WO2025192560A1 - 細胞剥離方法及び細胞剥離システム - Google Patents

細胞剥離方法及び細胞剥離システム

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WO2025192560A1
WO2025192560A1 PCT/JP2025/008927 JP2025008927W WO2025192560A1 WO 2025192560 A1 WO2025192560 A1 WO 2025192560A1 JP 2025008927 W JP2025008927 W JP 2025008927W WO 2025192560 A1 WO2025192560 A1 WO 2025192560A1
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WO
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shear force
cell
vibration
cells
culture substrate
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2025/008927
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English (en)
French (fr)
Inventor
研治郎 竹村
佑太 倉科
哉裕 今城
貴昭 古井
秀春 下澤
亮一 吉田
仁美 徳武
圭一郎 椿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Canon Inc
Original Assignee
Canon Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Canon Inc filed Critical Canon Inc
Publication of WO2025192560A1 publication Critical patent/WO2025192560A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • This disclosure relates to a cell detachment method and a cell detachment system.
  • the desired cells are obtained through the steps of culturing the cells on a culture substrate such as a polystyrene dish, detaching the cells from the culture substrate, and recovering and washing the cells.
  • a procedure known as subculture is performed in which some of the cells are transferred to a new culture substrate and cultured.
  • detachment methods are being investigated to recover cells at a high detachment rate without damaging them.
  • Patent Document 1 discloses a cell detachment device that applies ultrasonic vibrations to a container holding cells and culture medium or liquid, thereby detaching at least some of the cells from the container.
  • Patent Document 2 also discloses a method of detaching cells using mechanical stimulation caused by the flow of culture medium. The inventors have identified a problem with the above prior art. Specifically, when dealing with cells that are difficult to detach, such as cells that have a high adhesive force to the container, detaching under conditions that increase detachment efficiency can result in a decrease in cell viability.
  • the present disclosure therefore aims to provide a cell detachment method that increases both cell survival rate and detachment rate, and a cell detachment system using the same.
  • the cell detachment method disclosed herein is a method for detaching adherent cells cultured on a culture substrate, and includes a vibration imparting step of imparting ultrasonic vibrations to the culture substrate, and a shear force imparting step of imparting shear force to the culture surface of the culture substrate, characterized in that the start of the vibration imparting step precedes the start of the shear force imparting step, and the shear force is imparted by means other than ultrasonic vibrations.
  • the cell detachment system is a cell detachment system having a detachment unit that detaches adherent cells cultured on a culture substrate, and a control unit, wherein the detachment unit has a vibration imparting unit that imparts ultrasonic vibrations to the culture substrate, and a shear force imparting unit that imparts shear force to the culture surface of the culture substrate, and the control unit controls the start of driving of the vibration imparting unit to occur before the start of driving of the shear force imparting unit.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the cell detachment method of the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the cell detachment method of the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the cell detachment method of the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the cell detachment method of the present disclosure.
  • 1 is a schematic diagram illustrating an example of a piezoelectric body according to the present disclosure.
  • 1A and 1B are diagrams illustrating a vibration imparting mechanism that imparts vibration in the ultrasonic band in the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a bolt-clamped Langevin transducer.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a stick-on type vibrator.
  • FIG. 1 illustrates an example of a cell detachment system according to the present disclosure.
  • FIG. 1 illustrates an example of a cell detachment system according to the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating an adhesive strength measuring device used in the examples of the present disclosure.
  • 1 is a diagram illustrating a device 1 having a mechanism for applying ultrasonic vibrations that can be used in an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 illustrates an apparatus 2 having a mechanism used to apply shear forces in the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a device 3 having a mechanism used to apply ultrasonic vibration and shear force that can be used in an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 1 illustrates a device 4 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a device 5 having a mechanism for applying ultrasonic vibration and shear force that can be used in an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 6 illustrates an apparatus 6 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • FIG. 6 illustrates an apparatus 6 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • FIG. 1 illustrates a device 7 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • FIG. 1 illustrates a device 7 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • FIG. 1 illustrates an apparatus 8 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • FIG. 1 illustrates an apparatus 9 having a mechanism used to apply shear force in the present disclosure.
  • the present disclosure provides a method for detaching adherent cells cultured on a culture substrate, the method comprising a vibration imparting step of imparting ultrasonic vibrations to the culture substrate, and a shear force imparting step of imparting shear force to the culture surface of the culture substrate, wherein the start of the vibration imparting step precedes the start of the shear force imparting step, and the shear force is imparted by a means other than ultrasonic vibrations.
  • FIGS. 1A and 1B A specific example of the cell detachment method of the present disclosure is shown in FIGS. 1A and 1B.
  • a vibration applying step step S110
  • a culture substrate is placed and vibrations in the ultrasonic band are applied to the culture substrate.
  • the culture substrate is placed and the shear force application step (step S140) is initiated.
  • the detached cells are collected (step S150).
  • the vibration applying step (step S110) is started before the shear force applying step (step S140).
  • a further embodiment is shown in Figures 2A and 2B.
  • a vibration application process (step S210) is initiated, in which a culture substrate is placed and ultrasonic vibrations are applied.
  • an information acquisition process step S220 is executed, in which cell information on the culture substrate is acquired.
  • a shear force application process start time determination process (step S230) is executed, in which the start timing of the shear force application process is determined.
  • a culture substrate is placed, and a shear force application process (step S240) is initiated. Finally, the detached cells are collected (step S250).
  • the vibration application process begins before the shear force application process (step S240) begins.
  • vibration applying process vibrations in the ultrasonic band are applied to the culture substrate, thereby facilitating detachment of the cells from the culture substrate.
  • the inventors have discovered that applying ultrasonic vibrations to a culture substrate on which cells are cultured can reduce the adhesive force of the cells before they detach from the culture substrate, and have investigated how to actively utilize this effect.
  • the ultrasonic vibrations of the present disclosure refer to vibrations with a frequency of 10 kHz to 1 MHz.
  • the duration of application of ultrasonic vibrations in the vibration application step is not particularly limited, but from the viewpoint of effectively reducing the adhesive force of cells and increasing cell viability, it is, for example, 1 second to 1 hour, preferably 10 seconds to 30 minutes, and more preferably 30 seconds to 15 minutes.
  • applying ultrasonic vibrations for a long period of time may not be desirable.
  • the duration is too short, the adhesive force of cells may not be sufficiently reduced by ultrasonic vibrations.
  • the maximum amplitude of the vibration surface of the ultrasonic band vibrations in the vibration application process there are no particular restrictions on the maximum amplitude of the vibration surface of the ultrasonic band vibrations in the vibration application process, but from the perspective of maintaining cell viability, it is desirable for it to be 10 ⁇ m or less. Within this range, the effects of heat generation from the vibrator can be suppressed and an appropriate amount of vibration energy can be transmitted to the cells to reduce their adhesive strength. Furthermore, an amplitude of 10 ⁇ m or less is preferable because it makes it less likely for cavitation to occur when ultrasonic band vibrations are applied, making it less likely for cell viability to decrease.
  • the direction of vibration in the ultrasonic band preferably includes a component in a direction perpendicular to the culture surface.
  • the direction of ultrasonic band vibration refers to the direction connecting the vibration surface of a vibrator that generates ultrasonic band vibration and a vibration transmission member that transmits the ultrasonic band vibration.
  • vibration modes can be used for ultrasonic vibration patterns, depending on the vibrator and ultrasonic device used as the vibration imparting means. While various vibration modes can be selected depending on the cell type and detachment conditions, a vibration mode that excites a uniform amplitude throughout the vessel is preferred, such as when using a vibrator with high in-plane uniformity, such as a Langevin vibrator. Furthermore, when using a vibrator that can generate various vibration modes through bending vibration, such as a ring-shaped vibrator with an annular piezoelectric element attached to a glass plate, a mode that imparts a uniform amplitude with a constant period, such as a traveling wave or carrier wave that can be generated by dividing the electrodes into multiple parts, is preferred.
  • the amplitude variation between any position in the vessel when ultrasonic vibrations are applied is reduced, thereby reducing the differential effects between cultured cells.
  • heat may be generated during driving. This tendency tends to intensify when driving at a resonant frequency, depending on the applied voltage, the frequency band used, and the device environment.
  • it is possible to control the amount of heat generated by repeating driving and pausing at regular intervals (burst driving), or by repeatedly and continuously changing the driving frequency within a certain frequency range (sweep driving), either alone or in combination.
  • a cooling mechanism can be provided around the vibration imparting means to control the vibrator directly or indirectly via the environmental temperature.
  • the resonant frequency may change due to heat generated by the vibrating body during driving. In such a case, it is possible to perform a known resonant frequency tracking control, for example, by detecting a current.
  • the environmental temperature when carrying out the vibration application step can be set appropriately depending on the cell type used. From the perspective of maintaining cell viability, a temperature of 20°C or higher and 40°C or lower is preferable, and in the case of mammalian cells, for example, a temperature of 30.0°C or higher and 37.5°C or lower is particularly preferable. This is because within this range, the environmental temperature is close to the temperature during culture, which reduces the impact of temperature changes on the cells and allows for maintaining a high viability.
  • the environmental temperature for the vibration application step can be set to a temperature range that corresponds to the temperature responsiveness.
  • the vibration imparting step may be performed in an environment with a CO2 concentration of 5%, as in cell culture.
  • the environmental conditions for the vibration imparting step can be appropriately set depending on the type and characteristics of the cells and the method of using the cells after detachment.
  • shear force application process In the shear force application step, a shear force is applied to the culture surface of the culture substrate to detach the cells from the culture substrate.
  • Shear force refers to a force that acts laterally on cells. In other words, by reducing adhesive strength using ultrasonic vibrations and then separately applying shear force to the cells as a force to detach them from the side, it became possible to detach the cells without reducing their viability.
  • methods of applying shear force include at least beating (beating the culture substrate), shaking (shaking the culture substrate), rocking (rocking the culture substrate), and eccentric rotation (eccentric rotation of the culture substrate), which are applied to the culture substrate, discharging liquid onto the culture substrate, and stirring liquid on the culture substrate.
  • shear force applied by ultrasonic vibrations is not included.
  • Shear force is considered to be applied by means other than ultrasonic vibrations. Specific examples include the following:
  • An example of striking a culture substrate is to impart an impact force to the culture substrate by colliding a member with an appropriate mass against the culture substrate.
  • the colliding member may be rod-shaped, hammer-shaped, or spherical, but the means of imparting an impact force by colliding a member with the culture substrate is not limited to these.
  • the striking unit that strikes the substrate can impart an impact force by colliding the culture substrate with a flat, arc-shaped, or protruding member, or a combination of these methods can be used.
  • the striking unit of the present disclosure preferably uses a means of imparting an impact force to the culture substrate by colliding a member with an appropriate mass against the culture substrate, from the perspective of miniaturizing the device configuration.
  • the weight and raw materials of the colliding component can be selected appropriately depending on the impact force to be applied, and known materials such as inorganic materials such as metals and ceramics, organic materials such as resins and rubber, and even composites of these can be used as raw materials.
  • the power source for moving the colliding member can be a method that generates force by passing electricity, such as a motor or solenoid. These power sources can be used directly, or they can be used via a member that can store energy, such as a spring.
  • the hammering unit of the present disclosure can also control the impact force and inertial force applied to the culture substrate by arranging a micro-deformation member on the opposite side of the hammering direction.
  • the shape of the micro-deformation member is preferably cylindrical, hemispherical, or a combination thereof, and the material is preferably an elastic body, i.e., a rubber material.
  • An example of shaking the culture substrate is to use a configuration that generates a flow in the liquid in the culture substrate by applying acceleration that includes a component in a direction parallel to the culture surface of the culture substrate.
  • a configuration can be used in which the culture substrate is rotated by a motor and then reciprocated on one axis using a slide rail or the like.
  • a configuration can be used in which the culture substrate is accelerated using a linear motor or the like to apply acceleration including a component parallel to and a component non-parallel to the culture surface.
  • the axis of shaking can be appropriately designed so that an acceleration including a component parallel to and a component non-parallel to the culture surface of the culture substrate can be applied by shaking.
  • reciprocating shaking which involves reciprocating motion in the horizontal or vertical direction
  • the reciprocating shaking may include a horizontal or vertical component, and shaking may be performed only in the horizontal or vertical direction, or a combination of these may be performed obliquely.
  • the shaking axis is not limited to a single axis, and shaking may be performed on multiple axes, such as two or more axes, in different shaking directions.
  • Another shaking method is, for example, rotary shaking, which involves circular motion in a direction that includes a horizontal component.
  • the rotary shaking needs only to include a horizontal component, and it can be horizontal only, or it can be diagonal shaking that also includes the vertical direction.
  • the circular motion can also be circular, elliptical, figure-eight, or a combination of these.
  • Seesaw shaking refers to a shaking method in which the culture medium moves back and forth like a seesaw, with a single point in the culture medium as the axis, and examples include horizontal and vertical reciprocation, or a combination of these.
  • a shaking method is a swinging motion in which the sample is swung in an arc around a fulcrum like a pendulum.
  • these specific examples may be used alone or in combination.
  • Eccentric rotation of the culture substrate includes rotation with an eccentric axis, such as in stirring.
  • Specific examples include the aforementioned configuration in which the axis of rotation is eccentric, as well as horizontal eccentric vibration and vortex stirring.
  • Examples of dispensing liquid onto a culture substrate include a method in which liquid is dispensed from a needle or the like and directed onto the culture surface, thereby spreading and applying the liquid along the culture surface; a method shown in Figures 15A and 15B and described later, in which liquid is dispensed and sucked repeatedly from a pipetter or the like, thereby applying a flow of liquid from different directions along the culture surface; and a method shown in Figure 16 and described later, in which a flow path is created along the culture surface and a pump or syringe is used to send the liquid in one direction or by switching directions.
  • An example of agitating the liquid is a method of applying the shear force by creating a flow parallel to the culture surface using an agitator 9 with agitating blades as shown in Fig. 17.
  • the device 9 is an apparatus having a shear force applying mechanism, and includes a holding mechanism 11 that holds the culture substrate 10 and an agitation mechanism 137 for applying the shear force.
  • Other known methods for stirring the liquid such as a method using a stirring bar, can also be used.
  • shear force application methods may be used alone or in combination.
  • Temporal variation can include, for example, increasing or decreasing the shear force monotonically, at a constant rate, or by an arbitrary amount, or increasing or decreasing periodically, in a combination of multiple types, or randomly.
  • the magnitude of the shear force can be varied periodically, for example, at a rate of 5% or more, or it can vary in a sinusoidal wave, or the shear force can be applied in a repeated pulsed manner.
  • These changes over time can be achieved by changing the strength of the shear force.
  • the strength of the shear force itself can change, or the strength of the shear force can be changed as the impulse of the shear force per unit time.
  • the magnitude of the shear force applied in the shear force application process of the present disclosure be varied periodically.
  • the shear force at a constant cycle it is possible to apply a shear force of a constant strength range evenly per unit time, which is preferable from the perspective of improving peeling efficiency.
  • shear force application process of the present disclosure it is desirable to change the direction in which the shear force is applied.
  • the direction in which the shear force is applied may be changed over time, or shear forces may be applied simultaneously from different directions.
  • Specific examples of the types and directions of shear force exemplified in the present disclosure include shear force from one direction, such as when discharging a liquid, shear force applied from two different directions, such as when swinging around a single axis, such as when reciprocating shaking, or shear force applied from two directions, and shear force applied from multiple directions, such as when swinging around a two-axis stage or when hitting the culture substrate while rotating it.
  • the direction in which the shear force acts and the magnitude of the shear force applied to the culture surface be changed during the shear force application process. This is because there are variations in the growth and adhesion states of individual cells, so by changing the magnitude and direction in which the shear force acts, it is possible to apply multifaceted forces to the cells and apply shear forces that are appropriate for each individual cell.
  • the direction in which the shear force acts preferably includes a component parallel to the culture surface.
  • a component parallel to the culture surface By including a component parallel to the culture surface, cells whose adhesive strength has decreased in the vibration application step can be more effectively detached.
  • the time for applying shear force i.e., the time for which the shear force application step is carried out
  • the time for applying shear force is not particularly limited, but from the perspective of effectively detaching cells and increasing cell viability, it is, for example, from 1 second to 1 hour, preferably from 5 seconds to 30 minutes, and more preferably from 10 seconds to 10 minutes. If the shear force application time is too long, excessive damage to the cells may be caused, which is not desirable. Furthermore, if the time is too short, sufficient shear force may not be applied to the cells, resulting in a reduced detachment effect.
  • the environmental temperature when carrying out the shear force application step there are no particular limitations on the environmental temperature when carrying out the shear force application step, but from the perspective of maintaining cell viability, a temperature range of 20°C or higher and 40°C or lower is preferred, and a temperature range of 30.0°C or higher and 37.5°C or lower is particularly preferred. Within this range, the environmental temperature is close to the temperature during culture, which reduces the impact of temperature changes on the cells and allows for a high survival rate to be maintained. If a known container using a temperature-responsive membrane is used as the culture substrate, the environmental temperature for the shear force application step may be set to a temperature range that corresponds to the temperature responsiveness.
  • the shear force application step may be performed in an environment with a CO2 concentration of 5%, similar to cell culture.
  • the environmental conditions for the shear force application step can be appropriately set depending on the type and characteristics of the cells and the method of using the cells after detachment.
  • the cell detachment method of the present disclosure may include other steps besides the vibration applying step or the shear force applying step. Other steps may be included between the vibration applying step and the shear force applying step, or may be included during the shear force applying step, or may be included after the shear force applying step has ended, or may be included before the vibration applying step begins.
  • Other processes include a detached cell recovery process, an information acquisition process, a process for determining the start time of the shear force application process, and a process for replacing the liquid in the culture substrate with a cell detachment solution, a process for rinsing the cells with the cell detachment solution, and a process for diluting and homogenizing the detachment solution.
  • the vibration applying step and the shear force applying step may be repeated at regular intervals or at random intervals.
  • the ratio of the total time for which the vibration applying step is performed to the total time for which the shear force applying step is preferably 0.01 or more and 100 or less.
  • the relationship between a and b satisfy Equation 5. 0.01 ⁇ a/b ⁇ 100 (Formula 5)
  • the time difference between the start of the vibration applying step and the start of the shear force applying step is not particularly limited, as long as the start of the vibration applying step precedes the start of the shear force applying step. From the viewpoint of increasing the cell survival rate, the time difference is, for example, 30 minutes or less, preferably 10 minutes or less, and more preferably 5 minutes or less.
  • the shear force applying step may be started before the vibration applying step is completed, simultaneously with the completion of the vibration applying step, or after the completion of the vibration applying step. By starting the shear force applying step before the completion of the vibration applying step, it is possible to apply shear force while weakening the adhesive force of the cells, thereby more effectively detaching the cells. Furthermore, information on the cells adhered to the culture substrate may be measured and the measurement information may be used to determine whether to transition from the vibration applying step to the shear force applying step.
  • the shear force applying step may end after the vibration applying step ends, or it may end before the vibration applying step ends, or the vibration applying step and shear force applying step may end simultaneously.
  • information on the cells adhered to the culture substrate may be measured and the measurement information may be used to determine whether to end the vibration applying step or the shear force applying step.
  • the cell detachment method of the present disclosure may further include an information acquisition step of acquiring cell information, and may further include a shear force application step start time determination step of determining the start timing of the shear force application step based on the acquired cell information.
  • the cell information disclosed herein includes cell type, passage number, culture time, as well as cell measurement information.
  • measurement information in the present disclosure include cell adhesion strength, cell area, the area of a halo region in a phase contrast microscope image (also called a phase contrast image), brightness values in a phase contrast image, and brightness values when observing the cell culture surface of a culture substrate using oblique illumination.
  • An example of measurement information on cell adhesion force is a method in which a water stream with a known shear force is sprayed onto a cell culture surface to apply shear force to detach the cells, and the applied shear force is estimated from the size of the area where the cells have detached, and this is considered to be adhesion force.
  • An example of cell area measurement information is to acquire a phase contrast image of an adhered cell and use image processing to measure the area occupied by a single cell, thereby quantifying the cell area.
  • adhered cells appear larger in area in phase contrast images, and cells whose adhesive strength has decreased due to the vibration and shear stress application steps assume a shape close to sphere due to surface tension, and therefore appear smaller in area in phase contrast images. This fact may be utilized to determine the timing for starting the shear stress application step.
  • Other examples of cellular information include the brightness value in a phase contrast image or the area of a halo region.
  • phase-contrast image of cells in an adherent state only areas with a small phase difference (when the cells are flat) are detected.
  • a detachment solution is added, cell adhesion weakens and the cells lift off the culture substrate, the phase difference increases in the lifted areas, and it is known that halo regions with higher image brightness values than other areas appear in the phase-contrast image.
  • the area of the halo region increases and its value approaches a constant. This can be used to determine the timing for starting the shear force application process, and further, the magnitude, direction, and even time of changes in the shear force application process can be controlled based on the amount of change in cell information.
  • Another type of cell information is the brightness value when observing the cell culture surface of the culture substrate using oblique incidence illumination.
  • Cells whose adhesive strength has decreased due to the action of the cell detachment solution shrink their pseudopodia, reducing the microscopic adhesive surface with the culture substrate, making light more likely to scatter at the interface between the culture substrate and the cells. Therefore, when observing using oblique incidence illumination, which increases the proportion of scattered light, the brightness value of the cell culture surface of the culture substrate increases as the cell adhesion weakens, and this value approaches a constant value.
  • the cell detachment method disclosed herein may be equipped with a control unit that pre-sets the conditions for the vibration application process and shear force application process (ultrasonic wave intensity, application time of ultrasonic vibration, vibration mode, type, intensity, and application time of shear force, etc.) according to the cell type, or may control the conditions by combining the cell type with observation information, etc.
  • a control unit that pre-sets the conditions for the vibration application process and shear force application process (ultrasonic wave intensity, application time of ultrasonic vibration, vibration mode, type, intensity, and application time of shear force, etc.) according to the cell type, or may control the conditions by combining the cell type with observation information, etc.
  • ultrasonic vibrations include vibrations having a frequency of 10 kHz to 1 MHz.
  • the vibration generating means can be any means capable of applying ultrasonic vibrations to cells, and is not particularly limited.
  • an ultrasonic oscillator such as lead zirconate titanate (PZT) as the vibrating body.
  • the vibrator can be placed in direct contact with the outer surface of the culture substrate, which has been filled with culture medium and sealed, to impart vibration to the culture substrate.
  • a vibration-transmitting member described as an ultrasound-transmitting substance can be placed between the vibration-imparting means and the area to be treated, and ultrasound can be applied to the cells to be ablated.
  • any vibrating body can be used as long as it generates vibrations in the ultrasonic band, but examples include a piezoelectric body and a vibration plate bonded together.
  • the vibration plate is preferably made of glass, SUS, or quartz.
  • the vibrating body can include an ultrasonic vibrator.
  • the outer diameter of the diaphragm is equal to the outer diameter of the piezoelectric body.
  • the thickness of the diaphragm so that the midpoint of the flexure in the thickness direction, i.e., the neutral plane that is neither tensile nor compressive, is on the diaphragm side, in order to efficiently utilize the distortion of the piezoelectric element for flexure.
  • the vibrator of the present disclosure can also be a commercially available Langevin vibrator or rectangular vibrator.
  • Langevin vibrators have a piezoelectric body sandwiched between two metal blocks, which are fastened together with bolts or the like to form an integrated structure. Examples of such vibrators include those made by Hyundai Electronics and Fuji Ceramics.
  • a ring device in which a ring-shaped piezoelectric body is bonded to a glass plate or metal plate, or a Langevin vibrator (Langevin device), which allows for easy amplitude control on the order of micrometers, is preferably used.
  • the ring device When the ring device is used in standing wave mode, it is possible to transmit vibrations with the strongest amplitude to a position appropriate to the vibration mode, such as the center, although this depends on the size and resonant frequency of the piezoelectric material and diaphragm.
  • the ring device When the ring device is used in traveling wave mode or carrier wave mode, it is possible to periodically move the positions of the antinodes and nodes of the bending vibration, making it possible to apply more uniform vibrations to the culture substrate.
  • the Langevin device is capable of applying uniform vibrations to the culture substrate.
  • the piezoelectric body used in the vibrator is preferably a ring-shaped or annular piezoelectric body, but the shape of the piezoelectric body that deflects the vibrator may be a disk-shaped piezoelectric body.
  • the piezoelectric body is preferably annular in shape so that the field of view below the culture substrate can be secured.
  • Piezoelectric materials exhibit piezoelectric properties when polarized, but as shown in Figure 3, the polarity of polarization can be changed depending on the electrode pattern.
  • the area patterned with electrodes ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 1, ⁇ 2, and ⁇ 3 is the driving phase 301 that contributes to deformation
  • the area sandwiched between electrodes ⁇ 1 and ⁇ 1 is the sensor phase 302 for detecting the degree of deformation.
  • a polarized piezoelectric material can excite standing wave and traveling wave vibration modes by controlling the phase of the input AC voltage for each electrode pattern.
  • a standing wave is generated by applying an AC voltage with a 180-degree phase difference to negatively polarized electrodes ( ⁇ 2, ⁇ 2) relative to positively polarized electrodes ( ⁇ 1, ⁇ 3, ⁇ 1, ⁇ 3).
  • phase A 303 electrodes ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3
  • phase B 304 electrodes ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3
  • GND refers to ground, and is used to ground the electrodes located on the backside.
  • An example of an electrode pattern is one in which Ag is formed by printing, but the electrode material can be other than Ag, such as noble metals like Au, Pt, or Pd, or base metals like Cu.
  • the formation method can also be printing, plating, or sputtering.
  • the piezoelectric material used for the vibrator was PbZrTiO3 (PZT), but considering environmental regulations, a lead-free piezoelectric material that does not substantially contain Pb is preferable.
  • lead-free piezoelectric materials include BaTiO3 (BT), NaNbO3 , BiNaTiO3 , and BiFeO3 as the main components, and combinations of these materials or addition of metal elements to the main components are also acceptable.
  • BaTiO3 (BT)-based materials have been confirmed to have vibration performance equivalent to that of PbZrTiO3 (PZT).
  • Materials other than ceramics, such as single crystal materials and polymer-based piezoelectric materials, are also acceptable.
  • the thickness of the diaphragm is adjusted so that the midpoint of the flexure in the thickness direction, i.e., the neutral plane that is neither tensile nor compressive, is on the diaphragm side, in order to efficiently utilize the distortion of the piezoelectric element for flexure.
  • the combination of the thickness of the piezoelectric element and diaphragm was calculated based on the hardness of the piezoelectric element and the hardness of the diaphragm.
  • FIG. 4 shows an example in which a piezoelectric body is used to apply ultrasonic vibrations to a culture substrate.
  • a vibration applying mechanism 4102 comprises a vibrating body 4101 , a vibration transmitting member 413 and a cover 415 , and the vibrating body 4101 comprises a diaphragm 411 and a piezoelectric body 412 .
  • the culture substrate 421 is placed on a vibration transmission member 413.
  • the culture substrate 421 is covered with a culture substrate lid 422, and a weight 414 is placed on top of the culture substrate lid 422. By covering the culture substrate with the culture substrate lid 422 and further placing the weight 414 in this manner, ultrasonic vibrations may be efficiently applied.
  • the amplitude of the vibration source of the ultrasonic vibration applying unit can be measured using a laser Doppler vibrometer (Graphtec Corporation, AT7200).
  • the measurement method involves driving the ultrasonic vibration applying unit at a desired resonant frequency and voltage, scanning the transducer surface two-dimensionally in the X and Y directions with a laser, obtaining the vibration velocity at each point, and then calculating the amplitude in the Z direction. This allows the vibration waveform of the transducer to be measured three-dimensionally, allowing the maximum amplitude of the vibration source during driving to be determined.
  • a bolt-tightened Langevin transducer as shown in FIG.
  • the amplitude is the amplitude of the surfaces of M1 and M2.
  • the amplitude is the amplitude of the glass plate 501 or the metal plate 502.
  • the cells in the present disclosure are not particularly limited as long as they can be cultured in vitro on a culture vessel.
  • various cultured cell lines such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929 cells, mouse skeletal muscle myoblasts (C2C12 cells), human fetal lung-derived normal diploid fibroblasts (TIG-3 cells), human fetal kidney-derived cells (HEK293 cells), human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived A549 cells, mouse macrophage-like cells (RAW264.7), and human cervical cancer-derived HeLa cells, as well as epithelial cells and endothelial cells that constitute various tissues and organs in the body, and cells that exhibit contractility, can also be used.
  • Examples of cells that can be detached include skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiac muscle cells, neuronal cells that make up the nervous system, glial cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells involved in the body's metabolism, non-hepatic parenchymal cells, and adipocytes.
  • Examples of cells with differentiation potential include induced pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, embryonic carcinoma (EC) cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, skin stem cells, muscle stem cells, and germline stem cells, as well as progenitor cells of various tissues, and cells induced to differentiate therefrom.
  • iPS induced pluripotent stem
  • ES embryonic stem
  • EG embryonic germ
  • EC embryonic carcinoma
  • mesenchymal stem cells hepatic stem cells
  • pancreatic stem cells skin stem cells, muscle stem cells, and germline stem cells, as well as progenit
  • the cell detachment method disclosed herein may also be applied to sheet-like cells.
  • the cell detachment method disclosed herein is suitable for cells with strong intercellular bonds, cells with high adhesion to culture substrates, and cells with high trypsin sensitivity.
  • the method is particularly suitable for, for example, CHO cells used for protein production and mesenchymal stem cells that can be used in cell therapy.
  • the culture substrate in the present disclosure refers to a culture substrate used for cell culture.
  • the culture substrate is not particularly limited as long as it is a cell-adherent culture substrate, and examples thereof include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, multi-well plates, multi-plates, Petri dishes, culture bags, bottles, etc.
  • the material of the culture substrate in the present disclosure may be any material that is chemically stable and capable of culturing the desired cells, such as polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl chloride, nylon, polyurethane, polyurea, polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, poly(meth)acrylic acid, poly(meth)acrylic acid derivatives, polyacrylonitrile, poly(meth)acrylamide, poly(meth)acrylamide derivatives, polysulfone, cellulose, cellulose derivatives, polysilicone, polymethylpentene, glass, and metal.
  • polystyrene is preferred.
  • a cell detachment solution is a solution used in the cell detachment method of the present disclosure for detaching cells.
  • the pH of the cell detachment solution disclosed herein is preferably in the neutral range. This is because the neutral range is suitable for cell culture and allows for the cell viability to be maintained at a stable high level.
  • the pH can be adjusted appropriately using hydrochloric acid, sodium hydroxide, or the like.
  • Various buffer solutions are also suitable for maintaining a stable pH.
  • the viscosity of the cell detachment solution disclosed herein is preferably 1.80 mPa ⁇ s or less. This is because a viscosity within this range does not impede the flow of the detachment solution generated by ultrasonic vibrations, thereby maintaining high detachment efficiency.
  • the viscosity of the cell detachment solution can be adjusted as appropriate by adding polymers or sugars, for example.
  • the cell detachment solution of the present disclosure may contain protease, but preferably the amount of protease relative to the total mass of the cell detachment solution is 0.0005% by mass or less, and more preferably the cell detachment solution does not contain protease. This is because protease degrades part of the cells, which can increase detachment efficiency, but can also reduce the quality of the cells.
  • proteolytic enzymes refer to enzymes that break down parts of cells, making it easier to detach the cells from the culture substrate. Examples include trypsin, accutase, collagenase, natural proteases, chymotrypsin, elastase, papain, pronase, or recombinant forms thereof.
  • a solution containing a metal ion chelating agent (hereinafter sometimes referred to as a chelating agent) is particularly preferred as the cell detachment solution. This is because using a cell detachment solution containing a chelating agent allows cells to be effectively detached by vibrations in the ultrasonic band.
  • the chelating agent in the present disclosure is not particularly limited, but examples thereof include ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter sometimes referred to as EDTA), ethylenediamine, ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid, glycoletherdiaminetetraacetic acid, nitrilotriacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, iminodiacetic acid, dihydroxyethylglycine, dicarboxymethylglutamic acid, ethylenediaminedisuccinic acid, etidronic acid, citric acid, gluconic acid, and phosphonobutanetriacetic acid.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ethylenediamine ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid
  • glycoletherdiaminetetraacetic acid glycoletherdiaminetetraacetic acid
  • nitrilotriacetic acid diethylenetriaminepentaacetic acid
  • chelating agents that form chelates with divalent cations are preferred, with chelating agents that form chelates with Ca 2+ and Mg 2+ being particularly preferred, and ethylenediaminetetraacetic acid being the most preferred.
  • the pH of the cell detachment solution is preferably 7.0 or higher and 8.0 or lower. This is because a higher pH within the neutral range, which can maintain high cell viability, can enhance the chelating ability of ethylenediaminetetraacetic acid and thereby increase detachment efficiency.
  • the chelating agents may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the chelating agent is preferably 0.01 mM or more and 5.0 mM or less. Within this range, the chelating effect can be reliably obtained, and a decrease in activity due to the presence of an excess chelating agent can be suppressed.
  • the cell detachment solution of the present disclosure may contain a hydrophilic polymer containing a polyalkylene glycol structure.
  • Polyalkylene glycol can increase cell viability in cell detachment methods using ultrasound.
  • An example of a hydrophilic polymer containing a polyalkylene glycol structure is polyethylene glycol.
  • the hydrophilic polymer preferably has a peak molecular weight Mp measured by gel permeation chromatography of 800 or more and 50,000 or less, and more preferably 1,200 or more and 20,000 or less. This is because the polymer has little effect on cells and can suppress the thickening effect of the culture medium caused by the polymer.
  • the buffer solution in the present disclosure can be used without limitation as long as it can maintain a neutral pH range.
  • Tris buffer solutions such as Tris-HCl buffer solution, phosphate buffer solution, HEPES buffer solution, citrate-phosphate buffer solution, glycylglycine-sodium hydroxide buffer solution, Britton-Robinson buffer solution, and GTA buffer solution.
  • phosphate buffer solutions that are close to the in vivo environment are preferred, and phosphate-buffered saline (PBS) adjusted to be isotonic with intracellular fluid is more preferably used.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the type of medium is not particularly limited, and examples thereof include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture F12, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium ( ⁇ MEM)), and MEM medium (Minimum Essential Medium (MEM)).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • DMEM/F12 DMEM/F12 medium
  • McCoy's 5A medium Eagle's Minimum Essential Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ MEM medium alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium ( ⁇ MEM)
  • MEM medium Minimum Essential Medium (MEM)
  • Suitable medium include MT-1000 Medium (manufactured by Lonza), mTeSR1 or 2 medium (manufactured by Stem Cell Technology), Repro FF or Repro FF2 (manufactured by ReproCell), NutriStem medium (manufactured by Biological Industries), and MF-Medium mesenchymal stem cell proliferation medium (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • MCDB131 medium William's Medium E, IPL41 medium, Fischer's medium
  • StemSpan H3000 Stem Cell Technology
  • StemSpan SFEM Stem Cell Technology
  • Stemline II Sigma-Aldrich
  • Endothelial Cell Growth Medium 2 Kit Promocell
  • Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 Promocell
  • MSCGM Bullet Examples of suitable medium include MT-1000 Medium (manufactured by Lonza), mTeSR
  • the above-mentioned medium may contain serum or antibiotics.
  • serum include fetal bovine serum (FBS), baby calf serum, adult bovine serum, horse serum, sheep serum, goat serum, pig serum, chicken serum, rabbit serum, and human serum, with FBS being commonly used due to its ease of availability.
  • the medium may be serum-free, not containing raw or unpurified serum, but containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (e.g., growth factors).
  • antibiotics examples include penicillin, streptomycin, ampicillin, carbenicillin, tetracycline, bleomycin, actinomycin, kanamycin, actinomycin D, amphotericin B, and the like.
  • Cell culture conditions can be appropriately selected depending on the cells to be cultured. Generally, an appropriate medium is added to a culture substrate, and cells are seeded therein at approximately 1.0 x 10 to 5.0 x 10 cells/ cm2 , and cultured in an environment of 37°C and 5% CO2 concentration. In this case, it is preferable to culture until the cell occupancy rate in the culture substrate is approximately 70 to 80% (so-called subconfluent state).
  • the present disclosure provides a cell detachment system.
  • the cell detachment system disclosed herein is a cell detachment system having a detachment unit that detaches adherent cells cultured on a culture substrate, and a control unit, wherein the detachment unit has a vibration imparting unit that imparts ultrasonic vibrations to the culture substrate, and a shear force imparting unit that imparts shear force to the culture surface of the culture substrate, and the control unit controls the start of driving of the vibration imparting unit to occur before the start of driving of the shear force imparting unit.
  • the cell detachment system of the present disclosure is characterized in that the shear force applying unit applies shear force to the culture surface by at least one means selected from beating, shaking, rocking, and eccentric rotation applied to the culture substrate.
  • control unit has a shear force control unit that controls the shear force application unit, and the shear force control unit controls the shear force application unit so as to change the magnitude of the shear force over time.
  • the control unit of the cell detachment system disclosed herein includes a shear force control unit that controls the shear force application unit, and the shear force control unit controls the shear force application unit so as to periodically change the magnitude of the shear force.
  • the control unit of the cell detachment system disclosed herein has a shear force control unit that controls the shear force application unit, and the shear force control unit controls the shear force application unit to change the direction of the applied shear force based on at least one selected from the group consisting of the size, shape, adhesion area, and brightness value of the cell.
  • the control unit may be integrated with a shear force control unit, i.e., it may control the vibration applying unit so that it starts to drive before the shear force applying unit starts to drive, and it may also control the shear force applying unit.
  • the control unit may be separated into a part that controls the shear force control unit so that it starts to drive before the vibration applying unit starts to drive, and a shear force control unit.
  • the shear force applying unit may be provided with a shear force control unit separate from an information processing device that controls the vibration applying unit so that it starts to drive before the shear force applying unit starts to drive.
  • the cell detachment system 61000 illustrated in Figure 6 includes a detachment unit 61001 that detaches adherent cells cultured on a culture substrate 621, and a control unit 61002.
  • the detachment unit 61001 includes a vibration applying unit 6102 that applies ultrasonic vibrations to the culture substrate 621, and a shear force applying unit 6103 that applies shear force to the culture surface of the culture substrate.
  • the control unit 61002 controls the start of driving of the vibration applying unit 6102 to occur before the start of driving of the shear force applying unit 6103.
  • the vibration applying unit 6102 that constitutes the detachment unit 61001 includes a vibrating body 6101, a vibration transmission member 613, and a cover 615.
  • the vibrating body 6101 includes a vibration plate 611 and a piezoelectric body 612.
  • the shear force applying unit 6103 includes a tapping unit 617 and a tapping member 616.
  • the control unit 61002 is composed of a vibration control unit 619 that controls the vibration applying unit 6102, a shear force control unit 618 that controls the shear force applying unit, and a main control unit 620.
  • the vibration control unit 619, shear force control unit 618, and main control unit 620 may be integrated or separated.
  • Figure 6 further shows an example in which the culture substrate 621 is covered with a culture substrate top cover 622, and a weight 614 is placed on top of it.
  • the cell detachment system 7001 illustrated in Figure 7 is a cell detachment system having a detachment unit 71001 that detaches adherent cells cultured on a culture substrate 721, which is a dish in this example, a control unit 71002, and a cell information acquisition unit 71003.
  • the peeling unit 71001 has a vibration applying unit 7102 that applies ultrasonic vibrations to the culture substrate 721 held by the holding member 722, and a shear force applying unit 7103 that applies shear force to the culture surface of the culture substrate.
  • the shear force applying unit 7103 is a biaxial vibration mechanism.
  • the cell information acquisition unit 71003 has a mechanism for acquiring cell information about cells adhered to the culture substrate.
  • the cell information acquired by the cell information acquisition unit 71003 may be processed by the control unit 71002, and the control unit 71002 may control the detachment unit 71001 based on the cell information.
  • the acquired cell information is used to execute the information acquisition step (step S220) and can be used, for example, to determine whether to transition from the vibration application step to the shear force application step, or to determine whether to terminate the vibration application step or the shear force application step.
  • the control unit 71002 also functions as a computer that performs calculations and storage.
  • the control unit 71002 is equipped with a CPU (Central Processing Unit) 706, RAM (Random Access Memory) 707, ROM (Read Only Memory) 708, and HDD (Hard Disk Drive) 709 to perform calculations and store data. It also includes a control unit 71002, a communication I/F (interface) 710, a display device 711, and an input device 712.
  • the CPU 706, RAM 707, ROM 708, HDD 709, communication I/F 710, display device 711, and input device 712 are interconnected via a bus 713.
  • the display device 711 and input device 712 may also be connected to the bus 713 via a drive device (not shown) for driving these devices.
  • control unit 71002 the various components that make up the control unit 71002 are shown as an integrated device, but some of these functions may be configured by external devices.
  • the display device 711 and input device 712 may be external devices separate from the components that make up the computer's functions, including the CPU 706, etc.
  • the CPU 706 performs predetermined operations in accordance with programs stored in the RAM 707, HDD 709, etc., and also has the function of controlling each part of the control unit 71002.
  • the RAM 707 is made up of a volatile storage medium and provides temporary memory space necessary for the operation of the CPU 706.
  • the ROM 708 is made up of a non-volatile storage medium and stores necessary information such as programs used to operate the information processing system 705.
  • the HDD 709 is made up of a non-volatile storage medium and is a storage device that stores information regarding the number and positions of individual independent separation compartments, fluorescent light intensity, etc.
  • the communication I/F 710 is a communication interface based on standards such as Wi-Fi (registered trademark) and 4G, and is a module for communicating with other devices.
  • the display device 711 is a liquid crystal display, OLED (organic light-emitting diode) display, etc., and is used to display moving images, still images, text, etc.
  • the input device 712 is a button, touch panel, keyboard, pointing device, etc., and is used by the user to operate the information processing system 705.
  • the display device 711 and input device 712 may be formed integrally as a touch panel.
  • HDD 709 may be replaced with an SSD (Solid State Drive) that uses semiconductor elements such as flash memory, or may be replaced with cloud storage.
  • SSD Solid State Drive
  • the CPU 706 loads a program stored in the ROM 708 or the like into the RAM 707 and executes it, thereby controlling the vibration applying unit so that it starts to drive before the shear force applying unit starts to drive, and also controlling the vibration applying unit and the shear force applying unit.
  • the CPU 706 also controls the display device 711 to realize the functions of the display unit 711.
  • the CPU 706 also controls the HDD 709 to realize the functions of the storage unit.
  • CHO-K1 Choinese Hamster Ovary cells were seeded at a density of 10,000 cells/ cm2 onto a ⁇ 60 polystyrene dish (manufactured by Corning Incorporated), an example of a culture substrate, and cultured at 37°C in a 5% CO2 atmosphere.
  • the culture medium used was Ham's F12 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific). Culture was performed for 48 hours, and the cells were observed under a phase-contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell area coverage of the culture substrate was approximately 80%.
  • A549 cells Human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells, A549 cells, were seeded at a density of 10,000 cells/ cm2 onto a ⁇ 60 polystyrene dish (Corning), an example of a culture substrate, and cultured at 37°C in a 5% CO2 atmosphere.
  • the culture medium used was DMEM (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, Thermo Fisher Scientific). Culture was continued for 48 hours, and the cells were observed under a phase-contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell area coverage of the culture substrate was approximately 80%.
  • hMSCs Human mesenchymal stem cells
  • hMSCs Human mesenchymal stem cells
  • the culture medium used was Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (manufactured by Promocell) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific). Culture was continued for 7 days, with the medium replaced every 48 hours. Cell adhesion and proliferation were confirmed by observing the cells under a phase-contrast microscope. The cell area coverage of the culture substrate was approximately 80%.
  • Mouse macrophage-like cells (Culture of mouse macrophage-like cells on a culture substrate)
  • Mouse macrophage-like cells (RAW264.7) were seeded at a density of 20,000 cells/ cm2 onto a ⁇ 60 polystyrene dish (Corning), an example of a culture substrate, and cultured at 37°C in a 5% CO2 atmosphere.
  • the culture medium used was DMEM (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, Thermo Fisher Scientific). Culture was performed for 48 hours, and the cells were observed under a phase-contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell area coverage of the culture substrate was approximately 80%.
  • PBS(-) phosphate buffered saline
  • An adhesive strength evaluation device 1700 was prepared by combining a silicone tube 1701, a tube pump 1702, a reservoir tank 1703, a three-way valve 1704, a needle 1705, and a nozzle 1707 as shown in Figure 8.
  • a culture substrate 1706 on which cells were cultured was positioned so that the distance between the tip of a 1.04 mm inner diameter nozzle 1707 and the culture surface was 17 mm, and PBS was sprayed from the nozzle 1707 perpendicular to the culture surface at 0.65 mL/s for 3 seconds to apply shear force. After spraying, the PBS was removed from the culture substrate, and the position of the boundary of the cells detached by the spray (the size of the detached circle) was observed, and the shear force generated at that position was calculated using Ansys Fluent and used as adhesive strength.
  • the culture substrate was set under a phase-contrast microscope, and a phase-contrast image was observed at a magnification of 40.
  • the projected areas of the cells within the field of view of the phase-contrast image were determined, and the average value was taken as the cell adhesion area.
  • the culture substrate was set on a stage, and the average brightness value was calculated from an image of the culture surface of the dish observed under oblique incidence illumination, and this was used as brightness information of the cells.
  • each device For the application of vibration and shear force, the vibration imparting mechanisms of devices 1 to 8 or shear force imparting mechanisms such as shaking, beating, rocking, vortex stirring, and jetting were used, respectively.
  • the devices 1 to 9 used are shown in FIGS. 9 to 17, respectively.
  • the device 1 is a device having a vibration imparting mechanism, and includes a holding mechanism 11 for holding a culture substrate 10 and an ultrasonic band vibration imparting mechanism 12. Details of the ultrasonic band vibration imparting mechanism 12 are shown in Table 1.
  • device 2 is a device with a shear force application mechanism, and includes a holding mechanism 11 for holding the culture substrate 10 and a biaxial shaking mechanism 131.
  • device 3 is a device having a vibration imparting mechanism and a shear force imparting mechanism, and includes a holding mechanism 11 that holds the culture substrate 10, an ultrasonic band vibration imparting mechanism 12, and a biaxial shaking mechanism 131. Details of the ultrasonic band vibration imparting mechanism 12 are shown in Table 1.
  • device 4 is a device with a shear force application mechanism, and includes a holding mechanism 11 for holding the culture substrate 10, and a rotation mechanism 132 and a beating mechanism 133 for applying shear force.
  • device 5 is a device having a vibration mechanism and a shear force mechanism, and includes a holding mechanism 11 for holding the culture substrate 10, an ultrasonic vibration mechanism 12, and a rotation mechanism 132 and a beating mechanism 133 for applying shear force. Details of the ultrasonic vibration mechanism 12 are shown in Table 1.
  • device 6 is a device with a shear force application mechanism, and includes a holding mechanism 11 that holds the culture substrate 10, and a swinging mechanism 134.
  • the device 7 is an apparatus with a shear force application mechanism, and includes a holding mechanism 11 for holding the culture substrate 10, a jet mechanism 135 for applying shear force, an XY moving stage 14, and a Z moving stage 15. Using the stage movement, jets were applied to the culture substrate at 10 mm intervals, as shown in Figure 15B.
  • device 8 is a device with a shear force application mechanism, and includes a holding mechanism 11 that holds the culture substrate 10 and a flow mechanism 136 for applying shear force.
  • the ring device when the ring device is used in standing wave mode, it is possible to impart bending vibrations in a vibration mode in which the maximum amplitude acts on the center of the culture substrate in the frequency band used.
  • the ring device When the ring device is used in traveling wave mode, it is possible to impart bending vibrations in a vibration mode in which the maximum amplitude acts on a position two-thirds of the way from the center with respect to the outer diameter of the culture substrate in the frequency band used. Furthermore, by using traveling wave mode, it is possible to impart vibrations in which these bending vibrations rotate circumferentially around the center as an axis.
  • a Langevin device When a Langevin device is used, it is possible to impart vibrations with a nearly flat vibration distribution in which the center has the maximum amplitude across the entire area of the culture substrate.
  • Table 1 below shows vibration conditions 1 to 8, which are the conditions used by the ultrasonic vibration mechanisms of devices 1, 3, and 5.
  • Apparatus 2 ( FIG. 10 ) and apparatus 3 ( FIG. 11 ) had a biaxial shaking mechanism 131 as a shear force application mechanism.
  • Apparatuses 2 and 3 were equipped with a holding mechanism for holding a culture substrate on a biaxial shaking mechanism capable of applying shear force by shaking using an automatic stage that moved independently in the x and y directions, or an ultrasonic vibration application mechanism with a holding mechanism already installed.
  • the culture substrate was placed on the holding mechanism, and the biaxial shaking mechanism was operated at an ambient temperature of 37°C under the driving conditions shown in Table 2 to apply shear force.
  • Table 2 below shows movement conditions 1 to 4, which are the conditions used in the two-axis shaking mechanisms of devices 2 and 3.
  • the device 4 (FIG. 12) or the device 5 (FIG. 13) had a rotating mechanism 132 and a beating mechanism 133 as a shear force applying mechanism.
  • Apparatus 4 and Apparatus 5 were devices that combined a beating mechanism capable of applying shear force through beating, a culture substrate holding mechanism, and a rotation mechanism capable of rotating the holding mechanism, with Apparatus 5 also incorporating an ultrasonic vibration mechanism.
  • the culture substrate was set in the holding mechanism, and then shear force was applied to the outer periphery of the culture substrate at an ambient temperature of 37°C by varying the force, frequency, and force application position as shown in Table 3.
  • Table 3 below shows drive conditions 1 to 3, which are drive conditions for the rotation mechanisms of devices 4 and 5.
  • device 6 had a rocking mechanism as shown in FIGS. 14A and 14B
  • device 7 had a jet mechanism 135 as shown in FIGS. 15A and 15B
  • device 8 had a flow mechanism 136 as shown in FIG. 16.
  • the shear force was applied by the following methods.
  • device 6 for the rocking, device 6 was used, in which a culture substrate holding mechanism was installed on a rocking mechanism using a stage that moves on an arc with the center as a fulcrum as shown in FIG. 14A.
  • Figure 14B shows an image of the stage movement when shaking is applied.
  • the culture substrate was set in the holding mechanism, and then shear force was applied at an ambient temperature of 37°C at the speed and with the operation shown in Operating Condition 1 in Table 4.
  • the vortex mixer used was a culture substrate holding mechanism in which the sample mounting section of a Vortex Genie 2 (SI-0286; Scientific Industries) had been modified to allow for holding of a culture substrate.
  • the culture substrate was set and fixed in the holding mechanism, and shear force was applied at the speed and operation shown in Operating Condition 2 in Table 4 at an ambient temperature of 37°C. Because the speed varies depending on factors such as the load weight on the mixer, a culture substrate filled with the same amount of liquid was set on the holding mechanism in advance, and the mixer operating conditions were determined to achieve the set speed by observing it with a high-speed camera.
  • Apparatus 7 was used, in which the culture substrate holding mechanism was placed on an XY moving stage capable of moving in the XY directions as shown in Figure 15A, and a Z moving stage equipped with a jet flow mechanism using an electric pipettor was also installed.
  • the culture substrate was set in the holding mechanism, and at an ambient temperature of 37°C, the pipette volume was set to 1 mL for each position on the culture substrate corresponding to the top view of the culture substrate shown in Figure 15B.
  • Shear force was applied at the speed and operation shown in Operation Condition 3 in Table 4.
  • the operation at each position involved repeated suction and discharge twice over a period of 3 seconds, followed by moving to the next position over a period of 1 second, and then repeating the same operation.
  • the time required for the shear force application step will be 83 seconds.
  • a flow mechanism 136 that can be installed on the culture substrate was used, connected to a pump that can set the flow rate, and a device was used to make the liquid flow.
  • the culture substrate was set in the holding mechanism, and shear force was applied at an ambient temperature of 37°C, using the speed and operation shown in Operating Condition 4 in Table 4.
  • Table 4 below shows the operation under operating condition 1 (oscillation by device 6), operating condition 2 (eccentric rotation by vortex), operating condition 3 (jet by device 7), and operating condition 4 (flow by device 8).
  • step [2] For the peeling operation of step [2], a shear force was applied under the conditions shown in Table 5, starting 30 seconds after the application of ultrasonic vibrations had finished, using the mechanism of each shear force application device shown in Table 5.
  • each shear force application device shown in Table 5 was operated under each of the conditions to apply shear force, starting 30 seconds before the application of ultrasonic vibrations was completed.
  • step [2] the dish was rocked when placed on the holding mechanism of the shear force imparting device mechanism shown in Table 5, and it was confirmed that cell detachment was not complete in the detachment operation for step [1].
  • step [2] For the peeling operation of step [2], a shear force was applied under the conditions shown in Table 5, starting 30 seconds after the application of ultrasonic vibrations had finished, using the shear force application device mechanism shown in Table 5.
  • the dish was shaken when set on the holding mechanism of a shear force-applying device shown in Table 5, i.e., device 2, to confirm that cell detachment was not complete in the detachment operation for step [1].
  • step [2] a shear force was applied under the conditions shown in Table 5, starting 30 seconds after the application of ultrasonic vibrations had finished, using the shear force application device shown in Table 5, i.e., device 2.
  • step [2] ultrasonic band vibration was applied under the conditions shown in Table 5 using the ultrasonic band vibration application mechanism, i.e., device 1, 30 seconds after the application of shear force was completed.
  • Cell adhesion was evaluated using the following method. Three additional dishes in which cells had been cultured under the same conditions were prepared for cell information acquisition, and the culture medium in the dishes was replaced with a detachment solution. One of the dishes was sprayed with PBS under the conditions described above using the adhesion evaluation device 1700 shown in Figure 8, as described in the adhesion evaluation method described above, to apply shear force. After spraying, the PBS was removed from the culture substrate, and the position of the boundary of the cells detached by the spraying was observed. The shear force generated at that position was calculated using Ansys Fluent, and this was defined as adhesion force A1.
  • step [1] When sprayed using the adhesion evaluation device, cells on the culture surface of the dish detach in an approximately circular shape centered on the spraying position.
  • the position of the boundary of the detached cells that results in this circular boundary can also be referred to as the detachment circle.
  • the shear force was calculated by averaging the vertical diameters of the obtained detachment circles.
  • step [2] the adhesive strength of one of the dishes was evaluated in the same manner as described above using the adhesive strength evaluation device. The adhesive strength at this time was designated as A2.
  • step [2] For the remaining dish, the peeling operation of step [2] was performed, and then the adhesive strength was evaluated in the same manner as described above using the adhesive strength evaluation device.
  • the adhesive strength at this time was designated A3.
  • the adhesive strength can be evaluated in the range of 1 to 80 Pa under the conditions described above. If, after spraying PBS during adhesive strength measurement, the boundary of the peeled circle caused by spraying was not detected, or if the diameter of the peeled circle was small and the evaluated adhesive strength was a value of 80 Pa or greater, the adhesive strength was deemed to be 80 Pa or greater. However, if the diameter of the peeled circle became large and the adhesive strength was calculated as a value less than 1 Pa, it was uniformly deemed to be less than 1 Pa. Furthermore, with regard to the magnitude relationship of adhesive strength when the diameter of the peeled circle caused by spraying was larger, the adhesive strength was deemed to be smaller. From the obtained adhesive strengths A1, A2 and A3, it was confirmed whether the relationship A1>A2>A3 was satisfied.
  • Cell information acquisition method 2 The cell adhesion area was evaluated as follows. After replacing the culture medium in the cell-cultured dish with a detachment solution, the cells were placed under a phase-contrast microscope (Axio Obserer 7; manufactured by Carl Zeiss) and observed under phase contrast, as described in the cell adhesion area evaluation method. The average value was calculated from the sum of the projected areas of the cells within a 40x magnification field, and designated the cell adhesion area B1. Next, the detachment operation of step [1] was performed according to the detachment method described above, and phase-contrast observation was performed using a phase-contrast microscope immediately before starting step [2]. The cell projection area was calculated as described above.
  • This value was designated the cell adhesion area B2.
  • phase-contrast observation was performed using a phase-contrast microscope, and the cell projection area was calculated as described above. Cells with blurred outlines were considered to be non-adherent and floating, and their adhesion area was considered to be 0, and the average was calculated. This value was designated the cell adhesion area B3. From the obtained cell adhesion areas B1, B2 and B3, it was confirmed whether the relationships B2 ⁇ 0.5 ⁇ B1 and 0 ⁇ B3 ⁇ B2 were satisfied.
  • Cell information acquisition method 3 The evaluation of cell brightness information was performed using the following method. After replacing the culture medium in the cell-cultured dish with a detachment solution, optical measurements were performed as described above for evaluating cell brightness information. Specifically, the dish was placed on a stage, and an oblique incidence light source was set on the top surface of the dish and a camera was set on the bottom surface of the dish to obtain an image of the culture surface of the dish. From the images thus obtained, the average brightness value of the culture surface was calculated and designated as cell brightness information C1.
  • step [1] the detachment operation of step [1] was performed according to the above-described detachment method, and immediately before starting step [2], the dish was placed on the stage in the same manner as described above, and the average brightness value was calculated from the image of the culture surface of the dish observed with oblique incidence light. This value was designated as cell brightness information C2. From the obtained cell brightness information C1 and C2, it was confirmed whether the relationship C1 ⁇ C2 was satisfied.
  • Example 1 CHO cells on a dish were detached using detachment method 1. The detached cells were collected and then counted using a hemocytometer. The viability was calculated using a viability test using trypan blue staining. Furthermore, all cells that could not be detached by ultrasound were detached from the dish using a cell scraper, and the cell count was measured using a hemocytometer. The total number of detached cells was calculated by adding the number of cells detached by ultrasound and the number of cells subsequently detached with the cell scraper. The detachment rate was calculated as the ratio of the number of ultrasonically detached cells to the total number of detached cells. The resulting viability was 96.0%, and the detachment rate was 98.0%. A viability and detachment rate of 90% or higher was considered good. The cell types used, detachment methods, calculated viability, and detachment rates are shown in Table 6.
  • Adhesion force was obtained according to the method shown in the cell information acquisition method 1 described above.
  • Adhesion force A1 was evaluated using the adhesion force evaluation device described above after the culture medium in the dish was replaced with the detachment solution. Since no detached circle where cells had been detached by the spray was observed, it was determined that A1 > 80 Pa.
  • Adhesion force A2 was evaluated immediately before the start of step [2], and since the diameter of the detached circle caused by the spray was large, it was determined that A2 ⁇ 1 Pa.
  • Adhesion force A3 was evaluated after the completion of step [2], and since the diameter of the detached circle was large as described above, it was determined that A3 ⁇ 1 Pa.
  • the cell adhesion area was determined by the average area within the field of view according to the method described in Cell Information Acquisition Method 2 above.
  • Adhesion area B1 was evaluated after the culture medium in the dish was replaced with the detachment solution, and was 528 ⁇ m2.
  • Adhesion area B2 was evaluated immediately before the start of step [2], and was 192 ⁇ m2 .
  • adhesion area B3 was evaluated after the end of step [2], and, taking into account that most of the cells had detached, was averaged at 2 ⁇ m2. It was confirmed that these values satisfied the relationships B2 ⁇ 0.5 ⁇ B1 and 0 ⁇ B3 ⁇ B2.
  • Cell brightness information was obtained using the method described above in Cell Information Acquisition Method 3.
  • Brightness information C2 was evaluated immediately before starting step [2], and was 108.1. It was confirmed that these values satisfied the relationship C1 ⁇ C2.
  • Example 2 to 34 Comparative Examples 1 to 6
  • Example 2 to 34 and Comparative Examples 1 to 6 the combination of cell type and detachment method was changed, and the operations after detachment were evaluated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 6.
  • Table 7 also shows the results of cell information obtained for each representative example of the present disclosure. From these results, a threshold value for cell information used to determine whether to proceed to the shear force application process can be determined.
  • the threshold value for brightness information which can be obtained using a simple optical system, can be determined by referring to the smallest value in the brightness information column C2 in Table 7.
  • the brightness information threshold can be set to 105. By monitoring the brightness information values over time using the set threshold, it becomes possible to determine the timing to proceed to the shear force application process. Because the brightness information threshold value may vary depending on the cell type and culture conditions, experimental data can be acquired and the threshold value can be set in advance. The amount of change in brightness information per unit time can also be set as the threshold. The ultrasound intensity can also be determined based on the change in brightness information over time.
  • the present disclosure provides a cell detachment method and a cell detachment system using the same that increase both cell survival rate and detachment rate.

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Abstract

細胞を培養基材から剥離する際に、細胞の生存率と剥離率がともに高くなるような細胞剥離方法及び細胞剥離システムを提供すること。培養基材の上で培養された接着細胞の剥離方法であって、前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を付与する振動付与工程、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与するせん断力付与工程を含み前記振動付与工程の開始が、前記せん断力付与工程の開始よりも先であり、前記せん断力は超音波の振動以外の手段によって付与されることを特徴とする細胞の剥離方法を提供する。

Description

細胞剥離方法及び細胞剥離システム
　本開示は、細胞剥離方法及び細胞剥離システムに関するものである。
　細胞医薬・再生医療の分野においては、大量の細胞が必要であり、特に、生体組織の多くを占める接着性細胞を効率的かつ安定的に供給することが求められている。
　接着性細胞の培養においては、例えばポリスチレン製ディッシュのような培養基材上での細胞の培養、培養基材からの細胞の剥離、細胞の回収及び洗浄の各工程を経て、目的とする細胞を取得する。細胞をさらに増やす際には、取得した細胞の一部を新しい培養基材に移して培養する、いわゆる継代操作を行なう。このような細胞の取得、及び継代培養の工程の中でも、細胞に対するダメージを与えずに、高い剥離率で回収するために、剥離方法の検討がされている。
　一方、せん断力を用いた細胞剥離方法が提案されている。特許文献１には、細胞と、培地又は液体とを保持する容器に対して超音波振動を付与し、細胞の少なくとも一部を容器から剥離させる細胞剥離装置の開示がある。また特許文献２には、培養液の流動による機械的な刺激により細胞を剥離させる方法の開示がある。本発明者らは上記先行技術について課題を見出した。すなわち、容器に対する接着力が大きい細胞のように、剥離が困難な細胞を取り扱う場合などに、より剥離効率が強い条件で剥離を行うと細胞の生存率が低下する場合がある。
国際公開第２０１６／０４７３６８号明細書 特開第２０１３／５７６３６号公報
　そこで本開示は、細胞の生存率と剥離率がともに高くなるような細胞剥離方法、及びそれを用いた細胞剥離システムを提供することを目的とする。
　本発明者らは、細胞の剥離方法を検討する中で、培養基材に超音波帯域の振動を付与した後に培養基材の培養面に対してせん断力を付与した場合に、細胞にダメージを与えることなく高効率に剥離が可能である事を見出した。
　すなわち、本開示に係る細胞剥離方法は、培養基材の上で培養された接着細胞の剥離方法であって、前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を付与する振動付与工程、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与するせん断力付与工程を含み、前記振動付与工程の開始が、前記せん断力付与工程の開始よりも先であり、前記せん断力は超音波の振動以外の手段によって付与されることを特徴とする。
　また、本開示に係る細胞剥離システムは、培養基材の上で培養された接着細胞を剥離する剥離部、及び制御部を有する細胞剥離システムであって、前記剥離部は、前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を与える振動付与部、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与する、せん断力付与部を有し、前記制御部は、前記振動付与部の駆動の開始が、前記せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御することを特徴とする。
　細胞にダメージを与えることなく高効率な剥離を可能とする。 
本開示の細胞の剥離方法を説明する図である。 本開示の細胞の剥離方法を説明する図である。 本開示の細胞の剥離方法を説明する図である。 本開示の細胞の剥離方法を説明する図である。 本開示の圧電体の一例を説明する概略図である。 本開示で超音波帯域の振動を与える振動付与の機構を説明する図である。 ボルト締めランジュバン型振動子を説明する図である。 張り付け型振動子を説明する図である。 本開示の細胞剥離システムの一例を示す図である。 本開示の細胞剥離システムの一例を示す図である。 本開示の実施例で用いた接着力測定装置を説明する図である。 本開示の実施の形態で利用できる超音波帯域の振動を付与する機構を有する装置１を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置２を説明する図である。 本開示の実施の形態で利用できる超音波帯域の振動とせん断力を付与するために用いる機構を有する装置３を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置４を説明する図である。 本開示の実施の形態で利用できる超音波帯域の振動とせん断力を付与するために用いる機構を有する装置５を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置６を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置６を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置７を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置７を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置８を説明する図である。 本開示でせん断力を付与するために用いる機構を有する装置９を説明する図である。
　本発明のさらなる特徴について、例示的な実施形態の以下の説明及び添付図面を用いより詳細に説明する。はじめに、本開示の実施形態に係る細胞剥離方法について説明する。
（細胞剥離方法）
　本開示は、培養基材の上で培養された接着細胞の剥離方法であって、前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を付与する振動付与工程、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与するせん断力付与工程を含み、前記振動付与工程の開始が、前記せん断力付与工程の開始よりも先であり、前記せん断力は超音波の振動以外の手段によって付与されることを特徴とする細胞の剥離方法を提供する。
　本開示の細胞剥離方法の具体例の一形態を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
　図１Ａに示すように、まず、培養基材を設置して超音波帯域の振動を付与する振動付与工程（ステップＳ１１０）を開始する。
　次いで、培養基材を設置してせん断力付与工程（ステップＳ１４０）を開始する。最後に、剥離された細胞を回収する（ステップＳ１５０）。
　また、図１Ｂに示すように、振動付与工程（ステップＳ１１０）の開始は、せん断力付与工程（ステップＳ１４０）の開始より先に行われる。
　さらなる一形態を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
　図２Ａに示すように、まず、培養基材を設置して超音波帯域の振動を付与する振動付与工程（ステップＳ２１０）を開始する。その後、培養基材の細胞情報を取得する情報取得工程（ステップＳ２２０）を実行する。取得した細胞情報に基づいて、せん断力付与工程の開始タイミングを決定するせん断力付与工程開始時刻決定工程（ステップ２３０）を実行する。次いで、培養基材を設置してせん断力付与工程（ステップＳ２４０）を開始する。
　最後に、剥離された細胞を回収する（ステップＳ２５０）。
　また、図２Ｂに示すように、振動付与工程（ステップＳ２１０）の開始は、せん断力付与工程（ステップＳ２４０）の開始より先に行われる。
（振動付与工程）
　振動付与工程では、培養基材に対して超音波帯域の振動を与えることによって、培養基材から細胞を剥離しやすくする。
　本発明者らは、超音波帯域の振動を細胞が培養されている培養基材に対して与えると、細胞が培養基材から剥離する前の段階において、細胞の接着力を低下させることができることを見出し、この作用を積極的に利用することを検討した。
　本開示の超音波帯域の振動とは、１０ｋＨｚ以上１ＭＨｚ以下の周波数をもつ振動のことを指す。また、振動付与工程の超音波帯域の振動を付与する時間としては特に限定はないが、細胞の接着力を効果的に低下させ、細胞の生存率も高める観点からは、例えば１秒以上１時間以下、好ましくは１０秒以上３０分以下、さらに好ましくは３０秒以上１５分以下である。本開示の細胞剥離方法における細胞の環境（細胞剥離液の種類や環境温度、ＣＯ２濃度など）によっては、長時間にわたり超音波振動が付与されることが好ましくない場合がある。また、時間が短すぎると超音波帯域の振動によって細胞の接着力が十分に低下しない場合がある。
　振動付与工程の超音波帯域の振動の振動面の最大振幅としては、特に制限はないが、細胞生存率を維持する観点からは、１０μｍ以下が望ましい。この範囲であれば、振動体の発熱の影響を抑え、細胞に接着力を低下させるために適した量の振動のエネルギーを伝えることができる。また、振幅を１０μｍ以下とすることで超音波帯域の振動印加時にキャビテーションが発生しづらくなり、細胞生存率が低下しづらくなるため好ましい。
　超音波帯域の振動の方向は、培養面に対して垂直な方向の成分を含むことが好ましい。
　本開示において、超音波帯域の振動の方向とは、超音波帯域の振動を発生させる振動体の振動面と、超音波帯域の振動を伝達させる振動伝達部材とを結ぶ方向を指す。
　特に培養基材の底面より超音波帯域の振動を付与することで、培養面に対して垂直な方向の成分を有する超音波帯域の振動を付与することが可能となり、また、培養面に対して垂直な方向の成分を含むことで、細胞の接着力を低下させやすくなる。
　超音波帯域の振動パターンは、振動付与手段として使用する振動体や、超音波デバイスの種類によって様々な振動モードを使用することができる。その中で細胞種や剥離の条件に応じて様々な振動モードを選択することができるが、好ましくは容器全体において均一な振幅が励起される振動モードであり、例えばランジュバン型振動子のように面内均一性の高い振動体を使用する場合が挙げられる。また、円環状圧電素子をガラス板などに張り付けたリング状振動子のように曲げ振動で様々な振動モードを発生させることができる振動体を使用する場合は、複数に電極を分割することで発生させることができる進行波や搬送波など一定周期で均一な振幅を付与するモードが好ましい。培養基材器底面における面内の振幅が均一に近づくことで超音波帯域の振動を印加した際に容器の任意の位置間における振幅変化が小さくなるため、培養している細胞間の影響差を少なくすることが可能である。
　また、振動付与手段に用いる振動体の種類や駆動方法によっては、駆動中に発熱する場合がある。印加電圧や使用周波数帯、装置環境にもよるが、共振周波数での駆動を続けることで、この傾向が強まる傾向にある。それに対し、一定間隔で駆動と休止を繰り返すこと（バースト駆動）や、一定の周波数範囲内で繰り返し、かつ、連続的に駆動周波数を変化させること（スイープ駆動）、などを単独、或いは併用することで、発熱量を制御することが可能である。さらに、発熱を抑制するために、振動付与手段の周辺に冷却のための機構を備えて振動体を直接的に、或いは環境温度を介して間接的に制御することもできる。
　また、駆動中の振動体の発熱によって共振周波数が変化する場合があり、その場合は公知の、例えば電流検知による共振周波数追従制御などを行うこともできる。
　振動付与工程を行う際の環境温度としては特に限定はなく、使用する細胞種に応じて適宜設定することができる。細胞生存率を維持する観点からは、２０℃以上４０℃以下が好ましく、例えば哺乳動物細胞の場合、特に３０．０℃以上３７．５℃以下であることが好ましい。この範囲であれば、環境の温度が培養時の温度と近く、細胞への温度変化による影響を少なくでき、生存率を高く保つことができるためである。培養基材として例えば温度応答性膜を使用している公知の容器を使用する場合、振動付与工程の環境温度としては温度応答性に対応した温度域としても構わない。
　振動付与工程は細胞培養と同様にＣＯ２濃度５％の環境下で行っても構わない。振動付与工程を行う際の環境条件については細胞の種類や特性、剥離後の細胞使用方法に応じて適宜設定することができる。
（せん断力付与工程）
　せん断力付与工程では、培養基材の培養面に対してせん断力を加えることにより、培養基材から細胞を剥離させる。
　本発明者らは、さらに、培養された接着細胞は、超音波帯域の振動により培養基材に対する細胞の接着力を低下させると、せん断力の付与によって、より顕著に剥離しやすくなることを見出した。せん断力とは、細胞に対して側方から作用させる力をいう。つまり、超音波帯域の振動により接着力を低下させた後、細胞に側方から剥離させる力として、せん断力を別途加えることにより、細胞の生存率を下げることなく剥離することができるようになった。
　ここで、せん断力の付与方法としては、少なくとも培養基材へ付与される叩打（培養基材の叩打）、振とう（培養基材の振とう）、揺動（培養基材の揺動）、及び偏心回転（培養基材の偏心回転）、培養基材への液体の吐出、培養基材上での液体の撹拌などが挙げられる。なお、超音波の振動によって付与されるものは、せん断力には含めない。せん断力は超音波の振動以外の手段によって付与されるものとする。具体的には、以下の例が挙げられる。
　培養基材の叩打の例としては、適切な質量を有する部材を培養基材に衝突させる事で、培養基材に対して撃力を与えることを挙げられる。衝突させる部材は、棒状であっても良く、ハンマー状や球状であっても良いが、部材を培養基材に衝突させることで撃力を与える手段はこれに限定するものではない。また、基材へ叩打を付与する叩打部は、培養基材を平坦或いは円弧状、突起状の部材に衝突させることで撃力を付与することもできるし、これらの方法を組み合わせることもできる。これらの中でも本開示の叩打部は、適切な質量を有する部材を培養基材に衝突させて培養基材に撃力を付与する手段を用いることが装置構成を小型化する観点から好ましい。
　また、衝突させる部材は与える衝撃力に応じて、適宜重さや原材料を選ぶことができ、原材料としては金属やセラミックスなどの無機材料や、樹脂やゴムなどの有機材料、さらにはこれらの複合体など公知の材料を用いることができる。
　衝突させる部材を動かす動力源としては、例えばモーターやソレノイドといった通電によって力を発生させ得る方法を使用することができる。また、それらの動力源を直接使用しても良く、バネのようにエネルギーを貯蔵できる部材を介して使用することもできる。
　本開示の叩打部は、叩打方向の対側に微小変形部材を配置して培養基材に与える衝撃力、慣性力を制御することも可能である。微小変形部材の形状としては接点を最小化する観点より、円柱状や半球状、或いはその組み合わせが好ましく、材料としては弾性体、すなわちゴム材料が好ましい。
　培養基材の振とうの例としては、培養基材の培養面に対し平行な方向成分を含む加速度を加えることで、培養基材内の液体に流れを発生させる構成を使用することを挙げられる。
　例えば、培養基材を、モーターで回転運動させた上で、スライドレールなどを用いて一軸の往復運動させる構成を使用することできる。また、リニアモーターなどを用いて培養基材を加速させることで培養面に対し平行な方向成分や非平行な方向成分を含む加速度を加える構成を使用することができる。振とうによって培養基材の培養面に対して平行な方向成分や非平行な方向成分を含む加速度を加えることができる構成になるように、振とうの軸を適宜設計することが可能である。
　本開示の振とうの具体例について例示する。
　例えば、水平方向や垂直方向に往復運動する往復振とうが挙げられる。往復振とうはそれぞれ水平又は垂直方向成分を含んでいれば良く、水平方向や垂直方向のみに振とうしても良いし、これらを組み合わせた形で斜めに振とうすることもできる。また、振とう軸は１つである一軸に限らず、例えば二軸や多軸などの複数軸で異なる振とう方向に振とうしても構わない。
　また、他の振とう方法としては例えば、水平方向成分を含む方向に円運動をする旋回振とうが挙げられる。旋回振とうは水平方向成分を含んでいれば良く、水平方向のみに振とうしても良いし、上下方向を含む形で斜めに振とうすることもできる。また、円運動は真円状や楕円状、八の字状、あるいはこれらを組み合わせた形状となっても構わない。
　また、他の振とう方法としては例えば、シーソー振とうが挙げられる。シーソー振とうは培養基材内の一点を軸としてシーソーのように往復運動する振とう方法を指し、水平方向の往復、垂直方向の往復、又はこれらを組み合わせた往復運動などが挙げられる。
　また、他の振とう方法としては例えば、振り子のように支点を有して円弧状に振とうする、揺動運動が挙げられる。
　培養基材の振とうはこれらの具体例を単独で使用しても良いし、組み合わせて使用しても構わない。
　培養基材の偏心回転としては、撹拌動作のような回転運動の回転軸を偏心させた回転運動が挙げられる。具体的には前述したように回転運動の回転軸を偏心させた構成、さらには水平偏心震動、ボルテックス撹拌といった方法が挙げられる。
　培養基材への液体の吐出の例としては、例えば、ニードルなどから液体を吐出し培養面にあてることで培養面に沿って液を拡散させ付与する方法や、図１５Ａ及び図１５Ｂに示し、後に説明するようにピペッターなどから液体を吐出、及び吸引を繰り返すことで培養面に沿って異なる方向から液の流れを付与する方法、さらには図１６に示し、のちに説明するような培養面に沿った流路を作成しポンプやシリンジを用いて一方向もしく方向を切り替えて送液することで付与する方法などが挙げられる。
　また、液体の撹拌の例としては、例えば、図１７に示すように撹拌翼を用いた撹拌機９などを用いて培養面に対して平行な流れを作りだすことで付与する方法、などが挙げられる。装置９は、図１７に示されるように、せん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と、せん断力付与するための、撹拌機構１３７を有する。
　液体の撹拌については、これら以外にも撹拌子を使用する方法など、公知の手法を用いることができる。
　これらのせん断力付与方法のうち好ましくは叩打、振とう、偏心回転、液体の吐出である。
　また、ここで例示したせん断力付与方法を単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
　培養面に与えられるせん断力の大きさは、せん断力付与工程中に時間的に変化させることが望ましい。時間的な変化とは、例えば単調や、一定の割合や、任意の変化量でせん断力が増加又は減少したり、増加や減少を周期的、複数種の組合せで、又はランダムに繰り返すことなどが挙げられる。さらに、せん断力の大きさに対して、例えば５％以上の周期で周期的に変化してもよいし、正弦波状に変化してもよいし、せん断力をパルス状に繰り返して与えてもよい。
　これらの時間的な変化はせん断力の強度が変化すれば良く、例えばせん断力の強さそのものが変化しても良いし、単位時間当たりのせん断力の力積としてせん断力の強度を変化させても良い。
　本開示のせん断力付与工程で与えられるせん断力の大きさは、周期的に変化することが好ましい。一定の周期で変化することで、単位時間あたりに均等に一定の強度域のせん断力を付与することが可能となるため、剥離を効率化する観点で好ましい。
　本開示のせん断力付与工程において、せん断力の働く方向を変化させることが望ましい。せん断力の働く方向の変化については、時間的に変化させる場合や、異なる方向からのせん断力を同時に付与する場合などがある。本開示で例示しているせん断力の種類とその方向の具体例としては、例えば液体の吐出のように一方向からのせん断力や、往復振とうのように一つの軸で切り返す場合や二つの方向からの叩打のように二種類の方向から作用させるせん断力や、二軸ステージで旋回振とうさせたり、培養基材を回転させながら叩打させたりと多数の方向からのせん断力などが挙げられる。
　また、せん断力の働く方向と、培養面に加えるせん断力の大きさが、せん断力付与工程中に変化することが望ましい。これは、細胞の生育状態や接着状態には細胞個々でばらつきがあるため、せん断力の大きさやせん断力の働く方向を変化させることで、多面的な力を細胞にかけることができ、個々の細胞ごとに適したせん断力を付与できるためではないかと考えている。
　せん断力の働く方向は、培養面に対して平行な方向の成分を含むことが好ましい。
　培養面に対して平行な方向の成分を含むことで、振動付与工程において接着力が低下した細胞を、効果的に剥離しやすくなる。
　せん断力付与工程において、せん断力を与える時間、すなわち、せん断力付与工程を行う時間としては特に限定はないが、細胞を効果的に剥離させ、細胞の生存率も高める観点からは、例えば１秒以上１時間以下、好ましくは５秒以上３０分以下、さらに好ましくは１０秒以上１０分以下である。せん断力を与える時間が長すぎると、せん断力によって細胞へ過剰なダメージを与える場合があり好ましくない。また、時間が短すぎると十分なせん断力を細胞に与えることができず、剥離効果が低くなる場合がある。
　せん断力付与工程を行う際の環境温度としては特に限定はないが、細胞生存率を維持する観点からは、２０℃以上４０℃以下が好ましく、特に３０．０℃以上３７．５℃以下であることが好ましい。この範囲であれば、環境の温度が培養時の温度と近く、細胞への温度変化による影響を少なくでき、生存率を高く保つことができるためである。培養基材として例えば温度応答性膜を使用している公知の容器を使用する場合、せん断力付与工程の環境温度としては温度応答性に対応した温度域としても構わない。
　また、せん断力付与工程は細胞培養と同様にＣＯ２濃度５％の環境下としても構わない。せん断力付与工程を行う際の環境条件については細胞の種類や特性、剥離後の細胞使用方法に応じて適宜設定することができる。
　また、本開示の細胞の剥離方法は、振動付与工程、又はせん断力付与工程以外のその他の工程を含んでも構わない。振動付与工程とせん断力付与工程の間にその他の工程を含んでもよいし、せん断力付与工程の実施中にその他の工程を含んでもよいし、せん断力付与工程の終了後にその他の工程を含んでもよく、また振動付与工程が開始する前に含んでもよい。
　その他の工程としては、剥離細胞回収工程、情報取得工程、せん断力付与工程開始時刻決定工程、さらには、上述の培養基材の液を細胞剥離液に置換する工程や、細胞剥離液で細胞をリンスする工程、剥離液を希釈したり均一化する工程などが挙げられる。
　振動付与工程、及びせん断力付与工程は一定の周期、又はランダムな周期で繰り返しても構わない。
　振動付与工程が実施される合計時間と、せん断力付与工程が実施される合計時間との比率は、０．０１以上、１００以下であることが好ましい。すなわち、振動付与工程が行われる時間をａ、前記せん断力付与工程が行われる時間をｂとしたとき、ａ及びｂの関係が式５を満たすことが好ましい。
　０．０１≦ａ／ｂ≦１００（式５）
　振動付与工程とせん断力付与工程の開始の時刻差は、振動付与工程の開始が、せん断力付与工程の開始よりも先であれば、特に限定がない。細胞の生存率を高める観点からは、時間差は例えば３０分以下、好ましくは１０分以下、さらに好ましくは５分以下である。
　また、せん断力付与工程は、振動付与工程が終了する前に開始してもよいし、振動付与工程の終了と同時に開始してもよいし、振動付与工程の終了後に開始しても構わない。せん断力付与工程を振動付与工程が終了する前に開始することで、細胞の接着力を弱めながらせん断力を付与することができ、より効果的に細胞を剥離することができる。また、振動付与工程からせん断力付与工程に移行する判断をするために、培養基材に接着した細胞情報を測定し、その測定情報を利用してもよい。
　また、振動付与工程が開始される時刻と、せん断力付与工程が終了する時刻との差については、特に限定がないが、細胞の生存率を高める観点からは、例えば１０秒以上、３０分以下が好ましい。また、振動付与工程の終了後にせん断力付与工程が終了してもよいし、振動付与工程が終了する前にせん断力付与工程が終了してもよく、さらに振動付与工程とせん断力付与工程が同時に終了しても構わない。また、振動付与工程又はせん断力付与工程を終了する判断をするために、培養基材に接着した細胞情報を測定し、その測定情報を利用してもよい。
　振動付与工程が開始される際の細胞と培養基材との接着力をＡ１、せん断力付与工程が開始される際の細胞と培養基材との接着力をＡ２、振動付与工程、及びせん断力付与工程がいずれも終了した際における細胞と培養基材との接着力をＡ３とした際、Ａ１、Ａ２及びＡ３の関係が式１を満たすことが好ましい。
　Ａ１＞Ａ２＞Ａ３（式１）
　前記振動付与工程の開始時刻における前記細胞と前記培養基材との接着面積をＢ１、前記せん断力付与工程の開始時刻における前記細胞と前記培養基材との接着面積をＢ２、前記振動付与工程及び前記せん断力付与工程のいずれも終了した時刻での接着面積をＢ３としたとき、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の関係が式２、及び式３を満たすことが好ましい。
　Ｂ２＜０．５×Ｂ１（式２）
　０≦Ｂ３＜Ｂ２（式３）
　Ｂ１とＢ２の関係がＢ２＜０．５×Ｂ１（式２）を満たすことで、振動付与工程によってせん断力付与工程開始時に細胞の接着力が十分低下し、せん断力を付与しても生存率が高い状態で細胞が剥離しやすくなる。また、（式３）を満たすことで、細胞の剥離率が高くなる。
　また、振動付与工程の開始時刻に細胞の光学的な測定によって取得される輝度情報をＣ１、せん断力付与工程の開始時刻に前記細胞の光学的な測定によって取得される輝度情報をＣ２としたとき、Ｃ１とＣ２の関係が式４を満たすことが好ましい。
　Ｃ１＜Ｃ２（式４）
　（式４）を満たすことで、細胞の剥離率が高くなる。
（情報取得工程）
　本開示の細胞の剥離方法は、さらに、細胞情報を取得する工程である、情報取得工程を有してもよい。そして、さらには、取得した細胞情報に基づいて、せん断力付与工程の開始タイミングを決定するせん断力付与工程開始時刻決定工程を有してもよい。
　本開示の細胞情報としては、細胞種、継代回数、培養時間のほかに、細胞の測定情報が挙げられる。
　本開示における測定情報の例としては、細胞の接着力や、細胞の面積、位相差顕微鏡画像（位相差画像とも呼ぶ）におけるハロ領域の面積、位相差画像における輝度値、斜入射照明により培養基材の細胞培養面を観察した際の輝度値などが挙げられる。
　細胞の接着力の測定情報の例としては、例えば、細胞培養面に対してせん断力が既知の水流などを噴射することで、せん断力を作用させて細胞を剥離し、細胞が剥離した領域の大きさから作用したせん断力を見積ることで、接着力とみなす方法が挙げられる。
　振動付与工程、及びせん断力付与工程での接着力の変化を評価することで、振動付与工程における超音波の強度や、せん断力付与工程の開始時刻、さらにせん断力付与工程内におけるせん断力の大きさや方向、さらには時間などの変化の制御を最適化することもできる。
　細胞の面積の測定情報の例としては、例えば、接着している細胞の位相差画像を取得し、画像処理によって、細胞一つの専有面積を計測することで、細胞の面積を数値化することを挙げられる。
　接着している細胞は位相差画像で見ると面積が大きく写り、振動付与工程及びせん断付与工程により接着力が低下している細胞は表面張力により球形に近い形をとるため、位相差画像で見ると細胞の面積が小さく写ることが知られている。これを利用して、せん断力付与工程の開始タイミングを判断してもよい。
　別の細胞情報として、位相差画像における輝度値あるいはハロ領域の面積が挙げられる。
　細胞が接着した状態の位相差画像においては全体的に小さい位相差（細胞が平たい状態）の領域しか検出されない。一方、剥離液が添加され、細胞の接着が弱くなり、細胞が培養基材から浮き上がると、浮き上がったところは位相差が大きくなり、位相差画像において、他に比べて画像輝度値が高くなるハロ領域がみられることが知られている。すなわち、細胞の接着が弱くなれば、ハロ領域の面積が増え、その値は一定に近づく。これを利用して、せん断力付与工程の開始タイミングを判断してもよいし、さらにせん断力付与工程内におけるせん断力の大きさや方向、さらには時間などの変化の制御を細胞情報の変化量に基づいて決定してもよい。
　また別の細胞情報として、斜入射照明により培養基材の細胞培養面を観察した際の輝度値が挙げられる。細胞剥離液の作用で接着力が低下した細胞は、仮足が縮み、培養基材との微視的な接着面が減少するため、培養基材と細胞との界面で光が散乱しやすくなる。よって、散乱光の比率が高くなる斜入射照明を用いて観察すると、細胞の接着状態が弱くなれば、培養基材の細胞培養面の輝度値が高くなり、その値は一定に近づく。これを利用して、振動付与工程の終了タイミングや、せん断力付与工程の開始タイミングを判断してもよいし、振動付与工程の超音波帯域の振動付与条件である振動強度や振動付与時間、さらにはせん断力付与工程のせん断力付与条件である、せん断力付与強度やせん断力付与時間、せん断力付与の変化の制御など、それぞれの条件のうち少なくとも一つを決定してもよい。
　本開示の細胞剥離方法は、振動付与工程、せん断力付与工程の条件（超音波の強度、超音波帯域の振動の付与時間、振動モード、またせん断力の種類や強度、付与時間など）を細胞種に応じて予め設定する制御部を備えてもよいし、細胞種と観察などの情報を組み合わせて制御してもよい。
（超音波帯域の振動）
　本開示において超音波帯域の振動として、１０ｋＨｚ以上１ＭＨｚ以下の周波数をもつ振動を例示できる。振動発生手段は、細胞に超音波帯域の振動を付与することが可能な手段であれば、特に制限なく用いることができる。一例として、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）などの超音波発振子を振動体として用いる例を挙げることができる。
　ここで、培地が充填されて密閉された培養基材の外面に、振動体を直接当接させて、培養基材に振動を与えることができる。他には、振動付与手段を直接容器に接触させるのではなく、振動付与手段と処置対象領域との間に超音波伝達物質と記載されている振動伝達部材を介在させて、超音波を、剥離対象たる細胞に付与することもできる。
（振動体）
　本開示において、振動体は超音波帯域の振動を発生するものであれば、限定されることなく用いられるが、例えば圧電体と振動板とを接着したものが挙げられる。圧電体が円形型の場合は振動板はガラス、ＳＵＳ、石英であることが好ましい。振動板をガラス、ＳＵＳ、石英にすることで、振動体として破損することなく超音波帯域の比較的高い駆動周波数（振動周波数）で大きい振幅を出力することができる。振動体は超音波振動子を含むことができる。
　リング形状の圧電体の場合、振動板の外径寸法は圧電体の外径寸法と等しいことが好ましい。
　圧電体と振動板とが接着され撓み振動した際に、撓みの厚さ方向の中点すなわち引っ張り、圧縮のどちらにもならない中立面が振動板側にあるように、振動板の厚さが調整されていることが、圧電体の歪を効率良く撓みに利用するために好ましい。
　本開示の振動体には、市販のランジュバン型振動子や矩形型振動子を用いることもできる。ランジュバン型振動子は２つの金属ブロック間に圧電体を挟み込み、ボルト締めなどで締め付けて一体構造としているものが挙げられ、例えば本多電子製、富士セラミックス製などがある。
　本開示の振動体として、マイクロメートルオーダーで振幅制御が容易である、リング形状の圧電体をガラス板、又は金属板に接着したリングデバイスや、ランジュバン型振動子（ランジュバンデバイス）が好ましく用いられる。
　リングデバイスを定在波モードで使用する場合、圧電体や振動板のサイズや共振周波数にもよるが、中心部など、振動モードに応じた位置に最も強い振幅を有する振動を伝達させることができ、リングデバイスを進行波モード、搬送波モードで使用する場合、屈曲振動の腹や節の位置を周期的に移動させることが可能となり、培養基材に対してより均一な振動を付与することが可能となる。また、ランジュバンデバイスは培養基材に対して均一な振動を付与することが可能である。
（圧電体）
　本開示において振動体に用いられる圧電体はリング形状や円環形状の圧電体が好ましいが、振動体を撓ませる圧電体の形状は円板形状であっても構わない。情報取得工程において、細胞の情報を直接観察する場合は、圧電体は、培養基材下部の視野を確保できる円環形状が好ましい。
　圧電体は、分極処理を施すことで圧電特性を発揮するが、図３の通り、電極パターンに応じて分極の極性を変えて構わない。図３では、電極α１、α２、α３、β１、β２、β３がパターニングされた部分は変形に寄与する駆動相３０１であり、電極α１とβ１に挟まれた領域は変形度合いを検知するためのセンサ相３０２である。分極処理した圧電体は、入力した交流電圧の位相を電極パターン毎に制御することで、定在波モード、進行波モードの振動モードを励振することができる。プラスに分極した電極（α１、α３、β１、β３）に対して、マイナスに分極した電極（α２、β２）に１８０度の位相差を付けた交流電圧を印加することで定在波が発生する。これに対し、図３のように、一本鎖線の左右にＡ相３０３（電極α１、α２、α３）、Ｂ相３０４（電極β１、β２、β３）と分けたとき、Ａ相とＢ相の位相差を９０度にした交流電圧を印加すると、２相駆動の進行波が発生する。図３でＧＮＤはグランドを指し、裏面に配置された電極の接地に用いる。
　電極パターンは、Ａｇを印刷法で形成する例を挙げられるが、電極材料にはＡｇの他、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄなどの貴金属やＣｕなどの卑金属でも構わない。形成方法は印刷法、メッキ法、スパッタ法であっても構わない。
　振動体に用いた圧電体の材料組成はＰｂＺｒＴｉＯ３（ＰＺＴ）を用いたが、環境規制を考慮して実質的にＰｂを用いない非鉛圧電材料であることが好ましい。非鉛圧電材料には、主成分がＢａＴｉＯ３（ＢＴ）、ＮａＮｂＯ３、ＢｉＮａＴｉＯ３、ＢｉＦｅＯ３などが挙げられ、それぞれの組み合わせや、主成分に金属元素が添加されていても構わない。特に、ＢａＴｉＯ３（ＢＴ）系材料で、ＰｂＺｒＴｉＯ３（ＰＺＴ）と同等の振動性能を確認した。また、セラミックス以外の材料として、単結晶材料、高分子系圧電材料でも構わない。
　圧電体と振動板とが接着され撓み振動した際に、撓みの厚さ方向の中点すなわち引っ張り、圧縮のどちらにもならない中立面が振動板側にあるように、振動板の厚さが調整されていることが、圧電体の歪を効率良く撓みに利用するために好ましい。圧電体と振動板の厚さの組み合わせは、圧電体の硬さと振動板の硬さに基づいて算出した。
　図４に培養基材に対して、圧電体を利用して、超音波帯域の振動を付与する例を示す。
　図４において、振動を付与する機構４１０２は、振動体４１０１と振動伝達部材４１３とカバー４１５からなり、振動体４１０１は振動板４１１と圧電体４１２からなっている。
　培養基材４２１は、振動伝達部材４１３の上に設置される。この例においては、培養基材４２１は、培養基材上蓋４２２で覆われ、その上に、重り４１４が置かれた例を示している。このように培養基材上蓋４２２で覆い、さらに、重り４１４を置くことで、超音波帯域の振動を効率的に付与することができる場合がある。
（振動源振幅評価）
　超音波帯域の振動付与部の振動源の振幅はレーザードップラー振動計（グラフテック社製、ＡＴ７２００）で計測ることができる。計測手法は、所望の共振周波数、電圧で超音波帯域の振動付与部を駆動し、振動子表面をレーザーでＸＹ方向の２次元的にスキャンすると、各点の振動速度が得られ、計算よりＺ方向の振幅を算出することができる。この結果、振動子の振動波形を３次元的に計測することができ、駆動時の振動源の最大振幅を把握することができる。振動源の振幅とは、図５Ａに示すような電極Ｅ１、Ｅ２をそれぞれ挟んで配置された２つの円環形状の圧電素子Ｐ１、Ｐ２をさらに２つの金属ブロックＭ１、Ｍ２で挟み込み、軸方向にボルト５００で締結されたボルト締めランジュバン型振動子では、振幅はＭ１、Ｍ２の表面の振幅である。また、図５Ｂに示すような、圧電素子をガラス板や金属板などに接着剤などで張り付けた平板状の振動子（張り付け型振動子）などでは、振幅はガラス板５０１や金属板５０２の振幅である。
（細胞）
　本開示における細胞としては、インビトロで培養器材に接着培養可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、マウス骨格筋筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＴＩＧ－３細胞）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来Ａ５４９細胞やマウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞などの種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞などの各種幹細胞、又は各組織の前駆細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞などが挙げられる。また本開示の細胞の剥離方法はシート状の細胞に適用してもよい。本開示の細胞の剥離方法は、これらの中でも細胞間の結合が強い細胞や、培養基材への接着力が高い細胞や、トリプシン感受性の高い細胞において好適である。細胞の大量培養のニーズから、例えば、タンパク質生産用に用いられるＣＨＯ細胞や、細胞治療で利用可能な間葉系幹細胞などに対して特に好適である。
（培養基材）
　本開示における培養基材は、細胞培養に用いられる培養基材のことを意味する。培養基材は、細胞接着性の培養基材であれば特に制限はなく、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マルチウェルプレート、マルチプレート、シャーレ、培養バッグ、ボトルなどが挙げられる。
　本開示における培養基材の材質は、化学的に安定であり、所望の細胞を培養可能な材質であればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ポリメチルペンテン、ガラス、金属などが挙げられる。この中でもポリスチレンが好ましい。
（細胞剥離液）
　本開示において細胞剥離液は、本開示の細胞剥離方法で用いる、細胞を剥離させるための溶液である。
　本開示における細胞剥離液のｐＨは中性領域であることが好ましい。中性領域は細胞培養に適しており、細胞の生存率を安定的に高く保つことができるためである。ｐＨは塩酸や水酸化ナトリウムなどで適宜調整可能である。また、ｐＨを安定的に保つために各種緩衝液が好適に用いられる。
　本開示における細胞剥離液の粘度は１．８０ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。これは、粘度がこの範囲であれば、超音波帯域の振動によって発生する剥離液の流動が妨げられず、剥離効率を高く保つことができるためである。細胞剥離液の粘度はポリマーや糖類の添加などによって適宜調整可能である。
　本開示における細胞剥離液は、タンパク質分解酵素を含んでもよいが、好ましくは細胞剥離液の全質量に対するタンパク質分解酵素の量は０．０００５質量％以下であり、より好ましくは、タンパク質分解酵素を含まない。これは、タンパク質分解酵素は細胞の一部を分解するため剥離効率が高くできる半面、細胞の品質を低下させる可能性があるからである。
　本開示においてタンパク質分解酵素とは、例えば、細胞の一部を分解し、細胞を培養基材から剥離しやすくするものである。例えば、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体などが挙げられる。
　本開示における細胞剥離液としては、金属イオンキレート剤（以後、キレート剤と呼ぶことがある）を含む溶液が、特に好ましい。キレート剤を含む細胞剥離液を用いることによって、細胞を超音波帯域の振動により効果的に剥離できるからである。
　本開示におけるキレート剤としては、特に限定はないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（以後、ＥＤＴＡと呼ぶことがある）、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、イミノ二酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミンジコハク酸、エチドロン酸、クエン酸、グルコン酸、ホスホノブタン三酢酸などを挙げることができる。この中でも二価の陽イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋とキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸を用いた場合、細胞剥離液のｐＨは７．０以上８．０以下であることが好ましい。これは細胞生存率を高く保つことができる中性領域の中でも高めのｐＨであることにより、エチレンジアミン四酢酸のキレート能を高めることができ、剥離効率をより高くすることが可能であるためである。なおキレート剤は単独で用いても、或いは２種類以上を複合して用いてもよい。
　キレート剤の含有量としては０．０１ｍＭ以上５．０ｍＭ以下であることが好ましい。
　この範囲であることにより、キレート効果を確実に得ることができ、過剰なキレート剤の存在による活性低下も抑えることができる。
　本開示における細胞剥離液として、ポリアルキレングリコール構造を含む親水性ポリマーを含んでいてもよい。ポリアルキレングリコールは、超音波を用いた細胞剥離方法において、細胞の生存率を高くすることができる。ポリアルキレングリコール構造を含む親水性ポリマーの例として、ポリエチレングリコールが挙げられる。親水性ポリマーは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定されるピーク分子量Ｍｐが８００以上５００００以下であることが好ましく、１２００以上２００００以下であることがさらに好ましい。これは、ポリマーの細胞への影響が少なく、かつ、ポリマーによる培地の増粘効果が抑制できるためである。
（緩衝液）
　本開示における緩衝液は、中性領域を保つことができれば制限なく使用できる。例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液などのＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液などが挙げられる。この中でも、生体内の環境に近いリン酸緩衝液が好ましく、このリン酸緩衝液に、細胞内液と等張になるよう調整したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がより好適に用いられる。
（培地）
　培地の種類に特に制限はなく、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　Ｋｉｔ（プロモセル社製）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（プロモセル社製）、ＭＳＣＧＭ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ロンザ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）などが挙げられる。
　これらの中から、それぞれの細胞の培養に適した培地を用いるのが好ましい。
（血清）
　上記の培地には、血清や抗生物質を添加してもよい。血清の例としては、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清を挙げられるが、入手の容易さから一般的にＦＢＳがよく用いられる。また、未処理又は未精製の血清をいずれも含まず、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する無血清培地であってもよい。
（抗生物質）
　培地に添加される抗生物質の例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、カナマイシン、アクチノマイシンＤ、アンホテリシンＢなどが挙げられる。
（細胞の培養条件）
　細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。一般的には、培養基材内に適切な培地を添加し、そこに１．０×１０１～５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養する。この際、培養基材中の細胞占有面積率が７～８割程度、いわゆるサブコンフルエントの状態になるまで培養するのが好ましい。
（細胞剥離システム）
　本開示は、さらなる実施形態として、細胞剥離システムを提供するものである。
　本開示の細胞剥離システムは、培養基材の上で培養された接着細胞を剥離する剥離部、及び制御部を有する細胞剥離システムであって、前記剥離部は、前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を与える振動付与部、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与する、せん断力付与部を有し、前記制御部は、前記振動付与部の駆動の開始が、前記せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御することを特徴とする細胞剥離システムである。
　また、本開示の細胞剥離システムは、前記せん断力付与部は、前記培養基材へ付与される叩打、振とう、揺動、偏心回転から選択される少なくとも一つの手段により、前記培養面に対してせん断力を付与することを特徴とする。
　本開示の細胞剥離システムの、前記制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記せん断力の大きさを経時的に変化するように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする。
　本開示の細胞剥離システムの前記制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記せん断力の大きさを周期的に変化するように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする。
　本開示の細胞剥離システムの制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記細胞の大きさ、形状、接着面積、及び輝度値からなる群から選択される少なくとも１つに基づき付与するせん断力の方向を変化させるように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする。
　なお、制御部は、一体となって、せん断力制御部を有してもよく、すなわち、振動付与部の駆動の開始が、せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御し、かつ、せん断力付与部を制御してよい。あるいは、制御部は、せん断力制御部を、振動付与部の駆動の開始が、せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御する部分と、せん断力制御部が分かれて存在してもよい。
　例えば、振動付与部の駆動の開始が、せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御する情報処理装置とは別に、せん断力制御部が、せん断力付与部に備わった状態であってもよい。
　図６及び図７に本開示の細胞剥離システムの例を示す。
　図６に例示する細胞剥離システム６１０００においては、培養基材６２１の上で培養された接着細胞を剥離する剥離部６１００１、及び制御部６１００２を有する細胞剥離システムである。剥離部６１００１は、培養基材６２１に対して、超音波帯域の振動を与える振動付与部６１０２、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与する、せん断力付与部６１０３を有し、制御部６１００２は、振動付与部６１０２の駆動の開始が、せん断力付与部６１０３の駆動の開始よりも先となるよう制御する。図６の例においては、剥離部６１００１を構成する、振動付与部６１０２は、振動体６１０１と振動伝達部材６１３とカバー６１５からなり、振動体６１０１は振動板６１１と圧電体６１２からなっている。また、せん断力付与部６１０３は、叩打部６１７と叩打部材６１６からなる。制御部６１００２は、振動付与部６１０２を制御する振動制御部６１９、せん断力付与部を制御する、せん断力制御部６１８と、主制御部６２０からなっている。なお、振動制御部６１９、せん断力制御部６１８と、主制御部６２０は一体となっていても、分かれていても構わない。図６では、さらに、培養基材６２１は、培養基材上蓋６２２で覆われ、その上に、重り６１４が置かれた例を示している。
　図７に例示する細胞剥離システム７００１においては、この例においてはディッシュである、培養基材７２１の上で培養された接着細胞を剥離する剥離部７１００１、及び制御部７１００２、細胞情報取得部７１００３を有する細胞剥離システムである。
　剥離部７１００１は、保持部材７２２で保持した培養基材７２１に対して、超音波帯域の振動を与える振動付与部７１０２、及び培養基材の培養面に対して、せん断力を付与する、せん断力付与部７１０３を有する。この例において、せん断力付与部７１０３は、二軸振とう機構である。
　細胞情報取得部７１００３は、培養基材に接着した細胞に関する細胞情報を取得する機構を有する。細胞情報取得部７１００３によって取得された細胞情報は、制御部７１００２に処理されてもよく、細胞情報に基づいて制御部７１００２が剥離部７１００１を制御することも可能である。取得した細胞情報は、情報取得工程（ステップＳ２２０）の実行に用いられ、例えば、振動付与工程からせん断力付与工程に移行する判断、あるいは、振動付与工程又はせん断力付与工程を終了する判断のために利用することができる。
　また、この例においては、制御部７１００２は、演算及び記憶を行うコンピュータとしての機能を有する。
　制御部７１００２は、演算及び記憶を行うコンピュータとしての機能を実現するため、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）７０６、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）７０７、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）７０８及びＨＤＤ（Ｈａｒｄ　Ｄｉｓｋ　Ｄｒｉｖｅ）７０９を備える。また、制御部７１００２、通信Ｉ／Ｆ（インターフェース）７１０、表示装置７１１、及び入力装置７１２を備える。ＣＰＵ７０６、ＲＡＭ７０７、ＲＯＭ７０８、ＨＤＤ７０９、通信Ｉ／Ｆ７１０、表示装置７１１、及び入力装置７１２は、バス７１３を介して相互に接続される。なお、表示装置７１１及び入力装置７１２は、これらの装置を駆動するための不図示の駆動装置を介してバス７１３に接続されてもよい。
　図７では、制御部７１００２を構成する各部が一体の装置として図示されているが、これらの機能の一部は外付け装置により構成されていてもよい。例えば、表示装置７１１及び入力装置７１２は、ＣＰＵ７０６などを含むコンピュータの機能を構成する部分とは別の外付け装置であってもよい。
　ＣＰＵ７０６は、ＲＡＭ７０７、ＨＤＤ７０９などに記憶されたプログラムに従って所定の動作を行うとともに、制御部７１００２の各部を制御する機能をも有する。ＲＡＭ７０７は、揮発性記憶媒体から構成され、ＣＰＵ７０６の動作に必要な一時的なメモリ領域を提供する。ＲＯＭ７０８は、不揮発性記憶媒体から構成され、情報処理システム７０５の動作に用いられるプログラムなどの必要な情報を記憶する。ＨＤＤ７０９は、不揮発性記憶媒体から構成され、個別独立分離区画の数や位置に関する情報、蛍光強度などの記憶を行う記憶装置である。
　通信Ｉ／Ｆ７１０は、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、４Ｇなどの規格に基づく通信インターフェースであり、他の装置との通信を行うためのモジュールである。表示装置７１１は、液晶ディスプレイ、ＯＬＥＤ（Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｉｇｈｔ　Ｅｍｉｔｔｉｎｇ　Ｄｉｏｄｅ）ディスプレイなどであって、動画、静止画、文字などの表示に用いられる。入力装置７１２は、ボタン、タッチパネル、キーボード、ポインティングデバイスなどであって、利用者が情報処理システム７０５を操作するために用いられる。表示装置７１１及び入力装置７１２は、タッチパネルとして一体に形成されていてもよい。
　なお、図７に示されているハードウェア構成は例示であり、これら以外の装置が追加されていてもよく、一部の装置が設けられていなくてもよい。また、一部の装置が同様の機能を有する別の装置に置換されていてもよい。さらに、一部の機能がネットワークを介して他の装置により提供されてもよく、本実施形態を構成する機能が複数の装置に分散されて実現されるものであってもよい。例えば、ＨＤＤ７０９は、フラッシュメモリなどの半導体素子を用いたＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ　Ｓｔａｔｅ　Ｄｒｉｖｅ）に置換されていてもよく、クラウドストレージに置換されていてもよい。
　ＣＰＵ７０６は、ＲＯＭ７０８などに記憶されたプログラムをＲＡＭ７０７にロードして実行することにより、振動付与部の駆動の開始が、前記せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御を実現するとともに、振動付与部及びせん断力付与部の制御を実現する。また、ＣＰＵ７０６は、表示装置７１１を制御することにより表示部７１１の機能を実現する。また、ＣＰＵ７０６は、ＨＤＤ７０９を制御することにより記憶部の機能を実現する。
　以下、実施例、比較例をもって本開示をさらに詳細に説明するが、これは本発明を何ら限定するものではない。
　本開示の実施例で用いられる細胞はそれぞれ次に示す培養条件に従って得られた。
（ＣＨＯ細胞の培養基材上の培養）
　ＣＨＯ－Ｋ１（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞を培養基材の一例であるΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２　濃度５％の環境下で培養した。培地はＨａｍ’ｓ　Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。培養基材の細胞占有面積率は８割程度であった。
（Ａ５４９細胞の培養基材上の培養）
　ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞であるＡ５４９細胞を培養基材の一例であるΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。培養基材の細胞占有面積率は８割程度であった。
（ｈＭＳＣ細胞の培養基材上の培養）
　ヒト間葉系幹細胞であるｈＭＳＣ細胞を培養基材の一例であるΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に４，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（プロモセル社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。４８時間毎に培地を交換しながら培養を７日間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。培養基材の細胞占有面積率は８割程度であった。
（マウスマクロファージ様細胞の培養基材上の培養）
　マウスマクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７）を培養基材の一例であるΦ６０ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。培養基材の細胞占有面積率は８割程度であった。
（剥離液への置換）
　培養基材内の培地を除去し、剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、培養基材内に添加した。
（接着力評価方法）
　シリコンチューブ１７０１、チューブポンプ１７０２、リザーバータンク１７０３、三方弁１７０４、ニードル１７０５、ノズル１７０７を図８のように組み合わせて接着力評価装置１７００を作製した。内径１．０４ｍｍのノズル１７０７の先端と培養面の距離が１７ｍｍとなるように細胞を培養した培養基材１７０６を配置し、ノズル１７０７から０．６５ｍＬ／ｓで培養面に垂直に３秒間ＰＢＳを噴射してせん断力を付与した。噴射後に培養基材からＰＢＳを除去した後、噴射により剥離した細胞の境界となる位置（剥離円の大きさ）を観察し、その位置で生じるせん断力をＡｎｓｙｓ　Ｆｌｕｅｎｔを用いて算出し、接着力とした。
（細胞接着面積評価方法）
　培養基材を位相差顕微鏡にセットして、倍率４０倍において位相差像を観察した。位相差像の視野内の細胞の投影面積をそれぞれ求め、その平均値を細胞の接着面積とした。
（細胞の輝度情報評価方法）
　培養基材をステージ上にセットして、斜入射照明により観察されるディッシュ培養面の画像より平均の輝度値を算出し、細胞の輝度情報とした。
（各装置）
　振動付与、及びせん断力付与には、それぞれ、装置１から装置８の振動付与機構又は、振とう付与、叩打付与、揺動付与、ボルテックス撹拌、噴流付与のいずれかの、せん断力付与機構を用いた。
　それぞれに用いた装置１から９について、図９から図１７に示す。
　装置１は図９に示されるように、振動付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と超音波帯域の振動付与機構１２を有した。超音波帯域の振動付与機構１２の詳細は表１に示す。
　装置２は図１０に示されるように、せん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と二軸振とう機構１３１を有した。
　装置３は図１１に示されるように、振動付与機構とせん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と超音波帯域の振動付与機構１２と二軸振とう機構１３１を有した。超音波帯域の振動付与機構１２の詳細は表１に示す。
　装置４は図１２に示されるように、せん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１とせん断力付与するための、回転機構１３２と叩打機構１３３を有した。
　装置５は図１３に示されるように、振動付与機構とせん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と超音波帯域の振動付与機構１２と、せん断力付与するための、回転機構１３２と叩打機構１３３を有した。超音波帯域の振動付与機構１２の詳細は表１に示す。
　装置６は図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、せん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と、揺動機構１３４を有した。
　装置７は、図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、せん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と、せん断力付与するための、噴流機構１３５と、Ｘ－Ｙ移動ステージ１４と、Ｚ移動ステージ１５を有した。ステージ移動を利用し、図１５Ｂに示すように、培養基材上に１０ｍｍ間隔で、噴流を付与した。
　装置８は、図１６に示されるように、せん断力付与機構を有する装置であり、培養基材１０を保持する保持機構１１と、せん断力付与するための、フロー機構１３６を有した。
（超音波帯域の振動付与方法）
　装置１（図９）、装置３（図１１）、装置５（図１３）の、それぞれの超音波帯域の振動付与機構には表１で示す超音波デバイスをそれぞれ使用し、超音波デバイス上に設置された保持機構に培養基材をセットした。その後、環境温度３７℃において、表１に示すそれぞれの超音波デバイス及び振動付与条件で駆動させ、超音波帯域の振動を付与した。
　本実施例においてリングデバイスを定在波モードで使用する場合、使用した周波数帯域において、培養基材の中心部に最大振幅が作用するような振動モードの屈曲振動を付与することができ、リングデバイスを進行波モードで使用する場合、使用した周波数帯域において、培養基材の外径に対し、中心部から２／３の位置に最大振幅が作用するような振動モードの屈曲振動を付与することができる。さらに進行波モードとすることで、これらの屈曲振動が中心部を軸に周方向に回転するような振動を付与することができる。ランジュバンデバイスを使用する場合、培養基材の全域に対して中心部が最大振幅となるほぼ平坦な振動分布を有する振動を付与することができる。
　以下表１に、装置１、３、５の超音波帯域の振動付与機構で用いた条件である、振動付与条件１～８を示す。
（振とうによるせん断力付与方法）
　装置２（図１０）及び装置３（図１１）は、せん断力付与機構として、二軸振とう機構１３１を有した。装置２及び３は、それぞれ独立にｘ方向、ｙ方向に動く自動ステージによって振とうによるせん断力付与が可能な二軸振とう機構上に培養基材を保持する保持機構、又は保持機構を設置済みの超音波帯域の振動付与機構を設置した。培養基材を保持機構にセットし、環境温度３７℃において、二軸振とう機構を表２に示す駆動条件で動作させ、せん断力を付与した。
　以下表２に、装置２及び３の二軸振とう機構で用いた条件である、移動条件１～４を示す。
（叩打によるせん断力付与方法）
　装置４（図１２）、又は装置５（図１３）は、せん断力付与機構として、回転機構１３２と叩打機構１３３を有した。
　装置４及び装置５は、叩打によるせん断力付与が可能な叩打機構と培養基材の保持機構、及び保持機構を回転させることが可能な回転機構、さらに装置５は超音波帯域の振動付与機構とを組み合わせた装置だった。この装置を使用して、培養基材を保持機構にセットした後、環境温度３７℃において、培養基材の外周部に表３に示すような、力と周波数、及び力の付与位置を変更して、せん断力を付与した。
　以下表３に、装置４及び５の回転機構の駆動条件である、駆動条件１～３を示す。
（その他のせん断力付与方法）
　その他のせん断力付与機構として、装置６は、図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、揺動機構を有し、装置７は図１５Ａ及び図１５Ｂに示すように、噴流機構１３５を有し、装置８は図１６に示すようにフロー機構１３６を有した。
　せん断力の付与をそれぞれ以下の方法によって行った。
　揺動については、装置６により、図１４Ａに示すように中心を支点として円弧上に移動するステージを用いた揺動付与機構上に、培養基材保持機構を設置した装置を使用した。
　揺動付与時のステージの移動イメージを図１４Ｂに示す。この装置を使用し、培養基材を保持機構にセットした後、環境温度３７℃において、表４の動作条件１に示す速度、及び動作でせん断力を付与した。
　偏心回転については、ボルテックス撹拌を使用した。装置はボルテックスミキサーとして、ボルテックスジェニー２（ＳＩ－０２８６；サイエンティフィックインダストリーズ社製）のサンプル設置部を培養基材の保持が可能な形状に変更した培養基材の保持機構を使用した。保持機構に培養基材をセットして固定し、環境温度３７℃において、表４の動作条件２に示す速度、及び動作でせん断力を付与した。速度はミキサー上の積載重量などによって変化するため、予め保持機構上に同一液量を入れた培養基材をセットしておき、高速度カメラで観察して設定速度となるようにミキサーの駆動条件を決定した。
　噴流については、装置７を用い、図１５Ａに示すように培養基材保持機構をＸ－Ｙ方向に移動可能なＸ－Ｙ移動ステージ上に設置し、さらに電動ピペッターを使用した噴流機構を設置したＺ移動ステージを設置した装置を使用した。この装置を使用して、保持機構に培養基材をセットし、環境温度３７℃において、図１５Ｂに示す培養基材を上面視した図に対応した培養基材の各位置に対して、ピペット容量を１ｍＬに設定して、表４の動作条件３に示す、速度、及び動作を行ってせん断力を付与した。各位置の動作は３秒間で吸引と吐出を２回ずつ繰返し、１秒かけて次の位置に移動し、さらに同じ動作を繰り返した。
　例えば、図１５Ｂに示す視野には、上記に対応する位置が、全部で２１存在する。これらのすべてに噴流を付与すると、せん断力付与工程が行われる時間は８３秒となる。
　フローについては、装置８を用い、図１６に示すように培養基材に設置可能なフロー機構１３６を使用し、フロー速度を設定可能なポンプと接続して液体をフローさせる装置を使用した。この装置を使用して、保持機構に培養基材をセットし、環境温度３７℃において、表４の動作条件４に示す、速度、及び動作を行ってせん断力を付与した。
　以下表４に、動作条件１（装置６の揺動）、動作条件２（ボルテックスによる偏心回転）、動作条件３（装置７の噴流）、動作条件４（装置８によるフロー）のそれぞれの動作を示す。
（剥離方法）
　剥離方法１～３３は、上記の装置１～８を用いて、それぞれ以下の表５で示す条件で、工程［１］及び工程［２］を設定した。工程［１］は工程［２］より先に開始される。それぞれの剥離方法の詳細については、以下に述べる。
［剥離方法１、８～１２、１５～１７、２０～２７］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、超音波帯域の振動付与装置すなわち装置１の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動を付与した。その後、工程［２］の剥離操作のため、表５に示すそれぞれのせん断力付与装置の機構における保持機構上にディッシュをセットする際に揺らし、工程［１］の剥離操作では細胞剥離が完了していないことを確認した。
　次に、工程［２］の剥離操作として、表５に示すそれぞれのせん断力付与装置の機構上において、超音波帯域の振動付与が終了して３０秒後から、表５に示す各条件でせん断力を付与した。
［剥離方法２、５～７、１３、１８、１９］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、超音波帯域の振動付与装置とせん断力付与装置が一体化した、装置３又は装置５の、それぞれの装置の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動の付与を開始した。
　次いで、工程［２］開始前に目視で工程［１］の剥離操作では細胞剥離が完了していないことを確認してから、工程［２］の剥離操作として、超音波帯域の振動付与が終了する３０秒前より、表５に示すそれぞれのせん断力付与装置を、それぞれの条件で駆動させてせん断力を付与した。
［剥離方法３］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、超音波帯域の振動付与装置とせん断力付与装置が一体化した装置３の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動の付与を開始した。本方法では工程［１］の振動付与終了後、直ちに工程［２］の剥離操作を、表５に示す条件で駆動させてせん断力を付与した。工程［２］の剥離操作終了後は工程［１］の剥離操作を行い、これらを合計６回繰り返した。
［剥離方法４］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、超音波帯域の振動付与装置とせん断力付与装置が一体化した装置３の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動の付与を開始した。本剥離方法は工程［１］の振動付与をし続けながら工程［２］の剥離操作を繰り返す剥離方法である。工程［１］の剥離操作開始２０秒後から、工程［２］の剥離操作を、表５に示す条件で駆動させてせん断力を付与した。
［剥離方法１４］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、工程［１］の前操作として、図１４Ａ及び図１４Ｂの装置６の揺動機構を使用して、室温である２５℃環境下で３０秒間揺動させて剥離液を良くなじませた。次いで、表５に示す超音波帯域の振動付与装置、すなわち装置１の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動を付与した。その後、工程［２］の剥離操作のため、表５に示すせん断力付与装置の機構における保持機構上にディッシュをセットする際に揺らし、工程［１］の剥離操作では細胞剥離が完了していないことを確認した。
　次に、工程［２］の剥離操作として、表５に示すせん断力付与装置の機構上において、超音波帯域の振動付与が終了して３０秒後から、表５に示す各条件でせん断力を付与した。
［剥離方法２８］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、工程［１］の前操作として、３７℃インキュベーター内に２分間静置させて剥離液を良くなじませた。次いで、表５に示す超音波帯域の振動付与装置、すなわち装置１の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動を付与した。その後、工程［２］の剥離操作のため、表５に示すせん断力付与装置、すなわち装置２の保持機構上にディッシュをセットする際に揺らし、工程［１］の剥離操作では細胞剥離が完了していないことを確認した。
　次に、工程［２］の剥離操作として、表５に示すせん断力付与装置すなわち装置２の機構上において、超音波帯域の振動付与が終了して３０秒後から、表５に示す各条件でせん断力を付与した。
［剥離方法２９］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、せん断力付与装置である装置２の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５の条件、付与時間でディッシュにせん断力を付与した。その後、工程［２］の剥離操作のため、表５に示す超音波帯域の振動付与装置すなわち、装置１の保持機構上にディッシュをセットする際に揺らし、工程［１］の剥離操作で一部の細胞が剥離していることを確認した。
　次に、工程［２］の剥離操作として、表５に示す超音波帯域の振動付与機構、すなわち装置１上において、せん断力付与が終了して３０秒後から、表５に示す各条件で超音波帯域の振動を付与した。
［剥離方法３０、３１］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、それぞれのせん断力付与装置、すなわち、装置２又は装置４の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５のそれぞれの条件、付与時間でディッシュにせん断力を付与した。工程［２］は行わなかった。
［剥離方法３２、３３］
　細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換し、次いで表５に示すように、超音波帯域の振動付与装置、すなわち装置１の保持機構上にディッシュをセットし、工程［１］の剥離操作として、表５のそれぞれの条件、付与時間でディッシュに超音波帯域の振動を付与した。工程［２］は行わなかった。
［細胞情報取得方法１］
　細胞の接着力評価は次の方法で行った。同一条件で細胞を培養したディッシュを細胞情報取得用に別に３枚用意し、ディッシュ内の培養液を剥離液に置換した。そのうち１枚を前述の接着力評価方法の通り図８で示す接着力評価装置１７００を使用して、前述の条件でＰＢＳを噴射してせん断力を付与した。噴射後に培養基材からＰＢＳを除去した後、噴射により剥離した細胞の境界となる位置を観察し、その位置で生じるせん断力をＡｎｓｙｓ　Ｆｌｕｅｎｔを用いて算出することで、接着力Ａ１とした。接着力評価装置で噴射することでディッシュ培養面の細胞は噴射位置を中心におよそ円形に剥離する。この際に生じる、剥離した細胞の境界となる位置は円形の境界となることから、剥離円とも呼ぶことができる。本開示の実施例においては得られた剥離円の上下方向の直径の平均をとり、せん断力の算出を行った。次に、残る２枚のディッシュについて、それぞれ前述の剥離方法に従って工程［１］の剥離操作を行った。工程［２］を開始する直前に、そのうち１枚のディッシュについて接着力評価装置を使用して前述と同様に接着力を評価した。この時の接着力をＡ２とした。
　残る１枚のディッシュについて、工程［２］の剥離操作を行った後、接着力評価装置を使用して前述と同様に接着力を評価した。この時の接着力をＡ３とした。
　本実施例における接着力は前述の条件において、１～８０Ｐａの範囲で評価可能である。接着力測定時にＰＢＳを噴射した後、噴射により生じた剥離円の境界が検出されなかった場合や、剥離円の径が小さいことで評価した接着力が８０Ｐａ以上の数値となる場合には接着力を８０Ｐａ以上とみなし、剥離円の径が大きくなり、接着力が１Ｐａ未満の値として算出された場合は一律に１Ｐａ未満とした。また、１Ｐａ未満となった場合の接着力の大小関係については、噴射により生じた剥離円の直径が大きいほど接着力が小さいと判断した。
　得られた接着力Ａ１、Ａ２及びＡ３より、Ａ１＞Ａ２＞Ａ３の関係を満たすかどうかを確認した。
［細胞情報取得方法２］
　細胞の接着面積評価は次の方法で行った。細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換した後、前述の細胞接着面積評価方法の通り位相差顕微鏡（Ａｘｉｏ　Ｏｂｓｅｒｅｒ　７；カールツァイス社製）にセットして位相差観察を行い、倍率４０倍の視野内の細胞の投影面積の総和から平均値を算出し、細胞の接着面積Ｂ１とした。次いで、前述の剥離方法に従って工程［１］の剥離操作を行い、工程［２］を開始する直前に位相差顕微鏡によって位相差観察を行い、前述と同様に細胞の投影面積を算出した。この値を細胞の接着面積Ｂ２とした。次に、工程［２］の剥離操作を行った後、位相差顕微鏡によって位相差観察を行い、前述と同様に細胞の投影面積を算出した。この際に輪郭がぼやけている細胞については接着しておらず浮遊しているものとみなし接着面積を０とみなして平均を取った。この値を細胞の接着面積Ｂ３とした。
　得られた細胞の接着面積Ｂ１、Ｂ２及びＢ３より、Ｂ２＜０．５×Ｂ１及び、０≦Ｂ３＜Ｂ２の関係を満たすかどうかを確認した。
［細胞情報取得方法３］
　細胞の輝度情報評価は次の方法で行った。細胞を培養したディッシュ内の培養液を剥離液に置換した後、前述の細胞の輝度情報評価方法の通り、光学的な測定を行った。すなわち、ディッシュをステージ上にセットして、斜入射照明をディッシュ上面に、カメラをディッシュ下面にセットしてディッシュの培養面の画像を取得した。このよう得られた画像より培養面の平均の輝度値を算出し、細胞の輝度情報Ｃ１とした。次いで、前述の剥離方法に従って工程［１］の剥離操作を行い、工程［２］を開始する直前に前記と同様にディッシュをステージ上にセットして、斜入射照明により観察されるディッシュ培養面の画像から平均の輝度値を算出した。この値を細胞の輝度情報Ｃ２とした。
　得られた細胞の輝度情報Ｃ１及びＣ２より、Ｃ１＜Ｃ２の関係を満たすかどうかを確認した。
［実施例１］
　剥離方法１を用いて、ディッシュ上のＣＨＯ細胞を剥離させた。剥離した細胞は回収した後、血球計算盤を用いて細胞数の測定及びトリパンブルー染色による生死判別法を用いて生存率を算出した。また、超音波剥離後のディッシュに対して、セルスクレーパーを用いて超音波で剥離できなかった細胞も全て剥離し、血球計算盤で細胞数を測定した。超音波で剥離した細胞数とその後セルスクレーパーで剥離した細胞数を合わせて総剥離細胞数とし、総剥離細胞数に対する超音波剥離細胞数の割合を剥離率と定義し、算出した。結果、生存率は９６．０％、剥離率は９８．０％であった。なお、生存率、剥離率ともに９０％以上を良好と判断した。使用した細胞種、剥離方法、算出した生存率、及び剥離率は表６に示す。
　また、実施例１において前述の細胞情報のうち、接着力、接着面積、輝度情報を得た。
　接着力については前述の細胞情報取得方法１に示す方法に従って取得した。接着力Ａ１はディッシュ内の培養液を剥離液に置換した後に前述の接着力評価装置を用いて評価し、噴射によって細胞が剥離した剥離円が見られなかったためＡ１＞８０Ｐａとした。接着力Ａ２は工程［２］を開始する直前に評価し、噴射による剥離円の直径が大きいためＡ２＜１Ｐａとした。接着力Ａ３は工程［２］終了後に評価し、前述と同様に剥離円の直径が大きいためＡ３＜１Ｐａとした。Ａ２及びＡ３評価時における剥離円の直径の大きさはＡ３＞Ａ２であったため、接着力についてはＡ２＞Ａ３の関係となると判断した。以上より、実施例１における接着力の関係はＡ１＞Ａ２＞Ａ３の関係を満たすことを確認した。
　細胞の接着面積については前述の細胞情報取得方法２に示す方法に従って視野内の平均面積を取得した。接着面積Ｂ１はディッシュ内の培養液を剥離液に置換した後に評価し、Ｂ１＝５２８μｍ２であった。接着面積Ｂ２は工程［２］を開始する直前に評価し、１９２μｍ２であった。同様に、接着面積Ｂ３は工程［２］終了後に評価し、大半の細胞が剥離していることを考慮し、平均をとると２μｍ２となった。これらの値はＢ２＜０．５×Ｂ１及び、０≦Ｂ３＜Ｂ２の関係を満たすことを確認した。
　細胞の輝度情報については前述の細胞情報取得方法３に示す方法に従って取得した。輝度情報Ｃ１はディッシュ内の培養液を剥離液に置換した後に評価し、Ｃ１＝７８．５であった。輝度情報Ｃ２は工程［２］を開始する直前に評価し、１０８．１であった。これらの値はＣ１＜Ｃ２の関係を満たすことを確認した。
［実施例２～３４、比較例１～６］
　実施例２～３４、比較例１～６では、細胞種と剥離方法の組み合わせを変更し、剥離後の操作は実施例１と同様に評価を行った。結果を表６に示す。
　また、本開示の実施例のうち代表的な実施例について、それぞれで得られた細胞情報の結果を表７に示す。これらの結果より、せん断力を付与する工程に進むことを判断する細胞情報の閾値を決定することができる。例えば、細胞情報のうち、簡便な光学系で取得可能な輝度情報の閾値については、表７の輝度情報のＣ２の欄のうち最小となる数値を参考に閾値を決定することができ、本実施例においては、細胞種がＣＨＯ細胞の場合は輝度情報の閾値を１０５と設定することができる。設定した閾値により、経時的に輝度情報の数値をモニターすることで、せん断力を付与する工程に移るタイミングを判断することが可能になる。輝度情報の閾値は、細胞種や培養条件に応じて異なることがあるため、実験データを取得して、予め閾値を設定することができる。また、輝度情報の時間当たりの変化量を閾値として設定することもできる。また、輝度情報の時間変化をもとに、超音波の強度を決定することもできる。
　本開示によれば、細胞の生存率と剥離率がともに高くなるような、細胞剥離方法及びそれを用いた細胞剥離システムを提供することができる。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２４年３月１５日提出の日本国特許出願特願２０２４－０４１７２７を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims (25)

  1. 　培養基材の上で培養された接着細胞の剥離方法であって、
    　前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を付与する振動付与工程、及び
    　前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与するせん断力付与工程
    を含み
    　前記振動付与工程の開始が、前記せん断力付与工程の開始よりも先であり、
    　前記せん断力は超音波の振動以外の手段によって付与されることを特徴とする細胞の剥離方法。
  2. 　前記せん断力は前記培養基材へ付与される叩打、振とう、揺動、及び偏心回転、並びに前記培養基材への液体の吐出からなる群から選択される少なくとも一つにより付与されることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  3. 　前記振動付与工程において付与される前記超音波帯域の振動は、最大振幅が１０μｍ以下の振動源によってもたらされることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞剥離方法。
  4. 　前記振動付与工程の開始時刻における前記細胞と前記培養基材との接着力をＡ１
    　前記せん断力付与工程の開始時刻における前記細胞と前記培養基材との接着力をＡ２
    　前記振動付与工程及び前記せん断力付与工程のいずれも終了した時刻における前記細胞と前記培養基材との接着力をＡ３としたとき、Ａ１、Ａ２及びＡ３の関係が式１を満たすことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
    　Ａ１＞Ａ２＞Ａ３（式１）
  5. 　前記振動付与工程の開始時刻における前記細胞と前記培養基材との接着面積をＢ１
    　前記せん断力付与工程の開始時刻における前記細胞と前記培養基材との接着面積をＢ２
    　前記振動付与工程及び前記せん断力付与工程のいずれも終了した時刻での接着面積をＢ３
    としたとき、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の関係が式２及び式３を満たすことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
    　Ｂ２＜０．５×Ｂ１（式２）
    　０≦Ｂ３＜Ｂ２（式３）
  6. 　前記振動付与工程の開始時刻に前記細胞の光学的な測定によって取得される輝度情報をＣ１
    　前記せん断力付与工程の開始時刻に前記細胞の光学的な測定によって取得される輝度情報をＣ２
    としたとき、Ｃ１及びＣ２の関係が式４を満たすことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
    　Ｃ１＜Ｃ２（式４）
  7. 　前記せん断力付与工程で与えられるせん断力の大きさが経時的に変化することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  8. 　前記せん断力付与工程で与えられるせん断力の大きさが周期的に変化することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  9. 　前記せん断力付与工程において、付与されるせん断力の方向が経時的に変化することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  10. 　前記せん断力付与工程は、互いに方向の異なる複数のせん断力を付与する工程を含む請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  11. 　前記せん断力付与工程において、細胞の情報に基づいて、付与するせん断力の方向を決定することを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  12. 　前記培養基材に接着した状態の細胞の情報を取得する細胞情報取得工程、及び
    　前記細胞の情報に少なくとも基づいて、前記せん断力付与工程の開始時刻を決定する、せん断力付与工程開始時刻決定工程を含み、
    　前記細胞情報取得工程及び前記せん断力付与工程開始時刻決定工程は、いずれも、前記振動付与工程の開始より先に実行されることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  13. 　前記細胞の情報は、前記細胞の大きさ、形状、接着面積、及び輝度値で構成される群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  14. 　前記せん断力付与工程において、
    　前記細胞の情報に応じて前記せん断力を付与する条件を決定することを特徴とする請求項１２に記載の細胞剥離方法。
  15. 　前記振動付与工程が行われる時間は１秒以上、１時間以下であることを特徴とする請求項１から１４のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  16. 　前記せん断力付与工程が行われる時間は１秒以上１時間以下であることを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  17. 　前記振動付与工程が行われる時間をａ、前記せん断力付与工程が行われる時間をｂとしたとき、ａ及びｂの関係が式５を満たすことを特徴とする請求項１から１６のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
    　０．０１≦ａ／ｂ≦１００（式５）
  18. 　前記振動付与工程が開始される時刻と、前記せん断力付与工程が開始される時刻との差は１秒以上１時間以下であることを特徴とする請求項１から１７のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  19. 　前記振動付与工程が開始される時刻と、前記せん断力付与工程が終了する時刻との差は１０秒以上３０分以下であることを特徴とする請求項１から１８のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  20. 　培養基材の上で培養された接着細胞を剥離する剥離部、及び制御部を有する細胞剥離システムであって、
    　前記剥離部は、前記培養基材に対して、超音波帯域の振動を与える振動付与部、及び前記培養基材の培養面に対して、せん断力を付与する、せん断力付与部を有し、
    　前記制御部は、前記振動付与部の駆動の開始が、前記せん断力付与部の駆動の開始よりも先となるよう制御することを特徴とする細胞剥離システム。
  21. 　前記せん断力付与部は、前記培養基材へ付与される叩打、振とう、揺動、偏心回転から選択される少なくとも一つの手段により、前記培養面に対してせん断力を付与することを特徴とする請求項２０に記載の細胞剥離システム。
  22. 　前記制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記せん断力の大きさを経時的に変化するように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする請求項２０又は２１に記載の細胞剥離システム。
  23. 　前記制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記せん断力の大きさを周期的に変化するように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする請求項２０から２２のいずれか１項に記載の細胞剥離システム。
  24. 　前記制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記せん断力の方向を経時的に変化するように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする請求項２０から２３のいずれか１項に記載の細胞剥離システム。
  25. 　前記制御部は、前記せん断力付与部を制御する、せん断力制御部を有し、該せん断力制御部は、前記細胞の大きさ、形状、接着面積、及び輝度値からなる群から選択される少なくとも１つに基づき付与するせん断力の方向を変化させるように前記せん断力付与部を制御することを特徴とする請求項２０から２４のいずれか１項に記載の細胞剥離システム。
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