WO2025130862A1 - 一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途 - Google Patents

一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途 Download PDF

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WO2025130862A1
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hypertension
double
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modified nucleotides
conjugate
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舒志愚
左应林
池伟林
邹致富
徐鸿桂
陈慧梦
李静
汪璞
曾亮
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Sunshine Lake Pharma Co Ltd
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Sunshine Lake Pharma Co Ltd
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • the renin-angiotensin-aldosterone system plays a key role in blood pressure regulation.
  • the RAAS cascade begins with the secretion of renin into the circulation by the juxtaglomerular cells of the kidney. Renin secretion is stimulated by several factors, including Na+ load in the distal tubule, ⁇ -sympathetic stimulation, and/or reduced renal perfusion.
  • Active renin in plasma cleaves angiotensinogen (produced by the liver) into angiotensin I, which is subsequently converted to angiotensin II by circulating and locally expressed angiotensin-converting enzyme (ACE).
  • ACE angiotensin-converting enzyme
  • AT1R angiotensin II type 1 receptor
  • AT1R stimulation leads to aldosterone release, which subsequently promotes Na+ and K+ excretion in the distal tubules of the kidney.
  • Angiotensinogen is the common precursor of all angiotensins.
  • the liver is the main source of blood AGT.
  • AGT Angiotensinogen
  • Many studies have confirmed that increased blood AGT concentration is significantly positively correlated with hypertension. Reducing blood AGT concentration can inhibit the activity of the RAAS pathway and lead to a decrease in blood pressure.
  • Intravenous infusion of AGT to rats can increase blood pressure, which can be reversed by anti-AGT antibody treatment.
  • AGT-knockout mice have lower blood pressure, while AGT-overexpression leads to increased blood pressure. Treating hypertension by regulating AGT levels is a promising research and development target, but targeting AGT using traditional methods encounters many difficulties.
  • the present invention provides a double-stranded siRNA, its conjugate or salt, which comprises a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, the sense strand comprising one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:90 (i.e., one of the sense strands in Table 1 of the present invention), or a nucleotide sequence having a difference of no more than 5 nucleotides therefrom; wherein, the detailed information of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:90 is shown in Table 1 of the present invention specification.
  • the antisense strand comprises one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:91 to SEQ ID NO:180 (i.e., one of the antisense strands in Table 1 of the present invention), or a nucleotide sequence having no more than 5 nucleotide differences therefrom;
  • the double-stranded siRNA is a modified double-stranded siRNA.
  • the sense strand and/or antisense strand comprises a 3' overhang and/or a 5' overhang, and the 3' overhang or 5' overhang comprises 1, 2 or 3 nucleotides.
  • the double-stranded siRNA, its conjugate or salt described in the present invention comprises one of the double-stranded siRNAs shown in siRNA ID NO:1 to siRNA ID NO:90, wherein the information of the double-stranded siRNA shown in siRNA ID NO:1 to siRNA ID NO:90 is detailed in Table 1 of the specification of the present invention.
  • the sense strand and/or the antisense strand comprises at least one modified nucleotide, and the modified nucleotide is independently selected from at least one of the following:
  • Nucleotides of non-natural bases deoxynucleotides, 2'-fluoro modified nucleotides, 2'-amino modified nucleotides, 2'-O-allyl modified nucleotides, 2'-alkyl modified nucleotides, 2'-O-alkyl modified nucleotides (such as 2'-methoxy modified nucleotides), 2'-methoxyethyl modified nucleotides, locked nucleotides (LNA), unlocked nucleic acid modified nucleotides (UNA), 2'-allyl modified nucleotides, abasic nucleotides, morpholino modified nucleotides, tetrahydropyran modified nucleotides, cyclohexenyl modified nucleotides, PEG modified nucleotides, 5'-phosphoramidate modified nucleotides, thiophosphate linked modified nucleotides (such as: 5'-thiophosphate
  • InvAb also referred to as InvB in the present invention
  • GAA glycol nucleic acid
  • 2'-fluoro-modified nucleotide refers to a nucleotide in which the 2-position of ribose is substituted by fluorine
  • a 2'-methoxy-modified nucleotide refers to a nucleotide in which the 2-position of ribose is substituted by methoxy.
  • the sense strand and/or the antisense strand comprises at least one modified nucleotide, and the modified nucleotide is independently selected from at least one of the following:
  • the modified nucleotides are each independently present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the sense strand and the 5' end of the sense strand are the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th, 20th and 21st positions of the starting point.
  • the modified nucleotide of the present invention is present at the 5' end or 3' end of the sense strand, the modified nucleotide is linked to the 5' end or 3' end of the sense strand via a phosphorothioate or phosphate group.
  • the modified nucleotides are each independently present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the antisense strand and the 5' end of the antisense strand are the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th, 20th, 21st, 22nd and 23rd positions of the starting point.
  • the modified nucleotide of the present invention is present at the 5' end or 3' end of the antisense strand
  • the modified nucleotide is linked to the 5' end or 3' end of the antisense strand via a phosphorothioate or phosphate group.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the sense strand are between positions 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11, 11-12, 12-13, 13-14, 14-15, 15-16, 16-17, 17-18, 18-19, 19-20 and 20-21 of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the antisense strand are positions 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11, 11-12, 12-13, 13-14, 14-15, 15-16, 16-17, 17-18, between 18-19, 19-20, 20-21, 21-22 and between 22-23 of the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotide, the 2'-methoxy modified nucleotide and Y are each independently and optionally present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the sense strand are the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th, 20th and 21st nucleotides from the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotide, the 2'-methoxy modified nucleotide and Y are each independently and optionally present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the antisense strand are the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th, 20th, 21st, 22nd and 23rd positions of the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotide is present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the sense strand are the 5th, 7th, 8th, 9th, 10th and 11th nucleotides of the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotides are present at the 9th, 10th and 11th nucleotides starting from the 5'-terminal nucleotide of the sense strand, and optionally also at the 5th nucleotide.
  • the 2'-fluoro modified nucleotide is present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the antisense strand are the 2nd, 6th, 8th, 9th, 12th, 14th and 16th nucleotides of the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotides are present at the 2nd, 6th, 14th and 16th nucleotides starting from the 5'-terminal nucleotide of the antisense strand.
  • one or more positions are selected from the following:
  • the 2'-deoxy modified nucleotides are present at the 2nd, 5th, 7th, 10th, 12th and 14th positions of the 5'-terminal nucleotide of the antisense strand as the starting point.
  • the 2'-deoxy modified nucleotides are present at the 2nd, 5th, 7th, 12th and 14th positions of the 5'-terminal nucleotide of the antisense strand as the starting point.
  • the InvAb is modified to be connected to the 5' end or 3' end of the sense strand through a phosphorothioate group or a phosphate group.
  • the 5'-phosphorothioate group connection modification or the 3'-phosphorothioate group connection modification is each independently present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the sense strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently and optionally present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the positive strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the antisense strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the antisense strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • one or more positions in “each independently optionally exists in one or more positions selected from the following” or “each independently exists in one or more positions selected from the following” described in the present invention refers to the presence of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 modifications, wherein “optionally” means that the modification may be possible or there may be no modification, that is, 0 modification.
  • the double-stranded siRNA comprises at least one Y, wherein Y is
  • the sense chain described in the present invention comprises one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:181 to SEQ ID NO:212 (i.e., one of the sense chains in Table 1-A of the present invention), and the length of the sense chain does not exceed 21 nucleotides, wherein the detailed information of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:181 to SEQ ID NO:212 is shown in Table 1-A of the present invention.
  • the antisense chain includes one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:214 to SEQ ID NO:224 (i.e., one of the antisense chains in Table 1-A of the present invention), and the length of the antisense chain does not exceed 23 nucleotides; wherein, the detailed information of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:214 to SEQ ID NO:224 can be found in Table 1-A of the specification of the present invention.
  • the double-stranded siRNA, its conjugate or salt described in the present invention comprises one of the double-stranded siRNAs shown in siRNA ID NO: 91 to siRNA ID NO: 126; wherein the length of the sense strand does not exceed 21 nucleotides, and the length of the antisense strand does not exceed 23 nucleotides.
  • the detailed information of the double-stranded siRNA shown in siRNA ID NO: 91 to siRNA ID NO: 126 is shown in Table 1-A of the specification of the present invention.
  • the double-stranded region is 17-23 nucleotide pairs in length.
  • the siRNA, siRNA conjugate or siRNA conjugate salt comprises one of the following double-stranded nucleotide sequences:
  • the double-stranded siRNA conjugate in the double-stranded siRNA conjugate, is conjugated to a conjugation group.
  • the 3' end of the sense strand of the double-stranded siRNA is conjugated to the conjugate.
  • the 3' end or 5' end of the sense strand of the double-stranded siRNA is conjugated to the conjugation group through a phosphate group, a thiophosphate group or a phosphate group.
  • the conjugated group includes GalNAc or its derivatives.
  • the conjugated group is GalNAc or its derivative connected by a divalent, trivalent or tetravalent branched linker.
  • the conjugated group is DAW40007-4, L-96 or a stereoisomer thereof, wherein the structures of the conjugated groups DAW40007-4 and L-96 are respectively:
  • the double-stranded siRNA or its conjugate or salt described in the present invention further includes (R)- and (S)-enantiomers, diastereomers, and/or racemic mixtures thereof.
  • the phosphorothioate portion of the double-stranded siRNA or its conjugate includes (R)- and (S)-enantiomers, diastereomers, and/or racemic mixtures thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the double-stranded siRNA, its conjugate or salt thereof, double-stranded siRNA conjugate or salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier according to the present invention.
  • the present invention provides use of the double-stranded siRNA conjugate, its conjugate and its salt, and the pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of a drug for treating and/or preventing AGT-related diseases.
  • the AGT-related disease is hypertension.
  • the hypertension is selected from critical hypertension, essential hypertension, secondary hypertension, hypertensive crisis, hypertensive emergency state, isolated systolic and diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension, diabetic hypertension, resistant hypertension, refractory hypertension, paroxysmal hypertension, renovascular hypertension, Goldblatt's hypertension, pulmonary hypertension, portal hypertension, systemic venous hypertension, systolic hypertension and unstable hypertension.
  • small interfering RNA is a double-stranded RNA of 17 to 30 nucleotides in length, comprising a sense strand and an antisense strand.
  • siRNA mediates the targeted cleavage of RNA transcripts in the RISC pathway by forming a silencing complex (RISC).
  • RISC silencing complex
  • siRNA guides the specific degradation of mRNA sequences through the known RNA interference (RNAi) process, inhibiting the translation of mRNA into amino acids and proteins.
  • the sense strand and the antisense strand typically form a double-stranded siRNA ("dsRNA”), also referred to as an "RNAi agent" in the present invention.
  • dsRNA double-stranded siRNA
  • the double-stranded region of an RNAi agent can be 12-30 nucleotide pairs long.
  • the duplex region can be 14-30 nucleotide pairs long, 17-30 nucleotide pairs long, 27-30 nucleotide pairs long, 17-23 nucleotide pairs long, 17-21 nucleotide pairs long, 17-19 nucleotide pairs long, 19-25 nucleotide pairs long, 19-23 nucleotide pairs long, 19-21 nucleotide pairs long, 21-25 nucleotide pairs long or 21-23 nucleotide pairs long.
  • the duplex region is selected from 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 and 27 nucleotides long.
  • RNAi agent RNA agent
  • RNA interfering agent RNA agents as defined herein and mediate targeted cleavage of RNA transcripts through the RNA induced silencing complex (RISC) pathway.
  • RISC RNA induced silencing complex
  • iRNAs direct sequence-specific degradation of mRNAs through a process known as RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • iRNAs modulate, e.g., inhibit, expression of AGT in a cell, such as a cell of a subject, such as a mammalian subject.
  • the term “antisense strand (or guide strand)” includes a region that is substantially complementary to a target sequence.
  • Sense strand (or follower strand) refers to an RNAi strand that is substantially complementary to the antisense strand.
  • substantially complementary refers to complete complementarity or at least partial complementarity, for example, the antisense strand is completely complementary to the target sequence or at least partially complementary.
  • mismatches can exist in the interior or terminal regions of the molecule, wherein the most tolerated mismatches exist in the terminal regions, for example, within 5, 4, 3 or 2 nucleotides at the 5'- and/or 3'-end of the RNAi.
  • the antisense strand is substantially complementary to the mRNA
  • the antisense strand has a polynucleotide that is substantially complementary to a continuous portion of the mRNA of interest.
  • nucleotide overhang refers to at least one unpaired nucleotide that overhangs from the duplex structure of an iRNA (e.g., dsRNA).
  • a nucleotide overhang exists when the 3'-end of one strand of a dsRNA extends beyond the 5'-end of the other strand or vice versa.
  • a dsRNA may include an overhang of at least one nucleotide; alternatively, the overhang may include at least 2 nucleotides, at least 3 nucleotides, at least 4 nucleotides, at least 5 or more nucleotides.
  • the nucleotide overhang may include or consist of nucleotide/nucleoside analogs (including deoxynucleotides/nucleosides).
  • One or more overhangs may be on the sense strand, the antisense strand, or any combination thereof.
  • one or more nucleotides of the overhang may be present at the 5' end, the 3' end, or both ends of the antisense or sense strand of the dsRNA.
  • the conjugated groups of the present invention include pharmaceutically acceptable conjugated groups.
  • pharmaceutically acceptable conjugated groups include pharmaceutically acceptable targeting molecules (or targeting ligands) and optional linkers.
  • the conjugated groups are GalNAc or derivatives thereof.
  • Exemplary conjugated groups, linkers, and targeting molecules can be found in the disclosure of WO2015006740A2.
  • Exemplary conjugated groups include, but are not limited to, L96 or DAW40007-4.
  • conjugation refers to the covalent linkage of two or more chemical moieties, each with a specific function, to each other; accordingly, “conjugate” refers to a compound formed by covalent linkage of the chemical moieties.
  • the double-stranded siRNA conjugate of the present invention is a compound formed by connecting the double-stranded siRNA and a pharmaceutically acceptable conjugation group, and the double-stranded siRNA and the pharmaceutically acceptable conjugation group are covalently linked.
  • angiotensinogen-related disease or "AGT-related disease” is a disease or disorder caused by activation of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) or associated with the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), or a disease or disorder whose symptoms or progression correspond to RAAS inactivation.
  • RAAS renin-angiotensin-aldosterone system
  • RAAS renin-angiotensin-aldosterone system
  • RAAS renin-angiotensin-aldosterone system
  • angiotensinogen-related disease includes diseases, disorders or conditions that would benefit from reduced AGT expression. Such diseases are often associated with hypertension.
  • angiotensinogen-related diseases include hypertension, e.g., borderline hypertension (also known as prehypertension), essential hypertension (also known as essential hypertension or idiopathic hypertension), secondary hypertension (also known as inessential hypertension), hypertensive crisis (also known as malignant hypertension), hypertensive urgency, isolated systolic or diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension (e.g., preeclampsia, eclampsia, and postpartum preeclampsia), diabetic hypertension, resistant hypertension, refractory hypertension, paroxysmal hypertension, renovascular hypertension (also known as renal hypertension), Goldblatt's hypertension, ocular hypertension, glaucoma, pulmonary hypertension, portal hypertension, systemic venous hypertension, systolic hypertension, unstable Hypertension; Hypertensive heart disease, hypertensive nephropathy, atherosclerosis, arterios
  • pharmaceutical composition may refer to a composition used for the treatment of a disease, and may also be used for in vitro cell culture experiments.
  • pharmaceutical composition generally refers to a unit dosage form, and may be prepared by any of the methods well known in the pharmaceutical field. All methods include the step of combining the active ingredient with an excipient that constitutes one or more accessory ingredients. Typically, the composition is prepared by uniformly and fully combining the active siRNA with a liquid excipient, a finely divided solid excipient, or both.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” may include any solvent, solid excipient, diluent or other liquid excipient, etc., suitable for a specific target dosage form. Except for any conventional carrier incompatible with the RNAi (such as siRNA) of the present invention, such as any adverse biological effect produced or interaction with any other component of the pharmaceutically acceptable composition in a harmful manner, their use is also within the scope of the present invention.
  • RNAi such as siRNA
  • any adverse biological effects produced or interactions with any other components of the pharmaceutically acceptable composition in a deleterious manner their use is also contemplated by the present invention.
  • the content of the protective agent can be 0.01-30% by weight (such as 0.01% by weight, 0.05% by weight, 0.1% by weight, 0.5% by weight, 1% by weight, 5% by weight, 10% by weight, 15% by weight, 20% by weight, 25% by weight, 30% by weight or any value between any two of the above values).
  • the osmotic pressure regulator can be sodium chloride and/or potassium chloride.
  • the content of the osmotic pressure regulator makes the osmotic pressure of the pharmaceutical composition 200-700 mOsmole/kg. According to the desired osmotic pressure, those skilled in the art can determine the content of the osmotic pressure regulator.
  • the term "treatment” refers to the use of drugs to obtain the desired pharmacological and/or physiological effects.
  • the effect can be preventive in terms of completely or partially preventing a disease or its symptoms, and/or can be therapeutic in terms of partially or completely curing a disease and/or adverse effects caused by the disease.
  • the "treatment” used in the present invention covers diseases in mammals, especially humans, including: (a) preventing the occurrence of diseases or conditions in individuals who are susceptible to the disease but have not yet been diagnosed with the disease; (b) inhibiting the disease, such as blocking the development of the disease; or (c) alleviating the disease, such as alleviating symptoms associated with the disease.
  • treatment used in the present invention covers any medication that administers a drug, RNAi agent or siRNA to an individual to treat, cure, alleviate, improve, reduce or inhibit the individual's disease, including but not limited to administering a drug containing the RNAi agent, siRNA or siRNA conjugate of the present invention to an individual in need.
  • RNAi agent refers to an agent containing RNA or RNA-like (e.g., chemically modified RNA) oligonucleotide molecules that can degrade or inhibit the transcription and translation of target messenger RNA (mRNA) in a sequence-specific manner.
  • RNAi agent in the present invention can be manipulated by an RNA interference mechanism (i.e., inducing RNA interference by interacting with the RNA interference pathway-forming mechanism of mammalian cells (RNA-induced silencing complex or RISC)), or act through any other mechanism or pathway.
  • RNA interference mechanism i.e., inducing RNA interference by interacting with the RNA interference pathway-forming mechanism of mammalian cells (RNA-induced silencing complex or RISC)
  • RNAi agents include, but are not limited to, single-stranded oligonucleotides, single-stranded antisense oligonucleotides, short interfering RNA (siRNA), double-stranded RNA (dsRNA), microRNA (miRNA), short hairpin RNA (shRNA) and Dicer substrates.
  • siRNA short interfering RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • miRNA microRNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • Dicer substrates Dicer substrates.
  • capital letters C, G, U, and A represent bases of natural nucleotides; lowercase letters represent bases modified by methoxy at the 2nd position of the ribose of the nucleotide, such as c, g, u, and a represent 2'-OMe (2'-O-methyl) C, 2'-OMe G, 2'-OMe U, and 2'-OMe A, respectively; the f on the right side of the capital letter represents a base modified by fluorine at the 2nd position of the ribose of the nucleotide, such as Cf, Gf, Uf, and Af represent 2'-F (2'-fluoro) C, 2'-F G, 2'-F U, and 2'-FA, respectively; "s" represents that the two nucleotide residues adjacent to the left and right of "s" are connected by thiophosphate groups, for example, "gsu” represents that the g and u residue
  • TNA, PNA, D-FNA, ANA-5, HNA-5, FANA-5, ANA-6, HNA-6, FANA-6, bcDNA, tcDNA, S-MC, N-MC, 2'-F-NMC, cEt, D and InvAb of the present invention are as follows: Wherein, B is a base (including a natural base (A, U, G, C or T) or a modified base), each TNA, PNA, D-FNA, ANA-5, HNA-5, FANA-5, ANA-6, HNA-6, FANA-6, bcDNA, tcDNA, S-MC, N-MC and 2'-F-NMC are independently linked to the remaining nucleotides and/or conjugated groups through a phosphate bond or a phosphorothioate bond, and the present invention also includes their stereoisomers.
  • A, U, G, C or T should be understood as a base A, U, G, C or T without sugar, and for example, A, U, G or C in Table 1 of the present invention should be understood as a nucleoside containing the base A, U, G or C.
  • the structure of the nucleoside (UNA) modified by the present invention is
  • the structure of the glycol nucleic acid modified nucleoside (GNA) is B is a base (including a natural base (A, U, G, C or T) or a modified base).
  • phosphate group can be used interchangeably, including phosphate monoester, phosphodiester or phosphotriester.
  • Phosphate group in “phosphorothioate group” also has the same meaning. Unless otherwise specified, the phosphate group between natural nucleotides is a phosphodiester group.
  • deoxynucleotide refers to a nucleotide in which the hydroxyl group in the pentose of the nucleotide is deoxygenated, and the position of deoxygenation can be 2'-OH or 3'-OH.
  • the deoxynucleotides include 3'-deoxy modified nucleotides and 2'-deoxy modified nucleotides.
  • 2'-X modification means that the hydroxyl group (2'-OH) in the pentose of nucleotide is replaced by X (2'-X).
  • X 2'-X
  • “2'-fluoro modification” refers to replacement of the hydroxyl group (2'-OH) in the nucleotide pentose with fluorine (2'-F)
  • “2'-amino modification” refers to replacement of the hydroxyl group (2'-OH) in the nucleotide pentose with fluorine (2'-NH 2 )
  • “2'-alkyl modification” refers to replacement of the hydroxyl group (2'-OH) in the nucleotide pentose with an alkyl group (2'-alkyl)
  • locked nucleotide refers to a nucleotide obtained by modifying the 2' and 4' carbons on the pentose of the nucleotide to be linked together.
  • 5'-X modification refers to the replacement of phosphate (5'-PO(OH) 2 ) in nucleotide pentose by X (5'-X).
  • 5'-phosphoramidate modification refers to the replacement of phosphate (5'-PO(OH) 2 ) in nucleotide pentose by phosphoramidate
  • 5'-phosphorothioate modification refers to the replacement of phosphate (5'-PO(OH) 2 ) in nucleotide pentose by phosphorothioate
  • 5'-methylphosphonate modification refers to the replacement of phosphate (5'-PO(OH) 2 ) in nucleotide pentose by methylphosphonate
  • 5'-phosphate mimetic modification refers to the replacement of phosphate (5'-PO(OH) 2 ) in nucleotide pentose by phosphate mimetic.
  • cytosine modification or “5-methylcytosine modification” refers to methylation of the 5th carbon atom of cytosine;
  • uracil modification or “5-methyluracil modification” refers to methylation of the 5th carbon atom of uracil.
  • the "2'" in 2'-fluoro modified nucleotides, 2'-amino modified nucleotides, 2'-O-allyl modified nucleotides, 2'-alkyl modified nucleotides, 2'-O-alkyl modified nucleotides, 2'-methoxyethyl modified nucleotides, and 2'-allyl modified nucleotides means that the 2-position of the ribose is modified by the corresponding group.
  • chemically modified or “modification” means a structure that is chemically different when compared to a naturally occurring counterpart, including all changes by chemical means, such as the addition or removal of a chemical moiety, or the substitution of one chemical moiety for another.
  • the compounds of the present invention may be asymmetric, for example, having one or more stereoisomers. Unless otherwise indicated, all stereoisomers are included, such as enantiomers and diastereomers.
  • the compounds of the present invention containing asymmetric carbon atoms can be isolated in optically pure forms or racemic forms. Optically pure forms can be resolved from racemic mixtures or synthesized by using chiral starting materials or chiral reagents.
  • diastereomeric salts are formed with an appropriate optically active acid or base, followed by diastereomeric resolution by conventional methods known in the art, and then the pure enantiomer is recovered.
  • separation of enantiomers and diastereomers is usually accomplished by using chromatography, which employs a chiral stationary phase and is optionally combined with chemical derivatization (e.g., carbamate formation from an amine).
  • the present invention also includes isotopically labeled compounds of the present invention that are identical to those described herein, but in which one or more atoms are replaced by atoms having an atomic mass or mass number different from that commonly found in nature.
  • isotopes that may be incorporated into compounds of the present invention include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, iodine, and chlorine, such as 2 H, 3 H, 11 C, 13 C, 14 C, 13 N, 15 N, 15 O, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 123 I, 125 I, and 36 Cl, etc.
  • deuterium when a position is specifically designated as deuterium (D), the position is understood to have deuterium (i.e., at least 10% deuterium incorporation) at least 1000 times greater than the natural abundance of deuterium (which is 0.015%).
  • the natural abundance of the compound in the example may be at least 1000 times greater than deuterium, at least 2000 times greater than deuterium, at least 3000 times greater than deuterium, at least 4000 times greater than deuterium, at least 5000 times greater than deuterium, at least 6000 times greater than deuterium or more.
  • the present invention also includes various deuterated forms of the formula (I) compound. Each available hydrogen atom connected to a carbon atom may be independently replaced by a deuterium atom.
  • deuterated forms of the formula (I) compound can synthesize deuterated forms of the formula (I) compound with reference to the relevant literature.
  • commercially available deuterated starting materials may be used, or they may be synthesized using conventional techniques using deuterated reagents, including but not limited to deuterated borane, trideuterated borane in tetrahydrofuran, deuterated lithium aluminum hydride, deuterated iodoethane and deuterated iodomethane.
  • the conjugated groups of the present invention can enhance the delivery of therapeutic agents to specific target locations (e.g., specific organs or tissues) in objects such as humans or animals. In some embodiments of the present invention, the conjugated groups can enhance the targeted delivery of expression inhibitory oligonucleotides. In some embodiments of the present invention, the conjugated groups can enhance the delivery of expression inhibitory oligonucleotides to the liver.
  • “Pharmaceutically acceptable base addition salt” refers to a salt formed with an inorganic base or an organic base that can maintain the biological effectiveness of the free acid without other side effects.
  • Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, sodium salts, potassium salts, lithium salts, ammonium salts, calcium salts, magnesium salts, iron salts, zinc salts, copper salts, manganese salts, aluminum salts, and the like.
  • Preferred inorganic salts are ammonium salts, sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts, preferably sodium salts.
  • the compounds of the present invention may optionally be substituted with one or more substituents, such as the general formula compounds above, or as specific examples in the embodiments, subclasses, and classes of compounds encompassed by the present invention.
  • substituents such as the general formula compounds above, or as specific examples in the embodiments, subclasses, and classes of compounds encompassed by the present invention.
  • substituted means that one or more hydrogen atoms in a given structure are replaced by a specific substituent.
  • an optional substituted group may have a substituent substituted at each substitutable position of the group. When more than one position in a given structural formula can be substituted with one or more substituents selected from a specific group, the substituents may be substituted at each position in the same or different manner.
  • hydroxy protecting group refers to an unstable chemical moiety that protects the hydroxyl group from undesirable reactions during one or more synthesis procedures. After the one or more synthesis procedures, the hydroxy protecting group can be selectively removed. Hydroxy protecting groups as known in the art are generally described in TH Greene and PGM Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons, New York (1999).
  • hydroxy protecting groups of the present invention include, but are not limited to, C 1-10 alkylmethyl, benzyloxycarbonyl, 4-nitrobenzyloxycarbonyl, 4-bromobenzyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, methoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, biphenylmethoxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, 2-furfuryloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, acetyl (Ac or -C(O)CH 3 ), formyl, chloroacetyl, trifluoroacetyl, methoxyacetyl, phenoxyacetyl, benzoyl (Bz or -C(O)C 6 H 5 ), C 1-10 alkyl (methyl, tert-butyl, etc.), 2,2,2-trichloroe
  • amino protecting group refers to an unstable chemical moiety that protects an amino group from undesirable reactions during a synthetic procedure. After the one or more synthetic procedures, the amino protecting group as described herein may be selectively removed.
  • Amino protecting groups known in the art are generally described in T.H. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York (1999). Examples of amino protecting groups include, but are not limited to, acetyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl, and benzyloxycarbonyl, and the like.
  • Figure 1 shows the inhibitory effects of the siRNA conjugates of the present invention and the vehicle control group (normal saline) on AGT in the hAGT transgenic mouse model experiment.
  • conjugates 1-6 represent siRNA conjugate ID NO 1-6, and their corresponding specific sequences are detailed in Table 2.
  • the present invention provides a double-stranded siRNA, its conjugate or salt, which comprises a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region
  • the sense strand comprises one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:90 (i.e., one of the sense strands in Table 1 of the present invention), or a nucleotide sequence having 0, 1, 2, 3, 4 or 5 nucleotide differences therefrom; wherein, the detailed information of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:90 is shown in Table 1 of the present invention specification.
  • the antisense chain includes one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:91 to SEQ ID NO:180 (i.e., one of the antisense chains in Table 1 of the present invention), or a nucleotide sequence having 0, 1, 2, 3, 4 or 5 nucleotide differences therefrom; wherein, the detailed information of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:91 to SEQ ID NO:180 is shown in Table 1 of the specification of the present invention.
  • the double-stranded siRNA is a modified double-stranded siRNA.
  • the double-stranded siRNA conjugate is formed by conjugating the double-stranded siRNA with a conjugation group.
  • the length of the sense strand is no more than 21 nucleotides, and the length of the antisense strand is no more than 23 nucleotides.
  • the sense strand comprises a 3' overhang and/or a 5' overhang, and the 3' overhang or the 5' overhang comprises 1, 2 or 3 nucleotides.
  • the antisense strand comprises a 3' overhang and/or a 5' overhang, and the 3' overhang or the 5' overhang comprises 1, 2 or 3 nucleotides.
  • the double-stranded siRNA, its conjugate or salt described in the present invention comprises one of the double-stranded siRNAs shown in siRNA ID NO:1 to siRNA ID NO:90, wherein the information of the double-stranded siRNA shown in siRNA ID NO:1 to siRNA ID NO:90 is detailed in Table 1 of the specification of the present invention.
  • the sense strand and/or the antisense strand comprises at least one modified nucleotide, and the modified nucleotide is independently and optionally selected from at least one of the following:
  • Non-natural base nucleotides deoxynucleotides, 2'-fluoro modified nucleotides, 2'-amino modified nucleotides, 2'-O-allyl modified nucleotides, 2'-alkyl modified nucleotides, 2'-O-alkyl modified nucleotides (such as 2'-methoxy modified nucleotides), 2'-methoxyethyl modified nucleotides, locked nucleotides (LNA), unlocked nucleic acid modified nucleotides (UNA), 2'-allyl modified nucleotides, abasic nucleotides, morpholino modified nucleotides, tetrahydropyran modified nucleotides, cyclohexenyl modified nucleotides, PEG modified nucleotides, 5'-phosphoramidate modified nucleotides, thiophosphate linked modified nucleotides (such as: 5'-thiophosphate linked
  • InvAb also referred to as InvB in the present invention
  • GAA glycol nucleic acid
  • 2'-fluoro-modified nucleotide refers to a nucleotide in which the 2-position of ribose is substituted by fluorine
  • a 2'-methoxy-modified nucleotide refers to a nucleotide in which the 2-position of ribose is substituted by methoxy.
  • the sense strand and/or the antisense strand comprises at least one modified nucleotide, and the modified nucleotide is independently and optionally selected from at least one of the following:
  • the modified nucleotides are each independently present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the sense strand and the 5' end of the sense strand are the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th, 20th and 21st positions of the starting point.
  • the modified nucleotide of the present invention is present at the 5' end or 3' end of the sense strand, the modified nucleotide is linked to the 5' end or 3' end of the sense strand via a phosphorothioate or phosphate group.
  • the modified nucleotides are each independently present in one or more positions selected from the following:
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the antisense strand are positions 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-11, 11-12, 12-13, 13-14, 14-15, 15-16, 16-17, 17-18, between 18-19, 19-20, 20-21, 21-22 and between 22-23 of the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotide, the 2'-methoxy modified nucleotide and Y are each independently and optionally present in one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the sense strand are the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th, 8th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th, 15th, 16th, 17th, 18th, 19th, 20th and 21st nucleotides from the starting point.
  • the 2'-fluoro modified nucleotide, the 2'-methoxy modified nucleotide and Y are each independently and optionally present in one or more positions selected from the following:
  • the 2'-fluoro modified nucleotide is present at one or more positions selected from the following:
  • the 2'-fluoro modified nucleotide is present at one or more positions selected from the following:
  • the InvAb is modified to be linked to the 5' end or 3' end of the sense strand through a phosphorothioate group or a phosphate group.
  • the nucleotides at the 5' end of the sense strand are between positions 1-2, 2-3 and 3-4 of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently and optionally present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the positive strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 5' end of the antisense strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • the 5'-phosphorothioate linkage modification or the 3'-phosphorothioate linkage modification is each independently present at one or more positions selected from the following:
  • the nucleotides at the 3' end of the antisense strand are between the 1st and 2nd positions, the 2nd and 3rd positions, and the 3rd and 4th positions of the starting point.
  • the “at least one modified nucleotide” described in the present invention refers to the double-stranded siRNA, its conjugate or salt described in the present invention, the sense strand comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 modified nucleotides, and/or the antisense strand comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 modified nucleotides.
  • one or more positions in “each independently optionally exists in one or more positions selected from the following” or “each independently exists in one or more positions selected from the following” described in the present invention refers to the presence of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 modifications, wherein “optionally” means that the modification may be possible or there may be no modification, that is, 0 modification.
  • the double-stranded siRNA comprises 2 Ys.
  • the double-stranded siRNA comprises 3 Ys.
  • its sense strand has one of the following modification patterns:
  • its antisense strand has the modification pattern shown below:
  • Antisense strand (5’-3’): mBsBfsmBmBmBBfmBmBmBmBmBmBmBBfmBBfmBmBmBmBmBsmB
  • Antisense strand (5’-3’): mBsBfsmBmBmBBfmBmBmBsmBmBmBmBBfmBBfmBmBmBsmBsmB
  • the siRNA has one of the following modification patterns 1-6:
  • each B is independently a nucleotide of base A, base U, base G, base C or base T;
  • the m on the left side of B represents ribose 2'-methoxy modification, such as mB represents a base modified with methoxy at the 2nd position of ribose in the nucleotide;
  • the d on the left side of B represents ribose 2' deoxygenation, such as dB represents a base with H at the 2nd position of ribose in the nucleotide;
  • s is a thiophosphate bond;
  • the f on the right side of B represents ribose 2'-F modification, such as Bf represents a base replaced with F at the 2nd position of ribose in the nucleotide; if there is no s between the bases, it means that the nucleosides are connected by a phosphate bond.
  • the double-stranded region is 17-23 nucleotide pairs in length.
  • the double-stranded region is 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23 nucleotide pairs in length.
  • the sense chain described in the present invention comprises one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:181 to SEQ ID NO:212 (i.e., one of the sense chains in Table 1-A of the present invention), and the length of the sense chain does not exceed 21 nucleotides, wherein the detailed information of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:181 to SEQ ID NO:212 is shown in Table 1-A of the present invention.
  • the antisense chain includes one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:214 to SEQ ID NO:224 (i.e., one of the antisense chains in Table 1-A of the present invention), and the length of the antisense chain does not exceed 23 nucleotides; wherein, the detailed information of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO:214 to SEQ ID NO:224 can be found in Table 1-A of the specification of the present invention.
  • the double-stranded siRNA, its conjugate or salt described in the present invention comprises one of the double-stranded siRNA shown in siRNA ID NO:91 to siRNA ID NO:126; wherein the length of the sense chain does not exceed 21 nucleotides, and the length of the antisense chain does not exceed 23 nucleotides.
  • the detailed information of the double-stranded siRNA shown in siRNA ID NO:91 to siRNA ID NO:126 can be found in Table 1-A of the specification of the present invention.
  • the siRNA, siRNA conjugate or siRNA conjugate salt comprises one of the following double-stranded nucleotide sequences:
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5’-csasagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’; or
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3'
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3'; or
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5’-usGfsCfuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’; or
  • the positive strand comprises the nucleotide sequence of 5’-InvBscsaaguuGfaGfAfAfcaaaasusa-3’
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence of 5’-usAfsuuuUfuguuucucAfaCfuugsasa-3’.
  • the double-stranded siRNA conjugate in the double-stranded siRNA conjugate, is conjugated to a conjugation group.
  • the 3' end of the sense strand of the double-stranded siRNA is conjugated to the conjugate.
  • the 3' end or 5' end of the sense strand of the double-stranded siRNA is conjugated to the conjugation group through a phosphate group, a thiophosphate group or a phosphate group.
  • the conjugated group includes GalNAc or its derivatives.
  • the conjugated group is GalNAc or its derivative connected by a divalent, trivalent or tetravalent branched linker.
  • the conjugated group is DAW40007-4, L-96 or a stereoisomer thereof, wherein the structures of the conjugated group L-96 and DAW40007-4 are respectively:
  • the siRNA conjugate has one of the following double-stranded nucleotide sequences:
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3'
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3'; or
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-csasagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3'
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3'; or
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3'
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-usGfscuaAfY 2 cacuggUfuCfuugscsc-3'; or
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-InvBsgsgcaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3'
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugccsusc-3'; or
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3'
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of 5'-usGfsCfuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3'; or
  • the positive strand contains the nucleotide sequence of 5’-InvBscsaaguuGfaGfAfAfcaaaausasL96-3’, and the antisense strand contains the nucleotide sequence of 5’-usAfsuuuUfuguuucucAfaCfuugsasa-3’.
  • the double-stranded siRNA or its conjugate or salt described in the present invention further includes (R)- and (S)-enantiomers, diastereomers, and/or racemic mixtures thereof.
  • the phosphorothioate portion of the double-stranded siRNA or its conjugate includes (R)- and (S)-enantiomers, diastereomers, and/or racemic mixtures thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the double-stranded siRNA, its conjugate or salt, double-stranded siRNA conjugate or its salt according to the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be an injection.
  • the injection solution of the present invention can be used for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention further comprises other therapeutic agents, wherein the other therapeutic agents are selected from diuretics, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, beta-blockers, vasodilators, calcium channel blockers, aldosterone antagonists, ⁇ 2-agonists, renin inhibitors, ⁇ -blockers, peripherally acting adrenergic agents, selective D1 receptor partial agonists, non-selective ⁇ -adrenergic antagonists, synthetic steroidal anti-mineralocorticoid agents, or any combination of the foregoing, and hypertension therapeutic agents formulated into a pharmaceutical combination.
  • the other therapeutic agents are selected from diuretics, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, beta-blockers, vasodilators, calcium channel blockers, aldosterone antagonists, ⁇ 2-agonists, renin inhibitors, ⁇ -blockers, peripherally acting ad
  • the present invention also provides a method for inhibiting the expression of AGT gene in a patient, which comprises administering to the patient the double-stranded siRNA and double-stranded siRNA conjugate or a composition thereof (i.e., double-stranded RNAi agent) of the present invention, wherein the nucleic acid ligand conjugate or the composition thereof may be a therapeutically effective amount.
  • the double-stranded RNAi agent is administered at a dose of 0.01 mg/kg to 10 mg/kg or 0.5 mg/kg to 50 mg/kg, or at a dose of 10 mg/kg to 30 mg/kg, or at a dose of 3 mg/kg, or at a dose of 10 mg/kg.
  • the double-stranded RNAi agent is administered at a dose of 0.5 mg/kg twice a week, or at a dose of 10 mg/kg every other week, or at a dose of 0.5-1 mg/kg once a week.
  • the double-stranded RNAi agent is administered subcutaneously or intravenously.
  • the double-stranded RNAi agent is administered in two or more doses.
  • the present invention provides use of the double-stranded siRNA conjugate, its conjugate and its salt, and the pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of a drug for treating and/or preventing AGT-related diseases.
  • the AGT-related disease is hypertension.
  • the hypertension is selected from critical hypertension, essential hypertension, secondary hypertension, hypertensive crisis, hypertensive emergency state, isolated systolic and diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension, diabetic hypertension, resistant hypertension, refractory hypertension, paroxysmal hypertension, renovascular hypertension, Goldblatt's hypertension, pulmonary hypertension, portal hypertension, systemic venous hypertension, systolic hypertension and unstable hypertension.
  • the effective amount of the nucleic acid conjugate (such as siRNA conjugate or pharmaceutical composition) of the present invention may vary depending on the mode of administration and the severity of the disease to be treated.
  • the selection of the preferred effective amount can be determined by a person of ordinary skill in the art based on various factors (e.g., through clinical trials).
  • the factors include, but are not limited to: pharmacokinetic parameters of the active ingredient such as bioavailability, metabolism, half-life, etc.; the severity of the disease to be treated, the patient's weight, the patient's immune status, the route of administration, etc.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing an iRNA as described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutical compositions containing iRNA can be used to treat diseases or conditions associated with the expression or activity of the AGT gene.
  • Such pharmaceutical compositions are formulated based on the mode of delivery.
  • An example is a composition formulated so as to be systemically administered by parenteral delivery, such as by subcutaneous (SC) or intravenous (IV) delivery.
  • SC subcutaneous
  • IV intravenous
  • Another example is the following composition, which is formulated for direct delivery to the brain parenchyma, such as by infusion to the brain, such as by continuous pump infusion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be given in a dose sufficient to inhibit the expression of the AGT gene.
  • the suitable dosage of the iRNA of the present invention is in the range of about 0.001 to about 200.0 mg per kg of body weight of the recipient per day, typically in the range of about 1 to 50 mg per kg of body weight per day.
  • the dsRNA can be administered at about 0.01 mg/kg, about 0.05 mg/kg, about 0.5 mg/kg, about 1 mg/kg, about 1.5 mg/kg, about 2 mg/kg, about 3 mg/kg, about 10 mg/kg, about 20 mg/kg, about 30 mg/kg, about 40 mg/kg, or about 50 mg/kg per single dose.
  • dsRNA can be administered at a dose of about 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6. 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, or about 10 mg/kg. Values and ranges intermediate to these recited values are also intended to be part of the invention. Values and ranges intermediate to these recited values are also intended to be part of the invention. Values and ranges intermediate to these recited
  • the dsRNA is administered at a dose of about 0.1 to about 50 mg/kg, about 0.25 to about 50 mg/kg, about 0.5 to about 50 mg/kg, about 0.75 to about 50 mg/kg, about 1 to about 50 mg/kg, about 1.5 to about 50 mg/kg, about 2 to about 50 mg/kg, about 2.5 to about 50 mg/kg, about 3 to about 50 mg/kg, about 3.5 to about 50 mg/kg, about 4 to about 50 mg/kg, about 4.5 ...
  • the drug can be administered to a subject by any suitable route known in the art, including but not limited to oral or parenteral routes, including intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, airway administration (aerosol), pulmonary administration, nasal administration, rectal administration and topical administration (including buccal administration and sublingual administration), preferably intravenous injection.
  • oral or parenteral routes including intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, transdermal administration, airway administration (aerosol), pulmonary administration, nasal administration, rectal administration and topical administration (including buccal administration and sublingual administration), preferably intravenous injection.
  • the pharmaceutical composition can be administered by intravenous infusion within a period of time, such as within 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 and 21, 22, 23, 24 or about 25 minutes.
  • a period of time such as within 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 and 21, 22, 23, 24 or about 25 minutes.
  • it can be regularly repeated, such as weekly, two weeks (i.e., every two weeks), for one month, two months, three months, four months or longer.
  • treatment can be given with a lower frequency.
  • administration can be repeated once a month for six months or one year or longer.
  • pharmaceutical composition can be used by subcutaneous administration.
  • Pharmaceutical composition can be used once daily, or iRNA can be used as two, three or more sub-doses at suitable intervals in one day, or even use continuous infusion or send by controlled release formulation.In this case, the iRNA contained in each sub-dosage must be correspondingly less, to obtain total daily dose.
  • Also composite dosage unit can be used for sending in a few days, for example, using conventional sustained release formulation, it provides continuous iRNA release in the time period of a few days.Sustained release formulation is well known in the art and is particularly useful for delivering medicament in a specific part, as can be used together with medicament of the present invention. In this embodiment, dosage unit contains corresponding multiple daily doses.Higher dose (that is, loading dose) can be used initially, then lower dose is used in the duration period.
  • a single dose of the pharmaceutical composition can be long-acting, so that subsequent doses are administered at intervals of no more than 3,4 or 5 days, or no more than 1,2,3 or 4 weeks.
  • a single dose of the pharmaceutical composition of the invention is administered once a week.
  • a single dose of the pharmaceutical composition of the invention is administered every two months.
  • the iRNA is administered about once a month to about once a quarter (i.e., about once every three months).
  • compositions of the present invention include, but are not limited to, solutions, emulsions, and liposome-containing formulations. These compositions can be produced from a variety of components, including, but not limited to, preformed liquids, self-emulsifying solids, and self-emulsifying semisolids. Particularly preferred are formulations that target the liver when treating liver disorders (e.g., liver cancer).
  • liver disorders e.g., liver cancer
  • the pharmaceutical preparations of the present invention may be prepared according to conventional techniques well known in the pharmaceutical industry. Such techniques include the following steps: combining the active ingredients with the pharmaceutical carrier(s) or excipient(s). Generally speaking, these preparations are prepared by uniformly and finely combining the active ingredients with liquid carriers or finely dispersed solid carriers or both, and, if desired, shaping the product.
  • compositions of the present invention can be formulated as any one of many possible dosage forms, such as but not limited to tablets, capsules, gel capsules, liquid syrups, soft capsules, suppositories and enemas.
  • Compositions of the present invention can also be formulated as suspensions in aqueous, non-aqueous media or mixed media.
  • Aqueous suspensions can further include materials that increase the viscosity of the suspension, such materials include, for example, sodium carboxymethylcellulose, sorbitol and/or dextran.
  • the suspension can also include a stabilizing agent.
  • the pharmaceutical composition disclosed in the present invention includes preparations suitable for parenteral administration.
  • the preparation can be conveniently present in unit dosage form and can be prepared by any method known in the pharmaceutical field.
  • the amount of active ingredient that can be combined with auxiliary materials to prepare a single dose form is generally the amount of siRNA that produces a therapeutic effect. Generally speaking, in units of one percent, the amount is about 1% to about 99% active ingredient, preferably about 5% to about 70%, and most preferably about 10% to about 30%.
  • the invention provides methods of treating a subject having a disorder that would benefit from decreased expression of AGT, such as an AGT-related disease, e.g., hypertension, e.g., critical hypertension (also known as prehypertension), essential hypertension (also known as primary hypertension or idiopathic hypertension), secondary hypertension (also known as non-essential hypertension), hypertensive crisis (also known as malignant hypertension), hypertensive emergency state, isolated systolic or diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension (e.g., preeclampsia, eclampsia, and postpartum preeclampsia), diabetic hypertension, resistant hypertension, refractory hypertension, paroxysmal hypertension, renovascular hypertension (also known as renal hypertension), Goldblatt's hypertension, ocular hypertension, glaucoma, pulmonary hypertension, portal hypertension, systemic venous hypertension, systolic hypertension, unstable
  • AGT-related diseases include intrauterine growth retardation (IUGR) and fetal growth restriction.
  • the treatment methods (and uses) of the invention comprise administering to a subject, e.g., a human, a therapeutically effective amount of an iRNA agent targeting an AGT gene or a pharmaceutical composition comprising an iRNA agent targeting an AGT gene, thereby treating a subject having a disorder that would benefit from reduced AGT expression.
  • the invention provides for use of a therapeutically effective amount of an iRNA agent of the invention for treating a subject, eg, a subject who would benefit from reduced and/or inhibition of AGT expression.
  • the present invention provides the use of an iRNA agent of the invention (e.g., dsRNA) targeting an AGT gene or a pharmaceutical composition comprising an iRNA agent targeting an AGT gene in the manufacture of a medicament for treating a subject, e.g., a subject who would benefit from reduced and/or inhibition of AGT expression, such as a subject suffering from a disorder that would benefit from reduced AGT expression, e.g., an AGT-related disease, e.g., hypertension, e.g., critical hypertension (also known as prehypertension), essential hypertension (also known as primary hypertension or idiopathic hypertension), secondary hypertension (also known as non-essential hypertension), hypertensive crisis (also known as malignant hypertension), hypertensive urgency, isolated systolic or diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension (e.g., preeclampsia, eclampsia, and postpartum preeclampsi
  • hypertension
  • the invention provides the use of an iRNA (e.g., dsRNA) of the invention for preventing at least one symptom in a subject suffering from a disorder that would benefit from reduced and/or inhibited AGT expression, such as an AGT-related disease, e.g., hypertension, e.g., critical hypertension (also known as prehypertension), essential hypertension (also known as primary hypertension or idiopathic hypertension), secondary hypertension (also known as non-essential hypertension)), hypertensive crisis (also known as malignant hypertension), hypertensive emergency state, isolated systolic or diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension (e.g., preeclampsia, eclampsia and postpartum preeclampsia), diabetic hypertension, resistant hypertension, refractory hypertension, paroxysmal hypertension, renovascular hypertension (also known as renal hypertension), Goldblatt's hypertension, ocular hypertension,
  • the invention provides for use of an iRNA agent of the invention in the manufacture of a medicament for preventing at least one symptom in a subject suffering from a disorder that would benefit from reduced and/or inhibited AGT expression, e.g., an AGT-related disease, e.g., hypertension, e.g., critical hypertension (also known as prehypertension), essential hypertension (also known as primary hypertension or idiopathic hypertension), secondary hypertension (also known as non-essential hypertension), hypertensive crisis (also known as malignant hypertension), hypertensive urgency, isolated systolic or diastolic hypertension, pregnancy-related hypertension (e.g., preeclampsia, eclampsia, and postpartum preeclampsia), diabetic hypertension, resistant hypertension, refractory hypertension, paroxysmal hypertension, renovascular hypertension (also known as renal hypertension), Goldblatt's hypertension, ocular hypertension, e.
  • the compounds and nucleic acid conjugates of the present invention can be prepared by the methods described in the present invention.
  • the following reaction schemes and examples are used to further illustrate the content of the present invention.
  • MS data were determined by an Agilent 6320 series LC-MS spectrometer equipped with a G1312A binary pump and a G1316A TCC (column temperature was maintained at 30 °C).
  • G1329A autosampler and a G1315B DAD detector were used for the analysis, and an ESI source was applied to the LC-MS spectrometer.
  • MS data were determined using an Agilent 6130 series LC-MS spectrometer equipped with a G1311A quaternary pump and a G1316A TCC (column temperature was maintained at 30 °C).
  • a G1329A autosampler and a G1315D DAD detector were used for the analysis, and an ESI source was applied to the HR-MS spectrometer.
  • DAW50072-1 (4.975 g, 16.02 mmol) was dissolved in DCM (100 mL), and m-chloroperbenzoic acid (5.20 g, 25.63 mmol) was added under stirring, and the mixture was reacted at room temperature overnight.
  • DAW50072-2 (4.15 g, 12.71 mmol) and uracil (1.57 g, 13.98 mmol) were dissolved in DMF (50 mL), cooled to -5 °C, and sodium hydride (0.15 g, 3.81 mmol) was added under stirring. After stirring for 5 min, the mixture was transferred to room temperature and then heated to 110 °C for overnight reaction. The reaction was stopped, and EA (100 mL) was added to dilute the mixture after cooling to room temperature.
  • DAW50072-4 (4.37 g, 21.83 mmol), 4-dimethylaminopyridine (0.27 g, 2.18 mmol) and TEA (7.28 g, 71.94 mmol) were dissolved in THF (150 mL), and DMTrCl (11.09 g, 32.74 mmol) was added under stirring, and the reaction was allowed to proceed overnight at room temperature.
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the residue was dissolved in DCM (150 mL), then washed with saturated sodium chloride (100 mL ⁇ 3), and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated under reduced pressure, and purified by preparative chromatography to obtain white foamy solids DAW50072-5-a (3.60 g, yield: 32.82%) and DAW50072-5-b (2.48 g, yield: 22.61%).
  • DAW50072-5-a (0.5 g, 0.99 mmol), 1H-tetrazole (86 mg, 1.20 mmol) and TEA (0.31 g, 3.02 mmol) were dissolved in DCM (20 mL), and bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphine (0.51 g, 1.68 mmol) was added under stirring.
  • the reaction solution was reacted at room temperature for 3.5 h. After the reaction was completed, DCM (20 mL) was added to dilute the mixture, and the mixture was washed with saturated sodium chloride solution (40 mL ⁇ 2), dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was concentrated.
  • the compound L96-DMTr-CPG was prepared according to the method described in patent application WO2014025805A1.
  • the structure of the L96 conjugated group is:
  • Compound L96-DMTr-CPG is conjugated with oligonucleotide and then deprotected to obtain L96
  • compound DAW40007-3 is conjugated with oligonucleotide and then deprotected to obtain DAW40007-4.
  • Nucleoside monomer 1 and nucleoside monomer DAW50072-a are embedded in oligonucleotide and then deprotected to obtain nucleotide residues Y and Y 2 , respectively.
  • siRNA sense strand and antisense strand of the present invention are as follows:
  • RNA phosphoramidite monomers and auxiliary reagents were commercially obtained, and all phosphoramidite monomers were provided in 0.1M anhydrous acetonitrile solution.
  • 0.1M DDTT solution was used as the thiolation reagent.
  • the nucleotide containing solid support CPG obtained above was blown dry with dry argon, then transferred to a 2mL EP tube, and 28% ammonia solution (1.8mL) was added and heated at 55°C for 5 to 18 hours. Filter, wash the filter cake with water (0.5mL), combine the filtrate, and concentrate under reduced pressure to obtain a white or yellow colloidal solid. After reverse phase preparation and purification, the preparation solution is concentrated, passed through a gel column, and excess salt is removed to obtain an oligonucleotide. The concentration of the obtained oligonucleotide is determined by a micro-ultraviolet spectrophotometer (SPECTRO stat Nano). Mass spectrometry detection and analysis are completed on the Agilent 6530LC-MS Q-Tof system. After the primary scan, the molecular weight of the nucleic acid is calculated after deconvolution.
  • SPECTRO stat Nano micro-ultraviolet spectrophotometer
  • the double-stranded siRNA sense strand synthesized above was mixed with the anti-sense strand synthesized above in equimolar amounts, heated to 95° C., maintained at the temperature for 10 min, and then slowly cooled to room temperature, and then freeze-dried to obtain the target double-stranded siRNA.
  • the synthesis of the antisense strand was obtained by referring to the above-mentioned method for synthesizing the sense strand and antisense strand without GalNac.
  • the universal solid support CPG is replaced with the GalNAc solid support prepared in the present invention (such as compound DAW40007-3), and the sense strand of the double-stranded siRNA conjugate of the present invention is prepared by referring to the synthesis method of the antisense strand.
  • the unmodified double-stranded siRNA synthesized by the present invention is shown in Table 1; the modified siRNA synthesized by the present invention is shown in Table 1-A; the double-stranded siRNA conjugate synthesized by the present invention is shown in Table 2.
  • Example 5 Cellular activity and cytotoxicity test of siRNA or its conjugates of the present invention
  • HepG2 cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum in a 5% CO 2 , 37°C constant temperature incubator. When the cells were in the logarithmic growth phase and in good condition (70% confluence), transfection was performed using a transfection reagent. The cell concentration was adjusted to 2.5 ⁇ 10 5 /mL, and 2 ⁇ 10 4 cells were seeded into each well of a 96-well plate. Different concentrations of test siRNA, positive control, and negative control were transfected according to the instructions of the lipofectamine RNAiMAX transfection reagent.
  • the experimental results show that the siRNA of the present invention and its conjugates have a good knockdown effect on AGT mRNA.
  • the experimental results of the inhibition rate of some naked sequence siRNA on AGT are shown in Table A, and the experimental results of the inhibition rate of some modified siRNA on AGT are shown in Table B.
  • Table B Inhibition rate of AGT by partially modified double-stranded siRNA of the present invention
  • Example 6 Evaluation of the knockdown activity of AGT siRNA conjugates using hAGT transgenic mice
  • AGT humanized mouse model (5 to 9 mice per group) was used. Baseline serum weight, ALT and AGT protein levels of mice in each group were measured and grouped. A single dose of 1 mg/kg or 3 mg/kg of GalNAc-siRNA or saline was subcutaneously administered at the back of the neck on D0. Blood samples were collected on D0/4/7/14/21/28/35/49, and the concentration of human AGT protein was determined using Human AGT ELISA Kit (ab287170). The knockdown percentage was calculated by comparing the human AGT protein levels in the siRNA conjugate group and the vehicle group. The experimental results are shown in Figure 1.
  • the experimental results show that the siRNA conjugate of the present invention has a good knockdown effect on AGT mRNA in mice.

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Abstract

提供了一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途，所述双链siRNA及其缀合物可以抑制血管紧张素原(AGT)表达，可制备用于治疗和/或预防AGT相关疾病的药物。

Description

一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途 技术领域
本发明属于小核酸药物领域，目的在于提供一种新型的双链siRNA、其缀合物及其用途。本发明所述双链siRNA及其缀合物可制备用于治疗和/或预防血管紧张素原(AGT)相关疾病的药物。
背景技术
肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在血压调节中起着关键作用。RAAS级联始于肾脏的近肾小球细胞将肾素分泌至循环中。肾素分泌受到几个因素的刺激，包括远端小管中的Na+负荷、β-交感神经刺激和/或降低的肾灌注。血浆中的活性肾素将血管紧张素原(由肝脏产生)分裂成血管紧张素I，其随后通过循环和局部表达的血管紧张素-转化酶(ACE)转化成血管紧张素II。血管紧张素II对RAAS的大部分作用是通过其与血管紧张素II 1型受体(AT1R)的结合来发挥的，导致动脉血管收缩、肾小管和肾小球效应，如增强的Na+重吸收或肾小球滤过率的调节。此外，与其他刺激物(如促肾上腺皮质激素、抗-利尿激素、儿茶酚胺、内皮素、血清素)以及Mg2+和K+水平一起，AT1R刺激导致醛固酮释放，其随后促进肾远端曲小管中的Na+和K+排泄。
导致例如过度血管紧张素II产生和/或AT1R刺激的RAAS失调引起高血压，其可以导致例如提高的氧化应激，心脏、肾脏和动脉中炎症、肥大和纤维化的促进，并且导致例如左心室纤维化、动脉重建和肾血管球硬化症。
血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT)是所有血管紧张素的共同前体，肝脏是血液AG T的主要来源，多项研究证实，血液AGT浓度升高和高血压呈显著正相关，降低血液AGT浓度能够抑制RAAS通路的活性并导致血压下降，静脉输注AGT给大鼠能增高血压，并可通过采用抗AGT抗体治疗逆转，AGT-基因敲除小鼠血压降低，而AGT-过度表达导致血压上升。通过调控AGT的水平治疗高血压是很有希望的研发靶点，然而采用传统手段靶向AGT遇到诸多困难。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)指在进化过程中高度保守的、由双链小干扰核糖核酸(small interference RNA，siRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。因此，研究开发靶向AGT的siRNA具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种新型的双链siRNA、其缀合物、盐及其用途，所述双链siRNA及其缀合物可以抑制血管紧张素原(AGT)表达，可制备用于治疗和/或预防AGT相关疾病的药物。所述双链siRNA、其缀合物、盐具有较高的体内递送效率、较好的稳定性、较高的AGT基因表达抑制活性和/或较低的毒性。
一方面，本发明提供了一种双链siRNA、其缀合物或盐，其包含形成双链区的一条正义链和一条反义链，所述正义链包含如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:90所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1中正义链之一)，或与其具有不多于5个核苷酸差异的核苷酸序列；其中，所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:90所示的核苷酸序列的详细信息见本发明说明书表1。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述反义链包括如SEQ ID NO:91～SEQ ID NO:180所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1中反义链之一)，或与其具有不多于5个核苷酸差异的的核苷酸序列；
其中，所述SEQ ID NO:91～SEQ ID NO:180所示的核苷酸序列的详细信息见本发明说明书表1。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA为修饰的双链siRNA。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA缀合物为所述双链siRNA与缀合基团缀合而成。在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链的长度不超过23个核苷酸，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链和/或反义链包含3’突出端和/或5’突出端，所述3’突出端或5’突出端包括1、2或3个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA、其缀合物或盐包含siRNA ID NO:1～siRNA ID NO:90所示的双链siRNA之一，其中，所述siRNA ID NO:1～siRNA ID NO:90所示的双链siRNA信息详见本发明说明书表1。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立地选自下列的至少之一：
非天然碱基的核苷酸、脱氧核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸(如2'-甲氧基修饰的核苷酸)、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、锁核苷酸(LNA)、解锁核酸修饰的核苷酸(UNA)、2'-烯丙基修饰的核苷酸、无碱基核苷酸、吗啉基修饰的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、PEG修饰的核苷酸、5'-氨基磷酸酯修饰的核苷酸、硫代磷酸酯连接修饰的核苷酸(如：5'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸和/或所述3'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸)、5'-甲基膦酸酯基修饰的核苷酸(如5’-(E)-VP修饰的核酸)、5’-乙烯基磷酸酯修饰的核酸、5'-磷酸酯模拟物修饰的核苷酸、ANA-5修饰的核苷酸、FANA-5修饰的核苷酸、ANA-6修饰的核苷酸、TNA修饰的核苷酸、PNA修饰的核苷酸、D-FNA修饰的核苷酸、HNA修饰的核苷酸(优选HNA-5修饰的核苷酸和HNA-6修饰的核苷酸)、FANA-6修饰的核苷酸、bcDNA修饰的核苷酸、tcDNA修饰的核苷酸、S-MC修饰的核苷酸、N-MC修饰的核苷酸、2’-F-NMC修饰的核苷酸、5'-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸、5'-甲基尿嘧啶修饰的核苷酸、2,6-二氨基修饰的腺嘌呤修饰的核苷酸、cEt、D替换的核苷酸(即)、InvAb(在本发明中也称InvB)和乙二醇核酸(GNA)，其中，所述的2'-是指核糖的2位，如2'-氟代修饰的核苷酸是指核糖的2位被氟取代的核苷酸，再如，2'-甲氧基修饰的核苷酸是指核糖的2位被甲氧基取代的核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立地选自下列的至少之一：
2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、5'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸、3'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、锁核酸修饰的核苷酸、解锁核酸修饰的核苷酸(UNA)、乙二醇核酸(GNA)、5’-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5’-(E)-VP修饰的核酸、cEt、D替换的核苷酸、InvAb(在本发明中也称InvB)、Y2替换的核苷酸和Y替换的核苷酸，所述Y2为Y为所述D为其中，所述的2'-是指核糖的2位，如2'-氟代修饰的核苷酸是指核糖的2位被氟取代的核苷酸，再如，2'-甲氧基修饰的核苷酸是指核糖的2位被甲氧基取代的核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述修饰的核苷酸各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的3'末端和正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位和第21位。
当本发明所述修饰的核苷酸存在正义链的5'末端或3'末端时，所述修饰的核苷酸通过硫代磷酸酯或磷酸酯基连接在正义链的5'末端或3'末端。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述修饰的核苷酸各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的3'末端和反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位和第23位。
当本发明所述修饰的核苷酸存在反义链的5'末端或3'末端时，所述修饰的核苷酸通过硫代磷酸酯或磷酸酯基连接在反义链的5'末端或3'末端。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位、第3-4位、第4-5位、第5-6位、第6-7位、第7-8位、第8-9位、第9-10位、第10-11位、第11-12位、第12-13位、第13-14位、第14-15位、第15-16位、第16-17位、第17-18位、第18-19、第19-20位和第20-21位位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位、第3-4位、第4-5位、第5-6位、第6-7位、第7-8位、第8-9位、第9-10位、第10-11位、第11-12位、第12-13位、第13-14位、第14-15位、第15-16位、第16-17位、第17-18位、第18-19位之间、第19-20位、第20-21位、第21-22位和第22-23位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸和Y各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位和第21位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸和Y各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位和第23位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第5位、第7位、第8位、第9位、第10位和第11位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第9位、第10位和第11位，任选还包括第5位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第8位、第9位、第12位、第14位和第16位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第14位和第16位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，选自以下一个或多个位置：
所述2’-脱氧修饰的核苷酸存在于所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第5位、第7位、第10位、第12位和第14位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2’-脱氧修饰的核苷酸存在于所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第5位、第7位、第12位和第14位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述InvAb修饰为通过硫代磷酸酯基或磷酸酯基连接在正义链的5'末端或3'末端。在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的3'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的3'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
本发明所述的“各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置”或“各自独立地存在于选自以下一个或多个位置”中的“一个或多个位置”是指存在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个位置的修饰，其中的任选地，表示可以被修饰也可能不存在修饰，即0个修饰。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA包含至少一个Y，所述Y为
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，本发明所述正义链包含如SEQ ID NO:181～SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1-A中正义链之一)，所述正义链的长度不超过21个核苷酸，其中，所述的SEQ ID NO:181～SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列详细信息见本发明说明书表1-A。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述反义链包括如SEQ ID NO:214～SEQ ID NO:224所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1-A中反义链之一)，所述反义链的长度不超过23个核苷酸；其中，所述的SEQ ID NO:214～SEQ ID NO:224所示的核苷酸序列的详细信息见本发明说明书表1-A。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，本发明所述双链siRNA、其缀合物或盐包含siRNA ID NO:91～siRNA ID NO:126所示的双链siRNA之一；其中，所述正义链的长度不超过21个核苷酸，所述反义链的长度不超过23个核苷酸，所述siRNA ID NO:91～siRNA ID NO:126所示的双链siRNA详细信息见本发明说明书表1-A。在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链区为17-23个核苷酸对长。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述siRNA、siRNA缀合物或siRNA缀合物的盐包含以下双链核苷酸序列之一：
所述正义链包含5’-csasagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’的核苷酸序，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfsCfuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaaguuGfaGfAfAfcaaaaasusa-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usAfsuuuUfuguucucAfaCfuugsasa-3’的核苷酸序列。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA缀合物中，所述双链siRNA的正义链或反义链的3’末端或5’末端与缀合基团缀合。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA的正义链的3’末端与缀合物缀合。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团缀合。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述缀合基团包括GalNAc或其衍生物。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述缀合基团为通过二价、三价或四价分支接头连接的GalNAc或其衍生物。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述缀合基团为DAW40007-4、L-96或其立体异构体，其中，所述缀合基团DAW40007-4和L-96结构分别为：
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA或其缀合物或盐还包括(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、和/或其外消旋混合物。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA或其缀合物的硫代磷酸酯部分包括(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、和/或其外消旋混合物。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的双链siRNA、其缀合物或其盐、双链siRNA缀合物或其盐和药学上可接受的载体。
再一方面，本发明提供了本发明所述的双链siRNA缀合物、其缀合物和其盐，以及本发明所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防AGT相关疾病的药物中的用途。
在本发明所述的用途的一些实施例中，所述AGT相关疾病为高血压。
在本发明所述的用途的一些实施例中，所述高血压选自临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压。
本发明详细说明书
定义和一般术语
在本发明中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本发明中，术语“小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)”是一个长17到30个核苷酸的双链RNA，包含正义链和反义链。siRNA通过形成沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，介导RISC途径的RNA转录物靶向切割。具体地，siRNA通过已知的RNA干扰(RNAi)过程指导mRNA序列的特异性降解，抑制mRNA翻译成氨基酸和转化为蛋白质。
正义链和反义链通常形成双链siRNA(“dsRNA”)，在本发明中也称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链区可以为12-30个核苷酸对长。例如，双链体区域可以为14-30个核苷酸对长，17-30个核苷酸对长，27-30个核苷酸对长，17-23个核苷酸对长，17-21个核苷酸对长，17-19个核苷酸对长，19-25个核苷酸对长，19-23个核苷酸对长，19-21个核苷酸对长，21-25个核苷酸对长或21-23个核苷酸对长。在另一个实施例中，双链体区域选自15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26和27个核苷酸长。
术语“iRNA”，“RNAi剂”“iRNA剂”，“RNA干扰剂”在此可互换使用，是指在此所定义的术语包含RNA剂，并且介导通过RNA诱导沉默复合体(RISC)途径的RNA转录物靶向切割。iRNA通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节，例如抑制，AGT在细胞中的表达，如受试者的细胞，如哺乳动物受试者内。
在本发明中，术语“反义链(或称引导链)”包括与一个靶序列基本上互补的区域。“正义链(或称随从链)”是指含有与在反义链基本上互补的RNAi链。术语“基本上互补”是指完全互补或至少部分互补，例如该反义链与靶序列完全互补或至少部分互补。部分互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内，其中，最耐受的错配存在于末端区域内，例如在RNAi的5’-和/或3’-末端的5、4、3或2个核苷酸内部。
需要说明的是，反义链与mRNA的“至少部分基本上互补”是指反义链具有与感兴趣的mRNA的一个连续部分基本互补的多核苷酸。
术语“核苷酸悬端”或“突出端”是指至少一个非配对的核苷酸，其从iRNA的双链体结构(例如，dsRNA)悬端。例如当dsRNA的一条链的3′-端延伸超过另一条链的5′-端时或反之亦然，存在核苷酸悬端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的悬端；可替代地，该悬端可以包括至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个或更多个核苷酸。核苷酸悬端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个悬端可以处于正义链、反义链或其任意组合上。另外，悬端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义或正义链的5′末端、3′末端或两个末端上。
本发明所述的缀合基团包括药学上可接受的缀合基团，一般来说，药学上可接受的缀合基团包含药学上可接受的靶向分子(或靶向配体)和任选的接头(linker)。在本发明的一些实施例中，所述缀合基团为GalNAc或其衍生物。示例性的缀合基团、接头、靶向分子的种类可参见WO2015006740A2的公开内容。示例性的缀合基团包括但不限于L96或DAW40007-4。
除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。
本发明所述双链siRNA缀合物是双链siRNA和药学上可接受的缀合基团连接形成的化合物，并且双链siRNA和药学上可接受的缀合基团共价连接。
术语“血管紧张素原相关疾病”或“AGT相关疾病”是由肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活引起或与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)相关的疾病或失调，或是其症状或其进展对应于RAAS失活的疾病或失调。术语“血管紧张素原相关疾病”包括将受益于AGT表达降低的疾病、失调或病症。这样的疾病通常与高血压相关。血管紧张素原相关疾病的非限制性实例包括高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为essential hypertension(原发高血压)或特发性高血压)、继发性高血压(也称为inessential hypertension(非原发性高血压))、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
在本发明中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性siRNA与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。
在本发明中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
在本发明中，术语“药学上可接受的载体”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的载体与本发明的RNAi(如siRNA)不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
除了任何常规的载体外，与本发明的RNAi(如siRNA)不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
在一些实施例中，根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体可以为本领域常规采用的各种载体，例如，可以包括pH值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述PH缓冲液可以是乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任意组合。所述pH值缓冲液可以为pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇和蔗糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％(如0.01重量％、0.05重量％、0.1重量％、0.5重量％、1重量％、5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％或以上任意两个数值之间的任意值)。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以确定所述渗透压调节剂的含量
本发明中，术语“治疗”是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本发明使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本发明使用的“治疗”涵盖将药物、RNAi试剂或siRNA给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本发明所述RNAi试剂、siRNA或siRNA缀合物的药物给予有需要的个体。
本发明中所述“RNAi试剂”指含有能够以序列特异性方式降解或抑制靶信使RNA(mRNA)转录并翻译的RNA或RNA样(例如，化学修饰的RNA)寡核苷酸分子的试剂。本发明中RNAi试剂可以通过RNA干扰机制(即，通过与哺乳动物细胞的RNA干扰通路构成机制(RNA诱导的沉默复合物或RISC)相互作用诱导RNA干扰)操纵，或通过任何其它机制或途径起作用。RNAi试剂包括但不限于：单链寡核苷酸、单链反义寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和Dicer底物。
如无特别说明，在本发明上下文中，大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基；小写字母表示核苷酸核糖2位被甲氧基修饰的碱基，如c、g、u、a分别表示2'-OMe(2'-O-甲基)C、2'-OMe G、2'-OMe U和2'-OMe A；大写字母右边f表示核苷酸核糖2位被氟代修饰的碱基，如Cf、Gf、Uf、Af分别表示2'-F(2'-氟)C、2'-F G、2'-F U和2'-FA；“s”表示与“s”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接，例如，“gsu"表示g和u残基之间通过硫代磷酸酯基连接；Tgn表示胸腺嘧啶-二醇核苷酸残基，其结构为双链siRNA或寡核酸中的Y表示Y2为
本发明TNA、PNA、D-FNA、ANA-5、HNA-5、FANA-5、ANA-6、HNA-6、FANA-6、bcDNA、tcDNA、S-MC、N-MC、2’-F-NMC、cEt、D和InvAb分别为如下所示结构：
其中，B为碱基(包括天然的碱基(A、U、G、C或T)或修饰的碱基)，各TNA、PNA、D-FNA、ANA-5、HNA-5、FANA-5、ANA-6、HNA-6、FANA-6、bcDNA、tcDNA、S-MC、N-MC和2’-F-NMC独立地通过磷酸酯基键或硫代磷酸酯键与其余核苷酸和/或缀合基团链接，本发明还包它们的立体异构体。其中A、U、G、C或T的应当理解为不含糖的碱基A、U、G、C或T，再如，本发明表1中A、U、G或C应当理解为含碱基A、U、G或C的核苷。
本发明解锁核酸修饰的核苷(UNA)结构为所述的乙二醇核酸修饰的核苷(GNA)的结构为B为碱基(包括天然的碱基(A、U、G、C或T)或修饰的碱基)。
本发明中，“磷酸酯基团”、“磷酸酯基”、“磷酸酯键”可互换使用，包括磷酸一酯、磷酸二酯或磷酸三酯。“硫代磷酸酯基团”中的“磷酸酯基团”也具有同样的含义。若无特别说明，天然核苷酸间磷酸酯基为磷酸二酯基。
在发明中，“脱氧核苷酸”是指核苷酸戊糖中羟基脱氧后的核苷酸，其脱氧的位置可为2'-OH，也可为3'-OH。
在本发明的一些可选实施例中，所述脱氧核苷酸包括3'-脱氧修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸。
在发明中，“2'-脱氧修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)脱氧后为氢(2'-H)，“3'-脱氧修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(3'-OH)脱氧后为氢(3'-H)。
在发明中，“2'-X修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被X(2'-X)取代。例如：“2'-氟代修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被氟(2'-F)取代，“2'-氨基修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被氟(2'-NH2)取代，“2'-O-烯丙基修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被烯丙氧基(2'-OCH2CH＝CH2)取代，“2'-烷基修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被烷基(2'-烷基)取代，“2'-O-烷基修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被烷氧基(2'-烷氧基)取代，“2'-甲氧基修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被甲氧基(2'-OCH3)取代，“2'-甲氧乙基修饰”是指核苷酸戊糖中羟基(2'-OH)被甲氧乙基(2'-CH2CH2OCH3)取代。
在发明中，“锁核苷酸”是指核苷酸戊糖上的2'与4'碳连结在一起修饰后获得的核苷酸。
在发明中，“5'-X修饰”是指核苷酸戊糖中磷酸酯(5'-PO(OH)2)被X(5'-X)取代。例如：“5'-氨基磷酸酯修饰”是指核苷酸戊糖中磷酸酯基(5'-PO(OH)2)被氨基磷酸酯基取代，“5'-硫代磷酸酯基修饰”是指核苷酸戊糖中磷酸酯基(5'-PO(OH)2)被硫代磷酸酯基取代，“5'-甲基膦酸酯基修饰”是指核苷酸戊糖中磷酸酯基(5'-PO(OH)2)被甲基磷酸酯基取代，“5'-磷酸酯模拟物修饰”是指核苷酸戊糖中磷酸酯基(5'-PO(OH)2)被磷酸酯模拟物取代。
在发明中，“5'-甲基化胞嘧啶修饰”或“5-甲基胞嘧啶修饰”是指在胞嘧啶第5位碳原子发生甲基化；“5'-甲基化尿嘧啶修饰”或“5-甲基尿嘧啶修饰”是指在尿嘧啶第5位碳原子发生甲基化。
在本发明中，2'-氟代修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-烯丙基修饰的核苷酸中的“2'”是指核糖的2位被相应的基团修饰
如发明所使用，“化学修饰”或“修饰”意指当与天然存在的对应物相比时具有化学差异的结构，包括经化学手段的所有改变，例如化学部分的添加或去除，或以一个化学部分取代另一个化学部分。
本发明化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本发明含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
可以通过手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，其中将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过使用色谱法完成的，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合(例如由胺生成氨基甲酸盐)。
本发明还包括一些与本发明中记载的那些相同的，但一个或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数的原子置换的同位素标记的本发明化合物。可结合到本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、123I、125I和36Cl等。
除另有说明，当一个位置被特别地指定为氘(D)时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少1000倍的丰度的氘(即，至少10％的氘掺入)。示例中化合物的具有大于氘的天然丰度可以是至少1000倍的丰度的氘、至少2000倍的丰度的氘、至少3000倍的丰度的氘、至少4000倍的丰度的氘、至少5000倍的丰度的氘、至少6000倍的丰度的氘或更高丰度的氘。本发明还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘化形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
本发明所述的缀合基团可以增强治疗剂向诸如人或动物的对象内特定靶位置(例如，特定器官或组织)的递送。在本发明的一些实施方式中，所述缀合基团可以增强表达抑制性寡聚核苷酸的靶向递送。在本发明的一些实施方式中，缀合基团可以增强表达抑制性寡聚核苷酸向肝脏的递送。
本发明所述的缀合基团可以直接或间接地连接至化合物，诸如治疗剂，例如，表达抑制性寡聚核苷酸，例如，表达抑制性寡聚核苷酸的3’或5’末端。在本发明的一些实施方式中，表达抑制性寡聚核苷酸包括一个或多个修饰的核苷酸。在本发明的一些实施方式中，表达抑制性寡聚核苷酸是RNAi试剂，诸如包含正义链和反义链的双链RNAi试剂。在本发明的一些实施方式中，本发明所公开的缀合基团连接至双链RNAi试剂的正义链的3’末端。在一些实施方式中，本发明所公开的缀合基团经由磷酸酯、硫代磷酸酯或膦酸酯基团在双链RNAi试剂正义链3’末端与表达抑制性寡聚核苷酸试剂连接。
需要再此特别注明的是：在本发明说明书中的序列信息与序列表(ST26序列表)中序列信息有冲突或不一致的情况下，以说明书记载的序列信息为准。
本发明中立体化学的定义和惯例的使用通常参考以下文献：S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；and Eliel,E.and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994.本发明的化合物可以包含不对称中心或手性中心，因此存在不同的立体异构体。本发明的化合物所有的立体异构形式，包括但绝不限于，非对映异构体，对映异构体，阻转异构体，和它们的混合物，如外消旋混合物，组成了本发明的一部分。很多有机化合物都以光学活性形式存在，即它们有能力旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，前缀D、L或R、S用来表示分子手性中心的绝对构型。前缀d、l或(+)、(-)用来命名化合物平面偏振光旋转的符号，(-)或l是指化合物是左旋的，前缀(+)或d是指化合物是右旋的。这些立体异构体的化学结构是相同的，但是它们的立体结构不一样。特定的立体异构体可以是对映体，异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。50：50的对映体混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，这可能导致化学反应过程中没有立体选择性或立体定向性。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指等摩尔的两个对映异构体的混合物，缺乏光学活性。
术语“互变异构体”或“互变异构的形式”是指不同能量的结构的同分异构体可以通过低能垒互相转化。例如质子互变异构体(即质子转移的互变异构体)包括通过质子迁移的互变，如酮-烯醇和亚胺-烯胺的同分异构化作用。
术语“组合物”表示含有一种或多种本发明所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体的药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“可药用载体”或“药学上可接受的载体”包括但不限于任何已经被美国食品和药物管理局批准对于人类或家畜动物使用可接受的任何助剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增香剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
如无特殊说明，本发明的“化合物”、“配体”、“核酸缀合物”、“双链siRNA缀合物”、“双链siRNA”、“核酸”均可独立地以盐、混合盐或非盐(例如游离酸或游离碱)的形式存在。当以盐或混合盐的形式存在时，其可为药学上可接受的盐。
术语“可接受的盐”包括可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。“可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其它副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、2,2-二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、十一碳烯酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、癸二酸盐、己二酸盐、戊二酸盐、丙二酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、肉桂酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、焦谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、4-氨基水杨酸盐、萘二磺酸盐等。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
“药学上可接受的碱加成盐”是指能够保持游离酸的生物有效性而无其它副作用的、与无机碱或有机碱所形成的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐及镁盐，优选钠盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺类、仲胺类及叔胺类，被取代的胺类，包括天然的被取代胺类、环状胺类及碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。优选的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱及咖啡因。这些盐可通过本领域已知的方法制备。
像本发明所描述的，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像实施例里面特殊的例子，子类，和本发明所包含的一类化合物。一般而言，术语“取代的”，表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以有一个取代基在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不止一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。
术语“羟基保护基”是指一个不稳定的化学部分，它在一个或多个合成程序过程中保护羟基基团不发生不希望的反应。在该一个或多个合成程序后，该羟基保护基可被选择性地去除。本领域中已知的羟基保护基总体上描述于T.H.格林(Greene)和P.G.M.伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，第3版，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约(1999)中。本发明羟基保护基的例子包括但不限于C1-10烷基甲基、苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、甲氧羰基、叔-丁氧基羰基、异丙氧基羰基、联苯基甲氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2-糠基氧基羰基、烯丙氧羰基、乙酰基(Ac或-C(O)CH3)、甲酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基(Bz或-C(O)C6H5)、C1-10烷基(甲基，叔丁基等)、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1,1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、C6-10芳基C1-4烷基(如苄基，苯乙基等)、对甲氧基苄基二苯甲基、三苯甲基(triphenylmethyl或trityl)、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、C1-10烷硅基(如三甲基甲硅烷基(TMS或-Si(CH3)3))、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、MMTr、DMTr或4’,4’,4’-三甲氧基三苯甲基等。
术语“氨基保护基”是指在合成程序过程中保护氨基基团不发生不希望的反应的不稳定化学部分。在该一个或多个合成程序后，如此处所述的氨基保护基可被选择性地去除。本领域中已知的氨基保护基总体上描述于T.H.格林(Greene)和P.G.M.伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis)，第3版，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约(1999)中。氨基保护基的实例包括但不限于乙酰基、叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基以及苄氧基羰基等。
术语“固相支持体”具体表示在其上可发生寡核苷酸合成的任何颗粒、珠或表面。例如无机固相支持体和有机固相支持体，均可选择用于在本发明实施例中。无机固相支持体优选地选自硅胶和可控微孔玻璃珠(Controlled-pore glass，简称CPG)。有机固相支持体为树脂，优选大孔树脂，更优选高度交联的聚苯乙烯、Tentagel(由低交联的聚苯乙烯基质组成的接枝共聚物，聚乙二醇(PEG或POE)接枝于其上)、聚乙烯乙酸酯(PVA)、波罗斯(Poros)-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物、氨基聚乙二醇和纤维素等。本发明的优选实施例利用基于CPG的固相支持体。许多其他可购买的固相支持体均属于本发明。
附图说明：
附图1显示了本发明siRNA缀合物和溶媒对照组(生理盐水)在hAGT转基因小鼠模型实验中对AGT的抑制效果。其中，缀合物1-6分别代表siRNA缀合物ID NO 1-6，其对应的具体序列详见表2。
本发明化合物的详细描述
本发明提供了一种新型的双链siRNA及其缀合物，其可以实现RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的血管紧张素原(AGT)基因的RNA转录物的切割。AGT基因可以在细胞内，例如，受试者(如人)体内的细胞。本发明还提供了所述双链siRNA及其缀合物在制备用于治疗和/或预防AGT相关疾病(如高血压)的药物中的用途，所述的双链siRNA及其缀合物可以抑制或降低AGT基因表达，其通过RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的AGT基因的RNA转录物的切割而用于抑制AGT基因的表达。本发明所述的siRNA及其缀合物具有较高的体内递送效率和较好的稳定性，其对AGT具有较高的基因表达抑制活性和/或较低的毒性。
一方面，本发明提供了一种双链siRNA、其缀合物或盐，其包含形成双链区的一条正义链和一条反义链，所述正义链包含如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:90所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1中正义链之一)、或与其具有0、1、2、3、4或5个核苷酸差异的核苷酸序列；其中，所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:90所示的核苷酸序列的详细信息见本发明说明书表1。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述反义链包括如SEQ ID NO:91～SEQ ID NO:180所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1中反义链之一)、或与其具有0、1、2、3、4或5个核苷酸差异的核苷酸序列；其中，所述SEQ ID NO:91～SEQ ID NO:180所示的核苷酸序列的详细信息见本发明说明书表1。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其中，所述双链siRNA为修饰的双链siRNA。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA缀合物为所述双链siRNA与缀合基团缀合而成。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链的长度不超过23个核苷酸长，所述反义链的长度不超过23个核苷酸长。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链的长度为19、20、21、22或23个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述反义链的长度为21、22或23个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链的长度不超过21个核苷酸，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链包含3’突出端和/或5’突出端，所述3’突出端或5’突出端包括1、2或3个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述反义链包含3’突出端和/或5’突出端，所述3’突出端或5’突出端包括1、2或3个核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA、其缀合物或盐包含siRNA ID NO:1～siRNA ID NO:90所示的双链siRNA之一，其中，所述siRNA ID NO:1～siRNA ID NO:90所示的双链siRNA信息详见本发明说明书表1。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立任选地选自下列的至少之一：
非天然碱基的核苷酸、脱氧核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸(如2'-甲氧基修饰的核苷酸)、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、锁核苷酸(LNA)、解锁核酸修饰的核苷酸(UNA)、2'-烯丙基修饰的核苷酸、无碱基核苷酸、吗啉基修饰的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、PEG修饰的核苷酸、5'-氨基磷酸酯修饰的核苷酸、硫代磷酸酯连接修饰的核苷酸(如：5'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸和/或所述3'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸)、5'-甲基膦酸酯基修饰的核苷酸(如5’-(E)-VP修饰的核酸)、5’-乙烯基磷酸酯修饰的核酸、5'-磷酸酯模拟物修饰的核苷酸、ANA-5修饰的核苷酸、FANA-5修饰的核苷酸、ANA-6修饰的核苷酸、FANA-6修饰的核苷酸、TNA修饰的核苷酸、PNA修饰的核苷酸、D-FNA修饰的核苷酸、HNA修饰的核苷酸(优选HNA-5修饰的核苷酸和HNA-6修饰的核苷酸)、FANA-6修饰的核苷酸、bcDNA修饰的核苷酸、tcDNA修饰的核苷酸、S-MC修饰的核苷酸、N-MC修饰的核苷酸、2’-F-NMC修饰的核苷酸、5'-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸、5'-甲基尿嘧啶修饰的核苷酸、2,6-二氨基修饰的腺嘌呤修饰的核苷酸、cEt、D替换的核苷酸(即)、InvAb(本发明中也称InvB)和乙二醇核酸(GNA)，其中，所述的2'-是指核糖的2位，如2'-氟代修饰的核苷酸是指核糖的2位被氟取代的核苷酸，再如，2'-甲氧基修饰的核苷酸是指核糖的2位被甲氧基取代的核苷酸。在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立任选地选自下列的至少之一：
2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、5'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸、3'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、锁核酸修饰的核苷酸、解锁核酸修饰的核苷酸(UNA)、乙二醇核酸(GNA)、5’-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5’-(E)-VP修饰的核酸、cEt、D替换的核苷酸、InvAb(本发明中也称InvB)和Y替换的核苷酸，所述Y为所述D为其中，所述的2'-是指核糖的2位，如2'-氟代修饰的核苷酸是指核糖的2位被氟取代的核苷酸，再如，2'-甲氧基修饰的核苷酸是指核糖的2位被甲氧基取代的核苷酸。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述修饰的核苷酸各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的3'末端和正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位和第21位。
当本发明所述修饰的核苷酸存在正义链的5'末端或3'末端时，所述修饰的核苷酸通过硫代磷酸酯或磷酸酯基连接在正义链的5'末端或3'末端。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述修饰的核苷酸各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的3'末端和反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位和第23位。
当本发明所述修饰的核苷酸存在反义链的5'末端或3'末端时，所述修饰的核苷酸通过硫代磷酸酯或磷酸酯基连接在反义链的5'末端或3'末端。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位、第3-4位、第4-5位、第5-6位、第6-7位、第7-8位、第8-9位、第9-10位、第10-11位、第11-12位、第12-13位、第13-14位、第14-15位、第15-16位、第16-17位、第17-18位、第18-19、第19-20位和第20-21位位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位、第3-4位、第4-5位、第5-6位、第6-7位、第7-8位、第8-9位、第9-10位、第10-11位、第11-12位、第12-13位、第13-14位、第14-15位、第15-16位、第16-17位、第17-18位、第18-19位之间、第19-20位、第20-21位、第21-22位和第22-23位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸和Y各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位和第21位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸和Y各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位和第23位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第5位、第7位、第8位、第9位、第10位和第11位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第9位、第10位和第11位，任选还包括第5位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第8位、第9位、第12位、第14位和第16位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第14位和第16位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，选自以下一个或多个位置：
所述2’-脱氧修饰的核苷酸存在于所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第5位、第7位、第10位、第12位和第14位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述2’-脱氧修饰的核苷酸存在于所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第5位、第7位、第12位和第14位。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述InvAb修饰为通过硫代磷酸酯基或磷酸酯基连接在正义链的5'末端或3'末端。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置：
所述正义链的3'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
所述反义链的3'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
本发明所述的“至少一个修饰的核苷酸”是指本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐中，所述的正义链包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个修饰的核苷酸，和/或所述反义链包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个修饰的核苷酸。
本发明所述的“各自独立地任选地存在于选自以下一个或多个位置”或“各自独立地存在于选自以下一个或多个位置”中的“一个或多个位置”是指存在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个位置的修饰，其中的任选地，表示可以被修饰也可能不存在修饰，即0个修饰。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA包含2个Y。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA包含3个Y。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其正义链具有以下所示之一的修饰模式：
正义链(5’-3’)：mBsmBsmBmBmBmBBfmBBfBfBfmBmBmBmBmBmBsmBsmB；
正义链(5’-3’)：mBsmBsmBmBmBmBBfmBBfBfBfmBmBmBmBmBmBmBmB；
正义链(5’-3’)：mBmBmBmBmBmBBfmBBfBfBfmBmBmBmBmBmBsmBsmB；和
正义链(5’-3’)：mBsmBsmBmBmBmBmBmBBfBfBfmBmBmBmBmBmBsmBsmB；
其中，各B独立地为碱基A、碱基U、碱基G、碱基C或碱基T的核苷；B左边的m表示核糖2’-甲氧基修饰，如mB表示核苷酸核糖2位被甲氧基修饰的碱基；s为硫代磷酸酯键；B右边的f表示核糖2’-F修饰，如Bf表示核苷酸核糖2位被F取代的碱基；如碱基之间无s字母表示核苷之间通过磷酸酯键连接；其中，正义链的3’未端或5’未端通过磷酸酯键或硫代磷酸酯与GalNAc或其衍生物连接，优选与L96或DAW4007连接。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其反义链具有以下所示的修饰模式：
反义链(5’-3’)：mBsBfsmBmBmBBfmBmBmBmBmBmBmBBfmBBfmBmBmBsmBsmB
反义链(5’-3’)：mBsdBsmBmBdBmBdBmBmBmBmBdBmBdBmBmBmBmBmBsmBsmB和
反义链(5’-3’)：mBsBfsmBmBmBBfmBmBmBsmBsmBmBmBBfmBBfmBmBmBsmBsmB
其中，各B独立地为碱基A、碱基U、碱基G、碱基C或碱基T的核苷酸；B左边的m表示核糖2’-甲氧基修饰，如mB表示核苷酸核糖2位被甲氧基修饰的碱基；B左边的d表示核糖2’脱氧，如dB表示核苷酸核糖2位H的碱基；s为硫代磷酸酯键；B右边的f表示核糖2’-F修饰，如Bf表示核苷酸核糖2位被F取代的碱基；如碱基之间无s字母表示核苷之间通过磷酸酯键连接。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，其siRNA具有以下修饰模式1-6之一：
其中，其中，各B独立地为碱基A、碱基U、碱基G、碱基C或碱基T的核苷酸；B左边的m表示核糖2’-甲氧基修饰，如mB表示核苷酸核糖2位被甲氧基修饰的碱基；B左边的d表示核糖2’脱氧，如dB表示核苷酸核糖2位H的碱基；s为硫代磷酸酯键；B右边的f表示核糖2’-F修饰，如Bf表示核苷酸核糖2位被F取代的碱基；如碱基之间无s字母表示核苷之间通过磷酸酯键连接。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链区为17-23个核苷酸对长。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链区为17、18、19、20、21、22或23个核苷酸对长。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，本发明所述正义链包含如SEQ ID NO:181～SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1-A中正义链之一)，所述正义链的长度不超过21个核苷酸，其中，所述的SEQ ID NO:181～SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列详细信息见本发明说明书表1-A。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述反义链包括如SEQ ID NO:214～SEQ ID NO:224所示的核苷酸序列中之一(即本发明表1-A中反义链之一)，所述反义链的长度不超过23个核苷酸；其中，所述的SEQ ID NO:214～SEQ ID NO:224所示的核苷酸序列的详细信息见本发明说明书表1-A。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，本发明所述双链siRNA、其缀合物或盐包含siRNA ID NO:91～siRNA ID NO:126所示的双链siRNA之一；其中，所述正义链的长度不超过21个核苷酸，所述反义链的长度不超过23个核苷酸，所述siRNA ID NO:91～siRNA ID NO:126所示的双链siRNA详细信息见本发明说明书表1-A。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述siRNA、siRNA缀合物或siRNA缀合物的盐包含以下双链核苷酸序列之一：
所述正义链包含5’-csasagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’的核苷酸序，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagscsa-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfsCfuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaaguuGfaGfAfAfcaaaaasusa-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usAfsuuuUfuguucucAfaCfuugsasa-3’的核苷酸序列。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA缀合物中，所述双链siRNA的正义链或反义链的3’末端或5’末端与缀合基团缀合。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA的正义链的3’末端与缀合物缀合。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团缀合。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述缀合基团包括GalNAc或其衍生物。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述缀合基团为通过二价、三价或四价分支接头连接的GalNAc或其衍生物。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述缀合基团为DAW40007-4、L-96或其立体异构体，其中，所述缀合基团L-96和DAW40007-4结构分别为：
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述siRNA缀合物具有以下双链核苷酸序列之一：
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-csasagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfY2cacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBsgsgcaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugccsusc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfsCfuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
所述正义链包含5’-InvBscsaaguuGfaGfAfAfcaaaaausasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usAfsuuuUfuguucucAfaCfuugsasa-3’的核苷酸序列。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA或其缀合物或盐还包括(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、和/或其外消旋混合物。
在本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐的一些实施例中，所述双链siRNA或其缀合物的硫代磷酸酯部分包括(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、和/或其外消旋混合物。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的双链siRNA、其缀合物或盐、双链siRNA缀合物或其盐和药学上可接受的载体。
在一些实施例中，本发明所述药物组合物可以为注射液。
在一些实施例中，本发明所述注射液可以用于皮下、肌肉或静脉的注射。
在一些实施例中，本发明药物组合物还包括其他治疗剂，其中所述其他的治疗剂选自利尿剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β-阻滞剂、血管舒张剂、钙通道阻滞剂、醛固酮拮抗剂、α2-激动剂、肾素抑制剂、α-阻滞剂、外周作用肾上腺素能剂、选择性D1受体部分激动剂、非选择性α-肾上腺素能拮抗剂、合成的甾体抗盐皮质激素剂，或前述的任意组合，以及配制成药剂组合的高血压治疗剂。
另一方面，本发明还了提供了一种抑制患者体内AGT基因的表达的方法，其包括向患者给予本发明双链siRNA和双链siRNA缀合物或其组合物(即双链RNAi剂)，所述核酸配体缀合物或其组合物可为治疗有效量。
在一些实施例中，其中所述双链RNAi剂以0.01mg/kg至10mg/kg或0.5mg/kg至50mg/kg的剂量施用，或以10mg/kg至30mg/kg的剂量施用，或以3mg/kg的剂量施用，或以10mg/kg的剂量施用。
在一些实施例中，其中所述双链RNAi剂每周两次以0.5mg/kg的剂量施用，或每隔一周以10mg/kg的剂量施用，或每周一次以0.5-1mg/kg的剂量施用。
在一些实施例中，其中所述双链RNAi剂皮下施用或静脉内施用。
在一些实施例中，其中所述双链RNAi剂以两个或更多个剂量施用。
再一方面，本发明提供了本发明所述的双链siRNA缀合物、其缀合物和其盐，以及本发明所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防AGT相关疾病的药物中的用途。
在本发明所述的用途的一些实施例中，所述AGT相关疾病为高血压。
在本发明所述的用途的一些实施例中，所述高血压选自临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压。
本发明的核酸缀合物、组合物、制剂、给药和治疗疾病方法
本发明所述的核酸缀合物(如siRNA缀合物或药物组合物)的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
在一些实施例中，本发明供含有如此处所述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与AGT基因的表达或活性相关的疾病或病症。此类药物组合物基于递送模式而进行配制。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过皮下(SC)或静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。另一个实例是以下组合物，该组合物被配制用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，例如通过连续泵输注。本发明的药物组合物可以按足以抑制AGT基因的表达的剂量给予。通常，本发明的iRNA的适合剂量处于每日受体每千克体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。例如dsRNA可以按每个单剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、或约50mg/kg施用。
例如可以按以下剂量给予dsRNA：大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在另一些实施例中，将该dsRNA按以下的剂量给予：约0.1至约50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/kg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/kg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/kg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/kg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/kg、约1.5至约20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
可通过本领域己知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)，优选静脉注射内给药。
在一些实施例中，可以在一段时间内，如在5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20和21，22，23，24或约25分钟时间段内，通过静脉内输注来施用药物组合物。例如，可以规律地重复施用，如每周、两周(即，每两周)，持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长时间。初始治疗方案后，可以以较低频率来给予治疗。例如，每周或两周施用三个月后，施用可以每月一次重复，持续六个月或一年或更长时间。
在一些实施例中，药物组合物可以通过皮下施用来施用。药物组合物可以每日施用一次，或iRNA可以在一天中以合适的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量来施用，或甚至使用连续输注或通过控释制剂来递送。在这种情况中，每个亚剂量中含有的iRNA必须相应地较少，以获得总的日剂量。也可以复合剂量单位用于在几天内递送，例如，使用常规持续释放制剂，其在几天的时间段内提供持续的iRNA释放。持续释放制剂是本领域公知的并且对于在特定部分递送药剂特别有用，如可以与本发明的药剂一起使用。在这个实施方案中，剂量单位含有相应的多个日剂量。最初可以施用较高剂量(即，负荷剂量)，接着在持续时间段内施用较低剂量。
在一些实施例中，单个剂量的药物组合物可以是长效的，使得随后的剂量以不超过3，4或5天的间隔，或不超过1，2，3或4周的间隔来施用。在本发明的一些实施方案中，每周一次施用单个剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施方案中，每两月施用单个剂量的本发明的药物组合物。在特定实施方案中，以约每月一次至约每季度一次(即，约每三个月一次)施用iRNA。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体制剂。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的制剂。
本发明的药物制剂(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些制剂是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本发明的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
本发明公开的药物组合物包括适于胃肠外施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂型形式存在并且可以通过药学领域公知的任何方法来制备。可以与辅料物质组合来制备单剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗作用的siRNA的量。一般而言，以百分之一为单位，该量为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
在一个方面中，本发明提供了治疗患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者的方法，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压))、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠情况中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知功能障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。本发明的治疗方法(和用途)包括将治疗有效量的靶向AGT基因的iRNA剂或包含靶向AGT基因的iRNA剂的药物组合物施用于受试者，例如，人，由此治疗患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者。
在另一个方面中，本发明提供了治疗有效量的本发明的iRNA剂用于治疗受试者的用途，例如，将得益于AGT表达降低和/或抑制的受试者。
在进一步的方面中，本发明提供了靶向AGT基因的本发明iRNA剂(例如，dsRNA)或包含靶向AGT基因的iRNA剂的药物组合物在制造用于治疗受试者的药物中的用途，例如，将得益于AGT表达降低和/或抑制的受试者，如患有将得益于AGT表达降低的失调的受试者，所述失调例如为AGT相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压)、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
在另一个方面中，本发明提供了本发明的iRNA(例如，dsRNA)用于预防患有将得益于AGT表达降低和/或抑制的失调的受试者中的至少一种症状的用途，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压))、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
在进一步的方面中，本发明提供了本发明的iRNA剂在制造用于预防患有将得益于AGT表达降低和/或抑制的失调的受试者中的至少一种症状的药物中的用途，所述失调例如为AGT-相关疾病，例如，高血压，例如，临界性高血压(也称为高血压前期)、原发性高血压(也称为原发高血压或特发性高血压)、继发性高血压(也称为非原发性高血压)、高血压危症(也称为恶性高血压)、高血压急迫状态、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠相关的高血压(例如，先兆子痫、子痫和产后子痫前期)、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压(也称为肾性高血压)、戈德布拉特氏高血压、高眼压症、青光眼、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压、不稳定性高血压；高血压性心脏病、高血压性肾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、血管病(包括外周血管病)、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、慢性心力衰竭、心肌病、糖尿病性心肌病、肾小球硬化症、主动脉缩窄、主动脉瘤、心室纤维化、库欣综合征和其他糖皮质激素过多状态(包括慢性类固醇治疗)、嗜铬细胞瘤、肾素瘤、继发性醛固酮增多症和其他盐皮质激素过多状态、睡眠呼吸暂停、甲状腺/甲状旁腺疾病、心力衰竭(例如，左心室收缩功能不全)、心肌梗死、心绞痛、中风、糖尿病(例如，糖尿病性肾病)、肾病(例如，慢性肾病或糖尿病性肾病，任选在妊娠环境中)、肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)、认知障碍(如阿尔茨海默病)和系统性硬化(例如，硬皮病肾危象)。在特定实施方案中，AGT相关疾病包括宫内发育迟缓(IUGR)和胎儿生长受限。
本发明所述化合物、双链siRNA、双链siRNA缀合物的一般合成方法
一般地，本发明的化合物、核酸缀合物可以通过本发明所描述的方法制备得到。下面的反应方案和实施例用于进一步举例说明本发明的内容。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明，所有的温度定为摄氏度(℃)。色谱柱使用硅胶柱，硅胶(200-300目)购于青岛海洋化工厂，NH2CPG都是购置于河北迪纳兴科。核磁共振光谱以CDC13、DMSO-d6、CD3OD或丙酮-d6为溶剂(以ppm为单位)，用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰)，d(doublet，双峰)，t(triplet，三重峰)，m(multiplet，多重峰)，br(broadened，宽峰)，dd(doublet of doublets，双二重峰)，dt(doublet of triplets，双三重峰)，br.s(broadened singlet，宽单峰)，q(四重峰)。偶合常数J，单位用赫兹(Hz)表示。
低分辨率质谱(MS)数据通过配备G1312A二元泵和a G1316A TCC(柱温保持在30℃)的Agilent6320系列LC-MS的光谱仪来测定的，G1329A自动采样器和G1315B DAD检测器应用于分析，ESI源应用于LC-MS光谱仪。
高分辨率质谱(MS)数据通过配备G1311A四元泵和G1316A TCC(柱温保持在30℃)的Agilent 6130系列LC-MS的光谱仪来测定的，G1329A自动采样器和G1315D DAD检测器应用于分析，ESI源应用于HR-MS光谱仪。
下面简写词的使用贯穿本发明：
DCM     二氯甲烷                           DMTrCl 4,4'-双甲氧基三苯甲基氯
TFA      三氟乙酸                           TEA 三乙胺i-Pr     异丙基
Py       吡啶                                EtOAc,EA  乙酸乙酯
PE       石油醚                             HOBT   1-羟基苯并三唑
TBAF  四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液          DMAP   4-二甲氨基吡啶
ACN      乙腈                                MsCl       甲磺酰氯
Ac2O       乙酸酐                            TMSOTf   三氟甲磺酸三甲基硅酯
Boc       叔丁氧羰基                         THF            四氢呋喃
MeOH           甲醇                         mL            毫升
DMSO          二甲亚砜                     min           分钟
DMF            N,N-二甲基甲酰胺              M,N,mol/L             摩尔/升
DCM           二氯甲烷                     h              小时
DIPEA           N,N-二异丙基乙胺              RT,rt          室温
TiPDSCl2   1,3二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷       CDCl3         氘代氯仿
TBDPSCl      叔丁基二苯基氯硅烷
HBTU       苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。尤其是小核酸的合成和核酸缀合物的合成，是可以根据本发明的实施例或本领域的常规调整合成得到。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
制备实施例
在以下制备实施例中，发明人以本发明的部分化合物为例，详细描述了本发明化合物的制备过程，其中，为CPG。
实施例1：核苷单体1的合成
步骤1:化合物1-2的合成
将(2R,3R,5R)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-甲腈(即化合物1-1)(1.0g,3.43mmol)加入到吡啶(15mL)中，混合物氮气保护，降至-5℃，再滴加1,3二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷(1.13mL,3.53mmol)，加完后，反应混合物升温至25℃搅拌反应20h。反应液减压浓缩除去溶剂，残余物经硅胶柱层析分离纯化(淋洗剂：PE/EA(v/v)＝2/3)，得白色固体化合物1-2(1.38g,75.3％)，MS(ESI,pos.ion)m/z:534.3[M+H]+.
步骤2:化合物1-3的合成
将化合物1-2(1.08g,2.02mmol)和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(0.48g,4.04mmol)加入到甲苯(15mL)中，升温至50℃搅拌反应4h。反应完后，减压浓缩，得化合物1-3，为白色泡沫状固体(1.19g,100％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:589.3[M+H]+；1H NMR(599MHz,DMSO-d6)δ8.95(s,1H),8.15(s,1H),6.90(d,J＝4.4Hz,1H),6.80(d,J＝4.5Hz,1H),6.49(d,J＝5.7Hz,1H),4.58(dd,J＝5.7,4.4Hz,1H),4.23–4.12(m,3H),3.92(dd,J＝13.2,2.5Hz,1H),3.25(s,3H),3.19(s,3H),1.06–1.04(m,7H),1.01(dd,J＝7.2,2.0Hz,6H),0.96(dd,J＝8.8,7.0Hz,8H),0.89(t,J＝7.6Hz,7H).
步骤3:化合物1-4的合成
将化合物1-3(0.84g,1.43mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，降温至0℃，然后依次加入碘甲烷(0.41g,2.86mmol)和氢化钠(0.11g,2.86mmol,60％)，0℃下搅拌反应20min。反应完后，将反应液倒入饱和NH4Cl溶液中，用EA萃取，浓缩有机相，残留物经硅胶柱层析分离(EA/PE(v/v)＝1/1)纯化，得化合物1-4，为白色固体(0.71g，83％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:603.40[M+H]+.
步骤4:化合物1-5的合成
将化合物1-4(5.1g,8.46mmol)、四氢呋喃(50mL)和四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(9.48mL,9.48mmol,1M)混合，室温搅拌反应。反应完后，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析分离(MeOH/DCM(v/v)＝1/20)纯化，得白色固体化合物1-5(2.4g,79％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:361.3[M+H]+.
步骤5:化合物1-6的合成
将化合物1-5(2.4g,6.66mmol)、二氯甲烷(50mL)、三乙胺(2.02g,19.98mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.081g,0.67mmol)混合，然后降温至0℃，再分批加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(2.71g,7.99mmol)。所得反应混合物升至室温搅拌反应3h。降温至0℃，分两次共加入4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.35g)，在0℃下，继续搅拌反应2h。反应体系加入MeOH(1mL)和DCM(100mL)稀释，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱纯化(EA/PE(v/v)＝2/1)，得到浅黄色固体化合物1-6(4.0g,91％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:663.7[M+H]+.
步骤6:化合物1的合成
将化合物1-6(2.0g,3.02mmol)和1H-四氮唑(0.25g,3.62mmol)加入到二氯甲烷(40mL)中，氮气保护，再滴加双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.92mL,6.04mmol)，室温搅拌反应4h。反应完后，加入DCM(20mL)和饱和碳酸氢钠溶液(10mL)，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得残留物经硅胶柱层析(EA/PE(v/v)＝4/1)纯化，得到化合物1(2.13g,82％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:864.9[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),8.00(d,J＝12.0Hz,1H),7.45–7.39(m,2H),7.34–7.28(m,4H),7.22(qd,J＝7.6,6.4,3.5Hz,3H),7.02(dd,J＝6.8,4.5Hz,1H),6.92(dd,J＝4.6,3.1Hz,1H),6.78(td,J＝8.5,4.4Hz,4H),4.93(dd,J＝25.0,5.0Hz,1H),4.64–4.43(m,2H),4.05–3.88(m,2H),3.79(dd,J＝3.7,2.4Hz,6H),3.60(d,J＝6.3Hz,4H),3.48(dd,J＝10.5,3.6Hz,1H),3.27(s,3H),3.24(s,3H),2.66(d,J＝6.4Hz,1H),2.06(s,1H),1.28(t,J＝7.1Hz,2H),1.19(dd,J＝6.8,4.1Hz,8H),1.04(d,J＝6.8Hz,4H).
31P NMR(162MHz,CDCl3)δ150.01,149.80.
实施例2：核苷单体DAW50072-a的合成
步骤1：DAW50072-1的合成
将3-丁烯-2-醇(1.5g,20.39mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.49g,20.39mmol)溶于DCM(150mL)中。搅拌下注入叔丁基二苯基氯硅烷(6.73g,24.47mmol)，室温反应过夜。反应液浓缩，残留物经硅胶柱层析(石油醚)纯化，得透明油状物DAW50072(4.975g，收率：78.60％)。1H NMR(599MHz,CDCl3)δ(ppm)7.71–7.66(m,4H),7.44–7.40(m,2H),7.36(dt,J＝7.9,4.1Hz,4H),5.86(ddd,J＝17.1,10.4,5.4Hz,1H),5.10(dt,J＝17.2,1.6Hz,1H),4.95(dt,J＝10.4,1.5Hz,1H),4.34–4.27(m,1H),1.14(d,J＝6.3Hz,3H),1.07(s,9H).
步骤2：DAW50072-2的合成
将DAW50072-1(4.975g,16.02mmol)溶于DCM(100mL)，搅拌下加间氯过氧苯甲酸(5.20g,25.63mmol)，室温反应过夜。反应液减压浓缩，残留物经硅胶柱层析(PE/EA(V/V)＝20/1)纯化，得透明油状物DAW50072-2(4.53g，收率：86.30％)。1H NMR(599MHz,CDCl3)δ(ppm)7.73(ddd,J＝11.1,8.0,1.4Hz,4H),7.46–7.37(m,6H),3.67–3.61(m,1H),3.05(ddd,J＝5.9,4.1,2.8Hz,1H),2.75–2.70(m,1H),2.53(dd,J＝5.0,2.7Hz,1H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H),1.10(s,9H).
步骤3：DAW50072-3的合成
将DAW50072-2(4.15g,12.71mmol)和尿嘧啶(1.57g,13.98mmol)溶于DMF(50mL)，降温至-5℃，搅拌下加入氢化钠(0.15g,3.81mmol)，加完搅拌5min后转移至室温，然后加热至110℃反应过夜。停止反应，降至室温后加入EA(100mL)稀释，所得混合物依次用饱和碳酸氢钠(150mL×2)水溶液和饱和氯化钠(150mL)水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物经硅胶柱层析(DCM/甲醇(V/V)＝20/1)纯化，得白色泡沫状固体DAW50072-3(3.43g，收率61.53％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:439.2[M+H]+.
步骤4：DAW50072-4的合成
将DAW50072-3(3.43g,7.82mmol)溶于THF(50mL)，搅拌下加入四丁基氟化铵(0.61g,2.35mmol)，35℃反应过夜。反应液浓缩，残留物经硅胶柱层析(DCM/甲醇(V/V)＝9/1)纯化，得白色泡沫状固体DAW50072-4(1.374g，收率87.76％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:201.2[M+H]+.
步骤5：DAW50072-a的合成
氮气保护下将DAW50072-4(4.37g,21.83mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.27g,2.18mmol)和TEA(7.28g,71.94mmol)溶于THF(150mL)，搅拌下加入DMTrCl(11.09g,32.74mmol)，室温反应过夜。反应液减压浓缩，残留物用DCM溶解(150mL)，然后用饱和氯化钠(100mL×3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，再经制备色谱柱纯化，得白色泡沫状固体DAW50072-5-a(3.60g，收率：32.82％)和DAW50072-5-b(2.48g，收率：22.61％)。1H NMR(599MHz,CDCl3)δ(ppm)8.73(s,1H),7.47–7.43(m,2H),7.34(t,J＝5.9Hz,4H),7.29(t,J＝7.6Hz,2H),7.23(d,J＝7.3Hz,1H),6.91(d,J＝7.9Hz,1H),6.83(d,J＝8.7Hz,4H),5.53(d,J＝7.9Hz,1H),3.79(s,6H),3.70–3.57(m,4H),2.66(d,J＝7.2Hz,1H),1.18(d,J＝6.5Hz,3H).
步骤6：合成DAW50072-a
将DAW50072-5-a(0.5g,0.99mmol)、1H-四氮唑(86mg,1.20mmol)和TEA(0.31g,3.02mmol)溶于DCM(20mL)，搅拌下加入双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.51g,1.68mmol)，反应液室温反应3.5h。反应完毕，加DCM(20mL)稀释，混合物用饱和氯化钠溶液(40mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩溶剂。残留物经C18反相柱层析(乙腈/水(V/V)＝70/30)纯化，得白色固体DAW50072-a(330mg，收率47.20％)。1H NMR(599MHz,CDCl3)δ(ppm)8.00(s,1H),7.40–7.37(m,2H),7.31–7.23(m,6H),7.20(d,J＝7.3Hz,1H),7.01(d,J＝7.9Hz,1H),6.81–6.77(m,4H),5.41(d,J＝7.9Hz,1H),4.06(dd,J＝13.9,3.2Hz,1H),4.02–3.97(m,1H),3.90–3.85(m,1H),3.78(s,6H),3.73–3.68(m,2H),3.48(ddd,J＝13.7,9.5,7.0Hz,3H),2.52–2.45(m,2H),1.35(d,J＝6.5Hz,3H),1.13(d,J＝6.8Hz,6H),0.99(d,J＝6.8Hz,6H).31P NMR(243MHz,CDCl3)δ147.04(s),146.42(s).
实施例3：化合物DAW40007-3的合成

步骤1：化合物2-2的合成
将化合物2-1(2.50g,28.05mmol)和三乙胺(7.8mL,56.1mmol)溶于DCM(120mL)中，0℃条件下滴加氯甲酸苄酯(9.57g,56.1mmol)。加完后，反应混合物升至室温搅拌20h，加入饱和氯化铵溶液(50mL)稀释，分液，弃去水相，浓缩有机相，所得残留物经硅胶柱层析分离(MeOH/DCM(V/V)＝1/30)纯化，得白色固体化合物2-2(2.96g,47.2％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:224.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(d,J＝4.2Hz,5H),5.11(s,2H),5.00(s,1H),4.19–4.14(m,1H),3.70–3.64(m,2H),3.24(t,J＝6.4Hz,2H),3.15(q,J＝4.6Hz,1H),1.90(dq,J＝14.2,5.0,4.3Hz,2H),1.77–1.71(m,1H).
步骤2：化合物2-4的合成
将化合物2-3(1.5g,4.56mmol)和化合物2-2(1.22g,5.47mmol)溶于1,2-二氯乙烷(30mL)中，再加入3A分子筛(2.0g)，室温条件下搅拌10min。再加入TMSOTf(0.51g,2.28mmol)，反应混合物于室温搅拌18h。将反应液倒入饱和碳酸氢钠溶液(100mL)中，然后用DCM(100mL)萃取，饱和食盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，所得残留物经硅胶柱层析(PE/EA(V/V)＝2/1至0/1)纯化，得到浅棕色油状物化合物2-4(1.8g,71.51％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:553.3[M+H]+.
步骤3：化合物2-5的合成
将化合物2-4(0.57g,1.03mmol)和钯碳(0.11g,0.1mmol,10％)加入到THF(10mL)中，再加入TFA(0.12g,1.03mmol)，随后氢气置换三次，然后在氢气氛围中，于室温下搅拌19h，反应完后，硅藻土过滤，减压蒸干溶剂，得到浅棕色油状化合物2-5(0.55g,100.32％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:419.3[M-TFA+H]+。
步骤4：化合物2-7的合成
将化合物2-6(0.46g,2.29mmol，购买于上海毕得医药科技有限公司)和化合物2-5(1.16g,2.18mmol)溶于DCM(30mL)中，依次加入HOBT(0.46g,3.44mmol)、HBTU(1.30g,3.44mmol)和DIPEA(2.66mL,16.03mmol)，反应混合物于室温反应16h。反应完后，依次加入水(20mL)和DCM(50mL×2)，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液(30mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，减压蒸干溶剂，所得残留物经硅胶柱层析分离纯化(MeOH/EA(v/v)＝1/20)，得到白色固体2-7(1.0g,收率72.7％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:602.3[M+H]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.39–5.33(m,1H),5.07(dd,J＝11.2,3.4Hz,1H),4.58(d,J＝8.4Hz,1H),4.21–4.09(m,3H),4.04(t,J＝6.7Hz,1H),3.89(dt,J＝10.4,5.1Hz,1H),3.60–3.50(m,1H),3.30–3.13(m,2H),2.16(s,3H),2.04(s,3H),1.97(s,3H),1.94(s,3H),1.67–1.56(m,4H),1.48(s,9H),1.41–1.37(m,2H),1.02–0.98(m,2H).
步骤5：化合物2-8的合成
将化合物2-7(0.72g,1.17mmol)溶于DCM(8mL)中，然后加入TFA(0.87mL,11.7mmol)，反应混合物于25℃搅拌16h，浓缩溶剂，得棕色油状化合物2-8(0.74g,103.1％)。
MS(ESI,pos.ion)m/z:502.2[M+H]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ5.36(d,J＝3.3Hz,1H),5.08(dd,J＝11.3,3.3Hz,1H),4.58(d,J＝8.4Hz,1H),4.16–4.10(m,3H),4.08–4.02(m,1H),3.92–3.85(m,1H),3.58–3.50(m,1H),3.26–3.20(m,2H),2.16(s,3H),2.04(d,J＝5.2Hz,6H),1.98(s,3H),1.97(s,3H),1.61–1.56(m,4H),1.54–1.52(m,2H),1.42–1.38(m,2H).
步骤6：化合物2-10的合成
将化合物2-9(0.19g,0.30mmol)和化合物2-8(0.50g,0.99mmol)溶于DCM(30mL)中，然后再依次加入HOBT(0.17g,1.26mmol)、HBTU(0.48g,1.26mmol)和DIPEA(0.5mL,3.0mmol)，反应混合物于30℃搅拌3h。反应完后，加入水(20mL)淬灭反应，再用DCM(100mL×2)萃取，合并有机相，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液(40mL)和饱和氯化钠溶液(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，所得残留物经硅胶柱层析分离纯化(DCM/MeOH(v/v)＝10/1)，得到白色固体化合物2-10(0.23g,收率37％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:1046.3[M/2+H]+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.78(t,J＝5.8Hz,2H),7.38–7.36(m,3H),5.36(d,J＝3.4Hz,3H),5.13(s,2H),5.08(dd,J＝11.2,3.4Hz,3H),4.58(d,J＝8.4Hz,3H),4.21–4.08(m,9H),4.04(t,J＝6.7Hz,3H),3.93–3.82(m,3H),3.73–3.66(m,12H),3.60–3.52(m,3H),3.29–3.18(m,6H),2.52(t,J＝6.0Hz,6H),2.38(t,J＝7.4Hz,2H),2.20(t,J＝7.7Hz,2H),2.16(s,9H),2.04(s,9H),1.97(s,9H),1.95(s,9H),1.62–1.56(m,12H),1.50–1.42(m,6H),1.35–1.27(m,16H),1.04–0.97(m,6H).
步骤7：化合物2-11的合成
将化合物2-10(0.20g,0.094mmol)溶于甲醇(10mL)中，然后加入Pd/C(10mg,10％)，氢气置换三次，反应混合物在氢气氛围中，于室温下搅拌11h。反应完后，反应混合物经硅藻土过滤，所得滤液减压蒸干溶剂，得到白色固体化合物2-11(0.19g,100％)。MS(ESI,pos.ion)m/z:1001.1[M/2+H]+.
步骤8：化合物DAW40007-1的合成
将化合物2-11(0.28g,0.14mmol)溶于DCM(20mL)中，依次加入HOBT(0.038g,0.28mmol)、HBTU(0.080g,0.21mmol)、DIPEA(0.054g,0.42mmol)和化合物13(0.068g,0.16mmol)，反应混合物于室温搅拌13h，反应完后，加水(10mL)淬灭反应，用DCM(20mL)萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)洗涤，减压蒸干溶剂，所得残留物用乙腈(10mL)溶解后，经反相制备柱分离(乙腈/水溶液(v/v)＝43％至60％，50min)，向制备分离后的含产物的溶液加入食盐使溶液饱和，分出有机相，水相用乙腈(100mL×2)萃取，合并有机相，合并的有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，残留物加入乙腈(30mL)，再经硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到浅黄色固体化合物DAW40007-1(0.080g,收率24％)。MS(ESI,neg.ion)m/z:2400.18[M-H]-；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,3H),7.81(d,J＝9.2Hz,3H),7.57(t,J＝6.0Hz,3H),7.35–7.26(m,4H),7.20(td,J＝8.9,3.0Hz,5H),6.95(s,1H),6.88(ddd,J＝8.8,5.8,2.2Hz,4H),5.22(d,J＝3.4Hz,3H),4.97(dd,J＝11.2,3.5Hz,4H),4.49(d,J＝8.5Hz,3H),4.40(d,J＝4.8Hz,1H),4.15(s,1H),4.07–4.00(m,9H),3.88(dt,J＝11.2,8.8Hz,3H),3.74(s,9H),3.59–3.48(m,12H),3.17(dd,J＝8.8,5.0Hz,1H),3.10–2.95(m,8H),2.35(t,J＝6.3Hz,6H),2.10(s,9H),2.08(s,3H),2.04(d,J＝4.7Hz,2H),2.00(s,9H),1.89(s,9H),1.78(s,9H),1.40(d,J＝12.2Hz,17H),1.31–1.16(m,18H),0.79(q,J＝3.2Hz,6H).
步骤9：化合物DAW40007-2的合成
将化合物DAW40007-1(0.080g,0.033mmol)溶于DCM(10mL)中，加入DIPEA(0.029mL,0.17mmol)、丁二酸酐(0.008g,0.083mmol)和DMAP(0.014g,0.12mmol)，40℃搅拌5h，补加丁二酸酐(10mg)，继续反应16h后，补加DCM(10mL)、丁二酸酐(10mg)和DIPEA(0.05mL)，再继续搅拌9h，然后补加丁二酸酐(10mg)，再反应10h后，加入DCM(20mL)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(10mL)洗涤，弃去水相，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶剂，得白色固体化合物DAW40007-2(0.08g,96.07％)。MS(ESI,neg.ion)m/z:2500.12[M-H]-.
步骤10：化合物DAW40007-3的合成
将化合物DAW40007-2(0.08g,0.032mmol)、HBTU(0.015g,0.04mmol)和DIPEA(0.011mL,0.064mmol)溶于ACN(5mL)中，室温搅拌5min。随后转移至含有0.35g H2N-CPG(购置于河北迪纳兴科)的固相合成仪中，震荡22.5h。抽滤，滤饼用DCM/MeOH(V/V＝9/1,10mL)和DCM(10mL)冲洗，并抽干，所得滤饼稀释在25％ Ac2O/Py溶液(5mL)中搅拌反应3h，过滤，滤饼依次用DCM/MeOH(V/V＝9/1,10mL)和DCM(10mL)冲洗，减压抽干，得到白色固体DAW40007-3(0.357g)，测负载量为14.95μmol/g。
化合物L96-DMTr-CPG的合成
化合物L96-DMTr-CPG按照专利申请WO2014025805A1记载的方法制备获得。
L96缀合基团结构为：
化合物L96-DMTr-CPG与寡聚核苷酸缀合后脱保护得到L96，化合物DAW40007-3与寡聚核苷酸缀合后脱保护得到DAW40007-4。核苷单体1和核苷单体DAW50072-a嵌入寡核苷酸后脱保护，分别为核苷酸残基Y和Y2。
实施例4：双链siRNA和双链siRNA缀合物的合成
1、未接缀合基团的双链siRNA的合成
本发明所述siRNA正义链和反义链的合成步骤如下：
按照理论产量1umol合成规格完成。称取1umol规格固相支持物CPG(购置于河北迪纳兴科)所有的2’-修饰的RNA亚磷酰胺单体和辅助试剂均为商品化所得，所有的亚磷酰胺单体以0.1M无水乙腈溶液提供。对于磷酸骨架硫代修饰的寡聚核苷酸以0.1M DDTT溶液作为硫代试剂。5-乙硫基-1H-四唑乙腈溶液(0.25M)作为活化剂(购置于苏州柯乐玛)，0.02M碘的吡啶/水溶液作为氧化剂，以及3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液作为脱保护试剂，放置于KA-H8型号DNA/RNA自动合成仪对应的试剂指定位置。设置合成程序并输入指定的寡聚核苷酸碱基序列。检查无误后，开始循环寡聚核苷酸合成。每步偶合时间为6分钟，硫化时间6分钟。经自动循环后，得到含固相支持物CPG的寡核苷酸。
用干燥氩气吹干上述得到的含固相支持物CPG的核苷酸，然后转移到2mL EP管中，并加入28％氨水溶液(1.8mL)，于55℃加热5～18小时。过滤，用水(0.5mL)洗涤滤饼，合并滤液，减压浓缩后，得到白色或黄色胶状固体。反相制备纯化后，浓缩制备液，过凝胶柱，除去过量盐，得到寡聚核苷酸。所得寡聚核苷酸浓度由微量紫外分光光度计(SPECTRO stat Nano)测定含量。在Agilent 6530LC-MS Q-Tof系统上，完成质谱检测分析。以一级扫描后，再去卷积后计算核酸分子量。
退火步骤：
将上述合成得到的双链siRNA正义链按等摩尔量与上述合成得到的反义链混合，加热至95℃，控温10min后，缓慢降至室温。随后冻干得目标双链siRNA。
2、siRNA缀合物的合成：
反义链的合成，参考上述未接GalNac的正义链和反义链合成方法得到。
正义链的合成：将通用固相支持物CPG换为本发明制备得到的GalNAc固相支持物(如化合物DAW40007-3)，参考反义链合成方法制备得到本发明双链siRNA缀合物正义链。
退火步骤：
将上述合成得到的双链siRNA缀合物正义链按等摩尔量与上述合成得到的反义链混合，加热至95℃，控温10min后，缓慢降至室温。随后冻干得目标siRNA缀合物。
本发明合成得到的未修饰的双链siRNA见表1；本发明合成得到修饰的siRNA见表1-A；本发明合成得到的双链siRNA缀合物见表2。
表1：本发明合成得到的未修饰的双链siRNA


表1-A：本发明合成得到的修饰的siRNA

表2：本发明合成得到的双链siRNA缀合物
如无特别说明，在本发明上下文中，大写字母C、G、U、A表示天然核苷酸的碱基；小写字母表示核苷酸核糖2位被甲氧基修饰的碱基，如c、g、u、a分别表示2'-OMe(2'-O-甲基)C、2'-OMe G、2'-OMe U和2'-OMe A；大写字母右边f表示核苷酸核糖2位被氟代修饰的碱基，如Cf、Gf、Uf、Af分别表示2'-F(2'-氟)C、2'-F G、2'-F U和2'-FA；大小字母左边的d表示脱氧，即核苷酸核糖2位为H；“s”表示与“s”左右相邻的两个核苷酸残基之间为硫代磷酸酯基连接，例如，“gsu"表示g和u残基之间通过硫代磷酸酯基连接；Y2表示InvB表示
实施例5：本发明的siRNA或其缀合物的细胞活性和细胞毒性测试
测试方法：
将hepG2细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养。待细胞处于对数生长期且状态良好时(70％汇合度)采用转染试剂转染。调整细胞浓度为2.5×105/mL，于96孔板中每孔种入2×104个细胞，按照lipofectamine RNAiMAX转染试剂说明书转染不同浓度的测试siRNA、阳性对照和阴性对照。
1)37℃、5％CO2孵育24h后收集细胞，使用QuickEasy Cell Direct RT-qPCR kit(Taqman)检测AGT和GAPDH的mRNA表达水平。采用相对定量法计算每个样品中AGT基因的表达，最后计算抑制率％＝(对照的相对定量-样品的相对定量)/对照的相对定量×100％，或进行四参数拟合计算IC50。
2)37℃、5％CO2孵育72h后，收集细胞上清使用AGT Elisa试剂盒检测AGT表达量，CCK8检测细胞毒性。
实验结果表明，本发明siRNA和其缀合物对AGT mRNA具有较好的敲降作用，其中，部分裸序列siRNA对AGT的抑制率实验结果见表A，部分修饰siRNA对AGT的抑制率实验结果见表B。
表A：本发明部分裸序列双链siRNA对AGT的抑制率结果

表B：本发明部分修饰双链siRNA对AGT的抑制率结果

实施例6：应用hAGT转基因小鼠评价AGT siRNA缀合物敲降活性
为评估AGT siRNA缀合物的体内活性，使用AGT人源化小鼠模型(每组5～9只)，给药取各组小鼠基线血清检测体重、ALT和AGT蛋白含量进行分组，D0天颈背部皮下给药单剂量1mg/kg或3mg/kg的GalNAc-siRNA或溶媒saline，D0/4/7/14/21/28/35/49收集血样，使用Human AGT ELISA Kit(ab287170)测定人AGT蛋白浓度。通过比较siRNA缀合物组和溶媒组的人AGT蛋白水平来计算敲降百分比。实验结果见图1。
实验结果表明，本发明siRNA缀合物在小鼠体内对AGT mRNA具有较好的敲降作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (26)

  1. 一种双链siRNA、其缀合物或盐，其包含形成双链区的一条正义链和一条反义链，其中，所述正义链包含如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:90所示的核苷酸序列中之一、或与其具有不多于5个核苷酸差异的核苷酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述反义链包括如SEQ ID NO:91～SEQ ID NO:180所示的核苷酸序列中之一、或与其具有不多于5个核苷酸差异的核苷酸序列。
  3. 根据权利要求1或2所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述双链siRNA缀合物为所述双链siRNA与缀合基团缀合而成。
  4. 根据权利要求1-3任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述正义链的长度不超过23个核苷酸，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
  5. 根据权利要求1-4任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述正义链和/或反义链包含3’突出端和/或5’突出端，所述3’突出端或5’突出端包括1、2或3个核苷酸。
  6. 根据权利要求1-5任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，其包含siRNA ID NO:1～siRNA ID NO:90所示的双链siRNA之一。
  7. 根据权利要求1-6任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立地选自下列的至少之一：
    非天然碱基的核苷酸、脱氧核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、锁核苷酸、解锁核酸修饰的核苷酸、2'-烯丙基修饰的核苷酸、无碱基核苷酸、吗啉基修饰的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、PEG修饰的核苷酸、5'-氨基磷酸酯修饰的核苷酸、硫代磷酸酯连接修饰的核苷酸、5'-甲基膦酸酯基修饰的核苷酸、5’-乙烯基磷酸酯修饰的核酸、5'-磷酸酯模拟物修饰的核苷酸、TNA修饰的核苷酸、PNA修饰的核苷酸、D-FNA修饰的核苷酸、ANA-5修饰的核苷酸、FANA-5修饰的核苷酸、ANA-6修饰的核苷酸、HNA修饰的核苷酸(优选HNA-5修饰的核苷酸和HNA-6修饰的核苷酸)、FANA-6修饰的核苷酸、bcDNA修饰的核苷酸、tcDNA修饰的核苷酸、S-MC修饰的核苷酸、N-MC修饰的核苷酸、2’-F-NMC修饰的核苷酸、5'-甲基胞嘧啶修饰的核苷酸、5'-甲基尿嘧啶修饰的核苷酸、2,6-二氨基修饰的腺嘌呤修饰的核苷酸、cEt、D替换的核苷酸、InvAb和乙二醇核酸。
  8. 根据权利要求1-7任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述正义链和/或所述反义链包括至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸独立地选自下列的至少之一：
    2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、5'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸、3'-硫代磷酸酯基连接修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-羟基修饰的核苷酸、锁核酸修饰的核苷酸、解锁核酸修饰的核苷酸、乙二醇核酸、5’-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5’-(E)-VP修饰的核酸、cEt、D、InvAb、Y2替换的核苷酸和Y替换的核苷酸，所述Y2为所述Y为
  9. 根据权利要求7或8所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述修饰的核苷酸各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
    所述正义链的3'末端和正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位和第21位；和/或
    所述反义链的3'末端和反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1位、第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位、第9位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第15位、第16位、第17位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位和第23位；和/或
    所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下一个或多个位置：
    所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位、第3-4位、第4-5位、第5-6位、第6-7位、第7-8位、第8-9位、第9-10位、第10-11位、第11-12位、第12-13位、第13-14位、第14-15位、第15-16位、第16-17位、第17-18位、第18-19位、第19-20位和第20-21位之间；和/或
    所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位、第3-4位、第4-5位、第5-6位、第6-7位、第7-8位、第8-9位、第9-10位、第10-11位、第11-12位、第12-13位、第13-14位、第14-15位、第15-16位、第16-17位、第17-18位、第18-19位之间、第19-20位、第20-21位、第21-22位和第22-23位之间。
  10. 根据权利要求7-9任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于选自以下一个或多个位置：
    所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第5位、第7位、第8位、第9位、第10位和第11位，优选地，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第9位、第10位和第11位，任选还包括第5位；和或
    所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第8位、第9位、第12位、第14位和第16位；
    优选地，所述2'-氟代修饰的核苷酸存在于反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第6位、第14位和第16位；
    任选地，所述2’-脱氧修饰的核苷酸存在于所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第2位、第5位、第7位、第12位和第14位；
    任选地，所述InvAb修饰为通过硫代磷酸酯基或磷酸酯基连接在正义链的5'末端或3'末端；
    任选地，所述5'-硫代磷酸酯基连接修饰或3'-硫代磷酸酯基连接修饰各自独立地存在于选自以下位置一个或多个：
    所述正义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间；和/或
    所述正义链的3'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间；
    所述反义链的5'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间；和/或
    所述反义链的3'末端的核苷酸为起始点的第1-2位、第2-3位和第3-4位之间。
  11. 根据权利要求1-10任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述双链区为17-23个核苷酸对长。
  12. 根据权利要求1-11任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，所述正义链包含如SEQ ID NO:181～SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列中之一，所述正义链的长度不超过21个核苷酸；
    任选地，所述反义链包括如SEQ ID NO:214～SEQ ID NO:224所示的核苷酸序列中之一，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
  13. 根据权利要求1-12任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，其包含siRNA ID NO:91～siRNA ID NO:126所示的双链siRNA之一；其中，所述正义链的长度不超过21个核苷酸，所述反义链的长度不超过23个核苷酸。
  14. 根据权利要求1-13任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述双链siRNA缀合物中，所述双链siRNA的正义链或反义链的3’末端或5’末端与缀合基团缀合，优选地，所述双链siRNA的正义链的3’末端与缀合基团缀合；任选地，所述双链siRNA的正义链的3’末端或5’末端通过磷酸酯基团、硫代磷酸酯基团或磷酸基团与所述缀合基团缀合。
  15. 根据权利要求14所述的双链siRNA、其缀合物或盐，其特征在于，所述缀合基团包括GalNAc或其衍生物；优选地，所述缀合基团为通过二价、三价或四价分支接头连接的GalNAc或其衍生物；更优选地，所述缀合基团为L-96、DAW40007-4或其立体异构体，其中，所述缀合基团DAW40007-4和L-96的结构分别为：
  16. 根据权利要求1-15任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，所述siRNA缀合物具有以下双链核苷酸序列之一：
    所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
    所述正义链包含5’-csasagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
    所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfY2cacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
    所述正义链包含5’-InvBsgsgcaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfscuaAfacacuggUfuCfuugccsusc-3’的核苷酸序列；或
    所述正义链包含5’-InvBscsaagaaCfcAfGfUfguuuagcsasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usGfsCfuaAfacacuggUfuCfuugscsc-3’的核苷酸序列；或
    所述正义链包含5’-InvBscsaaguuGfaGfAfAfcaaaaausasL96-3’的核苷酸序列，所述反义链包含5’-usAfsuuuUfuguucucAfaCfuugsasa-3’的核苷酸序列。
  17. 一种药物组合物，其包含权利要求1-16任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或盐，和药学上可接受的载体。
  18. 权利要求1-16任意一项所述的双链siRNA缀合物、其缀合物和其盐或权利要求17所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防AGT相关疾病的药物中的用途。
  19. 根据权利要求18所述的用途，其中，所述AGT相关疾病为高血压。
  20. 根据权利要求19所述的用途，其中，所述高血压选自临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压。
  21. 权利要求1-16任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，或权利要求17所述的药物组合物用于预防、处理、治疗或减轻患者的AGT相关疾病。
  22. 根据权利要求21所述双链siRNA、其缀合物或其盐，或药物组合物，其中，所述AGT相关疾病为高血压。
  23. 根据权利要求22所述双链siRNA、其缀合物或其盐，或药物组合物，其中，所述高血压选自临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压。
  24. 一种预防、处理、治疗或减轻患者的AGT相关疾病的方法，包括给与患者有效治疗量的权利要求1-16任意一项所述的双链siRNA、其缀合物或其盐，或权利要求17所述的药物组合物。
  25. 根据权利要求24所述的方法，其中，所述AGT相关疾病为高血压。
  26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述高血压选自临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压。
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