WO2025170010A1 - 成熟心外膜細胞の製造方法 - Google Patents

成熟心外膜細胞の製造方法

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WO2025170010A1
WO2025170010A1 PCT/JP2025/004014 JP2025004014W WO2025170010A1 WO 2025170010 A1 WO2025170010 A1 WO 2025170010A1 JP 2025004014 W JP2025004014 W JP 2025004014W WO 2025170010 A1 WO2025170010 A1 WO 2025170010A1
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WO
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cells
epicardial
torin1
cell
expression
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PCT/JP2025/004014
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English (en)
French (fr)
Inventor
善紀 吉田
アントニオ ルセナカカセ
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Kyoto University
Original Assignee
Kyoto University
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing mature epicardial cells. More specifically, it relates to a method for producing mature epicardial cells, which includes a step of culturing epicardial cells in a medium containing an mTORC2 inhibitor, and to uses of the epicardial cells obtained by this method.
  • the human epicardium is the outermost layer of the heart and plays a crucial role in cardiac development and regeneration.
  • Epicardial cells are the source of various cells that form the heart, including cardiac fibroblasts, smooth muscle cells, and endothelial cells, and play an important role in cardiac organogenesis. Furthermore, these epicardial cell-derived cells play important roles in maintaining cardiac homeostasis and regulating responses to organ injury. For these reasons, epicardial cells and cells derived from epicardial cells are important cell groups in research on cardiac disease pathology models. Furthermore, recent mouse studies have shown that epicardial cells have the ability to regenerate after myocardial injury during fetal development and the first few days after birth (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 the epicardium becomes quiescent and loses its regenerative ability as the tissue functionally matures.
  • Non-Patent Document 3 quiescent epicardial cells remain metabolically and transcriptionally active.
  • Non-Patent Document 4 fetal-type epicardial cells
  • WT1 and TBX18 markers of fetal-type epicardial cells
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • an objective of the present invention is to provide a method for producing mature epicardial cells, and epicardial cells produced by said method.
  • inducing epicardial cell quiescence might produce adult-type (mature) epicardial cells that lack regenerative capacity.
  • mTOR mechanistic target of rapamycin
  • the mTOR signaling pathway plays an important role in controlling cellular quiescence in mature tissues by sensing and responding to changes in nutrient availability, growth factors, and other environmental cues (e.g., Liu, G. Y. & Sabatini, D. M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 183-203 (2020)).
  • mTOR mechanistic target of rapamycin
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing mature epicardial cells comprising the step of culturing epicardial cells in a medium containing an mTORC2 inhibitor.
  • the method according to [1] or [2], wherein at least one of the mTORC2 inhibitors is selected from the group consisting of Torin1, sapanisertib, WYE-687, AZD8055, and bistusertib.
  • the method according to [1] or [2], wherein at least one of the mTORC2 inhibitors is Torin1.
  • a transplantation therapy agent comprising the mature epicardial cells or cardiac organoids described in [7].
  • a method for producing mature cardiomyocytes comprising a step of co-culturing the mature epicardial cells or cardiac organoids described in [7] with cardiomyocytes.
  • a method for maturing epicardial cells comprising the step of culturing epicardial cells in a medium containing an mTORC2 inhibitor.
  • a method for maturing cardiomyocytes comprising a step of co-culturing the mature epicardial cells or cardiac organoids according to [7] with cardiomyocytes.
  • a method for treating or preventing heart disease comprising administering or transplanting an effective amount of the mature epicardial cells or cardiac organoids described in [7] and/or the cardiomyocytes or cell aggregates described in [10-2] to a mammal.
  • the mature epicardial cells or cardiac organoids according to [7] and/or the cardiomyocytes or cell aggregates according to [10-2] for use in the treatment or prevention of cardiac disease.
  • the present invention provides a novel method for producing mature epicardial cells from immature epicardial cells. Furthermore, it is also possible to produce mature cardiomyocytes using these mature epicardial cells.
  • FIG. 1 Venn diagram for targeted screening and identification of mTORC2-dependent elements also expressed in primary adult epicardial tissue.
  • Venn1 top left shows transcription factors (TFs) from Torin1, excluding those shared with or unique to rapamycin.
  • Venn2 (bottom left) shows TFs from differentially expressed genes (DEGs) after filtering out statistically significant genes in both fetal and adult epicardium.
  • Epicardial cells constitute the outermost layer of an animal's heart and play an important role in cardiac development and regeneration.
  • immature epicardial cells refer to cells that express WT1 and TBX18 and have proliferation and epithelial-mesenchymal transition activity.
  • mature epicardial cells refer to cells that have reduced or absent (in other words, “no expression”) fetal epicardial marker expression levels compared to epicardial cells prior to the step of culturing in a medium containing an mTORC2 inhibitor. These cells typically have further reduced or absent proliferation and epithelial-mesenchymal transition activity compared to epicardial cells prior to the step of culturing in a medium containing an mTORC2 inhibitor.
  • the epicardial cells of the present invention may also have increased expression levels of IGF2 and/or FN1.
  • markers for fetal epicardial cells include WT1, TBX18, ALDH1A2, and HAND2.
  • Cells in which the expression level of at least one of these (e.g., WT1) is reduced or absent can be considered mature epicardial cells, but preferably the expression levels of two or more (e.g., a combination of WT1 and TBX18, a combination of WT1, TBX18, ALDH1A2, and HAND2, etc.) are reduced or absent.
  • mature epicardial cells do not express WT1 and/or TBX18, and more preferably do not express WT1 and TBX18.
  • epicardial cells can be matured by culturing them in a medium containing an mTORC2 inhibitor, and epicardial cells within cardiac organoids can also be matured.
  • the epicardial cells used in the present invention are contained in cardiac organoids, and the epicardial cells are subjected to the production method of the present invention in the form of cardiac organoids. Therefore, the present invention also provides a method for producing cardiac organoids containing mature epicardium, which includes the step of culturing cardiac organoids containing epicardial cells in a medium containing an mTORC2 inhibitor.
  • cells includes “cell populations.” Furthermore, unless otherwise specified, “cells” refers to those obtained by cell culture. A cell population may be composed of one type of cell, or may be composed of two or more types of cells. Furthermore, unless otherwise specified, “cell populations” also include “organoids” such as “cell aggregates” and “artificial tissues.”
  • organoid refers to a structure (typically a spheroid) containing multiple types of cells.
  • artificial tissue typically refers to a structure that has a structure and/or function similar to that of tissue in a living organism. Whether a structure is an organoid or an artificial tissue can be determined, for example, by observing a sample that has been stained as necessary (e.g., immunostaining, hematoxylin-eosin (HE) staining, etc.) under a microscope to confirm the localization of cells and the presence or absence of layered structure formation.
  • HE hematoxylin-eosin
  • cardiac organoid refers to an organoid containing epicardial cells, and includes artificial cardiac tissue.
  • artificial cardiac tissue refers to artificial tissue containing epicardial cells.
  • cardiac tissue will be simply referred to as "cardiac tissue.”
  • cardiac organoids of the present invention contain TNNT2-positive cardiomyocytes exhibiting pulsatile activity, CD31-positive endothelial cells, NFATC1-positive endocardial cells, and VIM-positive cardiac fibroblasts. Cardiac organoids may also have tight junctions as indicated by ZO-1 expression.
  • the epicardial cells used in the present invention can be obtained by known methods. Examples include isolation from the heart using known techniques, differentiation induction of pluripotent stem cells, and procurement from companies such as ATCC. Midgut cells can be isolated from the heart using, for example, flow cytometry or mass cytometry using a surface antigen (e.g., CDH18) as an indicator, magnetic cell separation, or affinity columns immobilized with the desired antigen.
  • the epicardial cells used in the present invention are preferably obtained by differentiation induction of pluripotent stem cells.
  • the origin of the epicardial cells is not particularly limited, and may be from rodents such as rats, mice, hamsters, and guinea pigs; lagomorphs such as rabbits; ungulates such as pigs, cows, goats, and sheep; carnivores such as dogs and cats; humans; and primates such as monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees. Humans are the preferred origin.
  • the production method of the present invention may comprise at least one of the following steps (A) to (C).
  • EBs embryonic bodies
  • B A step of inducing cell aggregates containing mesodermal cells by subjecting the cell aggregates obtained in step (A) to suspension culture in the presence of BMP4, activin A, and bFGF.
  • C A step of dispersing the cell aggregates obtained in step (B) and culturing them in the presence of CHIR99021, BMP4, VEGF, and SB431542 to induce differentiation into epicardial cells.
  • the epicardial cells obtained in step (C) can also be maintained for a long period of time in a maintenance medium.
  • maintenance medium include, but are not limited to, DMEM containing 10% FBS and 10 ⁇ M SB431542.
  • step (A) The formation of cell aggregates in step (A) is typically carried out by the following method.
  • pluripotent stem cells are recovered from subculture and dispersed into single cells or a state close to single cells.
  • the pluripotent stem cells are dispersed using an appropriate cell dissociation solution.
  • cell dissociation solutions include EDTA; trypsin, collagenase IV, metalloproteases, and other proteolytic enzymes, which can be used alone or in appropriate combinations.
  • Commercially available cell dissociation solutions include Accutase (MILLIPORE), Dispase (EIDIA), and TrypLE (Invitrogen).
  • the dispersed pluripotent stem cells are suspended in a medium in a low-adhesion culture vessel.
  • the duration of step (A) can be determined as appropriate by those skilled in the art, and is usually 0.5 to 5 days (particularly 1 day).
  • Step (B) is a step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into mesodermal cells, and the medium used in this step preferably contains an extracellular matrix (e.g., 0.5% Matrigel) in addition to the above-mentioned additives.
  • the duration of step (B) can be appropriately determined by those skilled in the art, and is usually 1 to 6 days, with 2 to 4 days (particularly 2.5 days) being more preferred.
  • Step (C) is a step of inducing differentiation of mesodermal cells into epicardial cells, and is typically carried out by dispersing cell aggregates into single cells or a state close to single cells, as in step (A), and then culturing the cells in an adherent culture.
  • the duration of step (C) can be appropriately determined by those skilled in the art, and is usually 3 to 10 days, with 4 to 7 days (particularly 5.5 days) being more preferable.
  • cardiac organoids can be induced by, for example, culturing the cell aggregates obtained in step (A) above in suspension in a medium containing CHIR99021, BMP4, and Activin A, then treating the cell aggregates with Wnt-C59 for approximately two days, and continuing the suspension culture until the 15th day.
  • step (A) It is also possible to produce artificial cardiac tissue from cardiac organoids by dispersing cell aggregates into single cells or a state close to single cells, as in step (A), and then culturing the cells in an adhesive culture medium for artificial cardiac tissue.
  • pluripotent stem cells refer to stem cells that can differentiate into tissues and cells with a variety of different morphologies and functions in the body, and have the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, and ectoderm).
  • pluripotent stem cells used in the present invention include induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (ntES cells), multipotent germline stem cells (mGS cells), and embryonic germ stem cells (EG cells), with iPS cells (more preferably human iPS cells) being preferred.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • mGS cells multipotent germline stem cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • iPS cells more preferably human iPS cells
  • ES cells are stem cells that are pluripotent and have the ability to proliferate through self-renewal and are established from the inner cell mass of early mammalian embryos (e.g., blastocysts) such as humans and mice.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156), and subsequently, ES cell lines were established in humans, monkeys, and other primates (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. ( (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al. (1996), Biol.
  • ES cells can be established by extracting the inner cell mass from the blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on fibroblast feeders.
  • ES cells can be established using only a single blastomere from an embryo at the cleavage stage prior to the blastocyst stage (Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117), or from developmentally arrested embryos (Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676).
  • nt ES cells are ES cells derived from cloned embryos produced by nuclear transfer technology, and have almost the same properties as ES cells derived from fertilized eggs (Wakayama T. et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al. (2007), Nature, 450:497-502).
  • nt ES (nuclear transfer ES) cells are ES cells established from the inner cell mass of a blastocyst derived from a cloned embryo obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with the nucleus of a somatic cell.
  • nt ES cells To create nt ES cells, a combination of nuclear transfer technology (Cibelli J.B. et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646) and ES cell production technology (mentioned above) is used (Wakayama Kiyoka et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Special Issue), pp. 47-52).
  • nuclear transfer the nucleus of a somatic cell is injected into an enucleated unfertilized mammalian egg, which can then be initialized by culturing for several hours.
  • ES cell lines used in the present invention include, for example, various mouse ES cell lines established by inGenious targeting laboratory, RIKEN (Institute of Physical and Chemical Research), and human ES cell lines established by, for example, the University of Wisconsin, NIH, RIKEN, Kyoto University, National Center for Child Health and Development, and Cellartis.
  • human ES cell lines include CHB-1 to CHB-12, RUES1, RUES2, and HUES1 to HUES28 strains distributed by ESI Bio, H1 and H9 strains distributed by WiCell Research, and KhES-1, KhES-2, KhES-3, KhES-4, KhES-5, SSES1, SSES2, and SSES3 strains distributed by RIKEN.
  • iPS cells are cells obtained by reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors).
  • iPSCs established by Yamanaka et al. by introducing four factors, Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, into mouse fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), human cell-derived iPSCs established by introducing the same four factors into human fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S., et al.
  • Nanog-iPSCs established by selecting using Nanog expression as an indicator after introducing the above four factors (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317), and iPSCs created using a method that does not include c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106), iPSCs established by introducing six factors using a virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.), etc. can also be used.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing four factors, OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28, created by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells created by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), and induced pluripotent stem cells created by Sakurada et al. (JP Patent Publication No. 2008-307007) can also be used.
  • all published papers e.g., Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol.
  • iPSC lines established by the NIH, RIKEN, Kyoto University, and other institutions are available as induced pluripotent stem cell lines.
  • human iPSC lines include RIKEN's HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A, and Nips-B2 lines, as well as Kyoto University's 253G1, 253G4, 1201C1, 1205D1, 1210B2, 1383D2, 1383D6, 1390B1, 1390C1, 201B7, 409B2, 454E2, 606A1, 610B1, 648A1, 1231A3, and FfI-01s04 lines.
  • the induced pluripotent stem cells used in the production methods of the present invention may be cells derived from patients with a genetic disease (e.g., a patient with a genetic heart disease).
  • a genetic disease e.g., a patient with a genetic heart disease
  • Cells induced to differentiate from pluripotent stem cells derived from a patient with a genetic heart disease can serve as a disease model that reflects the pathology of the disease, and are therefore suitable for screening therapeutic or preventive drugs for the disease.
  • pluripotent stem cells derived from a patient with a genetic heart disease can be genetically repaired by genome editing using the CRISPR-Cas system or the like, and then differentiated into mature epicardial cells or cardiac organoids containing such cells, making it possible to use the cells or organoids as a therapeutic agent for the heart disease.
  • mGS cells are pluripotent stem cells derived from the testis and are the source of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into cells of various lineages. For example, when transplanted into mouse blastocysts, chimeric mice can be produced (Kanatsu-Shinohara M. et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al. (2004) Cell, 119:1001-1012). They are capable of self-renewal in culture media containing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), and germline stem cells can be obtained by repeated passage under culture conditions similar to those for ES cells (Takebayashi Masanori et al. (2008) Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Special Issue), pp. 41-46, Yodosha, Tokyo, Japan).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • mTORC2 inhibitors used in the present invention include small molecule compounds such as Torin1, Torin2, omipalisib (GSK2126458), KU-0063794, OSI-027, XL388, Palomid 529 (P529), WYE-354, torkinib (PP242), sapanisertib (TAK-228), WYE-687, AZD8055, and vistusertib (AZD2014), with Torin1 being preferred. Sapanisertib, WYE-687, AZD8055, and vistusertib may also be suitably used.
  • the medium contains an mTORC1 inhibitor, and the mTORC1 inhibitor may be the same as the mTORC2 inhibitor used in the present invention (when the mTORC2 inhibitor also has mTORC1 inhibitory activity) or may be a different mTORC1 inhibitor.
  • the term "compound” encompasses not only the free form but also its pharmacologically acceptable salts and hydrates.
  • pharmacologically acceptable salts vary depending on the type of compound, examples include inorganic base salts such as alkali metal salts (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salts (calcium salt, magnesium salt, etc.), aluminum salts, and ammonium salts; base addition salts such as organic base salts of trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, and N,N'-dibenzylethylenediamine; inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate, and phosphate; and organic acid salts such as citrate, oxalate, acetate, formate, propionate
  • proteins or peptides their origin is not particularly limited, but is preferably mammalian (e.g., human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, etc.). Furthermore, the proteins or peptides used in the production methods of the present invention include not only wild-type proteins or peptides, but also mutants thereof that have similar functions.
  • the gene can be said to be expressed or to be positive.
  • the production of mRNA encoded by the gene is not detected (i.e., below the detection limit) by the method (RT-qPCR) described in the Examples below, or if it is at background levels, the gene can be said to be not expressed or to be negative.
  • mTORC2 expression inhibitor when the mTORC2 expression inhibitor is a nucleic acid, such nucleic acid may be referred to as an "mTORC2 expression-inhibiting nucleic acid.”
  • a single mTORC2 expression inhibitor may be used, or multiple mTORC2 expression inhibitors may be used.
  • an mTORC2 expression inhibitor may be used in combination with another mTORC1 expression inhibitor.
  • the mTORC1 expression inhibitor may be a substance capable of inhibiting the expression of any of the proteins that make up mTORC1. Examples of such proteins include mTOR, raptor, and PRAS40.
  • the protein targeted by the mTORC2 expression-inhibiting nucleic acid When the protein targeted by the mTORC2 expression-inhibiting nucleic acid has multiple isoforms, it is typically capable of inhibiting the expression of a transcript encoding the full-length protein, but other isoforms may also be used as long as they are capable of inhibiting Akt phosphorylation.
  • the base sequence targeted by the mTORC2 expression-inhibiting nucleic acid can be appropriately designed, for example, based on information from a publicly known database (e.g., the NCBI database).
  • the length of the target sequence is not particularly limited as long as the expression-inhibiting nucleic acid can specifically recognize and bind to it, but is preferably 12 nucleotides or longer, more preferably 15 nucleotides or longer, and even more preferably 17 nucleotides or longer.
  • the upper limit of the length is also not particularly limited, but is, for example, 30 nucleotides or shorter, preferably 25 nucleotides or shorter, and more preferably 22 nucleotides or shorter.
  • complementary refers to a relationship in which nucleic acid bases can form so-called Watson-Crick base pairs (natural base pairs) or non-Watson-Crick base pairs (Hoogsteen base pairs, wobble base pairs, etc.) through hydrogen bonds. Therefore, “complementary sequence” is used to mean not only a sequence that is completely complementary to a target RNA sequence or target DNA sequence (i.e., hybridizes without mismatches), but also a sequence containing one to several (e.g., 2, 3, 4, 5 or more) mismatches, as long as it can hybridize with the target sequence under stringent conditions or under the physiological conditions of mammalian cells.
  • it includes a sequence that has 80% or more identity (e.g., 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more), and most preferably 100%, with a sequence that is completely complementary to a target RNA sequence or target DNA sequence.
  • siRNA is double-stranded RNA composed of RNA (i.e., the antisense strand) with a sequence complementary to the target RNA sequence and its complementary strand.
  • a preferred form of siRNA is small hairpin RNA (shRNA), which is single-stranded RNA in which a sequence complementary to the target RNA sequence (first sequence) is linked to its complementary sequence (second sequence) via a hairpin loop portion, and in which the first sequence forms a double-stranded structure with the second sequence by adopting a hairpin loop structure.
  • shRNA may be in the form of a nucleic acid (e.g., an expression vector, etc.) that encodes the shRNA.
  • each nucleic acid strand of the double-stranded nucleic acid is not particularly limited as long as it can exert an antisense effect, but is, for example, 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides, and more preferably 20 to 27 nucleotides.
  • miRNA refers to a single-stranded or double-stranded RNA (e.g., miRNA/miRNA * ) that does not cleave target RNA like siRNA, but rather recognizes the 3' untranslated region (UTR) of target RNA and controls translation.
  • miRNA refers to an endogenous non-coding RNA (ncRNA) of approximately 20 to 25 bases that is originally encoded on the genome.
  • ncRNA non-coding RNA
  • Pri-miRNA is expressed from the miRNA gene, followed by the generation of pre-miRNA, which then produces mature-miRNA. The mature-miRNA is then incorporated into RISC to produce single-stranded miRNA.
  • the miRNA used in the present invention may be in the form of pri-miRNA, pre-miRNA, mature-miRNA (miRNA/miRNA * ), or even single-stranded RNA.
  • the miRNA may be in the form of a nucleic acid (e.g., an expression vector) encoding the miRNA.
  • the length of the miRNA is not particularly limited as long as it can exert an antisense effect, but is, for example, 10 to 50 nucleotides in length, preferably 15 to 30 nucleotides in length, and more preferably 20 to 27 nucleotides in length.
  • the sense and antisense strands of the target RNA sequence can be synthesized using a commercially available automated DNA/RNA synthesizer (e.g., Applied Biosystems, Beckman, etc.), denatured in an appropriate annealing buffer at about 90°C to about 95°C for about 1 minute, and then annealed at about 30°C to about 70°C for about 1 to about 8 hours.
  • HDO can also be produced, for example, by the method described in WO2013/089283.
  • StemFit registered trademark
  • AK02 medium Alignomoto Co., Inc.
  • StemFit registered trademark
  • AK03 medium Alignomoto Co., Inc.
  • StemFit registered trademark
  • Basic03 medium CTS (registered trademark) KnockOut SR XenoFree Medium (Gibco)
  • mTeSR1 medium TeSR1 medium
  • Iscove's modified Dulbecco's medium GE Healthcare
  • Improved MEM Thermo Fisher Scientific
  • suspension culture refers to culture carried out under conditions that maintain cells or cell clumps suspended in the culture medium, i.e., culture under conditions that do not allow strong cell-substratum junctions to form between the cells or cell clumps and the culture vessel. Furthermore, when performing suspension culture, cells are typically in the form of cell clumps before and after suspension culture. As used herein, “adhesion culture” refers to culture under conditions that allow strong cell-substratum junctions to form between the cells and cultureware, etc.
  • the culture vessel used for suspension culture is not particularly limited as long as it is capable of "suspension culture,” and can be appropriately determined by one of ordinary skill in the art.
  • Examples of such culture vessels include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, microwell plates, micropores, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, Petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • Another example of a vessel for suspension culture is a bioreactor. These culture vessels are preferably non-cell-adhesive to enable suspension culture.
  • non-cell-adhesive culture vessels include those whose surfaces have not been artificially treated (e.g., coated with an extracellular matrix) to improve cell adhesion.
  • the well bottom shape of these culture vessels is not particularly limited, and examples include flat-bottomed, U-shaped, and V-shaped vessels.
  • Culture vessels used in adherent culture include those whose surfaces have been artificially treated to improve cell adhesion (e.g., coating with basement membrane preparations, extracellular matrices such as fibronectin, laminin or fragments thereof, entactin, collagen, gelatin, synthemax, vitronectin, etc., or polymers such as polylysine and polyornithine, or surface treatments such as positive charging).
  • basement membrane preparations include, for example, Matrigel and Geltrex.
  • laminin or a fragment thereof is also preferred.
  • laminin or a fragment thereof include laminin-111 or a fragment thereof containing the E8 region, laminin-211 or a fragment thereof containing the E8 region (e.g., iMatrix-211), laminin-121 or a fragment thereof containing the E8 region, laminin-221 or a fragment thereof containing the E8 region, laminin-332 or a fragment thereof containing the E8 region, laminin-3A11 or a fragment thereof containing the E8 region, laminin-411 or a fragment thereof containing the E8 region (e.g., iMatrix-411), and laminin-421.
  • laminin-511 or fragments thereof containing its E8 region laminin-511 or fragments thereof containing its E8 region (e.g., iMatrix-511, iMatrix-511 silk), laminin-521 or fragments thereof containing its E8 region, laminin-213 or fragments thereof containing its E8 region, laminin-423 or fragments thereof containing its E8 region, laminin-523 or fragments thereof containing its E8 region, laminin-212/222 or fragments thereof containing its E8 region, and laminin-522 or fragments thereof containing its E8 region.
  • laminin-511 or fragments thereof containing its E8 region e.g., iMatrix-511, iMatrix-511 silk
  • laminin-521 or fragments thereof containing its E8 region laminin-213 or fragments thereof containing its E8 region
  • laminin-423 or fragments thereof containing its E8 region laminin-523 or fragments thereof containing
  • cells may be cultured under feeder-free conditions and/or xeno-free conditions.
  • all steps may be performed under feeder-free and xeno-free conditions.
  • feeder-free refers to a medium or culture conditions that do not contain other cell types (i.e., feeder cells) that play a supporting role and are used to prepare the culture conditions for the cells to be cultured.
  • xeno-free refers to a medium or culture conditions that do not contain components derived from organisms other than the biological species of the cells to be cultured.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and the culture is carried out in an atmosphere of CO2- containing air, with the CO2 concentration preferably being about 2 to 5%.
  • the culture period for the steps of the production method of the present invention is not particularly limited, but is typically 1 to 20 days, preferably 3 to 15 days, and more preferably 5 to 10 days (particularly 7 days).
  • the present invention provides a method for maturing epicardial cells, comprising culturing epicardial cells in a medium containing an mTORC2 inhibitor.
  • a method for maturing epicardial cells comprising culturing epicardial cells in a medium containing an mTORC2 inhibitor.
  • Mature epicardial cells, cardiac organoids comprising said cells and their uses By the method of the present invention, mature epicardial cells or cardiac organoids such as cardiac tissue comprising said cells can be obtained.Therefore, in another aspect of the present invention, also provide the mature epicardial cells or cardiac organoids comprising said cells or cardiac tissue (hereinafter sometimes referred to as "epicardial cells of the present invention") obtained by the method of the present invention ("obtained” can be appropriately read as “obtained”).
  • a method for producing mature cardiomyocytes, or a method for maturing cardiomyocytes including this step is provided, which includes the step of co-culturing the epicardial cells of the present invention with cardiomyocytes.
  • the cardiomyocytes used in such a method are cardiomyocytes contained in cell aggregates (typically, embryoid bodies). These methods may also include the step of isolating mature cardiomyocytes using flow cytometry or the like.
  • cardiomyocytes obtained by the above-described method for producing mature cardiomyocytes may be referred to as "cardiomyocytes of the present invention.
  • Cardiomyocytes are broadly divided into immature (i.e., “fetal") cardiomyocytes and mature (i.e., "adult") cardiomyocytes; however, unless otherwise specified, “cardiomyocytes” refers to immature cardiomyocytes.
  • Cardiomyocytes are cells that make up the myocardium of animals, and as used herein, immature cardiomyocytes and mature cardiomyocytes refer to cells that repeatedly contract and relax (have pulsatile activity). Immature cardiomyocytes and mature cardiomyocytes typically express at least one cardiomyocyte marker selected from the group consisting of cardiac troponin T (cTNT), ⁇ MHC ( ⁇ myosin heavy chain, MYH6), and ⁇ MHC (MYH7). Immature cardiomyocytes refer to cells that express TNNI1.
  • cTNT cardiac troponin T
  • ⁇ MHC ⁇ myosin heavy chain
  • MYH7 ⁇ MHC
  • mature cardiomyocytes refer to cells that express TNNI3 and in which the expression level of TNNI1 has decreased or disappeared and the expression level of TNNI3 has increased compared to cardiomyocytes prior to the step of co-culturing with the epicardial cells of the present invention, and preferably cells that do not express TNNI1 but express TNNI3.
  • the cardiomyocytes used in the present invention can be obtained by known methods. Examples include methods of isolating cardiomyocytes from the heart using known techniques, methods of inducing differentiation of pluripotent stem cells, and methods of obtaining them from companies such as ATCC. Midgut cells can be isolated from the heart using, for example, methods that use flow cytometry or mass cytometry using a surface antigen (e.g., CD82) as an indicator, magnetic cell separation, or an affinity column on which the desired antigen is immobilized.
  • the epicardial cells used in the present invention are preferably obtained by methods of inducing differentiation of pluripotent stem cells.
  • Cell aggregates containing epicardial cells can also be induced to differentiate into epicardial cells by subjecting the cell aggregates containing mesodermal cells obtained in step (B) above to suspension culture in a medium containing epicardial cell-inducing factors.
  • This step can be performed, for example, by subjecting cell aggregates containing mesodermal cells to suspension culture in the presence of VEGF, IWP-3, Dorsomorphin, and SB431542.
  • the duration of this step can be determined appropriately by those skilled in the art, and is typically 6 to 25 days, with 10 to 20 days being more preferable. For all other culture methods, the descriptions of the production method of the present invention are incorporated by reference.
  • the period for co-culturing the epicardial cells of the present invention with cardiomyocytes is not particularly limited, but is typically 5 to 20 days, preferably 6 to 15 days, and more preferably 7 to 14 days (particularly 10 days).
  • the culture may be either suspension culture or adherent culture, with suspension culture being preferred.
  • the co-culturing method is not particularly limited, as long as the epicardial cells and cardiomyocytes are cultured in the same medium. For all other culture methods, the same description of the production method of the present invention is applicable.
  • a transplantation therapy agent (hereinafter sometimes referred to as the "transplantation therapy agent of the present invention") containing the epicardial cells and/or cardiomyocytes of the present invention is provided.
  • the present invention also encompasses a method for treating or preventing heart disease in which an effective amount of the epicardial cells and/or cardiomyocytes of the present invention is administered to or transplanted into a mammal (e.g., human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, etc.) that is the target of treatment or prevention.
  • a mammal e.g., human, mouse, rat, monkey, cow, horse, pig, dog, etc.
  • the term "drug for treating or preventing a disease also encompasses a pharmaceutical agent (or method) that can both treat and prevent the disease.
  • the transplantation therapy agent of the present invention can be administered or transplanted into the body of a subject in need thereof.
  • the cells or organoids to be transplanted should be administered in a therapeutically or prophylactically effective amount, which may vary depending on factors such as the age, weight, size of the transplant site, and severity of the disease of the transplant subject, and is not particularly limited.
  • the number of cells can be about 10 x 10 cells to 10 x 10 cells.
  • the epicardial cells and/or cardiomyocytes of the present invention are used as transplantation therapy agents, from the standpoint of avoiding rejection.
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to an extent that immune responses can be suppressed with immunosuppressants; for example, somatic cells with an HLA type that matches the three gene loci HLA-A, HLA-B, and HLA-DR, or four gene loci including HLA-C. If sufficient cells cannot be obtained due to age, constitution, or other reasons, they can be transplanted in a state that avoids rejection by embedding them in capsules or porous containers made of polyethylene glycol or silicone.
  • the epicardial cells and cardiomyocytes of the present invention are manufactured as parenteral preparations such as injections, suspensions, and infusions by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier according to conventional methods. Therefore, in one embodiment, there is also provided a method for manufacturing a transplant therapy agent, which includes the step of formulating the epicardial cells and/or cardiomyocytes of the present invention. Such a manufacturing method may also include the step of preparing the epicardial cells and/or cardiomyocytes of the present invention. It may also further include the step of preserving the epicardial cells and/or cardiomyocytes of the present invention.
  • compositions include aqueous solutions for injection, such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose or other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • aqueous solutions for injection such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose or other adjuvants (e.g., D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • the epicardial cells and cardiomyocytes of the present invention may be formulated with, for example, buffers (e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (e.g., human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants, etc.
  • buffers e.g., phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents e.g., benzal
  • the transplantation therapy agent of the present invention is provided in a frozen state stored under conditions typically used for cryopreserving cells, and can be thawed at the time of use.
  • it may further contain serum or a serum substitute, an organic solvent (e.g., DMSO), etc.
  • the concentration of serum or serum substitute is not particularly limited, but may be about 1 to about 30% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to about 50% (v/v), preferably about 5 to about 20% (v/v).
  • Test substances used in the present invention include, for example, cell extracts, cell culture supernatants, microbial fermentation products, extracts derived from marine organisms, plant extracts, purified or crude proteins, peptides, non-peptide compounds, synthetic low-molecular-weight compounds, and natural compounds.
  • test substances can also be obtained using any of the many approaches to combinatorial library methods known in the art, including (1) biological libraries, (2) synthetic library methods using deconvolution, (3) "one-bead one-compound” library methods, and (4) synthetic library methods using affinity chromatography selection. While the biological library method using affinity chromatography selection is limited to peptide libraries, the other four approaches can be applied to small molecule compound libraries of peptides, non-peptide oligomers, or compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145-67). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13; Erb et al.
  • Compound libraries can be stored in solution (see Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-21) or on beads (Lam (1991) Nature 354:82-4), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-6), bacteria (U.S. Patent No. 5,223,409), spores (U.S. Patent Nos. 5,571,698, 5,403,484, and 5,223,409), plasmids (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Ac. ad. Sci. USA 89:1865-9) or as phages (Scott and Smith (1990) Science 249:386-90; Devlin (1990) Science 249:404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-10; U.S. Patent Application No. 2002103360).
  • Cell lines and culture conditions 201B a hiPSC cell line reprogrammed using Yamanaka factors via retroviral methods, was propagated in ReproCell ES solution containing 4 ng/ml bFGF, supported by an irradiated MEF feeder layer. CTK was administered to the cells to remove the feeder layer.
  • the feeder-free 1390C1 and T1/T3 reporter (PMID: 34155205) cell lines were maintained in complete StemFit® AK02N solution on dishes coated with iMatrix-511 (obtained from Matrixome).
  • the MEC1 mouse epicardial cell line (Merck, SCC187) was obtained and grown according to the manufacturer's guidelines. Routine testing for mycoplasma was performed to ensure the absence of contamination.
  • siRNA solution was prepared with 50 ⁇ l of Opt-MEM, followed by 10 ⁇ l of RNAiMax to create a silencing mixture. After allowing to stand at room temperature for 10 minutes, the mixture was slowly added to a 6-well plate containing approximately 20,000–30,000 cells in 2 ml of maintenance medium, which had been set aside the previous day. The medium was refreshed one day later, and cells were cultured according to standard protocols. For immunocytochemistry tests, 260 ⁇ l of the silencing mixture was slowly added to a 12-well plate containing approximately 5,000 cells seeded the previous day in 1 ml of maintenance medium.
  • Feeder-independent hiPSCs (1390C1) were cultured on iMatrix-511 (Nippi)-coated dishes using StemFit® AK02N medium (Reprocell).
  • the process for generating human cardiac organoids from PSCs followed established protocols. Briefly, cells were suspended in Essential 8 Flex medium (Gibco) containing 10 ⁇ M of the ROCK inhibitor Y-27632 using Accumax. To generate embryoid bodies (EBs), 10,000 cells were dispersed into hemispherical, low-attachment HEMA-coated 96-well plates on day -2 in a total volume of 100 ⁇ l per well. Fresh Essential 8 Flex medium was added the following day.
  • hiPSCs were differentiated as previously reported (PMID: 35110584).
  • hiPSCs were converted into a single-cell mixture using Accutase. These cells were transferred to HEMA-coated plates designed for low attachment (ranging from 6,000 to 8,000 cells per 96-well plate) to form embryoid bodies (EBs).
  • the differentiation solution contained fully enriched StemPro®-34 medium, further enriched with components such as 50 ⁇ g/ml ascorbic acid, 2 mM L-glutamine, 0.4 ⁇ M monothioglycerol, and 150 mg/ml transferrin.
  • Differentiation was initiated by adding 0.5% Matrigel, 10 ⁇ M Y-27632, and 2 ng/ml human recombinant (hr) BMP4 to the medium. After the first 24 hours, EBs were immersed in a differentiation solution containing 10 ng/ml hrBMP4, 2 ng/ml activin A, and 5 ng/ml hrbFGF. After 84 hours, EBs were collected, disaggregated using Accutase, and replated (at a density of 0.3 x 10 cells/ cm ) onto 0.1% gelatin-coated plates.
  • This new environment contained differentiation medium containing 3 mM CHIR99021, 30 ng/ml hrBMP4, 5 ng/ml hrVEGF, and 10 ⁇ M SB431542.
  • a maintenance solution essentially DMEM supplemented with 10% FBS and 10 ⁇ M SB431542.
  • Ventricular cardiomyocytes were differentiated as follows: hiPSCs were dissociated into individual cells using a half-concentrated solution of TrypLE select (Thermo Fisher Scientific) mixed with 0.5 mM EDTA. These cells were then added to 1.5 ml/well of StemPro-34 medium (Invitrogen). This medium contains additional components, such as L-glutamine, MTG, ascorbic acid (AA), transferrin, ROCK inhibitor (Y-27632), Matrigel (Corning), and BMP4, at a concentration of 2 x 10 cells/well for embryoid body (EB) generation.
  • TrypLE select TrypLE select
  • AA ascorbic acid
  • ROCK inhibitor Y-27632
  • Matrigel Matrigel
  • BMP4 BMP4
  • E12, E14, and E18 embryos were collected in preheated PBS and carefully removed surrounding foreign material using tweezers. The embryo's head was separated, and the anterior thoracic cavity was torn open to access the heart. The fetal heart was then mechanically isolated and placed in a separate dish filled with preheated PBS. To prepare cardiac protein lysates, the hearts were first minced and then exposed to trypsin at 37°C for 20 minutes. The cell mixture was again vortexed and treated at 37°C for another 20 minutes. After centrifugation at 300g for 5 minutes, the clear liquid (supernatant) was collected.
  • Torin1 Cytotoxicity assay in hiPSC epicardial cells
  • Torin1 was freshly prepared in DMSO.
  • Human iPSC-derived epicardial cells were individually plated in 96-well plates at a density of 5,000 cells per well.
  • concentrations of Torin1 were administered to rapidly dividing cells at a consistent 1:3 ratio.
  • cell viability was measured using crystal violet.
  • absorbance at 595 nm was recorded using a microplate reader. Based on these results, IC50 values were calculated using GraphPad Prism 7 software.
  • iPSC-derived human cardiac organoids hHO
  • Torin1 was freshly mixed with DMSO.
  • Cardiac organoids (hHO) were differentiated and individually plated into 96-well low-attachment plates. Treatment effects were assessed after administering decreasing concentrations of Torin1 at a fixed 1:3 ratio to organoids at day 15 of growth. Each treatment included a decreasing dose of Torin1 as monotherapy. After 4 days (or 96 hours), the organoids' proliferation capacity was assessed using an MTT assay. Cytotoxicity levels were assessed by measuring absorbance at 595 nm using a dedicated microplate reader, and IC50 values were then calculated using GraphPad Prism 7 software.
  • ICC Immunocytochemistry
  • Flow cytometry analysis/FACS> Cells were dissociated into individual cells using Accutase, washed twice, and fixed in 4% PFA for 15 minutes. To identify quiescent cells in G0 , Hoechst 33342 and Pyronin Y staining were employed, as previously described. Analysis was performed using BD FACSDiva v6 or v8 and FlowJo v10. Cell populations were recognized by FSC/SSC gating, and doublets were excluded. A negative gate was set using unstained samples or isotype controls to ensure the absence of signal from negatives in the positive gate.
  • the primary antibodies used in the examples were anti-phospho-S6 ribosomal protein antibody (5364, CST), anti-phospho-4E-BP1 antibody (2855, CST), anti-4E-BP1 antibody (9644, CST), anti-phospho-AKT antibody (9271, CST), anti- ⁇ -actin antibody (A5441, Sigma), anti-WT1 antibody (ab89901), anti-cTnI TNNI3 antibody (ab10231), anti-SNAI1 antibody (ab63371), anti-NBL1 antibody (ab174843), anti-p53 antibody (12790S, D963E, CST), anti-p16 antibody (12D1, CST), anti-p21 antibody (D7C1M, CST), anti-TBX18 antibody (ab15262), and anti-KI67 antibody (Biolegend;
  • the secondary antibodies used were goat anti-rabbit IgG antibody with HRP (sc-2054, Santa Cruz) and anti-mouse IgG antibody with HRP (7076,
  • Example 1 Validation of the Relationship between Reduced Activity of the mTOR Signaling Pathway and Physiological Cardiac Maturation
  • mTOR mechanistic target of rapamycin
  • IGF-1 insulin-like growth factor 1 pathway
  • IGF-1 promotes activation of the mTOR pathway, which promotes cell proliferation, inhibits cell apoptosis during development and regeneration, and regulates overall cellularity within tissues.
  • mTOR maintains tissue integrity and function, and reduced mTOR signaling may be involved in the fundamental trigger for initiating functional maturation of tissues during adulthood.
  • mTORC1 primarily regulates protein synthesis, cell proliferation, and autophagy through the ribosomal protein S6 kinase (S6k) and eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E)-binding protein 1 (4E-BP1) (Liu, G. Y. & Sabatini, D. M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 183-203 (2020)).
  • S6k ribosomal protein S6 kinase
  • eIF4E eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1
  • 4E-BP1 eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1
  • mTORC2 is primarily involved in cell survival and cytoskeletal organization through phosphorylation of complex 1-associated protein kinase B (also known as Akt) ( Figure 1b) (Sen, B. et al. J. Bone Miner. Res. (2014)).
  • Example 2 Effect of Chemical Inhibition of mTOR During Embryonic Development on In Vivo Epicardial Maturation.
  • mTORKi an mTOR kinase inhibitor that can block a wide range of cellular activities controlled by mTOR.
  • Torin1 interacts with the ATP-binding pocket of both mTOR complexes (Liu, Q. et al. J. Med. Chem. 53, 7146-7155 (2010)), and therefore can inhibit the function of mTORC1 and mTORC2.
  • Example 3 Examination of the effects of dual mTORC1/2 inhibition on epicardial quiescence and maturation in hiPSC-derived epicardium To fully understand the contribution of cell quiescence in human fetal epicardial maturation, we used epicardium derived from human induced pluripotent stem cells and manipulated them to systematically study the effects of cell cycle withdrawal via complete inhibition of the mTOR pathway.
  • EPI epicardial-like cells from hiPSCs
  • Non-Patent Document 5 Cardiac mesoderm was formed using activin A and BMP4 (days 1–3/4), and epicardial fate was subsequently determined by activating WNT signaling (days 3/4–6).
  • WNT WNT signaling
  • TGF- ⁇ signaling SB431542
  • Torin1 treatment (Fig. 5a) significantly reduced the phosphorylation levels of both S6K and Akt (Fig. 5b). This highlights its effect on both mTORC1 (S6K) and mTORC2 (Akt) while preserving epicardial structure (Fig. 5c). Torin1-treated cells rapidly arrested cell proliferation (Fig. 5d). Growth arrest is a key phenotype of the adult human epicardium, a finding similar to that observed in mouse counterparts.
  • Torin1 treatment effectively reduced nuclear WT1 and TBX18 levels and preserved tight junctions, as indicated by ZO-1 expression, while maintaining epicardial morphology (Fig. 5e).
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -gal
  • Torin1-treated epicardium significantly reduced ⁇ -gal + cells (Fig. 5h, Fig. 8a, b), suggesting that dual inhibition of mTORC1 and mTORC2 can shift epicardium away from the senescent phenotype, as confirmed by reduced expression of SASP-related genes IL-8 and SPP1 (Fig. 8c).
  • Torin1 To investigate the transcriptional impact of Torin1 on iPSC-derived epicardium, we performed detailed RNA-sequencing analysis of cells treated with Torin1 (Lucena-Cacace, A. & Yoshida, Y. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 2320, 219-232 (2021)). Consistent with previous observations regarding mTOR inhibition in mouse epicardium, Torin1 significantly altered the transcriptome landscape of hiPSC-derived epicardium, with principal component 1 (PC1) accounting for 99.5% of the PCA variance (Fig. 10a). Analysis identified 379 differentially expressed genes specifically attributed to Torin1 treatment (Fig. 10b).
  • PC1 principal component 1
  • TJP1 the gene responsible for ZO-1 protein
  • WT1, TBX18, and ALDH1A2 fetal epicardial genes
  • ALDH1A2 fetal epicardial genes
  • This downregulation occurred concomitantly with a marked decrease in MKI67 mRNA levels, consistent with protein analysis.
  • genes driving epithelial-mesenchymal transition showed significant downregulation (Fig. 10d), as did CDH18, a cadherin associated with epicardial development (Fig. 10d). Elevated transcription of RB1 and HES1 reconfirmed the quiescent transcriptome signature (Sang, L., Coller, H. A. & Roberts, J. M.
  • mTOR functions as the central kinase in two unique multiprotein complexes, mTORC1 and mTORC2. These complexes differ in their component proteins and sensitivity to the drug rapamycin. Specifically, mTORC1 incorporates raptor as a primary subunit, whereas rictor is essential for mTORC2. mTORC1 activity is rapidly suppressed by rapamycin, whereas mTORC2 activity is largely unaffected during short-term rapamycin exposure.
  • Tacrolimus commonly known as FK506 (Dumont, F. J. Curr. Med. Chem. 7, 731-748 (2000)), is primarily used as an immunosuppressant for solid organ transplantation (Wallemacq, P. E. & Reding, R. Clin. Chem. 39, 2219-2228 (1993)). Its primary mechanism of action is calcineurin inhibition, but it is noteworthy that both tacrolimus and rapamycin bind to FKBP12 and can affect the epicardial maturation phenotype. However, tacrolimus treatment also failed to reduce epicardial proliferation (Figure 11a), suggesting that inhibition of calcineurin or mTORC1 alone is insufficient to promote epicardial maturation of hiPSC-derived epicardial cells.
  • Example 5 Validation of the paracrine effect of epicardium derived from mature hiPSCs expressing IGF2 and FN1.
  • IGF2/IGF1R signaling plays a crucial role in human cardiogenesis.
  • the interaction between epicardial IGF2 and myocyte IGF1R has been identified as a key catalyst for myocardial compaction (Meier, A. B. et al. Nat. Biotechnol. 1-14 (2023)).
  • epicardial fibronectin (FN1) secretion as a driver of accelerated cardiac maturation in 3D engineered tissues (Ong, L. P. et al. Stem Cell Rep. 18, 936-951 (2023)).
  • mRNA expression analysis demonstrated that when EBs were co-cultured with mature epicardial cells, they showed enhanced expression of genes important for left ventricular compression, such as TBX5 (Ross, S. B. et al. Hum. Genome Var. 7, 1-8 (2020)), HEY2 (Miao, L. et al. Sci. Rep. 8, 2678 (2016)), PRDM16 (Wu, T. et al. Circulation 145, 586-602 (2022)), and NPPA (Tian, X. et al. Nat. Commun. 8, 87 (2017)) ( Figure 13e). Together, these findings confirm that mTOR inhibition can promote cardiac maturation in a cell-autonomous manner and exogenously via paracrine IGF2 and FN1 mediated by the maturing epicardium.
  • Example 6 Generation of Mature iPSC-Derived Cardiac Organoids with Quiescent Epicardium To evaluate the efficacy of mTOR inhibition in a context that more closely reflects cardiac development, we generated self-organizing human cardiac organoids (hHOs) from human iPS cell lines (Lewis-Israeli, Y. R. et al. Nat. Commun. 12, 5142 (2021); Tian, Y. et al. Front. Cell Dev. Biol. 10, 1001453 (2022)). We aimed to examine the effects of Torin1 treatment on epicardial and myocardial maturation in these human cardiac organoids.
  • hHOs human cardiac organoids
  • Immunocytochemistry identified various cell populations.
  • the TNNT2 + population corresponds to beating cardiomyocytes
  • WT1 + cells represent human epicardial
  • CD31 + cells represent endothelial
  • NFATC1 + represent endocardial cells
  • VIM + highlights cardiac fibroblast populations. Consistent with previous findings, we noted minimal differences in cell composition between different differentiation batches. Subsequently, we used the MTT assay to characterize the cardiac cytotoxicity profile associated with various Torin1 doses over a 96-hour in vitro period. Human cardiac-derived organoids exhibited resistance to Torin1 comparable to monolayer human epicardial cells, exhibiting an IC50 value of 2.51 ⁇ M ( Figure 14b).
  • the present invention provides a novel method for producing mature epicardial cells from immature epicardial cells.
  • the epicardial cells produced by this method are similar to adult epicardial cells and can be used in adult-level two-dimensional and three-dimensional cardiac cell models, drug discovery screening, regenerative medicine, and more. Furthermore, because they may also have the effect of promoting the maturation of cardiomyocytes, they can also be used in methods for maturation of cardiomyocytes.

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Abstract

本発明は、心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、成熟した心外膜細胞を製造する方法を提供する。

Description

成熟心外膜細胞の製造方法
　本発明は成熟した心外膜細胞の製造方法に関する。より詳細には心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、成熟した心外膜細胞を製造する方法、および該方法により得られた心外膜細胞の用途などに関する。
　ヒトの心外膜は心臓の最外層であり、心臓の発生と再生において重要な役割を果たしている。心外膜細胞は心臓を形成する心臓線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞など様々な細胞のソースとなり、心臓の臓器形成に重要な働きをしている。また、心外膜細胞由来のこれらの細胞は心臓における恒常性の維持および臓器障害時の反応の制御などにおいて重要な役割を果たしている。これらのことから、心外膜細胞と、心外膜細胞から誘導される細胞は心疾患の病態モデル研究等において重要な細胞群である。また、マウスを使った最近の研究では、胎児の発生中、および出生後の最初の数日間は、心外膜細胞は心筋損傷後に再生する能力を有することが示されている（非特許文献１）。しかし、この時間枠を超えると、心外膜は静止状態になり、組織が機能的に成熟する過程で心外膜細胞は再生能力を失う（非特許文献２）。そして、非増殖性であるにもかかわらず、静止心外膜細胞は代謝的および転写的には活性を維持している（非特許文献３）。
　ヒト人工多能性幹細胞から心外膜細胞を作製する方法はこれまでに複数報告されているが（例えば、非特許文献４、非特許文献５)、これらの細胞は胎児型の心外膜細胞であり、胎児型心外膜細胞のマーカーであるWT1、TBX18を発現し、増殖活性や上皮間葉転換(EMT)の活性を有している。心疾患研究のためには成人型の（成熟した）心外膜細胞を作製する必要があるが、これまで心外膜細胞を作製する方法は確立されていなかった。
Cai, W. et al. Cell Rep. 28, 190-201.e3 (2019) Cao, Y., Duca, S. & Cao, J. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 12, a037192 (2020) Hesse, J. et al. eLife 10, e65921 (2021) Witty, A. D. et al. Nat. Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014) Junghof, J. et al. Npj Regen. Med. 7, 1-14 (2022)
　したがって、本発明は、成熟した心外膜細胞を製造する方法、および該方法により製造される心外膜細胞などを提供することを課題とする。
　本発明者らは、成人期の心外膜静止と再生能力の喪失を調節する分子機構を特定するために研究する中で、心外膜細胞の静止を誘導することにより、再生能力を喪失した、成人型の（成熟した）心外膜細胞を製造することではないかとの着想を得た。そして、心外膜細胞の静止を誘導する方法の１つとして、mTOR(mechanistic target of rapamycin)シグナル伝達経路に着目した。mTORシグナル伝達経路は、栄養素の利用可能性、成長因子、その他の環境の合図の変化を感知して応答することにより、成熟組織における細胞の静止を制御する上で重要な役割を果たす（例えば、Liu, G. Y. & Sabatini, D. M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 183-203 (2020)）。しかし、mTORシグナル伝達がヒトの心外膜の発達をどの程度調節しているかは、ほとんど解明されていなかった。
　鋭意研究の結果、本発明者らは、mTOR阻害剤であるTorin1で心外膜細胞を処理することとした。その結果、WT1、TBX18陰性の成人型心外膜細胞をヒトiPS細胞から作製することに初めて成功した。しかも意外なことに、mTORC1キナーゼ阻害剤であるラパマイシンを使用した場合では、心外膜細胞におけるWT1レベルを低下させることができなかった。そのため、心外膜細胞の成熟は、mTORシグナル伝達経路の中でもmTORC2に依存する機構に依存しているとの結論に至った。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下のとおりのものである。
［１］　心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、成熟した心外膜細胞を製造する方法。
［２］　培地がmTORC1阻害剤を含む、［１］に記載の方法。
［３－１］　mTORC2阻害剤の少なくとも１つがTorin1、サパニセルチブ、WYE-687、AZD8055およびビスツセルチブからなる群から選択される、［１］または［２］に記載の方法。
［３－２］　mTORC2阻害剤の少なくとも１つがTorin1である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］　成熟した心外膜細胞がWT1および／またはTBX18を発現しない細胞である、［１］～［３－２］のいずれか１つに記載の方法。
［５－１］　心外膜細胞が多能性幹細胞に由来する、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［５－２］　心外膜細胞がヒトに由来する、［１］～［５－１］のいずれか１つに記載の方法。
［６］　心外膜細胞が心臓オルガノイドに含まれるものである、［１］～［５－２］のいずれか１つに記載の方法。
［７］　［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法で得られる成熟した心外膜細胞または該細胞を含む心臓オルガノイド。
［８］　［７］に記載の成熟した心外膜細胞または心臓オルガノイドを含む、移植療法剤。
［９］　［７］に記載の成熟した心外膜細胞または心臓オルガノイドと、心筋細胞とを共培養する工程を含む、成熟した心筋細胞の製造方法。
［１０－１］　心筋細胞が細胞凝集体に含まれるものである、［９］に記載の方法。
［１０－２］　［９］または［１０－１］に記載の方法で得られる成熟した心筋細胞または該細胞を含む細胞凝集体。
［１１］　心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、心外膜細胞の成熟方法。
［１２］　［７］に記載の成熟した心外膜細胞または心臓オルガノイドと、心筋細胞とを共培養する工程を含む、心筋細胞の成熟方法。
［１３］　［７］に記載の成熟した心外膜細胞もしくは心臓オルガノイドおよび／または［１０－２］に記載の心筋細胞もしくは細胞凝集体の有効量を、哺乳動物に投与または移植する、心疾患の治療または予防方法。
［１４］　心疾患の治療または予防における使用のための、［７］に記載の成熟した心外膜細胞もしくは心臓オルガノイドおよび／または［１０－２］に記載の心筋細胞もしくは細胞凝集体。
［１５］　心疾患の治療または予防薬の製造における［７］に記載の成熟した心外膜細胞もしくは心臓オルガノイドおよび／または［１０－２］に記載の心筋細胞もしくは細胞凝集体の使用。
　本発明によれば、未熟な心外膜細胞から、成熟した心外膜細胞を製造することができる新規な方法が提供される。また、この成熟した心外膜細胞を用いて、成熟した心筋細胞を製造することも可能となる。
心外膜形成中のmTORシグナル伝達のダイナミクス。(a)発生時のmTORシグナル伝達スイッチの多段階の不活性化を示す、さまざまな発生段階におけるマウス胎仔心臓のバルクサンプルのデータセットであるGSE51483のレトロスペクティブ分析。(b)ホスホ（リン酸化）-Aktを調整する複合体1および2の下流シグナル伝達を強調する、発生中の心臓におけるmTORシグナル伝達ネットワークの概略図。(c)発生中のmTORの標的の特徴づけのためのマウス心臓のウェスタンブロット分析［pAkt、pS6k、p4E-BP1、p27；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。（d）心臓の発生および成熟時の細胞周期ダイナミクスの評価のためのデータセットであるGSE51483のレトロスペクティブ分析。（e）E12における左心房の心外膜のZO-1およびWT1発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット： 100 μm］。（f）E12およびE14における左心室心外膜のZO-1およびWT1発現の免疫細胞化学分析。（g）E12由来の心外膜増殖の位相差写真。（h）心外膜形成中のWt1、Tbx18、Cdh18、およびNbl1遺伝子の（E12に対する）mRNAの相対発現［n=3; t 検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］。（i）経時的なmTOR標的抑制の特徴づけのための心外膜外植片のウェスタンブロット分析［pAkt、pS6k、p4E-BP1、WT1；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される]。 MECにおけるTorin1の効果。（a）固定した1:3の比率で漸減濃度のTorin1で96時間処理した後のMEC1における細胞生存率およびIC50を示すMTTアッセイ。（b）対照と、未処理細胞と、Torin1処理MEC1細胞との間のトランスクリプトームの差異を示すPCA分析。（c）心外膜の成熟、mTOR経路、増殖およびEMTプログラムに関連する遺伝子についてのRNA-seqデータから得られる相対mRNA発現分析（Wt1、Sema3d、Scx、Gata4、Rptor、Rictor、E2f1、Ccnb1、Cdk4、Cdk6、Mki67、Snai1、Cdh2、Cdh1）。（d）未処理および50 nM Torin1および5 ng/mL TGF-βで48時間処理したMEC1細胞の位相差写真。（e）EMTの開始を評価するためのカドヘリン1/2スイッチのmRNA発現分析［n=3、t検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］。 マウス心外膜の成熟におけるTorin1効果の特徴づけ。（a）免疫細胞化学を使用して、異所性成熟を誘導するために200 nM Torin1で24時間処理した後のE12心臓組織におけるWT1発現を分析した。（b）Torin1処理時のmTORの標的抑制と心臓成熟の特徴づけのためのE12およびE14の心外膜外植片のウェスタンブロット分析［cTnI（TNNI3）、pS6k、pAkt、SNAI1、WT1；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。（c）Torin1処理時のmTORの標的抑制および心外膜成熟の特徴づけのためのE12の心外膜外植片のウェスタンブロット分析［pAkt、pS6k、TNNI1、NBL1、WT1；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。（d）位相差イメージングを使用して、マウス心外膜の心外膜成長に対するTorin1の効果を特徴づけた。この心外膜は、自発的な分化を防ぐために、10 μMのALK5/TGF-β阻害剤であるSB431542でも処理した。（e）Torin1で処理した、および未処理のE12由来マウス心外膜外植片のPCA［黒丸：コントロール、n=2；灰色丸：Torin1、n=2］。（f）Torin1処理時に上方制御された遺伝子、および下方制御された遺伝子898個を強調表示する、差次的に富化された遺伝子プロット(DEプロット)。（g）mTOR阻害剤であるTorin1で異所的に成熟したE12外植片における統計的に有意な生物学的プロセスのPANTHERベースの解析。（h）mTOR阻害剤であるTorin1で異所的に成熟したE12外植片における統計的に有意な損なわれた経路（compromised pathway）のPANTHERベースの解析。（i）増殖に関連する遺伝子（MKi67）およびマウス胎仔心外膜のプログラムに関連する遺伝子（Wt1、Tbx18、Raldh1a2、Hand2、Gata4)についてのmRNA発現解析（黒色の棒グラフ：コントロール、灰色の棒グラフ：Torin1)。（j）心臓成熟に関連する遺伝子についてのmRNA発現解析（Tnni3、Myh6）（黒色の棒グラフ：コントロール、灰色の棒グラフ：Torin1)。（k）心外膜静止に関連する遺伝子（Hes1、Rb1)についてのmRNA発現解析（黒色の棒グラフ：コントロール、灰色の棒グラフ：Torin1)。 ヒトiPSCから心外膜への分化。（a）ヒトiPSCから心外膜への分化ダイアグラムの概略図。（b）hiPSC株409B2（左）と分化24日目のEPI細胞（右）を示す位相差顕微鏡写真。（c）心外膜分化の12日目と比較した誘導中のWT1、TBX18およびALDH1A2のqRT-PCR分析［12日目 n=3、24日目 n=3；* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］。（d）WT1タンパク質発現についてのフローサイトメトリー由来のヒストグラム。（e）24日目でZO1およびWT1の発現増加を示すhiPSC由来の心外膜細胞の免疫細胞化学分析（6日目から、図4d)。 mTOR阻害による成熟したhiPSC由来の心外膜単層の作製。（a）hiPSC由来の心外膜単層におけるTorin1の効果をモニタリングするためのワークフローの概略図。（b）mTOR標的阻害および静止関連マーカーの評価のためのTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞のウェスタンブロット分析［pAkt、pS6k、p53、p16、p21；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される]。（c）Torin1で処理された、敷石（cobblestone）形態が保持された31日目のhiPSC由来の心外膜を表示する位相差顕微鏡写真［スケールバー100 μm］。（d）Torin1で処理した心外膜の7日間の成長曲線（Torin1、灰色丸)［n=3; ** p=0.0038、**** p<0.0001］。（e）WT1、TBX18、およびZO-1の発現についてのTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット： 100 μm］。（f）Ki67の発現についてのTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞の免疫細胞化学分析（左）およびそれぞれの定量化（右）［スケールバー： 500μm；インセット：100 μm]。（g）ホスホ-ヒストン3（pH3）の発現についてのTorin1で処理したhiPSC心外膜細胞の免疫細胞化学分析（左）およびそれぞれの定量化（右）［n=3、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm］。（h）成熟したhiPSC由来の心外膜における老化細胞を示すβ-ガラクトシダーゼアッセイ(濃い灰色）(左)およびパーセンテージでのそれぞれの定量化（%、右)。（i）Torin1処理後のhiPSC由来の心外膜における静止関連遺伝子（TP53、CDKN2A、HES1、RB1）および増殖関連遺伝子（MKI67、CCNA1、CCNB1、E2F1）についての相対的なmRNA発現解析（灰色の棒グラフ：Torin1)。（j）G0の細胞を識別するためのピロリンYおよびHoechst 33342染色に基づくFACS分析。（k）Torin1処理後の静止状態のhiPSC由来の心外膜細胞の定量化および統計分析(灰色の棒グラフ：Torin1)［n=3、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］。 hiPSC由来の心外膜に対するTorin1の有効性と用量の調整。（a）固定した1:3の比率で漸減濃度のTorin1で96時間処理した後のhiPSC由来の心外膜における細胞生存率およびIC50を示すMTTアッセイ。（b）2000 nMから、WT1タンパク質レベルを減少させる目標最適濃度まで濃度を減少させたTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜のウェスタンブロット分析［WT1、p21タンパク質；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される]。（c）新鮮なTorin1で培地を交換するための最適な時間枠において、mTORシグナル伝達の阻害におけるTorin1の効果を標的とする、2日間の時間モニタリングにおける200 nM Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜のウェスタンブロット分析［pS6k、pAkt、p4E-BP1、p21タンパク質；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。（d）WT1およびTBX18のタンパク質の減少とNBL1の獲得に関して定義される、心外膜成熟の誘導におけるTorin1の最大効果を標的とする、10日間の時間モニタリングにおける200 nM Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜のウェスタンブロット分析［WT1、TBX18、NBL1；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。 成熟したhiPSC由来の心外膜における自発的なEMT発生の喪失。（a）SNAI1の発現についての200 nM Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm; インセット：100 μm］。 Torin1で処理した心外膜細胞における細胞老化とSASPの特徴づけ。（a）老化細胞を検出するためのさまざまな濃度のTorin1で処理した心外膜の位相差画像。（b）成熟したhiPSC由来の心外膜におけるβ-ガラクトシダーゼアッセイの、パーセンテージ(%)での定量化［n=3、t 検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］。（c）成熟したhiPSC由来の心外膜における、SASP遺伝子であるCXCL8（IL-8）およびSPP1の相対的なmRNA発現解析［n=3、t検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005］。 GiWiGiプロトコルを用いたhiPSC由来の細胞におけるmTOR阻害の効果の特徴づけ。（a）フィーダーフリーのiPS細胞株である1390C1からGiWiGiプロトコルに従って分化させたd16のhiPSC由来心外膜細胞の位相差画像。（b）7日間200 nM Torin1で処理した時のmTOR標的の阻害および心外膜の成熟の程度を特徴づけるための、200 nM Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜のウェスタンブロット分析［WT1、p21、p16、p53、p4E-BP1；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される]。 Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜の全RNAトランスクリプトーム解析。（a）Torin1で処理した、および未処理のd31のhiPSC由来の心外膜単層のPCA［黒丸：コントロール、n=3；灰色丸：Torin1、n=3］。（b）Torin1処理時に上方制御された遺伝子、および下方制御された遺伝子を強調表示する、差次的に富化された遺伝子プロット（DEプロット）。（c）増殖に関連する遺伝子（MKI67）および胎児心外膜プログラムに関連する遺伝子（WT1、TBX18、ALDH1A2、HAND2）についてのmRNA発現解析（黒色の棒グラフ：コントロール、灰色の棒グラフ：Torin1)（n=3、t検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005)。（d）EMT関連遺伝子（SNAI1、SNAI2）についてのmRNA発現解析（黒色の棒グラフ：コントロール、灰色の棒グラフ：Torin1)（n=3、t検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005)。（e、f）ヒト成人心外膜の初代組織と比較して、Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜において富化された心外膜静止状態の活性化に必要な、上方制御された遺伝子、および下方制御された遺伝子サインを示すヒートマップ(GSE84085)。 ヒト心臓オルガノイドの成熟におけるTorin1および他のラパログの特徴づけ。（a）Torin1、タクロリムスおよびラパマイシンに対するhiPSC由来の心外膜におけるMKI67のRNA-Seqデータ（図12a）からのmRNA発現レベル。（b）Torin1（200 nM）、タクロリムス（1 μM）、またはラパマイシン（200 nM）で処理したヒト心臓オルガノイド（hHO）における、WT1およびTNNI3の発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm］。（c）Torin1（200 nM）、タクロリムス（1 μM）、またはラパマイシン（200 nM）で処理したhHOにおけるSNAI1およびZO-1発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm］。 心外膜成熟におけるmTORC2による影響の特徴づけ。（a）Torin1、タクロリムスおよびラパマイシンで処理した、ならびに未処理のd31のhiPSC由来心外膜単層のPCA［黒丸：コントロール、n=2；灰色丸：Torin1、n=2、濃灰色丸：ラパマイシン、n=2、淡灰色丸：タクロリムス、n=1］。（b）成人心外膜の初代組織においても発現するmTORC2依存性エレメントの標的スクリーニングおよび同定のためのベン図。Venn1（左上）は、ラパマイシンと共通した、またはラパマイシンに固有のものを除いた、Torin1からの転写因子（TF）を示す。Venn2（左下）は、胎児の心外膜および成人の心外膜の両方において統計的に有意な遺伝子を除外した後の差次的発現遺伝子（DEG）からのTFを示す。Venn3（右）は、（Venn1からの）Torin1-TFと、Venn1およびVenn2の両方で同定された共通のTFとの間の共有要素をフィルターで除外する。（c）hiPSC由来の心外膜単層において、Torin1処理時に最も上方制御された上位5位の転写因子（TF）の相対的なmRNA。（d）YBX3およびMAFFに対するsiRNAのトランスフェクションのためのワークフローの概略図。（e）YBX3に対するsiRNA（siYBX3：灰色の棒グラフ）、およびMAFFに対するsiRNA（siMAFF：濃灰色の棒グラフ）を過剰発現する、Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜単層における、YBX3、MAFF、WT1、TBX18、TCF21、および MKI67遺伝子についてのmRNA発現解析［n=3、t検定、* p<0.05、** p<0.005、*** p< 0.0005]。（f）WT1およびZO-1の発現についてのsiYBX3およびTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm]。（g）胎児プログラムを特徴とするタンパク質の特徴づけのための、YBX3に対するsiRNAおよびMAFFに対するsiRNAを個別に過剰発現するTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞のウェスタンブロット分析［WT1、TBX18；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。（h）細胞増殖を特徴とするタンパク質の特徴づけのための、YBX3に対するsiRNAおよびMAFFに対するsiRNAを個別に過剰発現するTorin1で処理したhiPSC由来の心外膜細胞のウェスタンブロット分析［KI67；β-アクチンタンパク質レベルは内因性ハウスキーピングコントロールとして使用される］。 胎児様のhiPSC由来心室心筋細胞に対する成熟したhiPSC由来心外膜のパラクリン効果。（a）hiPSC由来の心室心筋細胞に対する成熟したhiPSC由来心外膜のパラクリンシグナル伝達を評価するための共培養実験の概略図。（b）Torin1によるmTOR阻害の1週間後の心外膜IGF2およびFN1発現のmRNA発現レベル（灰色の棒グラフ：Torin1）［n=3、* p<0.05、** p<0.005、*** p<0.0005]。（c）Torin1で処理した成熟型hiPSC由来の心外膜（Phase constrastの矢印）で10日間共培養した心室のhiPSC由来心筋細胞で構成される拍動するEBにおける、心筋トロポニンIの成人アイソフォーム（mCherry+、TNNI3）および胎児心筋トロポニン（eGFP+、TNNI1）のIF検出。（d）Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜との10日間の共培養後の心臓のTNNI3発現のhiPSC由来EBにおけるmRNA発現レベル（濃灰色の棒グラフ：成熟した心外膜）［n=3、* p<0.05 、** p<0.005、*** p<0.0005］。（e）Torin1で処理したhiPSC由来の心外膜との10日間の共培養後の左心室圧縮に関連する遺伝子（TBX5、HEY2、PRDM16およびNPPA）のhiPSC由来EBにおけるmRNA発現レベル（濃灰色の棒グラフ：成熟した心外膜）［n=3、t検定、* p<0.05 、** p<0.005、*** p<0.0005］。 成熟したヒトiPS由来の心臓オルガノイドの作製。（a）mTORシグナル伝達の下方制御によって自己組織化した成熟ヒト心臓オルガノイド（hHO）を作製するプロトコルの概略図。（b）固定した1:3の比率で漸減濃度のTorin1で96時間処理した後のhHO細胞生存率およびIC50を示すMTTアッセイ。（c）Torin1による1週間の処理前（未処理、黒丸)と処理後（Torin1、灰色丸）のヒト心臓オルガノイドのサイズ（mm2）［n≧11、両側対応のないt検定］。（d）未処理hHOおよびTorin1で処理したhHOの位相差顕微鏡写真［スケールバー: 500 μm］。（e）発達15日目のhHOにおけるWT1およびTNNT2発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：50 μm］。（f）発達15日目のhHOにおけるSNAI1およびZO-1発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm］。（g）Torin1（200 nM）で処理したhHOにおけるWT1およびTNNT2発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μ m；インセット：100 μm］。（h）Torin1（200 nM）、タクロリムス（1 μM）、またはラパマイシン（200 nM）で処理したhHOにおけるWT1およびTNNI3発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm］。（i）Torin1（200 nM）、タクロリムス（1 μM）、またはラパマイシン（200 nM）で処理したhHOにおけるSNAI1およびZO-1発現の免疫細胞化学分析［スケールバー：500 μm；インセット：100 μm］。
１．心外膜細胞の製法
　本発明は、心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、成熟した心外膜細胞を製造する方法（以下、「本発明の製法」と称することがある）を提供する。心外膜細胞は、未熟な（換言すれば「胎児型」）心外膜細胞と、成熟した（換言すれば「成体型」）心外膜細胞とに大別されるが、以下では、特に断らない限り、心外膜細胞とは、未熟な心外膜細胞を指す。また、本明細書において、「心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程」は、「心外膜細胞をmTORC2阻害剤と接触させる工程」と適宜読み替えることができる。
　心外膜細胞は、動物の心臓の最外層を構成する細胞であり、心臓の発生と再生において重要な役割を果たしている。本明細書において、「未熟な心外膜細胞」は、WT1およびTBX18を発現し、増殖活性および上皮間葉転換活性を有する細胞を意味する。また、本明細書において、「成熟した心外膜細胞」とは、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を行う前の心外膜細胞と比較して、胎児型心外膜のマーカーの発現レベルが低下または消失した（換言すれば、「発現しない」）細胞を意味し、典型的には、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を行う前の心外膜細胞と比較して、さらに増殖活性および上皮間葉転換活性が低下または消失した細胞である。また、本発明の心外膜細胞は、IGF2および／またはFN1の発現レベルが上昇したものであってもよい。上記胎児型心外膜細胞のマーカーとしては、例えば、WT1、TBX18、ALDH1A2、HAND2が挙げられ、これらの内の少なくとも１種（例えば、WT1）の発現レベルが低下または消失した細胞が成熟した心外膜細胞といえるが、好ましくは２種以上（例：WT1とTBX18との組み合わせ、WT1、TBX18、ALDH1A2およびHAND2の組合せ等）の発現レベルが低下または消失した細胞である。一態様において、成熟した心外膜細胞は、WT1および／またはTBX18を発現せず、より好ましくはWT1およびTBX18を発現しない。
　増殖活性は、下述の実施例のような増殖アッセイに基づき評価してもよく、また細胞分裂関連遺伝子（例：MKI67、CCNA1、CCNB1、E2F1等）の発現レベルに基づき評価してもよい。あるいは、細胞周期の静止期に関連する遺伝子（例：TP53、CDKN2A、HES1、RB1等）の発現レベルに基づき評価してもよい。一態様において、成熟した心外膜細胞は、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を行う前の心外膜細胞と比較して、MKI67、CCNA1、CCNB1およびE2F1の発現レベルが低く、ならびに／またはTP53、CDKN2A、HES1およびRB1の発現レベルが高い細胞である。
　心外膜細胞における上皮間葉転換（EMT）とは、心外膜細胞が平滑筋細胞へと分化することであり、EMT活性は、EMT関連遺伝子（例：SNAI1、SNAI2、TCF21等）の発現により評価できる。本明細書において、SNAI1、SNAI2およびTCF21の少なくともいずれか１つが発現する細胞を、EMT活性を有すると評価することができる。一態様において、成熟した心外膜細胞は、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を行う前の心外膜細胞と比較して、SNAI1、SNAI2およびTCF21の少なくともいずれか１つの発現レベルが低く、好ましくはこれらすべての遺伝子の発現レベルが低い。
　下述の実施例で示される通り、心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養することで、該細胞を成熟させることができ、さらには心臓オルガノイド内の心外膜細胞を成熟させることができる。よって、本発明の一態様において、本発明で用いる心外膜細胞は、心臓オルガノイドに含まれるものであり、心外膜細胞は、心臓オルガノイドの形態で本発明の製法に供される。よって、本発明により、心外膜細胞を含む心臓オルガノイドを、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、成熟した心外膜を含む心臓オルガノイドの製造方法も提供される。
　本明細書において、特に断りのない限り、「細胞」には、「細胞集団」が含まれるものとする。また、特に断らない限り、「細胞」は、細胞培養により得られるものを指す。細胞集団は、１種類の細胞から構成されていてもよく、２種類以上の細胞から構成されていてもよい。さらに、特に断りのない限り、「細胞集団」には、「細胞凝集体」および「人工組織」などの「オルガノイド」も包含される。
　本明細書において、「オルガノイド」とは、複数種の細胞を含む構造体（典型的には、スフェロイド）を意味する。また、「人工組織」とは、典型的には、生体内の組織と類似した構造および／または機能を有する構造体を意味する。ある構造体がオルガノイドまたは人工組織であるかどうかは、例えば、必要に応じて染色（例：免疫染色、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色等）を行ったサンプルについて、顕微鏡観察により、細胞の局在や層構造形成の有無などを確認することにより行うことができる。
　本明細書において、「心臓オルガノイド」とは、心外膜細胞を含むオルガノイドを意味し、該オルガノイドには、人工心臓組織も包含される。「人工心臓組織」とは、心外膜細胞を含む人工組織を意味する。以下では、特に断らない限り、人工心臓組織を単に「心臓組織」と称する。典型的には、本発明の心臓オルガノイドは、拍動活動が認められるTNNT2陽性の心筋細胞、CD31陽性の内皮細胞、およびNFATC1陽性の心内膜細胞、およびVIM陽性の心臓線維芽細胞を含む。また、心臓オルガノイドは、ZO-1発現によって表されるタイトジャンクションを有し得る。
　本発明で用いる心外膜細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、心臓から、公知の手法により単離する方法、多能性幹細胞を分化誘導する方法、ATCCなどの企業から入手する方法などが挙げられる。心臓からは、例えば、表面抗原（例えば、CDH18など）を指標にして、フローサイトメトリーまたはマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて中腸細胞を単離することができる。本発明で用いる心外膜細胞は、多能性幹細胞を分化誘導する方法により得ることが好ましい。心外膜細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってよい。好ましい由来種は、ヒトである。
　多能性幹細胞から心外膜細胞への分化誘導方法として、公知の方法を用いることができる。かかる方法として、例えば、非特許文献４または非特許文献５に記載の方法、例えば、以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含む方法などが挙げられる。よって、本発明の製造方法は、以下の工程（Ａ）～（Ｃ）の少なくともいずれか１つの工程を含んでいてもよい。
（Ａ）多能性幹細胞を浮遊培養し、細胞凝集体（胚様体（EB））を形成させる工程。
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞凝集体を、BMP4、アクチビンA、bFGFの存在下で浮遊培養し、中胚葉細胞を含む細胞凝集体を誘導する工程。
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を分散させ、CHIR99021、BMP4、VEGFおよびSB431542の存在下で接着培養して、心外膜細胞を分化誘導する工程。
　工程（Ｃ）で得られる心外膜細胞は、維持培地中で長期間維持することもできる。かかる維持培地としては、例えば、10% FBSおよび10 μM SB431542を含むDMEMなどが挙げられるが、これに限定されない。
　工程（Ａ）における細胞凝集体の形成は、典型的には、次の方法により行われる。まず、多能性幹細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。多能性幹細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。このような細胞解離液として、例えば、アキュターゼ(MILLIPORE)、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE (Invitrogen)等の市販品が入手可能である。分散された多能性幹細胞は、低接着性の培養器内の培地中に懸濁される。工程（Ａ）の期間は、当業者が適宜設定でき、通常０．５日間～５日間（特に、１日間）である。
　工程（Ｂ）は、多能性幹細胞を中胚葉細胞へと分化誘導する工程であり、該工程における培地には、上記添加物の他に、細胞外マトリックス（例：0.5%マトリゲル等）を含むことが好ましい。工程（Ｂ）の期間は、当業者が適宜設定でき、通常１日間～６日間であり、２日間～４日間（特に、２．５日間）がより好ましい。
　工程（Ｃ）は、中胚葉細胞を心外膜細胞へと分化誘導する工程であり、典型的には、工程（Ａ）と同様に細胞凝集体を単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、該細胞を接着培養することにより行うことができる。工程（Ｃ）の期間は、当業者が適宜設定でき、通常３日間～１０日間であり、４日間～７日間（特に、５．５日間）がより好ましい。
　また、例えば、上記工程（Ａ）で得られる細胞凝集体を、CHIR99021、BMP4、およびActivin Aを含む培地で浮遊培養し、次いでWnt-C59で細胞凝集体を約2日間処理し、15日目まで浮遊培養を続けることなどにより、心臓オルガノイドを誘導することもできる。
　また、心臓オルガノイドから、工程（Ａ）と同様に細胞凝集体を単一の細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、該細胞を人工心臓組織培養用培地中で接着培養することなどにより、人工心臓組織を製造することも可能である。
　「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。本発明で用いる多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（nuclear transfer Embryonic stem cell：ntES細胞）、多能性生殖幹細胞（multipotent germline stem cell）（「mGS細胞」）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）などが挙げられるが、好ましくはiPS細胞(より好ましくはヒトiPS細胞)である。上記多能性幹細胞がES細胞またはヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、倫理的な観点からは、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman（1981）, Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al.（1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al.（1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al.（1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall（1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。あるいは、ES細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて樹立することもできるし（Chung Y. et al. (2008), Cell Stem Cell 2: 113-117）、発生停止した胚を用いて樹立することもできる（Zhang X. et al. (2006), Stem Cells 24: 2669-2676.）。
　nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（Wakayama T. et al.（2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al.（2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; Byrne J. et al.（2007）, Nature, 450:497-502）。即ち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES（nuclear transfer ES）細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（Cibelli J.B. et al.（1998）, Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 47～52頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
　本発明で用いるES細胞株としては、マウスES細胞であれば、例えば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞株であれば、例えば、ウィスコンシン大学、NIH、理研、京都大学、国立成育医療研究センターおよびCellartis社などが樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。具体的には、例えば、ヒトES細胞株としては、ESI Bio社が分譲するCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WiCell Researchが分譲するH1株、H9株等、理研が分譲するKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株などが挙げられる。
　iPS細胞は、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞である。現在、iPS細胞にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPSC（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPSC（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPSC（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）等も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許公報（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性幹細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPSC株が利用可能である。例えば、ヒトiPSC株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学の253G1株、253G4株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1383D2株、1383D6株、1390B1株、1390C1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株などが挙げられる。
　本発明の製法で用いる人工多能性幹細胞は、遺伝性疾患（例えば、遺伝性の心疾患患者など）の患者由来の細胞であってもよい。遺伝性疾患の心疾患患者由来の多能性幹細胞から分化誘導させた細胞は、該疾患の病態を反映する疾患モデルとなり得るため、該疾患の治療または予防薬のスクリーニングなどに適している。あるいは、遺伝性疾患の心疾患患者由来の多能性幹細胞に対して、CRISPR-Casシステムなどを用いたゲノム編集により遺伝子を修復した上で成熟した心外膜細胞または該細胞を含む心臓オルガノイドへと分化させることで、該細胞またはオルガノイドを心疾患の治療薬として用いることも可能となる。
　mGS細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質を有する（Kanatsu-Shinohara M. et al.（2003）Biol. Reprod., 69:612-616; Shinohara K. et al.（2004）, Cell, 119:1001-1012）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF））を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（2008）, 実験医学, 26巻, 5号（増刊）, 41～46頁, 羊土社（東京、日本））。
　EG細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞である。LIF、bFGF、幹細胞因子（stem cell factor）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立し得る（Matsui Y. et al.（1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al.（1992）, Nature, 359:550-551）。
　多能性幹細胞の由来種も特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などの細胞であってよい。好ましい由来種は、ヒトである。
　mTORは、mTORC1（mTOR Complex 1（mTOR複合体1））およびmTORC2（mTOR Complex 2（mTOR複合体2））の２つの複合体として細胞内に存在する。mTORC1は、raptorを含み、mTORC2はrictorを含む。これらの複合体は別々に調節され、異なる基質特異性およびラパマイシン感受性を有する。例えば、mTORC1はS6キナーゼ（S6K）および4EBP1をリン酸化し、これによりタンパク質への翻訳およびリボソーム合成の増加を促進して、細胞成長および細胞周期の進行を促す。また、S6Kもフィードバック経路で作用して、PI3K/Akt活性を弱める。mTORC2は、Aktなどの一部のAGCキナーゼのC末端疎水性モチーフをリン酸化することで、成長因子のシグナル伝達を調節すると考えられている。
　本発明で用いるmTORC2阻害剤としては、mTORC2によるAktのリン酸化（典型的には、S473部位のリン酸化）を阻害できるものであれば特に限定されない。また、本発明のmTORC2は、併せてmTORC1阻害活性を有するものが好ましい。本発明で用いるmTORC2として、具体的には、例えば、mTORC2阻害剤としては、Torin1（トリン1）、Torin2（トリン2）、オミパリシブ（Omipalisib）(GSK2126458)、KU-0063794、OSI-027、XL388、Palomid 529(P529)、WYE-354、トルキニブ（Torkinib）(PP242)、サパニセルチブ（Sapanisertib）(TAK-228)、WYE-687、AZD8055、ビスツセルチブ（Vistusertib）（AZD2014）などの低分子化合物が挙げられるが、中でもTorin1が好ましい。サパニセルチブ、WYE-687、AZD8055、ビスツセルチブも好適に用いられ得る。また、mTORC2のAktのリン酸化を阻害する抗体、ペプチドまたはアプタマーもまた好ましい。mTORC2阻害剤は、１種類のみ用いてもよく、複数種類用いてもよい。さらに、本発明のmTORC2阻害剤は、他のmTORC1阻害剤と併用して用いてもよい（特に、用いるmTORC2阻害剤がmTORC2の特異的な阻害剤である場合）。よって、一態様において、本発明の製法は、培地がmTORC1阻害剤を含むが、該mTORC1阻害剤は、本発明で用いるmTORC2阻害剤と同じであってもよく（mTORC2阻害剤がmTORC1阻害活性も有する場合）、別のmTORC1阻害剤であってもよい。
　本発明で用いる各物質が低分子化合物の場合には、該化合物には、フリー体だけでなく、その薬理学的に許容される塩および水和物も包含されるものとする。薬理学的に許容される塩は化合物の種類によって異なるが、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アルミニウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N，N’-ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基塩などの塩基付加塩、あるいは塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩などの酸付加塩が挙げられる。
　本発明で用いる各物質がタンパク質またはペプチドである場合には、その由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）である。また、本発明の製法で用いるタンパク質またはペプチドには、野生型のものだけでなく、同様の機能を有するその変異体も含まれるものとする。変異体としては、例えば、特定の野生型タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列に対して、高い同一性（例えば、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上の同一性）を有するタンパク質またはペプチドなどが挙げられる。
　mTORC2を構成する任意のタンパク質の発現を抑制できる物質（以下、「mTORC2発現抑制剤」と称することがある。）もまた、本発明で用いるmTORC2阻害剤として適している。mTORC2を構成するタンパク質としては、mTOR、rictor、mSIN1、mLST8、deptorおよびproctoなどが挙げられ、これらのタンパク質の少なくともいずれか１つの発現を抑制できればよいが、好まし標的は、mTORC1と共通のmTOR、deptor、mLST8であり、mTORがより好ましい。
　本明細書において、「遺伝子の発現」とは、特に断らない限り、少なくとも「転写産物の産生」を含む意味で用いられるが、好ましくは、さらに「機能的なタンパク質の産生」を含む意味で用いられる。従って、遺伝子の発現抑制とは、標的遺伝子の発現抑制剤との接触により、該遺伝子から転写される転写産物の細胞中での存在量が減少することだけでなく、該遺伝子にコードされる機能的なタンパク質の細胞中での存在量が減少することも含んでいてもよい。また、本明細書において、転写産物には、典型的には、mRNAおよびpre-mRNAが含まれるが、好ましくはmRNAである。
　また、遺伝子にコードされたmRNAの産生が少なくとも後述の実施例に記載の方法（RT-qPCR）で検出された場合には、遺伝子が発現するあるいは陽性といえる。一方で、遺伝子にコードされたmRNAの産生が後述の実施例に記載の方法（RT-qPCR）で検出されない（即ち、検出限界未満）場合、あるいはバックグラウンドレベルの場合には、遺伝子が発現していないあるいは陰性といえる。
　mTORC2発現抑制剤としては、心外膜細胞において標的タンパク質の発現を抑制できる物質であれば限定されないが、好ましくは核酸である。かかる核酸としては、例えば、アンチセンス核酸（例：アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）等）（該核酸をコードする核酸も含む）、siRNA（該siRNAをコードする核酸も含む）、ヘテロ二本鎖核酸（heteroduplex oligonucleotide; HDO）、shRNA（該shRNAをコードする核酸も含む）、miRNA（microRNA）（該miRNAをコードする核酸も含む）などが挙げられる。以下では、mTORC2発現抑制剤が核酸である場合、かかる核酸を「mTORC2発現抑制核酸」と称することがある。mTORC2発現抑制剤は、１種類のみ用いてもよく、複数種類用いてもよい。また、mTORC2発現抑制剤は、他のmTORC1発現抑制剤と併用して用いてもよい。mTORC1発現抑制剤は、mTORC1を構成する任意のタンパク質の発現を抑制できる物質であればよく、かかるタンパク質としては、例えば、mTOR、raptor、PRAS40などが挙げられる。
　mTORC2発現抑制核酸が標的とするタンパク質に、複数のアイソフォームが存在する場合には、典型的には完全長タンパク質をコードする転写産物の発現を抑制できるものであるが、Aktのリン酸化を抑制できるものであれば、その他のアイソフォームであってもよい。mTORC2発現抑制核酸が標的とする塩基配列（標的配列）は、例えば、公知のデータベース（例えば、NCBIのデータベース）の情報に基づき、適宜設計することができる。また、標的配列の長さは、発現抑制核酸が特異的に認識して結合し得る限り、特に制限されないが、好ましくは12ヌクレオチド長以上、より好ましくは15ヌクレオチド長以上、さらに好ましくは17ヌクレオチド長以上である。長さの上限も特に制限されないが、例えば30ヌクレオチド以下、好ましくは25ヌクレオチド以下、より好ましくは22ヌクレオチド以下である。
　本明細書において、「相補的」とは、核酸塩基同士が水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対(天然型塩基対)または非ワトソン-クリック塩基対(フーグスティーン型塩基対、ゆらぎ塩基対（Wobble base pair）など)を形成し得る関係を意味する。従って、「相補的な配列」には、標的RNA配列または標的DNA配列に対して、完全相補的な（即ち、ミスマッチなくハイブリダイズする）配列のみならず、ストリンジェントな条件下で、あるいは哺乳動物細胞の生理的条件下で標的配列とハブリダイズし得る限り、1ないし数個（例：2、3、4、5個またはそれ以上）のミスマッチを含む配列をも含む意味で用いられる。例えば、標的RNA配列または標的DNA配列に対して完全相補的な配列と、80%以上（例：85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上）、最も好ましくは100%の同一性を有する配列が挙げられる。
　アンチセンス核酸は、標的RNA配列と相補的な配列を含む一本鎖核酸である。アンチセンス核酸は、該標的RNA配列と相補的な配列により、標的RNA配列と二本鎖領域を形成し、該二本鎖領域がリボヌクレアーゼH（RNase H）により切断されることで、KLHL32遺伝子の発現を抑制する。アンチセンス核酸の長さは、特に制限されないが、典型的には10～30ヌクレオチド長であり、より好ましくは13～30ヌクレオチド長である。
　siRNAとは、標的RNA配列と相補的な配列を有するRNA（即ち、アンチセンス鎖）とその相補鎖から構成される二本鎖RNAである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的RNA配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖RNAであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と二本鎖構造を形成するRNA（smallhairpin RNA：shRNA）もsiRNAの好ましい態様の１つである。また、shRNAは、該shRNAをコードする核酸（例：発現ベクター等）の形態であってもよい。
　HDOは、主鎖DNA（即ち、アンチセンス鎖）と、該DNAに相補的なRNA（cRNA）鎖から構成される二本鎖核酸を意味する。HDOは、細胞内に取り込まれると、細胞内でRNase HによりcRNA鎖が切断される。HDOは、cRNA鎖の切断によって1本鎖のアンチセンス核酸となった主鎖DNAは標的RNAに結合し、再びRNase Hが標的RNAを切断することでアンチセンス効果を発揮すると推測されている。
　二本鎖核酸の各核酸鎖の長さは、アンチセンス効果を発揮できる限り特に制限されないが、例えば、10～50ヌクレオチド長、好ましくは15～30ヌクレオチド長、より好ましくは20～27ヌクレオチド長である。
　本明細書において、「miRNA」とは、siRNAのように標的RNAを切断するのではなく、標的RNAの３’非翻訳領域（UTR）を認識して、翻訳を制御する一本鎖RNAまたは二本鎖RNA（例：miRNA/miRNA*等）を意味する。miRNAは、本来ゲノム上にコードされた内在性の20～25塩基程度の非コードRNA（non-codingRNA：ncRNA）を意味し、miRNA遺伝子からpri-miRNAが発現し、その後pre-miRNAの生成を経て、mature-miRNAが生成される。その後、mature-miRNAがRISCに取り込まれて一本鎖miRNAが生成される。本発明で用いるmiRNAは、pri-miRNAの形態であってもよく、pre-miRNAの形態であってもよく、mature-miRNA（miRNA/miRNA*）の形態であってよく、さらには一本鎖RNAの形態であってもよい。また、miRNAは、該miRNAをコードする核酸（例：発現ベクター等）の形態であってもよい。miRNAの長さ（miRNAが二本鎖の場合には、各核酸鎖の長さ）は、アンチセンス効果を発揮できる限り特に制限されないが、例えば、10～50ヌクレオチド長、好ましくは15～30ヌクレオチド長、より好ましくは20～27ヌクレオチド長である。
　mTORC2発現抑制核酸は、従来公知の手法を用いて、化学的に合成することにより、または遺伝子組み換え技術を用いて産生することにより得ることができる。また、適宜市販されている核酸を用いることも可能である。例えば、核酸は、標的RNA配列に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAiDesigner； Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。二本鎖核酸の場合には、RNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90℃～約95℃で約1分程度変性させた後、約30℃～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、HDOは、例えば、WO2013/089283に記載の方法により作製することもできる。
　本発明で用いる基礎培地としては、特に限定されないが、RPMI-1640培地、EagleMEM(EMEM)、ダルベッコ改変MEM、Glasgow’s MEM（GMEM）、α-MEM、199培地、IMDM、DMEM、Hybridoma Serum free培地、KnockOutTM DMEM、Advanced TM培地（例：Advanced MEM、Advanced RPMI、Advanced DMEM/F-12）、Ham’s Medium F-12、Ham’s Medium F-10、Ham’s Medium F12K、DMEM/F-12、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy’s 5A、Leibovitz’s L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth’s Medium（例：Waymouth’s MB752/1）、CMRL培地（例：CMRL-1066）、Williams’ medium E、Brinster’s BMOC-3 Medium、Essential 8(E8) Medium、Essential 8 Flex Medium、StemPro 34、MesenPRO RS（以上サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ReproFF2、Primate ES Cell Medium、ReproStem（以上リプロセル株式会社）、ProculAD（ロート製薬株式会社）、MSCBM-CD、MSCGM-CD（以上Lonza社）、EX-CELL302培地（SAFC社）またはEX-CELL-CD-CHO（SAFC社）、ReproMedTM iPSC Medium（リプロセル株式会社）およびこれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の製法において、DMEMが好ましい。また、多能性幹細胞から心外膜細胞への分化誘導には、StemPro 34が好ましい。
　特にフィーダーフリーかつゼノフリー条件下での培養のために、StemFit（登録商標） AK02培地（味の素株式会社）、StemFit（登録商標） AK03培地（味の素株式会社）、StemFit（登録商標） Basic03培地、CTS（登録商標） KnockOut SR XenoFree Medium(Gibco)、mTeSR1培地、TeSR1培地（Stem Cell Technologies）、Iscove’s modified Dulbecco’s medium（GEヘルスケア社）、Improved MEM（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などを用いることもできる。
　必要に応じて、培地は、例えば、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清などの血清を含んでいてもよく、Knockout Serum Replacement(KSR)、N2 supplement（Invitrogen）、B27 supplement（Invitrogen）、アルブミン、トランスフェリン、アポトランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよく、また、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、セレン酸、プロゲステロンおよびプトレシンなどの1つ以上の物質も含有してもよい。
　本明細書において、「浮遊培養」とは、細胞または細胞集塊が培養液に浮遊して存在する状態を維持する条件で行われる培養、即ち細胞または細胞集塊と培養容器との間に強固な細胞－基質間結合（cell-substratum junction）を作らせない条件での培養を意味する。また、浮遊培養を行う場合、典型的には、浮遊培養の前後の細胞は細胞集塊の形態である。本明細書において、「接着培養」とは、細胞と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養容器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養容器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。さらに、浮遊培養用の容器としてバイオリアクターが例示される。これらの培養容器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例：細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。これらの培養容器のウェル底形状は、特に制限されず、例えば、平底、U字型、V字型のものが挙げられる。
　接着培養を行う際に用いられる培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例：基底膜調製物、フィブロネクチン、ラミニンまたはその断片、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、シンセマックス、ビトロネクチン等の細胞外マトリクス等、または、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、または、正電荷処理等の表面加工）されたものが挙げられる。基底膜調製物として市販されている商品として、例えば、マトリゲル、Geltrexなどが挙げられる。
　あるいは、ゼノフリーの観点からは、ラミニンまたはその断片も好ましい。ラミニンまたはその断片としては、例えば、ラミニン-111またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-211またはそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-211）、ラミニン-121またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-221またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-332またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-3A11またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-411またはそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-411）、ラミニン-421またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-511またはそのE8領域を含む断片（例：iMatrix-511、iMatrix-511 silk）、ラミニン-521またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-213またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-423またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-523またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-212/222またはそのE8領域を含む断片、ラミニン-522またはそのE8領域を含む断片などが挙げられる。
　本発明の製法の工程、およびその他の工程（例えば、上記工程（Ａ）～（Ｃ））の少なくともいずれか１つの工程では、フィーダーフリー条件下および／またはゼノフリー条件下で細胞を培養してもよい。本発明の製法では、全行程をフィーダーフリーかつゼノフリー条件下で行ってもよい。本明細書において、「フィーダーフリー」とは、培養対象の細胞の培養条件を整えるために用いる、補助役を果たす他の細胞種（即ち、フィーダー細胞）を含まない培地または培養条件を意味する。また、「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物由来の成分を含まない培地または培養条件を意味する。
　培養温度は、特に制限されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　細胞の播種密度は、細胞が増殖できる限り特に限定されない。典型的には1.0×102～1.0×107細胞/cm2、好ましくは1.0×103～1.0×106細胞/cm2、より好ましくは1.0×104～1.0×105細胞/cm2である。
　本発明の製法の工程（１）で用いるmTORC2阻害剤の培地中での濃度は、Torin1を用いる場合、典型的には1nM～10μM、好ましくは10nM～2μM、より好ましくは、50nM～600nM（特に、200nM）である。Torin1以外のmTORC2阻害剤を用いる場合には、培地中のmTORC2の濃度は、適宜選択される。
　本発明の製法の工程の培養期間は、特に限定されないが、典型的には、１日間～２０日間、好ましくは３日間～１５日間、より好ましくは５日間～１０日間（特に、７日間）である。
　本発明の製法は、本発明の製法により得られる成熟した心外膜細胞を単離する工程を含んでいてもよい。単離した細胞は、細胞凍結保存液を用いて凍結保存してもよい。また、容器に回収した細胞は、セルカウンターにてセルカウントを行ってもよく、細胞の表面マーカーに対する抗体により標識し、フローサイトメトリーやマスサイトメトリー、磁気細胞分離法などにより選別してもよい。
　さらに別の態様において、本発明は、心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、心外膜細胞の成熟方法を提供する。心外膜細胞およびmTORC2の定義および具体例、培養方法などは、すべて本発明の製法についての記載が援用される。
２．成熟した心外膜細胞、該細胞を含む心臓オルガノイドおよびこれらの用途
　本発明の製法により、成熟した心外膜細胞、または該細胞を含む心臓組織などの心臓オルガノイドが得られる。従って、本発明の別の態様において、本発明の製法で得られる（「得られる」は、適宜「得られた」と読み替えることができる。）成熟した心外膜細胞または該細胞を含む心臓オルガノイドまたは心臓組織（以下、「本発明の心外膜細胞」と称することがある）も提供される。
　また、下述の実施例において、本発明の心外膜細胞によるパラクライン効果により、心筋細胞の成熟を促進できることが示された。よって、さらに別の態様において、本発明の心外膜細胞と、心筋細胞とを共培養する工程を含む、成熟した心筋細胞の製造方法、あるいは工程を含む心筋細胞の成熟方法が提供される。一実施態様において、かかる方法で用いる心筋細胞は、細胞凝集体（典型的には、胚様体）に含まれる心筋細胞である。また、これらの方法は、フローサイトメトリーなどを用いて、成熟した心筋細胞を単離する工程を含んでいてもよい。以下では、上記成熟した心筋細胞の製造方法により得られる心筋細胞を、「本発明の心筋細胞」と称することがある。心筋細胞は、未熟な（換言すれば「胎児型」）心筋細胞と、成熟した（換言すれば「成体型」）心筋細胞とに大別されるが、特に断らない限り、心筋細胞とは、未熟な心筋細胞を指す。
　心筋細胞は、動物の心筋を構成する細胞であり、本明細書において、未熟な心筋細胞および成熟した心筋細胞は、収縮および弛緩を繰り返す（拍動活動が認められる）細胞を意味する。未熟な心筋細胞および成熟した心筋細胞は、典型的には、心筋トロポニンT(cTNT)、αMHC（α myosin heavy chain、MYH6）およびβMHC（MYH7）からなる群から選択される少なくとも１種の心筋細胞マーカーを発現する。未熟な心筋細胞は、TNNI1を発現する細胞を意味する。また、「成熟した心筋細胞」は、TNNI3を発現し、本発明の心外膜細胞と共培養する工程を行う前の心筋細胞と比較して、TNNI1の発現レベルが低下または消失し、TNNI3の発現レベルが上昇した細胞を意味し、好ましくは、TNNI1を発現せず、TNNI3を発現する細胞である。
　本発明で用いる心筋細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、心臓から、公知の手法により単離する方法、多能性幹細胞を分化誘導する方法、ATCCなどの企業から入手する方法などが挙げられる。心臓からは、例えば、表面抗原（例えば、CD82など）を指標にして、フローサイトメトリーまたはマスサイトメトリーを用いた方法、磁気細胞分離法、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて中腸細胞を単離することができる。本発明で用いる心外膜細胞は、多能性幹細胞を分化誘導する方法により得ることが好ましい。
　心外膜細胞への分化誘導に上記工程（Ｂ）で得られる中胚葉細胞を含む細胞凝集体を、心外膜細胞誘導因子を含む培地中で浮遊培養することで、心外膜細胞を含む細胞凝集体を誘導することもできる。この工程では、例えば、VEGF、IWP-3、Dorsomorphin、およびSB431542の存在下で中胚葉細胞を含む細胞凝集体を浮遊培養することなどにより行うことができる。この工程の期間は、当業者が適宜設定でき、通常６日間～２５日間であり、１０日間～２０日間がより好ましい。その他の培養方法は、すべて本発明の製法についての記載が援用される。
　本発明の心外膜細胞と、心筋細胞とを共培養する期間は、特に限定されないが、典型的には、５日間～２０日間、好ましくは６日間～１５日間、より好ましくは７日間～１４日間（特に、１０日間）である。培養は、浮遊培養であっても接着培養であってもよいが、好ましくは浮遊培養である。培養される心外膜細胞と心筋細胞が、同じ培地中で培養されていれば共培養する方法は特に限定されない。その他の培養方法は、すべて本発明の製法についての記載が援用される。
　本発明の心外膜細胞および心筋細胞は、再生医療などの医療に用いることができるため、別の態様において、本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞を含む、移植療法剤（以下、「本発明の移植療法剤」と称することがある。）が提供される。また、本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞の有効量を、治療または予防の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与または移植する、心疾患の治療または予防方法も、本発明に包含される。本明細書において、特に断らない限り、疾患の治療または予防薬（あるいは治療または予防方法）には、該疾患を治療でき、かつ予防できる医薬（あるいは方法）も包含される。
　心疾患としては、例えば、心不全、慢性心不全、重症心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、心筋症、虚血性心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、拡張型心筋症、アミロイド心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、ストレス誘起性心筋症、心筋炎、先天性障害、遺伝性障害、左室緻密化障害、僧帽弁逸脱症、不整脈源性右室異形成、各種弁狭窄症、各種弁逆流症などが挙げられる。本発明の心外膜細胞および心筋細胞は、患部に移植されることなどにより、心疾患の治療または予防効果を発揮する。
　本発明の移植療法剤は、それを必要とする対象に生体内に投与または移植して用いることができる。移植される細胞またはオルガノイドは、治療または予防上有効量を投与すればよく、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、細胞の数として、10×104細胞～10×1011細胞程度とすることができる。
　本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞を、移植療法剤として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したiPS細胞に由来する細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座或いはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコーンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。
　本発明の心外膜細胞および心筋細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。従って、一態様において、本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞を製剤化する工程を含む、移植療法剤の製法も提供される。かかる製法は、本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞を準備する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞を保存する工程を含むこともできる。
　当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の心外膜細胞および心筋細胞は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。
　本発明の移植療法剤は、細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清若しくはその代替物、有機溶剤（例、DMSO）等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清若しくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1～約30%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0～約50%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。
　また、本発明の心外膜細胞および心筋細胞は、心疾患の治療または予防に有用な薬剤である候補薬剤をスクリーニングする方法にも用いることができる。よって、本発明のさらに別の態様において、被験物質の存在下または非存在下で、本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞を培養する工程を含む、疾患の治療または予防薬のスクリーニング方法が提供される。かかる心疾患としては、本発明の移植療法剤の治療または予防目的となる上記の心疾患と同様のものが挙げられる。スクリーニングに用いる本発明の心外膜細胞および／または心筋細胞として、心疾患患者由来の細胞を用いることで、より精度の高いスクリーニングが可能となり得る。
　本発明で用いる被験物質としては、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。
　上記被験物質はまた、（1）生物学的ライブラリー、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam（1997）Anticancer Drug Des. 12:145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al.（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13; Erb et al.（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-6; Zuckermann et al.（1994）J. Med. Chem. 37:2678-85; Cho et al.（1993）Science 261:1303-5; Carell et al.（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al.（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; Gallop et al.（1994）J. Med. Chem. 37:1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten（1992）Bio/Techniques 13:412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam（1991）Nature 354:82-4）、チップ（Fodor（1993）Nature 364:555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al.（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith（1990）Science 249:386-90; Devlin（1990）Science 249:404-6; Cwirla et al.（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-82; Felici（1991）J. Mol. Biol. 222:301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
材料および方法
＜細胞株および培養条件＞
　レトロウイルス法を介して、山中因子を使用して初期化されたhiPSC細胞株である201Bを、照射されたMEFフィーダー層によってサポートされた、4 ng/mlのbFGFを含むReproCell ES溶液中で増殖した。フィーダー層を除去するために、CTKを細胞に投与した。フィーダーを必要としない1390C1およびT1/T3レポーター(PMID: 34155205)細胞株を、iMatrix-511（Matrixomeから入手）でコーティングされたディッシュ上の完全なStemFit（登録商標）AK02N溶液で維持した。MEC1マウス心外膜細胞株（Merck、SCC187）を入手し、製造元が提供するガイドラインに従って増殖させた。コンタミネーションがないことを確認するためにマイコプラズマについての定期検査を実施した。
＜細胞トランスフェクション＞
　遺伝子抑制テストでは、Silencer（登録商標） Select siRNA（ThermoFisherより入手）、具体的にはsiYBX3(s107202)およびsiMAFF (s115936)、を10 μmolの濃縮物として調製した。細胞をミュートするために、50 μlのOpt-MEM中に10 μlのsiRNA溶液を混合し、次いで10 μlのRNAiMaxを導入することでサイレンシング混合物を作製した。室温で10分間放置した後、前日置いておいた、2 mlの維持液と約20,000～30,000個の細胞を含む6ウェルプレートにゆっくりと加えた。培養液を1日後に更新し、それ以降は標準プロトコルに従って細胞培養を行った。免疫細胞化学に関する検査では、1 mlの維持液と前日に播種した約5,000個の細胞を含む12ウェルプレートに、260μlのサイレンシング混合物を徐々に加えた。
＜細胞培養およびヒト心臓オルガノイドの誘導＞
　フィーダー非依存的なhiPSC（1390C1）を、StemFit（登録商標）AK02N培地(Reprocellから入手)を使用して、iMatrix-511（nippi製）でコーティングしたディッシュ上で培養した。PSCからヒト心臓オルガノイドを作製するプロセスは、確立された手順に従った。簡潔に説明すると、Accumaxを使用し、10 μMのROCK阻害剤であるY-27632を含むEssential 8 Flex培地（Gibcoから入手）に懸濁した。胚様体(EB)を作製するために、-2日目に、10,000個の細胞を半球状の低付着性HEMAコーティング96ウェルプレート中に、ウェルあたり合計体積100 μlで分散させた。翌日新鮮なEssential 8 Flex培地を追加した。開始日（0日目）にEssential 8 Flex培地を捨て、インスリン（Gibco製）を含まず、CHIR99021、BMP4、およびActivin Aを添加したRPMI 1640/B-27を使用して分化を開始した。1日目に、インスリンを含まない新鮮なRPMI 1640/B-27で既存の培地を置き換えた。2日目までに、溶液を、インスリンを含まず、Wnt-C59を含むRPMI 1640/B27に移した。4日目と6日目は、それぞれインスリンを含まないRPMI 1640/B-27および標準のRPMI 1640/B-27で培地を更新した。7日目に、RPMI 1640/B-27中のCHIR99021でオルガノイドを短時間（1時間）処理した。7日目以降、15日目に達するまで培地を1日おきに交換した。
＜hiPSCから心外膜細胞への分化＞
　以前の報告（PMID: 35110584）と同様に心外膜細胞を分化させた。hiPSCを、Accutaseを使用して単一細胞混合物に変換した。これらの細胞を低付着用に設計されたHEMAコーティングプレートに移し（96ウェルあたり6000～8000個の細胞の範囲）、胚様体（EB）を形成させた。分化溶液は完全に富化されたStemPro（登録商標）-34培地を含み、50 μg/ml アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、0.4 μM モノチオグリセロール、および150 mg/ml トランスフェリンなどの成分でさらに強化した。0.5% マトリゲル、10 μM Y-27632、および2 ng/ml ヒト組換え（hr）BMP4をこの培地に添加することで分化を開始した。最初の24時間後、EBを10 ng/ml hrBMP4、2 ng/ml アクチビン A、および5 ng/ml hrbFGFを含む分化溶液に浸した。84時間経過後にEBを収集し、Accutaseを使用して分解し、0.1% ゼラチンでコーティングされたプレートに（0.3 x 105細胞/cm2の密度で）再配置した。この新しい環境には、3 mM CHIR99021、30 ng/ml hrBMP4、5 ng/ml hrVEGF、および10 μM SB431542を混合した分化培地が含まれていた。7日目から、産物であるhiPSC由来の心外膜様（epicardial-like; EPI）細胞を、本質的には10% FBSおよび10 μM SB431542を混合したDMEMである維持溶液中で保存した。EPI細胞を継代培養する際に、5分間のAccutase処理を使用して細胞を除去し、その後、前述の方法に従って再配置した。
＜hiPSCから心臓への分化＞
　心室心筋細胞を以下のように分化した。0.5 mM EDTAと混合したTrypLE select（Thermo Fisher Scientificから入手）の半濃度溶液を使用して、hiPSCを個々の細胞に分離した。次いで、これらの細胞を1.5 ml/ウェルのStemPro-34培地（Invitrogen製）に加えた。この培地には、L-グルタミン、MTG、アスコルビン酸(AA)、トランスフェリン、ROCK阻害剤（Y-27632）、マトリゲル（Corningから入手）およびBMP4などの追加成分が含まれており、2 x 106細胞／ウェルの濃度で、胚様体（EB）の作製を目的としている。翌日、ウェルにさらに1.5 mlの同じStemPro-34培地を加え、より多くのbFGF、アクチビンA、およびBMP4を含ませた。3日目までに、EBをIMDM（Invitrogenバージョン）で洗浄し、VEGF、IWP-3、Dorsomorphin、およびSB431542も含む別のバッチの富化されたStemPro34培地に導入した。6日目に、培地を同様のStemPro-34ミックスと交換し、その後、この培地を2～3日ごとに更新した。最初にプレートを低酸素設定(5% O2)で10日間保持し、その後通常の酸素雰囲気に移行した。
＜増殖アッセイ＞
　ベース直径6 cmのディッシュに4.5 x 103 個の細胞を播種することにより、未処理の細胞（コントロール）とTorin1で処理した細胞(Torin1)の両方の増殖タイムラインをプロットした。1日後、古い培地を新しい培地に置き換え、細胞を増殖比較のベースラインとして設定した（0日目として指定）。細胞を2% PAで固定し、1% CV（クリスタルバイオレット、Sigma；C6158-50G）で染色することにより、2日ごとに増殖を評価した。細胞を徹底的に洗浄した後、クリスタルバイオレットを20% 酢酸（Sigma）に溶解し、595 nmでの吸光度を測定して相対細胞数を見積もった（PerkinElmer、EnVision 2104 Multilabel Readerを使用）。相対数値は、指定された培地における細胞の増殖を示す。ゼロパーセント（0%）は、0日目に設定された初期成長ベンチマークを示す。
＜マウス胎仔心臓および全心臓ライセートの単離＞
　E12、E14、およびE18の胚を予熱したPBS中に集め、ピンセットを使用して周囲の異物を慎重に除去した。胚の頭部を切り離し、心臓にアクセスするために胸腔の前面を引き裂いた。次に、胎仔心臓を機械的に分離し、予熱したPBSで満たした別のディッシュに置いた。心臓タンパク質のライセートを調製するために、まず心臓を細かく切り刻み、次に37℃で20分間トリプシンに曝した。細胞混合物を再度撹拌し、37℃でさらに20分間処理し、300gで5分間遠心した後、透明な液体（上澄み）を回収した。
＜Ex vivo心外膜外植片＞
　E12またはE14で採取した心臓を、15% FBSを富化したDMEM（低グルコース）を使用して、0.1%ゼラチンでコーティングしたディッシュ上に置いた。配置後24時間以内に、増殖培養物が出現し始めた。72時間後、ピンセットを用いて心臓切片を慎重に持ち上げた。翌日、外植片細胞をトリプシン処理し、次いで10% FBSを含むDMEM（低グルコース）で培養し、10 μM SB431542でさらに強化した。
＜hiPSC心外膜細胞における細胞毒性アッセイ＞
　すべての実験では、Torin1をDMSOで新たに調製した。ヒトiPSC由来の心外膜細胞を、ウェルあたり5,000個の細胞密度で96ウェルプレートに別々に配置した。処理効果を評価するために、濃度を減少させながら、急速に分裂する細胞に一貫した1:3の比率でTorin1を投与した。播種から1日後、Torin1単独の用量を減少させてすべての処理の有効性を評価した。96時間後、クリスタルバイオレットを使用して細胞生存率を測定した。細胞毒性効果を測定するために、マイクロプレートを使用して595 nmでの吸光度を記録した。これらの結果に基づいて、GraphPad Prism 7ソフトウェアを使用してIC50値を計算した。
＜iPSC由来のヒト心臓オルガノイド(hHO)における心毒性アッセイ＞
　すべてのテストで、Torin1をDMSOと新たに混合した。心臓オルガノイド(hHO)を分化させ、96ウェル低接着プレートに別々に配置した。処理効果を、増殖15日目のオルガノイドに、固定した1:3の比率で漸減濃度のTorin1を投与した後に評価した。各処理には、単独療法として減量した量のTorin1を使用した。4日後（または96時間後）、MTTアッセイを使用してオルガノイドの増殖能力を評価した。専用のマイクロプレートリーダーで595 nmでの吸光度を測定することで細胞毒性レベルを評価し、その後GraphPad Prism 7ソフトウェアを使用してIC50値を計算した。
＜SA-βGal活性の検出＞
　β-ガラクトシダーゼ活性を、Senescence β-Galactosidase Staining Kit（Cell Signaling TECHNOLOGY、#9860）を製造元のプロトコルに従って使用して測定した。
＜免疫細胞化学（ICC）＞
　細胞を4% PFAを使用して15分間固定し、4℃でPBS中に保存した。PBS中に1% BSA、0.5% Triton X-100、および0.1 Mグリシンを含む溶液で30～45分間ブロッキングを行った。PBSで3回洗浄した後、一次抗体：抗TBX18（1:200、ab15262、Abcam）；抗WT1（1:200、ab89901、Abcam）；抗ZO-1（1:200、33-9100、Invitrogen）；抗pH3（1:200、C36B11、CST）；抗Ki67（1:200、BioLegend、350502）を溶液（グリシンを除く）に加え、4℃で一晩放置した。翌日、PBSで洗浄後、二次抗体であるロバ抗ウサギAlexa Fluro 594（1:1000、A21207、Invitrogen）を1% BSA-PBSに室温で2時間導入した。3回のPBS洗浄後、細胞はHoechst 33342を用いて1:10,000の比率で対比染色した。イメージングは、Keyenceを使用して行った。
　hHOの免疫蛍光染色工程は前述の方法に従った。hHOを、4%PFA溶液を使用して室温で45～60分間かけて安定化し、続いて10% 正常ロバ血清(Abcam)、0.5% Triton X-100（ナカライテスク）、および0.5% BSA（ナカライテスク）を含む溶液中で、4℃で一晩インキュベートした。その後、1% 正常ロバ血清、0.5% Triton X-100および0.5% BSAを含むPBS混合物中で、一次抗体および二次抗体を用いてhHOを染色した。核染色を、マウンティング工程の前に、1:1000濃度でHoechst 33342を使用して行った。蛍光を使用した観察を、オリンパスFV3000共焦点レーザー走査顕微鏡で行った。一次抗体としては、抗心筋トロポニンT抗体（1:200、ab8295、Abcam）および抗TNNI3抗体（1:200、ab10231、Abcam）が挙げられる。二次抗体は次のとおりであった：ロバ抗マウスAlexa-Fluor 488抗体（1:200、A21202、Invitrogen）；ロバ抗ウサギAlexa-Fluor 594抗体（1:200、A21207、Invitrogen）、ロバ抗ヤギAlexa-Fluor 488抗体（1:200、A11055、Invitrogen）；およびロバ抗ヤギAlexa-Fluor 647抗体（1:200、A21447、Invitrogen）。
＜フローサイトメトリー解析／FACS＞
　Accutaseを使用して細胞を個々の細胞に分離し、2回洗浄し、4% PFAで15分間固定した。G0の静止細胞を同定するために、前述の方法に従って、Hoechst 33342およびPyronin Y染色を採用した。分析を、BD FACSDiva v6またはv8およびFlowJo v10を用いて行った。FSC/SSCゲーティングによって細胞群を認識し、二重細胞を排除した。未染色のサンプルまたはアイソタイプコントロールを使用してネガティブゲートを設定し、ポジティブゲートにネガティブからのシグナルがないことを確認した。
＜イムノブロッティング＞
　細胞をThermo Scientificから入手したM-PER Mammalian Protein Extraction Reagent buffer（78501）を使用して分解し、hHOを同じくThermo Scientificから入手したT-PER Tissue Protein Extraction Reagent（78510）で溶解した。BSAをリファレンスとして用いたブラッドフォードアッセイを使用して、タンパク質含有量を測定した。一次抗体は市販されており、実施例で用いた一次抗体として、抗ホスホ-S6リボソームタンパク質抗体（5364、CST）、抗ホスホ-4E-BP1抗体（2855、CST）、抗4E-BP1抗体（9644、CST）、抗ホスホAKT抗体（9271、CST）、抗β-アクチン抗体（A5441、Sigma）、抗WT1抗体（ab89901）、抗cTnI TNNI3抗体（ab10231）、抗SNAI1抗体（ab63371）、抗NBL1抗体（ab174843）、抗p53抗体（12790S、D963E、CST）、抗p16抗体（12D1、CST）、抗p21抗体（D7C1M、CST）、抗TBX18抗体（ab15262）、抗KI67抗体（Biolegend; 350502）および抗TNNI1抗体が挙げられる（すべて1:1000の希釈で用いた）。投与した二次抗体は、HRPを有するヤギ抗ウサギIgG抗体（sc-2054、Santa Cruz）およびHRPを有する抗マウスIgG抗体（7076、CST）であった（両方とも1:5000の希釈で用いた）。
＜画像の取得、処理、および分析＞
　顕微鏡からの画像をBZ-X710を使用してキャプチャし、キーエンスのBZ-X Analyzerソフトウェアで処理した。色の表示法は図のキャプションで指定されているとおりである。画像の選択部分を選択し、トリミングし、拡大して、位相コントラストと蛍光の詳細の両方を表示した。ウェスタンブロットのデータを、CytivaのImageQuant 800を使用して収集した。広範な画像評価を、Microsoft PowerPointおよびImageJバージョン1.52を使用して実施した。
＜バイオインフォマティクスおよびRNA-Seq＞
　本研究で行われたレトロスペクティブバイオインフォマティクス分析は、R2：ゲノム解析および可視化プラットフォーム（http://r2.amc.nl/）を使用して実施した。本実施例でレトロスペクティブ分析に使用した公的に利用可能なデータセットはGSE51483である。データの正規化にはNOISeqを使用した。本研究中に作成された処理済みのfastqファイル、および生のfastqファイルを、Gene Expression Omnibus（GEO）に保存した。遺伝子発現についてのより深い洞察を得るために、RStudioを使用して生データを分析した。遺伝子発現データの読み取り、探索、および前処理のため、BioconductorパッケージのNOISeqパイプラインを使用した。これは、RNA-Seqのデータおよび差次的発現解析に役立った。hclust、statsパッケージ、およびクラスターパッケージのagnesを使用して、階層クラスター樹状図を作成した。マンハッタン都市ブロック距離アルゴリズムによって距離を決定した。Kmeansの計算にはkmeans関数を使用した。fatoextraパッケージにより、get_distとfviz_distを使用して距離行列と相関行列を計算してプロットするツールが提供された。クラスター散布図を、fviz_cluster関数を使用して作成した。Rスクリプトを使用して、差次的に発現した遺伝子（DEG）の発現データをグループ化してヒートマップを描画した。遺伝子機能プロファイルとGO用語クラスターの統計解析と視覚化のために、DOSEとclusterProfilerを使用した。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）を採用して、上流経路を設計し、経路活動の傾向を識別した。コードダイアグラムを、GOPlotを使用して作成した。
＜定量的RT-PCR＞
　製造元の説明書に従って、QIAzol（登録商標） Lysis Reagent（Qiagen）を使用してトータルRNAを抽出した。ReverTra Aceシステム（Toyobo BIOTECH）を使用して、1 μgのRNAをcDNAに変換した。StepOnePlusリアルタイムPCRシステムを採用し、Next SYBR（登録商標） qPCR Mix（Thunderbird）を使用して定量的RT-PCR（qPCR）を実行した。GAPDHは内部参照コントロールとして機能した。プライマーの配列を以下の表１に示す。
実施例１：mTORシグナル伝達経路の活性低下と心臓の生理学的成熟の関連性の検証
　ラパマイシン機構的標的（mechanistic target of rapamycin; mTOR）は、細胞の増殖と代謝の中心的な調節因子であり、組織の恒常性において重要な役割を果たしている。mTORシグナル伝達は、特にインスリン様成長因子1（IGF-1）経路と絡み合っている（Feng, Z. & Levine, A. J. Trends Cell Biol. 20, 427-434 (2010)；Floyd, S. et al. Mol. Biol. Cell 18, 3545-3555 (2007)；Schiaffino, S. & Mammucari, C. Skelet. Muscle 1, 4 (2011)）。IGF-1は、mTOR経路の活性化を促進し、これにより細胞増殖が促進され、発生および再生中の細胞アポトーシスが阻害され、組織内の全体的な細胞性が制御される。IGF-1経路を通じて細胞増殖と細胞死の間のバランスを制御することにより、mTORは、組織の完全性と機能を維持する。mTORシグナル伝達の減少は、成人期に組織の機能的成熟を開始するための基本的なトリガーに関連し得る。
　まず、マウスの心臓形成中のmTORシグナル伝達のダイナミクスを評価するために、公的に利用可能なトランスクリプトームデータを時間間隔で遡及的に分析して、心臓の成熟に関連する遺伝子発現の変化をモニタリングし（Li, X. et al. Genomics 46, 482-495 (2014)）、E121.5から始まるmTORシグナル伝達を徐々に不活性化するトランスクリプトームスイッチを確認した（図1a）。mTOR経路に関与する遺伝子、特に2つの主要なmTOR複合体である複合体1（C1）と複合体2（C2）（図1b）の組み立てに関与する遺伝子、すなわちMTOR、RPTORおよびRICTOR、の下方制御を調べるために実験を行った。これらの複合体は、経路が活性化したときに下流の標的をリン酸化する際に重要な役割を果たす。mTORC1は主に、リボソームタンパク質のS6キナーゼ（S6k）および真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）結合タンパク質1（4E-BP1）を介して、タンパク質合成、細胞増殖、およびオートファジーを制御する（Liu, G. Y. & Sabatini, D. M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 183-203 (2020)）。対照的に、mTORC2は主に、複合体1と結合したプロテインキナーゼB（Aktとしても知られる）のリン酸化を介して、細胞の生存および細胞骨格の組織化に関与している（図1b）（Sen, B. et al. J. Bone Miner. Res. (2014)）。
　心臓の成熟に向けた発生のスイッチを決定するために、異なる時間間隔で胎仔の心臓から得られたタンパク質のライセートにおけるmTORC1/2のリン酸化標的を調べた。E18では、より若いE12のカウンターパートと比較して、pAkt、pS6k、およびp4E-BP1レベルの有意な減少が観察されたが、これは、E12でのより増殖性の状態を示し、時間の経過とともにmTORの進行性の不活性化を確認するものであった。さらに、生後1週間（P7）では、細胞の静止に関連する重要な細胞周期阻害剤であるp27の上方制御が確認された（図1c）。p27レベルの増加は細胞周期の進行を停止させ、細胞を非分裂性でありながら代謝的に活性なG0期に維持し、過剰な細胞増殖を防ぎ、細胞が成体の機能と特殊化を獲得できるようにする。さらに、必須のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤の経時的な上方制御が観察されたが（図1d）、これは、成熟に向けた心臓の発生のトリガーの一部としての細胞静止との相関関係を示している。
　心外膜の成熟には、心臓成熟の不可欠な機序として同様の静止パターンが関与している可能性が高いという考えに基づいて、胎仔心臓において、ウィルムス腫瘍1（WT1）の発現によって定義される遊走能力を備えた増殖性のサブポピュレーションによる顕著な再生能力で知られる中皮の単層である心外膜を調べた(図1e)。この集団は、非心筋細胞の再生に寄与する。本実施例では、タイトジャンクションタンパク質であるZO-1の皮質分布を確認し、E12日目に心外膜特異的な転写因子であるWT1の発現を観察した（図1f）。しかし、E14日目には、WT1の発現の減少が認められ、これより一次胎仔心外膜ネットワークの低下が示唆された。WT1発現のこの減少は、成熟プログラムの漸進的な開始を示す。
　心外膜に特有の状況における成熟をより深く理解するために、さまざまな発生段階からの過度に増殖した心外膜外植片に関する実験を行った（図1g）。新生仔期まで発現とタンパク質の動態を経時的にモニタリングした。本発明者らの発見により、時間の経過とともに胎仔マーカーが徐々に減少することが確認された（図1h）。さらに、心外膜の成熟の獲得がmTORシグナル伝達の低下と相関していることが観察されたが（図1i）、これは、成体期における静止および組織恒常性への移行を示唆している。
実施例２：胚発生中のmTORの化学的阻害によるin vivoでの心外膜の成熟への影響の検証
　実施例１で観察された生理学的意味を解明するために、異所的な成熟刺激に曝された場合のE12心臓の応答を調べた。mTORシグナル伝達を完全に阻害するために、mTORによって制御される広範囲の細胞活動を遮断できるmTORキナーゼ阻害剤（mTORKi）であるTorin1の影響を調べた。Torin1は両方のmTOR複合体のATP結合ポケットと相互作用する（Liu, Q. et al. J. Med. Chem. 53, 7146-7155 (2010)）ため、mTORC1およびmTORC2の機能を阻害し得る。新たに単離した心臓を入手し、細胞生存率と長期にわたる持続的な心臓収縮を保証する化学的条件を使用して、足場非依存性の条件下で心臓を培養した。有効性と細胞の安全性のバランスをとる最適な用量を決定するために、マウス心外膜細胞に対する阻害剤の阻害能力を測定した。樹立されたマウス心外膜細胞株（MEC1）の単層を使用して、Torin1のIC50を定義した。IC50から、Torin1が60 nMの濃度で96時間以内に細胞増殖の50%を阻害できることを明らかとなった（図2a）。
　続いて、濃度200 nmol/LでのTorin1への24時間の短期間の急性曝露によるmTOR阻害を分析することを選択した。この条件は、hiPSC由来の心筋細胞の成熟特性を強化することが以前に証明されたものである。結果から、Torin1の単回投与により、細胞死が観察されることなく、マウス心外膜におけるWT1のタンパク質発現を大幅に減少させることができることが確認された（図3a）。これは、mTOR経路の阻害が、心外膜の成熟を改善し、その胎生計画（embryonic scheme）を停止させるために不可欠な発生の移行を促進できることを補強するものである。
　マウス胎仔の心臓においてTorin1によって誘導される成熟の程度を確認するために、E12ステージとE14ステージの両方からマウス心臓に対するTorin1の影響を体系的に評価し、対比した。未処理の心臓における最初の結果では、マーカーであるWT1、ホスホ-AKT、およびホスホ-S6Kが、E14と比較してE12でより大きな発現を示すことが確認された（図3b）。Torin1処理後、WT1レベルは著しく減少した。同時に、心筋トロポニンIの成体アイソフォームであるTNNI3が大幅に増加し、心外膜と心筋の両方において成熟の指標の同期の開始（synced onset）が加速されたことを示唆している（図3b）。
　バルクの心臓組織では心外膜マーカーの提示が不足している可能性を考慮して、心外膜外植片を再度増殖させ、初代培養における心外膜の成熟に焦点を当てた。7日間の処理期間後、WT1および他のmTOR下流標的の一貫した減少が認められ、細胞および組織の成熟に寄与するmTOR下方制御の特異性がさらに確認された（図3c）。Torin1を処理した心外膜外植片では、心臓TNNI1痕跡の不存在と、マウス心外膜成熟中にWt1を介したBmp4シグナル伝達経路に対抗することが認識される成熟マーカーであるNBL1タンパク質の存在の増強も示された（図3c）。
　次に、心外膜外植片培養をSB431542の存在下で1週間延長した。このALK5阻害剤は、TGF-βシグナル伝達経路の自発的な活性化とそれに続く上皮間葉転換（epithelial-to-mesenchymal transition; EMT）を防ぐ。その結果より、Torin1で処理したサンプルでは増殖および心外膜の成長が低下を示すことが明らかとなった。特に、顕著な形態学的変化は観察されなかった。これは、成熟した心外膜の特徴である細胞の遊走能力が損なわれていることを示唆している（図3d）。
　トランスクリプトームレベルで心外膜の成熟におけるmTOR抑制の役割の程度を理解するために、Torin1で処理した心外膜外植片をRNAシーケンシングに供した。主成分分析により、主成分（PC1）が変動の98.72%を占めていることが明らかになり、Torin1が心外膜のバイオロジーに大きな影響を与えていることが強調されている（図3e）。包括的な遺伝子発現解析により、条件全体で有意な差次的発現を示す898個の遺伝子が明らかとなった（図3f）。注目すべきことに、PANTHERベースの（Mi, H. et al. Nucleic Acids Res. 49, D394-D403 (2021)）生物学的プロセスのエンリッチメント研究では、心筋細胞の分化およびBMPシグナル伝達経路の制御など、心臓の発生にとって極めて重要なTorin1の影響を受けるプロセスが同定され、心外膜と心筋の両方の成熟におけるそれらの役割が強調されている（図3g）。PANTHERを使用したその後の経路解析では、心外膜バイオロジーに役立つカドヘリン、Wnt、およびTGF-βシグナル伝達経路（Dronkers, E., Wauters, M. M. M., Goumans, M. J. & Smits, A. M. Biomolecules 10, 404 (2020)）を強調し、いくつかの心臓形成関連経路の重要性が再確認された（図3h）。また、MEC1の単層におけるPC1のTorin1により駆動された変動も確認した（図2b）。
　最後に、Wt1、Tbx18、Raldh1a2などの胎仔心外膜遺伝子のmRNAレベルの低下を観察した（図3i）。さらに、MKi67レベルの低下は、EMT能力の抑制とともにMEC1でもさらに確認された指標である（図2c～e）、細胞増殖の停止を示した（図3i）。心筋細胞の残存痕跡は、マウス心筋細胞成熟度のマーカーである、Tnni3およびMyh6のレベルが大幅な増加を示したため確認された（図3j）。以上から、本発明者らのデータは、心外膜層と心筋層の両方で実証されているように、Torin1を介したmTORC1/2の同時阻害が胎仔の心臓の成熟を引き起こすのに優れていることを示唆している。Hes1およびRb1のmRNA発現の増強もまた、誘導された増殖停止とそれに続く心外膜静止の仮説を裏付けている（図3k）。
実施例３：mTORC1/2の二重阻害による、hiPSC由来心外膜における心外膜の静止および成熟への影響の検証
　ヒト胎児性心外膜の成熟における細胞静止の寄与を完全に理解するために、ヒト人工多能性幹細胞に由来する心外膜を使用し、それらを操作してmTOR経路の完全阻害を介した細胞周期離脱（cell cycle withdrawal）の影響を体系的に研究した。
　最初に、hiPSCから心外膜様（epicardial-like; EPI）細胞を分化させた（非特許文献５）(図4a）。アクチビンAおよびBMP4を使用して心臓中胚葉を形成させ（1～3/4日目）、その後、WNTシグナル伝達を活性化することによって心外膜運命を決定した（3/4～6日目）。心外膜の特徴を維持し、自発的な分化をせずに長期間のEPI細胞培養を可能にするために、3/4日目からTGF-βシグナル伝達を阻害した（SB431542）。一貫してhiPSC株409B2からEPI細胞を分化させたが、この細胞は24日目に典型的な敷石様の（cobblestone-like）形態を示し（図4b）、分化の間WT1、TBX18、およびALDH1A2を上方制御した（図4c）。24日目に、EPI細胞は核のWT1を発現したが、これはフローサイトメトリーおよびZO1との免疫蛍光共染色により確認された（図4d、e）。次に、心外膜静止を引き起こすため、Torin1の効果と、mTORC1およびmTORC2を二重に阻害して完全な細胞周期の離脱を促進するその能力を評価した（図5a）。まず、MTTアッセイを使用して、さまざまな用量レベルでのTorin1の細胞毒性効果をin vitroで96時間にわたって評価した（図6a）。細胞毒性を評価するこれらの手順の改良ステップの結果に従い（図6b）、細胞を200 nmol/L Torin1で7日間処理した。この処理は、分化の24日目のピークのWT1タンパク質レベルの検証後に開始した。
　分化した心外膜細胞に投与すると、Torin1処理（図5a）により、S6KおよびAktの両方のリン酸化レベルが顕著に減少した(図5b)。これは、心外膜構造を維持しながら、mTORC1（S6K）およびmTORC2（Akt）の両方に対するその効果を強調するものである（図5c）。Torin1で処理した細胞は、細胞増殖を急速に停止させたが（図5d）、増殖停止はヒト成人心外膜の主要な表現型の1つであり、マウスのカウンターパートでも同様の観察が認められる。次に、Torin1での処理により、心外膜の形態を維持しながら核のWT1およびTBX18レベルが効果的に低下し、ZO-1発現によって表されるタイトジャンクションが保持されることを検証した（図5e）。心外膜細胞におけるmTOR経路の阻害による増殖タンパク質Ki67の顕著な減少（図5f）、およびEMTマーカーであるSNAI1の不活性化の保持（図7a）が観察された。さらに、有糸分裂（M）期における凝縮した染色体を染色するホスホヒストンH3（pH3）が、有糸分裂指数を正確に測定するためのより正確な指標であることを発見し、Torin-1の心外膜細胞における増殖速度の規則的な低下を確認した(図5g)。
　老化の表現型と静止の表現型を区別するために、老化細胞に対する特異性のため、β-ガラクトシダーゼ（β-gal）アッセイを行った。その定量的な性質により、mTOR経路の完全な阻害による老化運命のダイナミクスをモニタリングすることが可能となる。Torin1で処理した心外膜は、β-gal+ 細胞を有意に減少させたが（図5h、図8a、b）、これは、mTORC1およびmTORC2の二重阻害が心外膜を老化の表現型から遠ざけ得ることを示唆しており、また、SASP関連遺伝子であるIL-8およびSPP1の発現低下によっても確認された（図8c）。p16、HES1、Rb1、p53を含む細胞静止に関連するマーカーの発現増加傾向が観察されている間、細胞増殖に関連するマーカー（MKI67、CCNA1、CCNB1、およびE2F1）の転写が有意に減少することを確かめた（図5i）。
　iPS細胞の起源と培養条件におけるドナー特異的またはプロトコル特異的な違いから生じる変動の可能性を排除するために、確立された心外膜のGiWiGi プロトコル（Witty, A. D. et al. Nat. Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014)）に従い、1390C1株のフィーダーフリーコロニーから得られた心外膜単層を使用して、主要な所見を検証した（図9a）。さらに、Torin1がWT1タンパク質の発現を効果的に減少させることを実証することで、最初の観察を裏付け、以前のタンパク質分析を補強した（図9b）。
　静止レベルをさらに調べるために、ピロニンY染色を利用した。ピロニンY染色は、細胞内のRNA内容物を選択的に染色できるため、G0期の細胞を検出するための信頼できる方法であることが証明されている（Eddaoudi, A., Canning, S. L. & Kato, I. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 1686, 49-57 (2018)）。G0期の細胞は、活発に細胞周期をまわしている細胞に比べてRNA合成が低下することを示すため、この技術をHoechst 33342またはヨウ化プロピジウム染色と組み合わせて、DNA内容物を同時に標識し、細胞周期のさまざまなフェーズで異なる細胞集団を識別できるようにした。FACSダイナミクスで実証されるように、Torin1による心外膜細胞の処理は、細胞周期からの実質的な離脱をもたらした（図5j）。この離脱は、G1細胞が75.9%から1.83%へと減少すると共に、静止（G0）細胞数が14.2%から82.5%へと大幅に増加することによって証明された（図5k）。
　iPSC由来の心外膜に対するTorin1の転写の影響を調べるために、Torin1で処理した細胞の詳細なRNAシーケンシング分析（Lucena-Cacace, A. & Yoshida, Y. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 2320, 219-232 (2021)）を実施した。マウス心外膜におけるmTOR阻害に関する以前の観察と一致して、Torin1はhiPSC由来の心外膜のトランスクリプトーム状況を大きく変化させ、主成分1（PC1）がPCAの変動の99.5％を占めた（図10a）。分析により、特にTorin1の処理が寄与する、差次的に発現する379個の遺伝子が検出された（図10b）。ZO-1タンパク質の責任遺伝子であるTJP1発現はTorin1処理後も影響を受けなかったが、胎児心外膜遺伝子であるWT1、TBX18、およびALDH1A2の有意な減少を確認した（図10c）。この下方制御は、MKI67 mRNAレベルの顕著な減少と同時に発生し、タンパク質分析と一致した。さらに、上皮間葉転換（EMT）を駆動する遺伝子は、心外膜の発生に関連するカドヘリンであるCDH18と同様に（図10d）、有意な下方制御を示した（図10d）。RB1およびHES1の転写の上昇により、静止状態のトランスクリプトームの特徴が再確認された（Sang, L., Coller, H. A. & Roberts, J. M. Science 321, 1095-1100 (2008)；Harris, L. & Guillemot, F. Genes Dev. 33, 479-481 (2019)；Sueda, R. & Kageyama, R. Dev. Growth Differ. 62, 59-66 (2020)）（図10e）。より広い意味で、本研究で得られたRNA-seqを、ヒト成人心外膜一次サンプルを含むデータセットであるGSE84085（Bao, X. et al. Nat. Biomed. Eng. 1, 0003 (2016)）と並べた。ヒートマップの比較により、成人心外膜とTorin1で処理された、iPSCから人工的に得られた心外膜が、全体的に静止した、成熟したヒト心外膜と一致する包括的な特徴を示すことが強調された（図10f）。
実施例４：hiPSC由来の心外膜の静止と成熟を促進する因子の探索
　mTORは、２種類のユニークなマルチタンパク質複合体であるmTORC1およびmTORC2の中心キナーゼとして機能する。これらの複合体は、構成タンパク質と薬物のラパマイシンに対する感受性が異なる。具体的には、mTORC1にはraptorが一次サブユニットとして組み込まれているのに対し、rictorがmTORC2には不可欠である。mTORC1の活性はラパマイシンによって迅速に抑制されるが、mTORC2は短期間のラパマイシン曝露中にほとんど影響を受けない。心外膜の成熟におけるこれらのmTOR複合体の役割を決定するため、ヒト人工多能性幹細胞由来の心外膜細胞を、両方のmTOR複合体を阻害する、ラパマイシンまたはTorin1に曝した。結果から、ラパマイシンは心外膜細胞の増殖を阻止しないことが示されが、これはおそらくホスホAKTの残留活性による、静止状態の獲得の失敗を示唆している（図11a）。これは、mTORC1ではなくmTORC2が心外膜の成熟と静止において極めて重要な役割を果たしていることを示唆している。
　一般にFK506として知られるタクロリムス（Dumont, F. J. Curr. Med. Chem. 7, 731-748 (2000)）は、主に固形臓器移植用の免疫抑制剤として使用される（Wallemacq, P. E. & Reding, R. Clin. Chem. 39, 2219-2228 (1993)）。その主な作用機序はカルシニューリン阻害剤あるが、タクロリムスとラパマイシンの両方がFKBP12に結合し、心外膜の成熟表現型に影響を与え得ることは注目に値する。しかし、タクロリムス処理もまた心外膜増殖を減少させることはできず（図11a）、これはカルシニューリンまたはmTORC1単独の阻害ではhiPSC由来の心外膜細胞の心外膜成熟を促進するには不十分であることを示唆している。
　次に、各処理が主成分分析(PCA)のダイナミクスにどのような影響を与えるかを調べた。ラパマイシンとタクロリムスの両方は、部分的な心外膜の成熟を示し得るトランスクリプトームの変動を誘導した。しかし、Torin1は、すべての化合物の中で、Y軸上で最も顕著な偏差を示した。ラパマイシンとTorin1との間のこの顕著な差異は、mTORC2阻害の影響を強調しており、Torin1が包括的な成熟表現型を誘導することを示唆している（図12a）。Torin1処理によってユニークに変化した66個の転写因子（TF）を特定し、それらをmTORC2応答性転写因子（mTORC2-TF）と名付けた。対照的に、ラパマイシンの効果を比較する場合、これらをmTORC1応答性TF（mTORC1-TF）として分類した。多能性幹細胞（PSC）に由来する胎児心外膜と成人心外膜との比較トランスクリプトーム解析により、発現の異なる104個のTFが明らかになり、これらを成熟した心外膜TFとして標識した。注目すべきことに、これらのうち、24個のTFがTorin1応答性エレメント内に存在した（図12b）。
　次に、胎児の心外膜（GSE84085）と比較して、成熟した心外膜において発現倍率の変化が少なくとも2倍高い転写因子のみを含むようにリストを改良した。これにより、リストを、MAFF、RELB、MAFG、HIVEP2、およびYBX3の5つの転写因子に絞り込んだ（図12c）。
　この5つの因子のうち、MAFF（Brundage, M. E. et al. Oncogene 33, 5626-5636 (2014)）およびYBX3（Cooke, A. et al. Cell Rep. 27, 3097-3106.e5 (2019)）はPI3K/Akt/mTOR軸の調節シグナル伝達における機能を説明しており、それらを次の実験で使用した。心外膜成熟の過程におけるMAFFおよびYBX3の個々の活性化の因果関係および生物学的関連性を実証するために、低分子干渉RNA（siRNA）の発現によって達成されるMAFFとYBX3を異所的に下方制御する（それぞれsiMAFFおよびsiYBX3）、心外膜細胞におけるTorin1処理の効果を体系的に調査した（図12d）。
　各遺伝子の選択的な下方制御を個別に検証したところ、Torin1処理がそれらの発現を促進しないことが確認された（図12e）。次に、2つの胎児の心外膜マーカーであるWT1およびTBX18、ならびに増殖性のマーカーであるMKi67の発現の評価に進んだ。興味深いことに、結果から、YBX3とMAFFが異なる方法で心外膜の成熟における役割を果たし得ることが確認された。（MKi67 mRNA発現によって証明されるように）MAFFの下方制御は心外膜細胞の増殖レベルを低下させなかったが、下方制御されたYBX3を有する細胞は、Torin1処理後の胎児の心外膜プログラムを終了させることができなかった。注目すべきことに、WT1タンパク質レベルは免疫細胞化学（ICC）において一貫したままであり、これは、YBX3がWT1、ひいては胚のプログラムの制御において極めて重要であることを示している（図12f）。最後に、ウェスタンブロットでTBX18（図12g）およびMKI67（図12h）のタンパク質レベルも検証し、さらにヒト心外膜の成熟におけるYBX3とMAFFの異なる役割を検証した。
実施例５：IGF2およびFN1を発現する成熟hiPSC由来の外膜のパラクライン効果の検証
　IGF2/IGF1Rのシグナル伝達はヒトの心臓形成において極めて重要な役割を果たす。げっ歯類モデルでは、心外膜のIGF2と筋細胞のIGF1Rとの相互作用が心筋圧縮の重要な触媒であることが特定されている（Meier, A. B. et al. Nat. Biotechnol. 1-14 (2023)）。さらに、最近の研究では、心外膜のフィブロネクチン（FN1）の分泌が3Dの人工組織における心臓の成熟の促進を駆動することが特定された（Ong, L. P. et al. Stem Cell Rep. 18, 936-951 (2023)）。エピカルディオイド（epicardioid）を用いた別の研究では、心筋と心外膜との相互作用を調べており、ヒトにおけるこの心筋圧縮プロセスがげっ歯動物のおけるそれを反映していることが明らかとなった（Meier, A. B. et al. Nat. Biotechnol. 1-14 (2023)）。
　成熟した人工心外膜が、IGF2およびFN1発現のパラクライン効果を潜在的に増幅し、hiPSC由来心筋細胞の安定化とその後の成熟および圧縮を促進し得るのではないかと考えた。これを調べるために、心室心筋細胞と心外膜細胞の分化を独立して開始した。心臓の分化のため、レポーターiPS細胞株（Miki, K. et al. Nat. Commun. 12, 3596 (2021)）を採用し、心筋トロポニンIの胎児アイソフォームから成人アイソフォームへの移行スイッチ、すなわち胎児の心外膜、新生児の心外膜、または成人の心外膜を区別できる重要な発生のスイッチ（Bedada, F. B. et al. Stem Cell Rep. 3, 594-605 (2014)）を監視した（図13a）。単層としての心外膜細胞の分化および成熟後、成熟した心外膜の存在下でのTNNI3の発現を観察するために、心室心筋細胞（TNNI1+）の拍動するEBの共培養に進んだ。
　これまでの研究では、hiPSC由来の心外膜細胞と心筋細胞とのさまざまな相互作用が概説されており、主に再生能力と心筋細胞の細胞周期の活性化における役割が強調されている（Bargehr, J. et al. Nat. Biotechnol. 37, 895-906 (2019)）。Torin1による処理後、心外膜細胞はIGF2およびFN1の顕著な過剰発現を示した（図13b）。特に、10日間の共培養期間により、TNNI3の発現増加とそれに対応するTNNI1の減少が明らかとなり、EBが成熟した心外膜細胞とパラクライン接触をしている間に構造的な成熟の特定の特徴を取り入れ始めたことを示唆している（図13c、d）。さらに、mRNA発現分析により、EBが成熟した心外膜細胞と共培養された場合、TBX5（Ross, S. B. et al. Hum. Genome Var. 7, 1-8 (2020)）、HEY2（Miao, L. et al. Sci. Rep. 8, 2678 (2018)）、PRDM16（Wu, T. et al. Circulation 145, 586-602 (2022)）、およびNPPA（Tian, X. et al. Nat. Commun. 8, 87 (2017)）などの左心室圧縮に重要な遺伝子の発現の増強を示すことが実証された（図13e）。以上より、これらの発見から、mTOR阻害が細胞自律的な方法で、そして成熟した心外膜によって媒介されるパラクラインIGF2およびFN1を介して外因的に心臓の成熟を促進できることが確認される。
実施例６：静止した心外膜を有する成熟したiPSC由来の心臓オルガノイドの作製
　心臓の発生をより厳密に反映する状況の中でmTOR阻害の有効性を評価するために、ヒトiPS細胞株由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイド(hHO)を作製した（Lewis-Israeli, Y. R. et al. Nat. Commun. 12, 5142 (2021)；Tian, Y. et al. Front. Cell Dev. Biol. 10, 1001453 (2022)）。このヒト心臓オルガノイドの心外膜および心筋の成熟に対するTorin1処理の効果を調べることを目的としていた。具体的には、複数の非自律的シグナル伝達経路が活性化する、複雑な多細胞環境におけるヒト心外膜の成熟プロセスを識別しようとした。3段階のWntシグナル伝達調節を利用して、以前に報告したように（Tian, Y. et al. Front. Cell Dev. Biol. 10, 1001453 (2022)）、フィーダーフリーのヒトiPS細胞株1390C1をhHOに分化させた（図14a）。6日目までに、これらのオルガノイドの80%～90%が拍動活動を示し、その後10日目までに100%に上昇した。15日目の時点で、hHOモデル内の多細胞組成と血管新生の程度の分析を行った。
　免疫細胞化学（ICC）により、さまざまな細胞集団が同定された。先行研究（Tian, Y. et al. Front. Cell Dev. Biol. 10, 1001453 (2022)）で本発明者らが特徴づけた通り、TNNT2+集団は拍動する心筋細胞に相当し、WT1+細胞はヒト心外膜を示し、CD31+細胞は内皮を示し、NFATC1+は心内膜細胞であり、VIM+は心臓線維芽細胞集団を強調する。以前の発見と一致して、異なる分化バッチ間の細胞組成比の差異が最小限であることに注目した。続いて、MTTアッセイを使用して、96時間のin vitro期間にわたるさまざまなTorin1用量に関連する心臓の細胞毒性プロファイルを特徴づけた。ヒト心臓由来のオルガノイドは、単層のヒト心外膜細胞に匹敵するTorin1に対する耐性を示し、2.51 μMのIC50値を示した（図14b）。
　従って、さらなる研究のために200 nmol/Lの濃度、IC50未満の用量、を使用し続けることを決め、hiPSC由来の心外膜単層における心外膜静止および成熟の促進に最適な効果を有することを証明した。生育15日目のhHOにTorin1を7日間投与した後、22日目には全体の細胞密度に対して顕著な効果が認められた。未処理のオルガノイドは一貫してサイズが拡大したが、Torin1で処理したオルガノイドは成長の停止を示した（図14c）。これは、Torin1がオルガノイドの形態に変化を引き起こすことなく、3D環境においても静止を誘導できることを示している（図14d）。
　ヒト心臓オルガノイドに対するmTOR阻害の影響をより包括的に理解するために、Torin1処理の前にまず次の2つの条件を確認した。（1）WT1陽性細胞はTNNT2陽性細胞に近接しており、独立して異なる細胞アイデンティティを維持している（図14e）。（2）EMTは、発達中のオルガノイドの固有の成長ダイナミクスにより、SNAI1を介して活発に作動する（図14f）。これらの観察から、心外膜細胞がEPDCへの活発な分化過程にあり、心臓オルガノイドの細胞集団の増強に寄与していることが示唆される。次に、WT1陽性細胞は継続的な自己複製状態にあり、EMTを受けていると想定される。その結果、オルガノイド全体にわたるWT1の分布は静的ではなく、動的であり変動する発現パターンを示す。Torin1処理後、WT1の発現の減少が観察されたが、TNNT2集団は影響を受けなかった（図14g、図11b）。これより、心外膜が効果的に成熟し得ることが示唆され、この発見はマウス心臓における本発明者らのin vivo観察、およびhiPSC由来の心外膜単層のin vitro成熟と一致する。
　オルガノイドの成熟に関連するmTORC2依存的な表現型をより厳密に検証するために、成長する心臓オルガノイドに対するタクロリムスおよびラパマイシンの影響を体系的に評価した。注目すべきことに、結果から、これらの化合物の中では、Torin1が依然として心外膜のWT1のタンパク質レベルを低下させることができる唯一の化合物であることが実証され（図14h）、mTORC1の阻害が成熟効果を引き起こすには依然として不十分であることが確認された。さらに、hiPSC由来の心筋細胞における以前の研究で確認されたように、Torin1が成人の心筋トロポニンタンパク質（TNNI3）の発現を有意に増強することが確認され（図14h）、したがって、心外膜と心筋を含む、完全なmTOR阻害が全体的な心臓の成熟において極めて重要な役割を果たし得ることが示唆された。
　最後に、観察されたSNAI1レベルの低下を通じてEMTプログラムの抑制のmTORC2依存性も検証し（図14i、図11c）、EMT開始能力が喪失すること、およびこの成熟様心臓オルガノイドが成人のカウンターパートにより類似していることが確認された。要約すると、hiPSC由来の心外膜の成熟を目的とした薬理学的アプローチにより、成体心筋細胞および心外膜細胞のマーカーを発現する成熟したヒトiPSC由来の心臓オルガノイドの作製における有効性が実証された。これは、成人の心外膜の再活性化を調査するためのプラットフォームを確立するための基礎を築き、再生反応におけるその基本的な役割についての洞察を提供する。
　本発明によれば、未熟な心外膜細胞から、成熟した心外膜細胞を製造することができる新規な方法が提供される。かかる方法により製造された心外膜細胞は、成体の心外膜細胞に類似した細胞であり、成人レベルの二次元および三次元の心臓細胞モデル、創薬スクリーニング、再生医療などに利用することができる。また、心筋細胞の成熟を促進する効果も有し得るため、心筋細胞の成熟方法にも用いることができる。
　　本出願は、日本で出願された特願２０２４－０１７１６６（出願日：２０２４年２月７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (11)

  1. 　心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、成熟した心外膜細胞を製造する方法。
  2. 　培地がmTORC1阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　mTORC2阻害剤の少なくとも１つがTorin1である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　成熟した心外膜細胞がWT1および／またはTBX18を発現しない細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　心外膜細胞が多能性幹細胞に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　心外膜細胞が心臓オルガノイドに含まれるものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で得られる成熟した心外膜細胞または該細胞を含む心臓オルガノイド。
  8. 　請求項７に記載の成熟した心外膜細胞または心臓オルガノイドを含む、移植療法剤。
  9. 　請求項７に記載の成熟した心外膜細胞または心臓オルガノイドと、心筋細胞とを共培養する工程を含む、成熟した心筋細胞の製造方法。
  10. 　心筋細胞が細胞凝集体に含まれるものである、請求項９に記載の方法。
  11. 　心外膜細胞を、mTORC2阻害剤を含む培地中で培養する工程を含む、心外膜細胞の成熟方法。
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