 is Tyr, and the amino acid that interacts with Asp at position 72 of SEQ ID NO: 6 is Thr, Asn, Gly, His, Ile, Ser, Val, or Ala.
  • such an antibody or antigen-binding fragment preferably has the amino acid adjacent to Phe at position 45 of SEQ ID NO: 6 as Tyr, and more preferably has all of the above amino acids contained in CDR3 of the variable region.
  • Such an antibody or antigen-binding fragment is preferably characterized by having a first variable region having a CDR3 comprising an amino acid sequence consisting of amino acids 97 to 112 of SEQ ID NO: 51, and a second variable region having a CDR3 comprising an amino acid sequence consisting of amino acids 89 to 97 of SEQ ID NO: 52, in which Thr 94 may be substituted with Asn, Gly, His, Ile, Ser, Val, or Ala; more preferably, the antibody or antigen-binding fragment is characterized by having a first variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a second variable region having an amino acid sequence consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, in which Thr 94 may be substituted with As
  • epitopes can be analyzed by conducting a competition test in which polypeptides containing binding sites for inhibitory receptors on the surface of NK cells compete with each other.
  • a K562 cell line expressing an scFv of a polypeptide having a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and a Fab fragment of a different polypeptide can be mixed with recombinant NKG2A or KIR, and the K562 cell line expressing the scFv and the Fab fragment can compete for binding to recombinant NKG2A or KIR.
  • each binder can be evaluated using as an indicator whether binding between the K562 cell line expressing the scFv and recombinant NKG2A or KIR is inhibited by competition.
  • the terms recombinant, recombinant, and soluble are used to refer to the same thing.
  • polypeptides of the present invention containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells include other polypeptides that recognize the epitope recognized by the polypeptides containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells analyzed by the above method.
  • the other polypeptides compete with the polypeptides of the present invention containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells for binding to the inhibitory receptor on the surface of NK cells and have inhibitory selectivity.
  • the membrane-type protein of the present invention has an extracellular domain containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and a transmembrane domain. Therefore, when expressed in a cell, a polypeptide that has a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and recognizes and binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells can be present on the cell membrane surface.
  • the membrane-type protein of the present invention may further contain an intracellular domain.
  • NK cells has a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and the polypeptide that binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells is linked to the transmembrane domain by an extracellular linker domain.
  • a domain refers to a region present in a polypeptide that folds into a specific structure independently of other regions.
  • a polypeptide that has a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell and binds to the inhibitory receptor on the surface of an NK cell can be called a binding domain.
  • the binding domain includes a first variable region and a second variable region derived from the heavy chain variable region and light chain variable region of the monoclonal antibody or antigen-binding fragment described in (1) above
  • the two variable regions can employ a linker sequence that can be employed in the scFv described above.
  • the first variable region may be arranged in the order of linker sequence-second variable region, or the second variable region-linker sequence-first variable region from the N-terminus of the polypeptide.
  • a transmembrane domain is a domain that has affinity for the lipid bilayer that constitutes the cell membrane. Examples include, but are not limited to, transmembrane domains of HLA, CD28, CD3, CD8, CD19, CD4, or 4-1BB. Transmembrane sequences derived from various natural membrane proteins and artificially designed transmembrane sequences can also be used. A preferred example is the CD8 ⁇ -derived transmembrane domain (SEQ ID NO: 27).
  • extracellular linkers include, but are not limited to, the full length or a portion of the extracellular domain of HLA, CD28, CD8, CD19, CD3, CD4, or 4-1BB.
  • Linker sequences derived from various natural proteins, hinge sequences (e.g., immunoglobulin hinge sequences), and artificially designed flexible linker sequences can also be used.
  • a 45-amino acid CD8 ⁇ -derived hinge sequence (SEQ ID NO: 26) or a 66-amino acid CD8 ⁇ -derived hinge sequence (SEQ ID NO: 24) is preferred.
  • the intracellular domain is necessary for the stability of the scFv, and a portion of the intracellular domain (preferably 10 amino acids or less, 9 amino acids or less, 8 amino acids or less, 7 amino acids or less, 6 amino acids or less, 5 amino acids or less, 4 amino acids or less, 3 amino acids or less, 2 amino acids or less, or 1 amino acid) that is not involved in intracellular signaling, such as HLA, CD28, CD3, CD8, CD19, CD4, or 4-1BB, can be used. However, if it is necessary to promote the activation or suppression of intracellular signals by binding to KIR, a portion of the intracellular domain that is involved in intracellular signaling can also be used.
  • a portion of the intracellular domain that is involved in intracellular signaling can also be used.
  • membrane proteins of the present invention are examples of membrane proteins of the present invention.
  • Membrane proteins that exhibit agonistic activity against NKG2A include membrane proteins that have an extracellular domain and a transmembrane domain that contain a binding site for NKG2A (specifically, an scFv containing the first and second variable regions described in (N-I) above).
  • Membrane proteins that exhibit agonist activity against KIR2DL2 or KIR2DL3 include membrane proteins having an extracellular domain and a transmembrane domain that contain a binding site for KIR2DL2 and/or KIR2DL3 (specifically, an scFv containing the first and second variable regions described in any of (I) to (XII) above).
  • Membrane proteins that exhibit agonistic activity against KIR3DL1 include membrane proteins that have an extracellular domain and a transmembrane domain that contain a binding site for KIR3DL1 (specifically, an scFv containing the first and second variable regions described in any of (XIII) to (XVIII) above).
  • Membrane proteins that exhibit agonistic activity against KIR2DL1 include membrane proteins having an extracellular domain and a transmembrane domain that contain a binding site for KIR2DL1 (specifically, an scFv containing the first and second variable regions described in any of (CI) to (CXV) above).
  • a polypeptide whose binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell includes a sequence derived from the binding site of an HLA molecule, which is a natural ligand of the inhibitory receptor on the surface of the NK cell, with the inhibitory receptor on the surface of the NK cell, and whose binding affinity to the TCR (T cell receptor) is deleted or weakened.
  • the inhibitory KIR is KIR2DL2 or KIR2DL3
  • a polypeptide that contains the C1 epitope motif sequence (the 77th amino acid is S and the 80th amino acid is N) found in HLA-Cw1, Cw3, Cw7, Cw8, Cw9, Cw10, Cw12, Cw14, Cw16, and HLA-B46 and B73, which belong to the HLA-C1 type, and that contains a domain that is not recognized by the TCR by adding a mutation or deleting the region recognized by the TCR of the HLA molecule.
  • the inhibitory KIR is KIR2DL1
  • a polypeptide that contains a C2 epitope motif sequence (where the 77th amino acid is N and the 80th amino acid is K) found in HLA-Cw2, Cw4, Cw5, Cw6, Cw15, Cw17, etc., which belong to the HLA-C2 type, and that contains a domain that is not recognized by TCR by adding a mutation or deleting the region recognized by TCR of the HLA molecule.
  • a polypeptide can be used that contains the Bw4 epitope motif sequence (where the 77th amino acid is N, the 80th amino acid is I or T, and the 83rd amino acid is R) found in HLA-B5, B27, B37, B38, B44, B49, B51, B52, B53, B57, B58, B59, B77, A23, A24, A25, A32, etc., which belong to the HLA-Bw4 type, and that contains a domain that is not recognized by TCR by adding a mutation or deleting the region of the HLA molecule that is recognized by TCR.
  • Such a polypeptide may be in the form of a soluble ligand containing an amino acid sequence that includes the epitope motif sequence, or in the form of a membrane protein that contains the epitope motif sequence in its extracellular domain.
  • a polypeptide containing a domain not recognized by TCR can be used, such as HLA-A3, A11, or B27 free heavy chain, or a polypeptide containing a domain not recognized by TCR, obtained by adding a mutation to or deleting the region of the HLA molecule that is recognized by TCR.
  • a polypeptide may be in the form of a soluble ligand or a membrane-type protein.
  • substances that have agonist activity toward inhibitory receptors on the surface of NK cells include low-molecular-weight compounds that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells and exhibit agonist activity toward those receptors.
  • Such compounds can be obtained, for example, by selecting from a compound library using the aforementioned method for evaluating agonist activity toward inhibitory receptors on the surface of NK cells.
  • compounds selected by this method can be further derivatived based on their structures, and their binding activity toward the target inhibitory receptor on the surface of NK cells and their agonist activity can be measured. Structure-activity relationships can be analyzed, and further derivative development can be repeated to obtain compounds with even better binding properties and/or agonist activity.
  • the polypeptide of the present invention that has a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells can be prepared in the form of a secreted protein (soluble protein) or a membrane protein by genetic recombination, genome editing, in vitro translation, chemical synthesis, peptide synthesis, or the like.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by introducing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the polypeptide into an expression system (such as a cell, phage, yeast, microorganism, or in vitro expression system) in a form that allows expression in the target expression system for the polypeptide, functionally linked to necessary factors, and recovering the polypeptide from the expression system after expression, or recovering cells on whose surface the polypeptide is expressed.
  • an expression system such as a cell, phage, yeast, microorganism, or in vitro expression system
  • “functionally linked” means that the elements are linked so that they can perform their function.
  • the expression system is a cell, yeast, microorganism, or the like
  • these nucleotides are inserted into an expression vector, host cells are transformed with the vector, the host cells are cultured to produce the polypeptide, and the polypeptide or cells expressing the polypeptide on their surface are recovered from the culture.
  • the vector may also contain nucleotides encoding a signal peptide that promotes secretion of the polypeptide from the host cells.
  • the nucleotides encoding the signal peptide and the nucleotides encoding the polypeptide are linked in-frame. After the polypeptide is produced, the signal peptide is removed, allowing the polypeptide to be obtained as a mature protein.
  • the CD8 signal peptide can be used as a signal peptide.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can replicate in a host such as an animal cell, bacteria, or yeast, and examples include known plasmids and phages.
  • vectors used to construct expression vectors include pcDNATM (ThermoFisher SCIENTIFIC), FlexiTM Vector (Promega), pUC19, pUEX2 (Amersham), pGEX-4T, pKK233-2 (Pharmacia), and pMAM-neo (Clontech). While prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, as well as eukaryotic cells such as yeast and animal cells, are both acceptable host cells, eukaryotic cells are preferred.
  • HEK293 cells a human embryonic kidney cell line, or Chinese hamster ovary (CHO) cells may be used as animal cells.
  • the expression vector can be introduced into the host cell using known methods to transform the host cell. Examples include electroporation, calcium phosphate precipitation, and DEAE-dextran transfection.
  • the produced antibodies can be purified using separation and purification methods commonly used for proteins. For example, affinity chromatography, other chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. can be selected and combined as appropriate.
  • Cells expressing a membrane-type protein of the present invention on their surface and a method for producing the same Cells expressing on their surface a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of an NK cell and inhibits the cytocidal activity of an NK cell are preferably cells expressing a polypeptide that has a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell and binds to the inhibitory receptor on the surface of an NK cell, as described in 1. (B) above, and a membrane-type protein having a transmembrane domain.
  • the transmembrane domain of the membrane-type protein is present in a state that it spans the cell membrane, and a polypeptide that has a binding site for an inhibitory receptor on the surface of an NK cell and binds to an inhibitory KIR is present on the cell surface.
  • Examples of such cells include cells expressing a membrane-type protein exhibiting agonistic activity against NKG2A (a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for NKG2A (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in (N-I) above)) on the cell surface, and cells expressing a membrane-type protein exhibiting agonistic activity against KIR2DL2 or KIR2DL3 (a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for KIR2DL2 and/or KIR2DL3 (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in any of (I) to (XII) above)) on the cell surface.
  • NKG2A a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for NKG2A (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in (N-I
  • Examples of such cells include cells expressing a membrane-type protein that exhibits agonistic activity against KIR3DL1 (a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for KIR3DL1 (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in any of (XIII) to (XVIII) above)) on the cell surface, and cells expressing a membrane-type protein that exhibits agonistic activity against KIR2DL1 (a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for KIR2DL1 (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in any of (CI) to (CXV) above)) on the cell surface.
  • KIR3DL1 a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for KIR3DL1 (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in any of (CI)
  • These cells may express multiple types of membrane-type proteins on their cell surface that correspond to different inhibitory receptors.
  • Cells expressing multiple types of membrane-type proteins exert agonistic activity against the inhibitory receptors on NK cells targeted by each membrane-type protein, thereby avoiding attack from heterogeneous NK cell populations that express NK cell receptors (KIR, NKG2, etc.) that distinguish between self and non-self Class I MHC in diverse expression patterns.
  • NK cell receptors KIR, NKG2, etc.
  • cells co-expressing a membrane-type protein that exhibits specific agonistic activity against NKG2A and a membrane-type protein that exhibits specific agonistic activity against inhibitory KIR can avoid attack from NKG2A-positive NK cells, NKG2C-positive NK cells, inhibitory KIR-positive NK cells, and the corresponding activating KIR-positive NK cells.
  • the cells have a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and a polynucleotide encoding a polypeptide that binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells can be introduced into the cells and expressed.
  • polypeptides that have a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells and bind to the inhibitory receptor on the surface of NK cells, and membrane proteins that have a transmembrane domain polynucleotides encoding the amino acid sequences of each domain may be linked and further functionally linked to elements such as a promoter, enhancer, polyadenylation signal, etc.
  • the extracellular linker domain may be present between the polypeptide that binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells and the transmembrane domain by linking the base sequences encoding the amino acid sequences of each domain, inserting them into a vector, and expressing them in host cells.
  • polynucleotides include: Polynucleotides containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a membrane-type protein that exhibits agonistic activity against NKG2A (a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for NKG2A (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in (N-I) above)); Polynucleotides containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a membrane-type protein that exhibits agonistic activity against KIR2DL2 or KIR2DL3 (a membrane-type protein having an extracellular domain and a transmembrane domain that includes a binding site for KIR2DL2 and/or KIR2DL3 (specifically, an scFv including the first and second variable regions described in any of (I) to (XII) above))
  • polynucleotides include polynucleotides
  • a single polynucleotide may encode multiple membrane-type proteins for different inhibitory receptors.
  • the nucleotide sequences encoding each membrane-type protein can be linked with a nucleotide sequence encoding a self-cleaving peptide, which can be cleaved sequentially and expressed on the cell surface as individual membrane-type proteins.
  • a polypeptide having a secretory signal peptide e.g., a CD8-derived signal peptide
  • a polypeptide containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a membrane-type protein having such a signal peptide at the N-terminus may be used as the polynucleotide.
  • the method for introducing the polynucleotide may be any commonly used method, and is not particularly limited.
  • examples of vectors that can be used include, but are not limited to, lentiviral vectors, retroviral vectors, foamy viral vectors, and adeno-associated viral vectors.
  • an expression control element such as an enhancer or promoter is linked to the nucleotide encoding the membrane-type protein, introduced into an expression vector, and cells are transformed with the expression vector to express the membrane-type protein in the cells.
  • an expression control element such as an enhancer or promoter is linked to the nucleotide encoding the membrane-type protein, introduced into an expression vector, and cells are transformed with the expression vector to express the membrane-type protein in the cells.
  • the promoter is not limited, but examples that can be used include viral promoters such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, SV40 virus, and cytomegalovirus, as well as promoters derived from mammalian cells.
  • the method for producing the polypeptide described in 2. above can be applied mutatis mutandis to produce cells that express the membrane-type protein of the present invention.
  • the expression vector may contain a selection marker gene.
  • the selection marker gene can be a known marker gene such as a thymidine kinase gene.
  • the present invention also encompasses DNA encoding the above-mentioned membrane-type proteins, as well as RNA that is a transcription product of the DNA.
  • Genome editing technology may also be used to express the membrane-type protein of the present invention.
  • Genome editing technology can include, but is not limited to, various methods such as CRISPR-Cas, Zinc-Finger, and TaLEN.
  • the method described in WO2018/018534 is a method for producing genetically modified cells using genome editing technology, which can efficiently perform genome editing not only on normal cells but also on pluripotent stem cells such as iPS cells.
  • Cells expressing the above-mentioned membrane-type proteins include cells for allogeneic transplantation for transplantation or cell therapy. These cells are called therapeutic cells.
  • Cells expressing the above-mentioned membrane-type proteins express on their surface a polypeptide that exhibits agonistic activity at inhibitory receptors on the surface of NK cells. When this polypeptide binds to the inhibitory receptor on the surface of NK cells, it transmits an inhibitory signal into the NK cells and suppresses the cytocidal activity of NK cells. As a result, immune rejection during transplantation is suppressed, making the cells less susceptible to immune rejection and reducing the risk of immune rejection.
  • Pluripotent stem cells are used as cells for allogeneic transplantation or cell therapy. These pluripotent stem cells can be used to express the membrane-type protein of the present invention or for useful gene editing, as described above. Other examples include mesenchymal stem cells and primary PBMC (peripheral blood mononuclear cell)-derived T cells, NK cells, and macrophages. Cells collected from these biological tissues can be modified, for example, to knock out HLA or to express NKG2A agonists and/or KIR agonists, thereby suppressing NK activity. Furthermore, mesenchymal cells can be modified to express and secrete useful therapeutic factors, such as cancer treatment factors, and then transplanted.
  • useful therapeutic factors such as cancer treatment factors
  • T cells and NK cells can be modified to have anti-cancer effects, such as CAR-T/NK, and used as therapeutic cells.
  • examples of cells for allogeneic transplantation for transplantation or cell therapy include cardiomyocytes, chondrocytes, retinal cells, liver cells, kidney cells, and pancreatic cells. These cells may be cells collected from a donor, or may be various cells produced by artificially inducing differentiation from pluripotent stem cells. Regardless of the cell type, if a membrane protein capable of binding to an inhibitory receptor on the surface of an NK cell is expressed on the cell surface, it can bind to the inhibitory receptor on the surface of the NK cell, transmit an inhibitory signal into the NK cell, and suppress the cytocidal activity of the NK cell. Furthermore, if the membrane protein has agonist activity specific to the inhibitory receptor on the surface of the NK cell (i.e., it does not exhibit agonist activity at the corresponding activating receptor), it can avoid attack by NK cells expressing the corresponding activating receptor.
  • the cells of the present invention may further have the expression of at least one Class I HLA eliminated or attenuated on the cell surface. It is preferable that the expression of all Class I HLA be eliminated or attenuated.
  • the elimination or attenuation of the expression of at least one Class I HLA on the cell surface may be due to modification of at least one of the Class I HLA, B2M, TAP1, TAP2, and TAPBP regions on the genome by gene editing. Of these, modification of B2M (preferably deletion of B2M) is preferred.
  • the cells of the present invention may be a cell line established from an individual in which HLA expression has been genetically lost.
  • the cells of the present invention may further express both a membrane protein that binds to an inhibitory KIR and a membrane protein that binds to NKG2A on the cell surface.
  • NKG2A (CD159) is a type of inhibitory receptor on the surface of NK cells.
  • HLA-E is an example of a ligand for NKG2A.
  • the membrane-type protein that binds to NKG2A and is expressed in the cells is preferably a membrane-type protein having an scFv in its extracellular domain that exhibits agonist activity against NKG2A but does not exhibit agonist activity against NKG2C.
  • the present invention encompasses a method for producing therapeutic cells with a reduced or suppressed risk of immune rejection in a subject, comprising expressing on the surface of the therapeutic cells a substance that binds to the inhibitory receptor on the surface of the NK cells of the present invention and inhibits the cytocidal activity of the NK cells.
  • CAR-T The present invention includes T cells (CAR-T) that further express a chimeric antigen receptor (CAR) that targets a desired antigen in addition to the above-mentioned membrane-type protein.
  • CAR-T used in the present invention is not limited to a CAR-T that targets a tumor-associated antigen.
  • the CAR-T expresses on its surface a polypeptide comprising a domain that specifically binds to a tumor-associated antigen specific to tumor cells, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
  • the domain that specifically binds to a tumor-associated antigen can be a polypeptide derived from an antibody against the tumor-associated antigen, such as an scFv or a polypeptide linking the Fv regions of an immunoglobulin heavy chain and light chain.
  • the CAR of the CAR-T of the present invention is present on the cell membrane and comprises an extracellular domain that contains a domain that specifically binds to a tumor-associated antigen specific to tumor cells, a transmembrane domain, and an intracellular domain that contains an intracellular signaling domain.
  • the extracellular domain may comprise an extracellular spacer domain, and the intracellular domain may comprise a costimulatory domain.
  • transmembrane domain examples include transmembrane domains such as CD8 ⁇ , CD28, CD3 ⁇ , CD3, and CD4.
  • extracellular spacer domain examples include spacer sequences such as (G4S)3 and the hinge region of IgG1.
  • costimulatory domain examples include CD27, CD28, CD134, CD27, CD2, CD5, CD30, and CD40.
  • intracellular signaling domain examples include human CD3 ⁇ chain, Fc receptor, Fc ⁇ RIII, and Fc ⁇ RI.
  • a polynucleotide encoding the CAR of the present invention can be prepared by linking polynucleotides encoding each of the above domains.
  • a CAR-T of the present invention can be prepared by introducing this polynucleotide and a polynucleotide encoding a polypeptide containing a binding site for an inhibitory KIR of the present invention into T cells.
  • the CAR-T cells of the present invention can be used to treat tumors expressing tumor-associated antigens.
  • the CAR-T cells of the present invention express on their cell surface a polypeptide containing a binding site for an inhibitory receptor on the surface of NK cells, and in addition to having cytocidal activity against target cells, they also have the ability to avoid immune rejection by NK cells.
  • the present invention encompasses pharmaceutical compositions containing the CAR-T cells of the present invention.
  • the present invention encompasses pharmaceutical compositions comprising, as active ingredients, the Substance of the Present Invention that Binds to an Inhibitory Receptor on the Surface of NK Cells and Inhibits the Cytocidal Activity of NK Cells, and cells Expressing on Their Surface a Substance That Binds to an Inhibitory Receptor on the Surface of NK Cells and Inhibits the Cytocidal Activity of NK Cells.
  • Examples of such cells include cells expressing on their surface a polypeptide that is a membrane-type protein having an extracellular domain containing an NKG2A-binding site and a transmembrane domain, wherein the polypeptide (1) binds to NKG2A on the surface of NK cells and inhibits the NK cells, and (2) has substantially no agonistic activity against NKG2C, further expresses a membrane-type protein that exhibits specific agonistic activity against an inhibitory KIR, and further has lost or attenuated expression of at least one Class I HLA on its cell surface.
  • a polypeptide that is a membrane-type protein having an extracellular domain containing an NKG2A-binding site and a transmembrane domain
  • the polypeptide (1) binds to NKG2A on the surface of NK cells and inhibits the NK cells, and (2) has substantially no agonistic activity against NKG2C, further expresses a membrane-type protein that exhibits specific agonistic activity against an inhibitory KIR, and
  • the pharmaceutical composition can be used as an agent to suppress immune rejection during organ or therapeutic cell transplantation. Specifically, it can be used to suppress rejection during allogeneic transplantation of kidneys, pancreatic islets, etc., to prevent and treat GVHD (graft-versus-host disease), and to suppress rejection during allogeneic transplantation of regenerative therapy cells. It can also be used for xenogeneic organ transplantation, such as transplantation of organs derived from genetically modified pigs into humans.
  • the pharmaceutical composition is also referred to as an immune rejection suppressant or transplant rejection suppressant.
  • Cells expressing on their surface a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells can be used as therapeutic cells to suppress immune rejection in a subject to whom the cells are administered or transplanted. These therapeutic cells can be used as a pharmaceutical composition for transplantation.
  • the present invention encompasses a method for suppressing immune rejection in a subject to be treated, comprising administering or transplanting to a subject in need of a transplant a substance of the present invention that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells, or cells on the cell surface of which a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells is expressed.
  • the present invention encompasses a method for suppressing immune rejection in a subject to be treated, comprising expressing on the surface of therapeutic cells a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells of the present invention and inhibits the cytocidal activity of NK cells.
  • Such a method includes, for example, expressing on the cell surface a polypeptide that is a membrane-type protein having an extracellular domain containing an NKG2A-binding site and a transmembrane domain, the polypeptide (1) having activity to bind to NKG2A on the surface of NK cells and inhibit the NK cells, and (2) having substantially no agonist activity against NKG2C; further expressing a membrane-type protein that exhibits specific agonist activity against an inhibitory KIR; and further modifying the genes of the cells so that expression of at least one Class I HLA on the cell surface is eliminated or attenuated.
  • This method is also a method for producing cells that will suppress immune rejection in a subject to be treated when transplanted.
  • this method also involves expressing on the surface of therapeutic cells a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of the NK cells of the present invention and inhibits the cytocidal activity of the NK cells, thereby suppressing immune rejection in a subject when the therapeutic cells are administered to the subject.
  • the patient to be treated has an HLA type that is a ligand for the inhibitory receptor on the surface of the target NK cell.
  • an agonist substance for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 or cells expressing such an agonist substance on their cell surface it exerts an immunosuppressive effect or immune rejection avoidance effect on patients who are HLA-C1 homozygous.
  • an agonist substance for inhibitory KIR2DL1 or cells expressing such an agonist substance on their cell surface it exerts an immunosuppressive effect or immune rejection avoidance effect on patients who are HLA-C2 homozygous.
  • HLA-Bw4-negative patients treatment appropriate to the HLA-C genotype described above can be performed, but for HLA-Bw4-positive patients, an agonist substance for KIR3DL1 can be administered in addition to the treatment, or cells expressing the combination on the cell surface can be used to exert an immunosuppressive effect or avoid immune rejection.
  • an agonist substance for NKG2A or cells expressing such an agonist substance on the cell surface when used, they exert an immunosuppressive effect or an immune rejection avoidance effect on patients with NKG2A-positive NK cells.
  • an agonist substance for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and an agonist substance for NKG2A are used in combination, or when cells expressing a combination of these two types of agonist substances on the cell surface are used, they exert an additive immunosuppressive effect or an immune rejection avoidance effect on HLA-C1 homozygous patients compared to when an agonist substance for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 is used alone.
  • an additive immunosuppressive effect or immune rejection avoidance effect is exerted in HLA-C2 homozygous patients compared to when an agonist substance for inhibitory KIR2DL1 is used alone.
  • an agonist substance for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 an agonist substance for inhibitory KIR2DL1, and an agonist substance for NKG2A are used in combination, or when cells expressing these three types of agonist substances on the cell surface are used in combination
  • an agonist substance for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and an agonist substance for inhibitory KIR2DL1 are used in combination, or when cells expressing these two types of agonist substances on the cell surface are used in combination
  • an additive immunosuppressive effect or immune rejection avoidance effect is exerted in patients with all HLA-C genotypes (HLA-C1 homozygous, HLA-C2 homozygous, and HLA-C1/C2 heterozygous).
  • immunosuppressive effects or immune rejection avoidance effects can be achieved by administering an agonist substance for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3, an agonist substance for inhibitory KIR2DL1, in addition to an agonist substance for KIR3DL1, or by using cells in which this combination is expressed on the cell surface.
  • an agonist substance for NKG2A in addition to these three types of agonist substances, or by using cells in which this combination is expressed on the cell surface, additive immunosuppressive effects or immune rejection avoidance effects can be achieved.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a therapeutically effective amount of a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells, or a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells, or cells on whose surface a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells is expressed, as well as pharmaceutically acceptable carriers, diluents, solubilizers, emulsifiers, preservatives, adjuvants, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by injection, for example, via local injection, intraperitoneal administration, selective intravenous injection, intravenous injection, subcutaneous injection, organ perfusion injection, etc.
  • injectable solutions may also be formulated using carriers such as salt solutions, glucose solutions, mixtures of salt water and glucose solutions, and various buffer solutions.
  • the composition may be formulated in powder form, which can be mixed with the liquid carrier at the time of use to prepare an injectable solution.
  • oral administration can be performed in the form of oral liquids, powders, pills, capsules, and tablets.
  • Oral liquid preparations such as suspensions and syrups, can be manufactured using water, sugars such as sucrose, sorbitol, and fructose, glycols such as polyethylene glycol, oils such as sesame oil and soybean oil, preservatives such as alkyl parahydroxybenzoates, and flavors such as strawberry flavor and peppermint.
  • Powders, pills, capsules, and tablets can be formulated using excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, and gelatin, surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as glycerin. Tablets and capsules are preferred unit dosage forms for the compositions of this invention due to their ease of administration. When producing tablets or capsules, solid manufacturing carriers are used.
  • the effective therapeutic amount of a substance that binds to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibits the cytocidal activity of NK cells varies depending on the patient's age and condition, and is ultimately determined by the physician. For example, it is 0.0001 mg to 100 mg per kg of body weight per dose.
  • the prescribed dose may be administered once every 1 to 180 days, or may be administered in divided doses two, three, four or more times per day at appropriate intervals.
  • the dosage of substances that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibit the cytocidal activity of NK cells, and cells expressing on their surface substances that bind to inhibitory receptors on the surface of NK cells and inhibit the cytocidal activity of NK cells, can be determined appropriately depending on the type of cells to be transplanted, etc.
  • the present invention encompasses a method for evaluating the activity of a test substance to suppress the cytocidal activity of NK cells mediated by inhibitory receptors on the surface of NK cells, i.e., the immune rejection avoidance activity.
  • test substance is a substance that binds to an inhibitory receptor on the surface of any NK cell and has the activity of inhibiting the cytocidal activity of the NK cell, and examples of such substances include those listed in 1 above.
  • the method comprises the following steps: (A) contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous in the presence of a test substance that binds to KIR (wherein the Bw4 phenotype of the donor of the NK cells is the same as that of the donor of the target cells); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • the inhibitory KIR may include the following steps: (A) contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous in the presence of a test substance that binds to KIR2DL2 or KIR2DL3 (wherein the NK cell donor and the target cell donor have the same phenotype of Bw4 motif-containing HLA); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • step A contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous in the presence of a test substance that binds to KIR2DL1 (wherein the NK cell donor and the target cell donor have the same phenotype of Bw4 motif-containing HLA);
  • step B A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • step A contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-Bw4 type is positive/homopositive or heteropositive/negative with target cells derived from a subject whose HLA-Bw4 type is negative/homonegative in the presence of a test substance that binds to KIR3DL1 (wherein the HLA-C type phenotype of the NK cell donor and that of the target cell donor are identical); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • step A contacting in vitro NK cells derived from a subject whose HLA-A type is A3 or A11 positive/homopositive or heteropositive/negative with target cells derived from a subject whose HLA-A type is A3 or A11 negative/homonegative in the presence of a test substance that binds to KIR3DL2 (wherein the HLA-C and Bw4 phenotypes of the donor of the NK cells and the donor of the target cells are identical); (B) A step of measuring the number of surviving target cells after step A.
  • NK cells for example, derived from peripheral blood
  • T cells for example, derived from peripheral blood
  • NK cells have a property known as "missing-self,” in that they recognize their own HLA types (C1, C2, Bw4) and exhibit cytocidal activity against target cells.
  • NK cells collected from an HLA-C1/C1 homozygous individual will recognize C1 as self, and therefore, unless the target cells possess C1-type HLA-C, signals will not enter the NK cells via inhibitory KIR, resulting in cytocidal activity.
  • the target cells possess C1 type, they will not exhibit cytocidal activity, and if a substance (agonist binder) that binds to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3, which are substitutes for C1 type, and inhibits the cytocidal activity of NK cells, is expressed, cytocidal activity can be reduced.
  • NK cells used in the above evaluation method can be isolated from PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) of humans with a homozygous HLA-C type of C1/C1 using CD56 positivity as an indicator. For example, they can be isolated using CD56 microbeads or flow cytometry. NK cells isolated in this way have activated KIR2DL2 and KIR2DL3.
  • Target cells derived from subjects with a homozygous HLA-C type of C2/C2 can be T cells, which can be isolated from PBMCs of humans with a homozygous HLA-C type of C2/C2 using CD3 positivity as an indicator. Because these target cells do not express C1 type HLA, NK cells derived from the above-mentioned subjects with a homozygous HLA-C type of C1/C1 exhibit cytocidal activity.
  • NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous are contacted as effector cells with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous, the target cells are killed by the effector cells.
  • the substance that binds to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and inhibits the cytocidal activity of NK cells is present, the substance will bind to KIR2DL2 and/or KIR2DL3 on NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous, inhibiting the cytocidal activity of the NK cells.
  • the cytocidal activity of the effector cells is reduced and the target cells are not killed. Therefore, by contacting NK cells derived from a subject whose HLA-C type is C1/C1 homozygous with target cells derived from a subject whose HLA-C type is C2/C2 homozygous in the presence of a test substance that binds to KIR2DL2 and/or KIR2DL3, and then measuring the viability of the target cells, the immune rejection avoidance activity of the test substance, which inhibits the cytocidal activity of NK cells against inhibitory KIR, can be evaluated.
  • the test substance can be determined to have immune rejection evasion activity.
  • the present invention encompasses a method for screening for substances with immune rejection evasion activity, which includes a step of selecting test substances with high target cell survival in step B as substances with immune rejection evasion activity.
  • the test substance may be present on the surface of the target cell in the form of a membrane protein 1 (2) expressed thereon.
  • Lenti-X 293T cell line (Takara Bio, 632180) was cultured to confluence in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Thermo Fisher Scientific, 10566-016) containing 10 (v/v)% fetal bovine serum (FBS). On the day of transfection, the cells were detached using trypsin (Thermo Fisher Scientific, 12563029) and reseeded in a T-flask.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the above-mentioned lentivirus production plasmid vector, Lentiviral High Titer Packaging Mix (Takara Bio, 6194), and TransIT-293 Transfection Reagent (Takara Bio, MIR2704) were mixed with Opti-MEM I Reduced Serum Media (Thermo Fisher Scientific, 31985070). After incubation, the mixture was added to the Lenti-X 293T cell line. The next day, the medium was replaced with DMEM medium containing 10 (v/v)% FBS, and the cells were cultured for 24 hours, after which the supernatant was collected.
  • the supernatant was aspirated, and the pellet was dissolved in 5 (v/v)% FBS-containing AIM-V medium (Thermo Fisher Scientific, 12055083) (hereinafter referred to as "basal medium”) and frozen and stored at -80°C or -150°C as a lentivirus concentrate.
  • NK92 cells were obtained from ATCC (Cat. No. CRL-2407 TM ) and were used as effector cells for the initial evaluation system by expressing various KIRs. The cells were cultured in MyeloCult H5100 medium (STEMCELL Technologies, ST-05150) supplemented with 500 IU/mL (100-2000) of IL-2 and streptmycin/penicillin at 37°C in 5% CO2 .
  • KIR2DL2 * 003 was used as KIR2DL2.
  • Retronectin (Takara Bio, T100B) was diluted with PBS (phosphate buffered saline) to 20-100 ⁇ g/mL and added to a non-treatment dish. After leaving the dish to stand for 2 hours at room temperature or overnight at 4°C, the dish was washed with PBS to prepare a coated plate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • NK92 cells were suspended in Myelocult H5100 medium at 1-2 x 10 cells/mL.
  • the lentivirus concentrate incorporating inhibitory KIR and activating KIR genes and the NK cell suspension were mixed in a RetroNectin-coated plate and centrifuged at 1000 x g at 32°C for 1 hour.
  • the cells were then cultured at 37°C in 5% CO2 . Starting after 3 days of culture, the entire medium was replaced with Myelocult H5100 medium every 1-3 days. After 1 week of culture, only positive cells were selected using an APC-labeled anti-Flag antibody or an APC-labeled anti-NGFR antibody, and anti-APC Microbeads (Miltenyi: 130-090-855).
  • the expression of the introduced KIR was confirmed using commercially available anti-KIR2DS1, anti-KIR2DL2/3/2DS2, and anti-KIR2DS4 antibodies. If necessary, the collected cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) at 0.5-1 x 10 cells/mL and cryopreserved at -80°C or -150°C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in NK cell culture medium before use.
  • the above fluorescently labeled antibody was suspended in autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer (Miltenyi Biotec, 130-091-221) at a concentration of 1-10 ⁇ g/mL, then added to the cells and incubated at 4°C for 30 minutes.
  • the antibody-stained cells were suspended in FACS buffer containing 1-10 ⁇ g/mL of 7-aminoactinomycin D (7-AAD; WAKO, 016-25241) and analyzed using a flow cytometer (Miltenyi biotec, MACSQuant Analyzer 10, 130-096-343). After extracting the FCS file, cell fractions were selected on an FSC/SSC plot using FLOW JO software (FLOWJO LLC, VER. 10.7.1), and 7-aminoactinomycin D-negative/target-positive cell groups were counted as live cells.
  • FLOW JO software FLOWJO LLC, VER. 10.7.1
  • Example 1 Lirilumab inhibits the cytocidal activity of K562 by NK92-expressing KIR2DL2 cell line
  • An evaluation system was constructed in which the cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK cell line is attenuated by HLA recognition by KIR2DL2, and further, an evaluation was conducted to determine whether agonist activity of KIR2DL2-expressing cell line is present when an existing anti-KIR antibody is added in a soluble form.
  • K562 cells were obtained from ATCC (CCL-243 TM ) and used as target cells for the initial evaluation system. They were cultured in RPMI 1640 Medium, GlutaMAX (Life Technologies, 61870036) (hereinafter referred to as "RPMI medium”) supplemented with 10 (v/v)% FCS and streptmycin/penicillin.
  • HLA-Cw3-expressing K562 cell line HLA-Cw3-Luc-K562 cell line
  • an artificial gene encoding a polypeptide linked in order from the N-terminus: luciferase (SEQ ID NO: 17), self-cleaving peptide T2A (SEQ ID NO: 20), human HLA-Cw3-derived signal peptide (SEQ ID NO: 21), and human HLA-Cw3 peptide (SEQ ID NO: 22) was introduced into the K562 cell line using CRISPR/CAS9.
  • luciferase activity was confirmed and clones were selected.
  • HLA-Cw3-K562 cell line expression was confirmed using anti-HLA-ABC, and after cloning, clones were selected based on luciferase activity and anti-HLA-ABC staining intensity.
  • the collected cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and cryopreserved at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in RPMI medium before use.
  • KIR2DL2 * 001 was used as KIR2DL2.
  • the day before the cytocidal activity assessment the KIR2DL2-NK92 cell line was stimulated with 500 IU/mL of IL-2 and added to a 96-well plate at 5 x 10 cells .
  • the anti-KIR antibody Lirilumab (1-7F9, Human IgG4) was added separately to the mixed wells of the KIR2DL2-NK92 cell line and Luc-K562 cells at four 9-fold dilutions starting from 2 ⁇ g/mL.
  • As a lirilumab control cells were treated with 2 ⁇ g/mL of human IgG4 (GeneTex, GTX63305) in the same manner. All cultures were performed using basal medium. After 3 hours, the cytotoxic activity was evaluated by expressing the luciferase activity in the K562 cell line as the number of remaining target cells, assuming the number of target cells in wells without KIR2DL2-NK92 cells to be 100%.
  • the results are shown in Figure 1-1.
  • the KIR2DL2-NK92 cell line exhibited cytocidal activity against the K562 cell line, but its cytocidal activity was attenuated against the HLA-Cw3-K562 cell line. This is thought to be because KIR2DL2, which recognized HLA-Cw3, suppressed the cytocidal activity of the KIR2DL2-NK92 cell line by transmitting an inhibitory signal to the KIR2DL2-NK92 cell line, thereby establishing an evaluation system that demonstrates the missing self of KIR2DL2.
  • lirilumab neutralizes the inhibitory signaling induced by KIR ligands, enhancing NK cell activation, thereby inhibiting the agonistic effect of HLA ligands on inhibitory KIR.
  • Lirilumab neutralizes the ligand's activity and enhances the cytotoxic activity of NK cells.
  • Lirilumab functions as a partial agonist that exhibits agonistic activity against inhibitory KIR.
  • Example 2 Inhibition of inhibitory KIR-dependent NK cell line activity by expression of scFv of Lirilumab and Pan2D
  • an agonist binder of an inhibitory receptor is made to act as a secreted protein as an allogeneic technology, there is a possibility that it may affect the immune system around the target tissue and even within the body. Therefore, we aimed to achieve local immune tolerance by expressing the agonist binder on the surface of the transplanted cells so that only the cells desired to evade the immune system would be immune tolerant.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 regions in the table are indicated by the range of amino acid numbers in the amino acid sequence of each variable region.
  • the amino acid numbers are specified according to the IMGT definition.
  • Retronectin (Takara Bio, T100B) was diluted with PBS (phosphate buffered saline) to 20-100 ⁇ g/mL and added to a non-treatment dish. After leaving the dish at room temperature for 2 hours or overnight at 4°C, the dish was washed with PBS to prepare a coated plate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • K562 cell lines were suspended in RPMI medium to a concentration of 1-2 x 10 cells/mL, and the lentivirus concentrate carrying the Lirilumab scFv-Luc or Pan2D scFv-Luc gene and the cells were mixed in a RetroNectin-coated plate and centrifuged at 1000 x g for 1 hour. From 3 days into culture, the entire medium was replaced with RPMI medium every 1-3 days, and after 1 week of culture, only positive cells were selected using an APC-labeled anti-Flag antibody and anti-APC Microbeads (Miltenyi Biotec, 130-090-855).
  • the collected cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and cryopreserved at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in RPMI medium before use.
  • KIR2DL2 * 001 was used as KIR2DL2.
  • the KIR2DL2-NK92 cell line stimulated with 500 IU/mL of IL-2 was added to a 96-well plate, and the Luc-K562 cell line, HLA-Cw3-Luc-K562 cell line, Lirilumab-scFv-K562 cell line, and Pan2D-scFv-K562 were added to separate wells at a ratio of NK92 to K562 cells of 3:1 or 1:1, and further cultured. Basal medium was used for all cultures.
  • the luciferase activity expressed by the K562 cell line was measured, and the luciferase activity in the wells containing KIR2DL2-NK92 cells was expressed as the number of remaining target cells, with the luciferase activity in the wells containing KIR2DL2-NK92 cells taken as 100%. Furthermore, the value obtained by subtracting the luciferase activity in the wells containing KIR2DL2-NK92 cells from the luciferase activity in the wells containing KIR2DL2-NK92 cells was expressed as the cell killing activity.
  • a ONE-GloTM Luciferase Assay System (PROMEGA, E6120) was used to measure luciferase activity.
  • the KIR2DL2-NK92 cell line exhibited cytocidal activity against the K562 cell line, but its cytocidal activity was attenuated against the HLA-Cw3-K562 cell line. Furthermore, Lirilumab-scFv-K562 and Pan2D-scFv-K562 had attenuated cytocidal activity compared to the K562 cell line.
  • Example 3 Lirilumab and Pan2D induce cytocidal activity of NK cells via activating KIRs
  • lirilumab and Pan2D exhibit agonistic activity not only against KIR2DL2 but also against other inhibitory KIRs and activating KIRs with which they show cross-reactivity.
  • the cytotoxic activity sensitivity of Lirilumab or Pan2D-scFv-K562 was evaluated using various KIR-expressing NK92 cell lines under the same evaluation conditions as in Example 2.
  • the activity ratio was calculated using the following formula.
  • the activity of the Luc-K562 line was set to 1, and the ratio was calculated.
  • KIR2DL2 * 001 was used as KIR2DL2.
  • Pan2D-scFv-K562 enhanced the activity of the KIR2DS1-NK92 cell line, KIR2DS2-NK92 cell line, and KIR2DS4-NK92 cell line, confirming that it exhibited agonist activity against the active forms of KIR2DS1/2/4.
  • Example 4 Obtaining KIR2DL2 and/or KIR2DL3-specific binders by phage panning Based on the results of Example 3, we aimed to obtain a novel binder that does not activate activating receptors but exhibits agonist activity to inhibitory receptors. We obtained an inhibitory KIR-specific binder that does not bind to activating KIRs by the following method.
  • Phage panning was performed using a human antibody phage library to obtain specific binders that bind to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 but do not bind to activating KIR2DS1, 2, and 4.
  • the soluble KIRs shown in Table 8 were prepared.
  • recombinant proteins were prepared by linking, from the N-terminus, an IL-2-derived signal peptide (SEQ ID NO: 91), the extracellular domain of each KIR protein listed in Table 7, a GGGS linker (SEQ ID NO: 97), an IgG Fc domain (SEQ ID NO: 98), a GAA linker, and an Avi tag (SEQ ID NO: 99).
  • soluble KIRs corresponding to each KIR listed in Table 7 were used, with or without biotinylation.
  • Recombinant Human KIR2DL3/CD158b2 Fc Chimera Protein R&D Systems, 2014-KR-050 was used as soluble KIR2DL3.
  • positive selection refers to the process of reacting a biotinylated recombinant protein with an scFv-expressing phage library solution and enriching the scFv-expressing phage that bind to the biotinylated recombinant protein using streptavidin or neutravidin beads.
  • depletion refers to the process of reacting a biotinylated recombinant protein with an scFv-expressing phage library solution and eliminating the scFv-expressing phage that bind to the biotinylated recombinant protein using streptavidin or neutravidin beads.
  • deselection refers to the process in which non-biotinylated recombinant protein is added during the reaction process between biotinylated recombinant protein and scFv-expressing phage library solution during positive selection, so that when scFv-expressing phages that bind to the biotinylated recombinant protein are concentrated using Streptavidin or Neutravidin Beads, scFv-expressing phages that do not bind to the added non-biotinylated recombinant protein but specifically bind to the biotinylated recombinant protein are more easily concentrated.
  • ELISA was performed using human KIR2DL2 (22-245)-Fc-Avi (the soluble KIR2DL2 described above), and scFv-expressing phages that bind to KIR2DL2 were selected from a polyclonal phage library.
  • the scFv sequence from the phagemid of the selected scFv-expressing phage was transferred to a recombinant protein expression vector for E. coli, which was then introduced into E. coli, and each scFv was prepared from the culture supernatant.
  • variable regions of scFvs that bind to KIR2DL2 and/or KIR2DL3 but not KIR2DS1, KIR2DS2, or KIR2DS4 were introduced into the membrane-type scFv expression format described in the section "ScFv gene transduction and preparation into K-562 cells" and inserted into pLVSIN EF1 ⁇ .
  • lentivirus was produced according to the method described in the section "Lentivirus preparation.” Using the produced lentivirus, K562 cell lines expressing each scFv as membrane-type scFv were created according to the method described in the section "ScFv gene transduction and preparation into K-562 cells.”
  • an Fc-conjugated recombinant protein shown in Table 7 or Recombinant Human KIR2DL3/CD158b2 Fc Chimera Protein (R&D Systems, 2014-KIR-050) was added at 0.1 ⁇ M, and the cells were incubated at 4 °C for 90 minutes.
  • the target cells were washed with PBS, and an APC-labeled anti-human IgG Fc antibody (BIOLEGEND, 409306) was added and allowed to react at 4°C for 30 minutes. After washing twice with PBS, binding was confirmed using flow cytometry. Binding to the K562 cell line (median APC-derived fluorescence intensity) was set to 1, and the ratio was calculated.
  • APC-labeled anti-human IgG Fc antibody BIOLEGEND, 409306
  • Lirilumab and Pan2D showed binding to recombinant KIR2DS1, 2 or 4, whereas all 12 binders suppressed binding to recombinant KIR2DS1, 2 or 4 and showed binding to recombinant KIR2DL2 and KIR2DL3.
  • Example 5 Evaluation of agonist activity of KIR2DL2 and/or KIR2DL3-specific binders (initial evaluation) The agonistic activity of the binders whose specificity was ensured in Example 4 was evaluated. These binders were inserted into pLVSIN EF1 ⁇ as genes encoding other polypeptides in the following constructs, in which membrane-type scFv and lucoferase were linked, according to the method described in the section [Preparation of lentivirus], to produce lentiviruses.
  • the amino acid sequence numbers for the heavy chain variable region and light chain variable region of each binder are shown in Table 8 below.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 regions in the table are indicated by the range of amino acid numbers in the amino acid sequence of each variable region.
  • the amino acid numbers are specified according to the IMGT definition.
  • the cytotoxic activity sensitivity of each binder to membrane-type scFv-K562 was evaluated using various KIR-expressing NK92 cell lines under the same evaluation conditions as in Examples 2 and 4.
  • the activity ratio was calculated using the following formula.
  • the activity of the Luc-K562 line was set to 1, and the ratio was calculated.
  • Example 6 Evaluation of agonist activity of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binders using primary NK cells
  • NK92 cell line has been used as an effector, and inhibitory and activating KIRs have been introduced.
  • agonist activity was evaluated using NK cells collected from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • NK cells have a property known as "missing-self,” in that they recognize their own HLA type (C1, C2, Bw4) and exhibit cytocidal activity against target cells.
  • NK cells collected from an HLA-C1/C1 homozygous individual will recognize C1 as self, and therefore, unless the target cells possess HLA-C of the C1 type, inhibitory signals will not enter the NK cells via inhibitory receptors, resulting in cytocidal activity.
  • the target cells possess the C1 type they will not exhibit cytocidal activity, and if an agonist binder that substitutes for the C1 type is expressed, cytocidal activity can be reduced.
  • KIR2DL2 and KIR2DL3 function as missing-self inhibitory receptors in HLA-C1 homozygous cells, KIR2DL1 in HLA-C2 homozygous cells, and KIR3DL1 in HLA-Bw4 positive cells, so agonists for these KIRs can be evaluated.
  • PBMC-derived NK cells Two types of HLA-C1/C1/Bw4-negative PBMCs were prepared as effector cells (PBMC-A and PBMC-B). Based on the KIR haplotype, PBMC-A was found to have the KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, and KIR2DS2 genes, while PBMC-B had the KIR2DL3 gene.
  • Anti-CD16 antibody (Biolegend, 302050) was diluted with PBS to 5 ⁇ g/mL and added to a non-treatment dish. After leaving the dish to stand for 2 hours at room temperature or overnight at 4°C, the dish was washed with PBS, and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs; Cellular Technology Limited, CTL-UP1) suspended in MyeloCult H5100 medium (hereinafter referred to as "NK medium") containing IL-2 and IL-18 (R&D systems, 9124-IL) at concentrations of 1000 U/mL and 100 ng/mL, respectively, were added. After 7 to 10 days, the cells were collected and CD56-positive cells (NK cells) were purified using CD56 MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-050-401). Culture was then continued again in Myelocult containing IL-2/18.
  • PBMCs Human peripheral blood mononuclear cells
  • IL-2 and IL-18 R&D systems, 9124-
  • PBMC-A the same as the effector
  • PBMC-C HLA-C2/C2/Bw4-negative PBMCs
  • Anti-CD3 antibody Biolegend, 317347
  • RetroNectin RetroNectin
  • PBS phosphate buffered saline
  • the dish was washed with PBS to prepare a coated plate (hereafter referred to as a "CD3 Ab/RetroNectin coated plate").
  • a lentivirus solution was prepared for expressing the membrane-type scFv of the 10 binders used in Example 5.
  • an artificial gene containing a polypeptide linking human CD19 polypeptide sequence number 53
  • self-cleaving peptide T2A sequence number 20
  • Firefly Luciferase sequence number 17
  • a virus-binding plate was prepared by adding the virus concentrate to the plate and centrifuging at 2000 ⁇ g for 2 hours.
  • Human peripheral blood mononuclear cells PBMCs; CTL-UP1, Cellular Technology Limited
  • IL-2 medium a basal medium
  • IL-2 IL-2
  • PBMC-A were infected with human CD19-luciferase
  • PBMC-C were infected with lentivirus containing human CD19-luciferase or membrane-bound scFv-luciferase of 10 different binders. Starting after three days of culture, the entire medium was replaced with IL-2 medium every one to three days. After one week of culture, cells were sorted using APC-labeled anti-CD19 antibody, APC-labeled anti-Flag antibody, and anti-APC Microbeads (Miltenyi, 130-090-855) to enrich for positive cells.
  • PBMC-derived NK cells to be evaluated for cytotoxic activity were added to a 96-well plate at 1 x 10 cells , and 1/10 the amount (i.e., 1 x 10 cells ) of target gene-expressing T cells was added to each well separately and further cultured. Basal medium was used for all cultures. After 4 hours, the cytotoxic activity was evaluated by expressing the luciferase activity of the target gene-expressing T cells as the number of remaining target cells, relative to the number of target cells in wells without PBMC-derived NK cells, which was set at 100%.
  • Example 7 Evaluation of binding ability of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binders The binders confirmed to have agonist activity in Example 6 were evaluated for their binding ability to inhibitory and activating molecules on the surface of NK cells. Pan2D was used as a control.
  • the recombinant proteins shown in Table 10 were used.
  • the recombinant proteins marked "In house” were the same as those listed in Table 7.
  • a recombinant KIR protein was produced as Fc-His-Avi, linking an IgG Fc domain (sequence number 98), a GAA linker, and an Avi tag (sequence number 99) from the N-terminus.
  • Pan2D showed binding to KIR2DS1, 2, and 4, whereas binder (a2DL2/3-DS4) and binder (a2DL2/3-DS10) not only did not show binding to KIR2DS1, 2, and 4, but also did not show binding to other inhibitory or activating receptors.
  • Example 8 Evaluation of agonist activity of KIR2DL1 binders and KIR3DL1 binders Whether binders that exhibit binding affinity to KIR2DL1 and KIR3DL1 exhibit agonist activity against NK cell lines expressing each receptor was evaluated.
  • the sequence of the anti-3DL1 antibody was taken from WO2018/148223 A1, and the polypeptides were linked using the following construct. This was then inserted into pLVSIN EF1 ⁇ according to the method described in the "Preparation of lentivirus" section to produce a lentivirus.
  • the CDR1, CDR2, and CDR3 regions in the table are indicated by the range of amino acid numbers in the amino acid sequence of each variable region.
  • the amino acid numbers are specified according to the IMGT definition.
  • Retronectin (Takara Bio, T100B) was diluted with PBS (phosphate buffered saline) to 20-100 ⁇ g/mL and added to a non-treatment dish. After leaving the dish to stand for 2 hours at room temperature or overnight at 4°C, the dish was washed with PBS to prepare a coated plate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • K562 cells were suspended in PRMI medium at 1-2 x 10 cells/mL.
  • the lentivirus concentrate carrying HLA or binder membrane-type scFv and the NK cell suspension were mixed in a RetroNectin-coated plate and centrifuged at 1000 x g at 32°C for 1 hour.
  • the cells were then cultured at 37°C in 5% CO2 . From 3 days into culture, the entire medium was replaced with PRMI medium every 1-3 days, and after 1 week of culture, only positive cells were selected using an APC-labeled anti-Flag antibody and anti-APC Microbeads (Miltenyi: 130-090-855).
  • the collected cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and cryopreserved at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in RPMI medium before use.
  • Pan2D which exhibits binding to KIR2DL1
  • Pan2D-scFv-K562 cell line described in Example 2 was used.
  • HLA-Cw4 The positive control, HLA-Cw4, exhibited agonistic activity against the KIR2DL1-NK92 cell line.
  • Pan2D exhibited agonistic activity against KIR2DL1
  • a3DL1-DS1 exhibited agonistic activity against KIR3DL1.
  • PBMC-derived NK cells were used as primary NK cells, and CAR-T cells prepared from the same PBMCs as the PBMC-derived NK cells, or CAR-T cells prepared from PBMCs derived from a different donor, were co-cultured with the PBMC-derived NK cells to evaluate the cytocidal activity of the CAR-T cells against target cells.
  • CAR-T cells derived from a different donor that do not express HLA that matches the inhibitory KIR of the primary NK cells are recognized by the primary NK cells as missing-self and become targets of attack.
  • Example 6 it was confirmed that the binders identified in Example 4 also exhibited agonist activity against primary NK cells and inhibited the cytocidal activity of primary NK cells.
  • PBMC-derived NK cells were used as primary NK cells, and three types of cells were mixed: PBMC-derived NK cells, CAR-T cells derived from a donor different from the PBMC-derived NK cells, or CAR-T cells derived from a donor different from the PBMC-derived NK cells expressing the binders identified in Example 4, and CAR-T cells exhibiting cytocidal activity via CAR, and the cytocidal activity of the CAR-T cells against target cells was evaluated.
  • PBMC-A-derived NK cells were prepared according to the method described in the section "Preparation of PBMC-derived NK cells," suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) and stored frozen at -80°C or -150°C. Two days before the test, the cells were thawed and cultured in MyeloCult H5100 medium supplemented with IL-2 and IL-18. The day before the test, the medium for PBMC-A-derived NK cells was replaced with MyeloCult H5100 medium without IL-2 or IL-18, and the cells were cultured.
  • PBMC-C HLA-C2/C2/Bw4-negative PBMCs
  • CD19CAR a CD8-derived signal peptide
  • SEQ ID NO: 23 a CD8-derived signal peptide
  • CD19CAR V an artificial gene encoding L (SEQ ID NO: 100), GS (G4S) linker (SEQ ID NO: 25), CD19CAR VH (SEQ ID NO: 101), CD8-derived hinge region sequence (SEQ ID NO: 26), CD8-derived cell membrane domain for CAR (SEQ ID NO: 102), intracellular costimulatory molecule (SEQ ID NO: 103), linker (GSG), self-cleaving peptide T2A (SEQ ID NO: 20), and blue fluorescent protein (BFP) (SEQ ID NO: 104) was inserted into pLV
  • a lentivirus concentrate carrying the membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv was prepared by the method described in the "Preparation of lentivirus" section using the plasmid prepared in Example 4.
  • NGFR-Luc a gene encoding a polypeptide arranged in the following order from the N-terminus: NGFR peptide (SEQ ID NO: 58), self-cleaving peptide T2A (SEQ ID NO: 20), and Firefly luciferase (SEQ ID NO: 17) (hereinafter referred to as "NGFR-Luc") was used as an artificial gene, and a concentrated NGFR-Luc-carrying lentivirus solution was prepared using a similar method.
  • PBMs were cultured in AIM V Medium (Thermo Fisher Scientific, 12055-083) supplemented with IL-2 (Nipro, 87-890), 5 (v/v)% FCS (Thermo Fisher Scientific, 10270-106), and Strepmycin/Penicillin (Thermo Fisher Scientific, 15240-062) (hereinafter referred to as "IL-2 medium").
  • IL-2 medium AIM V Medium (Thermo Fisher Scientific, 12055-083) supplemented with IL-2 (Nipro, 87-890), 5 (v/v)% FCS (Thermo Fisher Scientific, 10270-106), and Strepmycin/Penicillin (Thermo Fisher Scientific, 15240-062)
  • C-C were suspended and mixed with the prepared lentivirus concentrate (four conditions: NGFR-Luc-carrying lentivirus alone, membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv-carrying lentivirus alone, CD19CAR-carrying lentivirus alone, or a mixture of CD19CAR-carrying lentivirus and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv-carrying lentivirus), and added to the CD3 Ab/RetroNectin-coated plate described in the [Preparation of target gene-expressing T cells] section. Centrifuged for 1 hour. The following day, the same virus concentrate as the previous day was added to each well, and the plate was centrifuged for 1 hour.
  • PBMC-Cs were infected with membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv-carrying lentivirus or a mixture of CD19CAR-carrying lentivirus and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv-carrying lentivirus.
  • Membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv-positive cells were enriched using an APC-labeled anti-Flag antibody and anti-APC Microbeads (Miltenyi Biotec, 130-090-855).
  • PBMC-Cs infected with NGFR-Luc-carrying lentivirus were enriched for NGFR-positive cells using anti-LNGFR Microbeads (Miltenyi Biotec, 130-099-023). This procedure yielded PBMC-C-derived T cells expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv. Furthermore, PBMC-C-derived T cells infected with a mixture of CAR-carrying lentivirus and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv-carrying lentivirus contained a mixture of cells expressing both, cells expressing only one of the two, and cells expressing neither.
  • PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv were also obtained.
  • PBMC-C-derived T cells expressing NGFR-Luc and PBMC-C-derived T cells expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv were concentrated and cultured after a complete medium change to IL-2 medium as appropriate. They were then suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) and frozen at -80°C or -150°C.
  • PBMC-C infected with only the CD19CAR-carrying lentivirus and a mixed cell group of PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv obtained by the above enrichment, and PBMC-C-derived T cells expressing only membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv, were cultured, and then the entire amount was suspended in IL-2 medium and added to a CD19-coated plate coated with CD19 Human Recombinant Protein (Origene, TP302922).
  • PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR or PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv were enriched, and the cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) and cryopreserved at -80°C or -150°C.
  • Each PBMC-C-derived T cell was thawed the day before the test and cultured in IL-2 medium.
  • a cell line (hereinafter referred to as "Raji-GFP") in which GFP was introduced into Raji cells, which constitutively express CD19, using a viral vector was used as a target for CD19CAR-expressing T cells.
  • Raji-GFP a cell line in which Raji-GFP cells were mixed with PBMC-A-derived NK cells, or a sample containing only Raji-GFP cells, was prepared.
  • PBMC-C-derived T cells expressing NGFR-Luc, PBMC-C-derived T cells expressing only CD19CAR, PBMC-C-derived T cells expressing only membrane-type a2DL2/3-DS10, or PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv were added to the Raji-GFP cells at a ratio of 1:1, 1:0.5, or 1:0.1, and the resulting mixture was cultured in a 96-well plate.
  • the cell suspension was mixed using equal volumes of MyeloCult H5100 medium, AIM V medium supplemented with 5 (v/v)% FCS, RPMI 1640 medium supplemented with 10 (v/v)% FCS, and GlutaMAX (all containing streptmycin/penicillin).
  • PBMC-C-derived T cells Four days after the start of culture, the number of cells in each well was measured using the method described in the section "Flow cytometry and added staining antibodies.”
  • the antibody used to detect PBMC-C-derived T cells was APC/Fire 750 anti-human CD3 antibody (BIOLEGEND, 300470).
  • GFP expressed by Raji-GFP cells was used to detect Raji-GFP cells.
  • the number of viable Raji-GFP cells in wells to which only Raji-GFP cells were added was set at 100%, and the vertical axis represents the percentage of viable Raji cells in each well, while the horizontal axis represents the percentage of T cells relative to Raji-GFP cells in each well at the start of culture. The results are shown in Figure 20.
  • PBMC-C-derived T cells In wells not co-cultured with PBMC-A-derived NK cells, the cytotoxic activity of PBMC-C-derived T cells expressing only CD19CAR and PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv against Raji-GFP cells was comparable. On the other hand, in wells co-cultured with PBMC-A-derived NK cells, the cytotoxic activity of PBMC-C-derived T cells expressing only CD19CAR against Raji-GFP cells was weakened compared to the cytotoxic activity of PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv against Raji-GFP cells.
  • PBMC-C-derived T cells expressing only CD19CAR were recognized as missing-self by PBMC-A-derived NK cells and attacked, resulting in a decrease in their numbers, whereas the PBMC-C-derived T cells expressing CD19CAR and membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv exhibited agonistic activity against inhibitory KIR via a2DL2/3-DS10 against PBMC-A-derived NK cells, avoiding attack by PBMC-A-derived NK cells, resulting in no decrease in their numbers.
  • CAR-T cells expressing the binder identified in Example 4 suppress the cytocidal activity of primary NK cells and maintain the cytocidal activity of CAR-T cells against target cells in the presence of primary NK cells, compared to CAR-T cells that do not express the binder identified in Example 4.
  • Example 10 Evaluation of the effect of CDR modification of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binder on agonist activity [0123] The effect on agonist activity against inhibitory KIR was evaluated when a specific amino acid residue in CDR3 of the variable region (VH) of a2DL2/3-DS10 was substituted with alanine.
  • VH variable region
  • membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv mutants of membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv in which every amino acid residue in the CDR3 (amino acid numbers 97 to 112 of SEQ ID NO: 51) of the heavy chain variable region (VH) of a2DL2/3-DS10 was substituted with alanine were incorporated into a membrane-type scFv expression format in the order of VH-VL, and an artificial gene was inserted into pLVSIN EF1 ⁇ .
  • the name of each mutant and the amino acid substituted with alanine are shown in Table 13 below.
  • Lentivirus was produced using pLVSIN EF1 ⁇ transfected with each membrane-bound scFv mutant, as described in the "Preparation of Lentivirus" section.
  • K562 cell lines expressing each membrane-bound scFv mutant were generated using the produced lentivirus as described in the "ScFv transfection into K-562 cells and preparation" section.
  • NK92 cell line Using the NK92 cell line, KIR2DL3-NK92 cell line, and KIR2DS2-NK92 cell line used in Example 5, the cytocidal activity of each NK92 cell line against K562 cell lines expressing each membrane-bound scFv mutant was evaluated using the method described in the section "Evaluation of cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against Lirilumab-scFv/Pan2D-scFv-K562.”
  • Example 11 Evaluation of whether CDR-grafts in which the CDRs of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binders are grafted onto the constant regions of different scFvs maintain KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific agonistic activity
  • the heavy and light chain CDRs of a2DL2/3-DS1, a2DL2/3-DS2, or a2DL2/3-DS3 were grafted onto the CDR-less heavy and light chain constant regions of a2DL2/3-DS4 (hereinafter referred to as "a2DL2/3-DS1-2,”"a2DL2/3-DS2-2,” and "a2DL2/3-DS3-2,” respectively).
  • a2DL2/3-DS1-2 a2DL2/3-DS2-2
  • a2DL2/3-DS3-2 CDR-grafted binders were expressed as membrane-bound scFv in K562
  • Lentivirus was produced using pLVSIN EF1 ⁇ into which each CDR-grafted membrane-type scFv had been introduced, as described in the section titled "Preparation of Lentivirus.”
  • K562 cell lines expressing each CDR-grafted membrane-type scFv were produced using the method described in the section titled "ScFv gene introduction into K-562 cells and preparation.”
  • Other K562 cells expressing the genes of interest were those used in Example 5.
  • NK92 cell line KIR2DL2-NK92 cell line, KIR2DL3-NK92 cell line, KIR2DS1-NK92 cell line, KIR2DS2-NK92 cell line, and KIR2DS4-NK92 cell line used in Example 5
  • the cytocidal activity of each NK92 cell line against K562 cell lines expressing each CDR-grafted membrane-type scFv was evaluated using the method described in the section titled "Evaluation of cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against Lirilumab-scFv/Pan2D-scFv-K562.”
  • each CDR-grafted membrane-type scFv exhibited agonistic activity against KIR2DL2 and KIR2DL3 equivalent to that of K562 cell lines expressing membrane-type a2DL2/3-DS1, membrane-type a2DL2/3-DS2, or membrane-type a2DL2/3-DS3 without CDR grafting.
  • each CDR-grafted membrane-type scFv did not exhibit the same agonistic activity against KIR2DS1, KIR2DS2, and KIR2DS4 as the Pan2D scFv.
  • Example 12 Evaluation of the Additive Inhibitory Effect on the Cytocidal Activity of NK Cells When KIR2DL2- and/or KIR2DL3-Specific Binders Are Coexpressed with HLA-E
  • a stronger inhibitory effect on the cytocidal activity of NK cells coexpressing KIR2DL2 or KIR2DL3 and NKG2A the cytocidal activity of NK92 cells coexpressing KIR2DL2 or KIR2DL3 and NKG2A was evaluated against K562 cells coexpressing membrane-type a2DL2/3-DS4 scFv or membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv with HLA-E.
  • genes encoding polypeptides were linked in the following order from the N-terminus: human B2M-derived signal peptide (SEQ ID NO: 18), HLA-G signal peptide-derived peptide (SEQ ID NO: 88), GS(G4S) linker (SEQ ID NO: 25), human B2M peptide (SEQ ID NO: 19), GS(G4S)4 linker (SEQ ID NO: 89), and HLA-E peptide (SEQ ID NO: 90).
  • Lentivirus was produced using pLVSIN EF1 ⁇ transfected with HLA-E according to the method described in the section "Preparation of Lentivirus.”
  • the produced lentivirus was used to infect K562 cells expressing the membrane-type a2DL2/3-DS4 scFv or membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv produced in Example 4, according to the method described in the section "ScFv Gene Transduction into K-562 Cells and Preparation.”
  • tHLA-E HLA-E trimer
  • NK92 cells constitutively express NKG2A the NK92 cell line, KIR2DL2-NK92 cell line, and KIR2DL3-NK92 cell line used in Example 5 were used to evaluate the cytocidal activity of each NK92 cell line against K562 cell lines expressing tHLA-E and membrane-type a2DL2/3-DS4 scFv or membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv, using the method described in the section titled "Evaluation of cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against Lirilumab-scFv/Pan2D-scFv-K562.”
  • K562 cell lines expressing tHLA-E and membrane-type a2DL2/3-DS4 scFv or membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv exhibited stronger inhibitory effects on the KIR2DL2-NK92 and KIR2DL3-NK92 cell lines compared to K562 cell lines expressing only tHLA-E or membrane-type a2DL2/3-DS4 scFv or membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv.
  • Example 13 Evaluation of the suppression of NK cell cytocidal activity against iPS cells using iPS cells that do not express Class I HLA but express KIR2DL2 and/or KIR2DL3-specific binders.
  • iPS cells that do not express Class I HLA are recognized by NK cells as missing-self and are targeted for attack.
  • KIR2DL2 and/or KIR2DL3-specific binders suppress the NK cell cytocidal activity
  • KIR2DL2 and/or KIR2DL3-specific binders were introduced into iPS cells that had lost Class I HLA expression by gene editing, thereby deleting B2M. These iPS cells were co-cultured with PBMC-derived NK cells, and the cytocidal activity of PBMC-derived NK cells against iPS cells was evaluated.
  • membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv was introduced into iPS cells in which B2M was deleted using CRISPR/CAS9 (hereinafter referred to as "B2M KO iPS cells"). Additionally, as a control, wild-type iPS cells or B2M KO iPS cells were introduced with NGFR-Luc.
  • Lentivirus concentrates were prepared for the membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv using the plasmid used in Example 4, and for NGFR-Luc using the plasmid used in Example 9, as described in the "Preparation of Lentivirus" section.
  • mTeSR Plus cGMP (VERITAS, 100-0276) medium (hereinafter referred to as "mTeSR medium") was supplemented with iMatrix-511 silk (nippi, 892021) and CultureSure® Y-27632 (WAKO, 034-24024). Each iPS cell was detached using Accutase (ICT) (Funakoshi, AT104) and suspended in the above medium. The prepared lentivirus concentrate and iPS cell suspension were added to a RetroNectin-coated plate and centrifuged. The following day, the medium was replaced with mTeSR medium, and after culturing, only positive cells were selected using an APC-labeled anti-Flag antibody and anti-APC Microbeads.
  • ICT Accutase
  • iPS cell suspension were added to a RetroNectin-coated plate and centrifuged. The following day, the medium was replaced with mTeSR medium, and
  • iPS cells used to evaluate cytocidal activity were completely replaced with mTeSR medium containing Recombinant Human IFN- ⁇ (PEPROTECH, 300-02) 3 days, 2 days, and 1 day before the test.
  • PBMC-A-derived NK cells were prepared according to the method described in the section "Preparation of PBMC-derived NK cells," suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) and stored frozen at -80°C or -150°C. These cells were thawed two days before the test and cultured in MyeloCult H5100 medium supplemented with IL-2 and IL-18 (R&D Systems, 9124-IL). The day before the test, the medium for PBMC-A-derived NK cells was replaced with MyeloCult H5100 medium without IL-2 or IL-18, and the cells were cultured.
  • PBMC-A-derived NK cells were mixed with wild-type iPS cells, B2M KO iPS cells, or B2M KO iPS cells expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv and cultured in a 96-well plate.
  • Cell suspensions were mixed in equal volumes using MyeloCult H5100 medium and mTeSR supplemented with CultureSure® Y-27632. Two hours after the start of culture, luciferase activity in each well was measured using the ONE-GloTM Luciferase Assay System.
  • the cytotoxicity was calculated by subtracting the luciferase activity in wells with PBMC-A-derived NK cells from the luciferase activity in wells with no PBMC-A-derived NK cells added, with the luciferase activity in wells with no PBMC-A-derived NK cells set at 100%.
  • Example 14 Identification of epitopes on KIR2DL2 of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binders by X-ray crystal structure analysis To identify epitopes on KIR2DL2 of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binders, a complex of a Fab fragment of a KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binder with recombinant KIR2DL2 was crystallized and subjected to X-ray crystal structure analysis.
  • the Fab fragment of the KIR2DL2 and/or KIR2DL3-specific binder used was the a2DL2/3-DS10 Fab fragment, whose amino acid sequence is shown in Table 15.
  • the recombinant KIR2DL2 used was a recombinant protein containing, from the N-terminus, an IL-2-derived signal peptide (SEQ ID NO: 91), KIR2DL2 (22-225) (amino acids 1 to 204 of SEQ ID NO: 6), and a His tag (SEQ ID NO: 92) linked in this order.
  • the product was then eluted with 50 mM HEPES (pH 8), 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, and 5% (v/v) glycerol.
  • the recovered glycosylated KIR2DL2(22-225)-His fraction was purified using HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (Cytiva, 28989336) equilibrated with PBS(-).
  • Deglycosylated KIR2DL2(22-225)-His and a2DL2/3-DS10 Fab fragments were mixed at a molar ratio of 1.2:1 and incubated at 4°C for 1 hour. The mixture was added to HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (Cytiva) equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl, and the complex of deglycosylated KIR2DL2(22-225)-His and 61_3092_02_F10_Fab was purified.
  • the resulting complex of a2DL2/3-DS10 Fab and KIR2DL2 was concentrated to 19 mg/mL and used for crystallization. Vapor diffusion was used for crystallization.
  • 0.1-0.2 ⁇ L of the protein solution was mixed with equal volumes of precipitant solution (10% (w/v) polyethylene glycol 3,350 (Hampton Research, HR2-527), 0.2 M calcium acetate (Hampton Research, HR2-567), and 0.1 M imidazole-HCl, pH 7.5 (Nacalai Tesque, 19004-35)).
  • the solution was placed in a sealed container containing 0.05 mL of precipitant solution, ensuring that the two solutions did not come into contact, and allowed to stand at 20°C. After three days, single crystals measuring 0.2 mm x 0.1 mm x 0.05 mm were obtained.
  • the obtained crystals were immersed in a precipitant solution containing 35% (v/v) polyethylene glycol 3,350, and then frozen in liquid nitrogen.
  • X-ray diffraction data were collected at 95 K under a nitrogen stream at BL-17A of the High Energy Accelerator Research Organization's Synchrotron Radiation Facility. Diffraction intensities were quantified from the obtained diffraction patterns using the XDS software (Wolfgang Kabsch, Max Planck Institute for Medical Research) to determine the crystal structure factors.
  • the software package Phenix (Python-Based Hierarchical Environment for Integrated Xtalography) was used for structural analysis calculations. Using the software phaser, molecular replacement was performed using the obtained structure factors and the three-dimensional structural coordinates of KIR2DL2 (PDB code: 2DL2) and Fab (PDB code: 1MIM, with similar parts extracted) to determine the phase.
  • the crystal contained one complex in the asymmetric unit.
  • the structure was refined using the software phenix.refine, and the model was modified using the software coot. This process was repeated, resulting in a final R value of 23.4% and a free R value of 27.5% at 2.5 ⁇ resolution.
  • the model consists of one complex and includes amino acid residues 1-210 of the VL chain of a2DL2/3-DS10 Fab, amino acid residues 1-224 of the H chain, amino acid residues 25-221 of KIR2DL2, two N-acetylglucosamines, and 14 water molecules.
  • KIR2DL2 amino acid residues located within 4 ⁇ of the a2DL2/3-DS10 Fab are as follows: Glu42, His61, Lys65, Phe66, Lys67, Asp68, Thr69, Leu70, Ser86, Ile87, Gly88, Pro89, Met91, Gln92, Asp93, Leu94, Tyr101, and Leu111.
  • the above amino acids are the epitopes in KIR2DL2 of a2DL2/3-DS10 and are highlighted (boxed) on the amino acid sequence of KIR2DL2.
  • a comparison with the amino acid sequence of the activated KIR is shown in Figure 27.
  • the signal peptide and receptor sequences listed in Table 5 were used for the amino acid sequences of each KIR.
  • the amino acid numbers for each KIR are numbered starting from 1, combining the signal peptide and receptor sequences listed in Table 4. That is, the number of each amino acid in the KIR2DL2 epitope is the number obtained by adding 21 (the amino acid length of the signal peptide) to the number of the corresponding amino acid in the amino acid sequence listed in SEQ ID NO: 6, and the number of each amino acid in the corresponding KIR2DS1/2/4 is similarly the number obtained by adding 21 to the number of the corresponding amino acid in the amino acid sequences listed in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • amino acid corresponding to amino acid Pro89 on KIR2DL2 is amino acid Arg89 on KIR2DS1, but hydrogen bonds with amino acid Tyr106 on a2DL2/3-DS10 VH CDR3 cannot be formed or are weak, suggesting that amino acid Tyr106 contributes to the selectivity between KIR2DL2 and KIR2DS1.
  • amino acid corresponding to amino acid Phe66 on KIR2DL2 is amino acid Tyr66 on KIR2DS2, but steric hindrance occurs with amino acid Tyr107 on a2DL2/3-DS10 VH CDR3, suggesting that amino acid Tyr107 contributes to the selectivity between KIR2DL2 and KIR2DS2.
  • amino acid that corresponds to amino acid Asp68 on KIR2DL2 is amino acid Asn68 on KIR2DS4, but hydrogen bonds with amino acid Tyr107 on a2DL2/3-DS10 VH CDR3 cannot be formed or are weak, suggesting that amino acid Tyr107 contributes to the selectivity between KIR2DL2 and KIR2DS4.
  • Threonine the 94th amino acid in the VL chain of a2DL2/3-DS10 (amino acid number 94 in SEQ ID NO: 52; hereinafter referred to as "DS10-VL-T94"
  • DS10-VL-T94 amino acid number 94 in SEQ ID NO: 52
  • DS10-VL-Thr94 the 94th amino acid in the VL chain of a2DL2/3-DS10
  • This DS10-VL-T94 was analyzed using the software BIOLUMINATE manufactured by Schrodinger. As a result, it was observed that in the mutant a2DL2/3-DS10 in which the amino acid was substituted with an amino acid shown in Table 15, the formation of a hydrogen bond with Asp93 of KIR2DL2 at the main chain NH of the mutant was maintained, while the non-formation of a hydrogen bond with Val93 of KIR2DS4 was maintained. Substitutions into these amino acids are predicted to maintain the specificity of binding to inhibitory KIR but not to activating KIR.
  • Example 15 Evaluation of epitope sites of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binders by competition between a2DL2/3-DS10 and each KIR2DL2/3-specific binder in an antigen binding test Fab fragments were prepared for each KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific binder. These Fab fragments and recombinant KIR2DL2 were added to K562 cell lines expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv, and the epitope sites of each binder were evaluated using as an indicator whether the binding between the K562 cell line expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv and recombinant KIR2DL2 was inhibited by competition.
  • a recombinant protein was prepared by linking, in order from the N-terminus, a VH-derived signal peptide (SEQ ID NO: 92), a VH chain variable region shown in Table 15, and a Fab fragment VH chain constant region (SEQ ID NO: 95), and a recombinant protein was prepared by linking, in order from the N-terminus, a VL-derived signal peptide (SEQ ID NO: 95), a VL chain variable region shown in Table 16, and a Fab fragment VL chain constant region (SEQ ID NO: 96), and these were then assembled to form a Fab fragment.
  • the amino acid sequence of the variable region of each binder is shown in Table 15. Furthermore, the recombinant KIR2DL2 used was the biotinylated version of the human KIR2DL2(22-245)-Fc-Avi used in Example 4 (hereinafter referred to as "human KIR2DL2(22-245)-Fc-Biotin"). Additionally, the K562 cell line expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv prepared in Example 4 was used.
  • K562 cell line or K562 cell line expressing membrane-type a2DL2/3-DS10 scFv was suspended in autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer, and Fab fragments of each binder were added to a final concentration of 1.5 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 0.17 ⁇ M, 0.06 ⁇ M, 0.02 ⁇ M, or 0.01 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand.
  • Human KIR2DL2 (22-245)-Fc-Biotin was added to a final concentration of 0.05 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand.
  • the plate was washed with autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer, and APC-labeled anti-human IgG Fc antibody was added and allowed to stand. After the reaction, the plate was washed with autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer, and binding to human KIR2DL2 (22-245)-Fc-Biotin was confirmed using flow cytometry as the median fluorescence intensity derived from APC.
  • Example 16 Isolation of KIR2DL1- or KIR3DL1-specific binders by phage panning [0112] As in the above Examples, it was shown that binders with KIR2DL2- and/or KIR2DL3-specific agonistic activity inhibit the cytocidal activity of KIR2DL2- and/or KIR2DL3-expressing NK cells against cells recognized as missing-self.
  • phage panning was carried out in the same manner as described in the section "Isolation of inhibitory KIR-specific binders by phage panning" in Example 4, with the aim of obtaining novel binders that specifically bind to KIR2DL1 or KIR3DL1 and exhibit agonistic activity.
  • a recombinant protein was produced as a soluble KIR by linking, from the N-terminus, an IL-2-derived signal peptide (SEQ ID NO: 91), the extracellular domain of each KIR protein listed in Table 17, a GGGS linker (SEQ ID NO: 97), an IgG Fc domain (SEQ ID NO: 98), a GAA linker, and an Avi tag (SEQ ID NO: 99).
  • SEQ ID NO: 91 IL-2-derived signal peptide
  • SEQ ID NO: 97 the extracellular domain of each KIR protein listed in Table 17, a GGGS linker (SEQ ID NO: 97), an IgG Fc domain (SEQ ID NO: 98), a GAA linker, and an Avi tag (SEQ ID NO: 99).
  • the sequences of the extracellular domains of each KIR used in each soluble KIR are shown in Table 17.
  • Recombinant Human KIR3DS1/CD158e2 Fc Chimera Protein R&D Systems
  • ELISA was performed using soluble KIR of the target KIR (KIR2DL1 or KIR3DL1), and scFv-expressing phages that bind to KIR2DL1 or KIR3DL1, or each, were identified from a polyclonal phage library.
  • the binder sequence from the phagemid of the identified scFv-expressing phage was transferred to a recombinant protein expression vector for E. coli, which was then introduced into E. coli, and recombinant proteins of each binder were obtained from the culture supernatant.
  • ELISA was performed for each binder using the soluble KIR corresponding to each KIR listed in Table 16, and information on the binding ability of each binder to each KIR was obtained.
  • variable regions of binders that showed binding to KIR2DL1 or KIR3DL1 but not to KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, or KIR3DS1 were introduced into the membrane-type scFv expression format described in the section "ScFv gene transfection and preparation into K-562 cells," and then introduced into pPB[Exp]-EF1A (VectorBuilder).
  • sequence numbers for the amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region of the KIR2DL1-specific binder are shown in Table 18 below.
  • sequence numbers for the amino acid sequences of the heavy chain variable region and light chain variable region of the KIR3DL1-specific binder are shown in Table 19 below.
  • Electroporation was used to introduce genes into K562 cells.
  • pPB[Exp]-EF1A and pRP[Exp]-mCherry-CAG>hyPBase VectorBuilder, pDNA(VB010000-9365tax)-P
  • pDNA(VB010000-9365tax)-P pDNA(VB010000-9365tax)-P
  • the collected cells were suspended in CELLBANKER1 to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 7 cells/mL and cryopreserved at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in RPMI medium before use.
  • the recombinant KIR protein used in phage panning or Recombinant Human KIR3DS1/CD158e2 Fc Chimera Protein was diluted to 0.1 ⁇ M in autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer and added to these target cells, and the cells were incubated at 4°C for 45 to 90 minutes.
  • the K562 cells expressing membrane-bound a3DL1-DS1 scFv were the same as those used in Example 8.
  • K562 cells expressing the novel KIR2DL1-specific membrane-type binder scFv showed low binding to recombinant KIR2DS1, recombinant KIR2DS2, or recombinant KIR2DS4, and specific binding to the target recombinant KIR2DL1. Furthermore, K562 cells expressing the novel KIR3DL1-specific membrane-type binder scFv showed low binding to KIR3DS1, and specific binding to the target recombinant KIR3DL1.
  • Example 17 Evaluation of agonist activity of KIR2DL1-specific binders [0113] The agonist activity of the KIR2DL1-specific binders, the specificity of which was confirmed in Example 16, against inhibitory KIR and activating KIR was evaluated using a K562 cell line expressing each binder membrane-type scFv and an NK92 cell line expressing each KIR.
  • the K562 cell line expressing the KIR2DL1-specific membrane-type scFv was the same as that used in Example 16.
  • the NK92 cell lines expressing each inhibitory or activating KIR were prepared using the method described in the section "KIR gene introduction into NK92 cells and preparation.”
  • cytocidal activity of each NK92 cell line against the K562 cell line expressing KIR2DL1-specific membrane-bound scFv was evaluated using the method described in the section "Evaluation of cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against Lirilumab-scFv/Pan2D-scFv-K562.”
  • Example 18 Evaluation of agonist activity of KIR3DL1-specific binders The agonist activity of the KIR3DL1 binders whose specificity was confirmed in Example 16 against inhibitory KIR and activating KIR was evaluated using K562 cell lines expressing each binder membrane-type scFv and NK92 cell lines expressing each KIR.
  • the K562 cell line expressing the KIR3DL1-specific membrane-type scFv was the same as that used in Example 16.
  • the NK92 cell lines expressing each inhibitory KIR other than KIR3DS1 were prepared using the method described in the section "KIR gene introduction into NK92 cells and preparation.”
  • the K562 cells expressing the membrane-type a3DL1-DS1 scFv were the same as those used in Example 8.
  • KIR3DS1-expressing NK cells were obtained by gene transfer into NK92 cells using lentivirus, but an NK92 cell line expressing KIR3DS1 could not be obtained.
  • NK cells were cultured from PBMCs and KIR3DS1-expressing NK cells were enriched using a cell sorter.
  • HLA-C1/C1/Bw4-positive PBMCs or HLA-C2/C2/Bw4-positive PBMCs were prepared as effector cells (PBMC-D and PBMC-E).
  • Feeder K562 cells expressing membrane-type IL-21 and tHLA-E (hereinafter referred to as "Feeder K562 cells”) were used as feeder cells.
  • membrane-type IL-21 genes encoding, from the N-terminus, an IL-2-derived signal peptide (SEQ ID NO: 91), an IL-21 fragment (SEQ ID NO: 105), a CD8-derived hinge region (62 amino acids) sequence (SEQ ID NO: 106), a CD8-derived membrane domain and intracellular domain (SEQ ID NO: 102), an IRES sequence, and blue fluorescent protein (BFP) (SEQ ID NO: 104) were inserted into pLVSIN EF1 ⁇ .
  • a lentivirus concentrate was prepared using the method described in the "Lentivirus Preparation” section. Using the prepared lentivirus, the tHLA-E-expressing K562 cells used in Example 12 were infected with the viral vector using the method described in the section "Introduction and preparation of scFv into K-562 cells," and clones expressing BFP were selected to create a Feeder K562 cell line expressing membrane-type IL-21 and tHLA-E.
  • Feeder K562 cells were suspended in RPMI medium supplemented with 10 ⁇ g/ml Mitomycin C Solution (Nacalai Tesque, 20898-21) and incubated for 3 hours. After washing with RPMI medium, Feeder K562 cells were suspended in MyeloCult H5100 medium and co-cultured with PBMC-D or PBMC-E suspended in MyeloCult H5100 medium supplemented with 200 U/mL IL-2. After 7 to 10 days, the cells were harvested and suspended in MACSQuant Tyto Running Buffer (Miltenyi Biotech, 130-107-206) at 1 to 10 ⁇ g/mL for each antibody listed in Table 20. The antibodies were then added to the cells and incubated at 4°C for 30 minutes.
  • Mitomycin C Solution Nacalai Tesque, 20898-21
  • the antibody-stained cells were washed twice with MACSQuant Tyto Running Buffer, then resuspended to 50 x 10 cells/ml or less, loaded into MACSQuant Tyto Cartridges (130-106-088), and sorted for KIR3DS1-expressing NK cells using a MACSQuant Tyto Cell Sorter (130-103-931).
  • MACSQuant Tyto Cell Sorter 130-103-931
  • the anti-KIR3DL1 antibody-negative, anti-KIR3DL1/3DS1 antibody-positive cell fraction was sorted as KIR3DS1-expressing NK cells.
  • the anti-KIR3DL1/3DS1 antibody-negative cell fraction was also sorted as control NK cells. Thereafter, the cells were continuously cultured in MyeloCult H5100 medium supplemented with IL-2 and IL-18 at concentrations of 1000 U/mL and 100 ng/mL, respectively.
  • the cytocidal activity of each NK92 cell line or PBMC-derived NK cells expressing KIR3DS1 against the K562 cell line expressing KIR3DL1-specific membrane-bound scFv was evaluated using the method described in the section "Evaluation of the cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against Lirilumab-scFv/Pan2D-scFv-K562.”
  • the K562 cell line and PBMC-derived NK cells were mixed at a cell number ratio of 1:3.
  • Example 19 Cytocidal activity of NKG2A-positive NK cell line against K562 is suppressed by universal technology and expression of anti-NKG2A antibody-derived scFv Whether an anti-NKG2A antibody expressed on the cell surface as a membrane-bound scFv exhibits agonistic activity against NKG2A, similar to that of tHLA-E confirmed in Example 12, was evaluated.
  • Variable regions from the gene sequences of anti-NKG2A antibodies described in patent documents US 2015/0125464 A1, WO 2016/041947 A1, and US 2020/0199226 A1 were introduced into the membrane-type scFv expression format described in the section "scFv gene transduction and preparation into K562 cells," and then inserted into pLVSIN EF1 ⁇ .
  • Lentiviruses were produced using pLVSIN EF1 ⁇ containing each membrane-type scFv, as described in the section "lentivirus preparation.” Using the produced lentiviruses, K562 cell lines expressing each scFv as membrane-type scFv were created using the section "scFv gene transduction and preparation into K-562 cells" (see Table 21 for the sequence numbers of each variable region).
  • the cytocidal activity against the Luc-K562 cell line, the tHLA-E-Luc-K562 cell line used in Example 12, or the membrane-type aNKG2A-scFv-K562 cell line was evaluated using the method described in the section "Evaluation of cytocidal activity of KIR2DL2-expressing NK92 against Lirilumab-scFv/Pan2D-scFv-K562.”
  • the expression of cell surface proteins in the NK-92 cell line was confirmed using a PE-labeled anti-NKG2C antibody (Miltenyi Biotec, 130-119-776) and a PC7-labeled anti-NKG2A antibody (Beckman Coulter, 130-119-776).
  • the results are shown in Figures 48 and 49.
  • the results in Figure 48 indicate that the NK92 cell line exhibited cytocidal activity against the K562 cell line, but that cytocidal activity was attenuated against the tHLA-E-K562 cell line. Furthermore, among the K562 cell lines expressing membrane-type aNKG2A-scFv, the cytocidal activity of the NK92 cell line was attenuated against the membrane-type aNKG2A-DS11-K562 cell line and the membrane-type aNKG2A-DS12-K562 cell line. The results in Figure 49 confirmed that the NK92 cell line was NKG2A-positive and NKG2C-negative.
  • NKG2A which recognized tHLA-E, suppressed the cytocidal activity of the NK92 cell line by introducing an inhibitory signal into the NK92 cell line.
  • membrane-type aNKG2A-DS11 and membrane-type aNKG2A-DS12 are recognized by NKG2A, just like tHLA-E, and are thought to suppress the cytocidal activity of the NK92 cell line by transmitting an inhibitory signal.
  • Example 20 Evaluation of binding ability of tHLA-E or membrane-type aNKG2A scFv to NKG2A-CD94 complex and NKG2C-CD94 complex
  • tHLA-E, membrane-type aNKG2A-DS11, and membrane-type aNKG2A-DS12, whose agonistic activity was confirmed in Example 19 the binding ability to the NKG2A-CD94 complex and NKG2C-CD94 complex was evaluated.
  • the target cells were washed with autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer, and an APC-labeled anti-His tag antibody (BIOLEGEND, 362605) was added and incubated at 4°C for 30 minutes.
  • the target cells were washed twice with autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer, and flow cytometry was used to confirm the binding of the target cells to the His-tagged NKG2A-CD94 recombinant protein and the His-tagged NKG2C-CD94 recombinant protein.
  • the binding of each target cell to the recombinant protein was calculated by setting the binding of the recombinant protein to Luc-K562 cells (median value of APC-derived fluorescence intensity) to 1.
  • tHLA-E was confirmed to exhibit binding to both NKG2A-CD94 and NKG2C-CD94.
  • membrane-type aNKG2A-DS11 was confirmed to exhibit binding to NKG2A-CD94, but not to NKG2C-CD94.
  • membrane-type aNKG2A-DS12 was confirmed to exhibit binding to both NKG2A-CD94 and NKG2C-CD94, just like tHLA-E.
  • membrane-type aNKG2A-DS11 exhibited specific binding to NKG2A.
  • Example 21 Evaluation of the suppression of cytocidal activity of PBMC-derived NK cells against iPS cells expressing tHLA-E or membrane-type aNKG2A scFv and not expressing Class I HLA
  • PChiPS771 Human iPS cells (PChiPS771) (REPROCELL, RCRP001N, Lot No. A01QN21) were used as iPS cells and cultured in mTeSR medium.
  • CRISPR/CAS9 was used to generate iPS cells in which the B2M gene was deleted (hereinafter referred to as "B2M KO iPS cells").
  • a plasmid was created in which an artificial gene encoding polypeptides arranged in the following order from the N-terminus: truncated CD19 (sequence number 53), self-cleaving peptide T2A (sequence number 20), and EGFP (sequence number 171) was inserted using CRISPR/CAS9 at the position where the B2M gene exon is split on the genome.
  • iMatrix-511 silk manufactured by Nippi, 892021 was added to the mTeSR medium, and the cells were cultured in CultureSure® Y-27632 (manufactured by WAKO, 034-24024).
  • PCR was performed using PrimeSTAR GXL (Takara Bio, R050B) with primer A (sequence number 172) and primer B (sequence number 173), and electrophoresis confirmed that the artificial gene had been inserted into the genome of both alleles, confirming that iPS cells in which the B2M gene had been knocked out had been created.
  • a polypeptide encoding luciferase was inserted downstream of the ACTB gene using CRISPR/CAS9.
  • iPS cells expressing luciferase obtained here will be referred to as wild-type iPS cells or B2M KO iPS cells.
  • the collected cells were suspended in STEM-CELLBANKER GMP grade (ZENOGEN PHARMA, 11924) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and stored frozen at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in mTeSR medium before use.
  • STEM-CELLBANKER GMP grade ZENOGEN PHARMA, 11924
  • RetroNectin (Takara Bio, T100B) was diluted with PBS (phosphate buffered saline) to 20-100 ⁇ g/mL and added to a non-treatment dish. After leaving the dish to stand for 2 hours at room temperature or overnight at 4°C, the dish was washed with PBS to prepare a RetroNectin-coated plate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • B2M KO iPS cells expressing tHLA-E
  • gene transfer was performed using the lentivirus concentrate encoding the tHLA-E gene used in Example 12.
  • B2M KO iPS cells were suspended in mTeSR medium to a concentration of 1-2 x 10 cells/mL, and the lentivirus concentrate encoding the tHLA-E gene, iMatrix-511 silk (manufactured by Nippi, 892021), CultureSure® Y-27632 (manufactured by WAKO, 034-24024), and cells were mixed in a RetroNectin-coated plate and centrifuged at 1000 x g for 1 hour.
  • the collected cells were suspended in STEM-CELLBANKER GMP grade (ZENOGEN PHARMA, 11924) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and stored frozen at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in mTeSR medium before use.
  • STEM-CELLBANKER GMP grade ZENOGEN PHARMA, 11924
  • Electroporation was used to introduce the membrane-bound scFv gene into B2M KO iPS cells.
  • the pPB[Exp]-EF1A vector was used, which lacked the nucleic acid sequence encoding green fluorescent protein contained in pPB[Exp]-EF1A>EGFP/Neo (VectorBuilder, VB010000-9491dkf).
  • the gene encoding the membrane-bound scFv expression format was introduced into the multicloning site of pPB[Exp]-EF1A to prepare a plasmid vector for electroporation.
  • B2M KO iPS cells were suspended at 2 ⁇ 10 cells/20 ⁇ L using P3 Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (LONZA, V4XP-3032), and 200 ng each of the plasmid vectors pPB[Exp]-EF1A and pRP[Exp]-mCherry-CAG>hyPBase (VectorBuilder, pDNA(VB010000-9365tax)-P) containing gene sequences encoding membrane-type aNKG2A-DS11 or membrane-type aNKG2A-DS12 were added.
  • Electroporation was performed using 4D-Nucleofector (LONZA, AAF-1003B, AAF-1003X) with program CA-137.
  • iMatrix-511 silk (Nippi, 892021) was added to mTeSR medium, and the cells were cultured using CultureSure® Y-27632 (WAKO, 034-24024). From the next day onwards, the medium was replaced daily with mTeSR medium, and after one week of culture, only positive cells were selected using APC-labeled anti-FLAG and anti-APC Microbeads (Miltenyi Biotec, 130-090-855).
  • the collected cells were suspended in STEM-CELLBANKER GMP grade (ZENOGEN PHARMA, 11924) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and stored frozen at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in mTeSR medium before use.
  • STEM-CELLBANKER GMP grade ZENOGEN PHARMA, 11924
  • NK cells derived from three types of PBMC were isolated as PBMC-D, PBMC-E, and PBMC-F, respectively, and used as effector cells.
  • PBMC-derived NK cells were purified for PBMC-A, PBMC-D, PBMC-E, and PBMC-F using the method described in "Preparation of PBMC-derived NK cells" in Example 6. Culture was then continued in NK medium, and 8 to 10 days after purification, the cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) to a concentration of 0.5 to 1 x 10 cells/mL and cryopreserved at -80°C or -150°C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in NK medium before use.
  • iPS cells used to evaluate cytocidal activity were completely replaced with mTeSR medium containing Recombinant Human IFN- ⁇ (PEPROTECH, 300-02) 3 days, 2 days, and 1 day before the test.
  • PBMC-A-derived NK cells, PBMC-D-derived NK cells, PBMC-E-derived NK cells, and PBMC-F-derived NK cells which had been frozen and stored at -80°C or -150°C, were thawed the day before the test and cultured in NK medium.
  • Each PBMC-derived NK cell line was added to a 96-well plate, and the luciferase-expressing wild-type iPS cells, B2M KO iPS cells, tHLA-E-expressing B2M KO iPS cells, membrane-type aNKG2A-DS11-expressing B2M KO iPS cells, or membrane-type aNKG2A-DS12-expressing B2M KO iPS cells prepared in this example were added to separate wells at a cell ratio of 1:1 and cultured. The cell suspensions were mixed in equal volumes using MyeloCult H5100 medium and mTeSR supplemented with CultureSure® Y-27632 at 20 ⁇ M.
  • luciferase activity in each well was measured using the ONE-GloTM Luciferase Assay System (PROMEGA, E6120).
  • PROMEGA ONE-GloTM Luciferase Assay System
  • the cytotoxic activity was calculated by subtracting the luciferase activity in the wells containing PBMC-derived NK cells from the luciferase activity in the wells containing no PBMC-derived NK cells, with the luciferase activity in the wells containing no PBMC-derived NK cells set at 100%.
  • the results are shown in Figures 52-1 and 52-2.
  • the results in Figure 52-1 show that in PBMC-D-derived and PBMC-E-derived NK cells, the majority of the NK cells in the NK cell population were NKG2A-positive and NKG2C-negative, with very few NKG2A-negative and NKG2C-positive NK cells.
  • PBMC-A-derived and PBMC-F-derived NK cells the majority of the NK cells in the NK cell population were NKG2A-negative and NKG2C-positive, with very few NKG2A-positive and NKG2C-negative NK cells.
  • the results in Figure 52-2 show that B2M KO iPS cells activated the cytotoxic activity of PBMC-derived NK cells compared to wild-type iPS cells. Furthermore, compared with B2M KO iPS cells, B2M KO iPS cells expressing tHLA-E suppressed the cytocidal activity of PBMC-D- and PBMC-E-derived NK cells, but activated the cytocidal activity of PBMC-A- and PBMC-F-derived NK cells.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS11 suppressed the cytocidal activity of PBMC-D- and PBMC-E-derived NK cells, but did not activate the cytocidal activity of PBMC-A- and PBMC-F-derived NK cells.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS12 suppressed the cytocidal activity of PBMC-D-derived NK cells and PBMC-E-derived NK cells, and slightly activated the cytocidal activity of PBMC-A-derived NK cells and PBMC-F-derived NK cells.
  • membrane-type aNKG2A-DS12 can suppress the cytocidal activity of NKG2A-positive, NKG2C-negative NK cells, but activates the cytocidal activity of NKG2A-negative, NKG2C-positive NK cells, demonstrating that it has agonistic activity for both NKG2A and NKG2C.
  • membrane-type aNKG2A-DS11 was shown to suppress the cytocidal activity of NKG2A-positive, NKG2C-negative NK cells, but not activate the cytocidal activity of NKG2A-negative, NKG2C-positive NK cells.
  • membrane-type aNKG2A-DS11 is an NKG2A-specific agonist. Furthermore, using iPS cells as an example, it was shown that the NKG2A-mediated suppression of NK cell cytocidal activity by membrane-type NKG2A-specific agonists is effective not only in cell lines such as K562 that do not express Class I HLA even without gene editing, but also in cells in which Class I HLA expression has been eliminated by gene editing.
  • Example 22 Evaluation of the inhibition of the cytocidal activity of PBMC-derived NK cells against iPS cells that do not express Class I HLA, which were co-expressed with tHLA-E or a membrane-type NKG2A-specific agonist and a membrane-type inhibitory KIR-specific agonist As shown in Example 21, a membrane-type NKG2A-specific agonist does not activate NKG2A-negative and NKG2C-positive NK cells, but it also cannot suppress them.
  • NKG2C expression in NK cells is believed to be positively correlated with KIR expression, and co-expression of a membrane-type NKG2A-specific agonist and a membrane-type inhibitory KIR-specific agonist was evaluated based on the idea that it would be possible to avoid attack by NKG2A-negative, NKG2C-positive, inhibitory KIR-positive NK cells in addition to NKG2A-positive and NKG2C-negative NK cells.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 To generate B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL2/3-DS10, pPB[Exp]-EF1A encoding membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 was prepared using the method described in Example 21 [Plasmid vector for electroporation into B2M KO iPS cells], and B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL/3-DS10 were generated using the method described in Example 21 [Introduction and preparation of membrane-type scFv expression format gene into B2M KO iPS cells by electroporation].
  • pPB[Exp]-EF1A encoding tHLA-E was prepared using the method described in [Plasmid vector for electroporation into B2M KO iPS cells].
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 prepared in the previous section, B2M KO iPS cells co-expressing tHLA-E and membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 were generated using the method described in [Introduction and preparation of membrane-type scFv expression format gene into B2M KO iPS cells by electroporation].
  • an artificial gene in which the Flag tag sequence (SEQ ID NO: 2) of the membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 gene sequence was replaced with an HA tag sequence (SEQ ID NO: 178) was inserted into the pPB[Exp]-EF1A vector.
  • B2M KO iPS cells co-expressing membrane-type aNKG2A-DS11 and membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 2 ⁇ 10 5 B2M KO iPS cells prepared in Example 21 were cultured using P3 Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (LONZA, V4XP-3032).
  • the cells were suspended at a concentration of 100 ng each of pPB[Exp]-EF1A carrying membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 substituted with an HA tag and pPB[Exp]-EF1A carrying membrane-type aNKG2A-DS11, and 200 ng of pRP[Exp]-mCherry-CAG>hyPBase plasmid vector were added. Electroporation was performed using a 4D-Nucleofector (LONZA, AAF-1003B, AAF-1003X) with program CA-137.
  • iMatrix-511 silk manufactured by Nippi, 892021
  • was added to the mTeSR medium and the cells were cultured in CultureSure® Y-27632 (manufactured by WAKO, 034-24024). From the next day onwards, the medium was replaced with mTeSR medium every day.
  • B2M KO iPS cells expressing tHLA-E and membrane-type aKIR2DL2/3-DS10, and B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS11 and membrane-type aKIRKIR2DL2/3-DS10 were treated with PE-labeled anti-FLAG antibody (BioLegend, 637310), APC-labeled anti-HLA-E antibody (BioLegend, 342606), or P E-labeled anti-FLAG antibody (BioLegend, 637310) and APC-labeled anti-HA tag antibody (BioLegend, 901524) were suspended in autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer to which CultureSure® Y-27632 was added at 10 ⁇ M, each at 1-10 ⁇ g/mL, and then added to the cells and incubated at 4°C for 30 minutes.
  • PE-labeled anti-FLAG antibody BioLegend, 637310
  • the antibody-stained cells were washed twice with autoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer supplemented with CultureSure® Y-27632, then resuspended in MACSQuant Tyto Running Buffer (Miltenyi Biotech, 130-107-206) supplemented with 10 ⁇ M CultureSure® Y-27632 to a concentration of 50 ⁇ 10 cells/ml or less, and loaded into MACSQuant Tyto Cartridges (130-106-088). Cell sorting was performed using a MACSQuant Tyto Cell Sorter (130-103-931).
  • B2M KO iPS cells co-expressing tHLA-E and membrane-type aKIRKIR2DL2/3-DS10 and for B2M KO iPS cell lines co-expressing membrane-type aNKG2A-DS11-scFv and membrane-type aKIRKIR2DL2/3-DS10, cell fractions co-positive for PE and APC-derived fluorescence (double positive) were sorted. The sorted cells were further cultured in mTeSR medium.
  • the collected cells were suspended in STEM CELLBANKER GMP grade (ZENOGEN PHARMA, 11924) to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 cells/mL and stored frozen at ⁇ 80° C. or ⁇ 150° C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in mTeSR medium before use.
  • STEM CELLBANKER GMP grade ZENOGEN PHARMA, 11924
  • NK cells derived from three types of PBMC were isolated as PBMC-G, PBMC-H, and PBMC-I, respectively, and used as effector cells.
  • PBMC-A, PBMC-F, PBMC-G, PBMC-H, and PBMC-I were purified as described in "Preparation of PBMC-derived NK cells" in Example 6. Culture was then continued in NK medium, and 8 to 10 days after purification, the cells were suspended in CELLBANKER1 (Takara Bio, CB011) at 0.5 to 1 x 10 cells/mL and cryopreserved at -80°C or -150°C. When using frozen cells in experiments, they were thawed and cultured in NK medium before use.
  • iPS cells used to evaluate cytocidal activity were completely replaced with mTeSR medium containing Recombinant Human IFN- ⁇ (PEPROTECH, 300-02) 3 days, 2 days, and 1 day before the test.
  • PBMC-A-derived NK cells, PBMC-F-derived NK cells, PBMC-G-derived NK cells, PBMC-H-derived NK cells, and PBMC-I-derived NK cells which had been frozen and stored at -80°C or -150°C, were thawed the day before the test and cultured in NK medium.
  • Each PBMC-derived NK cell was added to a 96-well plate, and wild-type iPS cells, B2M KO iPS cells, B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL2/3-DS10, B2M KO iPS cells expressing tHLA-E, B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS11, B2M KO iPS cells co-expressing tHLA-E and membrane-type aKIR2DL2/3-DS10, or B2M KO iPS cells co-expressing membrane-type aNKG2A-DS11 and membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 were added to separate wells at a cell ratio of 1:1 and cultured.
  • the cell suspension was mixed in equal volumes using MyeloCult H5100 medium and mTeSR supplemented with 20 ⁇ M CultureSure® Y-27632. Two hours after the start of culture, luciferase activity in each well was measured using the ONE-GloTM Luciferase Assay System. For each PBMC-derived NK cell, the cytotoxic activity was calculated by subtracting the luciferase activity in the wells containing PBMC-derived NK cells from the luciferase activity in the wells containing no PBMC-derived NK cells, with the luciferase activity in the wells containing no PBMC-derived NK cells set at 100%.
  • FIGS 53-1, 53-2, and 53-3 The results are shown in Figures 53-1, 53-2, and 53-3.
  • the flow cytometry results for confirming the expression of cell surface proteins in each PBMC-derived NK cell group show that for PBMC-A-derived NK cells and PBMC-F-derived NK cells, the majority of NK cells in the NK cell population were NKG2A-negative and NKG2C-positive, with very few NKG2A-positive and NKG2C-negative NK cells. Furthermore, the majority of the NK cell population was NKG2C-positive and positive for inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3.
  • PBMC-G-derived NK cells PBMC-H-derived NK cells
  • PBMC-I-derived NK cells the majority of the NK cell population was NKG2A-positive and NKG2C-negative, with very few NKG2A-negative and NKG2C-positive NK cells. Furthermore, the number of inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3-positive NK cells was low.
  • Figure 53-3 shows that B2M KO iPS cells activated the cytocidal activity of PBMC-derived NK cells compared with wild-type iPS cells.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 suppressed the cytocidal activity of PBMC-A-derived NK cells and PBMC-F-derived NK cells compared with B2M KO iPS cells, but only limited suppression of the cytocidal activity of PBMC-G-derived NK cells, PBMC-H-derived NK cells, and PBMC-I-derived NK cells.
  • B2M KO iPS cells expressing tHLA-E suppressed the cytocidal activity of PBMC-G-, PBMC-H-, and PBMC-I-derived NK cells, but activated the cytocidal activity of PBMC-A- and PBMC-F-derived NK cells.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS11 suppressed the cytocidal activity of PBMC-G-, PBMC-H-, and PBMC-I-derived NK cells, but did not activate the cytocidal activity of PBMC-A- and PBMC-F-derived NK cells.
  • B2M KO iPS cells co-expressing tHLA-E and membrane-type aKIRKIR2DL2/3-DS10 suppressed the cytocidal activity of PBMC-G-, PBMC-H-, and PBMC-I-derived NK cells, but activated the cytocidal activity of PBMC-A-, and PBMC-F-derived NK cells.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS11 and membrane-type aKIRKIR2DL2/3-DS10 suppressed the cytocidal activity of all PBMC-derived NK cells evaluated.
  • B2M KO iPS cells expressing membrane-type aKIR2DL2/3-DS10 or B2M KO iPS cells expressing membrane-type aNKG2A-DS11
  • B2M KO iPS cells co-expressing membrane-type aNKG2A-DS11 and membrane-type aKIRKIR2DL2/3-DS10 suppressed the cytocidal activity of all PBMC-derived NK cells.
  • NKG2A-specific agonist and an inhibitory KIR-specific agonist are co-expressed in iPS cells that do not express Class I HLA, the cytocidal activity of NKG2A-positive, NKG2C-negative NK cells is suppressed, and the cytocidal activity of NKG2C-positive, inhibitory KIR-positive, NKG2A-negative NK cells can also be suppressed.
  • NKG2A-specific agonist does not activate NKG2C, and it has been shown that an immune evasion technique that combines an NKG2A-specific agonist and an inhibitory KIR-specific agonist can reduce immune exclusion for a larger number of NK cell populations than an immune evasion technique that combines tHLA-E and an inhibitory KIR agonist.
  • the substance of the present invention that specifically binds to NKG2A and inhibits the cellular activity of NK cell killers can be used as a composition that reduces the risk of immune rejection during transplantation.
  • the substance of the present invention that binds to inhibitory KIR2DL2 and/or KIR2DL3 and has the activity of inhibiting the cellular activity of NK cells can be used as a composition that reduces the risk of immune rejection during transplantation.

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Abstract

臓器移植や細胞治療に関する他家技術に有用な、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質及びその作製方法の提供。　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、及び該物質を細胞表面に発現している細胞。

Description

ＮＫＧ２Ａアゴニストを用いた免疫拒絶の回避方法
　本発明は、臓器移植や細胞治療に関する他家技術に有用な、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、その作製方法、その使用方法等に関する。
　さらに、本発明は、臓器移植や細胞治療に関する他家技術に有用な、抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、その作製方法、その使用方法等に関する。
　免疫は、自然免疫と獲得免疫に分類される。自然免疫は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、顆粒球等の免疫細胞を中心とした広範囲の病原体に対する迅速な免疫応答である。一方、獲得免疫は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞等の免疫細胞を中心とした選択的で効果的な免疫応答である。
　ヒト多能性幹細胞は様々な疾患を治療する可能性を持つが、ヒト多能性幹細胞の臨床使用には大きな制限があり、それは主要組織適合性複合体（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）の違いによる、レシピエントによる移植細胞の拒絶である。
　主なＭＨＣは、全ての脊椎動物に見られる白血球又は他細胞との白血球の相互作用を仲介する細胞表面多成分分子である。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、Ｃｌａｓｓ　Ｉ、Ｃｌａｓｓ　ＩＩ、Ｃｌａｓｓ　ＩＩＩの３つのグループに分類され、ヒトではヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。　Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡタンパク質は全ての有核細胞で発現され、ＨＬＡ　Ｃｌａｓｓ　Ｉ重鎖（又はα鎖）とβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）により構成される。Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡタンパク質はペプチドを、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。これまでに６つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ　α鎖が同定されており、３つの古典的（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）及び３つの非古典的（ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ及びＨＬＡ－Ｇ）α鎖が含まれる。Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ分子のペプチド結合クレフトに対するペプチド結合の特異性は、α鎖によって決定される。Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ分子によって提示されるペプチドのＣＤ８陽性Ｔ細胞による認識は、細胞性免疫を媒介する。
　移植において非自己に由来するＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡタンパク質は外来抗原として認識され、非自己Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡタンパク質の認識は多能性細胞の移植又は置換療法を使用する際の主要な障壁となる。現在、各患者に由来するＨＬＡタイプの幹細胞バンク又は多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統からのＨＬＡ一致又は部分一致の細胞が移植用に開発されているが、個々に一致する細胞株の開発には莫大なコスト、数ヶ月の細胞培養、高度な訓練を受けた人材、最終製品の広範な検証が必要であり、これらはすべて規制当局の承認を得て行わなければならない。さらに、各細胞株は、遺伝子発現パターン、培養特性、分化能、及び遺伝的変異において、やや異なる動作をする可能性があり、それを個々の細胞株ごとに適用することは非常に困難である。
　個別化された幹細胞の準備又はＨＬＡの多様な幹細胞バンクは、移植の現在の問題に対処できるが、複数の細胞株を特徴付け、治療用細胞製品に分化させ、ヒトへの投与を承認する必要がある。この時間のかかる、技術的に困難で費用のかかるプロセスは、幹細胞ベースの治療法が臨床試験に参加することを妨げる主な要因である。したがって、拒絶反応によって妨げられない、より効果的でより安価な細胞ベースの治療法が必要とされている。
　Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を介して、細胞表面にあるＨＬＡ分子を認識する。ＨＬＡは通常の細胞においては内在性の自己ペプチドを、感染細胞においてはウイルス由来非自己ペプチドを提示することによって、免疫反応を調整し、恒常性を維持している。
　ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｋｉｌｌｅｒ）細胞は、自己のＨＬＡタイプを認識して、同タイプのＨＬＡを発現しない細胞に対して殺細胞活性を示す、Ｍｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆという自己と非自己の認識機能を有する（非特許文献１）。Ｍｉｓｓｉｎｇ　Ｓｅｌｆ機能において、ＮＫ細胞表面に発現するＮＫＧ２、ＫＩＲ等の受容体が自己のＨＬＡタイプの認識を担っている。これらの受容体には抑制型受容体と活性型受容体が存在する。自己の細胞は、ＮＫ細胞と同じタイプのＨＬＡがＮＫ細胞上の抑制型受容体に結合し、抑制シグナルがＮＫ細胞内に伝達され、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、ＮＫ細胞による排除を回避している。
　また、このようなＮＫ細胞上の抑制型受容体について、一個体中のＮＫ細胞であっても、複数の抑制型受容体の発現型を呈するＮＫ細胞集団が含まれることが知られており、例えばヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に含まれＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性で同定されるＮＫ細胞の約半数がＮＫＧ２Ａ陽性であり、残りの半数はＮＫＧ２Ａ陰性で、ＫＩＲやＬＩＬＢといった別の抑制型受容体を発現するＮＫ細胞集団であったことが報告されている（非特許文献２）。
　ＮＫＧ２（ＣＤ１５９）は、Ｃ型レクチンスーパーファミリーに属し、ＮＫＧ２Ａ，ＮＫＧ２Ｂ，ＮＫＧ２Ｃ，ＮＫＧ２Ｄ，ＮＫＧ２Ｅ，ＮＫＧ２Ｆ，ＮＫＧ２Ｈの7つのアイソフォームから構成される。このうちＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈは同じくＣ型レクチンファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質であるＣＤ９４（ＫＬＲＤ１）とヘテロ二量体を形成し、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ由来のペプチドなどを提示したＨＬＡ－Ｅをリガンドとする。ＮＫＧ２はＮＫ細胞の活性化制御に関与しており、アイソフォームによって活性型と抑制型に分類されるが、ＣＤ９４は細胞質内にシグナル伝達モチーフを持たないため、活性型と抑制型の決定はＮＫＧ２の細胞質内モチーフによって決定される。ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｈは、膜貫通部分に荷電残基を持ち、ＩＴＡＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｍｏｔｉｆ）モチーフを持つアダプター蛋白質のＤＡＰ１２と結合し、活性型のシグナルを伝達する。一方、ＮＫＧ２ＡとＮＫＧ２Ｂは、細胞質内にＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｍｏｔｉｆ）モチーフを持ち、抑制型のシグナルを伝達する。また、ＮＫＧ２ＤはＣＤ９４とヘテロ２量体を形成せず、ＨＬＡ－ＥではなくＭＩＣＡ、ＭＩＣＢをリガンドとするＮＫレセプターであり、ＩＴＡＭモチーフを持つアダプター蛋白質のＤＡＰ１０と結合し、活性型のシグナルを伝達する（非特許文献３）。
　ＫＩＲ（Ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は一回膜貫通蛋白質で、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞、またＴ細胞の一部に発現し、主要リガンドとしてＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃを認識する（非特許文献２）。特に宿主のＨＬＡタイプに基づいた認識を行い、例えばＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ１（ＨＬＡ－Ｃの第７７アミノ酸がＳ、第８０アミノ酸がＮであるものをＣ１　ｔｙｐｅと呼ぶ）のヒト由来のＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ２（ＨＬＡ－Ｃの第７７アミノ酸がＮ、第８０アミノ酸がＫであるものをＣ２　ｔｙｐｅと呼ぶ）を感知したときに攻撃を加え、逆も同じ機序で殺細胞活性を示す（非特許文献１）。これがＭｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆと呼ばれる機構である。このＭｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆを司る分子は、宿主がＨＬＡ－Ｃ１由来であればＫＩＲ２ＤＬ２／３が抑制型受容体として機能し、ＨＬＡ－Ｃ２由来であればＫＩＲ２ＤＬ１が抑制型受容体として機能する。抑制受容体は細胞内部分にＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｍｏｔｉｆ）を持ち、ＨＬＡとの会合によりクラスターを形成し、細胞内部にてＳＨＰ－１などのアダプター分子を介し抑制型シグナルを伝達する（非特許文献４）。
　ＮＫ細胞はＣＤ５６陽性かつＣＤ３陰性の細胞として特徴づけられる。さらにＮＫ細胞はその機能及び表現型の違いから大きくＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ　ＮＫ細胞とＣＤ５６ｄｉｍ　ＮＫ細胞に大別される。サイトカインの刺激に高い応答を示すＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ　ＮＫ細胞はＴ細胞などの免疫調節の役割をもち、二次リンパ器官、肝臓、皮膚、骨髄に移動し、そこで優勢なＮＫ細胞のサブセットとなる。細胞傷害性を持つＣＤ５６ｄｉｍ　ＮＫ細胞は活性型及び抑制型受容体からの入力を優先し、末梢血液中のＮＫ細胞の大部分を生めることが知られている。一般的にＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ　ＮＫ細胞はＮＫＧ２Ａの発現が優勢であるのに対し、細胞傷害性を持つＣＤ５６ｄｉｍ　ＮＫ細胞は一般的にＮＫＧ２Ａの発現が低く、ＮＫＧ２Ｃや活性型もしくは抑制型ＫＩＲを優位に発現する傾向にあることが知られている（非特許文献５）。
　ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３に対する抗体としては、抗がん剤として臨床試験にあるＬｉｒｉｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－９８６０１５，　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ４）や、マウス抗体であるＰａｎ２Ｄ（ＮＫＶＦＳ１，　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１）が存在する。また、ＫＩＲ３ＤＬ１に対する抗体は特許文献（ＷＯ２０１８／１４８２２３　Ａ１）に記載の抗体が、同様に抗がん剤の候補物質として報告されている。癌細胞は免疫細胞の受容体に対する活性化リガンドの発現を低下させたり、抑制型リガンドの発現を増強したりすることで、殺細胞活性から回避する機序がある。癌細胞表面に発現するＨＬＡもＮＫ細胞の抑制型受容体に作用しＭｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆ機能を利用することで、ＮＫ細胞からの攻撃を回避する。ＬｉｒｉｌｕｍａｂやＰａｎ２Ｄ抗体の作用機序は抑制型ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＬ１／２／３に結合してＨＬＡとの会合を阻害し、癌に対するＮＫ細胞の活性化を促進することが報告されているが（非特許文献６、特許文献１）、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性については記載されていない。
　これまでに、ホストとドナーのＨＬＡ不一致に起因する免疫細胞による排除の問題を解決するため、ＨＬＡのタンパク質構成の一部であるＢ２Ｍ（ｂｅｔａ－２　ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を遺伝子編集で欠損させることで、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの細胞膜上発現を抑制させ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞による認識から逃れる手法をＤｒ．Ｄａｖｉｄ　Ｒｕｓｓｅｌらが報告した。これにより細胞表面のＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－Ｅ，ＨＬＡ－Ｆ，ＨＬＡ－Ｇを欠損した細胞ができる。一方でＮＫ細胞による排除を回避するために、Ｂ２Ｍの欠損と同時に、同細胞の細胞表面にＨＬＡ－Ｅ（天然ではヘテロ３量体）を一本鎖タンパク質として強制発現させた。このことにより他のＨＬＡは発現せずに、ＨＬＡ－Ｅのみ発現した細胞（以下、「ユニバーサルセル技術」という。）が取得され、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制したことが報告されている（特許文献２）。このユニバーサルセル技術は他家ＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－Ｔ細胞の開発など広く利用されている（非特許文献７）。
　ヒトＮＫＧ２Ａに対する抗体としては、抗がん剤として臨床試験にあるＭｏｎａｌｉｚｕｍａｂ（ＩＰＨ２２０１，　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ４、特許文献４）が存在する。また複数の特許文献（特許文献５、ＵＳ　２０１５／Ｏ１２５４６４　Ａ１、ＷＯ２０１６／０４１９４７Ａ１）に記載の抗体が、同様に抗がん剤の候補物質として報告されている。癌細胞は免疫細胞の受容体に対する活性化リガンドの発現を低下させたり、抑制型リガンドの発現を増強したりすることで、殺細胞活性から回避する機序があり、癌細胞表面に発現するＨＬＡもＮＫ細胞の抑制型受容体に作用しＭｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆ機能を利用することで、ＮＫ細胞からの攻撃を抑制する。Ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂやそのほか抗がん剤としてのＮＫＧ２Ａに対する抗体の作用機序はＮＫＧ２Ａに結合してＨＬＡ－Ｅとの会合を阻害し、癌に対するＮＫ細胞の活性化を促進することであることが報告されているが（特許文献４、特許文献５）、ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性については記載されていない。
　他の免疫排除回避技術としては、ＮＫ細胞やＴ細胞に広範囲に発現するＣＤ４５を標的としたアゴニストを細胞表面に発現させた細胞が、ＣＤ４５発現免疫細胞による殺細胞活性を抑制したことが報告されている（特許文献３）。
国際公開第ＷＯ２００６／００３１７９号 国際公開第ＷＯ２０１２／１４５３８４号 国際公開第ＷＯ２０２１／１１３８５３号 国際公開第ＷＯ２０１６／０４１９４７号 米国公開第ＵＳ２０２００１９９２２６号
ＮＫ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：　ｏｆ　ｍｉｓｓｉｎｇ　ｓｕｇａｒ　ａｎｄ　ｍｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆ．，　Ｐ　Ｐａｒｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ　Ｂｉｏｌ．　２０００　Ｍａｒ　９；１０（５）：Ｒ１９５－７． ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｈｕｍａｎ　ＮＫ－ｃｅｌｌ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ　ｔｏｗａｒｄ　ａ　ｂａｌａｎｃｅ　ｏｆ　ｍｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ，　Ｙａｗａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｌｏｏｄ．　２００８　Ｓｅｐ　１５；１１２（６）：２３６９－８０． Ｔｈｅ　ＣＤ９４／ＮＫＧ２　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：　ｆｒｏｍ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｌｅｖａｎｃｅ．　Ｆ．　Ｂｏｒｒｅｇｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｓ．　２００６；３５（３）：２６３－７８． Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：　ｔｈｅ　ＮＫ　ｃｅｌｌ　ｐａｒａｄｉｇｍ．　Ｅ　Ｏ　Ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ．　２００８　Ａｕｇ；２２４：７０－８４． Ａ　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ＮＫ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈａｔ　ｌａｃｋｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒｅｓｅｐｔｏｒｓ　ｆｗｏｒ　ｓｅｌｆ－ＭＨＣ　ｉｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ　ｉｍｍａｔｕｒｅ．Ｓａｒａｈ　Ｃｏｏｌｅｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００７　Ｊｕｌ　１５．１１０（２）：　５７８-５８６． Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　１－７Ｆ９，　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉ－ＫＩＲ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｈａｔ　ａｕｇｍｅｎｔｓ　ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ．　Ｆ　Ｒｏｍａｇｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｌｏｏｄ．　２００９　Ｓｅｐ　２４；１１４（１３）：２６６７－７７． Ｅｎｄｏｗｉｎｇ　ｕｎｉｖｕｌｅｒｓａｌ　ＣＡＲ　Ｔ－ｓｅｌｌ　ｗｈｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｅ－ｅｖａｓｉｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ＴＡＬＥＮ－ｇｅｎｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｕｍｉｎ　Ｊｏ，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ．２０２２　Ｎｏｖ　３０．１３，　３４５３．
　特許文献２に開示されたユニバーサルセル技術には、以下の課題がある。ヒト個体が保持する全てのＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａを発現しているわけではない。例えばヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に含まれＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性で同定されるＮＫ細胞のうち、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ　ＮＫ細胞はＮＫＧ２Ａ発現が優位な傾向にあり、ＣＤ５６ｄｉｍ　ＮＫ細胞はＮＫＧ２Ａの発現が低く、ＮＫＧ２ＣやＫＩＲといった別のＮＫレセプターを発現している傾向にある。つまり、ユニバーサルセル技術を搭載したＨＬＡ－Ｅ導入細胞は細胞傷害活性の高いＣＤ５６ｄｉｍ　ＮＫ細胞のようなＮＫＧ２Ａを低発現あるいは未発現かつ、ＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞に対し、ＨＬＡ－ＥがＮＫＧ２Ｃと結合しＮＫ細胞の細胞傷害活性を活性化することで攻撃を受ける可能性がある。
　非特許文献７では、ユニバーサル技術を搭載したＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞よりもＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞の割合が多いドナーから得たＮＫ細胞と共培養したとき、ユニバーサル技術を搭載したＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞からの攻撃を受け、細胞生存率が著しく低下することが示されている。この結果からユニバーサル技術におけるＨＬＡ－ＥのＮＫＧ２Ｃを介した宿主ＮＫ細胞の活性化は他家細胞技術の免疫回避において無視できない課題であることが示唆されている。
　特許文献２に開示された技術について、ＣＤ４５はＴ細胞に発現していることから、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞にＣＤ４５アゴニストを搭載する場合、自分自身の機能・活性を抑制するリスクが考えられる。またＣＤ４５という広範囲の免疫細胞に発現する標的分子を狙うことから副作用や、治療細胞が癌化しても拒絶による回避ができないリスクもある。以上から、広範囲ではなく、必要最低限の発現分布を持ち、免疫細胞の性質に直結した標的に対するアゴニスト物質を利用した免疫拒絶回避技術が求められる。
　ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２ＡとＫＩＲの発現分布は逆相関の関係性にあり（非特許文献２）、ＮＫＧ２Ａ発現が低いＮＫ細胞ではＫＩＲ発現量が高い。このことからユニバーサルセル技術においてＨＬＡ－Ｅ導入細胞はＮＫＧ２Ａ高発現細胞で有効性を示す一方で、ＮＫＧ２Ａ低又は非発現、かつ抑制型ＫＩＲ発現のＮＫ細胞では有効性を示さないことが示唆される。一方で抑制型ＫＩＲのリガンドはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃであることからこれを直接導入することはレシピエントＴ細胞のＴＣＲを介した拒絶の回避と両立できないことから、ＨＬＡ様のアゴニスト活性を持つ物質が必要となる。
　ＮＫＧ２Ａに対する抗体として知られているＭｏｎａｌｉｚｕｍａｂやそのほか抗がん剤としてのＮＫＧ２Ａに対する抗体は、ＮＫＧ２Ａに対して天然のリガンド結合による抑制シグナルを阻害する作用を示すことが報告されている。しかし、これらの抗体がＮＫＧ２Ａに対してアゴニスト活性を示すかどうかは不明であった。また、これらの抗体がＮＫＧ２Ｃに対してアゴニスト活性を示さないかどうかも不明であった。
　ＫＩＲに対する抗体として知られているＬｉｒｉｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－９８６０１５，Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ４）や、マウス抗体であるＰａｎ２Ｄ（ＮＫＶＦＳ１，Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ１）は、抑制型ＫＩＲに対して天然のリガンド結合による抑制シグナルを阻害する作用を示すことが報告されているが、リガンド非存在条件での作用は不明であった。
　本発明者らは、複数の抗ＮＫＧ２Ａ抗体の遺伝子配列から作成したｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ）を膜型タンパク質として細胞表面に発現させることで、ＨＬＡ－Ｅを細胞表面に発現した細胞同様にＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を入力しＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞からの攻撃を回避しうることを発見した。またＨＬＡ－ＥがＮＫＧ２Ｃにも結合性を有するのに対し、前記ｓｃＦｖのうち一つは、ＮＫＧ２Ａに対して高い結合性を示すが、ＮＫＧ２Ｃに対して結合性を示さないＮＫＧ２Ａ特異的ｓｃＦｖであることを発見した。
　ＨＬＡ－ＥもしくはＮＫＧ２Ａ特異的ｓｃＦｖを細胞表面に発現させた細胞をＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞と共培養すると、ＨＬＡ－Ｅを発現させた細胞ではＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞を活性化したのに対し、ＮＫＧ２Ａ特異的ｓｃＦｖを発現させた細胞ではＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞は活性化しないことを見出し、当該ｓｃＦｖがＮＫＧ２Ａ特異的アゴニスト活性を有することを見出した。
　さらに、本発明者らは、ＮＫＧ２Ａに対する特異的アゴニスト活性を有するｓｃＦｖ、及び抑制型ＫＩＲに結合しアゴニスト活性を示すｓｃＦｖを共発現させた細胞を、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞、あるいはＮＫＧ２Ｃ陽性かつ抑制型ＫＩＲ陽性ＮＫ細胞と共培養すると、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞及び、ＮＫＧ２Ｃ陽性かつ抑制型ＫＩＲ陽性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することを見出した
　また、抑制型ＫＩＲアゴニストの発明に関して、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂがリガンド不在の場合にＮＫ細胞の抑制型ＫＩＲに対してアゴニスト活性を示すことを発見した。またその遺伝子配列を導入したｓｃＦｖを細胞膜表面上に発現させた細胞が、ＮＫ細胞からの攻撃を回避しうることを発見した。またＫＩＲに対するＰａｎ２Ｄ（ＮＫＶＳＦ１）も同じく可溶性及び細胞表面上において、抑制型ＫＩＲに対してアゴニスト活性を示すことを発見した。しかしながらＬｉｒｉｌｕｍａｂとＰａｎ２Ｄは抑制型ＫＩＲだけでなく、活性型ＫＩＲにも結合性を示し、活性化ＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＳ１、２、４など）に対するアゴニスト作用としてＮＫ細胞の活性を増強させることが確認された。
　このことから活性型ＫＩＲに対する選択性を有し、抑制型ＫＩＲだけに結合し、更に抑制型ＫＩＲに対するアゴニストバインダーを取得することにした。結果として、ヒト抗体ファージライブラリーを用いたＰｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにより抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に結合しアゴニスト活性を示し、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に結合しない物質、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合しアゴニスト活性を示し、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に結合しない物質、及びＫＩＲ３ＤＬ１に結合しアゴニスト活性を示し、ＫＩＲ３ＤＳ１に結合しない物質を同定するに至り、更に検討を進めることにより本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
[１]　ヒト抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質。
[２]　ヒト抑制型ＫＩＲに対する結合部位を含有するポリペプチドである、[１]の物質。
[３]　ヒト抑制型ＫＩＲに対する結合部位が、ヒト抑制型ＫＩＲに結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、[２]の物質。
[４]　ヒト抑制型ＫＩＲに結合する活性が、その対応するヒト活性型ＫＩＲに結合する活性よりも高い、[１]の物質。
[５]　ヒト抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性が、その対応するヒト活性型ＫＩＲに対するアゴニスト活性よりも高い、[１]の物質。
[６]　その対応するヒト活性型ＫＩＲに対して、実質的にアゴニスト活性を示さない、[１]の物質。
[７]　ポリペプチドが、以下の（１）～（３）のいずれかである[２]の物質；
（１）　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位が、ＨＬＡ－Ｃ１タイプに属するＨＬＡ－Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、Ｃｗ８、Ｃｗ９、Ｃｗ１０、Ｃｗ１２、Ｃｗ１４、Ｃｗ１６、ＨＬＡ－Ｂ４６又はＢ７３に含まれるＣ１エピトープモチーフ配列（７７番目のアミノ酸がＳであり、８０番目のアミノ酸がＮである）を含み、ＴＣＲとの結合性を欠失又は減弱させたポリペプチド、
（２）　ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位が、ＨＬＡ－Ｃ２タイプに属するＨＬＡ－Ｃｗ２、Ｃｗ４、Ｃｗ５、Ｃｗ６、Ｃｗ１５又はＣｗ１７に含まれるＣ２エピトープモチーフ配列（７７番目のアミノ酸がＮであり、８０番目のアミノ酸がＫである）を含み、ＴＣＲとの結合性を欠失又は減弱させたポリペプチド、
（３）　ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位が、ＨＬＡ－Ｂｗ４タイプに属するＨＬＡ―Ｂ５、Ｂ２７、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ４４、Ｂ４９、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ７７、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２５又はＡ３２に含まれるＢｗ４エピトープモチーフ配列（７７番目のアミノ酸がＮであり、８０番目のアミノ酸がＩまたはＴであり、８３番目のアミノ酸がＲである）を含み、ＴＣＲとの結合性を欠失又は減弱させたポリペプチド。
[８]　ヒト抑制型ＫＩＲが、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３であり、結合部位が、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、[３]の物質。
[９]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片が、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３との結合においてＬｉｒｉｌｕｍａｂ、Ｐａｎ２Ｄ、又は、以下の（ｉ）～（ｘｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合することを特徴とする、[８]の物質；
（ｉ）　配列番号３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号３７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号３９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖ）　配列番号４１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉ）　配列番号４３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）　配列番号４５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）　配列番号４７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｘ）　配列番号４９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘ）　配列番号５１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列
（ｘｉ）　配列番号６１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号６２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｘｉｉ）　配列番号６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号６４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
[９－２]　配列番号５１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合することを特徴とする、[９]の物質。
[１０]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位が、ＫＩＲ２ＤＬ２との結合複合体のＸ線結晶構造に基づくモデル構造解析において、配列番号６のＫＩＲ２ＤＬ２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号４４～４９番目の領域における４７番目のＡｓｐを含む１～６個のアミノ酸、６５～６８番目の領域において、６７番目のＧｌｙ及び６８番目のＰｒｏを含む２～４個のアミノ酸、および、７０～７３番目の領域において７２番目のＡｓｐを含む１～４個のアミノ酸と近接した配置をとるアミノ酸をふくむ可変領域を含むことを特徴とする[８]の物質。
[１１]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位において、前記構造解析により配列番号６の４７番目のＡｓｐと相互作用すると計算されるアミノ酸がＴｙｒであり、前記構造解析により配列番号６の６７番目のＧｌｙと相互作用するとして計算されるアミノ酸がＧｌｙであり、前記構造解析により配列番号６の６８番目のＰｒｏと相互作用するとして計算されるアミノ酸がＴｙｒであり、且つ、前記構造解析により配列番号６の７２番目のＡｓｐと相互作用するとして計算されるアミノ酸がＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｌａであることを特徴とする[１０]の物質。
[１２]　［１１］において特定された可変領域に含まれるアミノ酸がＣＤＲ３に属することを特徴とする[１１]の物質。
[１３]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位として以下の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかの結合部位を含むポリペプチドであり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[８]の物質；
（Ｉ）　配列番号３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＩ）　配列番号３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＩＩ）　配列番号３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＶ）　配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（Ｖ）　配列番号４１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩ）　配列番号４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩＩ）　配列番号４５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩＩＩ）　配列番号４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＸ）　配列番号４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（Ｘ）　配列番号５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＩ）　配列番号６１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号６２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＸＩＩ）　配列番号６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号６４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[１３－２]　配列番号５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位を含むポリペプチドである、[１３]の物質。
[１４]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[１３]の物質。
[１４－２]　前記（ｘ）における第２の可変領域において、配列番号５２のアミノ酸番号９４のＴｈｒが、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｌａに置換されていてもよい、[１３]又は[１４]の物質。
[１５]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位として以下の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかの結合部位を含むポリペプチドである[１３]の物質；
（Ｉ）　配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＩ）　配列番号３５のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＩＩ）　配列番号３７のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＶ）　配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（Ｖ）　配列番号４１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩ）　配列番号４３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩＩ）　配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩＩＩ）　配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４８のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＸ）　配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（Ｘ）　配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＩ）　配列番号６１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号６２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＸＩＩ）　配列番号６３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号６４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[１５－２]　 配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位を含むポリペプチドである[１５]の物質。
[１６]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合活性が、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及び／又はＫＩＲ２ＤＳ４に対する結合活性よりも高いことを特徴とする[８]の物質。
[１７]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト活性が、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及び／又はＫＩＲ２ＤＳ４に対するアゴニスト活性よりも高いことを特徴とする[８]の物質。
[１８]　ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及び／又はＫＩＲ２ＤＳ４に対して実質的にアゴニスト活性を示さないことを特徴とする[１７]の物質。
[１９]　ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に対して実質的に結合しないことを特徴とする[１７]の物質。
[２０]　以下の方法で取得された抗原結合性断片を含むことを特徴とする[１９]の物質；工程Ａ：ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２およびＫＩＲ２ＤＳ４の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を懸濁液に混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団からＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[２１]　以下の方法で取得された抗原結合性断片を含むことを特徴とする[１９]の物質；工程Ａ：ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しないＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２およびＫＩＲ２ＤＳ４の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３に特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[２２]　ラベルおよびラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、[２０]または[２１]の物質。
[２３]　更に、ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３に対してアゴニスト活性を有する物質を選抜する工程、を含む方法により取得されることを特徴とする[２０]又は[２１]の物質。
[２４]　前記ポリペプチドが、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片である[８]～[２３]のいずれかの物質。
[２５]　第１の可変領域と第２の可変領域がＧＳリンカーまたはＧ４Ｓリンカーを介して連結されていることを特徴とする、一本鎖抗体又はｓｃＦｖである[２４]の物質。
[２６]　前記ポリペプチドが、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質である、[８]～[２３]のいずれかの物質。
[２７]　抑制型ＫＩＲが、ＫＩＲ３ＤＬ１であり、結合部位が、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、[３]の物質。
[２８]　ＫＩＲ３ＤＬ１に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片が、ＫＩＲ３ＤＬ１との結合において、以下の（ｘｉｉｉ）～（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合することを特徴とする、[２７]の物質；
（ｘｉｉｉ）　配列番号５６の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｉｖ）　配列番号１３７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖ）　配列番号１３９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖｉ）　配列番号１４１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖｉｉ）　配列番号１４３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｘｖｉｉｉ）　配列番号１４５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
[２９]　ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位として以下の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかの結合部位を含むポリペプチドであり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[２７]の物質；
（ＸＩＩＩ）　配列番号５６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＩＶ）　配列番号１３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（の組合せを含む結合部位、
（ＸＶ）　配列番号１３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶＩ）　配列番号１４１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶＩＩ）　配列番号１４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＸＶＩＩＩ）　配列番号１４５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[３０]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[２９]の物質。
[３１]　ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位として以下の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかの結合部位を含むポリペプチドである[２７]の物質；
（ＸＩＩＩ）　配列番号５６のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５５のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＩＶ）　配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３８のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶ）　配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶＩ）　配列番号１４１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶＩＩ）　配列番号１４３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＸＶＩＩＩ）　配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４６のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[３２]　ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合活性が、ＫＩＲ３ＤＳ１に対する結合活性よりも高いことを特徴とする[２７]の物質。
[３３]　ＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト活性が、ＫＩＲ３ＤＳ１に対するアゴニスト活性よりも高いことを特徴とする[２７]の物質。
[３４]　ＫＩＲ３ＤＳ１に対して実質的にアゴニスト活性を示さないことを特徴とする[３３]の物質。
[３５]　ＫＩＲ３ＤＳ１に対して実質的に結合しないことを特徴とする[３４]の物質。
[３６]　以下の工程を含む方法で取得された抗原結合性断片を含むことを特徴とする[３５]の物質；
工程Ａ：ＫＩＲ３ＤＬ１に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＫＩＲ３ＤＬ１の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＫＩＲ３ＤＳ１の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団からＫＩＲ３ＤＳ１に結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[３７]　以下の方法で取得された抗原結合性断片を含むことを特徴とする[３６]の物質；工程Ａ：ＫＩＲ３ＤＬ１に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＫＩＲ３ＤＬ１の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しないＫＩＲ３ＤＳ１の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＫＩＲ３ＤＬ１に特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[３８]　ラベルおよびラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチンーアビジンの組み合わせである、[３６]又は[３７]の物質。
[３９]　更に、ＫＩＲ３ＤＬ１に対してアゴニスト活性を有する物質を選抜する工程、を含む方法により取得されることを特徴とする[３６]～[３８]のいずれかの物質。
[４０]　前記ポリペプチドが、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片である[２７]～[３９]のいずれかの物質。
[４１]　第１の可変領域と第２の可変領域がＧＳリンカーまたはＧ４Ｓリンカーを介して連結されていることを特徴とする、一本鎖抗体又はｓｃＦｖである[４０]の物質。
[４２]　前記ポリペプチドが、ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質である、[２７]～[３４]のいずれかの物質。
[４３]　抑制型ＫＩＲが、ＫＩＲ２ＤＬ１であり、結合部位が、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、[３]の物質。
[４４]　ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片が、ＫＩＲ２ＤＬ１との結合において、Ｐａｎ２Ｄと競合することを特徴とする、[４３]の物質。
[４５]　ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片が、ＫＩＲ２ＤＬ１との結合において、以下の（ｃｉ）～（ｃｘｖ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合することを特徴とする、[４３]の物質：
（ｃｉ）　配列番号１０７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１０８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｉ）　配列番号１０９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｉｉ）　配列番号１１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｖ）　配列番号１１３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖ）　配列番号１１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉ）　配列番号１１７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉｉ）　配列番号１１９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉｉｉ）　配列番号１２１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｘ）　配列番号１２３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘ）　配列番号１２５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉ）　配列番号１２７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｉ）　配列番号１２９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｉｉ）　配列番号１３１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｖ）　配列番号１３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｃｘｖ）　配列番号１３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
[４６]　ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位として以下の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかの結合部位を含むポリペプチドであり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[４３]の物質；
（ＣＩ）　配列番号１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１０８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＩ）　配列番号１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＩＩ）　配列番号１１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＶ）　配列番号１１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位、
（ＣＶ）　配列番号１１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩ）　配列番号１１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩＩ）　配列番号１１９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩＩＩ）　配列番号１２１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＸ）　配列番号１２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸ）　配列番号１２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩ）　配列番号１２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＩ）　配列番号１２９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＩＩ）　配列番号１３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＶ）　配列番号１３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＣＸＶ）　配列番号１３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[４７]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[４６]の物質。
[４８]　ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位として以下の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）いずれかの結合部位を含むポリペプチドである[４６]の物質；
（ＣＩ）　配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＩ）　配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１０のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＩＩ）　配列番号１１１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＶ）　配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位、
（ＣＶ）　配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩ）　配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第１の可変領域（と配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩＩ）　配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩＩＩ）　配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＸ）　配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸ）　配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩ）　配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２８のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＩ）　配列番号１２９のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３０のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＩＩ）　配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３２のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＶ）　配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＣＸＶ）　配列番号１３５のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[４９]　ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合活性が、ＫＩＲ２ＤＳ１に対する結合活性よりも高いことを特徴とする[４３]の物質。
[５０]　ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト活性が、ＫＩＲ２ＤＳ１に対するアゴニスト活性よりも高いことを特徴とする[４３]の物質。
[５１]　ＫＩＲ２ＤＳ１に対して実質的にアゴニスト活性を示さないことを特徴とする[５０]の物質。
[５２]　ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に対して実質的に結合しないことを特徴とする[５１]の物質。
[５３]　以下の方法で取得された抗原結合性断片を含むことを特徴とする[５２]の物質；工程Ａ：ＫＩＲ２ＤＬ１に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＫＩＲ２ＤＳ１，ＫＩＲ２ＤＳ２およびＫＩＲ２ＤＳ４の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団からＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[５４]　以下の工程を含む方法で取得された抗原結合性断片を含むことを特徴とする[５２]の物質；
工程Ａ：ＫＩＲ２ＤＬ１に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＫＩＲ２ＤＬ１の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しないＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２およびＫＩＲ２ＤＳ４の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＫＩＲ２ＤＬ１に特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[５５]　ラベルおよびラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、[５３]又は[５４]の物質。
[５６]　更に、ＫＩＲ３ＤＬ１に対してアゴニスト活性を有する物質を選抜する工程、を含む方法により取得されることを特徴とする[５３]～[５５]のいずれかの物質。
[５７]　前記ポリペプチドが、モノクローナル抗体又は抗原結合性断片である[４３]～[５６]のいずれかの物質。
[５８]　第１の可変領域と第２の可変領域がＧＳリンカーを介して連結されていることを特徴とする、一本鎖抗体又はｓｃＦｖである[５７]の物質。
[５９]　前記ポリペプチドが、ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位を含む細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質である、[４３]～[５６]のいずれかの物質。
[６０]　[１]～[５９]のいずれかの物質を有効成分として含む医薬組成物。
[６１]　免疫拒絶抑制剤である、[６０]の医薬組成物。
[６２]　[１]～[５９]のいずれかの抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞。
[６３]　細胞表面に更に、ＮＫＧ２Ａに対するリガンド物質が発現している、[６２]の細胞。
[６４]　ＮＫＧ２Ａに対するリガンドが、ＨＬＡ－Ｅである[６３]の細胞。
[６５]　更に、細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱している、[６２]の細胞。
[６６]　細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現の消失又は減弱が、遺伝子編集によるゲノム上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びＴＡＰＢＰ領域からなる群から選択される少なくとも一つの改変（好ましくはＢ２Ｍの改変、より好ましくはＢ２Ｍの欠損）によるものである、[６５]の細胞。
[６７]　遺伝的にＨＬＡ発現が消失している個体から樹立された細胞株である、[６５]の細胞。
[６８]　細胞表面に更に、ＮＫＧ２Ａに対するリガンド物質が発現し、且つ、細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱している、[６２]の細胞。
[６９]　細胞が、多能性幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、間葉系幹細胞、心筋細胞、軟骨細胞、網膜細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、又は、すい臓細胞である、[６２]の細胞。
[７０]　多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である、[６９]の細胞。
[７１]　細胞表面に更に、キメラ受容体が発現している、[６２]～[７０]のいずれかの細胞。
[７２]　抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３であり、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が[２６]の膜型タンパク質である、[６２]の細胞。
[７３]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合する膜型タンパク質が、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３との結合においてＬｉｒｉｌｕｍａｂ、Ｐａｎ２Ｄ、又は、以下の（ｉ）～（ｘｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合する結合部位を含むことを特徴とする、[７２]の細胞；
（ｉ）　配列番号３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号３７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号３９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖ）　配列番号４１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉ）　配列番号４３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）　配列番号４５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）　配列番号４７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｘ）　配列番号４９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘ）　配列番号５１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
（ｘｉ）　配列番号６１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号６２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び、
（ｘｉｉ）　配列番号６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号６４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
[７４]　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位として以下の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかの結合部位を含む膜型タンパク質であり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい膜型タンパク質を細胞表面に発現する、[７２]の細胞；
（Ｉ）　配列番号３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＩ）　配列番号３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＩＩ）　配列番号３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＶ）　配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（Ｖ）　配列番号４１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩ）　配列番号４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩＩ）　配列番号４５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＶＩＩＩ）　配列番号４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号４８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＩＸ）　配列番号４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（Ｘ）　配列番号５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
（ＸＩ）　配列番号６１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号６２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＸＩＩ）　配列番号６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号６４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[７５]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[７４]の細胞。
[７６]　抑制型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＬ１であり、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が[４２]の膜型タンパク質である、[６２]の細胞。
[７７]　ＫＩＲ３ＤＬ１に結合する膜型タンパク質が、ＫＩＲ３ＤＬ１との結合において以下の（ｘｉｉｉ）～（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合する結合部位を含むことを特徴とする、[７６]の細胞；
（ｘｉｉｉ）　配列番号５６の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｉｖ）　配列番号１３７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖ）　配列番号１３９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖｉ）　配列番号１４１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖｉｉ）　配列番号１４３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｘｖｉｉｉ）　配列番号１４５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
[７８]　ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位として以下の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかの結合部位を含む膜型タンパク質であり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい膜型タンパク質を細胞表面に発現する、[７５]の細胞；
（ＸＩＩＩ）　配列番号５６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＩＶ）　配列番号１３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１３８のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位、
（ＸＶ）　配列番号１３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶＩ）　配列番号１４１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＸＶＩＩ）　配列番号１４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＸＶＩＩＩ）　配列番号１４５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[７９]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[７８]の細胞。
[８０]　抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ１であり、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が[５９]の膜型タンパク質である、[６２]の細胞。
[８１]　ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する膜型タンパク質が、ＫＩＲ２ＤＬ１との結合においてＰａｎ２Ｄと競合する結合部位を含むことを特徴とする、[８０]の細胞。
[８２]　ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位として以下の（Ｐ）の結合部位を含む膜型タンパク質であり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい膜型タンパク質を細胞表面に発現する、[７８]の細胞。
（Ｐ）　配列番号３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[８３]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[８２]の細胞。
[８４]　ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する膜型タンパク質が、ＫＩＲ２ＤＬ１との結合において以下の（ｃｉ）～（ｃｘｖ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合する結合部位を含むことを特徴とする、[８０]の細胞：
（ｃｉ）　配列番号１０７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１０８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｉ）　配列番号１０９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｉｉ）　配列番号１１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｖ）　配列番号１１３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖ）　配列番号１１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉ）　配列番号１１７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉｉ）　配列番号１１９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉｉｉ）　配列番号１２１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｘ）　配列番号１２３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘ）　配列番号１２５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉ）　配列番号１２７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｉ）　配列番号１２９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｉｉ）　配列番号１３１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｖ）　配列番号１３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｃｘｖ）　配列番号１３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
[８５]　ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位として以下の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかの結合部位を含む膜型タンパク質であり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい膜型タンパク質を細胞表面に発現する、[８０]の細胞；
（ＣＩ）　配列番号１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１０８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＩ）　配列番号１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＩＩ）　配列番号１１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＶ）　配列番号１１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位、
（ＣＶ）　配列番号１１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩ）　配列番号１１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（と配列番号１１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩＩ）　配列番号１１９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＶＩＩＩ）　配列番号１２１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＩＸ）　配列番号１２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸ）　配列番号１２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩ）　配列番号１２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１２８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＩ）　配列番号１２９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＩＩ）　配列番号１３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、
（ＣＸＩＶ）　配列番号１３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位、及び
（ＣＸＶ）　配列番号１３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１３６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
[８６]　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、[８５]の細胞。
[８７]　[６２]～[８６]のいずれかの細胞を有効成分として含む、投与又は移植対象における免疫拒絶リスクが低減された医薬組成物。
[８８]　免疫拒絶抑制剤である、[８７]の医薬組成物。
[８９]　[１]～[５９]のいずれかの物質を、治療用細胞の細胞表面に発現させる工程を含む、治療対象による治療用細胞に対する免疫拒絶を低減又は抑制する方法。
[９０]　[１]～[５９]のいずれかの物質を、治療用細胞の細胞表面に発現させる工程を含む、治療対象による免疫拒絶のリスクが低減又は抑制された治療用細胞の製造方法。
[９１]　以下の工程を含む、被験物質の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト活性による免疫拒絶回避活性を評価する方法；
（Ａ）体外において、ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、Ｂｗ４モチーフ含有ＨＬＡの発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
[９２]　以下の工程を含む、被験物質の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト活性による免疫拒絶回避活性を評価する方法；
（Ａ）体外において、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、Ｂｗ４モチーフ含有ＨＬＡの発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
[９３]　以下の工程を含む、被験物質の抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト活性による免疫拒絶回避活性を評価する方法；
（Ａ）体外において、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｂｗ４型が陽性／陽性ホモまたは陽性／陰性ヘテロの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｂｗ４型が陰性／陰性ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、ＨＬＡ－Ｃ型の発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
[９４]　[９１]～[９３]のいずれかの方法において、工程Ｂにおいて標的細胞の生存数が高い被験物質を免疫拒絶回避活性を有する物質として選抜する工程を含む、免疫拒絶回避活性を有する物質のスクリーニング方法。
[９５]　工程（Ａ）において、被験物質が、標的細胞の表面に膜型タンパク質として発現する形で存在することを特徴とする、[９１]～[９３]のいずれかの方法。
[９６]　以下の工程を含む、ヒト抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞を抑制する活性を有する物質を製造する方法；
工程Ａ：抑制型ＫＩＲに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液に当該抑制型ＫＩＲの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、当該ＫＩＲに結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、前記抑制型ＫＩＲに対応する活性型ＫＩＲの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ，担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団から当該活性型ＫＩＲに結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[９７]以下の工程を含むヒト抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞を抑制する活性を有する物質を製造する方法；
工程Ａ：抑制型ＫＩＲに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液に抑制型ＫＩＲの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しない前記抑制型に対応する活性型ＫＩＲの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、当該抑制型ＫＩＲに特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
[９８]　ラベルおよびラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、[９６]又は[９７]の方法。
[９９]　更に、当該抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を有する物質を選抜する工程を含む[９６]～[９８]のいずれかの方法。
[１００]　抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３であり、対応する活性型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４である、[９６]～[９９]のいずれかの方法。
[１０１]　抑制型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＬ１であり、対応する活性型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＳ１である、[９６]～[９９]のいずれかの方法。
[１０２]　抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ１であり、対応する活性型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４である、[９６]～[９９]のいずれかの方法。
　さらに、本発明は以下を提供する。
＜１＞　ＮＫＧ２Ａに対する結合部位を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質であるポリペプチドであって、（１）ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２Ａに結合して当該ＮＫ細胞を抑制する活性を有し、且つ、（２）実質的にＮＫＧ２Ｃに対するアゴニスト活性を有さない前記ポリペプチド。
＜２＞　前記結合部位が、ＮＫＧ２Ｃに結合する活性よりもＮＫＧ２Ａに結合する活性の方が高いことを特徴とする、＜１＞記載のポリペプチド。
＜３＞　前記結合部位が、実質的にＮＫＧ２Ｃに結合しないことを特徴とする、＜１＞のポリペプチド。
＜４＞　前記結合部位が、ＮＫＧ２Ａに結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の１つ又は２つの可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、＜１＞～＜３＞のいずれかのポリペプチド。
＜５＞　前記結合部位が、以下の方法で取得された抗原結合性断片に含まれる１つ又は２つの可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする＜４＞のポリペプチド；
工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＮＫＧ２Ａに結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を懸濁液に混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ，担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団からＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
＜６＞　前記結合部位が、以下の方法で取得された抗原結合性断片の１つ又は２つの可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする＜４＞のポリペプチド；
工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しないＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
＜７＞　ラベル及びラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、＜５＞又は＜６＞のポリペプチド。
＜８＞　更に、ＮＫＧ２Ａに対してアゴニスト活性を有する抗原結合性断片を選抜する工程、を含む方法により取得されることを特徴とする＜５＞又は＜６＞のポリペプチド。
＜９＞　前記結合部位が、第１の可変領域と第２の可変領域がＧＳリンカー又はＧ４Ｓリンカーを介して連結されていることを特徴とする一本鎖抗体又はｓｃＦｖである＜１＞～＜８＞のいずれかのポリペプチド。
＜１０＞　前記結合部位が、ＮＫＧ２Ａとの結合において、以下のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合することを特徴とする、＜１＞のポリペプチド；
（Ｎ－ｉ）配列番号１６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１６４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
＜１１＞　前記結合部位として以下の結合部位を含むポリペプチドであり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、＜１＞のポリペプチド；
（Ｎ－Ｉ）　配列番号１６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１６４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
＜１２＞　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、＜１１＞のポリペプチド。
＜１３＞　前記結合部位として以下の結合部位を含むポリペプチドである＜１１＞のポリペプチド；
（Ｎ－Ｉ）　配列番号１６３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
＜１４＞　＜１＞～＜１３＞のいずれか一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１５＞　＜１＞～＜１３＞のいずれか一つに記載のポリペプチドが細胞表面に発現している細胞。
＜１６＞　細胞表面に更に、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質が発現している、＜１５＞の細胞。ここで、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質として好ましくは、[２６]に記載のＫＩＲ２ＤＬ２／３に対する膜型タンパク質、[４２]に記載のＫＩＲ３ＤＬ１に対する膜型タンパク質及び[５９]に記載のＫＩＲ２ＤＬ１に対する膜型タンパク質である。
＜１７＞　抑制型ＫＩＲが、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ１の内少なくとも一つ（好ましくはＫＩＲ２ＤＬ２／３）である＜１６＞の細胞。
＜１８＞　更に、細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱している、＜１５＞～＜１７＞のいずれか一つの細胞。
＜１９＞　細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現の消失又は減弱が、遺伝子編集によるゲノム上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びＴＡＰＢＰ領域からなる群から選択される少なくとも一つの改変（好ましくはＢ２Ｍの改変、より好ましくはＢ２Ｍの欠損）によるものである、＜１８＞の細胞。
　このような細胞としてより好ましいものは以下の条件をすべて満たす細胞である。
＜i＞　上記＜１＞～＜１３＞のいずれか一つに記載のポリペプチドが細胞表面に発現している、
＜ii＞　抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質（好ましくは、[２６]に記載のＫＩＲ２ＤＬ２／３に対する膜型タンパク質、[４２]に記載のＫＩＲ３ＤＬ１に対する膜型タンパク質及び[５９]に記載のＫＩＲ２ＤＬ１に対する膜型タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つである）が細胞表面に発現している、及び
＜iii＞　遺伝子編集によるゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子の改変（好ましくは欠損）により細胞表面上の少なくとも一つ（好ましくは全て）のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱している。
＜２０＞　遺伝的にＨＬＡ発現が消失している個体から樹立された細胞株である、＜１８＞の細胞。
＜２１＞　細胞が、多能性幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、間葉系幹細胞、心筋細胞、軟骨細胞、網膜細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、又は、すい臓細胞である、＜１５＞～＜２０＞のいずれか一つの細胞。
＜２２＞　多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である、＜２１＞の細胞。
＜２３＞　細胞表面に更に、キメラ受容体が発現している、＜１５＞～＜２２＞のいずれか一つの細胞。
＜２４＞　＜１５＞～＜２３＞のいずれか一つの細胞を有効成分として含む、投与又は移植の対象における免疫拒絶リスクが低減された医薬組成物。
＜２５＞　＜１＞～＜１３＞のいずれか一つのポリペプチドを、治療用細胞の細胞表面に発現させる工程を含む、治療対象による治療用細胞に対する免疫拒絶を低減又は抑制する方法。好ましくは前記方法似おいて、更に、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質（好ましくは、[２６]に記載のＫＩＲ２ＤＬ２／３に対する膜型タンパク質、[４２]に記載のＫＩＲ３ＤＬ１に対する膜型タンパク質及び[５９]に記載のＫＩＲ２ＤＬ１に対する膜型タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つである）を治療用細胞の細胞表面に発現させる工程、並びに／又は、遺伝子編集による細胞表面上の少なくとも一つ（好ましくは全て）のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消失又は減弱させるためにゲノム上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びＴＡＰＢＰ領域から選択される少なくとも一つの遺伝子を改変（好ましくはＢ２Ｍ遺伝子を改変、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子を欠損）する工程、を含む治療対象による治療用細胞に対する免疫拒絶を低減又は抑制する方法。
＜２６＞　＜１＞～＜１３＞のいずれか一つのポリペプチドを、治療用細胞の細胞表面に発現させる工程を含む、治療対象による免疫拒絶のリスクが低減又は抑制された治療用細胞の製造方法。好ましくは前記方法において、更に、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質（好ましくは、[２６]に記載のＫＩＲ２ＤＬ２／３に対する膜型タンパク質、[４２]に記載のＫＩＲ３ＤＬ１に対する膜型タンパク質及び[５９]に記載のＫＩＲ２ＤＬ１に対する膜型タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つである）を治療用細胞野細胞表面に発現させる工程、並びに／又は、遺伝子編集による細胞表面上の少なくとも一つ（好ましくは全て）のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消失又は減弱させるためにゲノム上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びＴＡＰＢＰ領域から選択される少なくとも一つの遺伝子を改変（好ましくはＢ２Ｍ遺伝子を改変、より好ましくはＢ２Ｍ遺伝子を欠損）する工程、を含む治療対象による免疫拒絶のリスクが低減又は抑制された治療用細胞の製造方法。
＜２７＞　以下の工程を含む、＜１５＞の細胞を製造する方法；
工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液に当該ＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、当該ＮＫＧ２Ａに結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団から当該ＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位を細胞外ドメインに含む＜１＞のポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に発現させる工程。
＜２８＞以下の工程を含む＜１５＞の細胞を製造する方法；
工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しない前記ＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析を行い、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位を細胞外ドメインに含む＜１＞のポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に発現させる工程。
＜２９＞　ラベル及びラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、＜２７＞又は＜２８＞の方法。
＜３０＞　更に、ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を有する細胞を選抜する工程を含む＜２７＞～＜２９＞のいずれか一つの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2024-070975号の開示内容を包含する。
　ＮＫＧ２Ａに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質やそれを発現する細胞は、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することにより、臓器や治療用細胞の移植時の拒絶反応を抑制することができる。このため、ＮＫＧ２Ａに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質やそれを発現する細胞は、臓器移植や細胞治療の汎用性を大きく変える新しい他家技術として利用することができる。
　また、抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質やそれを発現する細胞は、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することにより、臓器や治療用細胞の移植時の拒絶反応を抑制することができる。このため、抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質やそれを発現する細胞は、臓器移植や細胞治療の汎用性を大きく変える新しい他家技術として利用することができる。
ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＫ５６２に対する殺細胞活性評価の結果を示す図であり、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂによる抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２へのアゴニスト活性を示す図である。 ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＨＬＡ－Ｃｗ３－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価の結果を示す図であり、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂによる抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２へのアゴニストに対する阻害活性を示す図である。 抗ＫＩＲ抗体であるＬｉｒｉｌｕｍａｂやＰａｎ２ＤをｓｃＦｖ－膜型タンパク質として発現した場合に、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株に対する殺細胞活性を減弱することを表すことを示す図である。 活性型ＫＩＲに結合性を示すバインダーは、活性型ＫＩＲを発現するＮＫ細胞株の活性を増強することを示す図である。 Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにより新たに取得したＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーの抑制型及び活性型ＫＩＲへの結合性を示す図である。 Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにより新たに取得したＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーの抑制型ＫＩＲへのアゴニスト活性を示す図である。 プライマリーＮＫ細胞を用いたＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーのアゴニスト活性評価の結果を示す図である。図６ＡはＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２の遺伝子を有するＮＫ細胞を用いた結果を示し、図６ＢはＫＩＲ２ＤＬ３の遺伝子を有するＮＫ細胞を用いた結果を示す図である。 新たに取得したバインダーが、２ＤＬ２又は３に結合して、ＮＫ細胞の活性化を抑制していることを示す図である。 ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１に対して結合性を示すバインダー（ｓｃＦｖ）が、各受容体を発現するＮＫ細胞株に対して殺細胞活性を変化させるか評価した結果を示す図である。 膜型ｓｃＦｖバインダーの模式図である。 ＫＩＲ２ＤＬ１＊００３（配列番号４、細胞外領域１～２２２）を基準とした、ＫＩＲ２ＤＬ２＊００１（配列番号６、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＬ２＊００３（配列番号５７、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＬ３＊００１（配列番号８、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＳ１＊００２（配列番号１０、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＳ２＊００１（配列番号１２、細胞外領域１～２２４）及びＫＩＲ２ＤＳ４＊００１（配列番号１４、細胞外領域１～２２４）との全長のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ＫＩＲ２ＤＬ２＊００１（配列番号６、細胞外領域１～２２４）を基準とした、ＫＩＲ２ＤＬ２＊００３（配列番号５７、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＬ１＊００３（配列番号４、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＬ３＊００１（配列番号８、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＳ１＊００２（配列番号１０、細胞外領域１～２２４）、ＫＩＲ２ＤＳ２＊００１（配列番号１２、細胞外領域１～２２４）及びＫＩＲ２ＤＳ４＊００１（配列番号１４、細胞外領域１～２２４）との全長のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５（配列番号１６、細胞外領域１～３１９）を基準とした、ＫＩＲ３ＤＬ２＊００２（配列番号５９、細胞外領域１～３１９）及びＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３（配列番号６０、細胞外領域１～３１９）との全長のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ＣＤ８由来シグナルペプチド（配列番号２３）、ＣＤ８由来ヒンジ（配列番号２４）、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２５）、ＣＤ８由来ヒンジ（配列番号２６）、ＣＤ８由来細胞膜ドメイン（配列番号２７）及びＣＤ８由来細胞内ドメイン（配列番号２８）のアミノ酸配列、並びにＬｉｒｉｌｕｍａｂ（１－７Ｆ９）ＶＨのアミノ酸配列（配列番号２９）及びＬｉｒｉｌｕｍａｂ　（１－７Ｆ９）ＶＬのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す図である。 Ｐａｎ２Ｄ　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号３１）及びＰａｎ２Ｄ　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号３２）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号３３）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す図である。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号３５）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号３６）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号３７）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号３９）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号４０）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ５　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号４１）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ５　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号４２）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ６　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号４３）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ６　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号４４）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ７　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号４５）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ７　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号４６）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ８　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号４７）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ８　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号４８）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ９　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号４９）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ９　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号５０）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号５１）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＬアミノ酸配列（配列番号５２）、並びにａ３ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号５５）及びａ３ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号５６）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーをＣＡＲ－Ｔ細胞が発現することにより、ＮＫ細胞からＣＡＲ－Ｔ細胞に対する殺細胞活性を抑制して、ＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット細胞に対する殺細胞活性が維持されることを示す図である。図２０ＡはＮＫ細胞を添加していないｗｅｌｌにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の殺細胞活性を示し、図２０ＢはＮＫ細胞を添加しているｗｅｌｌにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の殺細胞活性を示している。 ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞が共培養されているｗｅｌｌにおけるＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞の数を示す図である。 ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーであるａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０の可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３を１アミノ酸毎にアラニンに置換した変異体の、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を示す図である。 ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーのＣＤＲを異なるｓｃＦｖの定常領域に移植したＣＤＲ移植体の、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を示す図である。 ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーとＨＬＡ－Ｅを共発現する細胞の、抑制型ＫＩＲとＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞の殺細胞活性に対する相加的な抑制作用を示す図である。 Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現せずＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーを発現するｉＰＳ細胞の、ＮＫ細胞の殺細胞活性に対する抑制作用を示す図である。 Ｘ線結晶構造解析により同定されたＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーであるａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＦａｂフラグメントと、ＫＩＲ２ＤＬ２の結合モデル図を示した図である。 Ｘ線結晶構造解析により同定されたＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーであるａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０の、ＫＩＲ２ＤＬ２上のエピトープ部位をマッピングした図である。 ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーについて、抗原の結合試験においてａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と各ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーの競合を検証した結果を示した図である。 Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにより新たに取得したＫＩＲ２ＤＬ１特異的バインダー又はＫＩＲ３ＤＬ１特異的バインダーの抑制型及び活性型ＫＩＲへの結合性を示す図である。 Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにより新たに取得したＫＩＲ２ＤＬ１特異的バインダーの抑制型ＫＩＲへのアゴニスト活性を示す図である。 Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにより新たに取得したＫＩＲ３ＤＬ１特異的バインダーの抑制型ＫＩＲへのアゴニスト活性を示す図である。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１１　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号６１）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号６２）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号６３）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号６４）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ３ＤＬ２シグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号６５）及び３ＤＳ１シグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号６６）、並びにＲ９９Ａアミノ酸配列（配列番号６７）、Ｖ９９Ａのアミノ酸配列（配列番号６８）、Ｓ１００Ａのアミノ酸配列（配列番号６９）、Ｇ１０１Ａのアミノ酸配列（配列番号７０）、Ｔ１０２Ａのアミノ酸配列（配列番号７１）、Ｔ１０３Ａのアミノ酸配列（配列番号７２）、Ｇ１０４Ａのアミノ酸配列（配列番号７３）、Ｇ１０５Ａのアミノ酸配列（配列番号７４）、Ｙ１０６Ａのアミノ酸配列（配列番号７５）、Ｙ１０７Ａのアミノ酸配列（配列番号７６）、Ｔ１０８Ａのアミノ酸配列（配列番号７７）、Ｇ１０９Ａのアミノ酸配列（配列番号７８）、Ｍ１１０Ａのアミノ酸配列（配列番号７９）、Ｄ１１１Ａのアミノ酸配列（配列番号８０）、及びＶ１１２Ａのアミノ酸配列（配列番号８１）を示す図である。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１－２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号８２）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１－２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号８３）、並びにａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２－２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号８４）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２－２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号８５）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３－２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号８６）及びａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３－２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号８７）（下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。）、並びにＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド由来ペプチドのアミノ酸配列（配列番号８８）、Ｇ４Ｓリンカーのアミノ酸配列（配列番号８９）、ＨＬＡ－Ｅのアミノ酸配列（配列番号９０）、ＩＬ－２　シグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号９１）、Ｈｉｓタグのアミノ酸配列（配列番号９２）、及びＶＨシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号９３）を示す図である。 ＦａｂフラグメントＨ鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号９４）、Ｖｌシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号９５）、ＦａｂフラグメントＬ鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号９６）、ＧＧＧＳリンカーのアミノ酸配列（配列番号９７）、ＩｇＧ　Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）、ＧＡＡリンカーのアミノ酸配列（ＧＡＡ）、Ａｖｉタグのアミノ酸配列（配列番号９９）、ＣＡ１９ＣＡＲ　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１００）、及びＣＡ１９ＣＡＲ　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１０１）を示す図である。 ＣＤ８由来細胞膜ドメイン及び細胞内ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０２）、細胞内共刺激分子のアミノ酸配列（配列番号１０３）、青色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０４）、ＩＬ－２１フラグメントのアミノ酸配列（配列番号１０５）、並びに　ＣＤ８　ヒンジ（６２ａａ）のアミノ酸配列（配列番号１０６）を示す図である。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１０７）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１０８）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１０９）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１１０）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ３　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１１１）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１１２）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ４　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１１３）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ４　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１１４）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ５　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１１５）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ５　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１１６）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ６　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１１７）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ６　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１１８）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ７　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１１９）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ７　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１２０）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ８　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１２１）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ８　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１２２）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ９　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１２３）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ９　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１２４）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ１０　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１２５）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１０　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１２６）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ１１　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１２７）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１２８）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ１２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１２９）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１３０）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ１３　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３１）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１３　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１３２）、並びにａ２ＤＬ１－ＤＳ１４　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３３）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１４　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１３４）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ２ＤＬ１－ＤＳ１５　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３５）及びａ２ＤＬ１－ＤＳ１５　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１３６）、並びにａ３ＤＬ１－ＤＳ２　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３７）及びａ３ＤＬ１－ＤＳ２　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１３８）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ３ＤＬ１－ＤＳ３　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３９）及びａ３ＤＬ１－ＤＳ３　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１４０）、並びにａ３ＤＬ１－ＤＳ４　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１４１）及びａ３ＤＬ１－ＤＳ４　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１４２）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ａ３ＤＬ１－ＤＳ５　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１４３）及びａ３ＤＬ１－ＤＳ５　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１４４）、並びにａ３ＤＬ１－ＤＳ６　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１４５）及びａ３ＤＬ１－ＤＳ６　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１４６）を示す図である。 ＮＫ９２細胞による膜型抗ＮＫＧ２Ａ－ｓｃＦｖ発現Ｋ５６２細胞株に対する殺細胞活性評価の結果を示す図である。 フローサイトメトリー法でＮＫ９２細胞の細胞表面マーカーの発現を確認した図であり、ＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性であることを示す図である。 ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１　ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１６３）及びａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１　ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１６４）を示す図である。下線部の配列はＣＤＲ１～３の配列を示す。 ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を示した膜型抗ＮＫＧ２Ａ－ｓｃＦｖのうち、ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１がＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４組換えタンパク質に結合性を示した一方、ＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４組換えタンパク質には結合性を示さなかったことを示した図である。 実施例２１にて使用した各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリー法で確認した図である。 各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞のｔＨＬＡ－Ｅあるいは膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現した、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞に対する殺細胞活性を示した図であり、図５２－２ＡではＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞に対して優位なＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞、図５２－２ＢではＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫに対して優位なＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性をそれぞれ示した図である。 実施例２２にて使用した各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリー法で確認した図（その１）である。 実施例２２にて使用した各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリー法で確認した図（その２）である。 各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞のｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を共発現した、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞に対する殺細胞活性を示した図であり、図５３－３ＡではＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞に対して優位なＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞、図５３－３ＢではＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞に対し優位なＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性をそれぞれ示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質
　本発明は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質を提供する。このような物質をＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニスト活性を有する物質ということもある。すなわち、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性をＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニスト活性と呼ぶことがある。また、本発明において、ＮＫ細胞表面の受容体に結合する物質をバインダー、ＮＫ細胞表面の受容体に結合し、当該受容体からＮＫ細胞へのシグナルを活性化する作用を有する物質を当該受容体に対するアゴニストバインダーと呼ぶ。すなわち、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニストバインダーはＮＫ細胞の活性を抑制する作用を示し、ＮＫ細胞表面の活性型受容体に対するアゴニストバインダーはＮＫ細胞を活性化する作用を示す。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体として、ＮＫＧ２Ａ及び抑制型ＫＩＲが挙げられる。
　ＮＫＧ２はＮＫ細胞や一部のＴ細胞表面に発現し、ＮＫ細胞のＭｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆという自己と非自己の認識機能に関与している。ＮＫＧ２には、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂの抑制型ＮＫＧ２及びＮＫＧ２Ｃ，ＮＫＧ２Ｄ，ＮＫＧ２Ｅ，ＮＫＧ２Ｆ，ＮＫＧ２Ｈの活性型ＮＫＧ２がある。ＮＫＧ２Ａのリガンドとして、ＨＬＡ－ＥとＨＬＡ－Ｇが報告されており、リガンドのＨＬＡ－ＥはＮＫＧ２Ｃとも結合する。
　ＫＩＲはＮＫ細胞表面に発現し、ＮＫ細胞のＭｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆという自己と非自己の認識機能に関与している。ＫＩＲには、抑制型ＫＩＲ及び活性型ＫＩＲがあり、それぞれについて複数のサブタイプが存在する。抑制型ＫＩＲからのシグナルはＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する。すなわち、定常状態のＮＫ細胞は標的細胞の表面抗原を認識する際に、抑制型受容体へのシグナルが入らなければ、活性化し、当該認識された細胞を傷害する又は殺す活性（以下、「ＮＫ細胞の殺細胞活性」という。）を獲得する仕組みを持つ。つまり標的細胞がＮＫ細胞と同じタイプのＨＬＡを発現する細胞である場合、細胞のＨＬＡがＮＫ細胞上の抑制型ＫＩＲに結合し、抑制シグナルがＮＫ細胞内に伝達され、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する。この結果、ＮＫ細胞と同じタイプのＨＬＡが発現している細胞は、ＮＫ細胞による排除を回避することができる。
　一方で、活性型ＫＩＲは、ＮＫ細胞と同じタイプのＨＬＡが発現している細胞上のウイルス由来ペプチドを提示したＨＬＡ及び搭載されるペプチドを認識し、活性化シグナルがＮＫ細胞内に伝達され、ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化する。抑制型と異なり、活性型ＫＩＲはＨＬＡ上に提示されたウィルスペプチドを認識して排除するために機能している。
　本発明において、「結合」することを「認識」するともいう。本発明において「認識」、すなわち「結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。認識しているか否か、すなわち、結合しているか否の判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤ」という）を挙げることができる。本発明の好適な抗体等の抗原蛋白質に対するＫＤ値は、１×１０－５Ｍ以下、５×１０－６Ｍ以下、２×１０－６Ｍ以下、１×１０－６Ｍ以下である。本発明における結合は、ＳＰＲ法、ＢＬＩ法等の生体分子間相互作用解析システム、あるいはＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により測定又は判定することができる。細胞表面上の発現している物質と抑制型ＫＩＲのリコンビナント蛋白質との結合は、フローサイトメトリー法等により測定することができる。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体を作動させ、ＮＫ細胞内に抑制シグナルを伝達し、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する物質である。
　抑制型ＮＫＧ２として、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂが挙げられる。活性型ＮＫＧ２として、ＮＫＧ２Ｃ等が挙げられる。ＮＫＧ２Ａのリガンドとして、ＨＬＡ－ＥとＨＬＡ－Ｇが挙げられ、リガンドのＨＬＡ－ＥはＮＫＧ２Ｃとも結合する。
　本発明のＮＫＧ２Ａに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、ＮＫＧ２Ａに結合し、当該結合するＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質である。すなわち、ＮＫＧ２Ａに結合し、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質である。該物質はＮＫＧ２Ａに結合し、アゴニスト活性を発揮する。
　本発明のＮＫＧ２Ａに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化する活性が低い。例えば、本発明のＮＫＧ２Ａに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質のＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性は、該当物質がその対応するＮＫＧ２Ｃに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化する活性よりも高い。本発明のＮＫＧ２Ａに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、好ましくはＮＫＧ２Ｃには結合しない。すなわち、ＮＫＧ２Ｃに対して実質的にアゴニスト活性を示さない。
　抑制型ＫＩＲとして、ＫＩＲ２ＤＬサブクラス及びＫＩＲ３ＤＬサブクラスに属するものが挙げられる。ＫＩＲ２ＤＬサブクラスに属するものとして、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３及びＫＩＲ２ＤＬ５が挙げられＫＩＲ３ＤＬサブクラスに属するものとして、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ３が挙げられる。また、活性型ＫＩＲのサブタイプとして、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５及びＫＩＲ３ＤＳ１が挙げられる。さらに、抑制型と活性型の両方の性質を有するサブタイプとしてＫＩＲ２ＤＬ４が存在する。これらの抑制型ＫＩＲ及び活性型ＫＩＲに結合するリガンド（ＨＬＡ）を表１に示す。
　本発明の抑制型及び活性型ＫＩＲには様々なｖａｒｉａｎｔが存在するが、本発明の実施例では発現頻度が高いアミノ酸配列を有するｖａｒｉａｎｔを選択し、使用した。そのため、本発明の作用・効果は個別のバリアントに限定されることなく、それぞれのサブタイプに属するＫＩＲ、及び、当該ＫＩＲに対応するＨＬＡ型を有する細胞、宿主等に適用されるものである。ＫＩＲ２ＤＬ１についてはＫＩＲ２ＤＬ１＊００３（配列番号４、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ００００３）、ＫＩＲ２ＤＬ２についてはＫＩＲ２ＤＬ２＊００１（配列番号６、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ０００１０）及びＫＩＲ２ＤＬ２＊００３（配列番号５７、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ０００１２）、ＫＩＲ２ＤＬ３についてはＫＩＲ２ＤＬ３＊００１（配列番号８、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ０００１４）、ＫＩＲ２ＤＳ１についてはＫＩＲ２ＤＳ１＊００２（配列番号１０、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ０００３４）、ＫＩＲ２ＤＳ２についてはＫＩＲ２ＤＳ２＊００１（配列番号１２、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ０００３７）、ＫＩＲ２ＤＳ４についてはＫＩＲ２ＤＳ４＊００１（配列番号１４、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ０００４５）、ＫＩＲ３ＤＬ１についてはＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５（配列番号１６、ＩＰＤアクセス番号：ＫＩＲ００１０２）を使用した。
　図１１に示す通り、ＫＩＲ２ＤＬ２＊００３及びＫＩＲ２ＤＬ３＊００１のアミノ酸配列は互いに同一性が高く（特に、細胞外領域のアミノ酸配列同一性は非常に高い。）、さらに活性型ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＳ１＊００２、ＫＩＲ２ＤＳ２＊００１、ＫＩＲ２ＤＳ４＊００１のアミノ酸配列とも同一性が高い。
　本発明の抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、上記の抑制型ＫＩＲのサブクラスのうち少なくとも一つに結合し、当該結合するＫＩＲを発現するＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質であり、結合する抑制型ＫＩＲはとくに限定されるものではないが、好ましくは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、及び／又は、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合し、より好ましくはＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合し、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質である。該物質は抑制型ＫＩＲに結合し、アゴニスト活性を発揮する。
　ＫＩＲ２ＤＬ１は、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＭＨＣ分子であるＨＬＡ－Ｃ型のＣ２エピトープ（Ｃｗ２、Ｃｗ４、Ｃｗ５、Ｃｗ６、Ｃｗ１５、Ｃｗ１７）を認識する。
　ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３は、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＭＨＣ分子であるＨＬＡ－Ｃ型のＣ１エピトープ（Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、Ｃｗ８、Ｃｗ９、Ｃｗ１０、Ｃｗ１２、Ｃｗ１４、Ｃｗ１６）及びＨＬＡ－Ｂ型のＣ１エピトープ（Ｂ４６やＢ７３）を認識する。
　ＫＩＲ３ＤＬ１は、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＭＨＣ分子であるＨＬＡ－Ｂ型のＢｗ４エピトープ（Ａ２３、Ａ２４、Ａ２５、Ａ３２、Ｂ５、Ｂ２７、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ４４、Ｂ４９、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ７７）を認識する。
　ＫＩＲ３ＤＬ２は、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＭＨＣ分子であるＨＬＡ－Ａ型であるＡ３、Ａ１１を認識する。
　本発明の抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化する活性が低い。例えば、本発明の抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質のＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性は、該当物質がその対応する活性型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化する活性よりも高い。ここで、抑制型ＫＩＲに対して、その対応する活性型ＫＩＲとは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する活性型ＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３及びＫＩＲ２ＤＳ４であり、特に重要なものはＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＫＩＲ２ＤＳ４である。また、ＫＩＲ３ＤＬ１に対する活性型ＫＩＲは、ＫＩＲ３ＤＳ１である。本発明の抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、好ましくは活性型ＫＩＲには結合しない。すなわち、活性型ＫＩＲに対して実質的にアゴニスト活性を示さない。したがって、抑制型ＫＩＲに結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質は、好ましくは、図１０に示すＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４のアミノ酸配列のアラインメントにおいて、同一配列が少ないか、蛋白質の立体構造を取った際にアクセスの差異を持つ部分配列に結合する物質である。
　本発明の物質がその活性化を抑制するＮＫ細胞は、標的とするＮＫ細胞表面の抑制型受容体が細胞表面に発現するＮＫ細胞を意味する。このようなＮＫ細胞としては、当該抑制型受容体がＮＫＧ２Ａの場合、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞集団を含む対象の血液サンプル、又は当該血液から単離されたＮＫ細胞集団を使用する事ができる。当該抑制型受容体が抑制型ＫＩＲの場合、当該抑制型ＫＩＲに対応するＨＬＡ型を有する対象の血液サンプル、又は当該血液から単離されたＮＫ細胞集団を使用する事ができる。また、市販されているＮＫ細胞株に遺伝子工学的手法により、標的とするＮＫ細胞表面の抑制型受容体を発現させたＮＫ細胞を使用してもよい。
　本発明の物質のＮＫ細胞表面の抑制型受容体アゴニスト活性は、被験物質の存在下及び非存在下における、以下のエフェクター細胞による以下の標的細胞に対する殺細胞活性を測定し、被験物質存在下での殺細胞活性の抑制割合を算出することにより評価することができる。エフェクター細胞としては、前記の対象とするＮＫ細胞表面の抑制型受容体を発現するＮＫ細胞が使用される。標的細胞としては、対象のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対応したＨＬＡを発現しない細胞を使用する。このアゴニスト活性の測定において、被験物質は、可溶型の形態で培養液中に添加してもよく、後述の膜型タンパク質の形態で標的細胞表面に発現させてもよい。
　例えば、ＮＫＧ２Ａの場合、ＮＫＧ２Ａに結合する物質のアゴニスト活性の測定には、ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞をエフェクター細胞、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しない細胞（例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子を欠損した細胞など）、あるいはＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡをほとんど発現していない細胞を標的細胞として用いる。また、更に同標的細胞に対して、エフェクター細胞としてＮＫＧ２Ｃを発現するＮＫ細胞を用いた評価を行うことにより、被験物質のＮＫＧ２Ｃに対するアゴニスト活性を評価することができ、ＮＫＧ２Ａに特異的なアゴニスト活性を有する物質を選抜することができる。
　例えば、抑制型ＫＩＲの場合、ＫＩＲ２ＤＬ２／３に結合する物質のアゴニスト活性の測定には、ＨＬＡ－Ｃ１ホモタイプ又はＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ２ヘテロ由来でＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３を発現するＮＫ細胞をエフェクター細胞、ＨＬＡ－Ｃ１タイプを発現しない細胞（例えば、Ｃ２／Ｃ２ホモのＨＬＡ型の対象から採取した細胞など）を標的細胞として用いる。エフェクター細胞及び標的細胞は、ともにＢｗ４型は揃えられていること（両方陰性ホモ、又は、両方陽性ホモ）が好ましい。
　また、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する物質のアゴニスト活性の測定には、ＨＬＡ－Ｃ２ホモタイプ又はＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ２ヘテロ由来でＫＩＲ２ＤＬ１を発現するＮＫ細胞をエフェクター細胞、ＨＬＡ－Ｃ２タイプを発現しない細胞（例えば、Ｃ１／Ｃ１ホモのＨＬＡ型の対象から採取した細胞など）を標的細胞として用いる。エフェクター細胞及び標的細胞は、ともにＢＷ４型は揃えられていること（両方陰性ホモ、又は、両方陽性ホモ）が好ましい。
　また、例えば、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合する物質のアゴニスト活性の測定には、ＨＬＡ－Ｂｗ４タイプ由来でＫＩＲ３ＤＬ１を発現するＮＫ細胞をエフェクター細胞、ＨＬＡ－Ｂｗ４タイプを発現しない細胞（例えば、Ｂｗ４陽性／Ｂｗ４陰性ホモのＨＬＡ型の対象から採取した細胞など）を標的細胞として用いる。エフェクター細胞及び標的細胞は、ともにＨＬＡ－Ｃ型は揃えられていること（両方Ｃ１／Ｃ１ホモ、両方Ｃ２／Ｃ２ホモ、又は両方Ｃ１／Ｃ２ヘテロ）が好ましい。
　また、例えば、ＫＩＲ３ＤＬ２に結合する物質のアゴニスト活性の測定には、ＨＬＡ－Ａ０３、Ａ１１タイプ由来でＫＩＲ３ＤＬ２を発現するＮＫ細胞をエフェクター細胞、ＨＬＡ－Ａ０３、Ａ１１タイプを発現しない細胞を標的細胞として用いる。エフェクター細胞及び標的細胞は、ともにＨＬＡ－Ｃ型は揃えられていること（両方Ｃ１／Ｃ１ホモ、両方Ｃ２／Ｃ２ホモ、又は両方Ｃ１／Ｃ２ヘテロ）、及びともにＢＷ４型は揃えられていること（両方陰性ホモ、両方陽性ホモ、又は両方陽性／陰性ヘテロ）が好ましい。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質としてＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有する物質が挙げられる。そのような物質として、抑制型ＫＩＲに対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドが挙げられる。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドとして以下の（Ａ）又は（Ｃ）のポリペプチドが挙げられる。
（Ａ）抑制型受容体に対する抗体若しくは抗原結合性断片
　ＮＫＧ２Ａに対する抗体として、例えばＭｏｎａｌｉｚｕｍａｂ、後述するｓｃＦｖ（ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１）に含まれるＣＤＲ又は可変領域が移植されたモノクローナル抗体などが挙げられる。また、抑制型ＫＩＲに対する抗体として、例えばＬｉｒｉｌｕｍａｂ、Ｐａｎ２Ｄ、後述するｓｃＦｖ（ｉ）～（ｘ）に含まれるＣＤＲ又は可変領域が移植されたモノクローナル抗体などが挙げられる。本発明においては、これらの抗体に限定されず、ＮＫ細胞表面に発現する抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する抗体のすべてを含む。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する抗体及びＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合する抗原結合性断片（以下、本発明の抗体等とも記す）は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプは、特に限定されるものではなく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉｇ等をあげることができる。モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、例えば、オクテロニー法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等で決定することができる。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト抗体、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体などを挙げることができ、好ましくはヒト抗体を用いることができる。本発明の抗体の範囲には、抗体の変異体も含まれ、例えば、ヒト抗体の範囲には、ヒト変異抗体も含まれる。
　非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体などを挙げることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体などのげっ歯類由来の抗体、ラクダ、アルパカ、ラマなどに由来する一つの可変領域のみを有する単鎖抗体などを挙げることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等を挙げることができる。
　キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体などを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のフレームワーク領域の配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　ＣＤＲ移植抗体としては、ある抗体又は抗原結合性断片の可変領域中のＣＤＲを別の免疫グロブリンの可変領域に移植した抗体又は抗原結合性断片、ＣＤＲに加え元の抗体又は抗原結合断片のフレームワーク領域の配列も一部移の可変領域に移植したもの、それらのいずれかの下の抗体又は抗原結合断片由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
　上記のＣＤＲ移植において、ＣＤＲ中のアミノ酸を別のアミノ酸に置換する場合、当該ＣＤＲ領域におけるＮ末端側及び／又はＣ末端側の１、２又は３アミノ酸から選択される１～６個のアミノ酸を置換してもよく、より好ましくはＮ末端側及び／又はＣ末端側の２アミノ酸から選択される１～４個のアミノ酸を置換することであり、更に好ましくはＮ末端側及び／又はＣ末端側の１アミノ酸から選択される１又は２個のアミノ酸を置換することである。
　抗体は、公知の種々の方法で作製することができる。公知の方法として、ハイブリドーマを用いる方法や細胞免疫法等により作製し、遺伝子組換えの手法により作製することができる。また、ヒト抗体ファージライブラリーより選別したヒト抗体を取得する方法も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，４３３－４５５）。また、重鎖のみからなる単鎖抗体は、ラクダ、アルパカ、ラマなどが保持する抗体であり、これらの動物を免疫するか、これ等の動物に由来するファージライブラリーなどを利用することで取得することができる（例えば、Ｄａｖｉｄ　Ｒ．　Ｍａａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００７　Ｊｕｌ　３１）；３２４（１－２）：１３-２５、Ｌｕｋａｓ　Ｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．，（２０２０）；２０７０：１７３－１８９，等を参照）。
　本発明において、「抗原結合性断片」とは、一つ又は二つの可変領域から構成される、抗原との結合活性を有するペプチドを意味する。「抗原結合性断片」としては、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｄＡｂ）等の抗原結合性断片を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗原結合性断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗原結合性断片が遺伝子工学的手法により製造される場合、標的抗原に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（一本鎖抗体の場合、重鎖可変領域のみの場合もある）、又は、それらに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を所望の抗原結合性断片のフレームワーク配列に移植したものであってもよい。重鎖のみからなる単鎖抗体に由来する抗原結合性断片は、目的の抗原に結合するラクダ、アルパカ、ラマ等に由来する単鎖抗体の可変領域をコードする遺伝子を保持するファージやイーストなどの提示体ライブラリーなどを利用し、単独の可変領域に適した発現フォーマットに組み込むことで、公知又は本明細書に開示された方法に従い、ｓｃＦｖや膜型ｓｃＦｖと同様の方法により製造することができる（例えば、Ｄａｖｉｄ　Ｒ．　Ｍａａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００７　Ｊｕｌ　３１）；３２４（１－２）：１３-２５、Ｌｕｋａｓ　Ｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．，（２０２０）；２０７０：１７３－１８９，等を参照）。また、可変領域又はＣＤＲを移植する場合、元となる抗体等の配列の１つ又は２つ以上のアミノ酸を当該所望の抗原結合性断片のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。本発明の抗原結合性断片がｓｃＦｖのような一本鎖である場合、元となる抗体又は抗原結合性断片から所望の抗原結合性断片への可変領域又はＣＤＲの移植において、重鎖と軽鎖を入れ替えても結合性が維持される場合があることが知られており、本発明は、このように重鎖可変領域と軽鎖可変領域が入れ替えられたものを含む（Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｎ　ａｎｔｉ－ＨＥＲ２　ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，　Iｌｋａｙ　Ｋｏcｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ．２０２１　Ｍａｒ；３７（２）：３３１０２）。
　この中でもｓｃＦｖが好ましい。ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる抗原結合性断片である（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ　Ａ．Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２６９－３１５（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，１１２６－１１３６）。リンカー配列としては、人工配列など、一本鎖抗体、ｓｃＦｖのリンカー配列として知られている様々な配列を用いることができる。人工リンカー配列としては、グリシン及びセリンを豊富に含むアミノ酸配列が知られており、例えば、ＧＳＧの３アミノ酸又はＧＳＧＳの４アミノ酸（配列番号３）からなるＧＳリンカー、式（Ｇ４Ｓ）ｎで表されるリンカー配列を例示することができる。式中、ｎは、１～１０であり、好ましくはｎ＝３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ：配列番号２５）である。リンカードメインをペプチドリンカーともいい、公知のペプチドリンカーを細胞外リンカードメインとして利用することができる。上記式（Ｇ４Ｓ）ｎで表される配列をＧ４Ｓリンカーと呼ぶ。
　目的とする抗原に結合するｓｃＦｖは、可変領域のライブラリーを一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）により取得することができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合する可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。このような重鎖及び軽鎖の可変領域の配列が明らかになれば、当該可変領域に含まれるＣＤＲの配列も特定することができる。これらのＣＤＲや可変領域の配列を、所望の抗体、又は抗原結合性断片の配列フォーマットに組み込んだ配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることにより所望の抗原結合性を有する抗体又は抗原結合性断片を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。
　ＣＤＲは、本発明のポリペプチドのアゴニスト活性が変化しない範囲で改変することができる。すなわち、本発明のポリペプチドのＣＤＲについて、特定のアミノ酸１残基をアラニンに置換し、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性が維持されているかを確認すればよい。アラニンに置換しても、ポリペプチドが抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を維持しているアミノ酸は、アゴニスト活性には重要ではないと判断することができ、ＣＤＲ中のそのようなアミノ酸を他のアミノ酸に置換することができ、アミノ酸を置換したポリペプチドは、アミノ酸を置換する前のポリペプチドと同様の反応性を有する。ＣＤＲ中のアミノ酸を別のアミノ酸に置換する場合、当該ＣＤＲ領域におけるＮ末端側及び／又はＣ末端側の１、２又は３アミノ酸から選択される１～６個のアミノ酸を置換することが好ましく、より好ましくはＮ末端側及び／又はＣ末端側の２アミノ酸から選択される１～４個のアミノ酸を置換することであり、更に好ましくはＮ末端側及び／又はＣ末端側の１アミノ酸から選択される１又は２個のアミノ酸を置換することである。
　本発明のＮＫＧ２Ａに対するｓｃＦｖとして、以下の（Ｎ－ｉ）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖが挙げられる。ここで、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、例えば、ＧＳリンカー、Ｇ４Ｓリンカーなどで連結することができる。
（Ｎ－ｉ）　配列番号１６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１６４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
　本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するｓｃＦｖとして、以下の（ｉ）～（ｘｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖが挙げられる。ここで、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、例えば、ＧＳリンカー、Ｇ４Ｓリンカーなどで連結することができる。
（ｉ）　配列番号３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号３７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号３９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖ）　配列番号４１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉ）　配列番号４３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）　配列番号４５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）　配列番号４７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号４８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｉｘ）　配列番号４９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘ）　配列番号５１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｉ）　配列番号６１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号６２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｘｉｉ）　配列番号６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号６４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
　また、本発明の抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に対するｓｃＦｖとして、以下の（ｘｉｉｉ）～（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖが挙げられる。ここで、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、例えば、ＧＳリンカー、Ｇ４Ｓリンカーなどで連結することができる。
（ｘｉｉｉ）　配列番号５６の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号５５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｉｖ）　配列番号１３７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖ）　配列番号１３９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖｉ）　配列番号１４１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｘｖｉｉ）　配列番号１４３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｘｖｉｉｉ）　配列番号１４５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１４６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
　本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するｓｃＦｖとして、以下の（ｃｉ）～（ｃｘｖ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖが挙げられる。ここで、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、例えば、ＧＳリンカー、Ｇ４Ｓリンカーなどで連結することができる。
（ｃｉ）　配列番号１０７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１０８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｉ）　配列番号１０９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｉｉ）　配列番号１１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｖ）　配列番号１１３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖ）　配列番号１１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉ）　配列番号１１７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１１８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉｉ）　配列番号１１９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｖｉｉｉ）　配列番号１２１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｉｘ）　配列番号１２３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘ）　配列番号１２５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉ）　配列番号１２７の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１２８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｉ）　配列番号１２９の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｉｉ）　配列番号１３１の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、
（ｃｘｉｖ）　配列番号１３３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ｃｘｖ）　配列番号１３５の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１３６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
　さらに、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドは、上記のＮＫ細胞表面の抑制型受容体を認識し結合する抗体、又はｓｃＦｖに由来するアミノ酸配列からなる結合部位を有するポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは様々な形態をとりうるが、このましくはモノクローナル抗体、ｓｃＦｖのような抗原結合性断片、又は、細胞外に抗原結合性断片のアミノ酸配列を有する膜型タンパク質などが例示される。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体を認識し結合する抗体、又はｓｃＦｖに由来するアミノ酸配列とは、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体を認識し結合する抗体、又はｓｃＦｖ中のＮＫ細可変領域胞表面の抑制型受容体に結合する部位のアミノ酸配列を含み、さらにＮＫ細胞表面の抑制型受容体を認識し結合する抗体、又はｓｃＦｖ中のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合する部位のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加（付加には挿入が含まれる）（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を含み、かつＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有するアミノ酸配列を含む。ここで、「１個又は数個」における「数個」とは、２～１０個、このましくは7個以下、より好ましくは５個以下、更に好ましくは４、３、２もしくは1個を指す。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位として、具体的には、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するモノクローナル抗体又はｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のそれぞれに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列、当該各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む可変領域に由来するアミノ酸配列、又は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域に由来するアミノ酸配列を含む部位が含まれる。ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する抗体、又はｓｃＦｖに由来するアミノ酸配列は上記と同じ意味である。
　例えば、ＮＫＧ２Ａに対する結合部位を有し、ＮＫＧ２Ａに結合するポリペプチドは、表２１のａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せを有する。
　本発明のＮＫＧ２Ａに対する結合部位を有し、ＮＫＧ２Ａに結合するポリペプチドの一つの態様としては例えば、以下の（Ｎ－Ｉ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくはモノクローナル抗体、抗原結合性断片、当該アミノ酸配列からなるｓｃＦｖ又は、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質）が挙げられる。
（Ｎ－Ｉ）　配列番号１６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１６３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１６４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１６４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位、
　例えば、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合するポリペプチドは、表２に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せを有する。表２において、「ａ２ＤＬ２／３」は、バインダーが抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合することを示す。


＊表中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のそれぞれの領域は、各可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号の範囲で示した。アミノ酸番号はＩＭＧＴ定義に従って特定された番号である。
　また、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するポリペプチドは、表３に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せを有する。表３において、「ａ２ＤＬ１」は、バインダーが抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に結合することを示す。
　また、抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に結合するポリペプチドは、表４に示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せを有する。表４において、「ａ３ＤＬ１」は、バインダーが抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に結合することを示す。
＊表中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のそれぞれの領域は、各可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号の範囲で示した。アミノ酸番号はＩＭＧＴ定義に従って特定された番号である。
　本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲに結合するポリペプチドの一つの態様としては例えば、以下の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくはモノクローナル抗体、抗原結合性断片、当該アミノ酸配列からなるｓｃＦｖ又は、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質）が挙げられる。
（Ｉ）　配列番号３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号３３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、（ＩＩ）　配列番号３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号３６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＩＩＩ）　配列番号３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号３７のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＩＶ）　配列番号３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号３９のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（Ｖ）　配列番号４１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号４１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、（ＶＩ）　配列番号４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号４３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号４４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＶＩＩ）　配列番号４５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号４５のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＶＩＩＩ）　配列番号４７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号４８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＩＸ）　配列番号４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号４９のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（Ｘ）　配列番号５１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号５１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号５２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、（ＸＩ）　配列番号６１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号６１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号６２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号６２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位、及び（ＸＩＩ）　配列番号６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号６３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号６４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号６４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含む結合部位。
　また、本発明の抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に結合するポリペプチドの一つの態様としては例えば、以下の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくは、モノクローナル抗体、抗原結合性断片、当該アミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質）が挙げられる。
（ＸＩＩＩ）　配列番号５６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号５６のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号５５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号５５のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＸＩＶ）　配列番号１３７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１３８のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＸＶ）　配列番号１３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１３９のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１４０のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＸＶＩ）　配列番号１４１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１４１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１４２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＸＶＩＩ）　配列番号１４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１４３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１４４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１４４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ＸＶＩＩＩ）　配列番号１４５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１４５のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１４６のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列。
　また、本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するポリペプチドの一つの態様としては例えば、以下の（Ｐ）のアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくは、モノクローナル抗体、抗原結合性断片、当該アミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質）が挙げられる。
（Ｐ）配列番号３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号３１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号３２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列。
　さらに、本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に結合するポリペプチドの一つの態様としては例えば、以下の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくは、モノクローナル抗体、抗原結合性断片、当該アミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質）が挙げられる。
（ＣＩ）　配列番号１０７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１０８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１０８のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＩＩ）　配列番号１０９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１０９のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１１０のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＩＩＩ）　配列番号１１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１１１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１１２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＩＶ）　配列番号１１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１１３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＶ）　配列番号１１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１１５のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１１６のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＶＩ）　配列番号１１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１１７のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１１８のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＶＩＩ）　配列番号１１９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１１９のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１２０のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＶＩＩＩ）　配列番号１２１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１２１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列（好ましくは配列番号１２２のアミノ酸配列を含む可変領域）を含む第２の可変領域の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＩＸ）　配列番号１２３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１２３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１２４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＸ）　配列番号１２５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１２５のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１２６のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＸＩ）　配列番号１２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１２７のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１２８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列（好ましくは配列番号１２８のアミノ酸配列を含む可変領域）を含む第２の可変領域の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＸＩＩ）　配列番号１２９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列（好ましくは配列番号１２９のアミノ酸配列を含む可変領域）を含む第１の可変領域と配列番号１３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１３０のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＸＩＩＩ）　配列番号１３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１３１のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１３２のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、
（ＣＸＩＶ）　配列番号１３３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１３３のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１３４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１３４のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列、及び
（ＣＸＶ）　配列番号１３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域（好ましくは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む可変領域）と配列番号１３６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域（好ましくは配列番号１３６のアミノ酸配列を含む可変領域）の組合せを含むアミノ酸配列。
　上記の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、抗原との反応性が失われないようなアミノ酸の変異を有していてもよい。そのような変異として、例えばＣＤＲのアミノ酸配列の１又は２個のアミノ酸の置換であり、好ましくは、ＣＤＲのアミノ酸配列のＣ及び／又はＮ末端の１又は２個のアミノ酸の置換である。
　ここで、上記（Ｎ－Ｉ）（ＮＫＧ２Ａに対する結合部位を有し、ＮＫＧ２Ａに結合するポリペプチド）、並びに上記（Ｉ）～（ＸＩＩＩ）、（Ｐ）及び（ＣＩ）～（ＣＸＶ）（抑制型ＫＩＲに対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲに結合するポリペプチド）のポリペプチドにおいて、可変領域以外の構造は、選択されるポリペプチドの形態（モノクローナル抗体、抗原結合性断片など）に応じて適宜選択することができる。ポリペプチドが一本鎖の場合、Ｎ末端側から第１の可変領域―リンカー配列―第２の可変領域の順に配置されていてもよく、第２の可変領域―リンカー配列―第１の可変領域の順に配置されていてもよい。また、ポリペプチドが重鎖と軽鎖に分割された形態の場合、第１の可変領域が重鎖、第２の可変領域が軽鎖に配置されていてもよく、第１の可変領域が軽鎖、第２の可変領域が重鎖に配置されていてもよい。
　本発明の一つの態様において、本発明は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に特異的なアゴニスト活性を有する物質を提供する。「ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に特異的なアゴニスト活性」とは、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対してアゴニスト活性を示し、当該ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対応するＮＫ細胞表面の活性型受容体に対するアゴニスト活性が、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニスト活性の７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、又は、５％以下であり、最も好ましくは、ＮＫ細胞表面の活性型受容体に対して実質的にアゴニスト活性を示さないものである。ここで、「ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対応するＮＫ細胞表面の活性型受容体」とは、その細胞外ドメインのアミノ酸配列が、対象のＮＫ細胞表面の抑制型受容体の細胞外ドメインのアミノ酸配列と高いホモロジーを示すＮＫ細胞表面の活性型受容体を意味する。例えば、ＮＫＧ２Ａに対する活性型受容体としては、ＮＫＧ２Ｃが挙げられる。また、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ２／３に対応する活性型ＫＩＲとしては、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２又はＫＩＲ２ＤＳ４が挙げられる。また、ＫＩＲ２ＤＬ１に対応する活性型ＫＩＲはＫＩＲ２ＤＳ１であり、ＫＩＲ２ＤＬ２／３に対応する活性型ＫＩＲはＫＩＲ２ＤＳ２であり、またＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２に対応する活性型ＫＩＲはＫＩＲ３ＤＳ１である。
　このような抗体等は、例えば、上述の方法で取得されたＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合してアゴニスト活性を示す抗体又は抗原結合性断片を、対応する活性型ＫＩＲを発現させたＮＫ細胞と接触させた場合のＮＫ細胞の標的細胞に対する殺細胞活性を測定し、所定の活性以下である抗体又は抗原結合性断片を選抜する事で、取得することができる。このアゴニスト活性において、抗体又は抗原結合性断片は、可溶性タンパク質として添加してもよく、後述の膜型タンパク質の形態で、標的細胞表面に発現させてもよい。
また、このような抗体等の取得において、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し、且つ、ＮＫ細胞表面の活性型受容体に対する結合性が低い抗体は、例えば抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）により取得することができる。ファージディスプレイ法を用いてＮＫ細胞表面の抑制型受容体に特異的に結合するバインダーを取得する方法としては、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーよりＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するｓｃＦｖを発現するファージを回収・濃縮した（ポジティブセレクション）のち、得られたファージ混合液からＮＫ細胞表面の活性型受容体に結合するｓｃＦｖを発現するファージを除去する（デプリーション）ことで、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し、ＮＫ細胞表面の活性型受容体に結合しないｓｃＦｖを発現するファージを選択することができる。ここで、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体又は活性型受容体としては、各分子の細胞外領域であって、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体のアゴニスト活性に重要な部分配列を含む領域のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質／ペプチドを採用することができる。ファージの回収・濃縮工程又は除去工程には、結合性又は親和性を有する物質の選別に利用されるさまざまな方法を採用することができるが、例えば強い結合性を示す２つの分子（例えば、ビオチンとアビジンの組み合わせ）の一方をＮＫＧ２断片又はＫＩＲ断片に結合させ（ラベル化ＮＫＧ２又はＫＩＲ）、他方を担体（例えば、磁気ビーズなど）に結合させる。ファージ溶液とラベル化ＮＫＧ２又はＫＩＲを混合させたのち、前記担体と接触させることで、ラベル化ＮＫＧ２又はＫＩＲに結合するファージは担体側に回収・濃縮される。ポジティブセレクションではＮＫ細胞表面の抑制型受容体をラベル化し、担体側に濃縮・回収されたファージを取得する。逆に、デプリーションでは、ＮＫ細胞表面の活性型受容体をラベル化し、担体に結合しなかった、溶液中のファージを回収することで、ＮＫ細胞表面の活性型受容体に結合しないファージを取得することができる。
　別の方法として、上記ポジティブセレクションの工程において、ラベル化しないＮＫ細胞表面の活性型受容体断片を過剰量添加することによって、ラベル化ＮＫＧ２又はＫＩＲに対する結合特異性が高いファージを回収・濃縮する（デセレクション）することができる。これらの方法を複数回繰り返す、又は組み合わせて実施することによって、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合特異性が高いｓｃＦｖを取得できる割合が高くなる。
　具体的には、以下の（１）又は（２）に示す工程を含む方法により、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し、ＮＫ細胞表面の活性型受容体に結合しない抗体等を作製することができ、本発明はこのような製造方法、当該製造方法で製造された物質などを提供する。ここで、「提示体（Display-Body）」とはベクターにより組み込まれた遺伝子にコードされるたんぱく質やペプチドを脂質膜の表面に提示する機能を有する細胞用の遺伝子保持体であり、例えばファージ、酵母、細胞などを例示することができる。提示体としてファージを利用する場合、上述のファージディスプレイ法又はファージパニング法として公知の技術を利用することができる。また、提示体として酵母を採用する方法は、イーストディスプレイ法として知られている方法（例えば、Ｌｕｋａｓ　Ｒｏｔｈ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　２０２０，　Ｖｏｌ．２０７，ｐｐ．１７３－１８９，　ｄｏｉ：　１０．１００７／９７８－１－４９３９－９８５３－１＿１０，などを参照）を利用することができる。
（１）　以下の工程を含む、ヒトのＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞を抑制する活性を有する物質を製造する方法；
　工程Ａ：ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液に当該ＮＫ細胞表面の抑制型受容体の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、当該ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、前記ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対応するＮＫ細胞表面の活性型受容体の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ，担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団から当該ＮＫ細胞表面の活性型受容体に結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｄ：同定された抗原結合部位をコードする遺伝子を抗体又は抗原結合性断片の発現フォーマットに組み込んだ遺伝子を細胞に発現させる工程。
（２）　以下の工程を含むヒトのＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞を抑制する活性を有する物質を製造する方法；
工程Ａ：ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫ細胞表面の抑制型受容体の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しない前記抑制型に対応するＮＫ細胞表面の抑制型受容体の細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該細胞液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、当該ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
工程Ｃ：同定された抗原結合部位をコードする遺伝子を抗体又は抗原結合性断片の発現フォーマットに組み込んだ遺伝子を細胞に発現させる工程。
　上記方法（１）の工程Ａ―Ｂ、及び、方法（２）の工程Ａは、それぞれを複数回繰り返して行ってもよく、両方を組み合わせて行ってもよい。
　また方法（１）又は（２）において、ラベル及びラベルに結合する物質の組み合わせとしては、公知の様々な物質の組み合わせを採用することができるが、例えば、ビオチン－アビジンの組み合わせを例示することができる。
　方法（１）又は方法（２）で発現させた抗体又は抗原結合性断片（可溶型又は膜型タンパク質）について、更に、本明細書に記載の方法に従って当該抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を有する物質を選抜する工程を含んでいてもよい。
　上記方法において、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体がＮＫＧ２Ａであり、対応する活性型受容体がＮＫＧ２Ｃであってもよい。ＮＫ細胞表面の抑制型受容体が抑制型ＫＩＲの場合、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３であり、対応する活性型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４であってもよい。また、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＬ１であり、対応する活性型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＳ１であってもよい。さらに、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ１であり、対応する活性型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４であってもよい。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合する抗原結合部位を表面に提示するポリクローナルな提示体集団は、公知の方法により取得又は作製することができる。例えば、抗体等の取得に利用されるファージディスプレイ法に利用される多様な可変領域を提示するファージライブラリーやイーストディスプレイ法に利用されるイーストライブラリを利用することができる。また、別の態様としては、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体の細胞外ドメインを含む抗原タンパク質を動物へ免疫し、当該抗原に対する抗体又は抗原結合性断片を産生する動物の脾臓細胞からＢ細胞等の抗原特異的抗体遺伝子を保持する細胞を回収し、当該細胞の抗体遺伝子の可変領域をコードする遺伝子配列を増幅し、当該可変領域を所定のフォーマットで脂質膜表面に提示させるベクターに組み込み、提示体ライブラリーを作製することができる。このような手法は、例えばＤａｖｉｄ　Ｒ．　Ｍａａｓｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００７　Ｊｕｌ　３１）；３２４（１－２）：１３-２５、Ｌｕｋａｓ　Ｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．，（２０２０）；２０７０：１７３－１８９等に記載されている。提示体がファージの場合、ベクターとしてはファージミドベクターが使用される。
　方法（１）又は方法（２）において抗体又は抗原結合性断片を発現させる細胞としては、目的に応じて動物細胞、大腸菌など多様な細胞を採用することができる。膜型タンパク質として発現させる場合はアゴニスト活性測定試験に用いる標的細胞や細胞移植のための移植細胞（血液細胞、Ｔ細胞、多能性幹細胞などを例示できるが、これ等に限定されない）を採用することができる。
　ＮＫＧ２Ａに特異的なアゴニスト活性を有する物質としては、例えば上記の（Ｎ－Ｉ）のポリペプチド、ｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質等が挙げられる。
　抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２／３に特異的なアゴニスト活性を有する物質としては、例えば上記の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかのポリペプチド、ｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質等が挙げられる。また、抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に特異的なアゴニスト活性を有する物質としては、例えば上記（ＸＩＩＩ）のポリペプチド、ｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質、ｓｃＦｖ,当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質等である。
　抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に特異的なアゴニスト活性を有する物質としては、例えば上記の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかのポリペプチド、ｓｃＦｖ、当該ｓｃＦｖを細胞外ドメインに含む膜型タンパク質等である。
　さらに、本発明の一つの態様として、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位として、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合において上記のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片と競合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片（競合結合性抗体等）に含まれる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する結合部位を含有するポリペプチドを提供する。このような競合結合性抗体等は、上記のモノクローナル抗体又はｓｃＦｖと同じエピトープ、又は該エピトープとオーバーラップするエピトープ又は該エピトープの近傍に位置するエピトープを認識して結合するため、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対して上記モノクローナル抗体又は抗原結合性断片と同様のアゴニスト活性を示す蓋然性が高い。そのため、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する抗体等から本明細書の実施例でアゴニスト活性が確認された抗体又は抗原結合性断片と競合的に結合する抗体又は抗原結合性断片を複数取得し、その中から所望のアゴニスト活性（特に、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に特異的なアゴニスト活性）を示すものを選抜することにより、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対して所望のアゴニスト活性を有するポリペプチドを取得することができる。
　例えば、本発明のＮＫＧ２Ａに対する結合部位を含有するポリペプチドは、ＮＫＧ２Ａに対する結合において、上記の（Ｎ－ｉ）のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する結合部位を含有する。
　例えば、本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位を含有するポリペプチドは、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合において、上記の（ｉ）～（ｘｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ又はＰａｎ２Ｄと競合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する結合部位を含有する。
　例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位を含有するポリペプチドは、ＫＩＲ２ＤＬ１との結合において、Ｐａｎ２Ｄ又は上記（Ｐ）と競合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する結合部位を含有する。
　さらに、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位を含有するポリペプチドは、ＫＩＲ２ＤＬ１との結合において、上記の（ｃｉ）～（ｃｘｖ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する結合部位を含有する。
　また、例えば、本発明の抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位を含有するポリペプチドは、抑制型ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合において、上記の（ｘｉｉｉ）～（ｘｖｉｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する結合部位を含有する。
　本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチドが認識するＮＫ細胞表面の抑制型受容体のエピトープは、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチドとＮＫ細胞表面の抑制型受容体の複合体のＸ線結晶構造解析、すなわちＸ線結晶構造に基づくモデル構造解析により解析することができる。Ｘ線結晶構造解析によるエピトープ解析は、例えば、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有するポリペプチドとＮＫ細胞表面の抑制型受容体の複合体を結晶化し、Ｘ線構造解析を行うことにより行うことができる。この際、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有するポリペプチドとして、Ｆａｂフラグメントを用いることができる。解析は例えば、リボンモデルを得て、Ｆａｂフラグメントの近傍、例えば４Å以下に位置するアミノ酸残基を特定すればよく、そのアミノ酸残基がエピトープを形成するアミノ酸と判断することができる。前記Ｘ線構造解析により、結合部位における特定のアミノ酸が他の特定のアミノ酸と相互作用するとして計算され得る。
　例えば、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０（ＶＨ：配列番号５１、ＶＬ：配列番号５２）との結合における抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２のエピトープを構成するアミノ酸は、Ｇｌｕ４２（配列番号６のアミノ酸番号２１）、Ｈｉｓ６１（配列番号６のアミノ酸番号４０）、Ｌｙｓ６５（配列番号６のアミノ酸番号４４）、Ｐｈｅ６６（配列番号６のアミノ酸番号４５）、Ｌｙｓ６７（配列番号６のアミノ酸番号４６）、Ａｓｐ６８（配列番号６のアミノ酸番号４７）、Ｔｈｒ６９（配列番号６のアミノ酸番号４８）、Ｌｅｕ７０（配列番号６のアミノ酸番号４９）、Ｓｅｒ８６（配列番号６のアミノ酸番号６５）、Ｉｌｅ８７（配列番号６のアミノ酸番号６６）、Ｇｌｙ８８（配列番号６のアミノ酸番号６７）、Ｐｒｏ８９（配列番号６のアミノ酸番号６８）、Ｍｅｔ９１（配列番号６のアミノ酸番号７０）、Ｇｌｎ９２（配列番号６のアミノ酸番号７１）、Ａｓｐ９３（配列番号６のアミノ酸番号７２）、Ｌｅｕ９４（配列番号６のアミノ酸番号７３）、Ｔｙｒ１０１（配列番号６のアミノ酸番号８０）、Ｌｅｕ１１１（配列番号６のアミノ酸番号９０）である。ここで、活性型であるＫＩＲ２ＤＳ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列と相違するアミノ酸はＬｙｓ６５、Ｌｙｓ６７、Ｇｌｙ８８、Ｐｒｏ８９及びＭｅｔ９１であり、ＫＩＲ２ＤＳ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列と相違するアミノ酸はＰｈｅ６６であり、ＫＩＲ２ＤＳ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列と相違するアミノ酸はＬｙｓ６７、Ａｓｐ６８、Ｇｌｎ９２及びＡｓｐ９３であることから、これ等のアミノ酸とその近傍のアミノ酸と相互作用することがＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーとして重要である。
　ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０とＫＩＲ２ＤＬ２の相互作用解析において、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＶＨ鎖の１０７番目のＴｙｒ（配列番号５１のアミノ酸番号１０７、以下「ＤＳ１０－ＶＨ－Ｙ１０７」）は、ＫＩＲ２ＤＬ２上のＡｓｐ６８と水素結合を形成し、Ｐｈｅ６６と近接した配置をとることが確認された。一方、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と対応する活性型ＫＩＲの相互作用解析においてＤＳ１０－ＶＨ－Ｙ１０７、Ａｓｐ６８に対応するＫＩＲ２ＤＳ４のＡｓｎ６８（配列番号１４の４７）とは水素結合が弱い、又は形成できず、Ｐｈｅ６６に対応するＫＩＲ２ＤＳ２のＴｙｒ６６（配列番号１２の４５番目のＴｙｒ）とは立体障害が発生し、近接した配置をとることができないことが示唆され、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０がＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に結合しない特性に寄与することが示唆される。すなわち、ＫＩＲ２ＤＬ２上のＰｈｅ６６及びＡｓｐ６８と近接する可変領域のアミノ酸は受容体のＰｈｅ６６に対応するアミノ酸がＴｙｒである場合に立体障害が生じ、Ａｓｐと水素結合を形成できるがＡｓｎとの水素結合能が弱い又は欠失したアミノ酸であり、好ましくはＴｙｒである。
　ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０とＫＩＲ２ＤＬ２の相互作用解析において、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＶＨ鎖の１０６番目のＴｙｒ（配列番号５１のアミノ酸番号１０６のＴｙｒ、以下「ＤＳ１０－ＶＨ－Ｙ１０６」）は、ＫＩＲ２ＤＬ２上のＰｒｏ８９の主鎖のカルボニル基と水素結合を形成することが確認された。一方、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と対応する活性型ＫＩＲの相互作用解析においてＤＳ１０－ＶＨ－Ｙ１０６は、Ｐｒｏ８９に対応するＫＩＲ２ＤＳ１のＡｒｇ８９（配列番号１０の６８番目のＡｒｇ）の主鎖のカルボニル基とは水素結合が形成できないあるいは弱くなることが示唆され、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０がＫＩＲ２ＤＳ１に結合しない特性に寄与することが示唆される。すなわち、ＫＩＲ２ＤＬ２上のＰｒｏ８９と近接する可変領域のアミノ酸はＰｒｏと水素結合を形成でき、Ａｒｇとの水素結合形成能が弱い、又は欠失したアミノ酸であり、好ましくはＴｙｒである。
　ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０とＫＩＲ２ＤＬ２の相互作用解析において、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＶＨ鎖の１０４番目のＧｌｙ（配列番号５１のアミノ酸番号１０４のＧｌｙ、以下「ＤＳ１０－ＶＨ－Ｇ１０４」）は、その主鎖カルボニル基においてＫＩＲ２ＤＬ２上のＧｌｙ８８の主鎖のイミノ基と水素結合を形成することが確認された。一方、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と対応する活性型ＫＩＲの相互作用解析においてＤＳ１０－ＶＨ－Ｇ１０４は、Ｇｌｙ８８に対応するＫＩＲ２ＤＳ１のＳｅｒ８８（配列番号１０の６７番目のＳｅｒ）とは立体障害により主鎖間の水素結合が形成できないあるいは弱くなることが示唆され、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０がＫＩＲ２ＤＳ１に結合しない特性に寄与することが示唆される。すなわち、ＫＩＲ２ＤＬ２上のＧｌｙ８８と近接する可変領域のアミノ酸はＧｌｙの主鎖のイミノ基と水素結合を形成でき、Ｓｅｒの主鎖イミノ基との水素結合形成能が弱い、又は欠失したアミノ酸であり、好ましくはＧｌｙである。
　ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０とＫＩＲ２ＤＬ２の相互作用解析において、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＶＬ鎖の９４番目のＴｈｒ（配列番号５２のアミノ酸番号９４のＴｈｒ、以下「ＤＳ１０－ＶＬ－Ｔ９４」）は、その主鎖イミノ基においてＫＩＲ２ＤＬ２上のＡｓｐ９３の側鎖と水素結合を形成することが確認された。一方、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と対応する活性型ＫＩＲの相互作用解析においてＤＳ１０－ＶＬ－Ｔ９４は、Ａｓｐ９３に対応するＫＩＲ２ＤＳ４のＶａｌ９３（配列番号１４の７２番目のＶａｌ）とは水素結合が形成できないあるいは弱くなることが示唆され、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０がＫＩＲ２ＤＳ４に結合しない特性に寄与することが示唆される。また、このＫＩＲ２ＤＬ２との相互作用の特異性は、ＤＳ１０－ＶＬ－Ｔ９４をＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＡｌａに置換した場合も維持されることが示唆された。すなわち、ＫＩＲ２ＤＬ２上のＡｓｐ９３と近接する可変領域のアミノ酸はＡｓｐの側鎖と水素結合を形成でき、Ｖａｌとの水素結合形成能が弱い、又は欠失したアミノ酸であり、好ましくはＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、より好ましくはＴｈｒである。
　本発明のＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的アゴニストバインダーの一つの態様は、配列番号６のＫＩＲ２ＤＬ２のアミノ酸配列においてアミノ酸番号４４～４９番目の領域における４７番目のアミノ酸を含む１～６個（好ましくは３～６個、より好ましくは４～６個、更に好ましくは５又は６個）のアミノ酸、６５～６８番目の領域において、６７番目及び６８番目のアミノ酸を含む２～４個（好ましくは２、３又は４個）及び７０～７３番目の領域において７２番目のアミノ酸を含む１～４個（好ましくは２、３又は４個）と相互作用する可変領域を含む物質（抗体又は抗原結合性断片）である。このような物質として好適には、ＫＩＲ２ＤＬ２（配列番号６）のアミノ酸配列において、４５～４７番目の領域、４５～４８番目の領域、４４～４７番目の領域、４５～４８番目の領域、４４～４８番目の領域、４５～４９番目の領域又は４４～４９番目の領域のアミノ酸、配列番号６の６７～６８番目の領域、６６～６８番目の領域又は６５～６８番目の領域のアミノ酸、並びに、配列番号６の７２～７３番目の領域、７１～７３番目の領域又は７０～７３番目の領域のアミノ酸と相互作用する可変領域を含むバインダーである。
　また、本発明のＫＩＲ２ＤＬ２に特異的なアゴニストの一つの態様として、可変領域におけるＫＩＲ２ＤＬ２の配列番号６の４７番目のＡｓｐと相互作用するアミノ酸がＴｙｒであり、配列番号６の６７番目のＧｌｙと相互作用するアミノ酸がＧｌｙであり、配列番号６の６８番目のＰｒｏと相互作用するアミノ酸がＴｙｒであり、且つ、配列番号６の７２番目のＡｓｐと相互作用するアミノ酸がＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＡｌａである抗体又は抗原結合性断片である。このような抗体又は抗原結合性断片として好ましくは上記のアミノ酸に加えて、配列番号６の４５番目のＰｈｅに近接するアミノ酸がＴｙｒであることであり、より好ましくは前記のアミノ酸の全てが可変領域のＣＤＲ３にふくまれる。このような抗体又は抗原結合性断片として好ましくは、第１の可変領域として配列番号５１の９７～１１２からなるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有すること、及び、第２の可変領域として配列番号５２の８９～９７のアミノ酸配列において９４番目のＴｈｒがＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＡｌａに置換されていてもよいアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有することを特徴とし、より好ましくは第１の可変領域として配列番号５１のアミノ酸配列を含むこと、及び、第２の可変領域として配列番号５２のアミノ酸配列において９４番目のＴｈｒがＡｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＡｌａに置換されていてもよいアミノ酸配列を有ることを特徴とする抗体又は抗原結合性断片である。
　また、抗原との結合試験において、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチド同士を競合させ、競合試験を行うことによりエピトープを解析することができる。例えば、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有するポリペプチドのｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株と異なるポリペプチドのＦａｂフラグメントをＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＮＫＧ２Ａ又はＫＩＲと混合し、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＮＫＧ２Ａ又はＫＩＲへの結合をｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株とＦａｂフラグメントとで競合させればよい。ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株とＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＮＫＧ２Ａ又はＫＩＲの結合が競合により阻害されるかを指標に、各バインダーのエピトープ部位を評価することができる。なお、本発明において、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、リコンビナント、組換え、可溶型は同一のものを指す語として用いる。
　また、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチドは、上記の方法により解析したＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチドが認識するエピトープを認識する他のポリペプチドを含む。他のポリペプチドは、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体との結合において、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチドと競合し、かつ抑制型選択性を有する。
（Ｂ）　本発明の膜型タンパク質は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体との結合部位を含有する細胞外ドメインと膜貫通ドメインを有するので、細胞で発現したときにＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体を認識し結合するポリペプチドが細胞膜表面に存在し得る。本発明の膜型タンパク質は、さらに細胞内ドメインを含んでいてもよい。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドは細胞外リンカードメインによって膜貫通ドメインに連結している。
　ここで、ドメインとは、ポリペプチドに存在する領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる領域をいう。膜型タンパク質において、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドを結合ドメインということができる。結合ドメインが、上記（１）に記載されたモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に由来する第１の可変領域及び第２の可変領域を含む場合、当該２つの可変領域は、上述したｓｃＦｖに採用されうるリンカー配列を採用することができる。また、ポリペプチドのＮ末端側から、第１の可変領域―リンカー配列―第２の可変領域の順に配置されていてもよく、第２の可変領域―リンカー配列―第１の可変領域の順に配置されていてもよい。
　膜貫通ドメインは、細胞膜を構成する脂質二重層に親和性を有するドメインであり、例えば、ＨＬＡ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４又は４－１ＢＢなどの膜貫通ドメインを例示するが、これらに限定されず、様々な天然の膜タンパク質に由来する膜貫通配列や人工的に設計された膜貫通配列などを用いることができる。好ましくは、ＣＤ８α由来膜貫通ドメイン（配列番号２７）である。
　細胞外リンカーとして、ＨＬＡ、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４又は４－１ＢＢなどの細胞外ドメインの全長又は一部を例示するが、これらに限定されず、様々な天然のタンパク質に由来するリンカー配列、ヒンジ配列（例えば、免疫グロブリンのヒンジ配列）や人工的に設計されたフレキシブルリンカー配列などを用いることができる。好ましくは、４５アミノ酸長のＣＤ８α由来ヒンジ配列（配列番号２６）、６６アミノ酸長のＣＤ８α由来ヒンジ配列（配列番号２４）である。
　細胞内ドメインはｓｃＦｖ体の安定性のために必要であり、ＨＬＡ、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ４又は４－１ＢＢなどの細胞内シグナル伝達に関与しない細胞内ドメインの一部（好ましくは、１０アミノ酸以下、９アミノ酸以下、８アミノ酸以下、７アミノ酸以下、６アミノ酸以下、５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸）を用いることができる。ただしＫＩＲへの結合により、細胞内シグナルの活性化や抑制化を促す必要がある場合は、細胞内シグナル伝達に関与する細胞内ドメインの一部を用いることもできる。
　本発明の膜型タンパク質として、以下が例示できる。
　ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質としては、ＮＫＧ２Ａに対する結合部位（具体的には、上記の（Ｎ－Ｉ）に記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質等が挙げられる。
　ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質としては、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位（具体的には、上記の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質等が挙げられる。
ＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質としては、ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位（具体的には、上記の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質が挙げられる。
ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質としては、ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位（具体的には、上記の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質、等が挙げられる。
（Ｃ）ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位が、該ＮＫ細胞表面の抑制型受容体の天然リガンドであるＨＬＡ分子のＮＫ細胞表面の抑制型受容体との結合部位に由来する配列を含み、且つ、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）との結合性を欠失又は減弱させたポリペプチドである。
　例えば、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３の場合、ＨＬＡ－Ｃ１タイプに属するＨＬＡ－Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ７、Ｃｗ８、Ｃｗ９、Ｃｗ１０、Ｃｗ１２、Ｃｗ１４、Ｃｗ１６及びＨＬＡ－Ｂ４６やＢ７３等に含まれるＣ１エピトープモチーフ配列（７７番目のアミノ酸がＳであり、８０番目のアミノ酸がＮである）を含み、当該ＨＬＡ分子のＴＣＲに認識される領域に変異を加え、又は欠損させることでＴＣＲにより認識されないドメインを含むポリペプチドを採用することができる。
　例えば、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ２ＤＬ１の場合、ＨＬＡ－Ｃ２タイプに属するＨＬＡ－Ｃｗ２、Ｃｗ４、Ｃｗ５、Ｃｗ６、Ｃｗ１５、Ｃｗ１７等に含まれるＣ２エピトープモチーフ配列（７７番目のアミノ酸がＮであり、８０番目のアミノ酸がＫである）を含み、当該ＨＬＡ分子のＴＣＲに認識される領域に変異を加え、又は欠損させることでＴＣＲにより認識されないドメインを含むポリペプチドを採用することができる。
　例えば、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＬ１の場合、ＨＬＡ－Ｂｗ４タイプに属するＨＬＡ－Ｂ５、Ｂ２７、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ４４、Ｂ４９、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ５７、Ｂ５８、Ｂ５９、Ｂ７７、Ａ２３、Ａ２４、Ａ２５、Ａ３２等に含まれるＢｗ４エピトープモチーフ配列（７７番目のアミノ酸がＮであり、８０番目のアミノ酸がＩ又はＴであり、８３番目のアミノ酸がＲである）を含み、当該ＨＬＡ分子のＴＣＲに認識される領域に変異を加え、又は欠損させることでＴＣＲにより認識されないドメインを含むポリペプチドを採用することができる。このようなポリペプチドは、前記エピトープモチーフ配列を含むアミノ酸配列を含有する可溶型リガンドの形態であってもよく、また当該エピトープモチーフ配列を細胞外領域に含む膜型タンパク質の形態であってもよい。
　例えば、抑制型ＫＩＲがＫＩＲ３ＤＬ２の場合、ＨＬＡ－Ａ３、Ａ１１、Ｂ２７遊離重鎖や、当該ＨＬＡ分子のＴＣＲに認識される領域に変異を加え、又は欠損させることでＴＣＲにより認識されないドメインを含むポリペプチドを採用することができる。このようなポリペプチドは、可溶型リガンドの形態であってもよく、また膜型タンパク質の形態であってもよい。
　さらに、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニスト活性を有する物質として、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し、当該ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニスト活性を示す低分子化合物が挙げられる。このような化合物は、例えば化合物ライブラリーから、前記のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対するアゴニスト活性の評価方法によって選抜することで取得することができる。また、この方法で選抜された化合物の構造に基づき誘導体展開した化合物群に対して、更に対象とするＮＫ細胞表面の抑制型受容体との結合活性や前記アゴニスト活性を測定し、構造活性相関を解析し、更に誘導体展開を繰り返すことによって、より良好な結合性及び／又はアゴニスト活性を有する化合物を取得することができる。
２．ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質の製造方法
　本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドは、遺伝子組換え、ゲノム編集、インビトロ翻訳、化学合成、ペプチド合成等により、分泌タンパク質（可溶性タンパク質）又は膜型タンパク質の形態で調製することができる。
　例えば、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドを、当該ポリペプチドが対象とする発現系（細胞、ファージ、酵母、微生物、インビトロ発現系など）において発現可能な形態で必要な因子と機能的に連結させたポリヌクレオチドを発現系に導入し、発現後の発現系からポリペプチドを回収する、又は表面にポリペプチドが発現した細胞を回収することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
　ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。発現系が細胞、酵母、微生物などである場合、これらのヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベクターで形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させ、培養物から当該ポリペプチド、又は、表面に当該ポリペプチドを発現した細胞を回収すればよい。該ベクターは宿主細胞からの上記ポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードするヌクレオチドを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドと上記ポリペプチドをコードするヌクレオチドをインフレームで連結しておく。上記ポリペプチドが産生された後にシグナルペプチドを除去することにより、上記ポリペプチドを成熟タンパク質として得ることができる。シグナルペプチドとして、例えば、ＣＤ８シグナルペプチド等を用いることができる。
　発現ベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、公知のプラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＣ１９、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。例えば、動物細胞として、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞等を用いればよい。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法等が挙げられる。産生された抗体は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用して精製することができる。例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択し、組合せればよい。
３．本発明の膜型タンパク質が細胞表面に発現している細胞及びその製造方法
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞は、好ましくは、前記１．（Ｂ）のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチド、並びに膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質が発現している細胞である。該膜型タンパク質の膜貫通ドメインが細胞膜を貫通した状態で存在し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、抑制型ＫＩＲに結合するポリペプチドが細胞表面に存在する。
　このような細胞の例としては、ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＮＫＧ２Ａに対する結合部位（具体的には、上記の（Ｎ－Ｉ）に記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質）が細胞表面に発現する細胞、ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位（具体的には、上記の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質）が細胞表面に発現する細胞、ＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位（具体的には、上記の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質）が細胞表面に発現する細胞、ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位（具体的には、上記の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質）が細胞表面に発現する細胞、等が例示される。
　これらの細胞において、異なる抑制型受容体に対する複数種類の膜型タンパク質が細胞表面に発現していてもよい。複数種類の膜型タンパク質が発現した細胞は、それぞれの膜型タンパク質が標的とするＮＫ細胞上の抑制型受容体に対してアゴニスト活性を発揮するため、自己と非自己のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＭＨＣを識別するＮＫ細胞受容体（ＫＩＲ、ＮＫＧ２等）を多様な発現パターンで発現するヘテロなＮＫ細胞集団からの攻撃を回避することができる。特に、ＮＫＧ２Ａに対する特異的なアゴニスト活性を示す膜型タンパク質と抑制型ＫＩＲに対する特異的なアゴニスト活性を示す膜型タンパク質を共発現させた細胞は、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞、ＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞、抑制型ＫＩＲ陽性ＮＫ細胞、及び、その対応する活性型ＫＩＲ陽性ＮＫ細胞からの攻撃を回避することができる。
　該細胞は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して発現させればよい。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を有し、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチド、並びに膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質については、各ドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを連結し、さらに、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。また、細胞外リンカードメインは、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合するポリペプチドと、膜貫通ドメインとの間に存在し得るように、それぞれのドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結してベクターに挿入し、宿主細胞において発現させればよい。
　このようなポリヌクレオチドとして、具体的には、　ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＮＫＧ２Ａに対する結合部位（具体的には、上記の（Ｎ－Ｉ）に記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド　ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する結合部位（具体的には、上記の（Ｉ）～（ＸＩＩ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、ＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＫＩＲ３ＤＬ１に対する結合部位（具体的には、上記の（ＸＩＩＩ）～（ＸＶＩＩＩ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト活性を示す膜型タンパク質（ＫＩＲ２ＤＬ１に対する結合部位（具体的には、上記の（ＣＩ）～（ＣＸＶ）のいずれかに記載の第1及び第２の可変領域を含むｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが例示される。一つのポリヌクレオチド似は、異なる抑制型受容体に対する膜型タンパク質を複数コードしていてもよく、この場合、それぞれ膜型タンパク質をコードする塩基配列を自己解列ペプチドをコードする塩基配列で連結させることにより、翻訳語に切断され、個別の膜型タンパク質として細胞表面に発現させることができる。膜型タンパク質として細胞表面に発現させる場合、細胞外ドメインのN末端側に分泌用のシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８由来のシグナルペプチドなど））を連結させたポリペプチドを膜型タンパク質として採用してもよく、ポリヌクレオチドとしては、このようなシグナルペプチドをＮ末端に有する膜型タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリペプチドを採用してもよい。
　ポリヌクレオチドの導入方法は、通常使用されているものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。ベクターを用いて導入する場合、使用され得るベクターとしては、特に限定するものではないが、例えばレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。
　上記の膜型タンパク質を発現させるとき、エンハンサーやプロモーターのような発現制御要素を上記膜型タンパク質をコードするヌクレオチドに連結し、発現ベクターに導入し、該発現ベクターにより細胞を形質転換して細胞に膜型タンパク質を発現させる。ヌクレオチドを導入する際、適当なプロモーターを、導入するヌクレオチドの上流に機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターとしては、限定はないが、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０ウイルス、サイトメガロウイルス等のウイルスプロモーターや、哺乳動物細胞由来のプロモーター等を用いることができる。本発明の膜型タンパク質が発現する細胞の製造には、上記２．に記載のポリペプチドの製造方法を準用することができる。
　上記膜型タンパク質をコードするヌクレオチドを細胞に導入する際、発現ベクターは選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子等の公知のマーカー遺伝子を用いることができる。
　本発明は、上記膜型タンパク質をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡの転写産物であるＲＮＡも包含する。
　また、本発明の膜型タンパク質の発現には、ゲノム編集技術を採用してもよい。ゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ、ＴａＬＥＮ等様々な方法を採用する事が出来、限定されるものではない。ゲノム編集技術を用いた遺伝子改変細胞の作製方法としては、例えば、ＷＯ２０１８／０１８５３４に記載された方法は、通常の細胞のみならず、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に対しても効率的にゲノム編集を施すことができる。
　上記膜型タンパク質を発現させる細胞としては、移植のためや細胞治療のために他家移植するための細胞が挙げられる。これらの細胞を治療用細胞と呼ぶ。上記膜型タンパク質を発現させた細胞は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体にアゴニスト活性を示すポリペプチドを表面に発現しており、該ポリペプチドがＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合することでＮＫ細胞内に抑制シグナルを伝達し、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する。その結果、移植の際の免疫拒絶を抑制し、免疫拒絶を受けにくくし、免疫拒絶リスクを低減することができる。
　移植のためや細胞治療のために他家移植するための細胞として多能性幹細胞があり、特にＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が挙げられる。これらの多能性幹細胞においては、上記のようにゲノム編集により本発明の膜型タンパク質を発現させることや、有用な遺伝子編集を行うことができる。また間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）やプライマリー細胞としてのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージなども挙げられる。これらの生体組織から採取した細胞は、例えばＨＬＡをノックアウトしたり、ＮＫＧ２Ａアゴニスト及び／又はＫＩＲアゴニストを発現するように改変することによりＮＫ活性を抑制したりすることができる。また、間葉系細胞については、がん治療用因子等の有用な治療用因子を発現分泌できるように改変させて移植することができ、Ｔ細胞やＮＫ細胞については、ＣＡＲ－Ｔ/ＮＫ等の抗がん作用を有する細胞に改変して治療用細胞として用いることができる。さらに、移植のためや細胞治療のために他家移植するための細胞として、心筋細胞、軟骨細胞、網膜細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、すい臓細胞等が挙げられる。これらの細胞は、ドナーから採取された細胞であってもよく、多能性幹細胞から人工的に分化誘導して作製された各種細胞であってもよい。どのような細胞であっても、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し得る膜型タンパク質を細胞表面に発現すれば、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合し、ＮＫ細胞内に抑制シグナルを伝達し、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することができる。更に、当該膜型タンパク質がＮＫ細胞表面の抑制型受容体に特異的なアゴニスト活性を有する（すなわち、対応する活性型受容体にはアゴニスト活性を示さない）場合、対応する活性型受容体を発現するＮＫ細胞からの攻撃を回避することができる。
　本発明の細胞は、さらに細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱していてもよい。すべてのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱していることが好ましい。細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現の消失又は減弱が、遺伝子編集によるゲノム上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＢＰ領域の少なくとも一つの改変によるものであってもよい。この中でも、Ｂ２Ｍの改変（好ましくはＢ２Ｍの欠損）が好ましい。このように細胞表面上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消失又は減弱させる方法については、例えばUniversal Cell技術（特許文献２等を参照）に使用されている方法などを参考にして適宜採用することができる。
　また、本発明の細胞は遺伝的にＨＬＡ発現が消失している個体から樹立された細胞株であってもよい。
　また、本発明の細胞は、さらに細胞表面に抑制型ＫＩＲに結合する膜型タンパク質、及びＮＫＧ２Ａに結合する膜型タンパク質の両方を発現させてもよい。ＮＫＧ２Ａ（ＣＤ１５９）は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体の一種である。ＮＫＧ２Ａに対するリガンドとしてＨＬＡ－Ｅが挙げられる。
前記細胞に発現するＮＫＧ２Ａに結合する膜型タンパク質として、好ましくは、ＮＫＧ２Ａに対してアゴニスト活性を示し、且つＮＫＧ２Ｃに対してアゴニスト活性を示さないｓｃＦｖを細胞外ドメインに有する膜型タンパク質である。
　本発明は、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質を治療用細胞表面に発現させることを含む、治療対象における免疫拒絶のリスクが低減又は抑制された治療用細胞を製造する方法を包含する。
４．ＣＡＲ－Ｔ
　本発明は、上記膜型タンパク質に加えて所望の抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を更に発現させたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）を含む。本発明で用いるＣＡＲ－Ｔは、限定されず、腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔである。該ＣＡＲ－Ｔは、腫瘍細胞に特異的な腫瘍関連抗原に特異的に結合するドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含有するポリペプチドを表面に発現する。腫瘍関連抗原に特異的に結合するドメインとしては、腫瘍関連抗原に対する抗体由来のポリペプチド、例えばｓｃＦｖや免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のＦｖ領域を連結したポリペプチド等を用いることができる。本発明のＣＡＲ－ＴのＣＡＲは、細胞膜上に存在し、腫瘍細胞に特異的な腫瘍関連抗原に特異的に結合するドメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを細胞内ドメインとを含む。細胞外ドメインは、細胞外スペーサードメインを含んでいてもよく、細胞内ドメインは共刺激ドメインを含んでいてもよい。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ３、ＣＤ４等の膜貫通ドメインを用いることができる。細胞外スペーサードメインは、（Ｇ４Ｓ）３やＩｇＧ１のヒンジ領域等のスペーサー配列を用いることができる。共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ３０、ＣＤ４０等を用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ヒトＣＤ３ζ鎖、Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ等を用いることができる。本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、上記のそれぞれのドメインをコードするポリヌクレオチドを連結して作製することができる。このポリヌクレオチド及び本発明の抑制型ＫＩＲに対する結合部位を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に導入することによって、本発明のＣＡＲ－Ｔを作製することができる。
　本発明のＣＡＲ－Ｔは腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の治療に用いることができる。本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に対する結合部位を含有するポリペプチドを細胞表面に発現しておりターゲット細胞に対する殺細胞活性に加えて、ＮＫ細胞による免疫拒絶を回避する機能を併せ持つ。本発明は、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物を包含する。
５．本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、及びＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞の利用
　本発明は、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、及びＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞を有効成分として含む医薬組成物を包含する。そのような細胞として、例えば、細胞表面に、ＮＫＧ２Ａに対する結合部位を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質であるポリペプチドであって、（１）ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２Ａに結合して当該ＮＫ細胞を抑制する活性を有し、且つ、（２）実質的にＮＫＧ２Ｃに対するアゴニスト活性を有さない前記ポリペプチドが発現し、さらに、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質が発現し、さらに、細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱している細胞が挙げられる。
　該医薬組成物は、臓器や治療用細胞の移植の際の免疫拒絶の抑制剤として用いることができる。具体的には、腎臓や膵島等の他家移植時の拒絶の抑制、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）の予防や治療、再生治療用細胞の他家移植時の拒絶の抑制等に用いることができる。また遺伝子改変ブタ由来臓器のヒトへの移植など、異種の臓器移植に対しても用いることができる。該医薬組成物を免疫拒絶抑制剤や移植拒絶抑制剤ともいう。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞は、該細胞を投与又は移植する対象である治療対象における免疫拒絶を抑制する治療用細胞として利用できる。該治療用細胞は移植のための医薬組成物として用いることができる。
　さらに、本発明は、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、及びＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞を、移植を必要としている対象に投与又は移植することを含む、治療対象における免疫拒絶を抑制する方法を包含する。
　さらに、本発明は、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質を治療用細胞表面に発現させることを含む、治療対象における免疫拒絶を抑制する方法を包含する。そのような方法として、例えば、細胞表面に、ＮＫＧ２Ａに対する結合部位を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質であるポリペプチドであって、（１）ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２Ａに結合して当該ＮＫ細胞を抑制する活性を有し、且つ、（２）実質的にＮＫＧ２Ｃに対するアゴニスト活性を有さない前記ポリペプチドを発現させ、さらに、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質を発現させ、さらに、細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱するように当該細胞の遺伝子を改変することを含む方法が挙げられる。該方法は、移植したときに、治療対象における免疫拒絶を抑制するための細胞を製造するための方法でもある。さらに該方法は、本発明のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質を治療用細胞表面に発現させることを含む、治療用細胞を治療対象に投与したときに、当該対象における免疫拒絶を抑制する方法でもある。
　上記の用途に用いられる場合、治療対象の患者は、そのＨＬＡ型が、標的とするＮＫ細胞表面の抑制型受容体のリガンドとなるＨＬＡ型を有する。例えば、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質又は当該アゴニスト物質を細胞表面に発現する細胞を用いる場合、ＨＬＡ－Ｃ１ホモ型の患者に対して免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。また、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質又は当該アゴニスト物質を細胞表面に発現する細胞を用いる場合、ＨＬＡ－Ｃ２ホモ型の患者に対して免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質及び抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質を組み合わせて用いる場合、又は、それら２種類のアゴニスト物質を組み合わせて細胞表面に発現する細胞を用いる場合、全てのＨＬＡ－Ｃ遺伝子型（ＨＬＡ－Ｃ１ホモ型、ＨＬＡ－Ｃ２ホモ型及びＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ２ヘテロ型）の患者に対して免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。
　また、ＨＬＡ－Ｂｗ４陰性の患者に対しては、上記のＨＬＡ－Ｃの遺伝子型に対応した処置をすればよいが、ＨＬＡ－Ｂｗ４陽性の患者の場合は、それに加えて、ＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト物質を追加で組み合わせて投与、又は、組み合わせて細胞表面に発現させた細胞を用いることで、免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。
　また、ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト物質又は当該アゴニスト物質を細胞表面に発現する細胞を用いる場合、ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞を有する患者に対して免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。また、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質及びＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト物質を組み合わせて用いる場合、又は、それら２種類のアゴニスト物質を組み合わせて細胞表面に発現する細胞を用いる場合、ＨＬＡ－Ｃ１ホモ型の患者に対して、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質単独で使用した際に比べて、相加的な免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。また、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質に加えてＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト物質を組み合わせて用いる場合、又は、それら２種類のアゴニスト物質を組み合わせて細胞表面に発現する細胞を用いる場合、ＨＬＡ－Ｃ２ホモ型の患者に対して、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質単独で使用した際に比べて、相加的な免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質及びＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト物質を組み合わせて用いる場合、又は、それら３種類のアゴニスト物質を組み合わせて細胞表面に発現する細胞を用いる場合、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質及び抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質を組み合わせて用いる場合、又は、それら２種類のアゴニスト物質を組み合わせて細胞表面に発現する細胞を用いる場合に比べて、全てのＨＬＡ－Ｃ遺伝子型（ＨＬＡ－Ｃ１ホモ型、ＨＬＡ－Ｃ２ホモ型及びＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ２ヘテロ型）の患者に対して、相加的な免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。
　また、ＨＬＡ－Ｂｗ４陽性の患者の場合は、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト物質、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ１に対するアゴニスト物質に追加でＫＩＲ３ＤＬ１に対するアゴニスト物質を組み合わせて投与、又は、組み合わせて細胞表面に発現させた細胞を用いることで免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮するが、それら３種類のアゴニスト物質に加えてＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト物質を追加で組み合わせて投与、又は、組み合わせて細胞表面に発現させた細胞を用いることで、相加的な免疫抑制作用又は免疫拒絶回避作用を発揮する。
　本発明の医薬組成物には、治療に有効量のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、又はＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、及びＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞と薬学上許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤等を含めることができる。本発明の医薬組成物の投与方法は適宜選択することができるが、例えば注射投与することができ、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。 
　他の投与方法についても、製剤の開発と共に適宜選択することができる。例えば経口投与の場合には、経口液剤や散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤等を適用することができる。経口液剤の場合には、懸濁剤及びシロップ剤等のような経口液体調製物として、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギニン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤及びカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の組成物における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセル剤を製造する際には、固体の製造担体が用いられる。
　治療に用いるに有効なＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質の量は、患者の年齢や状態により変更され、最終的には医師が決めればよい。例えば、１回体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇである。所定の投与量は１～１８０日に１回投与してもよいし、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の分割投与とし適当な間隔で投与してもよい。
　ＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質、及びＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が細胞表面に発現している細胞の投与量は、移植する細胞の種類等により適宜決定することができる。
５．被験物質の免疫拒絶回避活性を評価する方法
　本発明は、被験物質のＮＫ細胞表面の抑制型受容体を介したＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性、すなわち免疫拒絶回避活性を評価する方法を包含する。
　被験物質は、任意のＮＫ細胞表面の抑制型受容体に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質であり、上記１に記載した物質が挙げられる。
　該方法は、以下の工程を含む。
（Ａ）体外において、ＫＩＲに結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、Ｂｗ４の発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
　抑制型ＫＩＲが具体的には、以下の工程を含んでいてもよい。
（Ａ）体外において、ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、Ｂｗ４モチーフ含有ＨＬＡの発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
　さらに、以下の工程を含んでいてもよい。
（Ａ）体外において、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、Ｂｗ４モチーフ含有ＨＬＡの発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
　さらに、以下の工程を含んでいてもよい。
（Ａ）体外において、ＫＩＲ３ＤＬ１に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｂｗ４型が陽性／陽性ホモ又は陽性／陰性ヘテロの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｂｗ４型が陰性／陰性ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、ＨＬＡ－Ｃ型の発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
　さらに、以下の工程を含んでいてもよい。
（Ａ）体外において、ＫＩＲ３ＤＬ２に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ａ型がＡ３もしくはＡ１１陽性／陽性ホモ又は陽性／陰性ヘテロの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ａ型がＡ３もしくはＡ１１陰性／陰性ホモの対象に由来する標的細胞を接触させる工程（ここで、ＮＫ細胞のドナーと標的細胞のドナーの、ＨＬＡ－Ｃ型及びＢｗ４型の発現型は同一である）、
（Ｂ）工程Ａ後に、標的細胞の生存数を測定する工程。
　ＮＫ細胞として、例えば末梢血由来のＮＫ細胞を用いることができ、標的細胞として、例えば末梢血由来のＴ細胞を用いることができる。
　ＮＫ細胞は自己のＨＬＡタイプ（Ｃ１、Ｃ２、Ｂｗ４）を認識し、対象細胞に対する殺細胞活性を示すＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆという性質を持つ。例えばＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ１ホモのヒトから採取されたＮＫ細胞はＣ１を自己として認識するため、Ｃ１タイプのＨＬＡ－Ｃを対象細胞が保持しないと抑制型ＫＩＲを介してＮＫ細胞内にシグナルが入らないため、殺細胞活性を示す。一方で対象細胞にＣ１タイプがあれば殺細胞活性を示さず、またＣ１タイプの代替となる抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質（アゴニストバインダー）が発現していれば殺細胞活性は低減できる。
　上記評価方法に用いるＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモのヒトのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）からＣＤ５６の陽性を指標に単離することができる。例えば、ＣＤ５６マイクロビーズやフローサイトメトリーを用いて単離することができる。このようにして単離したＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３が活性化している。
　ＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来する標的細胞は、Ｔ細胞を用いればよく、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモのヒトのＰＢＭＣからＣＤ３の陽性を指標に単離することができる。該標的細胞はＣ１タイプのＨＬＡを発現していないため、上記のＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞が殺細胞活性を示す。
　ＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞をエフェクター細胞として、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来する標的細胞を標的（ターゲット）細胞として、接触させた場合、標的細胞はエフェクター細胞により殺される。しかし、このときに抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合しＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性を有する物質が存在すれば該物質がＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞のＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合し、ＮＫ細胞の殺細胞活性が抑制されるため、エフェクター細胞の殺細胞活性が低減され、標的細胞は殺されなくなる。したがって、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合する被験物質の存在下で、ＨＬＡ－Ｃ型がＣ１／Ｃ１ホモの対象に由来するＮＫ細胞とＨＬＡ－Ｃ型がＣ２／Ｃ２ホモの対象に由来する標的細胞を接触させ、その後に標的細胞の生存率を測定することにより、被験物質の抑制型ＫＩＲに対するＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する活性の免疫拒絶回避活性を評価することができる。
　工程Ｂにおいて標的細胞の生存数が高い場合、被験物質は免疫拒絶回避活性を有する物質と判断できる。本発明は、本発明は上記工程Ｂにおいて標的細胞の生存数が高い被験物質を免疫拒絶回避活性を有する物質として選抜する工程を含む、免疫拒絶回避活性を有する物質のスクリーニング方法を包含する。
　なお、上記方法の工程（Ａ）において、被験物質は、標的細胞の表面に１（２）の膜型タンパク質として発現する形で存在してもよい。
　具体的には、後記の実施例の「殺細胞活性評価」や「アゴニスト活性評価」に記載の方法で行うことができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
方法
　各実験手法として、以下の方法を採用した。
［ウイルス作製用プラスミドベクター］
　エフェクター細胞としてのナチュラルキラー細胞株、標的細胞としてのＫ５６２細胞株、またヒトＴ細胞への目的遺伝子導入に用いるレンチウイルスの作製には、ｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１α　ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、６１９１）に含まれる緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ１）をコードする遺伝子配列を外したｐＬＶＳＩＮベクターを用いた。目的遺伝子はｐＬＶＳＩＮのマルチクローニングサイトに導入し、レンチウイルス作製用プラスミドベクターを調製した。
［レンチウイルスの調製］
　１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１０５６６－０１６）を用いて、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ細胞株（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、６３２１８０）をコンフルエントまで培養しておき、トランスフェクション当日にトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１２５６３０２９）を用いて剥離し、Ｔフラスコに再播種した。７０～８０％コンフルエントになるまで培養後、上記レンチウイルス作製用プラスミドベクター、Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｈｉｇｈ　Ｔｉｔｅｒ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、６１９４）及びＴｒａｎｓＩＴ－２９３　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＭＩＲ２７０４）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ　Ｉ　Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｓｅｒｕｍ　Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、３１９８５０７０）に混合し、インキュベート後にＬｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ細胞株に添加した。翌日に１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培地交換後、２４時間培養して上清を回収した。必要によっては、上清回収後に１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を再添加して２４時間培養し、上清を再回収した。回収した上清はフィルター処理した後、１／３量のＬｅｎｔｉ－Ｘ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、６３１２３２）を添加し、４℃で１時間以上インキュベートし、遠心（してウイルスを沈殿させた。上清を吸引除去し、ペレットを５（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１２０５５０８３）（以下、「基礎培地」という）に溶解させ、レンチウイルス濃縮液として-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。
［ＮＫ９２細胞へのＫＩＲ遺伝子導入及び調製］
　ＮＫ９２細胞は、ＡＴＣＣから入手し（Ｃａｔ．Ｎｏ：ＣＲＬ－２４０７TM）、適宜各種ＫＩＲを発現させて初期評価系のエフェクター細胞として利用した。培養はＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＳＴ－０５１５０）にＩＬ－２を５００ＩＵ／ｍＬ（１００－２０００の範囲）、及びＳｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ／Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎを加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　表４に記載の各種ＫＩＲ発現ＮＫ９２細胞株を樹立するために、Ｎ末端側から、対象ＫＩＲ由来シグナルペプチド（表５参照）、Ｆｌａｇタグ（配列番号２）、ＧＳＧＳ（配列番号３）、対象受容体ペプチド（表４参照）の順に配置されたポリペプチドをコードする人工遺伝子を、上記［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。またＫＩＲ２ＤＬ２＊００１については、Ｆｌａｇタグ、ＧＳリンカーを利用せず、対象ＫＩＲ由来シグナルペプチド（表５参照）、対象受容体ペプチド（配列番号５７）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、ＮＧＦＲペプチド（配列番号５８）の順に配置されたポリペプチドをコードする人工遺伝子を、上記［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。
　なお各ＫＩＲはＡｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　Ｎｅｔ　Ｄａｔａｂａｓｅに基づき、発現率の高いｖａｒｉａｎｔから選択した。本明細書の実施例では特に言及がない場合、ＫＩＲ２ＤＬ２としてＫＩＲ２ＤＬ２＊００３を使用した。
　レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、Ｔ１００Ｂ）を２０～１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を用いて希釈し、Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｉｓｈに添加した。室温で２時間又は４℃で終夜静置後、ＰＢＳ洗浄して、コートプレートを調製した。
　ＮＫ９２細胞をＭｙｅｌｏｃｕｌｔ　Ｈ５１００培地を用いて１～２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。抑制型ＫＩＲ、活性型ＫＩＲ遺伝子を組み込んだレンチウイルス濃縮液及びＮＫ細胞懸濁液をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅにて混合して１０００×ｇで３２℃において１時間遠心した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。培養３日後から、Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ　Ｈ５１００培地を用いて１～３日毎に培地全量を交換し、培養１週間後にＡＰＣラベル抗Ｆｌａｇ抗体又はＡＰＣラベル抗ＮＧＦＲ抗体、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ミルテニー社製：１３０－０９０－８５５）を用いて陽性細胞のみを選別した。また市販の抗ＫＩＲ２ＤＳ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３／２ＤＳ２抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ４抗体を用いて導入したＫＩＲ発現を確認した。必要に応じて、回収した細胞はＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＮＫ細胞培養培地で培養後に、使用した。
［フローサイトメトリー、及び添加用抗体］
　各種細胞表面タンパク質の発現を確認するフローサイトメトリー法において、表６に示す抗体を使用した。
　上記蛍光標識抗体を、ａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９１－２２１）に１～１０μｇ／ｍＬとなるよう懸濁後、細胞に添加して４℃で３０分反応させた。
　抗体染色済み細胞は、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ；ＷＡＫＯ社製、０１６－２５２４１）を１～１０μｇ／ｍＬ含有するＦＡＣＳ　Ｂｕｆｆｅｒに懸濁してフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃ社製、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ１０，　１３０－０９６－３４３）を用いて測定した。ＦＣＳファイルとして抽出後、ＦＬＯＷ　ＪＯソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ　ＬＬＣ社製、ＶＥＲ．１０．７．１）を用いて、ＦＳＣ／ＳＳＣプロットにおいて細胞画分を選択し、７－アミノアクチノマイシンＤ陰性／標的陽性である細胞群を生細胞としてカウントした。
実施例１：ＮＫ９２発現ＫＩＲ２ＤＬ２細胞株によるＫ５６２の殺細胞活性をＬｉｒｉｌｕｍａｂが抑制する
　ＫＩＲ２ＤＬ２によるＨＬＡの認識によりＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ細胞株の殺細胞活性が減弱される評価系を構築し、更に既存抗ＫＩＲ抗体を可溶性で添加した場合にＫＩＲ２ＤＬ２発現細胞株のアゴニスト活性があるかを評価した。
［Ｋ―５６２細胞への遺伝子導入及び調製］
　Ｋ５６２細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ－２４３ＴＭ）から入手し初期評価系のターゲット細胞として利用した。ＲＰＭＩ　１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ，　ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、６１８７００３６）（以下、「ＲＰＭＩ培地」という）にＦＣＳ　１０（ｖ／ｖ）％及びＳｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ／Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎを加え、培養した。
　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現Ｋ５６２細胞株（Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株）を樹立するために、まずＦｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）のポリペプチドをコードする人工遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９によりＫ５６２細胞株に遺伝子導入した。
　ヒトＨＬＡ－Ｃｗ３発現Ｋ５６２細胞株（ＨＬＡ－Ｃｗ３―Ｌｕｃ―Ｋ５６２細胞株）を樹立するために、Ｎ末端側からＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、ヒトＨＬＡ－Ｃｗ３由来シグナルペプチド（配列番号２１）、ヒトＨＬＡ－Ｃｗ３ペプチド（配列番号２２）の順に連結させたポリペプチドをコードする人工遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９によりＫ５６２細胞株に遺伝子導入した。
　Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株はクローン化した後に、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を確認してクローン選定を行った。ＨＬＡ－Ｃｗ３―Ｋ５６２細胞株に関しては、発現を抗ＨＬＡ－ＡＢＣにより確認し、クローン化したのち、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性及び抗ＨＬＡ－ＡＢＣの染色強度によりクローン選定を行った。
　必要に応じて、回収した細胞はＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＲＰＭＩ培地で培養後に使用した。
［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＫ５６２に対する殺細胞活性評価］
　本実施例でＫＩＲ２ＤＬ２としてＫＩＲ２ＤＬ２＊００１を使用した。殺細胞活性評価前日にＩＬ－２　５００ＩＵ／ｍＬで刺激したＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株を、９６ウェルプレートに５×１０３個で添加し、等量（すなわち、５×１０３個）のＬｕｃ－Ｋ５６２細胞株又はＨＬＡ－Ｃｗ３―Ｌｕｃ―Ｋ５６２細胞株をそれぞれ独立したウェルに添加してさらに培養した。ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株とＬｕｃ－Ｋ５６２細胞の混合ウェルには別途、抗ＫＩＲ抗体であるＬｉｒｉｌｕｍａｂ（１－７Ｆ９，　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ４）を２μｇ／ｍＬから９倍希釈において４段階にて、添加した。またＬｉｒｉｌｕｍａｂコントロールとして、Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ４（ＧｅｎｅＴｅｘ，　ＧＴＸ６３３０５）を２μｇ／ｍＬで同等に処理した。培養は全て基礎培地を用いた。３時間後に細胞傷害活性をＫ５６２細胞株におけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞非添加ウェルにおける標的細胞数を１００％とした場合の残存標的細胞数として表した。
　結果を図１－１に示す。ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株は、Ｋ５６２細胞株に対して殺細胞活性を示したが、一方でＨＬＡ－Ｃｗ３－Ｋ５６２細胞株に対しては殺細胞活性が減弱された。これはＨＬＡ－Ｃｗ３を認識したＫＩＲ２ＤＬ２が抑制型シグナルをＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株に入れることで殺細胞活性を抑制したと考えられ、ＫＩＲ２ＤＬ２のミッシングセルフを示す評価系を構築できた。このＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株のＫ５６２細胞株に対する系において、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂを培養液中に添加したところ、濃度依存的にＫＩＲ２ＤＬ２細胞株のＫ５６２細胞株に対する殺細胞活性が減弱され、２μｇ／ｍＬでは約５０％阻害した。このことから、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂは、Ｋ５６２細胞に対するＫＩＲ２ＤＬ２―ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性において、抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２へのアゴニスト活性を示すことが分かった。なおコントロール抗体のＨｕｍａｎ　ＩｇＧ４の２μｇ／ｍＬでは変化が無かった。
　一方でＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株によるＨＬＡ－Ｃｗ３－Ｋ５６２細胞株への殺細胞活性評価においてＬｉｒｉｌｕｍａｂを２μｇ／ｍＬで添加すると、その殺細胞活性は増強された。結果を図１－２に示す。またコントロール抗体のＨｕｍａｎ　ＩｇＧ４の２μｇ／ｍＬでは変化が無かった。
　これはＬｉｒｉｌｕｍａｂに関する事象（ＰＬ４：ＷＯ２００６／００３１７９＿Ａ２）と同等であり、ＫＩＲのリガンドによる抑制型シグナルをＬｉｒｉｌｕｍａｂが解除し、ＮＫ細胞の活性化を増強していることが推察され、抑制型ＫＩＲに対するＨＬＡリガンドによるアゴニスト作用を阻害する活性である。
　以上から、ＨＬＡ－Ｃｗ３といったＫＩＲ２ＤＬ２のアゴニストがある場合は抗ＫＩＲ抗体であるＬｉｒｉｌｕｍａｂはリガンドの活性を解除し、ＮＫ細胞の殺細胞活性を増強する。しかし一方で、ＫＩＲ２ＤＬ２のリガンドが無い場合は、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂは抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を示すパーシャルアゴニストとして機能することが示された。
実施例２：Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ及びＰａｎ２ＤのｓｃＦｖ発現における抑制型ＫＩＲ依存的なＮＫ細胞株の活性抑制
　他家技術として抑制型受容体のアゴニストバインダーを分泌タンパクとして作用させる場合は、標的組織周囲、更には体内の免疫系に影響を与えてしまう可能性があることから、免疫回避をしたい細胞のみが免疫寛容になるように移植する細胞の表面に当該アゴニストバインダーを発現させることで局所的免疫寛容を目指した。
　可溶化状態のＬｉｒｉｌｕｍａｂがＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞によるＫ５６２細胞への殺細胞活性を抑制したことから、Ｋ５６２細胞株の表面にＬｉｒｉｌｕｍａｂ又はＰａｎ２Ｄに由来するｓｃＦｖを膜型タンパク質として発現させ、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞の殺細胞活性を抑制できるか評価した。
［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］
　Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ及びＰａｎ２Ｄ（ＮＫＶＳＦ１）の配列は、ＷＯ２００６／００３１７９　Ａ２より引用した（各可変領域の配列番号は表６参照）。
　Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ　発現Ｋ５６２細胞株（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ　ｓｃＦｖ－Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株）及びＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ　発現Ｋ５６２細胞株（Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株）を樹立するために、まずＮ末端側からヒトＣＤ８由来シグナルペプチド（配列番号２３）、Ｆｌａｇタグ（配列番号２）、リンカー（ＧＳＧ）、下記表７の可変領域（VH）、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号２５）、下記表７の可変領域（VL）、ＣＤ８由来ヒンジ領域（６６アミノ酸）配列（配列番号２４）、ＣＤ８由来細胞膜ドメイン（配列番号２７）、ＣＤ８由来細胞内ドメイン（配列番号２８）及びを自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）とＦｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）の順に連結させたポリペプチドをコードする人工遺伝子(以下、「膜型ｓｃＦｖ発現フォーマット」という)を上記［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。このような膜型ｓｃＦｖバインダーの模式図を図９に示す。
＊表中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のそれぞれの領域は、各可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号の範囲で示した。アミノ酸番号はＩＭＧＴ定義に従って特定された番号である。
　レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、Ｔ１００Ｂ）を２０～１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を用いて希釈し、Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｉｓｈに添加した。室温で２時間又は４℃で終夜静置後、ＰＢＳ洗浄して、コートプレートを調製した。
　ＰＲＭＩ培地を用いて１～２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫ５６２細胞株を懸濁し、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ　ｓｃＦｖ－Ｌｕｃ又はＰａｎ２Ｄ　ｓｃＦｖ－Ｌｕｃ遺伝子を搭載したレンチウイルス濃縮液及び細胞をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅにて混合して１０００×ｇで１時間遠心した。培養３日後から、ＲＰＭＩ培地を用いて１～３日毎に培地全量を交換し、培養１週間後にＡＰＣラベル抗Ｆｌａｇ抗体、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９０－８５５）を用いて陽性細胞のみを選別した。
　必要に応じて、回収した細胞はＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＲＰＭＩ培地で培養後に使用した。
［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］
　本実施例でＫＩＲ２ＤＬ２としてＫＩＲ２ＤＬ２＊００１を使用した。殺細胞活性評価前日にＩＬ－２　５００ＩＵ／ｍＬで刺激したＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株を９６ウェルプレートに添加し、ＮＫ９２とＫ５６２細胞の比が３：１あるいは１：１となるようにＬｕｃ－Ｋ５６２細胞株、ＨＬＡ－Ｃｗ３－Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株、またＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２細胞株、そしてＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２をそれぞれ独立したウェルに添加してさらに培養した。培養は全て基礎培地を用いた。２～５時間後にＫ５６２細胞株が発現しているＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性を測定し、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１００％とした場合のＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を残存標的細胞数として表した。また、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性からＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を引いた値を、殺細胞活性として表した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の測定にはＯＮＥ－Ｇｌｏ（ＴＭ）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製、Ｅ６１２０）を用いた。
またＫＩＲ依存的な活性を判断するため、及びバインダー依存的な活性比を算出するために、Ｌｕｃ－Ｋ５６２株の活性を1として、殺細胞活性の比率を以下に示す計算式から算出した。
ＫＩＲ依存的な殺細胞活性比＝ＡＫＩＲ―ＮＫ９２／ＡＮＫ９２
［Ａ＝各ＮＫ細胞における殺細胞活性％＝（エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性－エフェクター細胞添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）／エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性ｘ１００］
　結果を図２に示す。ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株は、Ｋ５６２細胞株に対して殺細胞活性を示したが、一方でＨＬＡ－Ｃｗ３－Ｋ５６２細胞株に対しては殺細胞活性が減弱された。更にＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２やＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２は、Ｋ５６２細胞株と比較して、殺細胞活性が減弱した。
　以上から、抗ＫＩＲ抗体であるＬｉｒｉｌｕｍａｂやＰａｎ２ＤをｓｃＦｖ－膜型タンパク質として発現した場合に、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性を抑制し、ＫＩＲ２ＤＬ２に対するアゴニスト活性を示した。
実施例３：Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ，Ｐａｎ２Ｄは活性化ＫＩＲを介して、ＮＫ細胞の殺細胞活性を惹起する
　ＫＩＲ２ＤＬ２だけでなく、ＬｉｒｉｌｕｍａｂやＰａｎ２Ｄが交差性を示す他の抑制型ＫＩＲ及び活性型ＫＩＲに対して、アゴニスト活性を示すかを評価した。
　実施例２と同様の評価条件にて各種ＫＩＲ発現ＮＫ９２細胞株による、Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ又はＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２体の殺細胞活性感受性を評価した。ＫＩＲ依存的な活性を判断するために、以下の計算式による活性比を算出した。更にバインダー依存的な活性比を算出するために、Ｌｕｃ－Ｋ５６２株の活性を1として、比率を算出した。なお本実施例でＫＩＲ２ＤＬ２としてＫＩＲ２ＤＬ２＊００１を使用した。
ＫＩＲ依存的な殺細胞活性比＝ＡＫＩＲ―ＮＫ９２／ＡＮＫ９２
［Ａ＝各ＮＫ細胞における殺細胞活性％＝（エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性－エフェクター細胞添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）／エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性ｘ１００］
　結果を図３に示す。ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２に対してＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２細胞株又はＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２細胞株は殺細胞作用の抑制効果を示し、抑制型ＫＩＲへのアゴニスト活性を示した。これは実施例２と同様の結果である。一方でＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２はＫＩＲ２ＤＳ１－ＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＳ２－ＮＫ９２細胞株の活性を増強したことから、活性型であるＫＩＲ２ＤＳ１／２に対してアゴニスト活性を示したことが確認された。またＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２はＫＩＲ２ＤＳ１－ＮＫ９２細胞株、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＮＫ９２細胞株、更にＫＩＲ２ＤＳ４－ＮＫ９２細胞株の活性を増強したことから、活性型であるＫＩＲ２ＤＳ１／２／４に対してアゴニスト活性を示したことが確認された。
　Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ及びＰａｎ２Ｄの結合特異性はＷＯ２００６／００３１７９　Ａ２で報告されているが、ＬｉｒｉｌｕｍａｂはＫＩＲ２ＤＳ１とＫＩＲ２ＤＳ２に、Ｐａｎ２ＤはＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２そしてＫＩＲ２ＤＳ４に結合性を示すことが報告されている。すなわち、公知の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２／３に対する抗体は、対応する活性型ＫＩＲに結合性を示し、活性型ＫＩＲを発現するＮＫ細胞株の活性を増強することが確認された。
実施例４：Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇによるＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーの取得　
　実施例３の結果を踏まえて、活性型受容体を活性化せず、抑制型受容体にアゴニスト活性を示す新規バインダーの取得を目指して、以下の方法により活性型ＫＩＲに結合性を示さない抑制型ＫＩＲ特異的バインダーを取得した。
［Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇによる抑制型ＫＩＲ特異的バインダーの取得］
　ヒト抗体ファージライブラリーを用いて抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３への結合し、活性化ＫＩＲ２ＤＳ１、２、４に結合しない特異的バインダーを取得するべく、Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇを実施した。
　Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇを実施するため、表８に示す可溶型ＫＩＲを作製した。可溶型ＫＩＲについて、Ｎ末端側からＩＬ－２由来シグナルペプチド（配列番号９１）、表７に記載の各ＫＩＲタンパク質細胞外ドメイン、ＧＧＧＳリンカー（配列番号９７）、ＩｇＧ　Ｆｃドメイン（配列番号９８）、ＧＡＡリンカー、Ａｖｉタグ（配列番号９９）を連結させた組換えタンパク質を作製した。Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇには、表７に示す各ＫＩＲに対応した可溶型ＫＩＲにビオチン化処理を行ったもの、又は行わなかったものを用いた。また、ＥＬＩＳＡを実施する際に、可溶型ＫＩＲ２ＤＬ３としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＫＩＲ２ＤＬ３／ＣＤ１５８ｂ２　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２０１４－ＫＲ－０５０）を用いた。
　今回のＰｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにおいてＰｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎとは、ビオチン化した組換えタンパク質とｓｃＦｖ発現ファージライブラリー溶液を反応させ、ビオチン化した組換えタンパク質に結合するｓｃＦｖ発現ファージを、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ又はＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ　Ｂｅａｄｓを用いて濃縮する作業工程を指す。今回のＰｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにおいてＤｅｐｌｅｔｉｏｎとは、ビオチン化した組換えタンパク質とｓｃＦｖ発現ファージライブラリー溶液を反応させ、ビオチン化した組換えタンパク質に結合するｓｃＦｖ発現ファージを、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ又はＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ　Ｂｅａｄｓを用いて除外する作業工程を指す。今回のＰｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇにおいてＤｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎとは、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ中のビオチン化した組換えタンパク質とｓｃＦｖ発現ファージライブラリー溶液の反応過程において、ビオチン化していない組換えタンパク質を添加することで、ビオチン化した組換えタンパク質に結合するｓｃＦｖ発現ファージをＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ又はＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ　Ｂｅａｄｓを用いて濃縮した際に、添加したビオチン化していない組換えタンパク質に結合せず、ビオチン化した組換えタンパク質に特異的に結合するｓｃＦｖ発現ファージが濃縮されやすくなる作業工程を指す。
　Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇの各ラウンドにおいて、抑制型ＫＩＲに対するＰｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎと、活性型ＫＩＲに対するＤｅｐｌｅｔｉｏｎあるいはＤｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ又はその両方が行われた。２回のラウンド終了後、ＫＩＲ２ＤＬ２特異的バインダーが濃縮されたポリクローナルなファージライブラリーを取得した。
　ヒトＫＩＲ２ＤＬ２（２２―２４５）―Ｆｃ―Ａｖｉ（上記の可溶型ＫＩＲ２ＤＬ２）を用いてＥＬＩＳＡを行い、ポリクローナルなファージライブラリーよりＫＩＲ２ＤＬ２に結合するｓｃＦｖ発現ファージを選抜した。選抜されたｓｃＦｖ発現ファージのファージミドからｓｃＦｖ配列を大腸菌用の組換えタンパク質発現ベクターに乗せ換え、大腸菌に導入して培養上清より各ｓｃＦｖを調製した。各ｓｃＦｖについて、表７に記載の可溶型ＫＩＲ又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＫＩＲ２ＤＬ３／ＣＤ１５８ｂ２　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　Ｐｒｏｔｅin（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２０１４－ＫＩＲ－０５０）を用いてＥＬＩＳＡを実施し、各ｓｃＦｖの各ＫＩＲに対する結合性の情報を取得した。
　これらの中からＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合し、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に結合しないｓｃＦｖの可変領域を［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている膜型ｓｃＦｖ発現フォーマットに導入し、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入した。各膜型ｓｃＦｖを導入したｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法でレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスを用いて［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている方法で各ｓｃＦｖを膜型ｓｃＦｖとして発現するＫ５６２細胞株を作製した。
　これらの標的細胞５ｘ１０４個に対して、Ｆｃを付加した表７に示す組換えタンパク質又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＫＩＲ２ＤＬ３／ＣＤ１５８ｂ２　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　Ｐｒｏｔｅin（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２０１４－ＫＩＲ－０５０）を０．１μＭにて添加し、４℃９０分で反応させた。
　反応後の標的細胞をＰＢＳにて洗浄し、ＡＰＣラベル　抗ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社製、４０９３０６）を添加し、４℃３０分にて反応させた。ＰＢＳにより２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いて結合性の有無を確認した。Ｋ５６２細胞株に対する結合性（ＡＰＣ由来の蛍光強度のｍｅｄｉａｎ）を１として、それに対する比率を算出した。
　結果を図４に示す。
　ＬｉｒｉｌｕｍａｂやＰａｎ２ＤがＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＳ１、２又は４に結合を示したことに比べて、１２種類のバインダーともＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＳ１、２又は４への結合性を抑え、またＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に対して結合性を示した。
実施例５：ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのアゴニスト活性評価（初期評価）
　実施例４で特異性が担保されたバインダーに関してアゴニスト活性を評価した。
　なおこれらのバインダーに関しては以下のコンストラクトで膜型ｓｃＦｖとＬｕｃｏｆｅｒａｓｅが連結し他ポリペプチドをコードする遺伝子として、［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。
　各バインダーの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号は、下記表８に示す。各バインダーを細胞外ドメインに有する膜型タンパク質を標的細胞に発現させるために、Ｎ末端側からヒトＣＤ８由来シグナルペプチド（配列番号２３）、Ｆｌａｇタグ（配列番号２）、リンカー（ＧＳＧ）、下記表８の可変領域（VH）、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号２５）、下記表８の可変領域（VL）、ＣＤ８由来ヒンジ領域配列（配列番号２６）、ＣＤ８由来細胞膜ドメイン（配列番号２７）及びＣＤ８由来細胞内ドメイン（配列番号２８）からなる膜型ｓｃＦｖに、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）及びＦｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）を順に連結させたポリペプチドをコードする遺伝子を上記［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。表９において、「ａ２ＤＬ２／３」は、２ＤＬ２及び／又は２ＤＬ３に結合することを示す。

＊表中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のそれぞれの領域は、各可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号の範囲で示した。アミノ酸番号はＩＭＧＴ定義に従って特定された番号である。
　実施例２や実施例４と同様の評価条件にて各種ＫＩＲ発現ＮＫ９２細胞株による、各バインダーの膜型ｓｃＦｖ－Ｋ５６２体の殺細胞活性感受性を評価した。バインダー依存的な活性を判断するために、以下の計算式による活性比を算出した。更にバインダー依存的な活性比を算出する場合は、Ｌｕｃ－Ｋ５６２株の活性を1として、比率を算出した。
ＫＩＲ依存的な殺細胞活性比＝Ａバインダー－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２／ＡＫ５６２
［Ａ＝各Ｋ５６２に対する殺細胞活性％＝（エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性－エフェクター細胞添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）／エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性ｘ１００］
　結果を図５に示す。全てのバインダーにおいてＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３－ＮＫ９２細胞株に対してアゴニスト活性を示し、またＬｉｒｉｌｕｍａｂやＰａｎ２ＤのようにＫＩＲ２ＤＳ１／２／４－ＮＫ９２細胞株を活性化することは無かった。以上から、求めるプロファイルである抑制型ＫＩＲに特異的なアゴニストバインダーを取得した。これらのＫＩＲはＡｌｌｅｌｅ　Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　Ｎｅｔ　Ｄａｔａｂａｓｅ上で高頻度に発現するＫＩＲであることから、その特異性及びアゴニスト活性は多くの人において期待できる。
実施例６：プライマリーＮＫ細胞を用いたＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのアゴニスト活性評価
　これまでエフェクターはＮＫ９２細胞株を利用しており、抑制型及び活性型ＫＩＲを導入していた。生体内にあるＮＫ細胞上に発現するＫＩＲに対しても、実施例４で同定したバインダーらがアゴニスト活性を示すか調べるため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から採取されたＮＫ細胞を用いたアゴニスト活性評価を行った。
　ＮＫ細胞は自己のＨＬＡ　ｔｙｐｅ（Ｃ１，Ｃ２，Ｂｗ４）を認識し、対象細胞に対する殺細胞活性を示すＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆという性質を持つ。例えばＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ１ホモのヒトから採取されたＮＫ細胞はＣ１を自己として認識するため、Ｃ１　ｔｙｐｅのＨＬＡ－Ｃを対象細胞が保持しないと抑制型受容体を介してＮＫ細胞内に抑制型シグナルが入らないため、殺細胞活性を示す。一方で対象細胞にＣ１　ｔｙｐｅがあれば殺細胞活性を示さず、またＣ１　ｔｙｐｅの代替となるアゴニストバインダーが発現していれば殺細胞活性は低減できる。
　同様のことがＨＬＡ－Ｃ２ホモのＮＫや、ＨＬＡ－Ｂｗ４陽性のＮＫにも適用できる。それぞれに機能する抑制型ＫＩＲは異なり、ＨＬＡ－Ｃ１ホモではＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３が、ＨＬＡ－Ｃ２ホモではＫＩＲ２ＤＬ１が、ＨＬＡ－Ｂｗ４陽性ではＫＩＲ３ＤＬ１がｍｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆの抑制型受容体として機能するため、これらＫＩＲに対するアゴニストを評価することができる。
［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の調製］
　エフェクター細胞として、ＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ１／Ｂｗ４陰性のＰＢＭＣを２種類準備した（ＰＢＭＣ－ＡとＰＢＭＣ－Ｂとする）。ＫＩＲのｈａｐｌｏｔｙｐｅによりＰＢＭＣ－ＡはＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２の遺伝子を、ＰＢＭＣ－ＢはＫＩＲ２ＤＬ３の遺伝子を持つことが分かった。
　抗ＣＤ１６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、３０２０５０）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳを用いて希釈し、Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｉｓｈに添加した。室温で２時間又は４℃で終夜静置後、ＰＢＳ洗浄して、ＩＬ－２及びＩＬ－１８（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製、９１２４－ＩＬ）をそれぞれ１０００Ｕ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加したＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地（以下、「ＮＫ培地」という）に、懸濁したヒト由来末梢血単核球（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社製、ＣＴＬ－ＵＰ１）を添加した。７～１０日後に細胞を回収して、ＣＤ５６　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０５０－４０１）を用いてＣＤ５６陽性細胞（ＮＫ細胞）を精製した。その後、再度ＩＬ－２／１８入りのＭｙｅｌｏｃｕｌｔで培養を継続した。
［目的遺伝子発現Ｔ細胞の調製］
　ターゲット細胞として、ＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ１／Ｂｗ４陰性のＰＢＭＣをＰＢＭＣ－Ａ（エフェクターと同じである）と、ＨＬＡ－Ｃ２／Ｃ２／Ｂｗ４陰性のＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ－Ｃとする）を１種類ずつ準備した。
　抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、３１７３４７）を５～１０μｇ／ｍＬ、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、Ｔ１００Ｂ）を２０～１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を用いて希釈し、Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｉｓｈに添加した。室温で２時間又は４℃で終夜静置後、ＰＢＳ洗浄して、コートプレート（以下、「ＣＤ３　Ａｂ／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅ」という）を調製した。
　実施例５で利用した１０個のバインダーの膜型ｓｃＦｖ発現用のレンチウイルス液を用意した。またコントロールとして、ヒトＣＤ１９のポリペプチド（配列番号５３）と自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）及びＦｉｒｅｆｌｙ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）を連結させたポリペプチドを含む人工遺伝子をレンチウイルスに導入・作製した。
　ウイルス濃縮液をプレートに添加し、２０００×ｇで２時間遠心することでウイルス結合プレートを調製した。ＩＬ－２（Ｎｉｐｒｏ社製、８７－８９０、又は共和薬品社製、５８６９７９００）を終濃度で１００Ｕ／ｍＬとなるように添加した基礎培地（以下、「ＩＬ－２培地」という）を用いてヒト由来末梢血単核球（ＰＢＭＣ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社製、ＣＴＬ－ＵＰ１）を１～２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁し、ウイルス結合プレートに添加して３００×ｇで３～５分間遠心した。
　ここでＰＢＭＣ－ＡにはヒトＣＤ１９－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを、ＰＢＭＣ－ＣにはヒトＣＤ１９－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ又は１０種類のバインダーの膜型ｓｃＦｖ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのレンチウイルスを感染させた。培養３日後から、ＩＬ－２培地を用いて１～３日毎に培地全量を交換し、培養１週間後にＡＰＣラベル抗ＣＤ１９抗体、ＡＰＣラベル抗Ｆｌａｇ抗体、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ミルテニー社製、１３０－０９０－８５５）を用いて細胞選別を行い、陽性細胞を濃縮した。
［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を用いた殺細胞活性評価］
　細胞傷害活性の評価対象のＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を９６ウェルプレートに１×１０５個を添加し、１／１０量（すなわち、１×１０４個）の目的遺伝子発現Ｔ細胞をそれぞれ独立したウェルに添加してさらに培養した。培養は全て基礎培地を用いた。４時間後に細胞傷害活性を目的遺伝子発現Ｔ細胞におけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおける標的細胞数を１００％とした場合の残存標的細胞数として表した。
　結果を図６に示す。
　まずエフェクター細胞がＣ１／Ｃ１／Ｂｗ４陰性であるため、対象細胞がＣ１／Ｃ１／Ｂｗ４陰性の場合と、Ｃ２／Ｃ２／Ｂｗ４陰性の場合であると、Ｃ２／Ｃ２／Ｂｗ４陰性のＴ細胞に対して明確な殺細胞活性を示す。これはｍｉｓｓｉｎｇ　ｓｅｌｆであると考えられる。
　一方でＣ２／Ｃ２／Ｂｗ４陰性のＴ細胞にＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーを発現させた場合、Ｃ２／Ｃ２／Ｂｗ４陰性のＴ細胞にＣＤ１９－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現させた場合に比べて、殺細胞活性の減弱が確認された。この結果について、ＰＢＭＣ－Ａ由来のＮＫ細胞とＰＢＭＣ－Ｂ由来のＮＫ細胞で同様の傾向が認められ、実施例5で得られたＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーがプライマリーなＮＫ細胞に対してもアゴニスト活性を示すことが確認できた。
実施例７：ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーの結合性評価
　実施例６にてアゴニスト活性を確認したバインダーに関して、ＮＫ細胞表面の抑制分子及び活性分子への結合性評価を行った。コントロールとして、Ｐａｎ２Ｄを置いた。
　実施例５で作製された膜型ａ（抗）２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞、又は実施例３で作製されたＰａｎ２Ｄの膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞１ｘ１０４個に対して、Ｆｃを付加又はＨｉｓ体をタグとする組換えタンパク質を０．１μＭにて添加、４℃９０分で反応させた。ＰＢＳにて洗浄し、ＡＰＣラベル抗ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社製、４０９３０６）又はＡＰＣラベル抗Ｈｉs　ｔａｇ抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社製、３６２６０５）を添加し、４℃３０分にて反応させた。ＰＢＳにより２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いて結合性の有無を確認した。Ｋ５６２細胞株に対する結合性（ＡＰＣ由来の蛍光強度のｍｅｄｉａｎ）を１として、それに対する比率を算出した。
　表１０に示す組換えタンパク質を使用した。Ｉｎ　ｈｏｕｓｅと記載されている組換えタンパク質は表7に記載されているものと同じものを使用した。Ｆｃ－Ｈｉｓ－Ａｖｉとして、Ｎ末端側からＩｇＧ　Ｆｃドメイン（配列番号９８）、ＧＡＡリンカー、Ａｖｉタグ（配列番号９９）を連結させた組換えＫＩＲタンパク質を作製した。
　結果を図７に示す。
　Ｐａｎ２ＤがＫＩＲ２ＤＳ１ 、２及び４に結合を示したことに比べて、バインダー（ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４）及びバインダー（ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０）はＫＩＲ２ＤＳ１、２及び４には結合性を示さないだけでなく、他の抑制型受容体や活性型受容体にも結合を示さなかった。
　以上から、バインダーが他のＮＫ細胞受容体に結合して作用を示しているのでなく、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合して、ＮＫ細胞の活性化を抑制していることが示唆された。
実施例８：ＫＩＲ２ＤＬ１バインダー、及びＫＩＲ３ＤＬ１バインダーのアゴニスト活性評価
　ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ１に対して結合性を示すバインダーが、各受容体を発現するＮＫ細胞株に対してアゴニスト活性を示すかを評価した。
［Ｋ―５６２細胞への遺伝子導入及び調製］
　ヒトＨＬＡ－Ｃ２発現Ｋ５６２細胞株（ＨＬＡ－Ｃｗ４－Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株）を樹立するために、まずＮ末端側から表１１のシグナルペプチド、Ｆｌａｇタグ（配列番号２）及び表１０のＨＬＡペプチドの順に連結させたポリペプチドをコードする人工遺伝子を、またＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）配列下流にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）のポリペプチドをコードする人工遺伝子を、［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。
　抗３ＤＬ１抗体の配列は、ＷＯ２０１８／１４８２２３　Ａ１より引用し、以下のコンストラクトでポリペプチドを連結し、［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。
　各バインダーの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号は、表１２に示す。各バインダーを細胞外ドメインに有する膜型タンパク質を標的細胞に発現させるために、Ｎ末端側からヒトＣＤ８由来シグナルペプチド（配列番号２３）、Ｆｌａｇタグ（配列番号２）、リンカー（ＧＳＧ）、表１２の可変領域（VL）、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号２５）、表１２の可変領域（VH）、ＣＤ８由来ヒンジ領域（６６アミノ酸）配列（配列番号２４）、ＣＤ８由来細胞膜ドメイン（配列番号２７）及び、ＣＤ８由来細胞内ドメイン（配列番号２８）からなる膜型ｓｃＦｖのＣ末端に自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）及びＦｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）の順に連結させたポリペプチドをコードする遺伝子を上記［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従って、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、レンチウイルスを作製した。
＊表中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のそれぞれの領域は、各可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号の範囲で示した。アミノ酸番号はＩＭＧＴ定義に従って特定された番号である。
　レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、Ｔ１００Ｂ）を２０～１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を用いて希釈し、Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｉｓｈに添加した。室温で２時間又は４℃で終夜静置後、ＰＢＳ洗浄して、コートプレートを調製した。
　Ｋ５６２細胞を、ＰＲＭＩ培地を用いて１～２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。ＨＬＡ又はバインダーの膜型ｓｃＦｖを搭載したレンチウイルス濃縮液及びＮＫ細胞懸濁液をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅにて混合して１０００×ｇで３２℃において１時間遠心した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。培養３日後から、ＰＲＭＩ培地を用いて１～３日毎に培地全量を交換し、培養１週間後にＡＰＣラベル抗Ｆｌａｇ抗体、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ミルテニー社製：１３０－０９０－８５５）を用いて陽性細胞のみを選別した。
　必要に応じて、回収した細胞はＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＲＰＭＩ培地で培養後に使用した。
　なお抗２ＤＬ１抗体に関しては、ＫＩＲ２ＤＬ１に結合性を示すＰａｎ２Ｄを利用し、実施例２のＰａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２細胞株を用いた。
　実施例２や４と同様の評価条件にて各種ＫＩＲ発現ＮＫ９２細胞株による、各バインダーの膜型ｓｃＦｖ－Ｋ５６２体の殺細胞活性感受性を評価し、以下の計算式による活性を算出した。
各Ｋ５６２に対する殺細胞活性％＝（エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性－エフェクター細胞添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）／エフェクター細胞無添加における標的細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性ｘ１００
　結果を図８に示す。
　ポジティブコントロールであるＨＬＡ－Ｃｗ４はＫＩＲ２ＤＬ１－ＮＫ９２細胞株に対して、アゴニスト活性を示した。この系において、Ｐａｎ２ＤはＫＩＲ２ＤＬ１に対してアゴニスト活性を示した。またａ３ＤＬ１－ＤＳ１はＫＩＲ３ＤＬ１に対してアゴニスト活性を示した。
　以上よりＫＩＲ２ＤＬ１に対してアゴニスト活性を示すバインダー、及びＫＩＲ３ＤＬ１に対してアゴニスト活性を示すバインダーを同定した。
実施例９：プライマリーＮＫ細胞を用いた、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのアゴニスト活性がＣＡＲ－Ｔ細胞の薬効に与える影響の評価
　プライマリーＮＫ細胞としてＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を用い、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞と同じＰＢＭＣより作製したＣＡＲ－Ｔ細胞、又は異なるドナー由来のＰＢＭＣより作製したＣＡＲ－Ｔ細胞について、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞と共培養した状態でＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット細胞に対する殺細胞活性を評価した。
　プライマリーＮＫ細胞存在下においてはプライマリーＮＫ細胞の抑制型ＫＩＲに合致するＨＬＡを発現していない異なるドナー由来のＣＡＲ－Ｔ細胞は、プライマリーＮＫ細胞からＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆであると認識され攻撃の対象となる。
　実施例６において、プライマリーＮＫ細胞に対しても実施例４で同定したバインダーらがアゴニスト活性を示し、プライマリーＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することが確認された。プライマリーＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺細胞活性の維持に寄与するか調べるため、プライマリーＮＫ細胞としてＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を用い、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞と異なるドナー由来のＣＡＲ－Ｔ細胞又は実施例４で同定したバインダーを発現するＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞と異なるドナー由来のＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＡＲを介して殺細胞活性を示す細胞の３種を混合し、ＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット細胞に対する殺細胞活性を評価した。
　［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の調製］の項目に記載の方法に従って作製されたＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞について、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存されているものを試験前々日に融解し、ＩＬ－２及びＩＬ－１８を添加したＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地で培養した。試験前日にＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞の培地をＩＬ－２及びＩＬ－１８の含まれないＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地に置換し、培養した。
［ＣＡＲ及びＫＩＲ2ＤＬ2／特異的バインダーを発現するＴ細胞の調製］
　ＣＡＲを発現するＴ細胞の作製のため、ＨＬＡ－Ｃ２／Ｃ２／Ｂｗ４陰性のＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ－Ｃ）を用いた。
　ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｔ－ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｒｅｎｄｅｒｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ＣＤ１９：　ｔｏｗａｒｄ　ｔｈｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｅｆｆｅｃｔ．　Ｌ　Ｊ　Ｃｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｌｏｏｄ　２００３　Ｆｅｂ　１５；１０１（４）：１６３７－４４．に記載のＣＡＲ）（以下、「ＣＤ１９ＣＡＲ」という）を発現させるため、Ｎ末端側からＣＤ8由来シグナルペプチド（配列番号２３）、ＣＤ１９ＣＡＲ　ＶＬ（配列番号１００）、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号２５）、ＣＤ１９ＣＡＲ　ＶＨ（配列番号１０１）、ＣＤ８由来ヒンジ領域配列（配列番号２６）、ＣＡＲ用ＣＤ８由来細胞膜ドメイン（配列番号１０２）、細胞内共刺激分子（配列番号１０３）、リンカー（ＧＳＧ）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、Ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＦＰ）（配列番号１０４）をコードする人工遺伝子をｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入し、［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法でａｎｔｉ－ＣＤ１９ ＣＡＲ搭載レンチウイルス濃縮液を作製した。また、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現させるため、実施例４で作製したプラスミドを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法で膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ搭載レンチウイルス濃縮液を作製した。また、コントロールとして人工遺伝子に、Ｎ末端側からＮＧＦＲペプチド（配列番号５８）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、及び、Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）の順に配置されたポリペプチドをコードする遺伝子（以下、「ＮＧＦＲ－Ｌｕｃ」という）を採用して、同様の方法によりＮＧＦＲ－Ｌｕｃ搭載レンチウイルス濃縮液を調製した。
　ＩＬ－２（Ｎｉｐｒｏ社製、８７－８９０）を添加したＡＩＭ Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１２０５５－０８３）にＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１０２７０－１０６）５（ｖ／ｖ）％及びＳｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ／Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１５２４０－０６２）を添加したもの（以下、「ＩＬ－２培地」という）を用いてＰＢＭＣ－Ｃを懸濁し、作製したレンチウイルス濃縮液（ＮＧＦＲ－Ｌｕｃ搭載レンチウイルス単独　膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ搭載レンチウイルス単独、ＣＤ１９ＣＡＲ搭載レンチウイルス単独、又は、ＣＤ１９ＣＡＲ搭載レンチウイルスと膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ搭載レンチウイルスの混合液の４条件）と混合して［目的遺伝子発現Ｔ細胞の調製］の項目に記載されているＣＤ３　Ａｂ／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅに添加した。遠心機を用いて１時間遠心した。翌日に前日と同じウイルス濃縮液を各ｗｅｌｌに添加し、遠心機を用いて１時間遠心した。
　適宜ＩＬ－２培地へと全量培地交換し培養後、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ搭載レンチウイルス、又は、ＣＤ１９ＣＡＲ搭載レンチウイルスと膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ搭載レンチウイルスの混合液を感染させたＰＢＭＣ－Ｃについて、ＡＰＣラベル抗Ｆｌａｇ抗体、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９０－８５５）を用いて膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ陽性細胞を濃縮した。またＮＧＦＲ－Ｌｕｃ搭載レンチウイルスを感染させたＰＢＭＣ－Ｃについて、抗ＬＮＧＦＲ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９９－０２３）を用いてＮＧＦＲ陽性細胞を濃縮した。この作業により膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞が得られた。また、ＣＡＲ搭載レンチウイルスと膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖ搭載レンチウイルスの混合液を感染させたＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞においては、両方とも発現している細胞、片方のみ発現している細胞、両方発現していない細胞が混在していたが、濃縮によりＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞と膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖのみを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞の混合細胞群が得られた。また、ＮＧＦＲ－Ｌｕｃを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞が得られた。
　ＮＧＦＲ－Ｌｕｃを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞、及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞について、濃縮後適宜ＩＬ－２培地へと全量培地交換し培養後、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。
　ＣＤ１９ＣＡＲ搭載レンチウイルスのみを感染させたＰＢＭＣ－Ｃ、及び上記濃縮で得たＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞と膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖのみを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞の混合細胞群について、培養後に全量をＩＬ－２培地に懸濁しＣＤ１９　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製、ＴＰ３０２９２２）でコートしたＣＤ１９　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅに添加した。培養後に、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞、又はＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞が濃縮されていることを確認し、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。
　各ＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞は試験前日に融解し、ＩＬ－２培地にて培養した。
［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞存在下におけるＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット細胞に対する殺細胞活性評価］
　ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＴ細胞のターゲットとして、ＣＤ１９を恒常的に発現するＲａｊｉ細胞にウイルスベクターを用いてＧＦＰを導入した細胞株（以下、「Ｒａｊｉ－ＧＦＰ」という）を用いた。Ｒａｊｉ―ＧＦＰ細胞をＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞と混合したサンプル、又はＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞のみのサンプルを作製した。各サンプルに対して、ＮＧＦＲ－Ｌｕｃを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲのみを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のみを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞、又はＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞をＲａｊｉ－ＧＦＰ細胞に対して１：１、１：０．５又は１：０．１の割合で添加し、９６ウェルプレートにて培養を行った。培地としてＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地、ＦＣＳを５（ｖ／ｖ）％を添加したＡＩＭ Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＦＣＳを１０（ｖ／ｖ）％を添加したＲＰＭＩ　１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ，　ＧｌｕｔａＭＡＸ（全てＳｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ／Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎが添加されている）を用いて、各培地が等量となるよう細胞懸濁液を混合した。
　培養開始から４日後に、［フローサイトメトリー、及び添加染色用抗体］の項目に記載されている方法を用いて各ｗｅｌｌにおける細胞数の測定を行った。ＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞を検出する抗体として、ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ　７５０　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ３　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社製、３００４７０）を用いた。また、Ｒａｊｉ－ＧＦＰ細胞の検出にはＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞が発現しているＧＦＰを用いた。
　Ｒａｊｉ―ＧＦＰ細胞のみが添加されたｗｅｌｌにおけるＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞の生細胞数を１００％とし、縦軸に各ｗｅｌｌのＲａｊｉ細胞の生細胞数の割合を、横軸に培養開始時の各ｗｅｌｌにおけるＴ細胞のＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞に対する割合をプロットした結果を図２０に示す。
　ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞が共培養されていないｗｅｌｌにおいて、ＣＤ１９ＣＡＲのみを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞とＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞のＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞に対する細胞傷害活性は同程度であった。一方、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞が共培養されているｗｅｌｌにおいて、ＣＤ１９ＣＡＲのみを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞のＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞に対する細胞傷害活性はＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞のＲａｊｉ―ＧＦＰ細胞に対する細胞傷害活性と比較して減弱していた。
　このとき、図２１に示すようにＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞が共培養されているｗｅｌｌにおいてＣＤ１９ＣＡＲのみを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞の数がＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞の数と比較して減少している。ＣＤ１９ＣＡＲのみを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞はＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞によりＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆであると認識され、攻撃されたことから数が減少し、ＣＤ１９ＣＡＲ及び膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現しているＰＢＭＣ－Ｃ由来Ｔ細胞はＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞に対してａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を介した抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を示し、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞による攻撃を回避したことから数が減少しなかったと考察される。
　このことから、実施例４で同定されたバインダーを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞はプライマリーＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、プライマリーＮＫ細胞の存在下で、実施例４で同定されたバインダーを発現しないＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ－Ｔ細胞のターゲット細胞に対する殺細胞活性を維持することが示された。
実施例１０：ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＣＤＲ改変がアゴニスト活性に与える影響の評価
　ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０の可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３について、特定のアミノ酸１残基をアラニンに置換した際に、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性への影響を評価した。
　膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖにおいて、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３（配列番号５１のアミノ酸番号９７～１１２）について、各アミノ酸１残基毎にアラニンに置換された膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖの変異体をＶＨ－ＶＬの並び順で膜型ｓｃＦｖ発現フォーマットに組み込んだ人工遺伝子をｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入した。各変異体の呼称とアラニンに置換されたアミノ酸を下記表１３に示す。
　各膜型ｓｃＦｖ変異体を導入したｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法でレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスを用いて［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ導入及び調製］の項目に記載されている方法で各膜型ｓｃＦｖ変異体を発現するＫ５６２細胞株を作製した。
　実施例５で使用したＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＬ３－ＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＳ２－ＮＫ９２細胞株を用いて、［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］の項目に記載の方法で各膜型ｓｃＦｖ変異体を発現するＫ５６２細胞株に対する各ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性を評価した。
　結果を図２２に示す。変異体Ｒ９８Ａ、Ｓ１００Ａ、Ｇ１０１Ａ，Ｔ１０２Ａ、Ｇ１０５Ａ、Ｙ１０６Ａ、Ｙ１０７Ａにおいて、変異を導入していない膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＷＴ　ｓｃＦｖと比較してＫＩＲ２ＤＬ３に対するアゴニスト活性の減弱あるいは消失が確認された。一方、上記以外の変異体は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＷＴ　ｓｃＦｖと同程度のアゴニスト活性を示していることから、アゴニスト活性には重要でないアミノ酸であることが示唆された。また、これらの変異体はＫＩＲ２ＤＬ２／３に最も相同性の高い活性型ＫＩＲであるＫＩＲ２ＤＳ２に対してアゴニスト活性を示さなかった。
　以上の結果により、抑制型ＫＩＲに対する特異的なアゴニスト活性をもつバインダーのＣＤＲ中のアミノ酸配列を改変することで同様の性質をもつバインダーを得ることができる可能性が示唆された。また、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０においてＣＤＲ３のアミノ酸Ｒ９８、Ｓ１００、Ｇ１０１，Ｔ１０２、Ｇ１０５、Ｙ１０６、Ｙ１０７は抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性に寄与していることが示された。
実施例１１：ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＣＤＲについて、異なるｓｃＦｖの定常領域に移植を行ったＣＤＲ移植体が、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的なアゴニスト活性を維持していることの評価
　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に対する特異性がＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＣＤＲのみを移植した場合でも維持されることを確認するため、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２又はａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３の重鎖及び軽鎖ＣＤＲについて、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４のＣＤＲを除いた重鎖と軽鎖の定常領域に移植したＣＤＲ移植体バインダー（以下それぞれ、「ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１―２」、「ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２―２」及び「ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３―２」という）を膜型ｓｃＦｖとしてＫ５６２細胞に発現させ、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を評価した。
　ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１―２、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２―２又はａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３―２をそれぞれ膜型ｓｃＦｖ発現フォーマットに組み込んだ人工遺伝子をｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入した。各ＣＤＲ移植体のアミノ酸を下記表１４に示す。
　各ＣＤＲ移植体膜型ｓｃＦｖを導入したｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法でレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスを用いて［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている方法で各ＣＤＲ移植体膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株を作製した。その他目的の遺伝子を発現するＫ５６２細胞は実施例５で使用したものを用いた。
　実施例５で使用したＮＫ９２細胞株、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株、ＫＩＲ２ＤＬ３－ＮＫ９２細胞株、ＫＩＲ２ＤＳ１－ＮＫ９２細胞株、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＳ４－ＮＫ９２細胞株を用いて、［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］の項目に記載の方法で各ＣＤＲ移植体膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株に対する各ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性を評価した。
　結果を図２３に示す。各ＣＤＲ移植体膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株はＣＤＲ移植を行っていない膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３を発現するＫ５６２細胞株と同等のアゴニスト活性をＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３に対して示した。一方、各ＣＤＲ移植体膜型ｓｃＦｖはＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２及びＫＩＲ２ＤＳ４に対してＰａｎ２ＤのｓｃＦｖのようなアゴニスト活性を示さなかった。
　以上の結果により、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＣＤＲは、異なるｓｃＦｖの定常領域に移植を行った際もＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的なアゴニスト活性を維持することが示された。このことから、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的なアゴニスト活性にはＣＤＲの配列が重要であり、異なる定常領域に移植した場合でもその特異性は維持されることが示された。
実施例１２：ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーとＨＬＡ－Ｅと共発現させた際の、ＮＫ細胞の殺細胞活性に対する相加的な抑制作用の評価
　膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０ｓｃＦｖとＨＬＡ－Ｅを共発現することで、ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３とＮＫＧ２Ａを共発現するＮＫ細胞により強い殺細胞活性抑制作用を示すか検討するため、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖとＨＬＡ－Ｅを共発現するＫ５６２細胞に対する、ＫＩＲ２ＤＬ２又はＫＩＲ２ＤＬ３とＮＫＧ２Ａを共発現するＮＫ９２細胞の殺細胞活性を評価した。
　ＨＬＡ－Ｅを遺伝子導入するレンチウイルスを作製するため、Ｎ末端側からヒトＢ２Ｍ由来シグナルペプチド（配列番号１８）、ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド由来ペプチド（配列番号８８）、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）リンカー（配列番号２５）、ヒトＢ２Ｍペプチド（配列番号１９）、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号８９）、ＨＬＡ－Ｅペプチド（配列番号９０）の順にポリペプチドをコードする遺伝子を連結させ、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）とＦｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）を順にＣ末端側に連結させたポリペプチドをコードする人工遺伝子をｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入した。
　ＨＬＡ－Ｅを導入したｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載の方法に従ってレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスを用いて、［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている方法で、実施例４で作製した膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞にレンチウイルスを感染させ、ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド及びＢ２Ｍ及びＨＬＡ－Ｅがリンカーで結合したＨＬＡ－Ｅ　ｔｒｉｍｅｒ（以下、「tＨＬＡ－Ｅ」という）と膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株を作製した。
　ＮＫ９２細胞は恒常的にＮＫＧ２Ａを発現しているため、実施例５で使用したＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＬ３－ＮＫ９２細胞株を用いて、［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］の項目に記載の方法で、tＨＬＡ－Ｅと膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株に対する各ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性を評価した。
　結果を図２４に示す。tＨＬＡ－Ｅと膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株は、tＨＬＡ－Ｅのみを発現するＫ５６２細胞株あるいは膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ｓｃＦｖ又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖのみを発現するＫ５６２細胞株と比較して、ＫＩＲ２ＤＬ２－ＮＫ９２細胞株及びＫＩＲ２ＤＬ３－ＮＫ９２細胞株に対してより強い殺細胞活性抑制作用を示した。
　以上の結果により、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３とＮＫＧ２Ａを共発現しているＮＫ細胞に対して、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーとＨＬＡ－Ｅの共発現は相加的な殺細胞活性抑制作用があることが示された。
実施例１３：Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現せずＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーを発現するｉＰＳ細胞について、ＮＫ細胞のｉＰＳ細胞に対する殺細胞活性の抑制評価
　Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞は、ＮＫ細胞からＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆであると認識され、攻撃の対象となる。Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現せずＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーを発現するｉＰＳ細胞について、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制するか評価するため、Ｂ２Ｍを遺伝子編集により欠損させることでＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失したｉＰＳ細胞にＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーを導入した。このｉＰＳ細胞とＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を共培養し、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞のｉＰＳ細胞に対する殺細胞活性を評価した。
　Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現せずＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーを発現するｉＰＳ細胞を作製するため、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いてＢ２Ｍを欠損させたｉＰＳ細胞（以下、「Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞」という）に膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを導入した。また、コントロールとして野生型ｉＰＳ細胞又はＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞にＮＧＦＲ―Ｌｕｃを導入した。膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖは実施例４で使用したプラスミドを用いて、ＮＧＦＲ－Ｌｕｃは実施例９使用したプラスミドを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法で、それぞれレンチウイルス濃縮液を作製した。
　ｍＴｅＳＲ　Ｐｌｕｓ　ｃＧＭＰ（ＶＥＲＩＴＡＳ社製、１００－０２７６）培地（以下、「ｍＴｅＳＲ培地」という）にｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（ｎｉｐｐｉ社製、８９２０２１）を添加し、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ社製、０３４－２４０２４）を添加した。上記培地にＡｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ）（フナコシ社製、ＡＴ１０４）を用いて剥離した各ｉＰＳ細胞を懸濁した。作製したレンチウイルス濃縮液及びｉＰＳ細胞懸濁液をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコートしたプレートに添加し、遠心機を用いて遠心した。翌日にｍＴｅＳＲ培地に置換し、培養後にＡＰＣラベル抗Ｆｌａｇ抗体及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いて陽性細胞のみを選別した。
　殺細胞活性評価に用いるｉＰＳ細胞について、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製、３００－０２）を含むｍＴｅＳＲ培地に試験３日前、２日前、１日前にそれぞれ全量交換した。
　［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の調製］の項目に記載の方法に従って作製されたＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞について、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存されているものを試験前々日に融解し、ＩＬ－２及びＩＬ－１８（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社製、９１２４－ＩＬ）を添加したＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地で培養した。試験前日にＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞の培地をＩＬ－２及びＩＬ－１８の含まれないＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地に置換し、培養した。
　ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞と、野生型ｉＰＳ細胞又はＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳを混合し、９６ウェルプレートにて培養を行った。培地としてＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地とＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２を添加したｍＴｅＳＲを用いて、各培地が等量となるよう細胞懸濁液を混合した。培養開始から２時間後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（ＴＭ）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて各ウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性からＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を引いた値を、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１００％として殺細胞活性を算出した。
　結果を図２５に示す。Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は野生型ｉＰＳ細胞と比較してＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制できていない。一方、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は野生型ｉＰＳ細胞と同等のＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性抑制効果を示した。
　以上の結果により、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞はＮＫ細胞からＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆであると認識され攻撃の対象となるが、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞にＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーを発現させることで、ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することが示された。また、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＫＩＲによるＮＫ細胞の抑制は、Ｋ５６２のような遺伝子編集を行わなくてもＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現していない細胞株だけでなく、遺伝子編集によりＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消滅させた細胞でも有効であることが、ｉＰＳ細胞を例に示された。
実施例１４：Ｘ線結晶構造解析によるＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＫＩＲ２ＤＬ２に対するエピトープ同定
　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＫＩＲ２ＤＬ２に対するエピトープを同定するため、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＦａｂフラグメントとＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＬ２の複合体を結晶化し、Ｘ線結晶構造解析を行った。
　ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＦａｂフラグメントとして表１５にアミノ酸配列が記載されているａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＦａｂフラグメントを用いた。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＬ２として、Ｎ末端側からＩＬ－２由来シグナルペプチド（配列番号９１）、ＫＩＲ２ＤＬ２（２２－２２５）（配列番号６の１～２０４アミノ酸）、Ｈｉｓタグ（配列番号９２）の順に連結させた組換えタンパク質を用いた。
　９ｍｇのＫＩＲ２ＤＬ２（２２－２２５）－Ｈｉｓに対して３４０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　Ｍｉｘ　ＩＩ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社製、Ｐ６０４４Ｓ）を添加し、４℃で終夜反応させた。反応液を５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　８）、５００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２０　ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５％（ｖ／ｖ）　ｇｌｙｃｅｒｏｌで平衡化させたＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　（Ｃｙｔｉｖａ社製、１７－５３１８－０３）に添加したのち、５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　８），　５００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２５０　ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，　５％（ｖ／ｖ）　ｇｌｙｃｅｒｏｌでカラムを洗浄した。次に５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　８），　５００　ｍＭ　ＮａＣｌ、５００　ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５％（ｖ／ｖ）　ｇｌｙｃｅｒｏｌで溶出した。回収した糖鎖除去ＫＩＲ２ＤＬ２（２２－２２５）－Ｈｉｓ画分はＰＢＳ（－）で平衡化させたＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ（Ｃｙｔｉｖａ社製、２８９８９３３６）を用いて精製した。
　モル比で１．２：１になるよう糖鎖除去ＫＩＲ２ＤＬ２（２２－２２５）－Ｈｉｓとａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＦａｂフラグメントを混合し、４℃で１時間インキュベートした。混合液を２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌで平衡化させたＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇ（Ｃｙｔｉｖａ）添加し、糖鎖除去ＫＩＲ２ＤＬ２（２２－２２５）－Ｈｉｓと６１＿３０９２＿０２＿Ｆ１０＿Ｆａｂの複合体を精製した。
　得られたａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＦａｂとＫＩＲ２ＤＬ２の複合体を１９ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化に用いた。結晶化には蒸気拡散法を用いた。タンパク質溶液０．１乃至０．２μＬに沈殿剤溶液（１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３，３５０（ハンプトンリサーチ社製、ＨＲ２－５２７）、０．２Ｍ　酢酸カルシウム（ハンプトンリサーチ社製、ＨＲ２－５６７）、０．１M　イミダゾール-塩酸　ｐＨ７．５（ナカライテスク社製、１９００４－３５）を等量加えた溶液を、０．０５ｍＬの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、２０℃で静置した。３日後に０．２ｍｍ×０．１ｍｍ×０．０５ｍｍの単結晶を得た。
　得られた結晶を３５％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール３，３５０を加えた沈殿剤溶液に浸し、続いて液体窒素中で凍結した。高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設のＢＬ－１７Ａにて９５Ｋ窒素気流下でＸ線回折データを収集した。得られた回折像からソフトウェアＸＤＳ（Ｗｏｌｆｇａｎｇ　Ｋａｂｓｃｈ作、Ｍａｘ　Ｐｌａｎｃｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は単斜晶系で空間群はＣ１２１、結晶の単位格子はａ＝１７０．１１Å、ｂ＝７９．２４Å、ｃ＝６４．３６Å、β＝９２．３９°であった。
　構造解析計算にはソフトウェアパッケージＰｈｅｎｉｘ（Ｐｙｔｈｏｎ－Ｂａｓｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｘｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）を使用した。ソフトウェアｐｈａｓｅｒを用い、得られた構造因子とＫＩＲ２ＤＬ２（ＰＤＢコード：２ＤＬ２）及びＦａｂ（ＰＤＢコード：１ＭＩＭより相似部分を抜粋）の三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。結晶は非対称単位に１複合体を含んでいた。
　ソフトウェアｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅを用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアｃｏｏｔを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、２．５Å分解能で最終のＲ値２３．４％、ｆｒｅｅ　Ｒ値２７．５％を得た。モデルは１複合体から成り、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＦａｂのＶＬ鎖アミノ酸残基１－２１０、Ｈ鎖アミノ酸残基１－２２４、ＫＩＲ２ＤＬ２のアミノ酸残基２５－２２１、Ｎ－アセチルグルコサミン２個、及び１４個の水分子を含む。ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＦａｂのＬ鎖のＣ末２残基、Ｈ鎖のＣ末６残基及びＳｅｒ１３７－Ｇｌｕ１４４の８残基、ＫＩＲ２ＤＬ２のＨｉｓタグを含むＣ末１０残基はそれぞれ電子密度が明瞭でなかったためモデル構築していない。
　図２６に複合体全体のリボンモデルを示す。決定されたａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　Ｆａｂから４Å以内にあるＫＩＲ２ＤＬ２のアミノ酸残基は以下の通りである：Ｇｌｕ４２、Ｈｉｓ６１、Ｌｙｓ６５、Ｐｈｅ６６、Ｌｙｓ６７、Ａｓｐ６８、Ｔｈｒ６９、Ｌｅｕ７０、Ｓｅｒ８６、Ｉｌｅ８７、Ｇｌｙ８８、Ｐｒｏ８９、Ｍｅｔ９１、Ｇｌｎ９２、Ａｓｐ９３、Ｌｅｕ９４、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ１１１。上記アミノ酸がａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＫＩＲ２ＤＬ２におけるエピトープであり、ＫＩＲ２ＤＬ２のアミノ酸配列上でハイライトし（枠で囲んである）、活性型ＫＩＲのアミノ酸配列と比較したものを図２７に示した。各ＫＩＲのアミノ酸配列は表５に記載のシグナルペプチド及び受容体配列を用いた。また、各ＫＩＲのアミノ酸番号は表４に記載のシグナルペプチド及び受容体配列を結合し、１から附番したものである。すなわち、上記ＫＩＲ２ＤＬ２のエピトープの各アミノ酸の番号は、配列番号６に記載のアミノ酸配列における対応するアミノ酸の番号に２１（シグナルペプチドのアミノ酸長）を足した番号に相当し、対応するＫＩＲ２ＤＳ１／２／４の各アミノ酸の番号も同様に、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１４のそれぞれに記載のアミノ酸配列の対応するアミノ酸の番号に２１を足した番号である。
　また、ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲ社製ソフトウェアＭａｅｓｔｒｏを用いて、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０の選択性に寄与しているアミノ酸残基について解析を行った。解析の結果、ＫＩＲ２ＤＬ２上のアミノ酸Ｇｌｙ８８に対応するアミノ酸はＫＩＲ２ＤＳ１においてアミノ酸Ｓｅｒ８８であるが、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＨ　ＣＤＲ３上のアミノ酸Ｇｌｙ１０４と立体障害が発生することから、アミノ酸Ｇｌｙ１０４はＫＩＲ２ＤＬ２とＫＩＲ２ＤＳ１の選択性に寄与していることが示唆された。また、ＫＩＲ２ＤＬ２上のアミノ酸Ｐｒｏ８９に対応するアミノ酸はＫＩＲ２ＤＳ１においてアミノ酸Ａｒｇ８９であるが、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＨ　ＣＤＲ３上のアミノ酸Ｔｙｒ１０６との水素結合が形成できないあるいは弱くなることから、アミノ酸Ｔｙｒ１０６はＫＩＲ２ＤＬ２とＫＩＲ２ＤＳ１の選択性に寄与していることが示唆された。
　また、ＫＩＲ２ＤＬ２上のアミノ酸Ｐｈｅ６６に対応するアミノ酸はＫＩＲ２ＤＳ２においてアミノ酸Ｔｙｒ６６であるが、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＨ　ＣＤＲ３上のアミノ酸Ｔｙｒ１０７と立体障害が発生することから、アミノ酸Ｔｙｒ１０７はＫＩＲ２ＤＬ２とＫＩＲ２ＤＳ２の選択性に寄与していることが示唆された。
　また、ＫＩＲ２ＤＬ２上のアミノ酸Ａｓｐ６８に対応するアミノ酸はＫＩＲ２ＤＳ４においてアミノ酸Ａｓｎ６８であるが、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＨ　ＣＤＲ３上のアミノ酸Ｔｙｒ１０７との水素結合が形成できないあるいは弱くなることから、アミノ酸Ｔｙｒ１０７はＫＩＲ２ＤＬ２とＫＩＲ２ＤＳ４の選択性に寄与していることが示唆された。
　また、上記構造解析により、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　のＶＬ鎖の９４番目のアミノ酸であるＴｈｒｅｏｎｉｎｅ（配列番号５２のアミノ酸番号９４：以下、「ＤＳ１０－ＶＬ－Ｔ９４」という）について、ＫＩＲ２ＤＬ２上のアミノ酸Ａｓｐ９３と水素結合を形成しているが、ＫＩＲ２ＤＳ４においてアミノ酸Ｖａｌ９３に置換されると、ＤＳ１０－ＶＬ－Ｔｈｒ９４主鎖ＮＨ基との水素結合が形成できないあるいは弱くなることから、ＤＳ１０－ＶＬ－Ｔｈｒ９４はａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のＫＩＲ２ＤＬ２とＫＩＲ２ＤＳ４の選択性に寄与していることが示唆された。このＤＳ１０－ＶＬ－Ｔ９４について、ＳＣＨＲＯＤＩＮＧＥＲ社製ソフトウェアＢＩＯＬＵＭＩＮＡＴＥを用いて解析を行った結果、当該アミノ酸を表１５に示すアミノ酸に置換した変異体ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０において，ＫＩＲ２ＤＬ２のＡｓｐ９３との主鎖ＮＨにおける水素結合形成が維持され、ＫＩＲ２ＤＳ４のＶａｌ９３との水素結合の非形成が維持される現象が観察された。
　これらのアミノ酸への置換体は抑制型ＫＩＲに結合し活性型ＫＩＲに結合しない特異性を維持すると予測される。
実施例１５：ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーについて、抗原の結合試験におけるａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と各ＫＩＲ２ＤＬ２／３特異的バインダーの競合によるエピトープ部位の評価
　各ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーについて、Ｆａｂフラグメントを作製した。膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株について、これらのＦａｂフラグメントとＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＫＩＲ２ＤＬ２を添加し、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株とＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＫＩＲ２ＤＬ２の結合が競合により阻害されるかを指標に、各バインダーのエピトープ部位を評価した。
　各ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＦａｂフラグメントについて、Ｎ末端側からＶＨ由来シグナルペプチド（配列番号９２）、表１５に記載のＶＨ鎖可変領域、ＦａｂフラグメントＶＨ鎖定常領域（配列番号９５）の順に連結させた組換えタンパク質、及びＮ末端側からＶＬ由来シグナルペプチド（配列番号９５）、表１６に記載のＶＬ鎖可変領域、ＦａｂフラグメントＶＬ鎖定常領域（配列番号９６）の順に連結させた組換えタンパク質を作製し、会合させてＦａｂフラグメントとした。各バインダーの可変領域のアミノ酸配列を表１５に示す。またＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＫＩＲ２ＤＬ２として、実施例４で使用したヒトＫＩＲ２ＤＬ２（２２―２４５）―Ｆｃ―Ａｖｉをビオチン化したもの（以下、「ヒトＫＩＲ２ＤＬ２（２２―２４５）―Ｆｃ―Ｂｉｏｔｉｎ」という）を用いた。また膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株について、実施例４で作製したものを用いた。
　Ｋ５６２細胞株又は膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株をａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、各バインダーのＦａｂフラグメントを最終濃度が１．５μＭ又は０．５μＭ又は０．１７μＭ又は０．０６μＭ又は０．０２μＭ又は０．０１μＭとなるように添加し、静置した。ヒトＫＩＲ２ＤＬ２（２２―２４５）―Ｆｃ―Ｂｉｏｔｉｎを最終濃度が０．０５μＭとなるように添加し静置した。
　反応後にａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄し、ＡＰＣラベル　抗ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ抗体を添加して静置した。反応後にａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて洗浄し、フローサイトメトリーを用いてヒトＫＩＲ２ＤＬ２（２２―２４５）―Ｆｃ―Ｂｉｏｔｉｎとの結合をＡＰＣ由来の蛍光強度のｍｅｄｉａｎの値で確認した。
　結果を図２８に示す。ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーのＦａｂフラグメントは、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ５，７を除いて、１．５μＭの濃度でＦａｂフラグメントを添加した際に、Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｋ５６２細胞と比較して、膜型ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株とヒトＫＩＲ２ＤＬ２（２２―２４５）―Ｆｃ―Ｂｉｏｔｉｎの結合を３０％以上阻害した。このことから、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と各ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーの多くはＫＩＲ２ＤＬ２に対して競合することが示された。
　以上の結果により、ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０と多くの各ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的バインダーが結合するエピトープは互いに近傍に位置していることが分かる。Ｘ線結晶構造解析により同定されたａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０のエピトープは、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に特異的かつアゴニスト活性を示す性質に重要であると言える。
実施例１６：Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇによるＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１特異的バインダーの取得
　上記の実施例似おいて、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３特異的アゴニスト活性を持つバインダーは、ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３を発現するＮＫ細胞がＭｉｓｓｉｎｇ－ｓｅｌｆであると認識した細胞に発揮する殺細胞活性を抑制することが示された。そこで、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１を発現するＮＫ細胞に対して同様の殺細胞活性抑制効果を得るため、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１に特異的に結合しアゴニスト活性を示す新規バインダーの取得を目的として、実施例４の［Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇによる抑制型ＫＩＲ特異的バインダーの取得］の項目に記載されている方法と同様に、Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇを実施した。
　Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇを実施するため、可溶型ＫＩＲとしてＮ末端側からＩＬ－２由来シグナルペプチド（配列番号９１）、表１７に記載の各ＫＩＲタンパク質細胞外ドメイン、ＧＧＧＳリンカー（配列番号９７）、ＩｇＧ　Ｆｃドメイン（配列番号９８）、ＧＡＡリンカー、Ａｖｉタグ（配列番号９９）を連結させた組換えタンパク質を作製した。各可溶型ＫＩＲに採用した各ＫＩＲの細胞外ドメインの配列を表１７に示す。また、可溶型ＫＩＲ３ＤＳ１としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＫＩＲ３ＤＳ１／ＣＤ１５８ｅ２　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、４１３６－ＫＲ－０５０）を用いた。Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇには、作製した各可溶型ＫＩＲにビオチン化処理を行ったもの、又は行わなかったものを用いた。
　Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇの各ラウンドにおいて、抑制型ＫＩＲに対するＰｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎと、活性型ＫＩＲに対するＤｅｐｌｅｔｉｏｎあるいはＤｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ又はその両方が行われた。２回のラウンド終了後、ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１のいずれかに特異的に結合するバインダーを発現するファージが濃縮されたポリクローナルなファージライブラリーを取得した。
　目的とするＫＩＲ（ＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１）の可溶型ＫＩＲを用いてＥＬＩＳＡを行い、ポリクローナルなファージライブラリーの中からＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１又はそれぞれに結合するｓｃＦｖ発現ファージを特定した。特定したｓｃＦｖ発現ファージのファージミドからバインダー配列を大腸菌用の組換えタンパク質発現ベクターに乗せ換え、大腸菌に導入して培養上清より各バインダーの組換えタンパク質を取得した。各バインダーについて、表１６に記載の各ＫＩＲに対応する可溶型ＫＩＲを用いてＥＬＩＳＡを実施し、各バインダーの各ＫＩＲに対する結合性の情報を取得した。
　これらの中からＫＩＲ２ＤＬ１又はＫＩＲ３ＤＬ１に結合性を示し、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４及びＫＩＲ３ＤＳ１に結合性を示さないバインダーの可変領域を［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている膜型ｓｃＦｖ発現フォーマットに導入し、ｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１Ａ（ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ社製）に導入した。
　ＫＩＲ２ＤＬ１特異的バインダーの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号は、下記表１８に示す。ＫＩＲ３ＤＬ１特異的バインダーの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号は、下記表１９に示す。
　Ｋ５６２細胞への遺伝子導入ついて、エレクトロポレーションを用いた。エレクトロポレーションの際は、各膜型ｓｃＦｖを導入したｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１ＡとｐＲＰ［Ｅｘｐ］－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＧ＞ｈｙＰＢａｓｅ（ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ社製、ｐＤＮＡ（ＶＢ０１００００－９３６５ｔａｘ）－Ｐ）をＫ５６２細胞株と懸濁した。エレクトロポレーション後のＫ５６２細胞はＲＰＭＩ培地で培養し、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓを用いて各膜型ｓｃＦｖ陽性細胞のみを選別した。
　必要に応じて、回収した細胞はＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＲＰＭＩ培地で培養後に使用した。
　これらの標的細胞に対して、Ｐｈａｇｅ　ｐａｎｎｉｎｇで使用した組換えＫＩＲタンパク質、又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＫＩＲ３ＤＳ１／ＣＤ１５８ｅ２　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　ＰｒｏｔｅｉｎをａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに０．１μＭとなるよう希釈して添加し、４℃で４５～９０分反応させた。膜型ａ３ＤＬ１－ＤＳ１　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞は実施例８で使用したものを用いた。
　反応後の標的細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、ＡＰＣラベル　抗ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ抗体もしくはＰＥラベル　抗ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社製、４０９３０４）を添加し、４℃で３０分反応させた。ａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、フローサイトメトリーを用いて結合性の有無を確認した。野生型Ｋ５６２細胞株に対する結合性（ＡＰＣ又はＰＥ由来の蛍光強度のｍｅｄｉａｎ）を１として、各バインダー膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株に対する各Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲタンパク質の結合性を算出した。
　結果を図２９に示す。新規ＫＩＲ２ＤＬ１特異的バインダー膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＳ１、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＳ２又はＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＳ４に対して低い結合を示し、ターゲットであるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ２ＤＬ１に対して特異的な結合を示した。また、新規ＫＩＲ３ＤＬ１特異的バインダー膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞は、ＫＩＲ３ＤＳ１に対して低い結合を示し、ターゲットであるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ３ＤＬ１に対して特異的な結合を示した。
実施例１７：ＫＩＲ２ＤＬ１特異的バインダーのアゴニスト活性評価
　実施例１６で特異性が確認されたＫＩＲ２ＤＬ１特異的バインダーに関して、各バインダー膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株と各ＫＩＲを発現するＮＫ９２細胞株を用いて、抑制型ＫＩＲ及び活性型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を評価した。
　ＫＩＲ２ＤＬ１特異的膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株は実施例１６で使用したものを用いた。各抑制型あるいは各活性型ＫＩＲを発現するＮＫ９２細胞株は［ＮＫ９２細胞へのＫＩＲ遺伝子導入及び調製］の項目に記載してある方法で作製したものを用いた。
　［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］の項目に記載の方法でＫＩＲ２ＤＬ１特異的膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株に対する各ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性評価を行った。
　結果を図３０に示す。全てのバインダーについて、ターゲットであるＫＩＲ２ＤＬ１を発現するＮＫ９２細胞株による殺細胞作用が低減され、ＫＩＲ２ＤＬ１に対してアゴニスト活性を示すことを確認した。一方、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２又はＫＩＲ２ＤＳ４を発現するＮＫ９２細胞株を活性化することは無かった。以上の結果により、求めるプロファイルである抑制型ＫＩＲ特異的に結合し、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を持つバインダーを取得したことが示された。
実施例１８：ＫＩＲ３ＤＬ１特異的バインダーのアゴニスト活性評価
　実施例１６で特異性が確認されたＫＩＲ３ＤＬ１バインダーに関して、各バインダー膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株と各ＫＩＲを発現するＮＫ９２細胞株を用いて、抑制型ＫＩＲ及び活性型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を評価した。
　ＫＩＲ３ＤＬ１特異的膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株は実施例１６で使用したものを用いた。ＫＩＲ３ＤＳ１以外の各抑制型ＫＩＲを発現するＮＫ９２細胞株は［ＮＫ９２細胞へのＫＩＲ遺伝子導入及び調製］の項目に記載してある方法で作製したものを用いた。膜型ａ３ＤＬ１－ＤＳ１　ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞は実施例８で使用したものを用いた。
　ＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＮＫ細胞について、ＮＫ９２細胞にレンチウイルスを用いて遺伝子導入を行ったがＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＮＫ９２細胞株を得ることができなかった。ＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＮＫ細胞を用いて殺細胞活性の評価を行うため、ＰＢＭＣからＮＫ細胞を培養し、セルソータ―を用いてＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＮＫ細胞の濃縮を行った。
　エフェクター細胞として、ＨＬＡ－Ｃ１／Ｃ１／Ｂｗ４陽性のＰＢＭＣ又はＨＬＡ－Ｃ２／Ｃ２／Ｂｗ４陽性を準備した（ＰＢＭＣ－Ｄ、ＰＢＭＣ－Ｅとする）。
　Ｆｅｅｄｅｒ細胞として、膜型ＩＬ－２１及びｔＨＬＡ－Ｅを発現するＫ５６２細胞（以下、「Ｆｅｅｄｅｒ　Ｋ５６２細胞」という）を用いた。膜型ＩＬ－２１について、Ｎ末端側からＩＬ－２由来シグナルペプチド（配列番号９１）、ＩＬ－２１フラグメント（配列番号１０５）、ＣＤ８由来ヒンジ領域（６２アミノ酸）配列（配列番号１０６）、ＣＤ８由来細胞膜ドメイン及び細胞内ドメイン（配列番号１０２）、ＩＲＥＳ配列、Ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＦＰ）（配列番号１０４）をコードする遺伝子をｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入した。［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法でレンチウイルス濃縮液を作製した。作製したレンチウイルスを用いて、［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ 導入及び調整］の項目に記載されている方法で実施例１２で使用したｔＨＬＡ－Ｅを発現するＫ５６２細胞に対してウイルスベクターを感染させ、ＢＦＰが発現しているクローンを選抜し、膜型ＩＬ－２１及びｔＨＬＡ－Ｅを発現するＦｅｅｄｅｒ　Ｋ５６２細胞株を作製した。
　Ｆｅｅｄｅｒ　Ｋ５６２細胞について、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製、２０８９８－２１）を１０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＲＰＭＩ培地で懸濁し、３時間インキュベートした。ＲＰＭＩ培地でＦｅｅｄｅｒ　Ｋ５６２細胞を洗浄した後、ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地で懸濁し、ＩＬ－２を２００Ｕ／ｍＬとなるように添加したＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地で懸濁したＰＢＭＣ－Ｄ又はＰＢＭＣ－Ｅと混合培養した。７～１０日後に細胞を回収して、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、１３０－１０７－２０６）を用いて表２０の各抗体が１～１０μｇ／ｍＬとなるよう懸濁後、細胞に添加して４℃で３０分反応させた。
　抗体染色済み細胞はＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下となるよう再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（１３０－１０６－０８８）に充填してＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（１３０－１０３－９３１）を用いてＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＮＫ細胞のソーティングを行った。ＣＤ３陰性ＣＤ５６陽性であるＮＫ細胞の中から、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体陰性抗ＫＩＲ３ＤＬ１／３ＤＳ１抗体陽性細胞画分をＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＮＫ細胞としてソーティングを行った。また、抗ＫＩＲ３ＤＬ１／３ＤＳ１抗体陰性細胞画分をコントロールＮＫ細胞としてソーティングを行った。その後、ＩＬ－２及びＩＬ－１８をそれぞれ１０００Ｕ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加したＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地で培養を継続した。
　［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］の項目に記載の方法でＫＩＲ３ＤＬ１特異的膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株に対する各ＮＫ９２細胞株又はＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性評価を行った。Ｋ５６２細胞株とＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞について、Ｋ５６２細胞株とＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞のそれぞれの細胞数の比が１：３となるように混合した。
　結果を図３１に示す。全てのバインダーについて、ターゲットであるＫＩＲ３ＤＬ１を発現するＮＫ９２細胞株による殺細胞作用が低減され、ＫＩＲ３ＤＬ１に対してアゴニスト活性を示すことを確認した。一方、ＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を活性化することは無かった。一部ＫＩＲ３ＤＬ１特異的膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株において、ＫＩＲ３ＤＳ１を発現するＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞による殺細胞活性がコントロールＫ５６２細胞株と比較して高い数値となっているが、実施例１６において同ＫＩＲ３ＤＬ１特異的膜型ｓｃＦｖを発現するＫ５６２細胞株がＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＫＩＲ３ＤＳ１に対して結合していないことから、この殺細胞活性上昇は実験誤差の範囲と考えられる。以上の結果により、求めるプロファイルである抑制型ＫＩＲ特異的に結合し、抑制型ＫＩＲに対するアゴニスト活性を持つバインダーを取得したことが示された。
実施例１９：ＮＫＧ２Ａ陽性ＮＫ細胞株によるＫ５６２に対する殺細胞活性はユニバーサル技術及び抗ＮＫＧ２Ａ抗体由来ｓｃＦｖ発現により抑制される
　膜型ｓｃＦｖとして細胞表面に発現させた抗ＮＫＧ２Ａ抗体が、実施例１２で確認されたｔＨＬＡ－Ｅと同様にＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を示すかを評価した。
　特許文献ＵＳ　２０１５／Ｏ１２５４６４　Ａ１、ＷＯ２０１６／０４１９４７Ａ１、ＵＳ　２０２０／０１９９２２６　Ａ１に記載された抗ＮＫＧ２Ａ抗体の遺伝子配列から可変領域を［Ｋ５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている膜型ｓｃＦｖ発現フォーマットに導入し、ｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αに挿入した。各膜型ｓｃＦｖを導入したｐＬＶＳＩＮ　ＥＦ１αを用いて［レンチウイルスの調製］の項目に記載されている方法でレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスを用いて［Ｋ―５６２細胞へのｓｃＦｖ遺伝子導入及び調製］の項目に記載されている方法で各ｓｃＦｖを膜型ｓｃＦｖとして発現するＫ５６２細胞株を作製した（各可変領域の配列番号は表２１参照）。
　実施例５で使用されたＮＫ９２細胞株を用いて［ＫＩＲ２ＤＬ２発現ＮＫ９２によるＬｉｒｉｌｕｍａｂ－ｓｃＦｖ／　Ｐａｎ２Ｄ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２に対する殺細胞活性評価］の項目に記載の方法で、Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株、実施例１２で使用したｔＨＬＡ－Ｅ－Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞株、又は膜型aＮＫＧ２Ａ－ｓｃＦｖ－Ｋ５６２細胞株に対する殺細胞活性を評価した。
　［フローサイトメトリー、及び添加用抗体］の項目に記載された方法に従い、ＰＥラベル抗ＮＫＧ２Ｃ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－１１９－７７６）及びＰＣ７ラベル抗ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、１３０－１１９－７７６）を使用してＮＫ－９２細胞株の細胞表面タンパク質の発現を確認した。
　結果を図４８、４９に示す。図４８の結果からＮＫ９２細胞株は、Ｋ５６２細胞株に対して殺細胞活性を示したが、ｔＨＬＡ－Ｅ－Ｋ５６２細胞株に対しては殺細胞活性が減弱された。また、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ｓｃＦｖを発現させたＫ５６２細胞株のうち、膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１－Ｋ５６２細胞株及び膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２－Ｋ５６２細胞株に対して、ＮＫ９２細胞株の殺細胞活性が減弱された。図４９の結果から、ＮＫ９２細胞株はＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性であることが確認された。これらの結果から、ｔＨＬＡ－Ｅを認識したＮＫＧ２Ａが抑制型シグナルをＮＫ９２細胞株に入れることで殺細胞活性を抑制したと考えられる。また、膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１及び膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２はｔＨＬＡ－Ｅと同様にＮＫＧ２Ａから認識され抑制型シグナルがＮＫ９２細胞株に入ることで殺細胞活性を抑制したと考えられる。
　以上から、抗ＮＫＧ２Ａ抗体の遺伝子配列から作製したａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１及びａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２を膜型－ｓｃＦｖとして細胞膜に発現した場合、ＨＬＡ－Ｅ同様にＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を有することを示した。
実施例２０：ｔＨＬＡ－Ｅもしくは膜型ａＮＫＧ２Ａ　ｓｃＦｖのＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体及びＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４複合体に対する結合性評価
　実施例１９にてアゴニスト活性を確認したｔＨＬＡ－Ｅ、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１及び膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２に関して、ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４複合体及びＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４複合体に対する結合性評価を行った。
　２．５ｘ１０４個のＬｕｃ－Ｋ５６２細胞、ｔＨＬＡ－Ｅを発現するＫ５６２細胞、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現するＫ５６２細胞又は膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２を発現するＫ５６２細胞に対して、０．５μＭに調整したＨｉｓタグが付加されたＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４組換えタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＣ４－Ｈ８２Ｅ４－２５ｕｇ）もしくはＨｉｓタグが付加されたＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４組換えタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＮＣ４－Ｈ８２Ｅ３－２５ｕｇ）溶液をそれぞれ独立に添加し、４℃４５分で反応させた。
　反応後の標的細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、ＡＰＣラベル抗Ｈｉs　ｔａｇ抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社製、３６２６０５）を添加し、４℃３０分にて反応させた。反応後の標的細胞をａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒにより２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いてＨｉｓタグが付加されたＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４組換えタンパク質及びＨｉｓタグが付加されたＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４組換えタンパク質に対する標的細胞の結合性の有無を確認した。各標的細胞の組み換えタンパク質に対する結合を、Ｌｕｃ－Ｋ５６２細胞に対する組み換えタンパク質の結合（ＡＰＣ由来の蛍光強度のｍｅｄｉａｎ値）を１として算出した。
　結果を図５１に示す。ｔＨＬＡ－ＥがＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４の両方に対して結合性を示すことを確認した。一方、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１はＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４に結合性を示すが、ＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４には結合性を示さないことを確認した。また膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２は、ｔＨＬＡ－Ｅ同様に、ＮＫＧ２Ａ－ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ－ＣＤ９４の両方に対して結合性を示すことを確認した。
　以上から、ＨＬＡ－Ｅと異なり、膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１はＮＫＧ２Ａに対して特異的に結合性を示した。
実施例２１：ｔＨＬＡ－Ｅもしくは膜型ａＮＫＧ２Ａ　ｓｃＦｖを発現させたＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞に対するＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性の抑制評価
　Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消失し、ｔＨＬＡ－Ｅもしくは膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現させたｉＰＳ細胞に対するＰＢＭＣ由来ＮＫＧ２Ａ陽性もしくはＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞の殺細胞活性を評価した。
　ｉＰＳ細胞として、Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌｓ　（ＰＣｈｉＰＳ７７１）（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社製、ＲＣＲＰ００１Ｎ、Ｌｏｔ　Ｎｏ．Ａ０１ＱＮ２１）を使用し、ｍＴｅＳＲ培地を用いて培養した。
　Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消失させたｉＰＳ細胞を作製するため、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いてＢ２Ｍ遺伝子を欠損させたｉＰＳ細胞（以下、「Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞」という）を作製した。ゲノム上のＢ２Ｍ遺伝子のエキソンが分断される位置に対し、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９によりＮ末端側からＴｒｕｎｃａｔｅｄ　ＣＤ１９（配列番号５３）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、及び、ＥＧＦＰ（配列番号１７１）の順に配置されたポリペプチドをコードする人工遺伝子が挿入されるプラスミドを作製した。
［エレクトロポレーションによるｉＰＳ細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の導入及び調製］
　Ｐ３　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｘ　Ｋｉｔ　Ｓ（ＬＯＮＺＡ社製、Ｖ４ＸＰ－３０３２）をもちいて、ｉＰＳ細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／２０μＬになるように懸濁し、前段落に記載のポリペプチドをコードする人工遺伝子が挿入されたプラスミドと、ＣｌｅａｎＣａｐ　Ｃａｓ９　ｍＲＮＡ　（ｍｏｄ）（Ｔｒｉｌｉｎｋ社製、Ｌ－７２０６）のｍＲＮＡを各２００ｎｇ添加した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＬＯＮＺＡ社製、ＡＡＦ－１００３Ｂ、ＡＡＦ－１００３Ｘ）を用いて、プログラムＣＡ－１３７でエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、ｍＴｅＳＲ培地にｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（ｎｉｐｐｉ社製、８９２０２１）を添加し、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ社製、０３４－２４０２４）培養した。
　翌日以降、ｍＴｅＳＲ培地を用いて毎日培地を交換し、培養４－７日後に抗ＣＤ１９　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０５０－３０１）を用いて陽性細胞のみを選別した。蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰ高発現のコロニーを同定して単離し、回収した細胞の一部からＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製、ＱＥ０９０５０）を用いてゲノムを抽出した。抽出したゲノムを鋳型にＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ（Ｔａｋａｒａ　ｂｉｏ社製、Ｒ０５０Ｂ）とプライマーＡ（配列番号１７２）及びプライマーＢ（配列番号１７３）を用いてＰＣＲを行い、電気泳動により両アレルのゲノム上に人工遺伝子が挿入されていることを確認し、Ｂ２Ｍ遺伝子がＫＯされたｉＰＳ細胞が作製されたことを確認した。
　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現する野生型ｉＰＳ細胞、及びＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製するため、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９を用いてＡＣＴＢ遺伝子の下流にＬｕｃｉｆｅｒａｓｅをコードするポリペプチドを挿入した。Ｎ末端側から自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、Ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（配列番号１７）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１７４）、自己開裂ペプチドＴ２Ａ（配列番号２０）、及び、Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＣＤ８（配列番号１７５）の順に配置されたポリペプチドをコードする人工遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９によりゲノム上のＡＣＴＢ遺伝子のＣ末端にコドンの読み取り枠が接続されるように挿入し、ＡＣＴＢ遺伝子の下流で挿入した人工遺伝子を発現するｉＰＳ細胞を作製した。
　ｉＰＳ細胞及びＢ２ＭがＫＯされたｉＰＳ細胞に対して、［エレクトロポレーションによるｉＰＳ細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集の導入及び調製］に記載の方法を用いて、前段落に記載のポリペプチドをコードする人工遺伝子をＡＣＴＢ下流に導入した。翌日以降、ｍＴｅＳＲ培地を用いて毎日培地を交換し、培養４－７日後に抗ＣＤ８　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０４５－２０１）を用いて陽性細胞のみを選別した。蛍光顕微鏡を用いてｍＣｈｅｒｒｙ高発現のコロニーを同定して単離し、回収した細胞の一部からＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製、ＱＥ０９０５０）を用いてゲノムを抽出した。抽出したゲノムを鋳型にＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ（Ｔａｋａｒａ　ｂｉｏ社製、Ｒ０５０Ｂ）とプライマーＣ（配列番号１７６）及びプライマーＤ（配列番号１７７）を用いてＰＣＲを行い、電気泳動により片アレルのゲノム上に人工遺伝子が挿入されていることを確認した。以後、ここで得られたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するｉＰＳ細胞を、野生型ｉＰＳ細胞又はＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と呼称する。
　必要に応じて、回収した細胞はＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（ＺＥＮＯＧＥＮ　ＰＨＡＲＭＡ社製、１１９２４）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にｍＴｅＳＲ培地で培養後に使用した。
　レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、Ｔ１００Ｂ）を２０～１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を用いて希釈し、Ｎｏｎ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｄｉｓｈに添加した。室温で２時間又は４℃で終夜静置後、ＰＢＳ洗浄して、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅを調製した。
　ｔＨＬＡ－Ｅを発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製するために、実施例１２で使用したｔＨＬＡ－Ｅ遺伝子をコードしたレンチウイルス濃縮液を用いて、遺伝子導入を行った。ｍＴｅＳＲ培地を用いて１～２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を懸濁し、ｔＨＬＡ－Ｅ遺伝子がコードされたレンチウイルス濃縮液、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（ｎｉｐｐｉ社製、８９２０２１）、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ社製、０３４－２４０２４）及び細胞をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ　ｃｏａｔｅｄ　ｐｌａｔｅにて混合して１０００×ｇで１時間遠心した。遺伝子導入の翌日以降、ｍＴｅＳＲ培地を用いて毎日培地を交換し、培養１週間後にＡＰＣラベル抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、３４２６０６）、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９０－８５５）を用いてＡＰＣ陽性細胞のみを選別した。
　必要に応じて、回収した細胞はＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（ＺＥＮＯＧＥＮ　ＰＨＡＲＭＡ社製、１１９２４）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にｍＴｅＳＲ培地で培養後に使用した。
［Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞へのエレクトロポレーション用プラスミドベクター］
　Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞への膜型ｓｃＦｖの遺伝子導入にはエレクトロポレーションを用いた。ｐＰＢ［Ｅｘｐ］－ＥＦ１Ａ＞ＥＧＦＰ／Ｎｅｏ（ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ社製、ＶＢ０１００００－９４９１ｄｋｆ）に含まれる緑色蛍光タンパク質をコードする核酸配列を欠損させたｐＰＢ［Ｅｘｐ］－ＥＦ１Ａベクターを用いた。膜型ｓｃＦｖ発現フォーマットをコードした遺伝子はｐＰＢ［Ｅｘｐ］－ＥＦ１Ａのマルチクローニングサイトに導入し、エレクトロポレーション用プラスミドベクターを調製した。
［エレクトロポレーションによるＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞への膜型ｓｃＦｖ発現フォーマット遺伝子の導入及び調製］
　Ｐ３　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｘ　Ｋｉｔ　Ｓ（ＬＯＮＺＡ社製、Ｖ４ＸＰ－３０３２）をもちいて、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／２０μＬになるように懸濁し、膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１あるいは膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２をコードした遺伝子配列を導入したｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１Ａと、ｐＲＰ［Ｅｘｐ］－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＧ＞ｈｙＰＢａｓｅ（ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ社製、ｐＤＮＡ（ＶＢ０１００００－９３６５ｔａｘ）－Ｐ）のプラスミドベクターを各２００ｎｇ添加した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＬＯＮＺＡ社製、ＡＡＦ－１００３Ｂ、ＡＡＦ－１００３Ｘ）を用いて、プログラムＣＡ－１３７でエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、ｍＴｅＳＲ培地にｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（ｎｉｐｐｉ社製、８９２０２１）を添加し、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ社製、０３４－２４０２４）培養した。翌日以降、ｍＴｅＳＲ培地を用いて毎日培地を交換し、培養１週間後にＡＰＣラベル抗ＦＬＡＧ、及び抗ＡＰＣ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９０－８５５）を用いて陽性細胞のみを選別した。
　必要に応じて、回収した細胞はＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（ＺＥＮＯＧＥＮ　ＰＨＡＲＭＡ社製、１１９２４）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にｍＴｅＳＲ培地で培養後に使用した。
　実施例６で使用したＰＢＭＣ－Ａに加え、３種類のＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社製、ＣＴＬ－ＵＰ１）について、それぞれＰＢＭＣ－Ｄ、ＰＢＭＣ－Ｅ、ＰＢＭＣ－Ｆとして、各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を単離しエフェクター細胞として使用した。
　ＰＢＭＣ－Ａ、ＰＢＭＣ－Ｄ、ＰＢＭＣ－Ｅ、ＰＢＭＣ－Ｆについて、実施例６の［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の調製］に記載された方法を用いて、各ＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を精製した。その後、ＮＫ培地で培養を継続し、精製８～１０日後に、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、－８０℃又は－１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＮＫ培地で培養後に使用した。
　殺細胞活性評価に用いるｉＰＳ細胞について、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製、３００－０２）を含むｍＴｅＳＲ培地に試験３日前、２日前、１日前にそれぞれ全量交換した。
　-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存されているＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｄ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｅ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞を試験前日に融解し、ＮＫ培地で培養した。
　［フローサイトメトリー、及び添加用抗体］の項目に記載された方法に従い、ＢＶ４２１ラベル抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、３００４３４）ＢＶ５１０ラベル抗ＣＤ５６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、３６２５３４）、ＰＥラベル抗ＮＫＧ２Ｃ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－１１９－７７６）及びＰＣ７ラベル抗ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、１３０－１１９－７７６）を使用して殺細胞活性試験当日に使用する各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面タンパク質の発現を確認した。
　各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を９６ウェルプレートに添加し、本実施例にて作製したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現する野生型ｉＰＳ細胞、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、ｔＨＬＡ－Ｅを発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、又は膜型aＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳを細胞の比が１：１となるようにそれぞれ独立したウェルに添加して培養した。培地としてＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地とＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２を２０μＭとなるよう添加したｍＴｅＳＲを用いて、各培地が等量となるよう細胞懸濁液を混合した。培養開始から２時間後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（ＴＭ）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製、Ｅ６１２０）を用いて各ウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞について、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性からＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を引いた値を、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１００％として殺細胞活性を算出した。
　結果を図５２―１、５２―２に示す。図５２―１の結果から、ＰＢＭＣ－Ｄ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｅ由来ＮＫ細胞では、ＮＫ細胞群の大部分のＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性であり、ＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性のＮＫ細胞は極めて少なかった。一方、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞ではＮＫ細胞群の大部分のＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性であり、ＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性のＮＫ細胞は極めて少なかった。図５２―２の結果から、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は野生型ｉＰＳ細胞と比較してＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化した。また、ｔＨＬＡ―Ｅを発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ｄ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｅ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制したが、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化した。膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ｄ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｅ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性は活性化しなかった。膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ｄ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｅ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性をわずかに活性化した。
　以上の結果により、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞にｔＨＬＡ－Ｅを発現させるとＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することができるが、ＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化する。このことからｔＨＬＡ－ＥはＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃ両方に対してアゴニスト活性をもつことが示された。また膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２は、ｔＨＬＡ－Ｅ同様にＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することができるが、ＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化することから、ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｃ両方に対してアゴニスト活性をもつことが示された。一方、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１はＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、ＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化しないことが示された。このことから、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１はＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストであることが示された。また、膜型ＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストのＮＫＧ２Ａを介したＮＫ細胞の殺細胞活性の抑制は、Ｋ５６２のような遺伝子編集を行わなくてもＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現していない細胞株だけでなく、遺伝子編集によりＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現を消滅させた細胞でも有効であることが、ｉＰＳ細胞を例に示された。
実施例２２：ｔＨＬＡ－Ｅあるいは膜型ＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストと膜型抑制型ＫＩＲ特異的アゴニストを共発現させたＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞に対するＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性の抑制評価
　実施例２１で示されたように、膜型ＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストはＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞を活性化することはないが、抑制することもできない。一方、ＮＫ細胞においてＮＫＧ２Ｃの発現はＫＩＲの発現と正の相関があるとされており、膜型ＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストと膜型抑制型ＫＩＲ特異的アゴニストを共発現することでＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性ＮＫ細胞に加え、ＮＫＧ２Ａ陰性、ＮＫＧ２Ｃ陽性かつ抑制型ＫＩＲ陽性ＮＫ細胞の攻撃も回避できると考え評価した。
　膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製するために、実施例２１に記載された［Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞へのエレクトロポレーション用プラスミドベクター］の方法を用いて膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０をコードしたｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１Ａを作製し、実施例２１に記載された［エレクトロポレーションによるＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞への膜型ｓｃＦｖ発現フォーマット遺伝子の導入及び調製］の方法をもちいて膜型ａＫＩＲ２ＤＬ／３－ＤＳ１０を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製した。
　ｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製するために、［Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞へのエレクトロポレーション用プラスミドベクター］の方法を用いてｔＨＬＡ－ＥをコードしたｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１Ａを作製し、前項にて作成した膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞に対し、［エレクトロポレーションによるＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞への膜型ｓｃＦｖ発現フォーマット遺伝子の導入及び調製］の方法を用いてｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製した。
　膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１と膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製するために、膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０の遺伝子配列のＦｌａｇタグ配列（配列番号２）をＨＡタグ配列（配列番号１７８）に置き換えた人工遺伝子をｐＰＢ［Ｅｘｐ］－ＥＦ１Ａベクターへ挿入した。
　膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１と膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を作製するために、Ｐ３　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｘ　Ｋｉｔ　Ｓ（ＬＯＮＺＡ社製、Ｖ４ＸＰ－３０３２）をもちいて、実施例２１で作製したＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／２０μＬになるように懸濁し、ＨＡタグに置き換えた膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を導入したｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１Ａと膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を導入したｐＰＢ［Ｅｘｐ］―ＥＦ１Ａのプラスミドベクターを各１００ｎｇ、ｐＲＰ［Ｅｘｐ］－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＧ＞ｈｙＰＢａｓｅのプラスミドベクターを２００ｎｇ添加した。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＬＯＮＺＡ社製、ＡＡＦ－１００３Ｂ、ＡＡＦ－１００３Ｘ）を用いて、プログラムＣＡ－１３７でエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、ｍＴｅＳＲ培地にｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ（ｎｉｐｐｉ社製、８９２０２１）を添加し、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２（ＷＡＫＯ社製、０３４－２４０２４）培養した。翌日以降、ｍＴｅＳＲ培地を用いて毎日培地を交換した。
　ｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞及び膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１と膜型ａＫＩＲＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞について、遺伝子導入後にそれぞれＰＥラベル抗ＦＬＡＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、６３７３１０）、ＡＰＣラベル抗ＨＬＡ－Ｅ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、３４２６０６）、もしくはＰＥラベル抗ＦＬＡＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、６３７３１０）、ＡＰＣラベル抗ＨＡタグ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、９０１５２４）が各１～１０μｇ／ｍＬとなるようＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２を１０μＭになるように添加したａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒに懸濁後、細胞に添加して４℃で３０分反応させた。
　抗体染色済み細胞はＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２を添加したａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　－　ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、５０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下となるようＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２を１０μＭになるように添加したＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｒｕｎｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、１３０－１０７－２０６）に再懸濁し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（１３０－１０６－０８８）に充填した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ　Ｔｙｔｏ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（１３０－１０３－９３１）を用いて細胞のソーティングを行った。ｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＫＩＲＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞及び膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１－ｓｃＦｖと膜型ａＫＩＲＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞株について、ＰＥ及びＡＰＣ由来の蛍光が共陽性（二重陽性）の細胞画分をそれぞれソーティングした。ソーティングした細胞はｍＴｅＳＲ培地で培養を継続した。
　必要に応じて、回収した細胞はＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（ＺＥＮＯＧＥＮ　ＰＨＡＲＭＡ社製、１１９２４）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にｍＴｅＳＲ培地で培養後に使用した。
　実施例２１で使用したＰＢＭＣ－Ａ、ＰＢＭＣ－Ｆに加え、３種類のＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社製、ＣＴＬ－ＵＰ１）についてそれぞれＰＢＭＣ－Ｇ、ＰＢＭＣ－Ｈ、ＰＢＭＣ－Ｉとして、各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を単離しエフェクター細胞として使用した。
　ＰＢＭＣ－Ａ、ＰＢＭＣ－Ｆ、ＰＢＭＣ－Ｇ、ＰＢＭＣ－Ｈ、ＰＢＭＣ－Ｉについて、実施例６の［ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の調製］に記載した方法で各ＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を精製した。その後、ＮＫ培地で培養を継続し、精製８～１０日後に、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ１（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製、ＣＢ０１１）に０．５～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して、-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存した。凍結細胞を実験に使用する場合は、融解後にＮＫ培地で培養後に使用した。
　殺細胞活性評価に用いるｉＰＳ細胞について、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製、３００－０２）を含むｍＴｅＳＲ培地に試験３日前、２日前、１日前にそれぞれ全量交換した。
　-８０℃又は-１５０℃にて凍結保存されているＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｇ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｈ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｉ由来ＮＫ細胞を試験前日に融解し、ＮＫ培地で培養した。
　［フローサイトメトリー、及び添加用抗体］の項目に記載された方法に従い、ＢＶ４２１ラベル抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、３００４３４）ＢＶ５１０ラベル抗ＣＤ５６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製、３６２５３４）、ＰＥラベル抗ＮＫＧ２Ｃ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－１１９－７７６）及びＰＣ７ラベル抗ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、１３０－１１９－７７６）、ＡＰＣラベル抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３／２ＤＳ２抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０－０９２－６１７）を使用して殺細胞活性試験当日に使用する各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面タンパク質の発現を確認した。
　各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞を９６ウェルプレートに添加し、野生型ｉＰＳ細胞、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、ｔＨＬＡ－Ｅを発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞、ｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞又は膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１と膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞を細胞の比が１：１となるようにそれぞれ独立したウェルに添加して培養した。培地としてＭｙｅｌｏＣｕｌｔ　Ｈ５１００培地とＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅＲ　Ｙ－２７６３２を２０μＭとなるよう添加したｍＴｅＳＲを用いて、各培地が等量となるよう細胞懸濁液を混合した。培養開始から２時間後に、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（ＴＭ）　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて各ウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞について、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性からＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を引いた値を、ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞非添加ウェルにおけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１００％として殺細胞活性を算出した。
　結果を図５３―１、図５３―２及び図５３－３に示す。図５３―１及び図５３－２の各ＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の細胞表面タンパク質の発現を確認するフローサイトメトリー法の結果から、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞ではＮＫ細胞群の大部分のＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性であり、ＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性のＮＫ細胞は極めて少なかった。また、ＮＫ細胞群の大部分においてＮＫＧ２Ｃ陽性かつ抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３陽性だった。また、ＰＢＭＣ－Ｇ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｈ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｉ由来ＮＫ細胞では、ＮＫ細胞群の大部分のＮＫ細胞がＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性であり、ＮＫＧ２Ａ陰性かつＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞は極めて少なかった。また抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３陽性ＮＫ細胞は少数だった。図５３－３より、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は野生型ｉＰＳ細胞と比較してＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化した。また、膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制したが、ＰＢＭＣ－Ｇ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｈ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｉ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性の抑制は限定的であった。ｔＨＬＡ―Ｅを発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ｇ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｈ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｉ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制したが、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化した。膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ｇ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｈ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｉ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性は活性化しなかった。ｔＨＬＡ－Ｅと膜型ａＫＩＲＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、ＰＢＭＣ－Ｇ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｈ由来ＮＫ細胞、ＰＢＭＣ－Ｉ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制したが、ＰＢＭＣ－Ａ由来ＮＫ細胞及びＰＢＭＣ－Ｆ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を活性化した。膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１と膜型ａＫＩＲＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較して、評価したすべてのＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制した。また、膜型ａＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞もしくは膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１を発現するＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞と比較しても、膜型ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１と膜型ａＫＩＲＫＩＲ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０を共発現させたＢ２Ｍ　ＫＯ　ｉＰＳ細胞は、すべてのＰＢＭＣ由来ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制した。
　以上の結果により、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞に、ｔＨＬＡ－Ｅと抑制型ＫＩＲ特異的アゴニストを共発現させるとＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制する一方、ＮＫＧ２Ｃ陽性ＮＫ細胞では抑制型ＫＩＲ陽性であってもｔＨＬＡ－ＥのＮＫＧ２Ｃに対するアゴニスト活性により殺細胞活性が活性化されることが示された。これはｔＨＬＡ－Ｅと抑制型ＫＩＲ特異的アゴニストの併用ではＮＫＧ２Ｃ陽性かつＫＩＲ陽性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制することはできず、むしろ活性化するということを示している。一方、Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡを発現しないｉＰＳ細胞にＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストと抑制型ＫＩＲ特異的アゴニストを共発現すると、ＮＫＧ２Ａ陽性かつＮＫＧ２Ｃ陰性ＮＫ細胞の殺細胞活性を抑制し、さらにＮＫＧ２Ｃ陽性、抑制型ＫＩＲ陽性かつＮＫＧ２Ａ陰性のＮＫ細胞の殺細胞活性も抑制できることが示された。これはＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストがＮＫＧ２Ｃを活性化しないことに起因すると考えられ、ｔＨＬＡ－Ｅと抑制型ＫＩＲアゴニストを併用した免疫回避技術よりも、ＮＫＧ２Ａ特異的アゴニストと抑制型ＫＩＲ特異的アゴニストを併用した免疫回避技術のほうが多くのＮＫ細胞群に対し免疫排除を低減できることが示された。
　本発明のＮＫＧ２Ａに特異的に結合しＮＫ殺細胞の細胞活性を抑制する活性を有する物質を移植時の免疫拒絶リスクを低減する組成物として利用することができる。
　本発明の抑制型ＫＩＲ２ＤＬ２及び／又はＫＩＲ２ＤＬ３に結合しＮＫ殺細胞の細胞活性を抑制する活性を有する物質を移植時の免疫拒絶リスクを低減する組成物として利用することができる。
配列番号１：ＫＩＲ２ＤＬ１シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号２：Ｆｌａｇタグ　アミノ酸配列
配列番号３：ＧＳＧＳリンカー　アミノ酸配列
配列番号４：ＫＩＲ２ＤＬ１＊００３　アミノ酸配列
配列番号５：ＫＩＲ２ＤＬ２シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号６：ＫＩＲ２ＤＬ２＊００１アミノ酸配列
配列番号７：ＫＩＲ２ＤＬ３シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号８：ＫＩＲ２ＤＬ３＊００１　アミノ酸配列
配列番号９：ＫＩＲ２ＤＳ１シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号１０：ＫＩＲ２ＤＳ１＊００２　アミノ酸配列
配列番号１１：ＫＩＲ２ＤＳ２シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号１２：ＫＩＲ２ＤＳ２＊００１　アミノ酸配列
配列番号１３：ＫＩＲ２ＤＳ４シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号１４：ＫＩＲ２ＤＳ４＊００１　アミノ酸配列
配列番号１５：ＫＩＲ３ＤＬ１シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号１６：ＫＩＲ３ＤＬ１＊０１５　アミノ酸配列
配列番号１７：ホタルルシフェラーゼ　アミノ酸配列
配列番号１８：Ｂ２Ｍシグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号１９：Ｂ２Ｍ　アミノ酸配列
配列番号２０：Ｔ２Ａ　アミノ酸配列
配列番号２１：ＨＬＡ－Ｃｗ３シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号２２：ＨＬＡ－Ｃｗ３　アミノ酸配列
配列番号２３：ＣＤ８由来シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号２４：ＣＤ８由来ヒンジ　アミノ酸配列（６６アミノ酸）
配列番号２５：Ｇ４Ｓリンカー　アミノ酸配列
配列番号２６：ＣＤ８由来ヒンジ　アミノ酸配列（４５アミノ酸）
配列番号２７：ＣＤ８由来細胞膜ドメイン　アミノ酸配列
配列番号２８：ＣＤ８由来細胞内ドメイン　アミノ酸配列
配列番号２９：Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ　（１－７Ｆ９）　ＶＨアミノ酸配列
配列番号３０：Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ　（１－７Ｆ９）　ＶＬアミノ酸配列
配列番号３１：Ｐａｎ２Ｄ　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号３２：Ｐａｎ２Ｄ　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３３：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号３４：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３５：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号３６：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３７：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号３８：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号３９：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号４０：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ４　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号４１：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ５　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号４２：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ５　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号４３：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ６　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号４４：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ６　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号４５：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ７　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号４６：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ７　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号４７：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ８　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号４８：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ８　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号４９：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ９　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号５０：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ９　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号５１：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号５２：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１０　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号５３：Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＣＤ１９　アミノ酸配列
配列番号５４：ＨＬＡ－Ｃｗ４　アミノ酸配列
配列番号５５：ａ３ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号５６：ａ３ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号５７：ＫＩＲ２ＤＬ２＊００３　アミノ酸配列
配列番号５８：Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＮＧＦＲ　アミノ酸配列
配列番号５９：ＫＩＲ３ＤＬ２＊００２　アミノ酸配列
配列番号６０：ＫＩＲ３ＤＳ１＊０１３　アミノ酸配列
配列番号６１：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１１　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号６２：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１１　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号６３：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１２　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号６４：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１２　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号６５：３ＤＬ２シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号６６：３ＤＳ１シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号６７：Ｒ９９Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号６８：Ｖ９９Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号６９：Ｓ１００Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７０：Ｇ１０１Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７１：Ｔ１０２Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７２：Ｔ１０３Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７３：Ｇ１０４Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７４：Ｇ１０５Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７５：Ｙ１０６Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７６：Ｙ１０７Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７７：Ｔ１０８Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７８：Ｇ１０９Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号７９：Ｍ１１０Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号８０：Ｄ１１１Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号８１：Ｖ１１２Ａ　ＣＤＲ３　アミノ酸配列
配列番号８２：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１－２　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号８３：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ１－２　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号８４：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２－２　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号８５：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ２－２　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号８６：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３－２　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号８７：ａ２ＤＬ２／３－ＤＳ３－２　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号８８：ＨＬＡ－Ｇシグナルペプチド由来ペプチド　アミノ酸配列
配列番号８９：Ｇ４Ｓリンカー　アミノ酸配列
配列番号９０：ＨＬＡ－Ｅ　アミノ酸配列
配列番号９１：ＩＬ－２　シグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号９２：Ｈｉｓタグ　アミノ酸配列
配列番号９３：ＶＨシグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号９４：ＦａｂフラグメントＨ鎖定常領域　アミノ酸配列
配列番号９５：Ｖｌシグナルペプチド　アミノ酸配列
配列番号９６：ＦａｂフラグメントＬ鎖定常領域　アミノ酸配列
配列番号９７：ＧＧＧＳリンカー　アミノ酸配列
配列番号９８：ＩｇＧ　Ｆｃドメイン　アミノ酸配列
配列番号９９：Ａｖｉタグ　アミノ酸配列
配列番号１００：ＣＡ１９ＣＡＲ　ＶＬ　アミノ酸配列
配列番号１０１：ＣＡ１９ＣＡＲ　ＶＨ　アミノ酸配列
配列番号１０２：ＣＤ８由来細胞膜ドメイン及び細胞内ドメイン　アミノ酸配列
配列番号１０３：細胞内共刺激分子　アミノ酸配列
配列番号１０４：Ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　アミノ酸配列
配列番号１０５：ＩＬ－２１フラグメント　アミノ酸配列
配列番号１０６：ＣＤ８　ヒンジ（６２ａａ）　アミノ酸配列
配列番号１０７：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１０８：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１　ＶLアミノ酸配列
配列番号１０９：ａ２ＤＬ１－ＤＳ２　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１１０：ａ２ＤＬ１－ＤＳ２　ＶLアミノ酸配列
配列番号１１１：ａ２ＤＬ１－ＤＳ３　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１１２：ａ２ＤＬ１－ＤＳ３　ＶLアミノ酸配列
配列番号１１３：ａ２ＤＬ１－ＤＳ４　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１１４：ａ２ＤＬ１－ＤＳ４　ＶLアミノ酸配列
配列番号１１５：ａ２ＤＬ１－ＤＳ５　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１１６：ａ２ＤＬ１－ＤＳ５　ＶLアミノ酸配列
配列番号１１７：ａ２ＤＬ１－ＤＳ６　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１１８：ａ２ＤＬ１－ＤＳ６　ＶLアミノ酸配列
配列番号１１９：ａ２ＤＬ１－ＤＳ７　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１２０：ａ２ＤＬ１－ＤＳ７　ＶLアミノ酸配列
配列番号１２１：ａ２ＤＬ１－ＤＳ８　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１２２：ａ２ＤＬ１－ＤＳ８　ＶLアミノ酸配列
配列番号１２３：ａ２ＤＬ１－ＤＳ９　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１２４：ａ２ＤＬ１－ＤＳ９　ＶLアミノ酸配列
配列番号１２５：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１０　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１２６：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１０　ＶLアミノ酸配列
配列番号１２７：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１１　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１２８：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１１　ＶLアミノ酸配列
配列番号１２９：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１２　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１３０：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１２　ＶLアミノ酸配列
配列番号１３１：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１３　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１３２：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１３　ＶLアミノ酸配列
配列番号１３３：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１４　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１３４：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１４　ＶLアミノ酸配列
配列番号１３５：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１５　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１３６：ａ２ＤＬ１－ＤＳ１５　ＶLアミノ酸配列
配列番号１３７：ａ３ＤＬ１－ＤＳ２　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１３８：ａ３ＤＬ１－ＤＳ２　ＶLアミノ酸配列
配列番号１３９：ａ３ＤＬ１－ＤＳ３　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１４０：ａ３ＤＬ１－ＤＳ３　ＶLアミノ酸配列
配列番号１４１：ａ３ＤＬ１－ＤＳ４　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１４２：ａ３ＤＬ１－ＤＳ４　ＶLアミノ酸配列
配列番号１４３：ａ３ＤＬ１－ＤＳ５　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１４４：ａ３ＤＬ１－ＤＳ５　ＶLアミノ酸配列
配列番号１４５：ａ３ＤＬ１－ＤＳ６　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１４６：ａ３ＤＬ１－ＤＳ６　ＶLアミノ酸配列
配列番号１４７：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１４８：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１４９：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ２　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５０：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ２　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１５１：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ３　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５２：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ３、ＤＳ４、ＤＳ５、ＤＳ６，ＤＳ７　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１５３：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ４　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５４：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ５　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５５：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ６　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５６：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ７　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５７：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ８　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１５８：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ８　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１５９：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ９　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１６０：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ９　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１６１：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１０　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１６２：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１０　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１６３：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１６４：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１１　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１６５：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１６６：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１２　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１６７：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１３　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１６８：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１３　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１６９：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１４　ＶＨアミノ酸配列
配列番号１７０：ａＮＫＧ２Ａ－ＤＳ１４　ＶＬアミノ酸配列
配列番号１７１：ＥＧＦＰ　アミノ酸配列
配列番号１７２：プライマーＡ　塩基配列
配列番号１７３：プライマーＢ　塩基配列
配列番号１７４：ｍＣｈｅｒｒｙアミノ　酸配列
配列番号１７５：Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＣＤ８　アミノ酸配列
配列番号１７６：プライマーＣ　塩基配列
配列番号１７７：プライマーＤ　塩基配列
配列番号１７８：ＨＡタグ　アミノ酸配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (30)

  1. 　ＮＫＧ２Ａに対する結合部位を含む細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する膜型タンパク質であるポリペプチドであって、（１）ＮＫ細胞表面のＮＫＧ２Ａに結合して当該ＮＫ細胞を抑制する活性を有し、且つ、（２）実質的にＮＫＧ２Ｃに対するアゴニスト活性を有さない前記ポリペプチド。
  2. 　前記結合部位が、ＮＫＧ２Ｃに結合する活性よりもＮＫＧ２Ａに結合する活性の方が高いことを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 　前記結合部位が、実質的にＮＫＧ２Ｃに結合しないことを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド。
  4. 　前記結合部位が、ＮＫＧ２Ａに結合するモノクローナル抗体又は抗原結合性断片の１つ又は２つの可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一つに記載のポリペプチド。
  5. 　前記結合部位が、以下の方法で取得された抗原結合性断片に含まれる１つ又は２つの可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド；工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＮＫＧ２Ａに結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
    工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を懸濁液に混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ，担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団からＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
    工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
    工程Ｄ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
  6. 　前記結合部位が、以下の方法で取得された抗原結合性断片の１つ又は２つの可変領域に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド：
    工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しないＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
    工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
    工程Ｃ：同定された抗原結合部位を含む遺伝子を細胞に発現させる工程。
  7. 　ラベル及びラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、請求項５又は６に記載のポリペプチド。
  8. 　更に、ＮＫＧ２Ａに対してアゴニスト活性を有する抗原結合性断片を選抜する工程、を含む方法により取得されることを特徴とする請求項５又は６に記載のポリペプチド。
  9. 　前記結合部位が、第１の可変領域と第２の可変領域がＧＳリンカー又はＧ４Ｓリンカーを介して連結されていることを特徴とする一本鎖抗体又はｓｃＦｖである請求項１～８のいずれか一つに記載のポリペプチド。
  10. 　前記結合部位が、ＮＫＧ２Ａとの結合において、以下のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖと競合することを特徴とする、請求項１記載のポリペプチド；
    （Ｎ－ｉ）配列番号１６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号１６４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せを含むアミノ酸配列。
  11. 　前記結合部位として以下の結合部位を含むポリペプチドであり、それぞれのＣＤＲに１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、請求項１記載のポリペプチド；
    （Ｎ－Ｉ）　配列番号１６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１６４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に由来するアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
  12. 　それぞれのＣＤＲのＣ及び/又はＮ末端側に１又は２個のアミノ酸の変異を有していてもよい、請求項１１記載のポリペプチド。
  13. 　前記結合部位として以下の結合部位を含むポリペプチドである請求項１１記載のポリペプチド；
    （Ｎ－Ｉ）　配列番号１６３のアミノ酸配列を含む第１の可変領域と配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第２の可変領域の組合せを含む結合部位。
  14. 　請求項１～１３のいずれか一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  15. 　請求項１～１３のいずれか一つに記載のポリペプチドが細胞表面に発現している細胞。
  16. 　細胞表面に更に、抑制型ＫＩＲに対する特異的アゴニスト活性を示す膜型タンパク質が発現している、請求項１５記載の細胞。
  17. 　抑制型ＫＩＲが、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ２ＤＬ１の内少なくとも一つである請求項１６記載の細胞。
  18. 　更に、細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現が消失又は減弱している、請求項１５～１７のいずれか一つに記載の細胞。
  19. 　細胞表面上の少なくとも一つのＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡの発現の消失又は減弱が、遺伝子編集によるゲノム上のＣｌａｓｓ　Ｉ　ＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びＴＡＰＢＰ領域からなる群から選択される少なくとも一つの改変によるものである、請求項１８記載の細胞。
  20. 　遺伝的にＨＬＡ発現が消失している個体から樹立された細胞株である、請求項１８記載の細胞。
  21. 　細胞が、多能性幹細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、間葉系幹細胞、心筋細胞、軟骨細胞、網膜細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、又は、すい臓細胞である、請求項１５～２０のいずれか一つに記載の細胞。
  22. 　多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である、請求項２１記載の細胞。
  23. 　細胞表面に更に、キメラ受容体が発現している、請求項１５～２２のいずれか一つに記載の細胞。
  24. 　請求項１５～２３のいずれか一つに記載の細胞を有効成分として含む、投与又は移植の対象における免疫拒絶リスクが低減された医薬組成物。
  25. 　請求項１～１３のいずれか一つに記載のポリペプチドを、治療用細胞の細胞表面に発現させる工程を含む、治療対象による治療用細胞に対する免疫拒絶を低減又は抑制する方法。
  26. 　請求項１～１３のいずれか一つに記載のポリペプチドを、治療用細胞の細胞表面に発現させる工程を含む、治療対象による免疫拒絶のリスクが低減又は抑制された治療用細胞の製造方法。
  27. 　以下の工程を含む、請求項１５記載の細胞を製造する方法；
    工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液に当該ＮＫＧ２Ａの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、当該ＮＫＧ２Ａに結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
    工程Ｂ：工程Ａで取得された提示体集団を含む懸濁液に、ＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体を混合させ、当該ラベル部分と結合する物質を固定化した担体と接触させ，担体に結合しない提示体を回収することで、当該細胞集団から当該ＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合部位を提示する提示体を除去する工程、
    工程Ｃ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析をおこない、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
    工程Ｄ：同定された抗原結合部位を細胞外ドメインに含む請求項１のポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に発現させる工程。
  28. 　以下の工程を含む請求項１５記載の細胞を製造する方法；
    工程Ａ：ＮＫＧ２Ａに結合性を示す抗原結合部位を表面に提示する提示体を含むポリクローナルな提示体集団を含む懸濁液にＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質のラベル化体とラベル化しない前記ＮＫＧ２Ｃの細胞外ドメインを含む可溶化タンパク質を混合させた後、当該懸濁液を当該ラベル部分と特異的に結合する物質を固定化した担体と接触させ、担体に結合した提示体を回収することで、ＮＫＧ２Ａに特異的に結合する抗原結合部位を提示する提示体集団を取得する工程、
    工程Ｂ：前記工程を含む方法で得られた提示体の遺伝子解析を行い、抗原結合部位をコードする遺伝子配列を同定する工程、及び
    工程Ｃ：同定された抗原結合部位を細胞外ドメインに含む請求項１のポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に発現させる工程。
  29. 　ラベル及びラベルに結合する物質の組み合わせが、ビオチン－アビジンの組み合わせである、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 　更に、ＮＫＧ２Ａに対するアゴニスト活性を有する細胞を選抜する工程を含む請求項２７～２９のいずれか一つに記載の方法。
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