WO2025199711A1 - 一种维生素d结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型及其应用 - Google Patents

一种维生素d结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型及其应用

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刘梦雨
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biomedicine technology, and specifically relates to a vitamin D binding protein gene conditional knockout mouse model and application thereof.
  • Depression is a complex, multifactorial disease involving multiple factors, including genes, neurotransmitters, neural development, stress response, cognitive biases, interpersonal relationships, and social support.
  • the etiology remains unclear, and the diagnosis of depression is still primarily based on clinical manifestations and questionnaires, lacking objective indicators such as experimental diagnosis. This study found that knocking out vitamin D-binding protein in microglia can effectively mitigate depressive-like behaviors induced by chronic stress.
  • the purpose of the first aspect of the present invention is to provide a method for constructing a vitamin D binding protein gene conditional knockout mouse model.
  • the purpose of the second aspect of the present invention is to provide the use of the vitamin D binding protein gene conditional knockout mouse constructed by the construction method described in the first aspect of the present invention in at least one of the following.
  • the third aspect of the present invention aims to provide an sgRNA.
  • the fourth aspect of the present invention aims to provide a reagent.
  • the fifth aspect of the present invention aims to provide the use of vitamin D binding protein gene as a drug target in screening drugs for treating depression.
  • the sixth aspect of the present invention aims to provide the use of a vitamin D binding protein gene inhibitor in the preparation of a drug for treating depression.
  • the first aspect of the present invention provides a method for constructing a vitamin D binding protein gene conditional knockout mouse model, comprising the following steps:
  • Exon2-Exon4 of the mouse vitamin D binding protein gene is flox-modified.
  • Exon2-Exon4 of the mouse vitamin D binding protein gene is flox-modified using CRISPR/Cas9 technology.
  • step S1 specifically includes: introducing sgRNA1, sgRNA2, Cas9, and a targeting vector into a fertilized egg to obtain a flox-modified F0 generation positive mouse; the Cas9 protein binds to the target site under the guidance of the sgRNA, and the sgRNA target site is designed based on the non-conserved region sequence downstream of Intron1 and Intron4 of the vitamin D binding protein gene.
  • sequence of the sgRNA1 is shown in any one of SEQ ID NOs. 1 to 8;
  • sequence of sgRNA2 is shown in any one of SEQ ID NOs. 9 to 16;
  • the compound is a small molecule or polypeptide compound that binds to vitamin D binding protein
  • the sequence of the sgRNA is as shown in the second aspect of the present invention.
  • the present invention constructs a knockout mouse that specifically knocks out vitamin D binding protein in microglia and finds that it can resist chronic stress-induced depressive-like behavior. This indicates that vitamin D binding protein in microglia is a key factor in the occurrence and development of depressive-like behavior. By knocking out vitamin D binding protein in microglia, a significant effect can be achieved in resisting depressive-like behavior.
  • Vitamin D binding protein in microglia can be used as a drug target to screen drugs for treating depression.
  • Microglia vitamin D binding protein inhibitors can be used to prepare drugs for treating depression. This opens up a new direction for in-depth research on depression and provides more options for the clinical treatment of depression, which has very important theoretical and practical significance.
  • Figure 1 is a schematic diagram of a targeting vector.
  • Figure 4 shows the results of sgRNA activity detection.
  • FIG5 shows the detection results of the targeting vector.
  • Figure 6 is a map of the targeting vector.
  • Figure 7 shows the primer design for flox mouse genotype detection.
  • FIG8 shows the results of genotype identification of the F0 generation.
  • FIG11 is a mating scheme for obtaining conditional gene knockout mice.
  • FIG12 is a mating scheme for obtaining floxed heterozygous mice from conditional gene knockout mice.
  • FIG13 shows a mating scheme for obtaining floxed homozygous mice from conditional gene knockout mice.
  • FIG15 shows that RNA was extracted from cells screened by flow cytometry and then RT-qPCR was performed to verify the expression of VDBP gene, proving that the knockout was successful.
  • FIG 16 shows the tail suspension test (TST) and forced swim test (FST) to detect the depressive behavior of VDBP knockout mice. For the result.
  • the EGE-YMX-011-A gene is located on the reverse strand of chromosome 5 and is 40.4 kb in length. Gene ID: 14473.
  • Cre+/--VDBP+/+ transgenic mice were obtained by hybridizing B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm2.1(cre/ERT2)Litt/WganJ transgenic mice with self-constructed VDBP loxp/loxp transgenic mice. The mice were 5 weeks old. After tamoxifen injection, 75 mg/kg was administered for 5 days. Cre enzyme was expressed in microglia and specifically cleaved the Exon2-Exon4 fragment of the vitamin D binding protein gene, achieving gene knockdown. Mice were then subjected to 5 weeks of chronic, unpredictable mild stress, and their depressive-like behaviors were assessed using the classic sugar preference test, tail suspension test, and forced swim test (Figure 16).

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Abstract

一种维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型及其应用,包括以下步骤：S1：对小鼠维生素D结合蛋白基因进行flox修饰，获得完成flox修饰的F0代阳性小鼠；S2：将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配得到保留有flox修饰的F1代阳性小鼠；S3：将F1代阳性小鼠与组织特异性Cre工具鼠杂交获得杂合子小鼠，将杂合子小鼠相互交配，获得纯合子小鼠；S4：选取获得的纯合子小鼠进行他莫昔芬注射，获得维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠。

Description

一种维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型及其应用 技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型及其应用。
背景技术
抑郁症是一个复杂的多因素疾病，涉及到基因、神经递质、神经发育、应激反应、认知偏差、人际关系、社会支持等多个层面。病因至今尚不完全清楚，并且对于抑郁症的诊断还是以临床表现及量表作为其主要的诊断依据，尚缺乏实验诊断等客观指标。本研究发现了敲除小胶质细胞中的维生素D结合蛋白可有效抵抗慢性应激所导致的抑郁样行为。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型的构建方法。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面所述构建方法构建的维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠在以下至少一种中的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供一种sgRNA。
本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂。
本发明第五方面的目的，在于提供维生素D结合蛋白基因作为药物靶标在筛选治疗抑郁症药物中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供维生素D结合蛋白基因抑制剂在制备治疗抑郁症药物中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
S1：对小鼠维生素D结合蛋白基因进行flox修饰，获得完成flox修饰的F0代阳性小鼠；
S2：将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配得到保留有flox修饰的F1代阳性小鼠；
S3：将F1代阳性小鼠与组织特异性Cre工具鼠杂交获得杂合子小鼠(fl/+，Cre/+)，将杂合子小鼠相互交配，获得纯合子小鼠(fl/fl，Cre/+)；
S4：选取获得的纯合子小鼠进行他莫昔芬注射，获得维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠。
优选地，步骤S1中对小鼠维生素D结合蛋白基因的Exon2-Exon4进行flox修饰。
优选地，步骤S1中通过CRISPR/Cas9技术对小鼠维生素D结合蛋白基因的Exon2-Exon4进行flox修饰。
优选地，所述步骤S1具体包括：将sgRNA1、sgRNA2、Cas9、打靶载体导入受精卵中，获得完成flox修饰的F0代阳性小鼠；Cas9蛋白在sgRNA引导下结合到靶位点，所述sgRNA靶位点依据维生素D结合蛋白基因的Intron1和Intron4下游的非保守区序列设计。
优选地，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.1～8任一项所示；
优选地，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述sgRNA2的序列SEQ ID NO.9～16任一项所示；
优选地，所述sgRNA2的序列SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述组织特异性Cre工具鼠的Cre酶特异性表达于小胶质细胞。
优选地，所述组织特异性Cre工具鼠包括B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm2.1(cre/ERT2)Litt/WganJ基因鼠。
优选地，所述方法还包括对F0代阳性小鼠、F1代小鼠、杂合子小鼠、纯合子小鼠进行基因型鉴定的步骤。
优选地，所述基因型鉴定的方法为PCR。
优选地，所述他莫昔芬的给药剂量为60～90mg/kg/day，注射4～8天。
本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述构建方法构建的维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠在以下至少一种中的应用：
A1)维生素D结合蛋白基因功能和/或维生素D结合蛋白基因相关疾病研究；
A2)研究抑郁症发生、发展；
A3)研究抑郁症诊断、治疗。
本发明的第三方面，提供一种sgRNA，所述sgRNA的序列如本发明第一方面的sgRNA1和/或sgRNA2所示。
本发明的第四方面，提供一种试剂，所述试剂包括以下任一种：
B1)本发明第一方面所述sgRNA和所述Cas9蛋白；
B2)与本发明第一方面所述sgRNA相关的生物材料和所述Cas9蛋白；
B3)本发明第一方面所述sgRNA和与所述Cas9蛋白相关的生物材料；
B4)与本发明第一方面所述sgRNA相关的生物材料和与所述Cas9蛋白相关的生物材料；
所述sgRNA相关的生物材料为下述中的任一种：
C1)编码所述sgRNA的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物。
所述Cas9蛋白相关的生物材料为下述中的任一种：
D1)编码所述Cas9蛋白质的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。
优选地，所述试剂还包括引物。
优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO.17～20所示。
本发明的第五方面，提供一种维生素D结合蛋白基因作为药物靶标在筛选治疗抑郁症药物中的应用。
优选地，所述维生素D结合蛋白为小胶质细胞中的维生素D结合蛋白。
本发明的第六方面，提供维生素D结合蛋白抑制剂在制备治疗抑郁症药物中的应用。
优选地，所述维生素D结合蛋白为小胶质细胞中的维生素D结合蛋白。
优选地，所述维生素D结合蛋白抑制剂包括抑制维生素D结合蛋白基因表达和/或蛋白活性的物质。
优选地，所述维生素D结合蛋白抑制剂为核酸分子、蛋白分子或小分子化合物；
优选地，所述核酸分子为microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA和/或反义 寡核苷酸；
优选地，所述蛋白分子为维生素D结合蛋白的特异性抗体；
优选地，所述化合物为结合维生素D结合蛋白的小分子或多肽类化合物；
优选地，所述sgRNA的序列如本发明第二方面所示。
本发明的有益效果是：
本发明构建了一种在小胶质细胞中特异性敲除维生素D结合蛋白的敲除小鼠，发现其可以抗慢性应激诱导的抑郁样行为；说明小胶质细胞中的维生素D结合蛋白是发生、发展抑郁样行为的关键因子；通过敲除小胶质细胞中的维生素D结合蛋白，可以达到抵抗抑郁样行为的显著效果；小胶质细胞中的维生素D结合蛋白以作为药物靶标筛选治疗抑郁症的药物，小胶质细胞中的维生素D结合蛋白抑制剂能够用于制备治疗抑郁症的药物。这为深入开展抑郁症的研究开启了新的方向，也为抑郁症的临床治疗提供了更多的选择，具有非常重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为打靶载体示意图。
图2为Southern blot筛选策略的示意图。
图3为precut pCS载体图谱。
图4为sgRNA活性检测结果。
图5为打靶载体的检测结果。
图6为打靶载体图谱。
图7为flox小鼠基因型检测的引物设计。
图8为F0代基因型鉴定结果。
图9为F1代小鼠基因型鉴定结果。
图10为F1代PCR阳性小鼠Southern blot检测结果。
图11为获得条件性基因敲除小鼠的交配方案。
图12为获得条件性基因敲除小鼠中获得floxed杂合子小鼠的交配方案。
图13为获得条件性基因敲除小鼠中获得floxed纯合子小鼠的交配方案。
图14为通过流式细胞术筛选出了不同类型的神经细胞。
图15为将流式筛选出的细胞提RNA后进行RT-qPCR验证VDBP基因表达证明敲除成功。
图16为悬尾实验(TST)，强迫游泳实验(FST)检测VDBP敲除小鼠的抑郁样行 为结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1.lox模式小鼠的设计方案
1、EGE-YMX-011-A基因(即维生素D结合蛋白(Vitamin D Binding Protein，VDBP)基因)信息介绍
EGE-YMX-011-A基因在5号染色体反链上，全长40.4kb。Gene ID:14473。
2、打靶策略
分析EGE-YMX-011-A基因的结构，确认打靶方案，EGE-YMX-011-A基因的Exon2-4可被flox。sgRNAs分别设计在EGE-YMX-011-A基因Intron1和Intron4下游的非保守区中。5'端和3'端的同源臂分别为1.7kb和0.9kb。采用百奥赛图公司基于CRISPR/Cas9开发的EGE系统制备模式小鼠；打靶载体示意图如图1。
3、Southern blot筛选策略
为了筛选到发生正确重组的基因打靶小鼠，采用PCR和Southern blot方法验证，利用3'Probe和LR Probe验证F1代阳性小鼠。Southern blot筛选策略的示意图如图2；
具体设计如下表；
表1
利用NcoI和AseI作为Southern blot酶切位点。3’Probe用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；LR Probe用于检测是否含有随机插入，若没有随机插入，将会出现野生型和突变型两个条带。
实施例2 EGE-YMX-011-Aflox模式小鼠的制备
1、CRISPR/sgRNA设计及构建
1.1 sgRNA的设计
基于sgRNA的设计原则，在5’靶位点和3’靶位点区域分别设计8条sgRNA，其对应的靶向序列如下表；
表2
1.2 Cas9/sgRNA质粒的构建
按照已设计sgRNA序列合成oligos，通过Gibson的方式连入pCS-4G载体，连接产物转化后送样测序验证正确。
1.3载体图谱
precut pCS载体图谱见图3；
2、sgRNA的活性检测
采用一种自主研发的CRISPR/Cas9活性检测方法-UCATM方式进行；其具有无物种限制、高通量、适应性广、灵敏度高、简便性等优点；检测结果如图4；如图所示从活性上综合考量既不能选择活性较高容易发生毒性作用，活性太低导致敲减失败，所以选取了活性50-100的两条序列；因此综合选择EGE-YMX-011-A-sgRNA1和EGE-YMX- 011-A-sgRNA9进行下一步实验。
3、打靶载体的构建
根据打靶方案，设计引物构建打靶载体，并通过酶切鉴定和测序，具体见表3和图5；
表3
确认打靶载体构建完成；打靶载体图谱如图6。
4、受精卵显微注射
Cas9/sgRNA-打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后F0代小鼠出生情况如下表；
表4
5、F0代flox小鼠基因型鉴定
使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法制备flox小鼠。由于受精卵注射方法得到F0代小鼠可能为嵌合体/杂合/纯合，以F0代小鼠鼠尾进行基因型鉴定得到的F0代鼠的基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1代小鼠基因型鉴定后确定。
1)flox小鼠基因型检测的引物设计
引物设计原则如下图所示(用于检测是否正确重组)如图7；引物信息如下表：
表5

PCR反应条件(Touchdown)如表6；Enzyme:KOD-FX；
表6
2 F0代基因型鉴定
结果如图8所示，结果显示，通过PCR扩增及产物测序，表明E7X11-0027和E7X11-0033和为F0代阳性flox小鼠。E7X3-0010,E7X11-0025，E7X11-0105为F0代疑似PCR阳性flox小鼠。
3、F1代小鼠基因型及Southern blot鉴定
1)选择部分上述F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配得到F1代。交配结果如下表；
表7
2)F1代小鼠基因型鉴定
引物设计原则与F0代基因型鉴定方法一样，鉴定结果如下图9；
结果显示，通过PCR鉴定，结果表明1E7X11-0001，1E7X11-0007，1E7X11-0009，1E7X11-0012和1E7X11-0033为PCR阳性F1代flox小鼠。
3)F1代PCR阳性小鼠Southern blot检测
提取部分上述PCR鉴定为阳性的F1小鼠鼠尾DNA进行Southern blot检测及测序，结果如图10；检测结果表明：1E7X11-0001、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012和1E7X11-0033均为正确重组，且没有随机插入。
综上所述，1E7X11-0001、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012和1E7X11-0033均为PCR检测阳性，Southern blot检测正确重组且无随机插入，测序正确，为阳性F1代flox小鼠。
实施例3 flox模式小鼠的交配方案
1、获得条件性基因敲除小鼠
将floxed杂合子小鼠与组织特异性的Cre小鼠(B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm2.1(cre/ER T2)Litt/WganJ)交配，实现目的基因组织特异性的敲除。
交配方案见图11；
第一步：与组织特异性Cre小鼠交配，获得floxed杂合子小鼠(图12)；
基因型检测策略如表8；
表8

此步只能获得杂合子小鼠(fl/+，Cre/+)，纯合子小鼠(实验用小鼠)需要进行进一步地交配获得；基因型为+/+，Cre/+、fl/+，+/+、+/+，+/+的小鼠，均可用做对照。
第二步：获得floxed纯合子小鼠
获得的杂合子小鼠(fl/+，Cre/+)，相互交配，得到纯合子小鼠(fl/fl，Cre/+)(图13)。
基因型检测策略如表9所示；
表9
基因型为fl/fl，Cre/+的小鼠属于实验组，其它基因型的小鼠为对照组。最好的对照组是+/+，Cre/+小鼠。
实施例4
取小鼠脑组织制成单细胞悬液，使用BD FACSLyric流式分选系统对小胶质细胞进行筛选，首先通过圈门去除团块细胞后选择单细胞群，通过DAPI信号获得活细胞群，对小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞细胞等进行筛选(图14)，而后将流式筛选出的细胞提RNA后进行RT-qPCR实验对维生素D结合蛋白基因的表达进行验证，结果证明该小鼠实现了在小胶质细胞中特异性的敲减了维生素D结合蛋白基因的表达，敲减效率达到了80％以上(图15)。
实施例5
通过使用B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm2.1(cre/ERT2)Litt/WganJ基因鼠与自行构建的VDBP loxp/loxp基因鼠进行杂交得到Cre+/-—VDBP+/+基因鼠，小鼠5周龄进行 tamoxifen注射后，75mg/kg注射5天，cre酶在小胶质细胞中表达，可特异性的剪切维生素D结合蛋白基因的Exon2-Exon4片段，实现基因的敲减。而后对小鼠进行为期5周的慢性不可预测轻度应激，通过经典的糖水偏好实验，悬尾实验，强迫游泳实验检测小鼠的抑郁样行为(图16)。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

  1. 一种维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
    S1：对小鼠维生素D结合蛋白基因进行flox修饰，获得完成flox修饰的F0代阳性小鼠；
    S2：将F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配得到保留有flox修饰的F1代阳性小鼠；
    S3：将F1代阳性小鼠与组织特异性Cre工具鼠杂交获得杂合子小鼠，将杂合子小鼠相互交配，获得纯合子小鼠；
    S4：选取获得的纯合子小鼠进行他莫昔芬注射，获得维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠。
  2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中对小鼠维生素D结合蛋白基因的Exon2-Exon4进行flox修饰。
  3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中通过CRISPR/Cas9技术对小鼠维生素D结合蛋白基因的Exon2-Exon4进行flox修饰；优选地，所述步骤S1具体包括：将sgRNA1、sgRNA2、Cas9导入受精卵中，获得完成flox修饰的F0代阳性小鼠。
  4. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.1～8任一项所示；优选地，所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO.1所示；优选地，所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO.9～16任一项所示，优选地，所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO.9所示；优选地，所述组织特异性Cre工具鼠的Cre酶特异性表达于小胶质细胞。
  5. 权利要求1～4任一项所述构建方法构建的维生素D结合蛋白基因条件性敲除小鼠在以下至少一种中的应用：
    A1)维生素D结合蛋白基因功能和/或维生素D结合蛋白基因相关疾病研究；
    A2)研究抑郁症发生、发展；
    A3)研究抑郁症诊断、治疗。
  6. 一种sgRNA，所述sgRNA的序列如权利要求4所述的sgRNA1和/或sgRNA2所示。
  7. 一种试剂，所述试剂包括以下任一种：
    B1)权利要求6所述sgRNA和所述Cas9蛋白；
    B2)与权利要求6所述sgRNA相关的生物材料和所述Cas9蛋白；
    B3)权利要求6所述sgRNA和与所述Cas9蛋白相关的生物材料；
    B4)与权利要求6所述sgRNA相关的生物材料和与所述Cas9蛋白相关的生物材料；
    所述sgRNA相关的生物材料为下述中的任一种：
    C1)编码所述sgRNA的核酸分子；
    C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
    C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
    C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
    所述Cas9蛋白相关的生物材料为下述中的任一种：
    D1)编码所述Cas9蛋白质的核酸分子；
    D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
    D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
    D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。
  8. 维生素D结合蛋白基因作为药物靶标在筛选治疗抑郁症药物中的应用；优选地，所述维生素D结合蛋白为小胶质细胞中的维生素D结合蛋白。
  9. 维生素D结合蛋白抑制剂在制备治疗抑郁症药物中的应用；优选地，所述维生素D结合蛋白为小胶质细胞中的维生素D结合蛋白。
  10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述维生素D结合蛋白抑制剂包括抑制维生素D结合蛋白基因表达和/或蛋白活性的物质；优选地，所述维生素D结合蛋白抑制剂为核酸分子、蛋白分子或小分子化合物；
    优选地，所述核酸分子为microRNA、siRNA、shRNA、dsRNA、sgRNA和/或反义寡核苷酸；
    优选地，所述蛋白分子为维生素D结合蛋白的特异性抗体；
    优选地，所述化合物为结合维生素D结合蛋白的小分子或多肽类化合物；
    优选地，所述sgRNA的序列如权利要求6所述。
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