WO2025192583A1 - 遺伝子修飾された間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法 - Google Patents

遺伝子修飾された間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法

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WO2025192583A1
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mesenchymal stem
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suicide gene
cell
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宗哉 中山
真広 林
智之 中石
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Kaneka Corp
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell population containing genetically modified mesenchymal stem cells.
  • Cancer is a disease that affects many people worldwide, causing millions of deaths each year. Cancer is divided into various types depending on the organ in which it develops and the cells from which it originates. Some types of cancer are still poorly treated with existing therapies, and research into new treatments is actively underway.
  • Malignant brain tumors are one of the cancers with a particularly poor prognosis.
  • the standard existing treatment for malignant brain tumors is surgical removal of the tumor followed by radiation therapy and/or drug therapy.
  • radiation therapy and/or drug therapy it is often not possible to completely remove the tumor through surgery, and even after radiation therapy or drug therapy, cancer cells often remain and the tumor often recurs.
  • cancer cells often remain and the tumor often recurs.
  • Mesenchymal stem cells are somatic stem cells that have been reported to exist in bone marrow, adipose tissue, dental pulp, amniotic membrane, etc. Mesenchymal stem cells have immunosuppressive properties and can be transplanted allogeneically, making them a promising cell source for cell therapy. In fact, their practical application for acute graft-versus-host disease (GVHD) and spinal cord injury is progressing. Furthermore, mesenchymal stem cells are known to have the ability to specifically migrate and accumulate in cancer lesions within the body, and research is underway to utilize mesenchymal stem cells as a more targeted cancer treatment method.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • One cancer treatment method using mesenchymal stem cells is to use mesenchymal stem cells that have been given anti-cancer function by introducing a suicide gene such as herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK).
  • HSV-TK herpes simplex virus thymidine kinase
  • the gene introduction method used here generally uses a viral vector, from the perspective of gene introduction efficiency and gene expression stability.
  • Non-Patent Document 1 describes a method of producing the target cells by introducing HSV-TK into adipose tissue-derived mesenchymal stem cells using a lentiviral vector.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 it has been reported that introducing a suicide gene into induced pluripotent stem cells or dental pulp stem cells using a viral vector can sometimes result in cytotoxicity and a reduced proliferation ability of the suicide gene-introduced cells.
  • Amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells are characterized by the fact that they are derived from amniotic membrane, which is treated as medical waste after Cesarean section delivery, so cell collection does not require the invasiveness of a new donor; because the amniotic membrane is a fetal tissue, there is little variation in cell characteristics between donors; and a large number of mesenchymal stem cells can be obtained from the amniotic membrane of a single donor. These characteristics make amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells particularly excellent as a cell therapy material among various tissue-derived mesenchymal stem cells, and their use in the field of cancer treatment is expected to enable the provision of low-cost, stable-quality cell therapy.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells without significantly reducing the proliferation ability of the suicide gene-transduced amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • a plasmid vector such as a transposon method
  • the transfected cells did not experience a significant decrease in proliferation ability due to cytotoxicity.
  • the present invention relates to the following [1] to [10].
  • [1] A method for producing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells, comprising the step of introducing a suicide gene or an expression cassette for the suicide gene into amnion-derived mesenchymal stem cells using a plasmid vector.
  • [2] The method according to [1], wherein the plasmid vector is introduced into cells by electroporation.
  • [3] The method of production described in [1] or [2], wherein the suicide gene or an expression cassette for the suicide gene is integrated into a chromosome in the gene introduction step.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the suicide gene is a herpes simplex virus thymidine kinase gene or a cytosine deaminase gene.
  • [7] The method of any one of [1] to [6], wherein the suicide gene is a herpes simplex virus thymidine kinase gene.
  • [8] A cell preparation comprising genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells produced by the production method according to any one of [1] to [7].
  • a cell preparation comprising amnion-derived mesenchymal stem cells, wherein the amnion-derived mesenchymal stem cells have (i) a suicide gene or an expression cassette for the suicide gene, and (ii) a repetitive sequence recognized by a transposase integrated into their chromosomes.
  • the cell preparation described in [11], wherein the prodrug is ganciclovir wherein the prodrug is ganciclovir.
  • a cancer treatment kit comprising: (i) a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells produced by the production method according to any one of [1] to [7]; and (ii) a prodrug.
  • a cancer treatment kit comprising the cell preparation according to [9] and a prodrug.
  • the prodrug is ganciclovir or 5-fluorocytosine.
  • the present invention it is possible to produce a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells that express a suicide gene without reducing cell proliferation ability.
  • amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells refers to stem cells that can be collected from the amnion and that meet the following definition. i) They exhibit adhesion to plastic under culture conditions in standard medium. ii) The surface antigens CD73 and CD90 are positive, and CD45 and CD326 are negative.
  • amniotic membrane refers to the thin, transparent membrane with few blood vessels that is the innermost layer of the fetal membrane, and includes the amniotic epithelial layer (epithelial tissue), basement membrane, and stratum densa (interstitial tissue).
  • amniotic epithelial layer epithelial tissue
  • basement membrane basement membrane
  • stratum densa stratum densa
  • meenchymal stem cells also include “mesenchymal stromal cells.”
  • the origin of the amniotic membrane is not particularly limited, and it can be derived from any organism. Examples of such organisms include mammals such as humans, monkeys, cows, horses, dogs, cats, pigs, sheep, mice, rats, and rabbits, and birds such as parakeets, parrots, and chickens.
  • amniotic membrane used herein is preferably derived from humans, monkeys, cows, horses, dogs, cats, pigs, sheep, mice, rats, or rabbits, more preferably from humans, monkeys, dogs, or cats, and even more preferably from humans.
  • cell population containing mesenchymal stem cells refers to a cell aggregate composed of one or more cells, including one or more mesenchymal stem cells.
  • the form of the cell aggregate is not particularly limited, and examples include tissue, tissue fragment, cell pellet, cell aggregate, cell sheet, cell suspension, cell suspension, and frozen products thereof.
  • suicide gene refers to a gene that encodes a protein that converts a prodrug into a cytotoxic substance, and that induces cell death in cells expressing the gene in the presence of a prodrug.
  • suicide genes include the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene, cytosine deaminase (CD) gene, varicella-zoster virus thymidine kinase gene, nitroreductase gene, purine nucleoside phosphorylase gene, ⁇ -galactosidase gene, cytochrome P450 gene, Escherichia coli GPT gene, linamarase gene, horseradish peroxidase gene, carboxypeptidase A gene, and carboxypeptidase G2 gene.
  • the suicide gene is preferably the HSV-TK gene or the CD gene, and more preferably HSV-TK.
  • prodrug as used herein is not particularly limited, as long as it is a precursor drug that can be converted into a cytotoxic anticancer substance by the suicide gene used.
  • examples include ganciclovir, 5-fluorocytosine (5-FC), 6-methoxypurine arabinoside, CB1954, 6-methylpurine deoxyriboside, Daun02, cyclophosphamide, ifosfamide, and ZD-2767P.
  • ganciclovir can be converted into an anticancer substance when combined with the HSV-TK gene, 5-FC when combined with the CD gene, 6-methoxypurine arabinoside when combined with the varicella-zoster virus thymidine kinase gene, CB1954 when combined with the nitroreductase gene, and 6-methylpurine deoxyriboside when combined with the purine nucleoside phosphorylase gene.
  • the prodrug used herein is preferably ganciclovir or 5-FC, and more preferably ganciclovir.
  • expression cassette refers to a collection of nucleic acid regions that contain one or more genes and optionally one or more nucleic acid regions that control the expression of the genes, and encompass the expression units of the genes.
  • the nucleic acid regions that control the expression of genes are not particularly limited. Examples include promoters, enhancers, terminators, polyA signals, and linkers.
  • Gene transfer refers to the artificial introduction of nucleic acids into a target object such as a cell.
  • Gene transfer methods generally include methods using viral vectors and methods using non-viral vectors.
  • viral vectors include adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, baculoviral vectors, vaccinia viral vectors, and herpes simplex viral vectors.
  • non-viral vectors include plasmid vectors.
  • Examples of gene transfer methods using plasmid vectors include the transposon method, a method using cationic lipids, calcium phosphate coprecipitation, diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, a method using cationic polymers, electroporation, microinjection, a method using a gene gun, a method using a laser, and a method using magnetic nanoparticles.
  • the term “electroporation” refers to a gene transfer method in which cells are exposed to an electric pulse to temporarily form pores in the cell membrane, and nucleic acids such as plasmid vectors are delivered into the cells through the pores.
  • electroroporation also includes “electroporation.”
  • transposon method refers to a gene transfer method that utilizes the mechanism of gene transfer through the combination of a transposase and a specific repetitive sequence recognized by the transposase.
  • the transposase is not particularly limited. Examples include Sleeping Beauty, piggyBac, Tol2, Frog Prince, and HimarI.
  • transposon also includes “DNA transposons” and “retrotransposons.”
  • a “genetically modified” cell refers to a cell that has an artificially introduced nucleic acid.
  • cell preparation containing amnion-derived mesenchymal stem cells refers to a composition prepared in vitro that contains one or more genetically modified amnion-derived mesenchymal cells.
  • the form of the cell preparation is not particularly limited, and examples include a cell suspension, a cell suspension, a cell pellet, a cell aggregate, a sheet, a sealant, and frozen versions of these.
  • cancer as used herein is not particularly limited.
  • Examples include squamous cell carcinoma, lung cancer, peritoneal cancer, mesothelioma, colon cancer, bile duct tumor, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, bronchial cancer, oral cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, gallbladder cancer, kidney cancer, leukemia, bladder cancer, melanoma, brain cancer, glioma, brain tumor, skin cancer, pancreatic cancer, breast cancer, liver cancer, bone marrow cancer, esophageal cancer, colon cancer, gastric cancer, cervical cancer, endometrial cancer, prostate cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, rectal cancer, and testicular cancer.
  • cancer as used herein includes "carcinoma,””tumor,” and "malignant tumor.”
  • Method for producing a cell population comprising genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells One or more embodiments of the present invention provide a method for producing a cell population comprising genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • the method for producing a cell population comprising genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells of the present invention comprises the step of transfecting amnion-derived mesenchymal stem cells with a suicide gene or a suicide gene expression cassette.
  • the cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells used as a starting material for producing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell population containing one or more amnion-derived mesenchymal stem cells, and may also contain other cells. It is not particularly limited.
  • the percentage of amnion-derived mesenchymal stem cells in the cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells is, for example, 0.1% or more, 1% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, and 95% or more.
  • the cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells of the present invention may or may not have been pre-cultured or frozen. Specifically, it may be tissue or cells collected from an individual, or a frozen product thereof, or a culture of tissue or cells collected from an individual, or a frozen product thereof.
  • the present invention may also include a cell population obtaining step in which an amniotic membrane is subjected to an enzyme treatment to obtain a cell population containing amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells as a raw material.
  • the cell population obtaining step may further include a step of obtaining the amniotic membrane by Caesarean section.
  • the method for producing a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells preferably provides a cell population obtained by enzymatically treating a sample containing amnion.
  • the enzymatic treatment is preferably a treatment with an enzyme that can liberate mesenchymal stem cells contained in the extracellular matrix layer of the amnion without degrading the epithelial cell layer.
  • enzymes having the above activity include collagenase and metalloproteinase.
  • Metalloproteinases include, but are not limited to, thermolysin and dispase, which are metalloproteinases that cleave the N-terminal side of nonpolar amino acids.
  • two or more types of enzymes having the above activity may be used in combination.
  • the present invention may further comprise the step of culturing a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • the cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells can be cultured using a method similar to the method for culturing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells, described below.
  • the present invention involves the step of genetically introducing a suicide gene or a suicide gene expression cassette into amnion-derived mesenchymal stem cells contained in a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells. From the perspective of the efficiency of producing suicide gene-introduced cells, it is preferable that the suicide gene or suicide gene expression cassette be integrated into the chromosome of the genetically modified cells. This makes it possible to produce genetically modified cells more stably than genetically modified cells having an extrachromosomal vector.
  • a commonly used gene transfer method for integrating a transgene into the chromosome of a target cell is the use of a viral vector.
  • the present inventors have confirmed for the first time that when amnion-derived mesenchymal stem cells are subjected to gene transfer of a suicide gene or a suicide gene expression cassette using a viral vector, the cell proliferation ability is reduced and the efficiency of producing genetically modified cells is significantly reduced. Therefore, the present invention is characterized by using a plasmid vector for gene transfer.
  • plasmid vector at least one type of plasmid vector may be used, and two or more types of plasmid vectors may also be used.
  • a plasmid vector having a suicide gene or a suicide gene expression cassette in its structure may be used in combination with a plasmid vector that assists or controls the integration of the suicide gene into the genome of a target cell or the expression of the suicide gene.
  • Methods for introducing a plasmid vector into cells in the present invention include, for example, a method using a cationic lipid, calcium phosphate co-precipitation, diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, a method using a cationic polymer, electroporation, microinjection, a method using a gene gun, a laser, and a method using magnetic nanoparticles.
  • the method for introducing a plasmid vector into cells in the present invention is preferably a method using a cationic lipid, calcium phosphate co-precipitation, diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, a method using a cationic polymer, or electroporation, more preferably a method using a cationic lipid, a method using a cationic polymer, or electroporation, and most preferably electroporation.
  • the gene transfer method using a plasmid vector in the present invention is preferably the transposon method.
  • the transposon method involves introducing into target cells a construct in which a transgene or a transgene expression cassette is located adjacent to a repetitive sequence recognized by a transposase, and then expressing the transposase within the target cells, thereby enabling stable integration of the transgene into the chromosomes of the target cells. This method therefore has a relatively high efficiency of genomic integration of the transgene.
  • the present invention preferably uses two types of plasmid vectors: a plasmid vector having a construct in which a suicide gene or a suicide gene expression cassette is located adjacent to a repetitive sequence recognized by a transposase, and a plasmid vector having a transposase expression cassette.
  • a plasmid vector can be used that contains both a construct in which a suicide gene or a suicide gene expression cassette is placed adjacent to a repeat sequence recognized by the transposase, and a transposase expression cassette.
  • the transgene of the present invention may contain one or more suicide genes, or may contain two or more suicide genes. It may also contain one or more other genes as needed.
  • the other gene or its expression cassette may be introduced before the suicide gene or suicide gene expression cassette, after the suicide gene or suicide gene expression cassette, or simultaneously with the suicide gene or suicide gene expression cassette.
  • the other gene may also be included as a component of the suicide gene expression cassette. In this case, the other gene may be introduced simultaneously with the suicide gene or suicide gene expression cassette.
  • the other genes are not particularly limited as long as they are genes other than suicide genes.
  • Examples include antibiotic resistance genes, reporter genes, tag peptides, genes associated with undifferentiation, and genes associated with cell differentiation.
  • antibiotic resistance genes include genes that confer resistance to puromycin, neomycin, hygromycin, and blasticidin.
  • reporter genes include GFP, EGFP, RFP, Venus, DsRed, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, and luciferase.
  • the tag peptide is not particularly limited as long as it is a short peptide consisting of a dozen to several tens of amino acids that can label proteins, and examples include FLAG, HA, His, and myc.
  • Examples of genes associated with undifferentiation include Nanog, Oct4, Sox2, and Klf4.
  • Examples of genes involved in cell differentiation include Runx2, CBF-1 ⁇ , Sox9, PPAR ⁇ , GATA4, GATA6, and MyoD.
  • the method for introducing genes other than the suicide gene or their expression cassettes may be a method using a viral vector, regardless of whether they are integrated into a chromosome, or a method using a non-viral vector.
  • viral vectors include, but are not limited to, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, baculovirus vectors, vaccinia virus vectors, and herpes simplex virus vectors.
  • Examples of methods using non-viral vectors include, but are not limited to, the transposon method, a method using cationic lipids, calcium phosphate coprecipitation, diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, a method using cationic polymers, electroporation, microinjection, a method using a gene gun, a laser, and a method using magnetic nanoparticles.
  • the introduction of the other gene or its expression cassette is carried out simultaneously with the introduction of the suicide gene or its expression cassette, the introduction of the other gene or its expression cassette is carried out using a method using a non-viral vector, preferably the transposon method.
  • the transgene of the present invention may be operably linked to a promoter, an enhancer, or a combination thereof.
  • the promoter is not particularly limited, but examples include the cytomegalovirus (CMV) promoter, the elongation factor 1 alpha (EF1 ⁇ ) promoter, the simian virus 40 (SV40) promoter, the phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, and the CAG promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • EF1 ⁇ elongation factor 1 alpha
  • SV40 simian virus 40
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • the transgene may be formed by linking two or more genes with a linker.
  • the linker is not particularly limited as long as it is a nucleic acid or peptide that links two or more genes, but examples include IRES (internal ribosome entry site), Ubx-IRES, 2A peptides (P2A, T2A, E2A, F2A, etc.), and GS linkers.
  • the present invention may further comprise a step of selecting genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • Methods for selecting genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells include, for example, methods that utilize other genes (antibiotic resistance genes, reporter genes, tag peptides, etc.) as described above. Specific examples include, but are not limited to, a method in which a gene-transfected cell population is cultured in a medium containing an antibiotic to select cells that express an antibiotic resistance gene, a method in which cells that express a reporter gene are selected using a cell sorter, and a method in which cells that express a tag peptide are separated by chromatography using an antibody that binds to the tag peptide. Furthermore, two or more selection methods can be combined.
  • the cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell population containing one or more genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells, and may also be a population containing genetically unmodified amnion-derived mesenchymal stem cells or other cells.
  • the proportion of genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells in the cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells is, without particular limitation, for example, 0.01% or more, 0.1% or more, 1% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, or 95% or more.
  • the present invention may further include a step of culturing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • the medium used in the step of culturing a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells can be prepared by using any liquid medium for animal cell culture as a basal medium and adding other components as needed. Examples of such other components include, but are not limited to, albumin, serum, serum replacement reagents, platelet lysate, cytokines, and antibiotics. Two or more types of other components may also be added in combination.
  • the basal medium includes, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM (Alpha Modification of Minimum Essential Medium Ea Media that can be used include, but are not limited to, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), Ham's F10 medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixtures thereof (e.g., DMEM/F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham)).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Ham's F10 medium Ham's F12 medium
  • RPMI 1640 medium RPMI 1640 medium
  • Fischer's medium e.g., DMEM/F12 medium (Dulbe
  • the seeding density in the step of culturing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells is not particularly limited.
  • cells can be seeded at a density of 500 to 100,000 cells/ cm2 .
  • the lower limit of the seeding density is preferably, for example, 500 cells/ cm2 or more, 1,000 cells/ cm2 or more, 2,000 cells/ cm2 or more, 3,000 cells/ cm2 or more, 4,000 cells/ cm2 or more, or 5,000 cells/cm2 or more .
  • the upper limit of the seeding density is generally 100,000 cells/ cm2 or less.
  • the step of culturing the cell population containing the genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells may include a passaging step, or may include a step of repeating culture multiple times under different culture conditions.
  • the culture step may include a step of changing the culture medium during the culture period.
  • the new culture medium may have the same composition as the original culture medium, or it may have a different composition.
  • the frequency of changing the culture medium is not particularly limited. For example, it may be every 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, or 7 days.
  • the confluence rate after the step of culturing the cell population containing the genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells is not particularly limited. From the perspective of obtaining a larger number of cells, it is, for example, 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. Other examples include 1% or more, 10% or more, 30% or more, and 100%.
  • the present invention may further include a step of recovering the cells cultured in the culturing step.
  • the method for recovering the cultured cells is not particularly limited, but may be performed, for example, as follows. First, cells cultured to a predetermined confluence are treated with a cell detachment means to detach them from the culture vessel. Next, the obtained cell suspension is centrifuged, the supernatant is removed, and the obtained cell pellet is suspended in culture medium or any solvent. If necessary, the method may further include a step of centrifuging the cell suspension and washing it with a washing solution.
  • a cell detachment agent may be used as the cell detachment means.
  • the cell detachment agent There are no particular limitations on the cell detachment agent, as long as it has the ability to detach adherent cells from the culture vessel, and examples include trypsin, collagenase, dispase, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), etc.
  • Commercially available cell detachment agents may also be used. Examples include, but are not limited to, trypsin-EDTA solution (manufactured by Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (manufactured by Thermo Fisher Scientific), Accutase (manufactured by Stemcell Technologies), and Accumax (manufactured by Stemcell Technologies).
  • a physical cell detachment means may be used as the cell detachment means, such as, but not limited to, a cell scraper (manufactured by Corning). The cell detachment means may be used alone or in
  • the washing solution is not particularly limited, but from the viewpoint of reducing damage to cells, a buffer solution or an isotonic solution is preferable.
  • a buffer solution or an isotonic solution examples include, but are not limited to, PBS, HBSS(-), Ringer's solution, lactated Ringer's solution, glucose solution, various infusion solutions, physiological saline solution, culture medium, basal medium, albumin solution, blood-derived components, and mixtures thereof.
  • the present invention may further include a step of cryopreserving the cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells recovered via the recovery step.
  • the means for cryopreservation is not particularly limited. Examples include cryopreservation using a programmed freezer, a deep freezer, and cryopreservation in liquid nitrogen.
  • the freezing temperature is preferably -30°C or below, -40°C or below, -50°C or below, -80°C or below, -90°C or below, -100°C or below, -150°C or below, -180°C or below, or -196°C (liquid nitrogen temperature) or below.
  • the freezing rate is preferably, for example, 15°C/min or below, 11°C/min or below, 10°C/min or below, 9°C/min or below, 5°C/min or below, 2°C/min or below, or 1°C/min or below.
  • a programmable freezer is used as the above-mentioned cryopreservation method, it is preferable to set the freezing rate to be at least 1°C/min and no more than 2°C/min between room temperature and -10°C, and then change the cooling rate appropriately outside of that range to ultimately reach the desired freezing temperature (for example, -80°C to -150°C).
  • liquid nitrogen when used as the above-mentioned freezing method, the temperature can be rapidly lowered to, for example, -196°C to freeze the sample, and then the sample can be stored in liquid nitrogen (gas phase). It is also possible to store the sample in liquid nitrogen (liquid phase).
  • the cells may be frozen in any storage container.
  • storage containers include, but are not limited to, cryotubes, cryovials, freezing bags, and infusion bags.
  • the cells When freezing using the above-mentioned freezing methods, the cells may be frozen in any cryopreservation solution.
  • a commercially available cryopreservation solution may be used as the cryopreservation solution. Examples include, but are not limited to, BAMBANKER (manufactured by Lymphotec), STEM-CELLBANKER (manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), CP-1 (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Industries Co., Ltd.), ReproCryo RM (manufactured by ReproCell), CryoNovo (manufactured by Akron Biotechnology), MSC Freezing Solution (manufactured by Biological Industries), and CryoStor (manufactured by HemaCare).
  • BAMBANKER manufactured by Lymphotec
  • STEM-CELLBANKER manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • CP-1 manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Industries
  • the cryopreservation solution may contain a predetermined concentration of polysaccharides.
  • Preferred polysaccharide concentrations are, for example, 1% by mass or more, 2% by mass or more, 4% by mass or more, or 6% by mass or more.
  • preferred polysaccharide concentrations are, for example, 20% by mass or less, 18% by mass or less, 16% by mass or less, 14% by mass or less, or 13% by mass or less.
  • Examples of polysaccharides include, but are not limited to, hydroxyethyl starch (HES) and dextran (Dextran 40, etc.).
  • the cryopreservation solution may contain a predetermined concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a preferred concentration of DMSO is, for example, 1% by mass or more, 2% by mass or more, 3% by mass or more, 4% by mass or more, or 5% by mass or more.
  • a preferred concentration of DMSO is, for example, 20% by mass or less, 18% by mass or less, 16% by mass or less, 14% by mass or less, 12% by mass or less, or 10% by mass or less.
  • the cryopreservation solution may contain albumin at a predetermined concentration greater than 0% by mass.
  • Preferred albumin concentrations are, for example, 1% by mass or more, 2% by mass or more, 3% by mass or more, or 4% by mass or more.
  • preferred albumin concentrations are, for example, 30% by mass or less, 20% by mass or less, 10% by mass or less, or 9% by mass or less.
  • examples of albumin include, but are not limited to, bovine serum albumin (BSA), mouse albumin, and human albumin.
  • [3] Cell preparation comprising gene-transfected amnion-derived mesenchymal stem cells
  • a cell preparation comprising amnion-derived mesenchymal stem cells transfected with a suicide gene or a suicide gene expression cassette.
  • the cell preparation of the present invention contains, as an active ingredient, amnion-derived mesenchymal stem cells transfected with a suicide gene or a suicide gene expression cassette, and optionally contains pharmaceutically acceptable solvents and/or other additives.
  • the active ingredient may be a component of a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells produced by the production method described in [2] Method for producing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • the amount of the active ingredient contained is not particularly limited and can be determined appropriately depending on the dosage form of the cell preparation, the type of solvent or carrier, the dosage, the number of administrations, the administration route, the purpose of use, and the age, weight, and symptoms of the patient or subject.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • examples include water, saline, isotonic solutions containing glucose or other adjuvants, phosphate buffer, and sodium acetate buffer.
  • examples of the other adjuvants include D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, low-concentration nonionic surfactants, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters.
  • the other additives are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable additives. Examples include excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow regulators, lubricants, human serum albumin, and prodrugs.
  • the cell preparation of the present invention may be used in combination with a prodrug.
  • the prodrug may be administered to the subject before the cell preparation, simultaneously with the cell preparation, or after the cell preparation.
  • the cell preparations of the present invention are useful for treating, for example, cancer, immune-related diseases, ischemic diseases, lower limb ischemia, cerebrovascular ischemia, renal ischemia, pulmonary ischemia, neurological diseases, graft-versus-host disease (GVHD), inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, radiation enteritis, systemic lupus erythematosus, lupus erythematosus, collagen diseases, stroke, cerebral infarction, intracerebral hematoma, cerebrovascular plegia, liver cirrhosis, atopic dermatitis, multiple sclerosis, psoriasis, epidermolysis bullosa, diabetes, mycosis fungoides (Alibert-Bazin syndrome),
  • the cell preparation of the present invention can be used as a therapeutic agent for diseases selected from the group consisting of scleroderma, diseases caused by degeneration and/or inflammation of connective tissues such as cartilage, articul
  • cancers include squamous cell carcinoma, lung cancer, peritoneal cancer, mesothelioma, colon cancer, bile duct tumor, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, bronchial cancer, oral cancer, osteosarcoma, soft tissue sarcoma, gallbladder cancer, kidney cancer, leukemia, bladder cancer, melanoma, brain cancer, glioma, brain tumor, skin cancer, pancreatic cancer, breast cancer, liver cancer, bone marrow cancer, esophageal cancer, colon cancer, gastric cancer, cervical cancer, endometrial cancer, prostate cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, rectal cancer, and testicular cancer.
  • the cell preparation of the present invention can preferably be used as a therapeutic agent for brain tumors.
  • the method of administration of the cell preparation of one or more embodiments of the present invention is not particularly limited. Examples include subcutaneous injection, intralymph node injection, intravenous injection, intraperitoneal injection, intrathoracic injection, direct local injection, and direct local transplantation.
  • the cell preparation of one or more embodiments of the present invention can also be used as an injectable preparation, a transplant preparation in the form of a cell mass or sheet-like structure, or a gel preparation mixed with any gel.
  • Patients or subjects targeted by the cell preparations of one or more embodiments of the present invention are typically humans, but may also be other animals.
  • Examples of other animals include mammals such as monkeys, cows, horses, dogs, cats, pigs, sheep, mice, rats, and rabbits, and birds such as parakeets, parrots, and chickens.
  • the present invention provides a cancer treatment kit comprising: (i) a cell population comprising amnion-derived mesenchymal stem cells transfected with a suicide gene or an expression cassette for the suicide gene; and (ii) a prodrug.
  • the cancer treatment kit of the present invention is manufactured for the purpose of administering a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells transfected with a suicide gene or a suicide gene expression cassette in combination with a prodrug.
  • the kit is manufactured so that a subject requiring treatment can be administered a suicide gene or a cell population containing amnion-derived mesenchymal stem cells transfected with a suicide gene or a suicide gene expression cassette before, simultaneously with, or after the administration of a prodrug, or in a combination of two or more of these.
  • the cell population may be a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells produced by the production method described in [2] Method for producing a cell population containing genetically modified amnion-derived mesenchymal stem cells.
  • the subject is typically a human, but may be another animal. Examples of other animals include mammals such as monkeys, cows, horses, dogs, cats, pigs, sheep, mice, rats, and rabbits, as well as birds such as parakeets, parrots, and chickens.
  • the subject is preferably a mammal, including a human, and more preferably a patient in need of cancer treatment. Patients in need of cancer treatment include patients currently undergoing cancer treatment, patients who have previously undergone cancer treatment, and patients who need to undergo cancer treatment, and may also include patients who have undergone surgery to remove cancer as part of cancer treatment.
  • the cancer is similar to the cancer described in "Cell preparation containing gene-transfected amnion-derived mesenchymal stem cells” in [3].
  • the cancer treatment kit of the present invention may be composed of a first compartment and a second compartment, the first compartment containing a cell population including amnion-derived mesenchymal stem cells transfected with a suicide gene or a suicide gene expression cassette, and the second compartment containing a prodrug.
  • the kit may contain each of the components in a single container, each divided into a single dose, or in several different small containers.
  • kit of the present invention may also include equipment necessary for use and instruction materials describing how to administer each component.
  • the lentiviral vector-containing solution carrying the Venus expression cassette was prepared as follows. First, a nucleic acid sequence in which the Venus gene was linked under the control of a CMV promoter was introduced into a lentiviral vector construction plasmid to create a lentiviral vector construction plasmid carrying a Venus expression cassette. This plasmid and a lentiviral packaging plasmid were transfected into Lenti-X 293T (Takara Bio Inc.), a lentiviral packaging cell line, using Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), and the cells were cultured for 48 hours. The Lenti-X 293T culture supernatant was then collected and filtered through a 0.8 ⁇ m filter to prepare a lentiviral vector-containing solution carrying a Venus expression cassette.
  • Lenti-X 293T Takara Bio Inc.
  • Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific
  • the lentiviral vector-containing solution carrying the HSV-TK expression cassette was prepared as follows. First, the HSV-TK gene was placed under the control of the EF-1 ⁇ promoter. Furthermore, a nucleic acid sequence in which the Venus gene was linked downstream of the HSV-TK gene via an IRES was introduced into a lentiviral vector construction plasmid to create a lentiviral vector construction plasmid carrying the HSV-TK expression cassette. Linking the Venus gene downstream of the HSV-TK gene via an IRES enabled HSV-TK-expressing cells to be identified by the Venus fluorescent signal.
  • This plasmid and a lentiviral packaging plasmid were transfected into the lentiviral packaging cell line Lenti-X 293T (Takara Bio) using Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) and the cells were cultured for 48 hours.
  • the Lenti-X 293T culture supernatant was then collected and filtered through a 0.8 ⁇ m filter to prepare a solution containing a lentiviral vector carrying an HSV-TK expression cassette.
  • HSV-TK-expressing amniotic MSCs To mass-produce HSV-TK-expressing amniotic MSCs, we attempted to expand the HSV-TK-expressing amniotic MSCs contained in the recovered cell population containing HSV-TK-expressing amniotic MSCs. Specifically, the recovered cell population containing HSV-TK-expressing amniotic MSCs was seeded at a seeding density of 10,000 cells/ cm2 into a T25 flask (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured in ⁇ -MEM containing a final concentration of 5% human platelet lysate.
  • Example 1 Preparation of HSV-TK-expressing amniotic MSCs using the transposon method
  • the Venus gene was first introduced into amniotic MSCs using a lentiviral vector to improve the visibility of the HSVTK-expressing amniotic MSCs.
  • a cell population containing Venus-expressing amniotic MSCs was collected using the same method as in Comparative Example 1, and Venus-expressing amniotic MSCs were selected and collected using a cell sorter FACSAriaIII (BD) using the fluorescent signal as an indicator.
  • BD cell sorter FACSAriaIII
  • Venus-expressing amniotic MSCs were seeded at a density of 10,000 cells/ cm2 onto 15-cm dishes (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured for 3 days in ⁇ -MEM containing a final concentration of 5% human platelet lysate. After culture, the cells were detached using TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific), diluted with medium, and collected by centrifugation.
  • the collected cells were transfected with a plasmid vector containing a construct in which an HSV-TK expression cassette was placed adjacent to a repeat sequence recognized by the transposase, and a plasmid vector containing a transposase expression cassette (a total of two plasmid vectors).
  • the construct placed the HSV-TK gene under the control of the EF-1 ⁇ promoter, and further placed a repeat sequence recognized by transposase on both ends of an expression cassette in which a puromycin resistance gene was linked downstream of the HSV-TK gene via T2A. Linking the puromycin resistance gene downstream of the HSV-TK gene via T2A made it possible to select HSV-TK-expressing cells by drug selection.
  • the cells were seeded into a T75 flask and cultured for 24 hours. Puromycin was then added at a final concentration of 1 ⁇ g/mL, and the cells were further cultured.
  • the cell culture status was observed under a microscope using bright field observation ( ⁇ 40 magnification, 1/25 second exposure time) and green fluorescence observation ( ⁇ 40 magnification, 3 second exposure time) ( Figure 3A).
  • the cell culture status was again observed under a microscope using bright field observation ( ⁇ 40 magnification, 1/25 second exposure time) and green fluorescence observation ( ⁇ 40 magnification, 1 second exposure time) ( Figure 3B).
  • the bright field and green fluorescence observation images showed an increase in HSV-TK-expressing cells resistant to puromycin, indicating the proliferation of HSV-TK-expressing amniotic membrane MSCs within the seeded cell population.
  • amniotic membrane MSCs transduced with HSV-TK using a viral vector exhibit inhibited proliferation
  • amniotic membrane MSCs transduced with HSV-TK using a plasmid vector via the transposon method can be efficiently produced without a decrease in proliferation ability.
  • Example 2 Evaluation of the anticancer effect of HSV-TK-expressing amniotic MSCs generated using the transposon method on brain tumors.
  • An experiment was conducted to confirm the anticancer effect of HSVTK-expressing amniotic MSCs (TK-AMSCs), generated using the transposon method for gene transfer of an HSV-TK expression cassette, on brain tumors.
  • TK-AMSCs were generated using the method described in Example 1 and selected using puromycin resistance as an indicator. They were then detached and collected using the same method as in Comparative Example 1.
  • TK-AMSCs were seeded at a seeding density of 1,000 cells/ cm2 onto a 15 cm dish (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured for 7 days in ⁇ -MEM containing a final concentration of 5% human platelet lysate. After culturing, TK-AMSCs were detached and collected in the same manner as in Comparative Example 1. 2 x 10 6 cells of TK-AMSCs were suspended in 50 ⁇ L of physiological saline containing 50% Matrigel (manufactured by Corning Incorporated) to prepare a TK-AMSC administration solution.
  • U-87MG a human brain tumor-derived cell line
  • TK-AMSC administration solution and/or U-87MG administration solution were subcutaneously transplanted into the right flank of 5-week-old immunodeficient nude mice (Balb/c-nu/nu).
  • ganciclovir GCV was administered intraperitoneally once daily at a dose of 50 mg/kg for 7 days.
  • tumor volume (mm 3 ) long diameter (mm) ⁇ short diameter (mm) ⁇ short diameter (mm) ⁇ 2) and graphed ( Figure 4).
  • tumor growth was significantly suppressed in the experimental group that received TK-AMSC transplantation and GCV administration treatment (TK-AMSC(+), GCV(+)) compared to the untreated group (TK-AMSC(-), GCV(-)) and the experimental group that received ganciclovir administration treatment only (TK-AMSC(-), GCV(+)).

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Abstract

本発明は、自殺遺伝子を羊膜由来間葉系幹細胞に導入し、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞の製造方法を提供することを課題とする。　羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団に、トランスポゾン法等のプラスミドベクターを用いる方法により自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入する工程を含む、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。

Description

遺伝子修飾された間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
　本発明は、遺伝子修飾された間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
　癌は、世界的に患者数及び死者数の多い疾患であり、年間数百万人が、癌が原因で死亡している。癌は発生する臓器や発生源となる細胞によって様々な種類に分けられる。その中には未だに既存療法では治療効果が乏しいものもあり、新規治療法の研究が盛んに行なわれている。
　悪性脳腫瘍は、生命予後が特に悪い癌の一つである。悪性脳腫瘍に対する既存の治療法としては、外科的手術による腫瘍摘出とその後の放射線治療、及び／又は薬物治療が標準とされる。しかしながら、脳腫瘍の種類や発生箇所によっては外科的手術で腫瘍を摘出しきれない場合が多く、放射線治療や薬物治療を施しても癌細胞が残存し再発することが多い。癌細胞に対する標的性をさらに高めた新たな悪性脳腫瘍の治療法が求められている。
　間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄、羊膜等に存在することが報告されている体性幹細胞である。間葉系幹細胞は免疫抑制作用を有しており、他家移植も可能であることから、細胞治療における有望な細胞ソースとして注目されており、実際に、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）や脊髄損傷等に対する実用化が進んでいる。さらに、間葉系幹細胞は生体内で癌病変に対して特異的に遊走し集積する性質を有することが知られており、標的性を高めたがん治療法として間葉系幹細胞を利用する研究が進められている。
　間葉系幹細胞を利用した癌治療法としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）等の自殺遺伝子を遺伝子導入することで抗癌機能を付与した間葉系幹細胞を用いる方法がある。この際の遺伝子導入方法には、遺伝子導入効率や遺伝子発現の安定性の観点から、ウイルスベクターを用いる方法が一般的である。例えば、非特許文献１には、脂肪組織由来間葉系幹細胞にＨＳＶ－ＴＫをレンチウイルスベクターにより遺伝子導入し、目的の細胞を製造する方法が記載されている。一方で、人工多能性幹細胞や歯髄幹細胞に自殺遺伝子をウイルスベクターにより遺伝子導入すると、細胞毒性を示し自殺遺伝子導入細胞の増殖能が低下する場合があることが報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。
　羊膜由来間葉系幹細胞は、帝王切開分娩後の医療廃棄物として扱われる羊膜を原料とするために細胞の採取に新たなドナーの侵襲を伴わない点、胎児由来組織である羊膜を原料とするために細胞特性のドナー間差が小さい点、１ドナーの羊膜から多数の間葉系幹細胞を取得できる点を特長とする。これらの特長から、羊膜由来間葉系幹細胞は、様々な組織由来間葉系幹細胞の中でも特に細胞医療材料として優れており、癌治療分野において利用することで、低コストかつ品質の安定した細胞医療の提供が期待できる。
de Melo SM, et al. The Anti-Tumor Effects of Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cell Transduced with HSV-Tk Gene on U-87-Driven Brain Tumor. PLoS One. 2015 Jun 12;10(6): e0128922. Iwasawa C, et al. Increased Cytotoxicity of Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2019 Feb 14;20(4):810. Oishi T, et al. Efficacy of HSV-TK/GCV system suicide gene therapy using SHED expressing modified HSV-TK against lung cancer brain metastases. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 Jul 6:26:253-265.
　本発明者らは、最初に、遺伝子導入効率が高いことで知られている手法としてレンチウイルスベクターを用いて羊膜由来間葉系幹細胞に自殺遺伝子の遺伝子導入を行った。その結果、細胞毒性により遺伝子導入細胞の増殖能が著しく低下し、目的の細胞を製造できないことがわかった。そこで、本発明の課題は、自殺遺伝子を導入した羊膜由来間葉系幹細胞の増殖能を大きく低下させることなく、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を製造する方法を提供することである。
　本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった。その結果、驚くべきことに、自殺遺伝子を遺伝子導入する際にトランスポゾン法等のプラスミドベクターを用いた場合、遺伝子導入細胞は、細胞毒性による増殖能の著しい低下を起こさなかった。それにより、自殺遺伝子を安定発現する羊膜由来間葉系幹細胞の製造が可能となることを見出し、本発明の完成に至った。
　すなわち、本発明は、下記［１］～［１０］に関する。
［１］羊膜由来間葉系幹細胞に、プラスミドベクターを用いて自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入する工程を含む、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
［２］前記プラスミドベクターが、エレクトロポレーション法により細胞内に導入される、［１］に記載の製造方法。
［３］前記遺伝子導入工程で、前記自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを染色体に組み込む、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記遺伝子導入工程において、前記自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットをトランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトを含むプラスミドベクターとトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドベクターの２種類のプラスミドベクターを用いる、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記遺伝子導入工程において、前記自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットをトランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトとトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドベクターを用いる、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子又はシトシンデアミナーゼ遺伝子である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子である、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法により製造される遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤。
［９］羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤であって、前記羊膜由来間葉系幹細胞が、（ｉ）自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセット、及び（ｉｉ）トランスポザーゼが認識する反復配列が染色体に組み込まれている、細胞製剤。
［１０］前記細胞製剤がプロドラッグと組み合わせて使用される、［８］又は［９］に記載の細胞製剤。
［１１］前記プロドラッグがガンシクロビル又は５－フルオロシトシンである、［１０］に記載の細胞製剤。
［１２］前記プロドラッグがガンシクロビルである、［１１］に記載の細胞製剤。
［１３］前記細胞製剤が癌治療用である、［８］～［１２］のいずれかに記載の細胞製剤。
［１４］前記細胞製剤が脳腫瘍治療用である、［１３］に記載の細胞製剤。
［１５］（ｉ）［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法により製造される遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団及び（ｉｉ）プロドラッグを含む癌治療用キット。
［１６］［９］に記載の細胞製剤、及びプロドラッグを含む癌治療用キット。
［１７］前記プロドラッグがガンシクロビル又は５－フルオロシトシンである、［１５］に記載の癌治療用キット。
［１８］前記プロドラッグがガンシクロビルである、［１６］に記載の癌治療用キット。
［１９］前記癌が脳腫瘍である、［１５］～［１８］のいずれかに記載のキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2024-037914号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、細胞増殖能を低下させることなく、自殺遺伝子を発現する羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造することができる。
比較例１における、レンチウイルスベクターを用いて作製したＶｅｎｕｓ発現羊膜由来間葉系幹細胞の顕微鏡下における明視野観察結果、及び蛍光観察結果である。（Ａ）培養３日目、（Ｂ）培養１０日目。 比較例２における、レンチウイルスベクターを用いて作製したＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜由来間葉系幹細胞の顕微鏡下における明視野観察結果、及び蛍光観察結果である。（Ａ）培養３日目、（Ｂ）培養１０日目。 実施例１における、トランスポゾン法を用いて作製したＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜由来間葉系幹細胞の顕微鏡下における明視野観察結果、及び蛍光観察結果である。（Ａ）培養３日目、（Ｂ）培養１０日目。 実施例２における、トランスポゾン法を用いて作製したＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜由来間葉系幹細胞の生体内における抗癌効果を腫瘍体積の経時推移で評価した結果である。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　［１］用語の説明
　（羊膜由来間葉系幹細胞）
　本明細書における「羊膜由来間葉系幹細胞」とは、羊膜から採取することができる、下記の定義を満たす幹細胞のことをいう。
　ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。
　ｉｉ）表面抗原のＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６が陰性である。
　ここでいう「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜のことを指し、上皮羊膜上皮層（上皮組織）、基底膜及び緻密層（間質組織）を含む。本明細書における「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」には、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ)」も含まれる。本明細書における羊膜の由来は特に限定されず、任意の生物に由来することができる。前記生物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、及びウサギ等の哺乳類、インコ、オウム、及びニワトリ等の鳥類が挙げられる。本明細書における羊膜は、好ましくは、ヒト、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、又はウサギ由来であり、より好ましくはヒト、サル、イヌ、又はネコ由来であり、さらに好ましくはヒト由来である。
　（間葉系幹細胞を含む細胞集団）
　本明細書における「間葉系幹細胞を含む細胞集団」とは、間葉系幹細胞を１細胞以上含む、１細胞以上で構成される細胞の集合体のことをいう。その形態は特に限定されず、例えば、組織、組織片、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞シート、細胞浮遊液、細胞懸濁液、及びこれらの凍結物等が挙げられる。
　（自殺遺伝子）
　本明細書における「自殺遺伝子」とは、プロドラッグを細胞毒性物質に変換する働きを有するタンパク質をコードする遺伝子であり、当該遺伝子を発現した細胞において、プロドラッグ存在下で細胞死を誘導する遺伝子のことをいう。自殺遺伝子は、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、シトクロムＰ４５０遺伝子、大腸菌ＧＰＴ遺伝子、リナマラーゼ遺伝子、ホースラディッシュペルオキシダーゼ遺伝子、カルボキシペプチダーゼＡ遺伝子、及びカルボキシペプチダーゼＧ２遺伝子等が挙げられる。本明細書における自殺遺伝子は、好ましくは、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子又はＣＤ遺伝子であり、より好ましくは、ＨＳＶ－ＴＫである。
　本明細書における「プロドラッグ」は、使用する自殺遺伝子により細胞毒性を有する抗癌物質に転換され得る前駆薬物であれば特に限定されない。例えば、ガンシクロビル、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）、６－メトキシプリンアラビノシド（６－ｍｅｔｈｏｘｙｐｕｒｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、ＣＢ１９５４、６－メチルプリンデオキシリボシド（６－ｍｅｔｈｙｌｐｕｒｉｎｅ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ）、Ｄａｕｎ０２、シクロホスファミド、イホスファミド、及びＺＤ－２７６７Ｐ等が挙げられる。プロドラッグは自殺遺伝子との組み合わせが重要であり、例えばガンシクロビルはＨＳＶ－ＴＫ遺伝子との組み合わせで、５－ＦＣはＣＤ遺伝子との組み合わせで、６－メトキシプリンアラビノシドは水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子との組み合わせで、ＣＢ１９５４はニトロレダクターゼ遺伝子との組み合わせで、そして６－メチルプリンデオキシリボシドはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子との組み合わせで、それぞれ抗癌物質に転換され得る。本明細書におけるプロドラッグは、好ましくは、ガンシクロビル又は５－ＦＣであり、より好ましくは、ガンシクロビルである。
　（発現カセット）
　本明細書における「発現カセット」とは、１種類以上の遺伝子を含み、前記遺伝子の発現を制御する１以上の核酸領域を任意で含む、前記遺伝子の発現単位を包含する核酸領域の集合体のことをいう。遺伝子の発現を制御する核酸領域としては、特に限定されない。例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡシグナル、及びリンカー等が挙げられる。
　（遺伝子導入）
　本明細書における「遺伝子導入」とは、細胞等の対象物に、人為的に核酸を導入することをいう。遺伝子導入の方法としては、一般的にウイルスベクターを用いる方法又は非ウイルスベクターを用いる方法が挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。非ウイルスベクターとしては、例えばプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターを用いた遺伝子導入方法としては、例えば、トランスポゾン法、陽イオン性脂質を用いた方法、リン酸カルシウム共沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）ーデキストラン法、陽イオン性ポリマーを用いた方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクションクション法、遺伝子銃を用いた方法、レーザーを用いた方法、及び磁性ナノ粒子を用いた方法等が挙げられる。
　本発明における「エレクトロポレーション法」とは、細胞に電気パルスを当てることで一時的に細胞膜に孔を形成し、孔を介してプラスミドベクター等の核酸を細胞内に送達する遺伝子導入法をいう。本明細書における「エレクトロポレーション法」には、「電気穿孔法」も含まれる。
　本明細書における「トランスポゾン法」は、トランスポザーゼ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）とトランスポザーゼが認識する特定の反復配列の組み合わせによる遺伝子転移の機構を利用した遺伝子導入方法をいう。前記トランスポザーゼは、特に限定されない。例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、Ｆｒｏｇ　Ｐｒｉｎｃｅ、及びＨｉｍａｒＩ等が挙げられる。本明細書における「トランスポゾン」には、「ＤＮＡトランスポゾン」及び「レトロトランスポゾン」も含まれる。
　（遺伝子修飾された）
　本明細書における「遺伝子修飾された」細胞とは、人為的に導入された核酸を有している細胞をいう。
　（羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤）
　本明細書における「羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤」とは、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系細胞を１細胞以上含む、生体外で調製される組成物のことをいう。その形態は特に限定されず、例えば、細胞浮遊液、細胞懸濁液、細胞ペレット、細胞凝集塊、シート、シール剤、及びこれらの凍結物等が挙げられる。
　本明細書における「癌」は、特に限定されない。例えば、扁平上皮癌、肺癌、腹膜癌、中皮腫、結腸癌、胆管腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、軟部肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髄癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、直腸癌、及び精巣癌等が含まれる。本明細書における「癌」は、「がん」、「腫瘍」、及び「悪性腫瘍」を含む。
　［２］遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法
　本発明の一以上の実施形態では、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法を提供する。本発明における遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、羊膜由来間葉系幹細胞に、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入する工程を含む製造方法である。
　本発明における遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造の原料となる羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団は、羊膜由来間葉系幹細胞を１細胞以上含む細胞集団であれば特に限定されず、他の細胞を含む集団であってもよい。特に限定されない。前記羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団における羊膜由来間葉系幹細胞の比率は、例えば、０．１％以上、１％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、及び９５％以上である。
　本発明における羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団は、前培養操作の有無、及び凍結操作の有無を問わない。具体的には、個体から採取した組織又は細胞、又はこれらの凍結物であってもよいし、個体から採取した組織又は細胞の培養物、又はこれらの凍結物であってもよい。
　本発明は、羊膜を酵素処理することにより、原料となる羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を取得する、細胞集団取得工程を含むものでもよい。前記細胞集団取得工程は、羊膜を帝王切開により取得する工程をさらに含む工程でもよい。
　本発明の一以上の実施形態によれば、羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法は、好ましくは、羊膜を含む試料を酵素処理して得た細胞集団である。前記酵素処理は、好ましくは、上皮細胞層を分解することなく羊膜の細胞外基質層に含まれる間葉系幹細胞を遊離することができる酵素による処理である。前記活性を有する酵素としては、例えば、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及びディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。また、前記活性を有する酵素を２種類以上組み合わせて使用してもよい。
　本発明は、羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含んでもよい。この時の羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の培養方法は、後述する遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の培養方法と同様の方法を用いることができる。
　本発明は、羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団に含まれる羊膜由来間葉系幹細胞に、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入する工程を含む。自殺遺伝子導入細胞の製造効率の観点から、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットは、遺伝子修飾された細胞の染色体に組み込まれることが好ましい。これにより、染色体外ベクターを有する遺伝子修飾された細胞と比べて、遺伝子修飾された細胞をより安定的に産生することが可能となる。
　導入遺伝子を標的細胞の染色体に組み込む遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを用いる方法が一般的に用いられる。ところが、羊膜由来間葉系幹細胞は、ウイルスベクターを用いる方法により自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入を施すと、細胞増殖能が低下し、遺伝子修飾された細胞の製造効率が著しく低下することが本発明者により初めて確認された。そのため、本発明では、プラスミドベクターを用いて遺伝子導入を施すことを特徴とする。
　本発明におけるプラスミドベクターは、少なくとも１種類のプラスミドベクターを用いればよく、２種類以上のプラスミドベクターを用いてもよい。特に限定されない。例えば、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを構造に持つプラスミドベクターと、自殺遺伝子の標的細胞ゲノムへの組み込みや自殺遺伝子の発現を補助又は制御するプラスミドベクターを組み合わせて用いてもよい。
　本発明におけるプラスミドベクターの細胞内への導入方法は、例えば、陽イオン性脂質を用いた方法、リン酸カルシウム共沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）―デキストラン法、陽イオン性ポリマーを用いた方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクションクション法、遺伝子銃を用いた方法、レーザーを用いた方法、及び磁性ナノ粒子を用いた方法等が挙げられる。本発明におけるプラスミドベクターの細胞内への導入方法は、導入効率及び操作の簡便性の観点から、好ましくは、陽イオン性脂質を用いた方法、リン酸カルシウム共沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）―デキストラン法、陽イオン性ポリマーを用いた方法、又はエレクトロポレーション法であり、さらに好ましくは陽イオン性脂質を用いた方法、陽イオン性ポリマーを用いた方法、又はエレクトロポレーション法であり、最も好ましくはエレクトロポレーション法である。
　本発明におけるプラスミドベクターを用いた遺伝子導入方法は、好ましくはトランスポゾン法である。トランスポゾン法は、導入遺伝子又は導入遺伝子の発現カセットをトランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトを標的細胞に導入し、さらに標的細胞内でトランスポザーゼを発現させることで、導入遺伝子が標的細胞の染色体に安定的に組み込まれ得るため、導入遺伝子のゲノム組み込み効率が比較的高い遺伝子導入方法である。羊膜由来間葉系幹細胞に自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入を施す際にトランスポゾン法を用いると、驚くべきことに、ウイルスベクターを用いた場合に起こる細胞増殖能の低下が起こらず、効率的に遺伝子修飾された細胞を製造することが可能となる。したがって、本発明は、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットをトランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトを構造に持つプラスミドベクターと、トランスポザーゼ発現カセットを構造に持つプラスミドベクターの２種類のプラスミドベクターを用いることが好ましい。又は、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットをトランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトとトランスポザーゼ発現カセットの双方を構造に持つプラスミドベクターを用いることもできる。
　本発明における導入遺伝子は、１種類以上の自殺遺伝子を含んでいればよく、２種類以上の自殺遺伝子を含んでもよい。また、必要に応じて１種類以上の他の遺伝子を含んでもよい。
　前記他の遺伝子又はその発現カセットの遺伝子導入は、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入の前に施されてもよく、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入の後に施されてもよく、又は自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入と同時に施されてもよい。また、前記他の遺伝子は、自殺遺伝子の発現カセットに構成要素として含まれていてもよい。この時、他の遺伝子の遺伝子導入は自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入と同時に施され得る。
　前記他の遺伝子としては、自殺遺伝子以外の遺伝子であれば特に限定されない。例えば、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子、タグペプチド、未分化性に関わる遺伝子、及び細胞分化に関わる遺伝子等が挙げられる。前記抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ピューロマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びブラストサイジン等に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。前記レポーター遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ、及びルシフェラーゼ等が挙げられる。前記タグペプチドとしては、タンパク質を標識化することのできる十数アミノ酸～数十アミノ酸からなる短ペプチドであれば特に限定されず、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｈｉｓ、及びｍｙｃ等が挙げられる。前記未分化性に関わる遺伝子としては、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４等が挙げられる。前記細胞分化に関わる遺伝子としては、例えば、Ｒｕｎｘ２、ＣＢＦ－１α、Ｓｏｘ９、ＰＰＡＲγ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、及びＭｙｏＤ等が挙げられる。
　前記自殺遺伝子以外の他の遺伝子又はその発現カセットの遺伝子導入方法は、染色体への組み込みの有無を問わず、ウイルスベクターを用いる方法でもよく、非ウイルスベクターを用いる方法でもよい。前記ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルスベクター等が挙げられるが、特に限定されない。前記非ウイルスベクターを用いる方法としては、例えば、トランスポゾン法、陽イオン性脂質を用いた方法、リン酸カルシウム共沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）ーデキストラン法、陽イオン性ポリマーを用いた方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクションクション法、遺伝子銃を用いた方法、レーザーを用いた方法、及び磁性ナノ粒子を用いた方法等が挙げられるが、特に限定されない。なお、前記他の遺伝子又はその発現カセットの遺伝子導入が自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットの遺伝子導入と同時に施される場合は、他の遺伝子又はその発現カセットの遺伝子導入は、非ウイルスベクターを用いる方法により施され、好ましくはトランスポゾン法により施される。
　本発明における導入遺伝子は、プロモーター、エンハンサー又はこれらの組み合わせが作動可能に連結されていてもよい。前記プロモーターは、特に限定されないが、例えば、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子遺伝子（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　１　ａｌｐｈａ；ＥＦ１α）プロモーター、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０；ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ；ＰＧＫ）プロモーター、及びＣＡＧプロモーター等が挙げられる。
　本発明における導入遺伝子は、２種類以上の遺伝子がリンカーで連結されていてもよい。前記リンカーは、２種類以上の遺伝子を連結する核酸又はペプチドであれば特に限定されないが、例えば、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）、Ｕｂｘ－ＩＲＥＳ、２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ等）、及びＧＳリンカー等が挙げられる。
　本発明は、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を選別する工程をさらに含むものでもよい。遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を選別する方法としては、例えば、前述した他の遺伝子（抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子、タグペプチド等）を利用する方法が挙げられる。より具体的な例としては、抗生物質を含有した培地中で遺伝子導入した細胞集団を培養して抗生物質耐性遺伝子を発現した細胞を選択する方法、セルソーターを用いてレポーター遺伝子を発現した細胞を選別する方法、及びタグペプチドに結合する抗体を用いてタグペプチドを発現した細胞をクロマトグラフィーにより分離する方法等が挙げられるが、特に限定されない。また、２種類以上の選別方法を組み合わせることもできる。
　本発明における遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団は、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を１細胞以上含む細胞集団であれば特に限定されず、遺伝子修飾されていない羊膜由来間葉系幹細胞やその他の細胞を含む集団であってもよい。特に限定されないが、前記遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団における遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞の比率は、例えば、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
　本発明は、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程をさらに含むものでもよい。羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程の培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分を適宜添加することにより調製することができる。前記他の成分としては、例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬、血小板溶解物、サイトカイン、及び抗生物質等が挙げられるが、特に限定されない。また、２種類以上の他の成分を組み合わせて添加してもよい。
　前記基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２　Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。また、市販の各種の無血清培地も使用できる。
　遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程の播種密度は、特に限定されない。例えば５００～１００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種することができる。前記播種密度の下限としては、例えば５００細胞／ｃｍ２以上、１，０００細胞／ｃｍ２以上、２，０００細胞／ｃｍ２以上、３，０００細胞／ｃｍ２以上、４，０００細胞／ｃｍ２以上、又は５，０００細胞／ｃｍ２以上が好ましい。また、前記播種密度の上限としては、細胞培養の効率性の観点から、１００，０００細胞／ｃｍ２以下を用いることが一般的である。他にも、例えば５０，０００細胞／ｃｍ２以下、３０，０００細胞／ｃｍ２以下、２０，０００細胞／ｃｍ２以下、又は１５，０００細胞／ｃｍ２以下が使用できる。
　前記遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程は、継代工程を含んでもよいし、異なる培養条件で複数回培養を繰り返す工程を含んでもよい。
　前記培養工程の培養期間中は、培地を交換する工程を含んでもよい。交換先の培地は、交換元の培地と同一の組成の培地であってもよいし、異なる組成の培地であってもよい。培地を交換する頻度は、特に限定されない。例えば１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、及び７日毎が挙げられる。
　前記遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程後のコンフルエント率は、特に限定されない。より多くの細胞を得る観点から、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。他にも、１％以上、１０％以上、３０％以上、及び１００％が挙げられる。
　本発明においては、前記培養工程にて培養した細胞を回収する工程をさらに含んでもよい。培養した細胞の回収方法は、特に限定されないが、例えば以下のようにして行うことができる。まず、所定のコンフルエント率となるまで培養した細胞を、細胞剥離手段にて処理して培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地又は任意の溶媒にて懸濁する。必要に応じて細胞懸濁液をさらに遠心分離し、洗浄液を用いて洗浄する工程を含んでもよい。
　前記の細胞剥離手段として、例えば、細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤は、少なくとも接着細胞を培養容器から剥離する作用を有する薬剤であれば特に限定されず、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。例えば、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、及びＡｃｃｕｍａｘ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（コーニング社製）を使用することができるが、これに限定されない。細胞剥離手段は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。
　前記洗浄液としては、特に限定されないが、細胞に与えるダメージを低減する観点から、緩衝液や等張液がより好ましい。例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（－）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、ブドウ糖液、各種輸液、生理食塩液、培養液、基礎培地、アルブミン溶液、血液由来成分、及びそれらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明においては、前記回収工程を経て回収した遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を、凍結保存する工程をさらに含んでも良い。前記凍結保存の手段は、特に限定されない。例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素での凍結保存等が挙げられる。上記の凍結保存手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１５０℃以下、－１８０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、１５℃／分以下、１１℃／分以下、１０℃／分以下、９℃／分以下、５℃／分以下、２℃／分以下、又は１℃／分以下である。上記の凍結保存手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、少なくとも室温から－１０℃の間は、１℃／分以上、２℃／分以下の凍結速度となるように設定した上で、それ以外は適宜冷却速度を変更し最終的には目的とする凍結温度（例えば-８０℃から－１５０℃）に到達させるのが好ましい。また、上記の凍結手段として液体窒素を用いた場合、例えば、－１９６℃まで急速に温度を下げて凍結させた後、液体窒素（気相）中で保存することができる。また液体窒素（液相）中で保存することもできる。
　前記の凍結手段により凍結する際、凍結する細胞は任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。前記保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、及び輸注バッグ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記の凍結手段により凍結する際、凍結する細胞は、任意の凍結保存液中で凍結されてもよい。前記凍結保存液としては、市販の凍結保存液を用いてもよい。例えば、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＣＰ－１（極東製薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ　ＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（Ａｋｒｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＭＳＣ　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記凍結保存液は、所定濃度の多糖類を含有することができる。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、４質量％以上、又は６質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）やデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０等）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　前記凍結保存液は、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することができる。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、又は５質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、１２質量％以下、又は１０質量％以下である。
　前記凍結保存液は、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有するものでもよい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、又は４質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウスアルブミン、及びヒトアルブミン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　［３］遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤
　本発明の別の実施態様では、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤を提供する。
　本発明における細胞製剤は、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を有効成分として含み、任意選択可能な構成成分として、製薬上許容し得る溶媒及び／又はその他添加物を含む。前記有効成分は、［２］遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に記載した製造方法で製造した、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の構成成分であってよい。
　前記有効成分の含有量は特に限定されず、細胞製剤の剤形、溶媒や担体の種類、投与量、投与回数、投与経路、使用目的、及び患者又は被験者の年齢、体重及び症状等によって適宜決定することができる。
　前記溶媒は、薬学的に許容可能な溶媒であれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。前記その他の補助剤としては、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム、低濃度の非イオン性界面活性剤、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。
　前記その他添加物は、薬学的に許容可能な添加物であれば特に限定されない。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン、及びプロドラッグ等が挙げられる。
　本発明における細胞製剤は、プロドラッグと組み合わせて用いられるものでもよい。前記プロドラッグは、細胞製剤を投与する前に対象に投与されてもよく、細胞製剤と同時に対象に投与されてもよく、又は細胞製剤を投与した後に対象に投与されてもよい。
　本発明における細胞製剤は、例えば、癌、免疫関連疾患、虚血性疾患、下肢虚血、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、神経性疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、放射線腸炎、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、膠原病、脳卒中、脳梗塞、脳内血腫、脳血管麻痺、肝硬変、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、乾癬、表皮水疱症、糖尿病、菌状息肉腫（Ａｌｉｂｅｒｔ－Ｂａｚｉｎ症候群）、強皮症、軟骨等の結合組織の変性及び／又は炎症から起こる疾患、関節軟骨欠損、半月板損傷、離弾性骨軟骨症、無腐性骨壊死、変形性膝関節症、炎症性関節炎、関節リウマチ、眼疾患、血管新生関連疾患、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、心筋梗塞、狭心症、心不全、心筋症、弁膜症、創傷、上皮損傷、線維症、肺疾患、筋ジストロフィー、又は慢性膵炎、慢性腎炎から選択される疾患の治療剤として使用することができる。本発明における細胞製剤は、好ましくは癌の治療剤として使用され得る。
　前記癌は、例えば、扁平上皮癌、肺癌、腹膜癌、中皮腫、結腸癌、胆管腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、軟部肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髄癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、直腸癌、及び精巣癌等が挙げられる。本発明における細胞製剤は、好ましくは脳腫瘍の治療剤として使用され得る。
　本発明の一以上の実施形態の細胞製剤の投与方法は、特に限定されない。例えば、皮下注射、リンパ節内注射、静脈内注射、腹腔内注射、胸腔内注射、局所への直接注射、及び局所に直接移植すること等が挙げられる。
　本発明の一以上の実施形態の細胞製剤は、注射用製剤、細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、又は任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。
　本発明の一以上の実施形態の細胞製剤が対象とする患者又は被験者は、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、及びウサギ等の哺乳類、インコ、オウム、及びニワトリ等の鳥類が挙げられる。
　［４］癌治療用キット
　本発明の別の実施態様では、
（ｉ）自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団、及び
（ｉｉ）プロドラッグを含む癌治療用キットを提供する。
　本発明における癌治療用キットは、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団とプロドラッグの併用処理の目的のために製造されるものである。治療を要する対象に、プロドラッグを投与する前に、プロドラッグ投与と同時に、プロドラッグを投与した後に、又は複数それらの２以上の組み合わせで、自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を投与するように製造されたキットである。
　前記細胞集団は、［２］遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法に記載した製造方法で製造した、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団であってよい。
　前記対象は、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、サル、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類、インコ、オウム、及びニワトリ等の鳥類が挙げられる。前記対象は、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、癌治療を要する患者であることがさらに好ましい。前記癌治療を要する患者としては、癌治療中の患者、癌治療を受けた事がある患者、癌治療を受ける必要がある患者をいずれも含み、癌治療のために癌を摘出する外科的手術を施した患者も含まれ得る。
　前記癌は、「前記［３］遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤」に記載の癌に準ずる。
　本発明における癌治療用キットは、第１区画と第２区画で構成されてもよく、第１区画に自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入した羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団を含んでもよく、第２区画にプロドラッグを含んでもよい。前記キットは、便利性及び携帯性を高めるために、それぞれ１回の投与量に分けて一つの容器内に含有する、又は相違するいくつかの小容器内に含有してもよい。
　本発明のキットは、必要に応じて、使用に必要な装備及び各成分の投与方法を記載した指示資料等を含んでもよい。
　以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　（比較例１）
　レンチウイルスベクターを用いたＶｅｎｕｓ発現羊膜由来間葉系幹細胞（羊膜ＭＳＣ）の作製
　ヒト羊膜ＭＳＣ（継代数２）を２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で６ウェルプレート（コーニング社製）に播種し、ヒト血小板溶解物を終濃度５％含有するαＭＥＭ中で２日間培養した。培養後の細胞の培地を除去し、Ｖｅｎｕｓ発現カセットを搭載したレンチウイルスベクター含有液を添加して０．５時間培養し、レンチウイルスベクター含有液と等量の培地を添加して１８時間培養した。次いで、ウイルス含有液を除去し、培地を添加して２４時間培養したのち、培養細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離によりＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を回収した。
　前記Ｖｅｎｕｓ発現カセットを搭載したレンチウイルスベクター含有液は、以下のようにして調製した。まず、ＣＭＶプロモーター制御下にＶｅｎｕｓ遺伝子を連結した核酸配列をレンチウイルスベクター作製プラスミドに導入し、Ｖｅｎｕｓ発現カセット搭載レンチウイルスベクター作製プラスミドを作製した。本プラスミド及びレンチウイルスパッケージングプラスミドをレンチウイルスパッケージング用細胞株であるＬｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ（タカラバイオ社製）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてトランスフェクションし、４８時間培養した。その後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ培養上清を回収し、０．８μｍフィルターで濾過して、Ｖｅｎｕｓ発現カセットを搭載したレンチウイルスベクター含有液を調製した。
　Ｖｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを大量製造するために、前記回収したＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを含む細胞集団に含まれるＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣの増殖を試みた。具体的には、前記回収したＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度でＴ２５フラスコ（住友ベークライト社製）に播種し、ヒト血小板溶解物を終濃度５％含有するαＭＥＭ中で培養した。培養３日目に、顕微鏡下で細胞培養状態の明視野観察（×４０倍率、露光時間１／２５秒）及び緑色蛍光観察（×４０倍率、露光時間１秒）を行った（図１Ａ）。さらに７日間培養した培養１０日目に、細胞培養状態を再度顕微鏡下で明視野観察（×４０倍率、露光時間１／２５秒）及び緑色蛍光観察（×４０倍率、露光時間１秒）した（図１Ｂ）。その結果、明視野観察画像で細胞増殖を認め、かつ緑色蛍光観察画像において蛍光シグナルを発するＶｅｎｕｓ発現細胞が増えていたことから、播種した細胞集団中に含まれるＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣが増殖していたことがわかった。すなわち本結果は、レンチウイルスベクターを用いて自殺遺伝子以外の遺伝子を遺伝子導入した場合、羊膜由来間葉系幹細胞の増殖能に問題はないことを示す。
　（比較例２）
　レンチウイルスベクターを用いたＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣの作製
　ヒト羊膜ＭＳＣ（継代数２）を２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で６ウェルプレート（コーニング社製）に播種し、ヒト血小板溶解物を終濃度５％含有するαＭＥＭ中で２日間培養した。培養後の細胞の培地を除去し、ＨＳＶ－ＴＫ発現カセットを搭載したレンチウイルスベクター含有液を添加して０．５時間培養し、レンチウイルスベクター含有液と等量の培地を添加して１８時間培養した。次いで、ウイルス含有液を除去し、培地を添加して２４時間培養したのち、比較例１と同様の方法でＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を剥離・回収した。
　前記ＨＳＶ－ＴＫ発現カセットを搭載したレンチウイルスベクター含有液は、以下のようにして調製した。まず、ＥＦ－１αプロモーター制御下にＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を配置し、さらにＨＳＶ－ＴＫ遺伝子の下流にＩＲＥＳを介してＶｅｎｕｓ遺伝子を連結した核酸配列をレンチウイルスベクター作製プラスミドに導入し、ＨＳＶ－ＴＫ発現カセット搭載レンチウイルスベクター作製プラスミドを作製した。ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子の下流にＩＲＥＳを介してＶｅｎｕｓ遺伝子を連結することで、ＨＳＶ－ＴＫ発現細胞をＶｅｎｕｓ蛍光シグナルにより判別できるようにした。本プラスミド及びレンチウイルスパッケージングプラスミドをレンチウイルスパッケージング用細胞株であるＬｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ（タカラバイオ社製）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてトランスフェクションし、４８時間培養した。その後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ　２９３Ｔ培養上清を回収し、０．８μｍフィルターで濾過して、ＨＳＶ－ＴＫ発現カセットを搭載したレンチウイルスベクター含有液を調製した。
　ＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣを大量製造するために、前記回収したＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣを含む細胞集団に含まれるＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣの増殖を試みた。具体的には、前記回収したＨＳＶ－ＴＫ発現羊羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度でＴ２５フラスコ（住友ベークライト社製）に播種し、ヒト血小板溶解物を終濃度５％含有するαＭＥＭ中で培養した。培養３日目に、顕微鏡下で細胞培養状態の明視野観察（×４０倍率、露光時間１／２５秒）及び緑色蛍光観察（×４０倍率、露光時間２．５秒）を行った（図２Ａ）。さらに７日間培養した培養１０日目に、細胞培養状態を再度顕微鏡下で明視野観察（×４０倍率、露光時間１／２５秒）及び緑色蛍光観察（×４０倍率、露光時間５秒）した（図２Ｂ）。その結果、明視野観察画像では細胞増殖を認めたが、緑色蛍光観察画像では蛍光シグナルを発するＨＳＶ－ＴＫ発現細胞の増殖は認められなかった。このことから、ＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣの増殖に失敗したことがわかった。明視野観察画像においてＨＳＶ－ＴＫ未導入細胞の増殖は認められたことから、ＨＳＶ－ＴＫの遺伝子導入及び発現により羊膜ＭＳＣの増殖能が大きく低下ことが示された。
　（実施例１）
　トランスポゾン法を用いたＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣの作製
　トランスポゾン法を用いてＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣを作製するに当たり、ＨＳＶＴＫ発現羊膜ＭＳＣの視認性を高めるために、まずはレンチウイルスベクターを用いて羊膜ＭＳＣにＶｅｎｕｓ遺伝子を導入した。具体的には、比較例１と同様の方法でＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを含む細胞集団を回収し、セルソーターＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ社製）を用いて、蛍光シグナルを指標にしてＶｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを選別し、回収した。
　Ｖｅｎｕｓ発現羊膜ＭＳＣを１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で１５ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に播種し、ヒト血小板溶解物を終濃度５％含有するαＭＥＭ中で３日間培養した。培養後の細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離により回収した。Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ　Ｌ（Ｒｏｎｚａ社製）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ＩＩ／２ｂ（Ｒｏｎｚａ社製）を用いたエレクトロポレーション法を用いて、ＨＳＶ－ＴＫ発現カセットをトランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトを構造に持つプラスミドベクター、及びトランスポザーゼ発現カセットを構造に持つプラスミドベクター（計２種類のプラスミドベクター）を回収細胞にトランスフェクションした。
　前記コンストラクトは、ＥＦ－１αプロモーター制御下にＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を配置し、さらにＨＳＶ－ＴＫ遺伝子の下流にＴ２Ａを介してピューロマイシン耐性遺伝子を連結した発現カセットの両端にトランスポザーゼが認識する反復配列を配置した。ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子の下流にＴ２Ａを介してピューロマイシン耐性遺伝子を連結することで、ＨＳＶ－ＴＫ発現細胞を薬剤選択により選別できるようにした。
　トランスフェクション後の細胞をＴ７５フラスコに播種して２４時間培養した後、ピューロマイシンを終濃度１μｇ／ｍＬで添加し、培養した。培養３日目に、顕微鏡下で細胞培養状態の明視野観察（×４０倍率、露光時間１／２５秒）及び緑色蛍光観察（×４０倍率、露光時間３秒）を行った（図３Ａ）。さらに７日間培養した培養１０日目に、細胞培養状態を再度顕微鏡下で明視野観察（×４０倍率、露光時間１／２５秒）及び緑色蛍光観察（×４０倍率、露光時間１秒）した（図３Ｂ）。その結果、明視野観察画像及び緑色蛍光観察画像においてピューロマイシン耐性を示すＨＳＶ－ＴＫ発現細胞が増えていたことから、播種した細胞集団中に含まれるＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣが増殖していたことがわかった。
　上記結果より、ウイルスベクターを用いてＨＳＶ－ＴＫを遺伝子導入した羊膜ＭＳＣは増殖が阻害される一方、プラスミドベクターを用いてトランスポゾン法によりＨＳＶ－ＴＫを遺伝子導入した羊膜ＭＳＣは、増殖能が低下することなく効率的に製造することが可能であることが示された。
　（実施例２）
　トランスポゾン法を用いて作製したＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣの脳腫瘍に対する抗癌効果の評価
　ＨＳＶ－ＴＫ発現カセットの遺伝子導入にトランスポゾン法を用いて作製したＨＳＶＴＫ発現羊膜ＭＳＣ（ＴＫ－ＡＭＳＣ）が、脳腫瘍に対して抗癌効果を有することを確認するための実験を行った。まず、実施例１に記載の方法で作製し、ピューロマイシン耐性を指標にして選別したＴＫ－ＡＭＳＣを、比較例１と同様の方法で剥離・回収した。回収後のＴＫ－ＡＭＳＣを１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で１５ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に播種し、ヒト血小板溶解物を終濃度５％含有するαＭＥＭ中で７日間培養した。培養後のＴＫ－ＡＭＳＣを比較例１と同様の方法で剥離・回収し、２×１０６ｃｅｌｌｓのＴＫ－ＡＭＳＣを５０％マトリゲル（コーニング社製）を含有した生理食塩液５０μＬに懸濁し、ＴＫ－ＡＭＳＣ投与液を調製した。また、２×１０６ｃｅｌｌｓのヒト脳腫瘍由来細胞株であるＵ－８７ＭＧを５０％マトリゲル（コーニング社製）を含有した生理食塩液５０μＬに懸濁し、Ｕ－８７ＭＧ投与液を調製した。ＴＫ－ＡＭＳＣ投与液及び／又はＵ－８７ＭＧ投与液を生後５週齢の免疫不全ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ）の右腹側部皮下に移植した。細胞移植の翌日より７日間、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を５０ｍｇ／ｋｇの容量で１日１回腹腔内に投与した。細胞移植後１日、３日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日、２４日、２８日、３１日に腫瘍の長径及び短径を計測し、計算式（腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）÷２）をもとに腫瘍体積を算出してグラフ化した（図４）。その結果、ＴＫ－ＡＭＳＣの移植及びＧＣＶ投与処置を施した実験群（ＴＫ－ＡＭＳＣ（＋），ＧＣＶ（＋））は、無処置群（ＴＫ－ＡＭＳＣ（－），ＧＣＶ（－））及びガンシクロビル投与処置のみを施した実験群（ＴＫ－ＡＭＳＣ（－），ＧＣＶ（＋））と比較して顕著に腫瘍の成長が抑制された。本結果は、ＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜由来間葉系幹細胞移植及びガンシクロビル投与を施した試験群において、腫瘍の成長阻害効果を認めたことを示す。
　以上の結果より、実施例に記載の方法で作製したＨＳＶ－ＴＫ発現羊膜ＭＳＣが優れた抗癌効果を有し、癌治療用の細胞製剤として非常に有用であることが確認された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (19)

  1. 　羊膜由来間葉系幹細胞に、プラスミドベクターを用いて自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを遺伝子導入する工程を含む、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
  2. 　前記プラスミドベクターが、エレクトロポレーション法により細胞内に導入される、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記遺伝子導入工程で、前記自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを染色体に組み込む、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　前記遺伝子導入工程において、前記自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを、トランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクトを含むプラスミドベクターと、トランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドベクターの２種類のプラスミドベクターを用いる、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記遺伝子導入工程において、前記自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセットを、トランスポザーゼが認識する反復配列に隣接して配置したコンストラクト、及びトランスポザーゼ発現カセットを含むプラスミドベクターを用いる、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子又はシトシンデアミナーゼ遺伝子である、請求項１に記載の製造方法。
  7. 　前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子である、請求項１に記載の製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤。
  9. 羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞製剤であって、前記羊膜由来間葉系幹細胞が、
    （ｉ）自殺遺伝子又は自殺遺伝子の発現カセット、及び
    （ｉｉ）トランスポザーゼが認識する反復配列
    が染色体に組み込まれている、細胞製剤。
  10. 　前記細胞製剤がプロドラッグと組み合わせて使用される、請求項８又は９に記載の細胞製剤。
  11. 　前記プロドラッグがガンシクロビル又は５－フルオロシトシンである、請求項１０に記載の細胞製剤。
  12. 　前記プロドラッグがガンシクロビルである、請求項１１に記載の細胞製剤。
  13. 　前記細胞製剤が癌治療用である、請求項８又は９に記載の細胞製剤。
  14. 　前記細胞製剤が脳腫瘍治療用である、請求項１２に記載の細胞製剤。
  15. 　（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法により製造される、遺伝子修飾された羊膜由来間葉系幹細胞を含む細胞集団、及び
    　（ｉｉ）プロドラッグ
    を含む癌治療用キット。
  16. 　請求項９に記載の細胞製剤、及びプロドラッグを含む癌治療用キット。
  17. 　前記プロドラッグがガンシクロビル又は５－フルオロシトシンである、請求項１５又は１６に記載の癌治療用キット。
  18. 　前記プロドラッグがガンシクロビルである、請求項１７に記載の癌治療用キット。
  19. 　前記癌が脳腫瘍である、請求項１５又は１６に記載のキット。
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DE MELO SUELY, BITTENCOURT SIMONE, FERRAZOLI ENÉAS GALDINI, DA SILVA CLIVANDIR SEVERINO, DA CUNHA FLAVIA FRANCO, DA SILVA FLAVIA H: "The Anti-Tumor Effects of Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cell Transduced with HSV-Tk Gene on U-87-Driven Brain Tumor", PLOS ONE, vol. 10, no. 6, 12 June 2015 (2015-06-12), US , pages 1 - 13, XP093356845, ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/journal.pone.0128922 *
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