WO2025192534A1 - ２，３－ブタンジオール産生形質転換体および該形質転換体を用いた２，３－ブタンジオールの製造方法 - Google Patents

２，３－ブタンジオール産生形質転換体および該形質転換体を用いた２，３－ブタンジオールの製造方法

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WO2025192534A1
WO2025192534A1 PCT/JP2025/008833 JP2025008833W WO2025192534A1 WO 2025192534 A1 WO2025192534 A1 WO 2025192534A1 JP 2025008833 W JP2025008833 W JP 2025008833W WO 2025192534 A1 WO2025192534 A1 WO 2025192534A1
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WO
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nucleic acid
hydrogen
transformant
butanediol
gene
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PCT/JP2025/008833
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English (en)
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勝也 大野
晃章 横田
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Ibiden Co Ltd
Original Assignee
Ibiden Co Ltd
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Publication date
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric

Definitions

  • the present invention relates to a 2,3-butanediol-producing transformant, a method for producing 2,3-butanediol using the transformant, a vector for producing the transformant, and a transformation method using the vector.
  • 2,3-butanediol is a commodity chemical used in the production of a variety of chemical products.
  • 2,3-butanediol is used in a variety of fields as a raw material for 1,3-butadiene and methyl ethyl ketone, as a solvent, chain extender, and dispersant, and as a raw material for printing inks, cosmetic moisturizers, fragrances, plasticizers, pharmaceutical intermediates, liquid crystals, insecticides, fabric softeners, antifreeze, and food.
  • 2,3-butanediol used industrially is mainly produced using organic chemical methods using crude oil as a raw material.
  • Non-Patent Document 1 describes the production of 2,3-butanediol by expressing the alsS gene, alsD gene, and adh gene, which are involved in 2,3-butanediol synthesis, in an arabinose induction system.
  • Non-Patent Document 1 The genetically modified strain produced in Non-Patent Document 1 does not produce sufficient amounts of 2,3-butanediol. Furthermore, in order to increase the amount of 2,3-butanediol produced, the acoXABC gene cluster, which corresponds to the enzyme group involved in acetoin decomposition and which is naturally contained in hydrogen-oxidizing bacteria, is deleted. The genetic modification requires two steps: a step of recombining the 2,3-butanediol synthesis genes, and a step of deleting the acoXABC gene cluster.
  • the object of the present invention is to provide a microorganism capable of producing 2,3-butanediol in high yields.
  • the present invention relates to a transformant of a hydrogen-oxidizing bacterium that grows in the presence of oxygen, (a) a nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate; (b) a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin; and (c) a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol; and (d) a regulatory sequence operably linked to the nucleic acid of (a) to (c); has been introduced,
  • the present invention relates to a transformant used for producing 2,3-butanediol, wherein the nucleic acid (b) is located upstream of the nucleic acid (a) and the nucleic acid (c).
  • the hydrogen-oxidizing bacteria are preferably hydrogen-oxidizing bacteria capable of synthesizing pyruvic acid using carbonate ions and/or CO 2 as a carbon source.
  • the hydrogen-oxidizing bacteria be at least one species selected from the group consisting of hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Cupriavidus, hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Hydrogenophilus, hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Hydrogenobacter, and hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Hydrogenovibrio.
  • the hydrogen-oxidizing bacteria belong to the genus Cupriavidus or the genus Hydrogenophilus.
  • nucleic acid (b) is located upstream of the nucleic acid (a) and the nucleic acid (c), and that the nucleic acid (a) is located upstream of the nucleic acid (c).
  • the regulatory sequence includes an inducible promoter.
  • the introduction of the regulatory sequence and the nucleic acids (a) to (c) removes at least a portion of the nucleic acid encoding the enzymes that synthesize hydroxyalkanoic acid in the genomic DNA.
  • the nucleic acid (a) is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus or Acinetobacter.
  • the nucleic acid (b) is derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus or Enterobacter.
  • the nucleic acid (c) is derived from a microorganism belonging to the genus Clostridium or Acinetobacter.
  • the nucleic acid (b) is A nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14, or It is preferable that the nucleic acid contains a nucleic acid that has at least 80% identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14 and encodes a protein that has catalytic activity to produce acetoin from acetolactate.
  • the nucleic acid (b) may be a nucleic acid that has at least 90% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14, or has a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 14, and encodes a protein that has catalytic activity for producing acetoin from acetolactate.
  • the nucleic acid (a) is A nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15, or It preferably includes a nucleic acid that has at least 80% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15 and encodes a protein that has catalytic activity for producing acetolactate from pyruvate.
  • the nucleic acid (a) may be a nucleic acid that has at least 90% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15, or a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 15, and encodes a protein that has catalytic activity for producing acetolactate from pyruvate.
  • the nucleic acid (c) is A nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16, or It is preferable that the nucleic acid contains a nucleic acid that has at least 80% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16 and encodes a protein that has catalytic activity for producing 2,3-butanediol from acetoin.
  • the nucleic acid (c) may be a nucleic acid that has at least 90% identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16, or a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 16, and encodes a protein that has catalytic activity for producing 2,3-butanediol from acetoin.
  • the hydrogen-oxidizing bacteria is Cupriavidus necator.
  • a transformant that retains the endogenous acoXABC gene cluster is preferred.
  • the hydrogen-oxidizing bacterium is a transformant in which the acoXABC gene cluster is at least partially deleted or inactivated.
  • the hydrogen-oxidizing bacterium is a transformant in which the acoXABC gene cluster has been deleted.
  • the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid sequence including a gene capable of expressing an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, a gene capable of expressing an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and a gene capable of expressing an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol, wherein the nucleic acid sequence is operably linked to a regulatory sequence for expression of the three enzymes in hydrogen-oxidizing bacteria, and the gene capable of expressing the enzyme that converts acetolactate to acetoin in the nucleic acid sequence is located upstream of the gene capable of expressing the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate and the gene capable of expressing the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol.
  • the present invention relates to a transformation method comprising transforming hydrogen-oxidizing bacteria using the vector of the present invention.
  • the present invention relates to a method for producing 2,3-butanediol, which includes a step of culturing the transformant of the present invention.
  • the culture is preferably carried out by introducing CO 2 , hydrogen, and oxygen into a medium containing the transformant.
  • the transformant of the present invention is a transformant into which exogenous (a) nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, (b) nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and (c) nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol have been introduced, wherein the nucleic acid (b) is located upstream of the nucleic acid (a) and the nucleic acid (c).
  • 2,3-butanediol can be produced much more efficiently using CO2 directly as a carbon source than by transformants of the prior art.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of the transformant prepared in the examples.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the structure of the transformant prepared in the comparative example.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of the transformant prepared in the example.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the structure of the transformant prepared in the example.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing the structure of the transformant prepared in the example.
  • the transformant of the present invention is a transformant of a hydrogen-oxidizing bacterium into which (a) a nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, (b) a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and (c) a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol have been introduced, and the nucleic acid (b) is located upstream of the nucleic acid (a) and the nucleic acid (c), making it a transformant used for producing 2,3-butanediol.
  • the metabolic pathway involved in the biosynthesis of 2,3-butanediol in 2,3-butanediol-producing microorganisms is known to involve three steps, starting with pyruvate obtained from sugar metabolism.
  • the thiamine-dependent enzyme ⁇ -acetolactate synthase catalyzes the condensation of two molecules of pyruvate to produce ⁇ -acetolactate and release CO2 .
  • ⁇ -acetolactate is converted to acetoin by a decarboxylation reaction catalyzed by ⁇ -acetolactate decarboxylase.
  • acetoin is reduced to 2,3-butanediol by acetoin dehydrogenase using NADH as a cofactor.
  • the hydrogen-oxidizing bacteria used as a host are not particularly limited as long as they can grow under autotrophic conditions in the presence of oxygen.
  • Hydrogen-oxidizing bacteria generally have high growth potential and significantly higher energy efficiency in inorganic carbon fixation, making them preferred hosts for producing chemical products from carbon dioxide as a raw material.
  • Bacteria that synthesize pyruvic acid as a metabolic intermediate in sugar metabolism using carbonate ions and/or CO2 as a carbon source can be suitably used as the hydrogen-oxidizing bacteria of the present invention.
  • the hydrogen-oxidizing bacteria are bacteria capable of producing hydroxyalkanoic acids such as polyhydroxybutyrate (PHB) from pyruvic acid.
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • the PHB synthesis pathway in such hydrogen-oxidizing bacteria involves three major enzymatic steps: conversion of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA by ⁇ -ketothiolase (acetyl-CoA C-acetyltransferase, phaA), reduction of acetoacetyl-CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA by NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase (PhaB), and synthesis of PHB from 3-hydroxybutyryl-CoA by PHA synthase (PhaC).
  • acetyl-CoA C-acetyltransferase phaA
  • PhaB NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase
  • PhaC PHA synthase
  • Such hydrogen-oxidizing bacteria include hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Cupriavidus, hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Hydrogenophilus, hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Hydrogenobacter, and microorganisms belonging to the genus Hydrogenovibrio.
  • the hydrogen-oxidizing bacteria of the present invention are hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Cupriavidus or hydrogen-oxidizing bacteria belonging to the genus Hydrogenophilus.
  • Cupriavidus necator is a preferred microorganism belonging to the genus Cupriavidus due to its adaptability to a wide range of environments.
  • hydrogen-oxidizing bacteria can be modified (e.g., genetically engineered) by any method known in the art so that they contain and/or express at least a nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol.
  • a transformed strain of modified hydrogen-oxidizing bacteria is a bacterium that is capable of producing 2,3-butanediol even when cultured using carbon dioxide and/or carbonate ions as the sole carbon source.
  • bacteria capable of producing 2,3-butanediol refers to bacteria that, when cultured in a medium, have the ability to secrete 2,3-butanediol into the medium and produce 2,3-butanediol to an extent that it can be recovered from the medium.
  • the transformant of the present invention comprises the above-mentioned at least three nucleic acids, namely, a nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol, as well as regulatory sequences operably linked to these nucleic acids.
  • the regulatory sequence is operably linked upstream of the above-mentioned at least three nucleic acids and may include a transcription promoter. "Operably linked” refers to the linkage of polynucleotide elements in a functional relationship.
  • a nucleic acid is "operably linked” when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. "Operably linked” means that the linked DNA sequences are usually contiguous, and if necessary, the linkage of one or more protein-coding regions is contiguous and in reading frame.
  • the transcription promoter is an inducible promoter.
  • the at least three nucleic acids of the present invention can be integrated into the genomic DNA of a host organism in a state where they can be expressed under the control of an inducible promoter in the host organism.
  • the nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, the nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and the nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol are operably linked to a regulatory sequence that includes at least an arabinose-inducible promoter as an inducible promoter and a regulatory gene araC that encodes the arabinose-responsive regulatory protein AraC.
  • the arabinose-inducible promoter may be, for example, the araBAD promoter.
  • a nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate is an acetolactate synthase gene.
  • the alsS gene is preferred. Examples include the alsS gene or its orthologue derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, or the alsS gene or its orthologue derived from a microorganism belonging to the genus Acinetobacter.
  • the alsS gene may be the alsS gene of Bacillus subtilis or its orthologue, or the alsS gene of Acinetobacter venetianus or its orthologue, with the alsS gene of Bacillus subtilis or its orthologue being particularly preferred.
  • the base sequence of the alsS gene of Bacillus subtilis includes a sequence containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence of the alsS gene of Acinetobacter venetianus includes a sequence containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • nucleic acids encoding enzymes having acetolactate synthase activity in the present invention include the following nucleic acids (i) and (ii): (i) A nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15. (ii) A nucleic acid having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15, which has at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 97% identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15, and which encodes a protein having catalytic activity for producing acetolactate from pyruvate.
  • Nucleic acids encoding enzymes having acetolactate synthase activity in the present invention can also be used, for example,
  • the nucleic acid may be a nucleic acid having a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted, substituted, or added in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15, the nucleotide sequence encoding an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 97% identical to the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 2 or 15, and encoding a protein having catalytic activity for synthesizing acetolactate from pyruvate, or a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a nucleotide sequence complementary to the nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 15.
  • stringent conditions generally refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and nonspecific hybrids are not formed. Such stringent conditions are well known to those skilled in the art and can be determined by reference to, for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), etc.
  • a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin is an acetolactate decarboxylase gene.
  • the alsD gene is preferred. Examples include the alsD gene or its orthologue derived from a microorganism belonging to the genus Bacillus, or the alsD gene or its orthologue derived from a microorganism belonging to the genus Enterobacter. More preferably, for example, the alsD gene may be the alsD gene of Bacillus subtilis or its orthologue, or the alsD gene of Enterobacter kobei or its orthologue, with the alsD gene of Bacillus subtilis or its orthologue being particularly preferred.
  • nucleotide sequence of the alsD gene of Bacillus subtilis is a sequence including the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence of the alsD gene of Enterobacter kobei is a sequence containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • nucleic acids encoding an enzyme having acetolactate decarboxylase activity in the present invention include the following nucleic acids (iii) and (iv): (iii) A nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14. (iv) A nucleic acid having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14, which has at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 97% identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14, and which encodes a protein having catalytic activity for converting acetolactate to acetoin.
  • the nucleic acid encoding the enzyme having acetolactate decarboxylase activity in the present invention can also be, for example,
  • the nucleic acid may be a nucleic acid having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14, which has a base sequence that encodes an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 97% identical to the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 or 14, and which encodes a protein that has catalytic activity for producing acetoin from acetolactate, or a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid having a base sequence complementary to a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 14.
  • a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol is an acetoin dehydrogenase gene.
  • the adh gene is preferred. Examples include the adh gene or its orthologue derived from a microorganism belonging to the genus Clostridium, or the adh gene or its orthologue derived from a microorganism belonging to the genus Acinetobacter.
  • the adh gene may be the adh gene of Clostridium beijerinckii or its orthologue, or the adh gene of Acinetobacter lactucae or its orthologue, with the adh gene of Clostridium beijerinckii or its orthologue being particularly preferred.
  • the base sequence of the adh gene of Clostridium beijerinckii includes a sequence containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of the adh gene of Acinetobacter lactucae includes a sequence containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • nucleic acids encoding enzymes having acetoin dehydrogenase activity in the present invention include the following nucleic acids (v) and (vi): (v) A nucleic acid comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16. (vi) A nucleic acid having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16, which has at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 97% identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16, and which encodes a protein having catalytic activity for converting acetoin to 2,3-butanediol.
  • the nucleic acid encoding the enzyme having acetolactate decarboxylase activity in the present invention can also be, for example,
  • the nucleic acid may be a nucleic acid having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16, which has a base sequence that encodes an amino acid sequence that is at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 97% identical to the amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3 or 16, and which encodes a protein that has catalytic activity for converting acetoin to 2,3-butanediol, or a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a base sequence complementary to a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 16.
  • orthologous genes refer to related genes that exist in different organisms and encode proteins with homologous functions.
  • the nucleic acid encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate can be incorporated so as to remove at least a partial region of the gene encoding the enzymes that synthesize hydroxyalkanoic acids in the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium. This removal eliminates or reduces the function of the enzymes required for hydroxyalkanoic acid synthesis.
  • hydrogen-oxidizing bacteria of the genus Capriavidus have a phaC1AB1 operon encoding PHA synthase (PhaC1), acetyl-CoA C-acetyltransferase (PhaA), and acetoacetyl-CoA reductase (PhaB1), which are key enzymes in the PHB synthesis pathway.
  • PhaC1 PHA synthase
  • PhaA acetyl-CoA C-acetyltransferase
  • PhaB1 acetoacetyl-CoA reductase
  • a nucleic acid encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and a nucleic acid encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol, as well as regulatory sequences operably linked to these nucleic acids are integrated into the genome of the host so that at least a portion of the phaC1AB1 operon is deleted from the genome.
  • the nucleic acid encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate the nucleic acid encoding the enzyme that converts acetolactate to acetoin
  • the nucleic acid encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol, as well as the regulatory sequences operably linked to these nucleic acids are integrated into the genome by homologous recombination, with the region upstream of the start codon of the phaC1 gene and the region downstream of the stop codon of the phaB1 gene serving as homologous recombination sequences.
  • the phaC1AB1 operon is knocked out in the host hydrogen-oxidizing bacterium, and the nucleic acids encoding the enzyme that synthesize acetolactate from pyruvate for 2,3-butanediol production, the nucleic acid encoding the enzyme that converts acetolactate to acetoin, and the nucleic acid encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol are knocked in.
  • nucleic acid (a) encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, nucleic acid (b) encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and nucleic acid (c) encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol are introduced such that nucleic acid (b) encoding the enzyme that converts acetolactate to acetoin is located upstream of nucleic acid (a) encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate and nucleic acid (c) encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol.
  • nucleic acid (a) which encodes the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, which is the first step in the 2,3-butanediol biosynthetic pathway, is not located at the position closest to the regulatory sequence among the three nucleic acids.
  • nucleic acid (b) encoding an enzyme that converts acetolactate to acetoin is located upstream of nucleic acid (a) encoding an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate and nucleic acid (c) encoding an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol
  • nucleic acid (a) encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate may be upstream of nucleic acid (c) encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol
  • nucleic acid (c) encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol may be upstream of nucleic acid (a) encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, but it is particularly desirable that nucleic acid (a) encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate
  • nucleic acid (b) encoding the enzyme that converts acetolactate to acetoin (i.e., the alsD gene); nucleic acid (a) encoding the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate (i.e., the alsS gene); and nucleic acid (c) encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol (i.e., the adh gene)
  • nucleic acid (c) encoding the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol (i.e., the adh gene)
  • the step involving acetolactate decarboxylase encoded by the alsD gene is the rate-limiting step in 2,3-butanediol metabolism among the steps involving each metabolic enzyme in the 2,3-butanediol biosynthetic pathway. It has also been found that the expression level of the alsD gene is lower than that of the other two genes, the alsS gene and the adh gene.
  • the expression level of the alsD gene increases, and the amount of acetolactate decarboxylase increases, which can increase the reaction rate of the reaction in which acetolactate decarboxylase contributes in the step in which acetolactate decarboxylase is involved. For this reason, it is thought that placing the alsD gene closer to the regulatory sequence increased the amount of 2,3-butanediol produced.
  • Hydrogen-oxidizing bacteria are known to be species capable of using acetoin as a carbon source. Therefore, they can express endogenous acetoin-degrading enzymes. These endogenous acetoin-degrading enzymes oxidatively cleave acetoin into two C2 hydrocarbons. In other words, if acetoin is produced by expression of genes introduced into hydrogen-oxidizing bacteria via transformation, there is a risk that the endogenous acetoin-degrading enzymes of the hydrogen-oxidizing bacteria themselves may degrade acetoin into metabolites other than 2,3-butanediol.
  • the endogenous acetoin-degrading enzymes may react in competition with the expressed acetoin dehydrogenase for the acetoin produced by transformation, potentially reducing the amount of 2,3-butanediol produced from acetoin. For this reason, in conventional genetically engineered hydrogen-oxidizing bacteria for 2,3-butanediol production, the acoXABC gene cluster, a group of endogenous enzymes involved in acetoin degradation, is deleted to effectively utilize acetoin as a substrate for the 2,3-butanediol biosynthetic pathway. This reduces or eliminates the activity of endogenous acetoin-degrading enzymes, which metabolize acetoin through oxidative cleavage, thereby inhibiting the breakdown of acetoin.
  • the transformants of the present invention can produce significantly higher amounts of 2,3-butanediol without deleting the endogenous acoXABC genes.
  • the endogenous acoXABC gene cluster may be maintained, or may be partially or entirely deleted, inactivated, or disrupted. Since the present invention does not require treatment to disrupt the endogenous acoXABC gene cluster, it is possible to more easily obtain transformants that are excellent at producing 2,3-butanediol.
  • 2,3-butanediol can be produced by reacting the transformant of the present invention described above in a reaction solution containing a carbon source. Therefore, the present invention encompasses a method for producing 2,3-butanediol, which comprises culturing such a transformant under conditions for producing 2,3-butanediol and for a sufficient period of time.
  • the carbon source can be used alone or in combination with two or more.
  • the carbon source is carbonate ion and/or CO2 .
  • the method for producing 2,3-butanediol includes the step of culturing the transformant by introducing CO2 , hydrogen, and air (oxygen) into a medium containing the transformant of the present invention.
  • the medium, culture temperature, pH, and other parameters used are not particularly limited as long as the objective is achieved, and can be selected by those skilled in the art depending on the type of bacteria, etc.
  • the growth rate of the transformant is approximately equivalent to that of the hydrogen-oxidizing bacterium before transformation, even after the introduction of enzyme genes involved in 2,3-butanediol production and the disruption of the phaC1AB1 operon involved in PHB synthesis by transformation.
  • the method for producing 2,3-butanediol from hydrogen-oxidizing bacteria according to the present invention preferably includes a step of removing cells from the culture filtrate obtained in the culturing step, and a step of isolating 2,3-butanediol from the cell-removed culture filtrate.
  • 2,3-butanediol can be collected from the culture by applying common methods for isolating and purifying ordinary water-soluble neutral substances.
  • the present invention also encompasses a composition for producing 2,3-butanediol, comprising one or more selected from the group consisting of a culture of the transformant, i.e., recombinant hydrogen-oxidizing bacteria, obtained using the transformant, i.e., recombinant hydrogen-oxidizing bacteria, a lysate of the bacteria, and an extract of the culture or lysate.
  • a culture of the transformant i.e., recombinant hydrogen-oxidizing bacteria
  • the transformant of the present invention may incorporate a recombinant vector containing a gene of interest for expressing a desired enzyme in the transformant.
  • Introduction (transformation) of a recombinant vector into a host cell can be carried out using known methods.
  • Introduction methods mainly include methods using an expression vector and genome recombination methods using a suicide vector.
  • a known broad-host-range vector can be used as the expression vector used for introduction.
  • Introduction methods may be selected from bacterial protoplast fusion, electroporation, gene gun techniques, and infection using a viral vector.
  • the suicide vector used for introduction is not limited as long as it is replicable in the host cell, but examples include suicide vectors for homologous recombination introduction, particularly pLO3.
  • Homologous recombination can be carried out, for example, by inserting the gene of interest into a sequence homologous to a sequence on the genome and then introducing this DNA fragment into the cell by electroporation to induce homologous recombination.
  • An expression vector and a suicide vector may also be combined.
  • a recombinant vector refers to a recombinant nucleic acid molecule capable of transmitting an operably linked polynucleotide of interest.
  • an appropriate nucleic acid construct or vector can be designed to be integrated into the region of the target gene in the genome of the parent microorganism to disrupt the gene.
  • a polynucleotide encoding a protein involved in 2,3-butanediol production is introduced by genetic recombination techniques to disrupt, for example, the phaC1AB1 operon involved in PHB synthesis in the hydrogen-oxidizing bacterium, and the host hydrogen-oxidizing bacterium is transformed.
  • the present invention encompasses vectors for introducing a target gene, i.e., a polynucleotide encoding a protein involved in 2,3-butanediol production, into hydrogen-oxidizing bacteria.
  • a target gene i.e., a polynucleotide encoding a protein involved in 2,3-butanediol production
  • the pathway for 2,3-butanediol production is based on three precursors: pyruvate, acetolactate, and acetoin.
  • the vector of the present invention is a nucleic acid construct for gene expression, including a nucleic acid encoding a gene capable of expressing an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, a nucleic acid encoding a gene capable of expressing an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and a nucleic acid encoding a gene capable of expressing an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol.
  • the target gene is preferably linked to a promoter to enable expression control.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions within the hydrogen-oxidizing bacteria cells into which it is introduced.
  • the vector may also include a marker gene for selecting strains into which the target gene has been introduced, polynucleotides required for expression of the target gene, such as a terminator, restriction enzyme recognition sites, and polynucleotides required for cloning genes related to auxotrophy (e.g., amino acids) and drug resistance genes.
  • a marker gene for selecting strains into which the target gene has been introduced polynucleotides required for expression of the target gene, such as a terminator, restriction enzyme recognition sites, and polynucleotides required for cloning genes related to auxotrophy (e.g., amino acids) and drug resistance genes.
  • the vector of the present invention comprises a nucleic acid sequence including a gene capable of expressing an enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate, a gene capable of expressing an enzyme that converts acetolactate to acetoin, and a gene capable of expressing an enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol;
  • the nucleic acid sequence is operably linked to a regulatory sequence for expression of three enzymes in the hydrogen-oxidizing bacterium, and the gene capable of expressing the enzyme that converts acetolactate to acetoin in the nucleic acid sequence is located upstream of the gene capable of expressing the enzyme that synthesizes acetolactate from pyruvate and the gene capable of expressing the enzyme that converts acetoin to 2,3-butanediol.
  • the transformant of the present invention may be cultured using a heterotrophic medium or an autotrophic medium. Furthermore, a combination of heterotrophic and autotrophic media may be used at each stage of the culture.
  • Nutrients used in heterotrophic media include Bacto Yeast Extract, tryptone, beef extract, and the like.
  • ingredients that may be included in the autotrophic medium include nitrogen sources such as ammonia, ammonium (e.g., ammonium chloride ( NH4Cl ), ammonium sulfate (( NH4 ) 2SO4 ), ammonium ferric citrate ), nitrates (e.g., potassium nitrate ( KNO3 )), urea, or organic nitrogen sources; phosphates (e.g., sodium dihydrogen phosphate ( NaH2PO4 ), disodium hydrogen phosphate ( Na2HPO4 ), potassium dihydrogen phosphate ( KH2PO4 ), phosphoric acid ( H3PO4 ), potassium dithiophosphate ( K3PS2O2 ), potassium orthophosphate ( K3PO4 ) , dipotassium hydrogen phosphate ( K2HPO4 ) ) ; sulfates (e.g., ammonium sulfate (( NH4 ) 2
  • ammonium ferric citrate
  • Suitable inorganic salts that may be included in the autotrophic medium include ammonium sulfate, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate heptahydrate, sodium bicarbonate, ferric ammonium citrate, ferric chloride hexahydrate, ammonium chloride, calcium chloride, nickel chloride hexahydrate, etc.
  • the culture conditions are not particularly limited, and typical hydrogen-oxidizing bacteria culture conditions can be used.
  • the supplied substrate gases of H 2 , O 2 , and CO 2 do not require 100% purity of the three components, and may contain gases and impurities other than hydrogen, carbon dioxide, and oxygen.
  • the hydrogen concentration in the culture vessel may be within the ranges of 4-99 vol%, preferably 30-80 vol%, the oxygen concentration of 2-20 vol%, preferably 4-10 vol%, and the carbon dioxide concentration of 0.01-30 vol%, preferably 0.04-10 vol%.
  • the above mixed gas can be supplied to the culture medium at a flow rate of 70 to 4000 mL/min.
  • the air flow rate should be adjusted so that the O2 flow rate is within the above range. Specifically, it is desirable that CO2 be 10 to 1000 mL/min, H2 be 50 to 2000 mL/min, and O2 be 10 to 1000 mL/min.
  • the substrate gas may be hydrogen exhaust gas containing by-product hydrogen emitted from a factory, combustion exhaust gas containing CO2 emitted from a factory, or air.
  • CO2 When CO2 is collected from exhaust gas, it can be concentrated and used. Concentration methods include the pressure swing adsorption (PSA) method, in which CO2 is adsorbed onto zeolite or the like under pressure and concentrated, and then the CO2 is released by reducing the pressure, or the so-called amine method, in which CO2 is absorbed into an amine solution and concentrated, and then heated to release the CO2 .
  • PSA pressure swing adsorption
  • amine method in which CO2 is absorbed into an amine solution and concentrated, and then heated to release the CO2 .
  • H2 can be reused by separating only H2 using a gas separation membrane and refluxing it to the culture tank.
  • the temperature during cultivation is not particularly limited, and can be set to a temperature suitable for culturing the hydrogen-oxidizing bacteria used. For example, it can be set to 25 to 35°C.
  • the cultivation time is also not particularly limited, but can be set to, for example, 30 to 80 hours.
  • sodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4 ) and sodium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), or sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) may be added to the culture medium to provide a pH buffering capacity.
  • a substance that induces gene expression by an inducible promoter is added to the culture medium, and the transformants of the present invention are continued to be cultured.
  • arabinose is added.
  • solid-liquid separation is performed by filtration or centrifugation to remove the transformant of the present invention and solid impurities from the culture solution containing 2,3-butanediol. 2,3-butanediol is then separated and purified from the culture solution using methods such as solvent extraction or distillation.
  • the constructed artificial gene was seamlessly cloned into the suicide vector pLO3 (SEQ ID NO: 4) (Vector Builder synthesis).
  • the above work was outsourced to Eurofins Genomics, Inc.
  • the vector used in Example 1 was named pLO3-1.
  • Figure 1 shows the mechanism by which a target gene is integrated into a predetermined position in the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator strain H16 by homologous recombination using pLO3-1 in the production of Example Transformant 1, as well as the structure of the recombinant strain used in Example 1 obtained by recombination.
  • the constructed artificial gene was integrated into the suicide vector pLO3 (SEQ ID NO: 4) (synthesized using Vector Builder) by seamless cloning. This work was outsourced to Eurofins Genomics.
  • This vector for Example 3 was named pLO3-2.
  • Figure 3 shows the mechanism by which the target gene was integrated into a predetermined position in the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator strain H16 by homologous recombination using pLO3-2 in the production of Example Transformant 3, as well as the structure of the recombinant strain for Example 3 obtained by recombination.
  • FIG. 1 The constructed artificial gene was integrated into the suicide vector pLO3 (SEQ ID NO: 4) (synthesized using Vector Builder) by seamless cloning. This work was outsourced to Eurofins Genomics.
  • This vector for Example 3 was named pLO3-2.
  • Figure 3 shows the mechanism by which the target gene was integrated into a predetermined position in the genomic DNA of the hydrogen-
  • the alsD gene derived from the Enterobacter kobei ENHKU01 strain the alsS gene derived from Acinetobacter venetianus, and the adh gene derived from Acinetobacter lactucae strain OTEC-02 are indicated as alsD * , alsS * , and adh * , respectively.
  • the constructed artificial gene was seamlessly cloned into the suicide vector pLO3 (SEQ ID NO: 4) (Vector Builder synthesis).
  • the above work was outsourced to Eurofins Genomics, Inc.
  • the vector for Example 5 was named pLO3-3.
  • Figure 4 shows the mechanism by which a target gene was integrated into a predetermined position in the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator strain H16 by homologous recombination using pLO3-3 in the production of Example Transformant 5, as well as the structure of the recombinant strain for Example 5 obtained by recombination.
  • An artificial gene was prepared by arranging a 750 bp region upstream of the phaC1 gene derived from the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator strain H16, the araC gene derived from Escherichia coli, an arabinose-responsive promoter, and downstream thereof, the alsD gene (SEQ ID NO: 14) derived from the Enterobacter kobei strain ENHKU01, the adh gene (SEQ ID NO: 16) derived from Acinetobacter lactucae strain OTEC-02, the alsS gene (SEQ ID NO: 15) derived from Acinetobacter venetianus, and a 750 bp region downstream of the phaB1 gene derived from the Cupriavidus necator strain H16.
  • the constructed artificial gene was integrated into the suicide vector pLO3 (SEQ ID NO: 4) (synthesized using Vector Builder) by seamless cloning. This work was outsourced to Eurofins Genomics.
  • This vector for Example 6 was named pLO3-4.
  • Figure 5 shows the mechanism by which the target gene was integrated into a predetermined position in the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator strain H16 by homologous recombination using pLO3-4 in the production of Example Transformant 6, as well as the structure of the recombinant strain for Example 6 obtained by recombination.
  • FIG. 1 The constructed artificial gene was integrated into the suicide vector pLO3 (SEQ ID NO: 4) (synthesized using Vector Builder) by seamless cloning. This work was outsourced to Eurofins Genomics.
  • This vector for Example 6 was named pLO3-4.
  • Figure 5 shows the mechanism by which the target gene was integrated into a predetermined position in the genomic DNA of
  • alsD gene derived from the Enterobacter kobei ENHKU01 strain the adhere gene derived from the Acinetobacter lactucae strain OTEC-02, and the alsS gene derived from Acinetobacter venetianus are indicated as alsD * , adh * , and alsS * , respectively.
  • Example 1 Preparation of transformant 1 for use in the example ⁇ Preparation of Escherichia coli S17-1 competent cells> (2) Escherichia coli S17-1 strain was inoculated into 10 mL of LB liquid medium (Miller) (Sm+) and cultured overnight with shaking at 37°C and 140 rpm. The entire culture solution after overnight culture was transferred to 1 L of LB liquid medium (Miller), placed in a 2 L Erlenmeyer flask, and cultured with shaking at 30°C and 140 rpm.
  • Miller LB liquid medium
  • the supernatant was discarded, and the precipitate was suspended in 1 mL of 10% glycerol solution and centrifuged at 3,350 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was discarded, and the precipitate was suspended in 1 mL of 10% glycerol solution. This was dispensed in 50 ⁇ L aliquots into 1.5 mL Eppendorf tubes to prepare competent cells. The cells were stored at -80 ° C until use.
  • the mixture was cultured at 37°C and 200 rpm for 1 hour with shaking. After the 1-hour curing, the mixture was centrifuged at 3,350 ⁇ g for 5 minutes at room temperature (Kubota Shoji Co., Ltd., 7780II), 900 ⁇ L of the supernatant was discarded, and the pellet was suspended in the remaining 100 ⁇ L. The resulting suspension was plated on LB agar medium (Miller) (Tc+) and incubated at 30°C for 2 days.
  • PCR products were electrophoresed on a 1% agarose gel at 100 V for 25 minutes, stained, and then judged whether or not a PCR product of the desired length had been obtained (Mupid (registered trademark)-exU, manufactured by ADV).
  • the PCR conditions were 94 ° C for 2 minutes, followed by 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 3 minutes, for a total of 35 cycles.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel at 100 V for 25 minutes, and after staining, it was determined whether a PCR product of the desired length had been obtained.
  • the colony from which a PCR product of the desired length was obtained was a strain in which the phaC1AB1 gene cluster originally present in the genome had been replaced with the artificial gene prepared in (1). This was designated as the genetically modified strain for Example 1, Example Transformant 1.
  • Example 3 Preparation of Example Transformant 3
  • the genetically modified strain for Example 3, Example Transformant 3, was obtained in the same manner as in (2) to (9) above, except that the transformation of E. coli S17-1 in (3) was carried out using the pLO3-2 vector.
  • Example 5 Preparation of Example Transformant 5 [0123] The above steps (2) to (9) were repeated except that the transformation of Escherichia coli S17-1 in (3) was carried out using the pLO3-3 vector, to obtain Example Transformant 5, a recombinant strain for Example 5.
  • Example 6 Preparation of Example Transformant 6
  • the genetically modified strain for Example 6, Example Transformant 6, was obtained in the same manner as in (2) to (9) above, except that the transformation of Escherichia coli S17-1 in (3) was carried out using the pLO3-4 vector.
  • Example 2 Preparation of transformant 2 for use in the example ⁇ Preparation of acoXABC knockout vector> (10)
  • a DNA fragment containing 1,024 bp upstream of the acoX gene followed by 821 bp downstream of the acoC gene was created using an artificial gene synthesis service (Eurofins Genomics, Inc.). This DNA fragment was integrated by seamless PCR into the suicide vector pLO3 used in (1).
  • the resulting vector was designated pLO3 ⁇ acoXABC, a vector for deleting the acoXABC gene.
  • Figure 1 shows the mechanism of homologous recombination using pLO3 ⁇ acoXABC in the production of Example Transformant 2 and the structure of the recombinant strain used in Example 2 obtained by recombination.
  • coli and pLO3 ⁇ acoXABC was then transferred from the cuvette to a 1.5 mL Eppendorf tube, and 1 mL of LB liquid medium (Miller) was added.
  • the mixture was cultured at 37°C and 200 rpm for 1 hour with shaking. After the 1-hour curing, the mixture was centrifuged at 5,000 rpm for 5 minutes at room temperature, 900 ⁇ L of the supernatant was discarded, and the pellet was suspended in the remaining 100 ⁇ L.
  • the resulting suspension was inoculated onto LB agar medium (Miller) (Tc+) and incubated at 30°C for 2 days.
  • Example 2 The resulting PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel at 100V for 25 minutes, and after staining, it was determined whether a PCR product of the desired length had been obtained. Colonies that yielded PCR products of the desired length were strains lacking the acoXABC gene cluster originally present in the genome. This was designated the genetically modified strain for Example 2, Example Transformant 2.
  • Example 4 Preparation of Example Transformant 4 The above steps (10) to (17) were repeated to obtain the genetically modified strain for Example 4, Example Transformant 4, except that the co-culture sample (C) in (12) was prepared using the genetically modified strain for Example 3. Note that Figure 3 shows the mechanism of homologous recombination using pLO3 ⁇ acoXABC in the production of Example Transformant 4, and the structure of the recombinant strain for Example 4 obtained by recombination.
  • Comparative Example 1 Preparation of Comparative Transformant 1 ⁇ Preparation of alsS-alsD-adh Recombination Vector pLO3-0> (18)
  • An artificial gene was constructed by arranging a 750 bp upstream region of the phaC1 gene derived from the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator H16 strain, the araC gene derived from Escherichia coli, an arabinose-responsive promoter, the alsS gene derived from Bacillus subtilis, the alsD gene derived from Bacillus subtilis, and the adh gene derived from Clostridium beijerinckii, and a 750 bp downstream region of the phaB1 gene derived from Cupriavidus necator H16 strain.
  • FIG. 1 shows the mechanism by which a target gene is integrated into a predetermined site in the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator strain H16 by homologous recombination using pLO3-0 in the production of comparative transformant 1, as well as the structure of the recombinant strain obtained by recombination.
  • Competent cells of Escherichia coli S17-1 were prepared in the same manner as in (2).
  • the mixture was cultured at 37°C and 200 rpm for 1 hour with shaking. After the 1-hour curing, the mixture was centrifuged at 3,350 ⁇ g for 5 minutes at room temperature, 900 ⁇ L of the supernatant was discarded, and the pellet was suspended in the remaining 100 ⁇ L. The resulting suspension was inoculated onto LB agar medium (Miller) (Tc+) and incubated at 30°C for 2 days.
  • ⁇ PCR check of primary selection colonies> (24) Several colonies formed in the Petri dish (23) were selected, and colony PCR was used to determine whether the recombinant gene had been inserted into the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator H16 strain. KOD Fx Neo (Toyobo Co., Ltd.) was used as the colony PCR reagent.
  • the primers used for PCR were phaC1up1138 (SEQ ID NO: 5) and phaCr (SEQ ID NO: 6).
  • the PCR conditions were 94°C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98°C for 10 seconds and 68°C for 3 minutes.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel at 100V for 25 minutes, and after staining, it was determined whether a PCR product of the desired length had been obtained.
  • the PCR conditions were 94 ° C for 2 minutes, followed by 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 3 minutes, for a total of 35 cycles.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel at 100 V for 25 minutes, and after staining, it was determined whether a PCR product of the desired length had been obtained.
  • Colonies from which PCR products of the desired length were obtained were strains in which the phaC1AB1 gene cluster originally present in the genome had been replaced with the artificial gene created in (18). This was designated as the genetically modified strain for Comparative Example 1, Comparative Example Transformant 1.
  • Comparative Example 2 Preparation of Comparative Transformant 2 ⁇ Transformation of Escherichia coli S17-1 with pLO3 ⁇ acoXABC Vector> (27) In the same manner as in (11), competent cells of S17-1 were transformed with the acoXABC gene deletion vector pLO3 ⁇ acoXABC prepared in (10).
  • PCR check of primary selection colonies> (31) Several colonies formed in the Petri dish (30) were selected, and colony PCR was used to determine whether the recombinant gene had been inserted into the genomic DNA of the hydrogen-oxidizing bacterium Cupriavidus necator H16 strain. KOD Fx Neo (Toyobo Co., Ltd.) was used as the colony PCR reagent.
  • the primers used for PCR were acoXUPupF (SEQ ID NO: 10) and acoCdnR (SEQ ID NO: 11).
  • the PCR conditions were 94°C for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98°C for 10 seconds and 68°C for 3 minutes.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel at 100V for 25 minutes, and after staining, it was determined whether a PCR product of the desired length had been obtained.
  • PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel at 100V for 25 minutes, and after staining, it was determined whether a PCR product of the desired length had been obtained.
  • Colonies that yielded PCR products of the desired length were strains lacking the acoXABC gene cluster originally present in the genome. This was designated the genetically modified strain for Comparative Example 2, Comparative Example Transformant 2.
  • Example Transformants 1 to 6 and Comparative Example Transformants 1 and 2 ⁇ Pre-culture under Heterotrophic Conditions> (34) Colonies of the recombinant strains for Examples 1 to 6 prepared in (9) and (17), respectively, and colonies of the recombinant strains for Comparative Examples 1 and 2 prepared in (26) and (33), respectively, were attached with the back of a toothpick and inoculated into FN(+) liquid medium placed in a 100 mL Erlenmeyer flask. This was cultured with shaking at 30°C and 140 rpm for 2 days in an incubator (Yamato Scientific Co., Ltd., IN604W).
  • Three types of gases were constantly supplied through a sterilizing filter (Toyo Roshi Kaisha, DISMIC (registered trademark)-25CS) and a kerami filter (AS ONE Corporation, 2-554-01, pore size 40-50 ⁇ m). The gases and their supply rates were as follows: hydrogen gas 80 mL/min, carbon dioxide gas 30 mL/min, and air 100 mL/min.
  • the temperature of the culture solution during cultivation was maintained at 28-32°C by controlling a belt heater (Hakko Electric Co., Ltd., SBH2127) with a temperature controller (KETOTEK, KT3100).
  • the solution was stirred at 500 ⁇ 20 rpm with a screw-type stirring blade (Kenis Co., Ltd., four-blade stirring propeller, 65 mm) attached to a motor (Wosune, xd-37Gb555) attached to the top of the incubator.
  • ⁇ Sampling of culture medium for evaluation> (37) 36 to 48 hours after arabinose-induced expression of the 2,3-butanediol synthesis-related enzymes, the culture medium was collected from the culture vessel and used as a sample for evaluating the amount of 2,3-butanediol produced.
  • the precipitate obtained in (38) was frozen at ⁇ 20° C. for 12 hours or more, and then dried in a freeze dryer (Tokyo Rikakikai Co., Ltd., FDU-1200) for 12 hours or more.
  • the weight of the precipitate was then measured using a precision balance (Shimadzu Corporation, AYU120) to obtain the dry cell weight.
  • a calibration curve was created using 2,3-butanediol (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to obtain the 2,3-butanediol concentration of the sample.

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Abstract

２，３－ブタンジオール産生能に優れた形質転換体を提供することを目的とする。酸素共存下で増殖する水素酸化細菌の形質転換体であって、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸と、（ｂ）アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸と、（ｃ）アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸と、（ｄ）（ａ）～（ｃ）の核酸と作動可能に連結された調節配列と、が導入されており、（ｂ）の核酸が、（ａ）の核酸および（ｃ）の核酸の上流に位置している、２，３－ブタンジオールの製造に用いられる形質転換体。

Description

２，３－ブタンジオール産生形質転換体および該形質転換体を用いた２，３－ブタンジオールの製造方法
　本発明は、２，３－ブタンジオール産生形質転換体、該形質転換体を用いた２，３－ブタンジオールの製造方法、該形質転換体を作製するためのベクター、および該ベクターを用いた形質転換法に関する。
　２，３－ブタンジオールは、様々な化成品の生産に用いられる汎用化学品である。例えば、２，３－ブタンジオールは、１，３－ブタジエンやメチルエチルケトンの原料として、溶媒や鎖延長剤、分散剤として、また、印刷用インク、化粧品の保湿剤、芳香剤、可塑剤、医薬品の中間体、液晶、殺虫剤、柔軟剤、不凍液、食品などの原料として様々な分野において使用されている。工業的に利用される２，３－ブタンジオールは、主に原油を原料とした有機化学的な方法によって製造されている。
　地球環境などの観点から、原油からバイオマス原料にシフトして微生物による発酵を用いたバイオプロセスが注目されている。２，３－ブタンジオールを炭水化物から天然に発酵生産する微生物は多数知られているが、バイオマスの前処理の必要性に加え、病原菌であったり、低い２，３－ブタンジオールの生産性などの欠点があった。
　一方、ＣＯ2を直接炭素源として物質生産することのできる化学合成独立栄養微生物を利用するバイオプロセスもまた大量の炭素を固定化できる可能性から注目されている。例えば、高いＣＯ2固定化能を有する水素酸化細菌の遺伝子組換えにより、ＣＯ2から有用物質を合成する方法が知られている。非特許文献１には、２，３－ブタンジオール合成に関わる遺伝子であるａｌｓＳ遺伝子、ａｌｓＤ遺伝子、およびａｄｈ遺伝子をアラビノース誘導系で発現させ、２，３－ブタンジオールを生産することが記載されている。
R. R. Bommareddy et al., A Sustainable Chemicals Manufacturing Paradigm Using CO2 and Renewable H2, iScience, 2020 June 26, Vol 23, 101218
　非特許文献１にて作製された遺伝子組換え株では十分量の２，３－ブタンジオールが得られていない。また、非特許文献１では２，３－ブタンジオールの生産量を高めるために、水素酸化細菌が本来もつ、アセトイン分解に関与する酵素群に対応するａｃｏＸＡＢＣ遺伝子群を欠損させている。遺伝子組換えにおいて、２，３－ブタンジオール合成遺伝子を組み替える工程とａｃｏＸＡＢＣ遺伝子群を欠損させる工程の２段階を経る必要がある。
　したがって、より簡便に作製でき、かつより効率的に２，３－ブタンジオールを産生することのできる遺伝子組換え体を用いたバイオプロセスの開発が求められている。
　本発明は、２，３－ブタンジオールを高い生産量で産生可能な微生物を提供することを目的とする。
　本発明は、酸素共存下で増殖する水素酸化細菌の形質転換体であって、
（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸と、
（ｂ）アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸と、
（ｃ）アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸と、
（ｄ）前記（ａ）～（ｃ）の核酸と作動可能に連結された調節配列と、
が導入されており、
前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）の核酸および前記（ｃ）の核酸の上流に位置している、２，３－ブタンジオールの製造に用いられる形質転換体に関する。
　前記水素酸化細菌が、炭素源として炭酸イオンおよび／またはＣＯ2を利用してピルビン酸を合成できる水素酸化細菌であることが好ましい。
　前記水素酸化細菌が、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する水素酸化細菌、ヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属に属する水素酸化細菌、ヒドロゲノバクター（Hydrogenobacter）属に属する水素酸化細菌およびヒドロゲノビブリオ（Hydrogenovibrio）属に属する水素酸化細菌から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
　前記水素酸化細菌が、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する水素酸化細菌またはヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属に属する水素酸化細菌であることが好ましい。
　前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）の核酸および前記（ｃ）の核酸の上流に位置しており、かつ前記（ａ）の核酸が、前記（ｃ）の核酸の上流に位置していることが好ましい。
　前記調節配列が誘導性プロモーターを含むことが好ましい。
　前記調節配列および前記（ａ）～（ｃ）の核酸が導入されることで、ゲノムＤＮＡにおけるヒドロキシアルカン酸を合成する酵素群をコードする核酸の少なくとも一部の領域が除去されていることが好ましい。
　前記（ａ）の核酸が、バシラス（Bacillus）属またはアシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物に由来する核酸であることが好ましい。
　前記（ｂ）の核酸が、バシラス（Bacillus）属またはエンテロバクター（Enterobacter）属に属する微生物に由来する核酸であることが好ましい。
　前記（ｃ）の核酸が、クロストリジウム（Clostridium）属またはアシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物に由来する核酸であることが好ましい。
　前記（ｂ）の核酸が、
　配列番号１または１４で示される塩基配列を含む核酸、または、
　配列番号１または１４で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつアセト乳酸からアセトインを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
を含むことが好ましい。
　なお、前記（ｂ）の核酸は、配列番号１または１４で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、または、配列番号１または１４の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつアセト乳酸からアセトインを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
　前記（ａ）の核酸が、
　配列番号２または１５で示される塩基配列を含む核酸、または、
　配列番号２または１５で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつピルビン酸からアセト乳酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
を含むことが好ましい。
　なお、前記（ａ）の核酸は、配列番号２または１５で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、または、配列番号２または１５の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつピルビン酸からアセト乳酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
　前記（ｃ）の核酸が、
　配列番号３または１６で示される塩基配列を含む核酸、または、
　配列番号３または１６で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつアセトインから２，３－ブタンジオールを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
を含むことが好ましい。
　なお、前記（ｃ）の核酸は、配列番号３または１６で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、または、配列番号３または１６の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつアセトインから２，３－ブタンジオールを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
　前記水素酸化細菌が、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）であることが好ましい。
　内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを保持する形質転換体であることが好ましい。
　前記水素酸化細菌におけるａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが少なくとも部分的に欠失または不活性化されている形質転換体であることが好ましい。
　前記水素酸化細菌におけるａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが欠失されている形質転換体であることが好ましい。
　本発明は、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子を含む核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列が水素酸化細菌における前記３つの酵素の発現のための調節配列に作動可能に連結されており、前記核酸配列において前記アセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子が、前記ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子および前記アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子の上流に位置しているベクターに関する。
　本発明は、本発明によるベクターを用いて水素酸化細菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法に関する。
　本発明は、本発明による形質転換体を培養する工程を含む２，３－ブタンジオールの製造方法に関する。
　前記培養が、前記形質転換体を含む培地中にＣＯ2、水素および酸素を導入することにより行われることが好ましい。
　本発明の形質転換体は、外因性の（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸と（ｂ）アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸と（ｃ）アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸とが導入された形質転換体であって、（ｂ）の核酸が、（ａ）の核酸および（ｃ）の核酸の上流に位置している。このような形質転換体を用いることによって、ＣＯ2を直接炭素源として２，３－ブタンジオールを従来技術の形質転換体と比較してはるかに効率的に製造することができる。
図１は、実施例で作製した形質転換体の構造を模式的に示す図である。 図２は、比較例で作製した形質転換体の構造を模式的に示す図である。 図３は、実施例で作製した形質転換体の構造を模式的に示す図である。 図４は、実施例で作製した形質転換体の構造を模式的に示す図である。 図５は、実施例で作製した形質転換体の構造を模式的に示す図である。
　本発明の形質転換体は、（ａ）ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸と（ｂ）アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸と（ｃ）アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸とが導入された水素酸化細菌の形質転換体であって、（ｂ）の核酸が、（ａ）の核酸および（ｃ）の核酸の上流に位置している、２，３－ブタンジオールの製造に用いられる形質転換体である。
　２，３－ブタンジオールを産生する微生物における２，３－ブタンジオールの生合成に関与する代謝経路は、糖代謝から得られるピルビン酸から開始される３つのステップを含むことが知られている。最初のステップでは、チアミン依存性酵素のα－アセト乳酸シンターゼがピルビン酸の２分子の縮合を触媒してα－アセト乳酸を生成し、ＣＯ2を放出する。次に、α－アセト乳酸は、α－アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される脱炭酸反応により、アセトインに変換される。最後に、アセトインは、補助因子としてＮＡＤＨを用いて、アセトインデヒドロゲナーゼによって２，３－ブタンジオールに還元される。
　本発明において、宿主として用いる水素酸化細菌は、酸素共存下で、独立栄養条件下で増殖できる細菌であれば特に限定されない。水素酸化細菌は、一般的に、高い増殖能をもち、および、無機炭素固定におけるエネルギー効率が格段に高いため、二酸化炭素原料から化学品を製造させる宿主として好ましい。本発明の水素酸化細菌としては、炭素源として炭酸イオンおよび／またはＣＯ2を利用して、糖代謝の代謝中間体としてピルビン酸を合成する細菌であれば好適に使用できる。好ましくは、水素酸化細菌は、ピルビン酸からのポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）などのヒドロキシアルカン酸産生能を有する細菌である。このような水素酸化細菌におけるＰＨＢ合成経路は既知であり、３つの主な酵素ステップ：β－ケトチオラーゼ（アセチルＣｏＡ　Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、ｐｈａＡ）によるアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換、ＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡリダクターゼ（ＰｈａＢ）によるアセトアセチルＣｏＡの３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへの還元、およびＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）による３－ヒドロキシブチリルＣｏＡからのＰＨＢ合成、を含んでいる。
　このような水素酸化細菌としては、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する水素酸化細菌、ヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属に属する水素酸化細菌、ヒドロゲノバクター（Hydrogenobacter）属に属する水素酸化細菌およびヒドロゲノビブリオ（Hydrogenovibrio）属に属する微生物が含まれる。好ましくは、本発明の水素酸化細菌は、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する水素酸化細菌またはヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属に属する水素酸化細菌である。例えば、カプリアビダス属に属する微生物としては、多様な環境適応性をもつことから、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）が好ましい。
　本発明において、水素酸化細菌は、少なくとも、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、および、アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸を含むおよび／または発現するように、当該技術分野において公知の任意の方法によって改変（例えば、遺伝子操作）され得る。改変された水素酸化細菌の形質転換体は、培養の際、二酸化炭素および／または炭酸イオンを唯一の炭素源として培養しても、２，３－ブタンジオールの製造が可能な細菌である。なお、「２，３－ブタンジオールの製造が可能な細菌」とは、培地中で培養したときに、２，３－ブタンジオールを培地に分泌し、培地から回収可能な程度に２，３－ブタンジオールを製造できる能力を有する細菌を意味する。
　本発明の形質転換体は、上記少なくとも３つの核酸、すなわちピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸と、これら核酸と作動可能に連結された調節配列を含む。本発明において、調節配列は、上記少なくとも３つの核酸の上流に作動可能なように連結され、転写プロモーターを含み得る。「作動可能に連結」とは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結」される。作動可能に連結されるということは、連結されているＤＮＡ配列が通常は連続しており、必要であれば１つ以上のタンパク質コード領域の連結が連続しており、リーディングフレーム内にあることを意味する。
　好ましくは、転写プロモーターは、誘導性プロモーターである。本発明の上記少なくとも３つの核酸は、宿主生物において誘導性プロモーターの制御下で発現可能な状態で宿主のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。
　一実施形態において、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸は、誘導性プロモーターとしてのアラビノース誘導性プロモーターと、アラビノース応答性調節タンパク質ＡｒａＣをコードしている調節遺伝子ａｒａＣとを少なくとも含む調節配列に作動可能に連結される。アラビノース誘導性プロモーターは例えば、ａｒａＢＡＤプロモーターであり得る。
　本発明において、例えば、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸は、アセト乳酸シンターゼ遺伝子である。２，３－ブタンジオールの生産性の観点から、ａｌｓＳ遺伝子が好ましい。例えば、バシラス（Bacillus）属に属する微生物に由来するａｌｓＳ遺伝子またはそのオーソログ、または、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物に由来するａｌｓＳ遺伝子またはそのオーソログなどが挙げられる。さらに好ましくは、例えば、ａｌｓＳ遺伝子は、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のａｌｓＳ遺伝子もしくはそのオーソログ、またはアシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）のａｌｓＳ遺伝子もしくはそのオーソログであってもよく、特には、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のａｌｓＳ遺伝子またはそのオーソログが好ましい。例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のａｌｓＳ遺伝子の塩基配列としては、配列番号２で示される塩基配列を含む配列が挙げられる。例えば、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）のａｌｓＳ遺伝子の塩基配列としては、配列番号１５で示される塩基配列を含む配列が挙げられる。
　本発明におけるアセト乳酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする核酸は、例えば、下記（ｉ）または（ii）の核酸が挙げられる。
（ｉ）配列番号２または１５で示される塩基配列を含む核酸。
（ii）配列番号２または１５で示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸であって、配列番号２または１５で示される塩基配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有し、かつピルビン酸からアセト乳酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸。
　本発明におけるアセト乳酸シンターゼ活性を有する酵素をコードする核酸はまた、例えば、
　配列番号２または１５で示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸であって、配列番号２または１５がコードするアミノ酸配列に対して同一性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつピルビン酸からアセト乳酸を合成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸、または
　配列番号２または１５で示される塩基配列を有する核酸と相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
であってもよい。なお、「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Molecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）等を参照して設定することができる。
　本発明において、例えば、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子である。２，３－ブタンジオールの生産性の観点から、ａｌｓＤ遺伝子が好ましい。例えば、バシラス（Bacillus）属に属する微生物に由来するａｌｓＤ遺伝子またはそのオーソログ、または、エンテロバクター（Enterobacter）属に属する微生物に由来するａｌｓＤ遺伝子またはそのオーソログなどが挙げられる。さらに好ましくは、例えば、ａｌｓＤ遺伝子は、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のａｌｓＤ遺伝子もしくはそのオーソログ、またはエンテロバクター・コベイ（Enterobacter kobei）のａｌｓＤ遺伝子もしくはそのオーソログであってもよく、特には、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のａｌｓＤ遺伝子またはそのオーソログが好ましい。例えば、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のａｌｓＤ遺伝子の塩基配列としては、配列番号１で示される塩基配列を含む配列が挙げられる。例えば、エンテロバクター・コベイ（Enterobacter kobei）のａｌｓＤ遺伝子の塩基配列としては、配列番号１４で示される塩基配列を含む配列が挙げられる。
　本発明におけるアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸は、例えば、下記（iii）または（iv）の核酸が挙げられる。
（iii）配列番号１または１４で示される塩基配列を含む核酸。
（iv）配列番号１または１４で示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸であって、配列番号１または１４で示される塩基配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有し、かつアセト乳酸をアセトインに変換する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸。
　本発明におけるアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸はまた、例えば、
　配列番号１または１４で示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸であって、配列番号１または１４がコードするアミノ酸配列に対して同一性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつアセト乳酸からアセトインを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸、または
　配列番号１または１４で示される塩基配列を有する核酸と相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
であってもよい。
　本発明において、例えば、アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸は、アセトインデヒドロゲナーゼ遺伝子である。２，３－ブタンジオールの生産性の観点から、ａｄｈ遺伝子が好ましい。例えば、クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物に由来するａｄｈ遺伝子またはそのオーソログ、または、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物に由来するａｄｈ遺伝子またはそのオーソログなどが挙げられる。さらに好ましくは、例えば、ａｄｈ遺伝子は、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）のａｄｈ遺伝子もしくはそのオーソログ、またはアシネトバクター・ラクタカエ（Acinetobacter lactucae）のａｄｈ遺伝子もしくはそのオーソログであってもよく、特には、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）のａｄｈ遺伝子もしくはそのオーソログが好ましい。例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）のａｄｈ遺伝子の塩基配列としては、配列番号３で示される塩基配列を含む配列が挙げられる。例えば、アシネトバクター・ラクタカエ（Acinetobacter lactucae）のａｄｈ遺伝子の塩基配列としては、配列番号１６で示される塩基配列を含む配列が挙げられる。
　本発明におけるアセトインデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸は、例えば、下記（ｖ）または（vi）の核酸が挙げられる。
（ｖ）配列番号３または１６で示される塩基配列を含む核酸。
（vi）配列番号３または１６で示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸であって、配列番号３または１６で示される塩基配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％の同一性を有し、かつアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸。
　本発明におけるアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸はまた、例えば、
　配列番号３または１６で示される塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有する核酸であって、配列番号３または１６がコードするアミノ酸配列に対して同一性が、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％であるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸、または
　配列番号３または１６で示される塩基配列を有する核酸と相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
であってもよい。
　なお、本発明において「オーソログ」遺伝子とは、異なる生物に存在する相同な機能を有するタンパクをコードする類縁遺伝子を意味している。
　本発明の形質転換体において、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸、ならびにこれら核酸と作動可能に連結された調節配列は、水素酸化細菌のゲノムＤＮＡにおけるヒドロキシアルカン酸を合成する酵素群の遺伝子の少なくとも一部の領域を除去するように組み込まれ得る。除去によりヒドロキシアルカン酸合成に必要とされる酵素の機能が欠損または低減される。この結果、水素酸化細菌においてピルビン酸からアセチルＣｏＡを介した例えばＰＨＢへの合成系が破壊または低減されると共に、ピルビン酸からの２，３－ブタンジオール合成のための酵素群が発現される。
　例えば、カプリアビダス属の水素酸化細菌においては、ＰＨＢ合成経路における主要な酵素であるＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ１）、アセチルＣｏＡ　Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰｈａＡ）、およびアセトアセチルＣｏＡリダクターゼ（ＰｈａＢ１）をコードしているｐｈａＣ1ＡＢ1オペロンが構成されている。したがって、好ましくは、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸、ならびにこれら核酸と作動可能に連結された調節配列は、ｐｈａＣ1ＡＢ1オペロンの少なくとも一部が宿主のゲノムから欠失するようにゲノムに組み込まれる。好ましくは、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸、ならびにこれら核酸と作動可能に連結された調節配列は、ｐｈａＣ１遺伝子の開始コドンの上流領域およびｐｈａＢ１遺伝子の終止コドンの下流流域を相同組換え配列とする相同組換えによりゲノムに組み込まれる。ｐｈａＣ1ＡＢ1オペロンは宿主の水素酸化細菌においてノックアウトされ、２，３－ブタンジオール産生のためのピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸がノックインされる。
　本発明の形質転換体においては、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸（ｂ）、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）は、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸（ｂ）が、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）の上流に位置しているように、導入されている。驚くべきことに、このように、調節配列の下流に配置される２，３－ブタンジオール生合成経路に関与する各酵素をコードする遺伝子について、遺伝子を合成経路のステップの順番とは異なる順番で配置することにより、形質転換体が顕著に高い量の２，３－ブタンジオールを産生し得ることが、本発明によって初めて発見された。
　本発明の形質転換体において、２，３－ブタンジオールの生合成経路における最初のステップであるピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）が、３つの核酸のうち、調節配列に最も近い位置に配置されていないことが望ましい。
　アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸（ｂ）が、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）の上流に位置している場合、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）が、アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）の上流であってもよく、また、アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）がピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）の上流であってもよいが、特にピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）が、アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）の上流であることが望ましい。
　以下の実施例に記載されているように、２，３－ブタンジオール生合成経路に関与する各代謝酵素をコードする遺伝子が、調節配列に近い位置から下流に向かって、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸（ｂ）すなわちａｌｓＤ遺伝子、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸（ａ）すなわちａｌｓＳ遺伝子、アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸（ｃ）すなわちａｄｈ遺伝子の順序で位置するように形質転換体を設計することにより、０．００２～０．００７（ｇ／ｇ菌・時間）という、従来の遺伝子組換え水素酸化細菌による２，３－ブタンジオール生産量よりもはるかに多い２，３－ブタンジオール生産量が得られた。環境や反応条件によって異なり得るとは考えられるものの、２，３－ブタンジオール生合成経路においては、各代謝酵素が関与するステップのうち、ａｌｓＤ遺伝子がコードするアセト乳酸デカルボキシラーゼが関与するステップが、２，３－ブタンジオール代謝の律速段階になっている可能性がある。また、ａｌｓＤ遺伝子の発現量が他の２つの遺伝子、ａｌｓＳ遺伝子およびａｄｈ遺伝子それぞれの発現量と比較して低いという知見も得られている。そこで、このａｌｓＤ遺伝子をコードする核酸を調節配列すなわちアラビノース誘導性プロモーターに近い位置に配置するように設計することで、ａｌｓＤ遺伝子の発現量が増え、そしてアセト乳酸デカルボキシラーゼ量が増えることで、アセト乳酸デカルボキシラーゼが関与するステップにおけるアセト乳酸デカルボキシラーゼが寄与する反応の反応速度が大きくなり得る。このため、ａｌｓＤ遺伝子を調節配列により近い位置に配置することで、２，３－ブタンジオールの生産量が増えたと考えられる。
　水素酸化細菌は、アセトインを炭素源として使用できる菌種であることが知られている。したがって、水素酸化細菌は、内因性のアセトイン分解酵素を発現し得る。この内因性のアセトイン分解酵素は、アセトインを２つのＣ２炭化水素に酸化的開裂する。すなわち、形質転換により水素酸化細菌に導入された遺伝子の発現によりアセトインが産生された場合、水素酸化細菌自身の内因性のアセトイン分解酵素によってアセトインが２，３－ブタンジオール以外の代謝物へと分解される虞がある。形質転換により産生されたアセトインに対して、内因性のアセトイン分解酵素が発現されたアセトインデヒドロゲナーゼと競合して反応し、アセトインからの２，３－ブタンジオール生成量が低下し得る。このため、２，３－ブタンジオール生産のための従来の遺伝子組換え水素酸化細菌では、アセトインを２，３－ブタンジオール生合成経路の基質として有効に利用するために、アセトイン分解に関わる内因性酵素群のａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを欠失させている。これにより、アセトインを酸化的開裂して代謝する内因性アセトイン分解酵素の活性が低下または消失されてアセトインの分解が抑制される。
　しかしながら、このような組換え水素酸化細菌を作製するためには、多くの労力を要する。本発明の形質転換体では、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子を欠失させずとも、顕著に高い量の２，３－ブタンジオールが得られ得る。本発明の２，３－ブタンジオール産生形質転換体において、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターは保持されていてもよいし、部分的にまたは全体が欠失、不活性化または破壊されていてもよい。本発明においては、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを破壊する処理が不要であることから、より簡便に２，３－ブタンジオール生産に優れた形質転換体を得ることができる。
　上記説明した本発明の形質転換体を、炭素源を含む反応液中で反応させることにより２，３－ブタンジオールを製造することができる。したがって、本発明は、２，３－ブタンジオールを産生する条件下および十分な時間で、このような形質転換体を培養することを含む、２，３－ブタンジオールを産生する方法を包含する。炭素源は、１種を単独で、または２種以上を混合して使用できる。好ましくは、炭素源は、炭酸イオンおよび／またはＣＯ2である。２，３－ブタンジオールの製造方法は、本発明の形質転換体を含む培地中に、ＣＯ2、水素および空気（酸素）を導入して、形質転換体を培養する工程を含む。使用される培地や培養温度、ｐＨなどは目的に達する限り何ら特別の制限はなく、菌の種類などにより当業者が任意に選択することができる。好ましくは、形質転換による２，３－ブタンジオール産生に関わる酵素遺伝子の導入およびＰＨＢ合成に関わるｐｈａＣ1ＡＢ1オペロンの破壊によっても、形質転換体の生育速度は形質転換前の水素酸化細菌とほぼ同等である。
　本願発明による水素酸化細菌からの２，３－ブタンジオールの製造方法は、好ましくは、培養する工程で得られた培養ろ液から細胞を除去する工程と、細胞を除去した培養ろ液から２，３－ブタンジオールを単離する工程とを含む。培養物からの２，３－ブタンジオールの採取は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。
　本発明はまた、本発明による形質転換体すなわち組換え水素酸化細菌を用いて得られた前記細菌の培養物、前記細菌の破砕物、および前記培養物または破砕物の抽出物からなる群より選択された１種以上を含む、２，３－ブタンジオール生産用組成物を包含する。
　本発明の形質転換体には、該形質転換体において所望の酵素を発現させるための、目的遺伝子を含む組換えベクターが組み込まれていてもよい。組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。導入方法としては主に、発現ベクターを用いた方法と、自殺ベクターを用いたゲノム組換え法とが挙げられる。導入に用いる発現ベクターとしては公知の広域宿主ベクターを用いることができる。導入方法としては、例えば、細菌原形質体の融合、電気穿孔法、遺伝子銃法、およびウイルスベクターを使用した感染などから選択されたものであってもよい。導入に用いる自殺ベクターとしては、宿主細胞で複製可能なものであれば限定されないが、例えば相同組換え導入用自殺ベクター、特にはｐＬＯ３などが挙げられる。相同組換えによる方法は、例えば、ゲノム上の配列と相同な配列に目的の遺伝子を挿入し、このＤＮＡ断片をエレクトロポレーションによって細胞内に導入して相同組換えを起こさせることにより実施できる。発現ベクターと自殺ベクターとが組み合わされてもよい。なおここで、組換えベクターとは、作動可能なように連結された目的ポリヌクレオチドを伝達することができる組換え核酸分子を意味している。
　典型的には、突然変異を遺伝子に導入する場合であって、標的遺伝子を破壊もしくはノックアウトする場合、適切な核酸構築物またはベクターを、親微生物のゲノムにおける標的遺伝子の領域へ組み込んで、その遺伝子を破壊するように設計することができる。本発明においては、２，３－ブタンジオール産生に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが遺伝子組換え技術により、水素酸化細菌のＰＨＢ合成に関わる例えばｐｈａＣ1ＡＢ1オペロンを破壊するように導入されて、宿主の水素酸化細菌が形質転換される。
　本発明は、目的遺伝子すなわち２，３－ブタンジオール産生に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを水素酸化細菌に導入するためのベクターを包含する。２，３－ブタンジオールの産生のための経路は、上述のように、３つの前駆体：ピルビン酸、アセト乳酸、およびアセトインに基づいている。したがって、本発明のベクターは、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子の核酸、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子の核酸、およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子の核酸を含む、遺伝子発現のための核酸構築物である。目的遺伝子は、発現制御が可能なようにプロモーターに連結されていることが好ましい。プロモーターは、前述のとおりであるが、導入される水素酸化細菌細胞内で機能するものであれば特に限定されない。また、ベクターには、目的の遺伝子が導入された株を選別するためのマーカーとなる遺伝子やターミネーター等目的遺伝子の発現に必要なポリヌクレオチド、制限酵素認識部位、アミノ酸などの栄養要求性に関連する遺伝子や薬剤耐性遺伝子等のクローニングに必要なポリヌクレオチド等が含まれていてもよい。
　具体的には、本発明のベクターは、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子を含む核酸配列を含むベクターであって、核酸配列が水素酸化細菌における３つの酵素の発現のための調節配列に作動可能に連結されており、核酸配列においてアセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子が、ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子の上流に位置しているベクターである。上述のように、調節配列に近い位置から下流に向かって各遺伝子をこのような順で配置されるように水素酸化細菌を形質転換することで、２，３－ブタンジオール産生能に優れた水素酸化細菌の形質転換体が得られ得る。なお、導入される３つの核酸および調節配列や調節配列に含まれるプロモーターなどは、本発明の形質転換体について上述した通りである。
　本発明の形質転換体を培養することによって２，３－ブタンジオールを製造するにあたっては、以下のような製造条件を採用してもよい。本発明の形質転換体の培養は、従属栄養培地を用いて行ってもよいし、また、独立栄養培地を用いて行ってもよい。また、培養の各段階において従属栄養培地と独立栄養培地とを組み合わせて用いてもよい。
（従属栄養培地の調製）
　従属栄養培地に使用される栄養成分としては、ＢＡＣＴＯ　ＹＥＡＳＴ　ＥＸＴＲＡＣＴ、トリプトン、牛肉エキス等が挙げられる。
（独立栄養培地の調製）
　独立栄養培地に含まれていてもよい成分としては、アンモニア、アンモニウム（例えば、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）、クエン酸鉄アンモニウム）、硝酸塩（例えば、硝酸カリウム（ＫＮＯ3））、尿素、または有機窒素源などの窒素源；リン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、リン酸（Ｈ3ＰＯ4）、ジチオリン酸カリウム（Ｋ3ＰＳ2Ｏ2）、オルトリン酸カリウム（Ｋ3ＰＯ4）、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4））；硫酸塩（例えば、硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）、硫酸マグネシウム・七水和物（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ））；酵母抽出物；キレート鉄；カリウム塩、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、臭化カリウム（ＫＢｒ））；並びに他の無機塩、無機質、微量栄養素（例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）または炭酸カルシウム（ＣａＣＯ3）、硫酸マンガン・七水和物（ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）または塩化マンガン（ＭｎＣｌ2）、塩化第二鉄・六水和物（ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ）、硫酸第一鉄・七水和物（ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）、または塩化第一鉄・四水和物（ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）または炭酸ナトリウム（Ｎａ2ＣＯ3）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4）または塩化亜鉛（ＺｎＣｌ2）、モリブデン酸アンモニウム（ＮＨ4ＭｏＯ4）またはモリブデン酸ナトリウム・二水和物（Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ）、硫酸第一銅（ＣｕＳＯ4）または塩化銅・二水和物（ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、塩化コバルト・六水和物（ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）、塩化アルミニウム・六水和物（ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、ホウ酸（Ｈ3ＢＯ3）、塩化ニッケル・六水和物（ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）、塩化スズ・一水和物（ＳｎＣｌ2・Ｈ2Ｏ）、塩化バリウム・二水和物（ＢａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、セレン酸銅・五水和物（ＣｕＳｅＯ4・５Ｈ2Ｏ）または亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ2ＳｅＯ3）、メタバナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ3）、クロム塩のうちの１つ以上の無機塩）を挙げることができる。例えば、上記のような微量栄養素の含有により本発明の形質転換体の生育、増殖を促進することも可能である。
　独立栄養培地に含まれていてもよい好適な無機塩としては、硫酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム・七水和物、炭酸水素ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、塩化第二鉄・六水和物、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、塩化ニッケル・六水和物等が挙げられる。
　本発明の形質転換体を培養する場合には、培養液（培地）にＣＯ2、Ｈ2および空気やＯ2を吹き込んで培養を行うことが好ましい。
　培養条件は、特に限定されるものではなく、通常の水素酸化細菌培養条件を用いることができる。例えば、培地に吹き込むＨ2、Ｏ2、ＣＯ2各ガス比率は、Ｈ2：Ｏ2：ＣＯ2＝４～９０：２～２０：０．０１～３０が望ましい。なお、供給されるＨ2、Ｏ2およびＣＯ2の基質ガスとしては、３成分系の１００％純度であることを要求するものではなく、水素、二酸化炭素および酸素以外の気体や不純物を含んでもよい。例えば、培養槽内で、水素濃度が、４～９９ｖｏｌ％、好ましくは３０～８０ｖｏｌ％、酸素濃度が、２～２０ｖｏｌ％、好ましくは４～１０ｖｏｌ％、二酸化炭素濃度が０．０１～３０ｖｏｌ％、好ましくは０．０４～１０ｖｏｌ％の範囲内程度であればよい。
　上記混合ガスを７０～４０００ｍＬ／ｍｉｎの流量で培養液に送気することができる。空気としてＯ2を導入する場合はＯ2としての流量が上記範囲となるように空気の流量を調製するとよい。具体的には、ＣＯ2は１０～１０００ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ2は５０～２０００ｍＬ／ｍｉｎ、Ｏ2は１０～１０００ｍＬ／ｍｉｎであることが望ましい。
　なお、基質ガスとしては、工場等から排出された副生水素等を含んだ水素排ガスや、工場等から排出されたＣＯ2等を含んだ燃焼排ガスや、空気が使用されてもよい。ＣＯ2を排気ガスから採取する場合は、これを濃縮して使用することができる。濃縮する方法としては、ＣＯ2を加圧下でゼオライト等に吸着させて濃縮し、減圧することでＣＯ2を離脱させる圧力スイング吸着法（ＰＳＡ法）やアミン溶液にＣＯ2を吸収させて濃縮し、これを加熱することでＣＯ2を脱離させるいわゆるアミン法を採用することができる。また、Ｈ2については、気体分離膜を利用してＨ2のみを分離し、これを培養槽に還流させることで、再利用することができる。
　培養時の温度は特に限定されず、使用する水素酸化細菌の培養に適した温度で設定すればよい。例えば２５～３５℃とすることができる。また、培養の時間も特に限定されるものではないが、例えば３０～８０時間とすることができる。
　例えば、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）およびリン酸二水素ナトリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、または重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）を培養液に添加することにより、ｐＨ緩衝能をもたせてもよい。
　例えば本発明の形質転換体が一定数増殖した後、誘導性プロモーターによる遺伝子発現を誘導する物質を培養液に添加し、さらに本発明の形質転換体の培養を継続する。例えばアラビノース誘導性プロモーターの場合には、アラビノースを添加する。
　培養終了後、ろ過や遠心分離により固液分離を行い、２，３－ブタンジオールを含む培養液をから本発明の形質転換体や固形不純物を除去する。その後、溶媒抽出法や蒸留法などを用いることにより、培養液から２，３－ブタンジオールを分離精製する。
　本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）実施例用の相同組換えベクターの作製
＜ａｌｓＤ－ａｌｓＳ－ａｄｈ組換え用ベクターｐＬＯ３－１の作製＞
　水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＣ１遺伝子の上流７５０ｂｐ部位、大腸菌（Escherichia coli）由来のａｒａＣ遺伝子、アラビノース応答型のプロモーター、その下流にバシラス・サチリス（Bacilius subtilis）由来のａｌｓＤ遺伝子（配列番号１）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のａｌｓＳ遺伝子（配列番号２）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）由来のａｄｈ遺伝子（配列番号３）、さらにカプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＢ１遺伝子の下流７５０ｂｐ部位を配置したものを人工遺伝子として作製した。作製した人工遺伝子を自殺ベクターｐＬＯ３（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ合成）にシームレスクローニングにより組み込んだ。上記作業については、ユーロフィンジェノミクス（株）に委託した。この実施例１用のベクターをｐＬＯ３－１と名付けた。図１に、実施例用形質転換体１の製造においてｐＬＯ３－１を用いた相同組換えによって目的遺伝子を、水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡの所定の位置に組み入れるメカニズムおよび組換えによって得られた実施例１用の組換え株の構造が示されている。
＜ａｌｓＤ*－ａｌｓＳ*－ａｄｈ*組換え用ベクターｐＬＯ３－２の作製＞
　水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＣ１遺伝子の上流７５０ｂｐ部位、大腸菌（Escherichia coli）由来のａｒａＣ遺伝子、アラビノース応答型のプロモーター、その下流にエンテロバクター・コベイ　ＥＮＨＫＵ０１（Enterobacter kobei ENHKU01）株由来のａｌｓＤ遺伝子（配列番号１４）、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）由来のａｌｓＳ遺伝子（配列番号１５）、アシネトバクター・ラクタカエ　ＯＴＥＣ－０２株（Acinetobacter lactucae strain OTEC-02）由来のａｄｈ遺伝子（配列番号１６）、さらにカプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＢ１遺伝子の下流７５０ｂｐ部位を配置したものを人工遺伝子として作製した。作製した人工遺伝子を自殺ベクターｐＬＯ３（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ合成）にシームレスクローニングにより組み込んだ。上記作業については、ユーロフィンジェノミクス（株）に委託した。この実施例３用のベクターをｐＬＯ３－２と名付けた。図３に、実施例用形質転換体３の製造においてｐＬＯ３－２を用いた相同組換えによって目的遺伝子を、水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡの所定の位置に組み入れるメカニズムおよび組換えによって得られた実施例３用の組換え株の構造が示されている。なお、図３においては、エンテロバクター・コベイ　ＥＮＨＫＵ０１（Enterobacter kobei ENHKU01）株由来のａｌｓＤ遺伝子、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）由来のａｌｓＳ遺伝子、アシネトバクター・ラクタカエ　ＯＴＥＣ－０２株（Acinetobacter lactucae strain OTEC-02）由来のａｄｈ遺伝子は、それぞれ、ａｌｓＤ*、ａｌｓＳ*、ａｄｈ*と示されている。
＜ａｌｓＤ－ａｄｈ－ａｌｓＳ組換え用ベクターｐＬＯ３－３の作製＞
　水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＣ１遺伝子の上流７５０ｂｐ部位、大腸菌（Escherichia coli）由来のａｒａＣ遺伝子、アラビノース応答型のプロモーター、その下流にバシラス・サチリス（Bacilius subtilis）由来のａｌｓＤ遺伝子（配列番号１）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）由来のａｄｈ遺伝子（配列番号３）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のａｌｓＳ遺伝子（配列番号２）、さらにカプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＢ１遺伝子の下流７５０ｂｐ部位を配置したものを人工遺伝子として作製した。作製した人工遺伝子を自殺ベクターｐＬＯ３（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ合成）にシームレスクローニングにより組み込んだ。上記作業については、ユーロフィンジェノミクス（株）に委託した。この実施例５用のベクターをｐＬＯ３－３と名付けた。図４に、実施例用形質転換体５の製造においてｐＬＯ３－３を用いた相同組換えによって目的遺伝子を、水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡの所定の位置に組み入れるメカニズムおよび組換えによって得られた実施例５用の組換え株の構造が示されている。
＜ａｌｓＤ*－ａｄｈ*－ａｌｓＳ*組換え用ベクターｐＬＯ３－４の作製＞
　水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＣ１遺伝子の上流７５０ｂｐ部位、大腸菌（Escherichia coli）由来のａｒａＣ遺伝子、アラビノース応答型のプロモーター、その下流にエンテロバクター・コベイ　ＥＮＨＫＵ０１（Enterobacter kobei ENHKU01）株由来のａｌｓＤ遺伝子（配列番号１４）、アシネトバクター・ラクタカエ　ＯＴＥＣ－０２株（Acinetobacter lactucae strain OTEC-02）由来のａｄｈ遺伝子（配列番号１６）、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）由来のａｌｓＳ遺伝子（配列番号１５）、さらにカプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＢ１遺伝子の下流７５０ｂｐ部位を配置したものを人工遺伝子として作製した。作製した人工遺伝子を自殺ベクターｐＬＯ３（配列番号４）（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ合成）にシームレスクローニングにより組み込んだ。上記作業については、ユーロフィンジェノミクス（株）に委託した。この実施例６用のベクターをｐＬＯ３－４と名付けた。図５に、実施例用形質転換体６の製造においてｐＬＯ３－４を用いた相同組換えによって目的遺伝子を、水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡの所定の位置に組み入れるメカニズムおよび組換えによって得られた実施例６用の組換え株の構造が示されている。なお、図５においては、エンテロバクター・コベイ　ＥＮＨＫＵ０１（Enterobacter kobei ENHKU01）株由来のａｌｓＤ遺伝子、アシネトバクター・ラクタカエ　ＯＴＥＣ－０２株（Acinetobacter lactucae strain OTEC-02）由来のａｄｈ遺伝子、アシネトバクター・ベネチアヌス（Acinetobacter venetianus）由来のａｌｓＳ遺伝子は、それぞれ、ａｌｓＤ*、ａｄｈ*、ａｌｓＳ*と示されている。
実施例１　実施例用形質転換体１の作製
＜大腸菌Ｓ１７－１コンピテントセルの作製＞
　（２）大腸菌Ｓ１７－１株をＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｓｍ＋）１０ｍＬに植菌し、３７℃、１４０ｒｐｍで一晩振盪培養した。一晩培養した上記培養液を全量、１ＬのＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）に移し、２Ｌ三角フラスコに入れて、３０℃、１４０ｒｐｍで振盪培養した。ＯＤ６００が０．５６になった時点で５０ｍＬ遠心管に培養液を４０ｍＬずつ分注し、３，３５０×ｇで１５分間、４℃で遠心（久保田商事（株）製、７７８０II）した。上清を捨て、沈殿を３０ｍＬの氷冷滅菌水で懸濁し、３，３５０×ｇで１５分間、４℃で遠心した。再度上清を捨て、沈殿を１０ｍＬの氷冷滅菌水で懸濁し、３，３５０×ｇで１５分間、４℃で遠心した。上清を捨て、１ｍＬの１０％グリセロール溶液に懸濁し、３，３５０×ｇで１５分間、４℃で遠心した。上清を捨て、１ｍＬの１０％グリセロール溶液に懸濁した。これを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに５０μＬずつ分注してコンピテントセルとした。使用するまでは－８０℃で保管した。
＜ｐＬＯ３－１ベクターによる大腸菌Ｓ１７－１の形質転換＞
　（３）－８０℃で保管したＳ１７－１コンピテントセルを氷上で解凍し、１０ｎｇ／μＬのｐＬＯ３－１を１μＬ加え、ピペッティングで混合した。混合後、即座にエレクトロポレーション用キュベット（サーモフィッシャーサイエンティフィック　Ｎｏ．５５４０　１ｍｍ）に入れ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ２５１０を用いて、電気穿孔法による形質転換を行った。電気穿孔条件は、２０００Ｖで５秒間であった。その後、大腸菌とｐＬＯ３－１との混合液をキュベットから１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を１ｍＬ加え、３７℃、２００ｒｐｍで１時間振盪培養を行った。上記１時間のキュア後、３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心（久保田商事（株）製、７７８０II）し、９００μＬの上清を捨て、残った１００μＬでペレットを懸濁した。得られた懸濁液をＬＢ寒天培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）に播種し、３０℃で２日間静置して培養を行った。
＜共培養用の大腸菌とＨ１６株の培養＞
　（４）水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株をグリセロールストックから１００μＬ取り、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（＋）液体培地に植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで３日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ａ）とした。（３）で得られた大腸菌コロニーを爪楊枝の裏で付着させ、５０ｍＬ遠心管に入れたＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）１０ｍＬに植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで２日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｂ）とした。
＜共培養＞
　（５）（４）の共培養用サンプル（Ａ）を全量５０ｍＬ遠心管に移した。その後３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。また、（４）の共培養用サンプル（Ｂ）を全量別の５０ｍＬ遠心管に移した。その後、３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿を２０ｍＬのＦＮ（－）液体培地で懸濁した。これを再度３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。上記２種の懸濁液を２００μＬずつ、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングで混合した後、ＬＢ寒天培地に全量４００μＬ滴下した。滴下後、シャーレ蓋をしてクリーンベンチ内に５時間放置して水分を自然蒸発させた。その後、シャーレごとインキュベーター（ヤマト科学（株）製、ＩＮ６０４Ｗ）内に移動させ、３０℃で一晩静置培養した。
＜１次セレクション＞
　（６）パスツールピペットをガスバーナーで炙り、スプレッダーの形状にした。（５）で得られたペースト状培養物をスプレッダー状パスツールピペットで全量回収し、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。懸濁液のうち５０μＬをＦＮ（＋）（Ｔｃ＋）寒天培地に播種し、スプレッダーでシャーレ全体に広げた後、インキュベーターに入れて３７℃で３日間静置培養した。
＜１次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（７）（６）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより組換え遺伝子が水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡ内に挿入されたかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ｐｈａＣ１ｕｐ１１３８（配列番号５）とｐｈａＣｒ（配列番号６）である。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。ＰＣＲのサーマルサイクラーはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　２７２０を用いた。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後、目的の長さのＰＣＲ産物が得られているかを判定した（ＡＤＶ製、Ｍｕｐｉｄ（登録商標）－ｅｘＵ）。
＜２次セレクション＞
　（８）（７）において目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーを、オートクレーブ滅菌した爪楊枝でピックアップし、５０ｍＬ遠心管に入れたＬＢスクロース液体培地１０ｍＬに植菌し、一晩培養した。培養液を全量３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿をＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）２００μＬで懸濁した後、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を用いて１００，０００倍希釈を行った。このうち内５０μＬをＬＢスクロース寒天培地に播種し、スプレッダーでシャーレ全体に広げた後インキュベーターに入れて、３０℃で３日間静置培養した。
＜２次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（９）（８）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより自殺ベクターｐＬＯ３のベクター部分が消滅したかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ｐｈａＣ１ｕｐ１１３８（配列番号５）とａｒａＢ（配列番号７）の組み合わせ、ｓａｄｈ　ｆｏｒ（配列番号８）とｐｈａＢ１ｄｏｗｎｒｖ５（配列番号９）の組み合わせ、またはａｄｈ２　ｆｏｒ（配列番号１３）とｐｈａＢ１ｄｏｗｎｒｖ５（配列番号９）の組合せである。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後目的の長さのＰＣＲ産物が得られているか判定した。目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーは、本来ゲノム中に存在するｐｈａＣ１ＡＢ１遺伝子群が（１）で作製した人工遺伝子に置き換わっている株である。これを実施例１用の遺伝子組換え株、実施例用形質転換体１とした。
実施例３　実施例用形質転換体３の作製
　（３）における大腸菌Ｓ１７－１の形質転換をｐＬＯ３－２ベクターにより行ったこと以外、上記（２）～（９）を同様に行い、実施例３用の遺伝子組換え株、実施例用形質転換体３を得た。
実施例５　実施例用形質転換体５の作製
　（３）における大腸菌Ｓ１７－１の形質転換をｐＬＯ３－３ベクターにより行ったこと以外、上記（２）～（９）を同様に行い、実施例５用の遺伝子組換え株、実施例用形質転換体５を得た。
実施例６　実施例用形質転換体６の作製
　（３）における大腸菌Ｓ１７－１の形質転換をｐＬＯ３－４ベクターにより行ったこと以外、上記（２）～（９）を同様に行い、実施例６用の遺伝子組換え株、実施例用形質転換体６を得た。
実施例２　実施例用形質転換体２の作製
＜ａｃｏＸＡＢＣノックアウト用ベクターの作製＞
　（１０）（９）で得られた遺伝子組換え株のうち、実施例１用および実施例３用の遺伝子組換え株それぞれのゲノムＤＮＡ内のａｃｏＸＡＢＣ遺伝子を欠損させるため、ａｃｏＸ遺伝子上流１０２４ｂｐの後にａｃｏＣ下流８２１ｂｐが配置されたＤＮＡフラグメントを人工遺伝子合成サービス（ユーロフィンジェノミクス（株））により作製した。このＤＮＡフラグメントを（１）で用いたものと同じ自殺ベクターｐＬＯ３にシームレスＰＣＲで組み込んだ。得られたベクターをａｃｏＸＡＢＣ遺伝子欠損用ベクターｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣと名付けた。図１に、実施例用形質転換体２の製造においてｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣを用いた相同組換えのメカニズムおよび組換えによって得られた実施例２用の組換え株の構造が示されている。
＜ｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣベクターによる大腸菌Ｓ１７－１の形質転換＞
　（１１）（２）において－８０℃で保管していたＳ１７－１コンピテントセルを氷上で解凍し、１０ｎｇ／μＬのｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣを１μＬ加え、ピペッティングで混合した。混合後、即座にエレクトロポレーション用キュベット（サーモフィッシャーサイエンティフィック　Ｎｏ．５５４０　１ｍｍ）に入れ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ２５１０を用いて、電気穿孔法による形質転換を行った。電気穿孔条件は、２０００Ｖで５秒間であった。その後、大腸菌とｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣとの混合液をキュベットから１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を１ｍＬ加え、３７℃で２００ｒｐｍで１時間振盪培養を行った。上記１時間のキュア後、５，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心し、９００μＬの上清を捨て、残った１００μＬでペレットを懸濁した。得られた懸濁液をＬＢ寒天培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）に播種し、３０℃で２日間静置して培養を行った。
＜共培養用の大腸菌と実施例１用の遺伝子組換え株の培養＞
　（１２）（９）で得られた実施例１用の遺伝子組換え株をオートクレーブ滅菌した爪楊枝の裏で付着させ、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（＋）液体培地に植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで３日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｃ）とした。（１１）で得られた大腸菌コロニーを爪楊枝の裏で付着させ、５０ｍＬ遠心管に入れたＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）１０ｍＬに植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで２日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｄ）とした。
＜共培養＞
　（１３）（１２）の共培養用サンプル（Ｃ）を全量５０ｍＬ遠心管に移した。その後３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。また、（１２）の共培養用サンプル（Ｄ）を全量別の５０ｍＬ遠心管に移した。その後、３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿を２０ｍＬのＦＮ（－）液体培地で懸濁した。これを再度３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。上記２種の懸濁液を２００μＬずつ、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングで混合した後、ＬＢ寒天培地に全量４００μＬ滴下した。滴下後、シャーレ蓋をしてクリーンベンチ内に５時間放置して水分を自然蒸発させた。その後、シャーレごとインキュベーター内に移動させ、３０℃で一晩静置培養した。
＜１次セレクション＞
　（１４）パスツールピペットをガスバーナーで炙り、スプレッダーの形状にした。（１３）で得られたペースト状培養物をスプレッダー状パスツールピペットで全量回収し、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。懸濁液のうち５０μＬをＦＮ（＋）（Ｔｃ＋）寒天培地に播種し、スプレッダーでシャーレ全体に広げた後、インキュベーターに入れて３７℃で３日間静置培養した。
＜１次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（１５）（１４）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより組換え遺伝子が水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡ内に挿入されたかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ａｃｏＸＵＰｕｐＦ（配列番号１０）とａｃｏＣｄｎＲ（配列番号１１）である。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後、目的の長さのＰＣＲ産物が得られているかを判定した。
＜２次セレクション＞
　（１６）（１５）において目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーを、オートクレーブ滅菌済みの爪楊枝でピックアップし、５０ｍＬ遠沈管に入れたＬＢスクロース液体培地１０ｍＬに植菌し、一晩培養した。培養液全量を３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿をＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）２００μＬで懸濁した後、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を用いて１００，０００倍希釈を行った。このうち内５０μＬをＬＢスクロース寒天培地に播種し、スプレッダーで広げた後インキュベーターに入れて、３０℃で３日間静置培養した。
＜２次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（１７）（１６）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより自殺ベクターｐＬＯ３のベクター部分が消滅したかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ａｃｏＸＵＰｕｐＦ（配列番号１０）とａｃｏＣＤｎｄｎＲ（配列番号１２）である。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後目的の長さのＰＣＲ産物が得られているか判定した。目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーは、本来ゲノム中に存在するａｃｏＸＡＢＣ遺伝子群が欠損した株である。これを実施例２用の遺伝子組換え株、実施例用形質転換体２とした。
実施例４　実施例用形質転換体４の作製
　（１２）における共培養用サンプル（Ｃ）を実施例３用の遺伝子組換え株を用いて作製したこと以外、上記（１０）～（１７）を同様に行い、実施例４用の遺伝子組換え株、実施例用形質転換体４を得た。なお、図３に、実施例用形質転換体４の製造においてｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣを用いた相同組換えのメカニズムおよび組換えによって得られた実施例４用の組換え株の構造が示されている。
比較例１　比較例用形質転換体１の作製
＜ａｌｓＳ－ａｌｓＤ－ａｄｈ組換え用ベクターｐＬＯ３－０の作製＞
　（１８）水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＣ１遺伝子の上流７５０ｂｐ部位、大腸菌（Escherichia coli）由来のａｒａＣ遺伝子、アラビノース応答型のプロモーター、その下流にバシラス・サチリス（Bacilius subtilis）由来のａｌｓＳ遺伝子、バシラス・サチリス（Bacilius subtilis）由来のａｌｓＤ遺伝子、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）由来のａｄｈ遺伝子、さらにカプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株由来のｐｈａＢ１遺伝子の下流７５０ｂｐ部位を配置したものを人工遺伝子として作製した。作製した人工遺伝子を自殺ベクターｐＬＯ３（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｕｉｌｄｅｒ合成）にシームレスクローニングにより組み込んだ。上記作業については、ユーロフィンジェノミクス（株）に委託した。この比較例用のベクターをｐＬＯ３－０と名付けた。図２に、比較例用形質転換体１の製造においてｐＬＯ３－０を用いた相同組換えによって目的遺伝子を、水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡの所定の位置に組み入れるメカニズムおよび組換えによって得られた組換え株の構造が示されている。
＜大腸菌Ｓ１７－１コンピテントセルの作製＞
　（１９）（２）と同様の方法で大腸菌Ｓ１７－１のコンピテントセルを作製した。
＜ｐＬＯ３－０ベクターによる大腸菌Ｓ１７－１の形質転換＞
　（２０）－８０℃で保管したＳ１７－１コンピテントセルを氷上で解凍し、１０ｎｇ／μＬのｐＬＯ３－０を１μＬ加え、ピペッティングで混合した。混合後、即座にエレクトロポレーション用キュベット（サーモフィッシャーサイエンティフィック　Ｎｏ．５５４０　１ｍｍ）に入れ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ２５１０を用いて、電気穿孔法による形質転換を行った。電気穿孔条件は、２０００Ｖで５秒間である。その後、大腸菌とｐＬＯ３－０との混合液をキュベットから１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を１ｍＬ加え、３７℃、２００ｒｐｍで１時間振盪培養を行った。上記１時間のキュア後、３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、９００μＬの上清を捨て、残った１００μＬでペレットを懸濁した。得られた懸濁液をＬＢ寒天培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）に播種し、３０℃で２日間静置して培養を行った。
＜共培養用の大腸菌とＨ１６株の培養＞
　（２１）水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株をグリセロールストックから１００μＬ取り、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（＋）液体培地に植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで３日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｅ）とした。（２０）で得られた大腸菌コロニーを爪楊枝の裏で付着させ、５０ｍＬ遠心管に入れたＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）１０ｍＬに植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで２日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｆ）とした。
＜共培養＞
　（２２）（２１）の共培養用サンプル（Ｅ）を全量５０ｍＬ遠沈管に移した。その後３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。また、（２１）の共培養用サンプル（Ｆ）を全量別の５０ｍＬ遠心管に移した。その後、３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿を２０ｍＬのＦＮ（－）液体培地で懸濁した。これを再度３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。上記２種の懸濁液を２００μＬずつ、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングで混合した後、ＬＢ寒天培地に全量４００μＬ滴下した。滴下後、シャーレ蓋をしてクリーンベンチ内に５時間放置して水分を自然蒸発させた。その後、シャーレごとインキュベーター内に移動させ、３０℃で一晩静置培養した。
＜１次セレクション＞
　（２３）パスツールピペットをガスバーナーで炙り、スプレッダーの形状にした。（２２）で得られたペースト状培養物をスプレッダー状パスツールピペットで全量回収し、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。懸濁液のうち５０μＬをＦＮ（＋）（Ｔｃ＋）寒天培地に播種し、スプレッダーでシャーレ全体に広げた後、インキュベーターに入れて３７℃で３日間静置培養した。
＜１次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（２４）（２３）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより組換え遺伝子が水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡ内に挿入されたかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ｐｈａＣ１ｕｐ１１３８（配列番号５）とｐｈａＣｒ（配列番号６）である。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後目的の長さのＰＣＲ産物が得られているかを判定した。
＜２次セレクション＞
　（２５）（２４）において目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーを、オートクレーブ滅菌した爪楊枝でピックアップし、５０ｍＬ遠心管に入れたＬＢスクロース液体培地１０ｍＬに植菌し、一晩培養した。培養液を全量３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿をＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）２００μＬで懸濁した後、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を用いて１００，０００倍希釈を行った。このうち内５０μＬをＬＢスクロース寒天培地に播種し、スプレッダーでシャーレ全体に広げた後インキュベーターに入れて、３０℃で３日間静置培養した。
＜２次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（２６）（２５）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより自殺ベクターｐＬＯ３のベクター部分が消滅したかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ｐｈａＣ１ｕｐ１１３８（配列番号５）とａｒａＢ（配列番号７）の組み合わせ、ｓａｄｈ　ｆｏｒ（配列番号８）とｐｈａＢ１ｄｏｗｎｒｖ５（配列番号９）の組み合わせである。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後目的の長さのＰＣＲ産物が得られているか判定した。目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーは、本来ゲノム中に存在するｐｈａＣ１ＡＢ１遺伝子群が（１８）で作製した人工遺伝子に置き換わっている株である。これを比較例１用の遺伝子組換え株、比較例用形質転換体１とした。
比較例２　比較例用形質転換体２の作製
＜ｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣベクターによる大腸菌Ｓ１７－１の形質転換＞
　（２７）（１１）と同様の方法で、Ｓ１７－１のコンピテントセルを、（１０）で作製したａｃｏＸＡＢＣ遺伝子欠損用ベクターｐＬＯ３ΔａｃｏＸＡＢＣで形質転換した。
＜共培養用の大腸菌と比較例１用の遺伝子組換え株の培養＞
　（２８）（２６）で得られた比較例１用の遺伝子組換え株をオートクレーブ滅菌した爪楊枝の裏で付着させ、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（＋）液体培地に植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで３日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｇ）とした。（２７）で得られた大腸菌コロニーを爪楊枝の裏で付着させ、５０ｍＬ遠心管に入れたＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｔｃ＋）１０ｍＬに植菌した。これを３０℃、１４０ｒｐｍで２日間振盪培養した。この培養液を共培養用サンプル（Ｈ）とした。
＜共培養＞
　（２９）（２８）の共培養用サンプル（Ｇ）を全量５０ｍＬ遠心管に移した。その後３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。また、（２８）の共培養用サンプル（Ｈ）を全量別の５０ｍＬ遠心管に移した。その後、３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿を２０ｍＬのＦＮ（－）液体培地で懸濁した。これを再度５０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心し、６００μＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。上記２種の懸濁液を２００μＬずつ、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングで混合した後、ＬＢ寒天培地に全量４００μＬ滴下した。滴下後、シャーレ蓋をしてクリーンベンチ内に５時間放置して水分を自然蒸発させた。その後、シャーレごとインキュベーター内に移動させ、３０℃で一晩静置培養した。
＜１次セレクション＞
　（３０）パスツールピペットをガスバーナーで炙り、スプレッダーの形状にした。（２９）で得られたペースト状培養物をスプレッダー状パスツールピペットで全量回収し、５０ｍＬ遠心管に入れた１０ｍＬのＦＮ（－）液体培地に懸濁した。懸濁液のうち５０μＬをＦＮ（＋）（Ｔｃ＋）寒天培地に播種し、スプレッダーでシャーレ全体に広げた後、インキュベーターに入れて３７℃で３日間静置培養した。
＜１次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（３１）（３０）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより組換え遺伝子が水素酸化細菌カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）Ｈ１６株のゲノムＤＮＡ内に挿入されたかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ａｃｏＸＵＰｕｐＦ（配列番号１０）とａｃｏＣｄｎＲ（配列番号１１）である。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後目的の長さのＰＣＲ産物が得られているか判定した。
＜２次セレクション＞
　（３２）（３１）において目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーを、オートクレーブ滅菌済みの爪楊枝でピックアップし、５０ｍＬ遠沈管に入れたＬＢスクロース液体培地１０ｍＬに植菌し、一晩培養した。培養液全量を３，３５０×ｇで５分間、室温で遠心した。上清を捨て、沈殿をＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）２００μＬで懸濁した後、ＬＢ液体培地（Ｍｉｌｌｅｒ）を用いて１００，０００倍希釈を行った。このうち内５０μＬをＬＢスクロース寒天培地に播種し、スプレッダーで広げた後インキュベーターに入れて、３０℃で３日間静置培養した。
＜２次セレクションコロニーのＰＣＲチェック＞
　（３３）（３２）のシャーレに形成されたコロニーを数個選び、コロニーＰＣＲにより自殺ベクターｐＬＯ３のベクター部分が消滅したかを判定した。コロニーＰＣＲ試薬にはＫＯＤ　Ｆｘ　Ｎｅｏ（東洋紡（株）製）を用いた。ＰＣＲに用いたプライマーは、ａｃｏＸＵＰｕｐＦ（配列番号１０）とａｃｏＣＤｎｄｎＲ（配列番号１２）である。ＰＣＲ条件は９４℃２分間の後、９８℃１０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして、３５サイクルであった。得られたＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで１００Ｖ、２５分間電気泳動を行い、染色後目的の長さのＰＣＲ産物が得られているか判定した。目的の長さのＰＣＲ産物が得られたコロニーは、本来ゲノム中に存在するａｃｏＸＡＢＣ遺伝子群が欠損した株である。これを比較例２用の遺伝子組換え株、比較例用形質転換体２とした。
実施例用形質転換体１～６ならびに比較例用形質転換体１および２を用いた２，３－ブタンジオール産生実験
＜従属栄養条件でのプレ培養＞
　（３４）（９）および（１７）でそれぞれ作製した実施例１～６用の遺伝子組換え株の各コロニー、ならびに、（２６）および（３３）でそれぞれ作製した比較例１および２用の遺伝子組換え株の各コロニーを爪楊枝の裏で付着させ、１００ｍＬ三角フラスコ内に入れたＦＮ（＋）液体培地に植菌した。これをインキュベーター（ヤマト科学（株）製、ＩＮ６０４Ｗ）内で、３０℃、１４０ｒｐｍで２日間振盪培養した。
＜独立栄養条件での本培養＞
　（３５）１Ｌの円柱状容器を使って作製した自作の培養器に７００ｍＬのＦＮ（－）液体培地を入れ、（３４）で培養した培養液をＯＤ６００ｎｍが０．０５になるように添加した（（株）島津製作所製、Ｂｉｏｓｐｅｃ－ｍｉｎｉ）。また、３種類のガスを滅菌用フィルター（東洋濾紙（株）製、ＤＩＳＭＩＣ（登録商標）－２５ＣＳ）とケラミフィルター（アズワン（株）製、２－５５４－０１、細孔径４０～５０μｍ）を通して、常時送気した。それぞれのガスと供給量は次のとおりである。水素ガスは８０ｍＬ／ｍｉｎ、二酸化炭素ガスは３０ｍＬ／ｍｉｎ、空気は１００ｍＬ／ｍｉｎ。培養中の培養液温度は、温度コントローラー（ＫＥＴＯＴＥＫ製、ＫＴ３１００）によるベルトヒーター（（株）八光電機製、ＳＢＨ２１２７）制御によって２８～３２℃に保たれた。液の攪拌は培養器上部に取り付けたモーター（Ｗｏｓｕｎｅ製、ｘｄ－３７Ｇｂ５５５）に取り付けたスクリュー型撹拌翼（ケニス（株）製、撹拌機用プロペラ四枚羽６５ｍｍ）によって５００±２０ｒｐｍの回転数で行った。
＜アラビノースによる誘導＞
　（３６）８種の遺伝子組換え菌が増殖し、３時間ごとのＯＤ600増加率が１００％未満になったら、Ｌ（＋）－アラビノース溶液（富士フイルム和光純薬（株）製）を終濃度０．１％になるように添加した。
＜評価用培養液のサンプリング＞
　（３７）アラビノースによる２，３－ブタンジオール合成関連酵素の発現誘導から３６～４８時間後に培養液を培養器から回収し、２，３－ブタンジオール生産量評価用のサンプルとした。
＜サンプルの固液分離＞
　（３８）（３７）で回収した培養液を５０ｍＬ遠沈管に４０～５０ｍＬ分注を行った。その後高速遠心機（久保田商事（株）製、７７８０II）で１０，０００×ｇ、１０分間の条件で遠心を行った。遠心後、上清は２，３－ブタンジオール測定用に別の５０ｍＬ遠沈管に移し、沈殿物は乾燥菌重量測定用に－２０℃に一時保存した。
＜乾燥菌重量測定＞
　（３９）（３８）で得られた沈殿物を、－２０℃で１２時間以上凍結させた後、凍結乾燥機（東京理化器械（株）製、ＦＤＵ－１２００）で１２時間以上乾燥させた後。次いで、沈殿物の重量を精密天秤（（株）島津製作所製、ＡＹＵ１２０）を用いて測定し、乾燥菌重量を得た。
＜２，３－ブタンジオールの濃度測定の前処理＞
　（４０）（３８）で得られた上清を、孔径０．４５μｍのシリンジフィルター（東洋濾紙（株）製、ＤＩＳＭＩＣ（登録商標）－２５ＣＳ）を通してろ過し、適宜メタノール（富士フイルム和光純薬（株）製）にて希釈をした。
＜２，３－ブタンジオールの濃度測定＞
　（４１）ＧＣ－ＭＳ装置（（株）島津製作所製、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０、Ｐｌｕｓ）、カラム（アジレント・テクノロジー（株）、ＤＢ－ＷＡＸ、３０ｍ×０．２５ｍｍ、ｉｄ×０．２５μｍ、ｆｉｌｍ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を用いて、以下の条件で２，３－ブタンジオール濃度測定を行った。
　カラムオーブン温度：４０℃（３分）－１０℃／分－２５０℃（１０分）、
　キャリアーガス：Ｈｅ　１．０ｍＬ／ｍｉｎ（定流量モード）、
　注入口：２５０℃、
　スプリット１０:１、
　検出器：ＭＳ、
　イオン化法：ＥＩ法、電子エネルギー：７０ｅＶ、
　インターフェイス温度：１５０℃、
　イオンソース温度：２３０℃、
　質量範囲：ｍ／ｚ＝４３，４５，５７（ＳＩＭ）
　２，３－ブタンジオール（富士フイルム和光純薬（株）製）を用いて検量線を作成し、サンプルの２，３－ブタンジオール濃度を得た。
＜各形質転換体の２，３－ブタンジオール生産能力＞
　（４２）得られた２，３－ブタンジオール濃度および菌重量、ならびに培養時間から実施例１～６用の遺伝子組換え株ならびに比較例１および２用の遺伝子組換え株それぞれの２，３－ブタンジオール生産能力を算出した。結果を以下の表１に示す。
　表１に示されるように、ａｌｓＤ－ａｌｓＳ－ａｄｈ組換え用ベクターで形質転換された実施例１～４、ならびに、ａｌｓＤ－ａｄｈ－ａｌｓＳ組換え用ベクターで形質転換された実施例５および６の形質転換体は、ａｌｓＳ－ａｌｓＤ－ａｄｈ組換え用ベクターで形質転換された比較例１、またはａｌｓＳ－ａｌｓＤ－ａｄｈ組換え用ベクターで形質転換されさらに内因性のアセトイン分解酵素に関わる内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが欠失されている従来の遺伝子組換え水素酸化細菌に対応する比較例２の形質転換体に比べて、１．５倍以上の２，３－ブタンジオール生産能力を有していた。この結果は、２，３－ブタンジオールの生産量を高めるためには、２，３－ブタンジオール生合成経路に関与するａｌｓＳ、ａｌｓＤ、およびａｄｈの３つの遺伝子が、調節配列に近い位置から下流に向かって、２，３－ブタンジオールの生合成に関与するステップと同じ順番（ａｌｓＳ－ａｌｓＤ－ａｄｈ）で発現されるのではなく、ａｌｓＤが調節配列に最も近い位置で発現されることが好ましかったことを示している。また、ａｌｓＤの後にａｄｈを配置した株（ａｌｓＤ－ａｄｈ－ａｌｓＳ）では、ａｌｓＤの後にａｌｓＳを配置した株（ａｌｓＤ－ａｌｓＳ－ａｄｈ）に比べて２，３－ブタンジオール生産量が３分の１程度まで低下した。このことから、２，３－ブタンジオール生産にはａｌｓＤ、ａｌｓＳ、ａｄｈという順番で酵素の役割が大きいと推測される。
　また、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを保持している実施例１の形質転換体の２，３－ブタンジオール生産能力と内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが欠失されている実施例２の形質転換体の２，３－ブタンジオール生産能力とがほぼ同程度であった。同様に、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを保持している実施例３の形質転換体の２，３－ブタンジオール生産能力と、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが欠失されている実施例４の形質転換体の２，３－ブタンジオール生産能力もまた、ほぼ同程度であった。この結果から、２，３－ブタンジオール生合成経路に関与するａｌｓＳ、ａｌｓＤ、およびａｄｈの３つの遺伝子が、調節配列に近い位置から下流に向かってａｌｓＤ－ａｌｓＳ－ａｄｈの順番に配置されている形質転換体においては、２，３－ブタンジオールの産生において、内因性のアセトイン分解酵素が発現されていたとしても、２，３－ブタンジオールの生産量には影響しないことが理解される。一方、２，３－ブタンジオール生合成経路に関与する各代謝酵素をコードする遺伝子が、２，３－ブタンジオールの生合成に関与するステップと同じ順番（ａｌｓＳ－ａｌｓＤ－ａｄｈ）で配置されており、かつ、内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを保持している比較例２の形質転換体では、２，３－ブタンジオールの産生はほぼ認められなかった。

Claims (21)

  1. 酸素共存下で増殖する水素酸化細菌の形質転換体であって、
    （ａ）ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素をコードする核酸と、
    （ｂ）アセト乳酸をアセトインに変換する酵素をコードする核酸と、
    （ｃ）アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素をコードする核酸と、
    （ｄ）前記（ａ）～（ｃ）の核酸と作動可能に連結された調節配列と、
    が導入されており、
    前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）の核酸および前記（ｃ）の核酸の上流に位置している、２，３－ブタンジオールの製造に用いられる形質転換体。
  2. 前記水素酸化細菌が、炭素源として炭酸イオンおよび／またはＣＯ2を利用してピルビン酸を合成できる水素酸化細菌である請求項１記載の形質転換体。
  3. 前記水素酸化細菌が、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する水素酸化細菌、ヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属に属する水素酸化細菌、ヒドロゲノバクター（Hydrogenobacter）属に属する水素酸化細菌およびヒドロゲノビブリオ（Hydrogenovibrio）属に属する水素酸化細菌から選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の形質転換体。
  4. 前記水素酸化細菌が、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する水素酸化細菌またはヒドロゲノフィラス（Hydrogenophilus）属に属する水素酸化細菌である請求項１記載の形質転換体。
  5. 前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）の核酸および前記（ｃ）の核酸の上流に位置しており、かつ前記（ａ）の核酸が、前記（ｃ）の核酸の上流に位置している請求項１記載の形質転換体。
  6. 前記調節配列が誘導性プロモーターを含む請求項１記載の形質転換体。
  7. 前記調節配列および前記（ａ）～（ｃ）の核酸が導入されることで、ゲノムＤＮＡにおけるヒドロキシアルカン酸を合成する酵素群をコードする核酸の少なくとも一部の領域が除去されている請求項１記載の形質転換体。
  8. 前記（ａ）の核酸が、バシラス（Bacillus）属またはアシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物に由来する請求項１記載の形質転換体。
  9. 前記（ｂ）の核酸が、バシラス（Bacillus）属またはエンテロバクター（Enterobacter）属に属する微生物に由来する請求項１記載の形質転換体。
  10. 前記（ｃ）の核酸が、クロストリジウム（Clostridium）属またはアシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物に由来する請求項１記載の形質転換体。
  11. 前記（ｂ）の核酸が、
    　配列番号１または１４で示される塩基配列を含む核酸、または、
    　配列番号１または１４で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつアセト乳酸からアセトインを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
    を含む請求項１記載の形質転換体。
  12. 前記（ａ）の核酸が、
    　配列番号２または１５で示される塩基配列を含む核酸、または、
    　配列番号２または１５で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつピルビン酸からアセト乳酸を生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
    を含む請求項１記載の形質転換体。
  13. 前記（ｃ）の核酸が、
    　配列番号３または１６で示される塩基配列を含む核酸、または、
    　配列番号３または１６で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、かつアセトインから２，３－ブタンジオールを生成する触媒活性を有するタンパク質をコードする核酸
    を含む請求項１記載の形質転換体。
  14. 前記水素酸化細菌が、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）である請求項１記載の形質転換体。
  15. 内因性ａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターを保持する請求項１記載の形質転換体。
  16. 前記水素酸化細菌におけるａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが少なくとも部分的に欠失または不活性化されている請求項１記載の形質転換体。
  17. 前記水素酸化細菌におけるａｃｏＸＡＢＣ遺伝子クラスターが欠失されている請求項１記載の形質転換体。
  18. ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子、アセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子およびアセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子を含む核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列が水素酸化細菌における前記３つの酵素の発現のための調節配列に作動可能に連結されており、前記核酸配列において前記アセト乳酸をアセトインに変換する酵素を発現可能な遺伝子が、前記ピルビン酸からアセト乳酸を合成する酵素を発現可能な遺伝子および前記アセトインを２，３－ブタンジオールに変換する酵素を発現可能な遺伝子の上流に位置しているベクター。
  19. 請求項１８記載のベクターを用いて水素酸化細菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
  20. 請求項１記載の形質転換体を培養する工程を含む２，３－ブタンジオールの製造方法。
  21. 前記培養が、前記形質転換体を含む培地中にＣＯ2、水素および酸素を導入することにより行われる請求項２０記載の２，３－ブタンジオールの製造方法。
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