WO2025129708A1 - Dna聚合酶及其应用 - Google Patents

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谢庆庆
高重亮
张辉
郑越
董宇亮
章文蔚
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BGI Shenzhen Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to the field of DNA polymerase, in particular to a DNA polymerase and an application thereof.
  • DNA polymerase is an enzyme that uses DNA as a replication template and four deoxyribonucleotides as substrates to replicate and synthesize a new DNA chain complementary to the template chain sequence starting from the 5' end.
  • DNA polymerase can add free deoxyribonucleotides to the 3' end of the newly formed chain, thereby extending the newly generated chain in the 5'-3' direction.
  • Some DNA polymerases have 3'-5' exonuclease activity, which can correct errors in the newly synthesized DNA chain. For mismatched bases generated during PCR amplification, these DNA polymerases can remove the incorrectly added bases, reinsert the correct bases and continue to replicate, thereby ensuring the accuracy of amplification.
  • thermostable DNA polymerases are divided into six families: A, B, C, D, X, and Y. Most of the thermostable DNA polymerases discovered so far belong to family A or family B.
  • the thermostable DNA polymerases belonging to family A are all derived from true bacteria, such as Taq (Thermus aquaticus), Tth (Thermus thermophilus), Tca (Thermus caldophilus), Tfl (Thermus flavus), Tfi (Thermus filiformis) from Thermus genus, and Bst (Bacillus stearothemophilis) from Bacillus genus.
  • the heat-resistant DNA polymerases belonging to family B are all derived from archaea, such as Tli (Thermococcus litoralis) from the genus Thermococcus, Pfu (Pyrococcus furiosus) and KOD1 (Thermococcus kodacaraensis) from the genus Thermococcus, as well as Pwo (Pyrococcus woesei), Tgo (Thermococcus gorgonarius), Pab (Pyrococcus abyssi), etc.
  • archaea such as Tli (Thermococcus litoralis) from the genus Thermococcus, Pfu (Pyrococcus furiosus) and KOD1 (Thermococcus kodacaraensis) from the genus Thermococcus, as well as Pwo (Pyrococcus woese
  • a family DNA polymerases have 5'-3' polymerization activity and 5'-3' exonuclease activity.
  • B family DNA polymerases have 5'-3' polymerization activity and 3'-5' exonuclease activity.
  • the main application scenario of DNA polymerase is polymerase chain reaction (PCR) technology. Under the catalysis of DNA polymerase, PCR technology uses the parent DNA as a template and a specific primer as the extension starting point to replicate the daughter DNA complementary to the parent template DNA in vitro through steps such as denaturation, annealing, and extension. This application places requirements on the key properties of DNA polymerases, namely thermal stability, specificity, fidelity, and synthesis ability.
  • DNA polymerases need to have high thermal stability and be able to obtain high amplification yields. They also need to have faster extension speeds, high amplification specificity, amplification performance for low-amount templates, and amplification performance for special environmental samples (such as high salt, etc.).
  • high-throughput sequencing based on reversibly blocked modified dNTPs also requires DNA polymerases to have polymerization activity for modified bases.
  • the structure of B family DNA polymerase is usually divided into five domains, namely the N-terminal domain, the exonuclease domain, the palm domain, the finger domain and the thumb domain. It is generally believed that the activity of DNA polymerase is closely related to the palm domain, the finger domain and the thumb domain.
  • the palm domain is the catalytic site of the polymerase; the thumb domain interacts with the newly synthesized dsDNA and with the introduced nucleotides; the finger domain plays a role in template fixation and nucleotide specificity; the exonuclease domain is related to the 3'-5' exonuclease activity.
  • the domains of DNA polymerase work closely with each other to complete the entire process of DNA amplification.
  • B family DNA polymerases Compared with A family DNA polymerases (such as Taq DNA polymerase, etc.), the 3'-5' nucleoside exonuclease activity (proofreading activity) of B family DNA polymerases makes them have a lower error rate and are more suitable for experiments with high requirements for PCR fidelity, such as gene screening, Sequencing, mutation detection, etc.
  • a family DNA polymerases such as Taq DNA polymerase, etc.
  • proofreading activity 3'-5' nucleoside exonuclease activity (proofreading activity) of B family DNA polymerases makes them have a lower error rate and are more suitable for experiments with high requirements for PCR fidelity, such as gene screening, Sequencing, mutation detection, etc.
  • most of the commercially available high-fidelity DNA polymerases are developed based on Pfu DNA polymerase or KOD DNA polymerase, with fewer options, and it is difficult to meet the use requirements in existing technologies.
  • the main purpose of the present invention is to provide a DNA polymerase and its application to solve the problem of few types of DNA polymerase in the prior art.
  • a DNA polymerase comprising any of the following proteins: (a) a protein having the sequence shown in SEQ ID NO: 1; (b) a protein in which, in the sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or more amino acids are substituted, deleted and/or added at least one of the following sites: D147, E149, L424, Y425, P426 and A503; or (c) a protein having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% homology with the sequence in (a) or (b) and having DNA polymerase activity.
  • the DNA polymerase is thermostable; preferably, the thermostable DNA polymerase is better than that of KOD DNA polymerase or Pfu DNA polymerase; preferably, the DNA polymerase has 3’-5’ exonuclease activity.
  • the type of amino acid substituted at each site includes at least one of the following: D147A, E149A, L424A/G/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V, Y425A/G/S/T/V, P426I/A/D/G/L/P/S/T/V or A503L/C/D/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y.
  • the DNA polymerase includes a protein having a sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a protein having more than 70% homology with the sequence shown in SEQ ID NO: 3, having DNA polymerization activity, and having polymerization activity for modified deoxyribonucleotides; preferably, the modification includes a 3’-O-blocking modification; preferably, the 3’-O-blocking modification includes a 3’-O-azidomethyl modification.
  • a DNA molecule comprising a polynucleotide encoding the above DNA polymerase.
  • DNA molecule has a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • a recombinant vector which comprises the above DNA molecule.
  • a host cell wherein the host cell contains the above DNA molecule or the above recombinant vector.
  • the host cell includes a prokaryotic cell or a eukaryotic cell; preferably, the prokaryotic cell includes Escherichia coli.
  • a PCR kit which comprises the above DNA polymerase.
  • the buffer comprises 9.5-10.5 mM Tris-HCl, pH 8.2-9.4, 20-80 mM KCl, 1.0-3.0 mM MgCl 2 , 35-45 mM TMAC, 0.05-0.15% Triton X-100; preferably, the buffer comprises any one or more of the following:
  • Tris-HCl pH 8.2 ⁇ 8.6, 20 ⁇ 30mM KCl, 1.0 ⁇ 2.0mM MgCl 2 , 35 ⁇ 45mM TMAC, 0.05 ⁇ 0.15% Triton X-100;
  • Tris-HCl pH 8.2 ⁇ 8.6, 70 ⁇ 80mM KCl, 1.0 ⁇ 2.0mM MgCl 2 , 35 ⁇ 45mM TMAC, 0.05 ⁇ 0.15% Triton X-100;
  • Tris-HCl pH 8.2 ⁇ 8.6, 70 ⁇ 80mM KCl, 2.01 ⁇ 3.0mM MgCl 2 , 35 ⁇ 45mM TMAC, 0.05 ⁇ 0.15% Triton X-100;
  • Tris-HCl pH 8.61 ⁇ 9.0, 20 ⁇ 30mM KCl, 1.0 ⁇ 2.0mM MgCl 2 , 35 ⁇ 45mM TMAC, 0.05 ⁇ 0.15% Triton X-100;
  • Tris-HCl pH 9.01 ⁇ 9.4, 20 ⁇ 30mM KCl, 1.0 ⁇ 2.0mM MgCl 2 , 35 ⁇ 45mM TMAC, 0.05 ⁇ 0.15% Triton X-100;
  • the buffer comprises any one or more of the following:
  • the library construction method includes: using DNA polymerase to perform PCR amplification on the fragments to be sequenced connected with sequencing adapters to obtain a DNA library; preferably, the library construction method also includes: using DNA polymerase to incorporate modified deoxyribonucleotides during the DNA amplification process.
  • Figure 5 shows the test results of 22°S DNA polymerase exoactivity according to Example 6 of the present invention.
  • the above amino acid mutations were all experimentally investigated in the examples of the present application, and all had DNA polymerase activity compared to the parent having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the above mutation sites include mutations in the exonuclease domain and the finger domain (active site), which can improve the activity of the protein.
  • the effect on enhancing the activity of the protein is small, so it is possible to obtain a protein having 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% or 99.9% or more homology with the above amino acid sequence and having the same ability to improve specific enzyme activity.
  • Those skilled in the art can flexibly add commonly used elements in the prior art to the above-mentioned DNA polymerase or mutant, including but not limited to promoters for regulating transcription and translation levels, molecular tags for purifying proteins, signal peptides for localizing proteins, and other known protein sequences in the prior art.
  • the above-mentioned elements do not affect the activity of the DNA polymerase, including but not limited to the ability to polymerize or polymerize the modified deoxyribonucleotides.
  • the homology in this specification refers to the "homology" between amino acid sequences or nucleic acid sequences, that is, the total ratio of the same type of amino acid residues or nucleotides in the amino acid sequence or nucleic acid sequence.
  • the homology of amino acid sequences or nucleic acid sequences can be determined using alignment programs such as BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) and FASTA.
  • Hydrophobic amino acids (Ala, Cys, Gly, Pro, Met, Val, Ile, Leu) are replaced by other hydrophobic amino acids;
  • hydrophobic amino acids with bulky side chains (Phe, Tyr, Trp) are replaced by other hydrophobic amino acids with bulky side chains;
  • Amino acids with positively charged side chains are replaced by other amino acids with positively charged side chains;
  • Amino acids with polar, uncharged side chains (Ser, Thr, Asn, Gln) are replaced by other amino acids with polar, uncharged side chains.
  • a person skilled in the art may also perform conservative substitutions on amino acids according to amino acid substitution rules well known to those skilled in the art, such as the "blosum62 scoring matrix" in the prior art.
  • the "AlphaFold2" used in this application is a deep learning-based protein structure prediction model launched by DeepMind. It uses deep neural networks to analyze and predict protein sequences, thereby predicting the three-dimensional structure of proteins, providing a new tool and method for protein research.
  • the type of amino acid substituted at each site includes at least one of the following: D147A, E149A, L424A/G/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V, Y425A/G/S/T/V, P426I/A/D/G/L/P/S/T/V or A503L/C/D/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y; wherein the letters before the numbers represent the original amino acids, and the letters after the numbers represent the mutated amino acids; "/" means "or", that is, "Y425A/G/S/T/V” means Y425A, Y425G, Y425S, Y425T or Y425V.
  • the DNA polymerase mutant includes: the protein shown in SEQ ID NO: 3, or a protein having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% homology with the protein shown in SEQ ID NO: 3, having DNA polymerase activity, and having polymerization activity for blocking modified deoxyribonucleotides; preferably, the 3'-O-blocking modification includes a 3'-O-azidomethyl modification.
  • the protein shown in SEQ ID NO: 3 is a protein with D147A+E149A+L424A+Y425A+P426I+A503L mutations.
  • this DNA polymerase mutant is named 22°S-Mut DNA polymerase.
  • sites 147 and 149 are located in the exonuclease domain, and sites 424, 425, 426 and 503 are all located in the finger domain.
  • the DNA polymerase mutant has polymerization activity for modified single bases (including but not limited to 3'-O-blocked modified deoxyribonucleotides). This DNA polymerase mutant can be used to amplify PCR reactions that are difficult to perform with ordinary DNA polymerases, thereby being applied to fields such as high-throughput sequencing.
  • a DNA molecule which encodes the above-mentioned DNA polymerase.
  • nucleotide sequence of the translated amino acid sequence is not the only constant sequence, and any nucleotide sequence that can encode the amino acid sequence of the above-mentioned DNA polymerase is a nucleic acid sequence within the scope of this patent.
  • the DNA molecule has a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • nucleic acid sequences for expressing commonly used elements in the prior art near the above-mentioned DNA molecules include but are not limited to promoters for regulating transcription and translation levels, molecular tags for purifying proteins, signal peptides for localizing proteins, and other known sequences in the prior art.
  • a library construction kit comprising the above-mentioned DNA polymerase.
  • the Escherichia coli genome was used as a template to amplify the 16s gene.
  • the upstream and downstream primers used were E16S-27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, SEQ ID NO: 9) and E16S-1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’, SEQ ID NO: 10).
  • the PCR reaction system is shown in Table 5.
  • the PCR cycle was as follows: 95°C pre-denaturation for 3 min; 95°C for 20 s, 58°C for 15 s, 72°C for 1.5 min, 30 cycles; and finally 72°C extension for 7 min, and storage at 4°C.
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the molecular marker used was Tiangen 100 bp DNA ladder (Cat. No.: MD109-01).
  • the agarose gel electrophoresis results of the PCR amplification product of 22°S DNA polymerase are shown in Figure 6. 22°S DNA polymerase can perform PCR amplification under these 5 buffer conditions, and the amplification is the best and the yield is the highest under Buffer 4.
  • the rapid PCR reaction system was: 5 ⁇ L Pfu DNA polymerase 10X Buffer with MgSO 4 , 1 ⁇ L dNTP Mix (10 mM each), 1.5 ⁇ L forward primer (10 ⁇ M), 1.5 ⁇ L reverse primer (10 ⁇ M), 50 ng template DNA, 0.5 ⁇ L Pfu DNA polymerase (3 U/ ⁇ L, Promega, catalog number: M7741), and nuclease-free water was added to a total volume of 50 ⁇ L.
  • the rapid PCR reaction program was set as: 95°C pre-denaturation for 2 min; 95°C for 30 s, 58°C for 30 s, 72°C for 8 min, 16 cycles; and finally 72°C extension for 5 min, and storage at 4°C.
  • the expression and purification of the 22°S DNA polymerase mutant 22°S-Mut was performed as described in Example 3.
  • the collected protein elution peak samples were subjected to SDS-PAGE electrophoresis analysis to determine the protein purity.
  • the results of SDS-PAGE electrophoresis analysis of the purified 22°S-Mut DNA polymerase samples are shown in Figure 7. 22°S-Mut was stored in a storage solution with an enzyme storage concentration of 0.25 mg/mL.
  • 10X reaction buffer is 200mM Tris-HCl, 100mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100mM KCl, 20mM MgSO 4 , pH 8.5@25°C.
  • a 50 ⁇ L reaction system is prepared as follows: 5 ⁇ L 10X reaction buffer, 40 ⁇ M dT/G/GTP, 0.1mg/mL BSA (bovine serum albumin), 1 ⁇ M Cy3-DNA double-stranded template (structure shown in Figure 8), 4 ⁇ M Cy5-modified 3'-O-AzidoMethyl-dATP (3'-O-azidomethyl-dATP), 0.5 ⁇ g 22°S DNA polymerase or 22°S-Mut DNA polymerase, and nuclease-free water is used to make up the reaction system to 50 ⁇ L.
  • the sense strand of the Cy3-DNA double-stranded template is 5'-CGTGTATGCGTAATAGGATCCCGACTCACTA TGGACG-3' (SEQ ID NO: 17); the antisense strand is 5'-CGTGTATCGTCCATAGTGAGTCGGGATC CTATTACGC-3' (SEQ ID NO: 18), the 5' ends of both the sense strand and the antisense strand are modified with Cy3.
  • the reaction system was set up on ice, and after preparation, it was transferred to a 384-well plate and placed in a microplate reader (BioTek Synergy H1, Agilent) for fluorescence signal detection.
  • the reaction temperature was 40°C, and 530/568nm and 630/676nm (FRET Cy5) fluorescence signals were collected every 30s.
  • the entire reaction time was 2 hours.
  • 22°S-Mut DNA polymerase was replaced with an equal volume of enzyme storage solution.
  • the raw data was exported and the maximum slope, i.e., the ⁇ FRET-Cy5 fluorescence value per unit time ( ⁇ RFU), was calculated to characterize the polymerization activity of the polymerase for the incorporation of modified single bases.
  • the experimental results are shown in Table 7 below.
  • the fluorescence signal curve of the 22°S DNA polymerase experimental group is the same as that of the negative control group, and no FRET Cy5 fluorescence signal was detected.
  • the 22°S-Mut DNA polymerase experimental group can detect an increase in fluorescence signal, and its polymerization rate is 1.4 ⁇ RFU/min.
  • the 22°S-Mut DNA polymerase obtained by mutation modification has polymerization activity for modified single bases. By effectively mutating the 22°S DNA polymerase, mutants with great application potential can be provided for high-throughput sequencing.
  • the above embodiments of the present invention achieve the following technical effects: compared with the existing B family DNA polymerase or other DNA polymerases, the above DNA polymerase is a new type of DNA polymerase, and the wild type of the polymerase has good thermal stability and PCR amplification ability, the original enzymatic performance is good, and PCR amplification can be performed well; the sequence novelty is good, and a new enzyme skeleton can be provided for the transformation needs of different application scenarios of DNA polymerase, and further system optimization and transformation can be performed according to different application scenarios, with large room for improvement and application potential.
  • a DNA polymerase mutant with polymerization activity for deoxyribonucleotides modified by blocking 3'-O-azidomethyl and the like can be obtained, which has application value in high-throughput sequencing technology based on deoxyribonucleotides modified by blocking 3'-O-azidomethyl and the like.

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Abstract

本发明提供了一种DNA聚合酶及其应用。其中，上述DNA聚合酶包括：(a)具有SEQ ID NO：1所示的序列的蛋白；(b)在SEQ ID NO：1所示的序列中，如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸的蛋白：D147、E149、L424、Y425、P426和A503；或(c)与(a)或(b)中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％以上同源性、且具有DNA聚合酶活性的蛋白。能够解决现有技术中的DNA聚合酶种类少的问题，适用于DNA聚合酶领域。

Description

DNA聚合酶及其应用 技术领域
本发明涉及DNA聚合酶领域，具体而言，涉及一种DNA聚合酶及其应用。
背景技术
DNA聚合酶是以DNA为复制模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，由5'端开始复制合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。DNA聚合酶可以将游离脱氧核糖核苷酸添加到新形成链的3'端，从而实现新生成链在5'-3'方向的延伸。一些DNA聚合酶具有3'-5'核酸外切酶的活性，可以校正新合成DNA链中的错误。对于PCR扩增过程中产生的错配碱基，这些DNA聚合酶可以将错误加入的碱基进行切除、重新插入正确的碱基并继续复制，从而保证扩增的准确性。
DNA聚合酶分为六个家族：A、B、C、D、X以及Y家族。目前发现的耐热DNA聚合酶大部分属于A家族或B家族。属于A家族的耐热DNA聚合酶均来源于真细菌，如来源于栖热属的Taq(Thermus aquaticus)、Tth(Thermus thermophilus)、Tca(Thermus caldophilus)、Tfl(Thermus flavus)、Tfi(Thermus filiformis)以及来源于芽孢菌属的Bst(Bacillus stearothemophilis)。属于B家族的耐热DNA聚合酶均来源于古细菌，如来源于高温球菌属的Tli(Thermococcus litoralis)、焦热球菌属的Pfu(Pyrococcus furiosus)和KOD1(Thermococcus kodacaraensis)，以及Pwo(Pyrococcus woesei)、Tgo(Thermococcus gorgonarius)、Pab(Pyrococcus abyssi)等。
A家族DNA聚合酶具有5'-3'聚合活性和5'-3'外切活性。B家族DNA聚合酶具有5'-3'聚合活性以及3'-5'核酸外切活性。DNA聚合酶的主要应用场景为聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR技术在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。该应用对DNA聚合酶的关键属性提出了要求，即热稳定性、特异性、保真度和合成能力。同时，一些特殊的应用场景(如珍稀样本或特殊样本的PCR扩增等)对DNA聚合酶提出了更高的性能要求。DNA聚合酶需要具有较高的热稳定性，能获得较高的扩增产量，还需要有更快的延伸速度、高的扩增特异性、对低量模板的扩增性能以及对特殊环境样本(如高盐等)的扩增性能。此外，基于可逆阻断修饰dNTPs的高通量测序还需要DNA聚合酶对修饰碱基具有聚合活性。
B家族DNA聚合酶的结构通常分为5个结构域，分别为N-端域、核酸外切域、掌域、指域及拇指域。一般认为，DNA聚合酶活性与掌域、指域及拇指域密切相关。掌域是聚合酶的催化部位；拇指域与新合成的dsDNA相互作用并与引入的核苷酸相互作用；指域在模板固定和核苷酸特异性中发挥作用；核酸外切域与3'-5'核酸外切活性相关。DNA聚合酶各域彼此紧密配合以完成DNA扩增全过程。
和A家族DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶等)相比，B家族DNA聚合酶的3'-5'核酸外切活性(校正活性)使其具有更低的错误率，更适用于对PCR保真性要求较高的实验，如基因筛选、 测序、突变检测等。目前，绝大部分市售高保真DNA聚合酶均是基于Pfu DNA聚合酶或KOD DNA聚合酶开发而来，可选择性较少，难以满足现有技术中使用需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种DNA聚合酶及其应用，以解决现有技术中的DNA聚合酶种类少的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种DNA聚合酶，包括如下任一种蛋白：(a)具有SEQ ID NO：1所示的序列的蛋白；(b)在SEQ ID NO：1所示的序列中，如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸的蛋白：D147、E149、L424、Y425、P426和A503；或(c)与(a)或(b)中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％以上同源性、且具有DNA聚合酶活性的蛋白。
进一步地，DNA聚合酶具有热稳定性；优选地，DNA聚合酶的热稳定性优于KOD DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶；优选地，DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切活性。
进一步地，(b)中，各位点取代的氨基酸类型包括以下至少一种：D147A、E149A、L424A/G/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V、Y425A/G/S/T/V、P426I/A/D/G/L/P/S/T/V或A503L/C/D/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y。
进一步地，DNA聚合酶包括具有SEQ ID NO：3所示的序列的蛋白，或与SEQ ID NO：3所示的序列具有70％以上同源性、具有DNA聚合活性、且对修饰的脱氧核糖核苷酸具有聚合活性的蛋白；优选地，修饰包括3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括3’-O-叠氮甲基修饰。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子包含编码上述DNA聚合酶的多核苷酸。
进一步地，DNA分子具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种重组载体，该重组载体包含有上述DNA分子。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内含有上述DNA分子、或上述重组载体。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选地，原核细胞包括大肠杆菌。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种PCR试剂盒，该PCR试剂盒包括上述DNA聚合酶。
进一步地，PCR试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：1)用于提供PCR扩增环境的缓冲液；2)PCR引物；3)用于提取目标DNA的试剂。
进一步地，缓冲液包括9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～9.4，20～80mM KCl，1.0～3.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；优选地，缓冲液包括如下任意一种或多种：
9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～8.6，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～8.6，70～80mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～8.6，70～80mM KCl，2.01～3.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.61～9.0，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 9.01～9.4，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
更优选地，缓冲液包括如下任意一种或多种：
10mM Tris-HCl，pH 8.4，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
10mM Tris-HCl，pH 8.4，75mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
10mM Tris-HCl，pH 8.4，75mM KCl，2.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
10mM Tris-HCl，pH 8.8，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；或
10mM Tris-HCl，pH 9.2，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种上述DNA聚合酶或上述PCR试剂盒在PCR扩增、文库构建或测序中的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种PCR扩增方法，该PCR方法包括：利用上述DNA聚合酶或上述PCR试剂盒进行PCR扩增。
进一步地，PCR方法包括：在扩增过程中利用DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸；优选地，修饰包括3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括3’-O-叠氮甲基修饰。
为了实现上述目的，根据本发明的第八个方面，提供了一种文库构建试剂盒，该文库构建试剂盒中包括上述DNA聚合酶。
进一步地，文库构建试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：1)用于文库构建的接头序列；2)用于提供文库构建环境的缓冲液；3)用于构建文库的酶，包括DNA打断酶、末端修复酶或连接酶中的一种或多种；4)含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
为了实现上述目的，根据本发明的第九个方面，提供了一种文库构建方法，该文库构建方法包括：利用上述DNA聚合酶或上述文库构建试剂盒进行文库构建。
进一步地，文库构建方法包括：利用DNA聚合酶对连接有测序接头的待测序片段进行PCR扩增，获得DNA文库；优选地，文库构建方法还包括：在进行DNA扩增过程中利用DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
为了实现上述目的，根据本发明的第十个方面，提供了一种测序试剂盒，该测序试剂盒包括上述DNA聚合酶。
进一步地，测序试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：1)用于与接头序列互补配对的引物；2)双脱氧核苷酸；3)dNTPs；4)核酸探针；5)用于测序的酶，包括DNA连接酶和/或内切酶；6)用于洗脱核酸探针和/或dNTPs的缓冲液；7)含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
为了实现上述目的，根据本发明的第十一个方面，提供了一种测序方法，该测序方法包括：利用上述DNA聚合酶或上述测序试剂盒进行测序。
进一步地，测序方法包括利用DNA聚合酶对待测序样本进行PCR扩增，获得DNA文库；利用测序技术对DNA文库进行测序，获得测序结果；优选地，测序方法还包括：在进行PCR扩增过程中利用DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
应用本发明的技术方案，上述DNA聚合酶序列新颖，可为DNA聚合酶不同应用场景的改造需求提供全新的酶骨架，可根据不用的应用场景进行进一步体系优化和改造，具有较大提升空间和应用潜力。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例1的22°S DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶的序列比对结果。
图2示出了根据本发明实施例2的22°S DNA聚合酶的结构域特征分析图。
图3示出了根据本发明实施例3的22°S DNA聚合酶纯化样品的SDS-PAGE电泳结果图。
图4示出了根据本发明实施例5的聚合活性检测原理示意图。
图5示出了根据本发明实施例6的22°S DNA聚合酶外切活性测试结果图。
图6示出了根据本发明实施例7的22°S DNA聚合酶PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图7示出了根据本发明实施例9的22°S-Mut DNA聚合酶纯化样品的SDS-PAGE电泳分析结果图。
图8示出了根据本发明实施例10的Cy3-DNA双链模板序列。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，虽然基于不断提高的性能要求，越来越多的商用DNA聚合酶都采用了天然存在的野生型DNA聚合酶的工程化改造突变体，许多专利及文献已描述了多种有用的或性能提升的DNA聚合酶及其突变体，具有改进的催化活性、热稳定性等性能。然而，基于目前已知的DNA聚合酶进行进一步开发改造的空间有限。因此，寻找新型B家族DNA聚合酶具有重要的意义和价值，可以提供更多的改造模板以满足DNA扩增、合成、检测、测序以及其他重要的重组DNA技术的需要。在本申请中发明人尝试开发一种新型的DNA聚合酶，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种DNA聚合酶，包括如下任一种蛋白：(a)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；(b)DNA聚合酶突变体，上述DNA聚合酶突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：D147、E149、L424、Y425、P426、A503，且DNA聚合酶突变体具有DNA聚合酶活性；或(c)与(a)或(b)中的蛋白质具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％以上同源性且具有DNA聚合酶活性的蛋白。
上述SEQ ID NO：1所示的DNA聚合酶，是一种深海海底热泉区沉积物来源的新型DNA聚合酶，将其命名为22°S DNA聚合酶。该DNA聚合酶序列和现有同类商品化DNA聚合酶相比序列一致性低于45％。和现有同类酶产品相比，22°S DNA聚合酶蛋白序列同源性较低，可改造空间大。且具有较好的热稳定性、5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性，且PCR扩增性能较好。
且上述22°S DNA聚合酶通过简单的突变改造获得的DNA聚合酶突变体，对3’-O-阻断修饰的脱氧核糖核苷酸具有聚合活性，能够应用于基于3’-O-阻断修饰的脱氧核糖核苷酸的高通量测序技术中。
SEQ ID NO：1：

上述氨基酸突变均在本申请实施例中进行试验探究，相较于具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的母本，均具有DNA聚合酶活性。上述突变位点包括在核酸外切域和指域(活性位点)进行的突变，此种突变能够改善蛋白的活性，对于远离活性位点的突变，对增强蛋白的活性的影响较小，因此能够获得与上述氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或以上同源性、且具有相同提高比酶活性作用能力的蛋白质。
本领域技术人员能够灵活在上述DNA聚合酶或突变体上增加现有技术中常用元件，上述元件包括但不限于调控转录翻译水平的启动子，用于纯化蛋白的分子标签，用于定位蛋白的信号肽等现有技术中的已知的蛋白序列。上述元件不影响DNA聚合酶的活性，包括但不限于聚合能力或聚合阻断修饰的脱氧核糖核苷酸的能力。
本说明书中的同源性(Identity)是指氨基酸序列或核酸序列之间的“同源性”，即氨基酸序列或核酸序列中的种类相同的氨基酸残基或核苷酸的比率的总计。氨基酸序列或核酸序列的同源性可以利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)、FASTA等比对程序来确定。
70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上(比如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％以上，甚至99.9％以上)同源性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均和a)序列提供的蛋白质大概率相同。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
一般情况下，根据取代、替换等规则，性质类似的氨基酸之间相互替换后的效果也类似。例如，在上述蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu)被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸(Arg、His、Lys)被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸(Ser、Thr、Asn、Gln)被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
本申请中所用的“AlphaFold2”是DeepMind推出的一种基于深度学习的蛋白质结构预测模型，利用深度神经网络对蛋白质序列进行分析和预测，从而预测出蛋白质的三维结构，为蛋白质研究提供了一种全新的工具和方法。
在一种优选的实施例中，(b)中，各位点取代的氨基酸的类型包括以下至少一种：D147A、E149A、L424A/G/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V、Y425A/G/S/T/V、P426I/A/D/G/L/P/S/T/V或A503L/C/D/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y；其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸；“/”表示“或”，即“Y425A/G/S/T/V”表示Y425A、Y425G、Y425S、Y425T或Y425V。
在一种优选的实施例中，DNA聚合酶突变体包括：SEQ ID NO：3所示的蛋白，或与S EQ ID NO：3所示的蛋白具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％以上同源性，具有DNA聚合酶活性，且对阻断修饰的脱氧核糖核苷酸具有聚合活性的蛋白；优选地，3’-O-阻断修饰包括3’-O-叠氮甲基修饰。
SEQ ID NO：3所示的蛋白即为发生D147A+E149A+L424A+Y425A+P426I+A503L突变的蛋白，本申请中，此种DNA聚合酶突变体命名为22°S-Mut DNA聚合酶。上述突变体中，147和149位点位于核酸外切域，424、425、426和503位点均位于指域。
SEQ ID NO：3：
上述DNA聚合酶突变体，对修饰单碱基(包括但不限于对3’-O-阻断修饰的脱氧核糖核苷酸)具有聚合活性。利用此种DNA聚合酶突变体能够对普通的DNA聚合酶难以进行的P CR反应进行扩增，从而应用于高通量测序等领域。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述DNA聚合酶。
需要说明的是，由于密码子简并性原则，翻译氨基酸序列的核苷酸序列并不是唯一恒定的序列，任何可以编码上述DNA聚合酶的氨基酸序列的核苷酸序列都是本专利范围内的核酸序列。
在一种优选的实施例中，DNA分子具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2：
SEQ ID NO：4：

进一步地，本领域技术人员能够灵活在上述DNA分子附近增加用于表达现有技术中常用元件的核酸序列，上述元件包括但不限于调控转录翻译水平的启动子，用于纯化蛋白的分子标签，用于定位蛋白的信号肽等现有技术中的已知的序列。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种重组载体，该重组载体连接有上述DNA分子。
上述DNA能够编码上述DNA聚合酶和DNA聚合酶突变体，并能够连接在重组载体上形成环状DNA。上述DNA和重组载体均能在RNA聚合酶、核糖体、tRNA等的作用下，进行转录、翻译，获得上述DNA聚合酶和DNA聚合酶突变体。针对DNA分子或重组载体的不同的宿主种类，可以利用现有技术灵活对核苷酸序列进行密码子优化，从而获得转录、翻译效率更高的核苷酸序列。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内含有上述DNA分子、或重组载体。
在一种优选的实施例中，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选地，原核细胞包括大肠杆菌。
利用上述宿主细胞，能够在宿主细胞中进行重组载体的复制，也能够将重组载体上携带的DNA分子进行转录、翻译，获得大量DNA聚合酶。利用现有技术，对宿主细胞进行破碎、破碎后蛋白纯化或其他方式，能够获得DNA聚合酶。该宿主细胞为非植物来源的宿主细胞。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种PCR试剂盒，该PCR试剂盒包括上述DNA聚合酶。
在一种优选的实施例中，PCR试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：1)用于提供PCR扩增环境的缓冲液；2)PCR引物；3)用于提取目标DNA的试剂。
上述PCR引物，包括但不限于用于扩增特定目标DNA的通用引物，包括但不限于针对原核细菌的16S通用扩增引物、针对真核细菌的18S通用扩增引物、针对真菌的ITS通用扩增引物或其他对于特定生物或特定目标片段设计的PCR引物。
上述缓冲液即现有技术中常见的PCR buffer，用于提供适合上述DNA聚合酶及聚合酶突变体的反应条件。本申请的DNA聚合酶及聚合酶突变体与野生型的Pfu DNA聚合酶类似，能够在现有技术的PCR buffer中进行PCR反应，本领域技术人员也可以对上述PCR buffer中的成分进行灵活优化，从而获得更适宜此种DNA聚合酶及聚合酶突变体的缓冲液。
上述用于提取目标DNA的试剂，能够从目标样本中提取获得DNA，为后续的PCR反应提供扩增模板。
在一种优选的实施例中，缓冲液包括9.5～10.5mM Tris-HCl(pH 8.2～9.4)，20～80mM KCl，1.0～3.0mM MgCl2，35～45mM TMAC(四甲基氯化铵)，0.05～0.15％Triton X-100(曲拉通X-100)；优选地，缓冲液包括如下任意一种或多种：9.5～10.5mM Tris-HCl(pH 8.2～8.6)，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；9.5～10.5mM Tris-HCl(pH 8.2～8.6)，70～80mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；9.5～10.5mM Tris-HCl(pH 8.2～8.6)，70～80mM KCl，2.01～3.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；9.5～10.5mM Tris-HCl(pH 8.61～9.0)，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；9.5～10.5mM Tris-HCl(pH9.0～9.4)，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100。
更优选地，缓冲液包括如下任意一种或多种：
10mM Tris-HCl(pH 8.4)，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
10mM Tris-HCl(pH 8.4)，75mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
10mM Tris-HCl(pH 8.4)，75mM KCl，2.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
10mM Tris-HCl(pH 8.8)，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；或
10mM Tris-HCl(pH 9.2)，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100。
在上述缓冲液中，pH指为Tris-HCl溶液的pH值，在获得特定pH的Tris-HCl溶液后，加入KCl、MgCl2、TMAC、Triton X-100等成分，即能够获得上述缓冲液。
在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种上述DNA聚合酶或PCR试剂盒在PCR扩增、文库构建或测序中的应用。
在本申请第七种典型的实施方式中，提供了一种PCR扩增方法，上述PCR方法中利用上述DNA聚合酶或上述PCR试剂盒进行PCR扩增。
在一种优选的实施例中，PCR方法包括：在扩增过程中利用上述DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸；优选地，修饰包括3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括3’-O-叠氮甲基修饰。
在本申请第八种典型的实施方式中，提供了一种文库构建试剂盒，上述文库构建试剂盒中包括上述DNA聚合酶。
在一种优选的实施例中，文库构建试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：1)用于文库构建的接头序列；2)用于提供文库构建环境的缓冲液；3)用于构建文库的酶，包括DNA打断酶、末端修复酶或连接酶中的一种或多种；4)含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
优选地，上述修饰包括但不限于3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括但不限于3’-O-叠氮甲基修饰。
在本申请第九种典型的实施方式中，提供了一种文库构建方法，包括：利用上述DNA聚合酶或上述文库构建试剂盒进行文库构建。
在一种优选的实施例中，文库构建方法包括：利用上述DNA聚合酶对连接有测序接头的待测序片段进行PCR扩增，获得DNA文库；优选地，文库构建方法包括：在进行DNA扩增过程中利用DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸；优选地，文库构建方法还包括：对基因组DNA进行片段化处理，获得片段化DNA；对片段化DNA进行末端修复，获得修复片段化DNA；将接头序列连接至修复片段化DNA，获得连接有测序接头的待测序片段；优选地，上述修饰包括但不限于3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括但不限于3’-O-叠氮甲基修饰。
利用上述文库构建试剂盒和/或文库构建方法，利用上述DNA聚合酶能够将连接有测序接头(包括但不限于全长型接头或截短型接头)的待测序片段进行PCR扩增、富集，为后续的测序提供充足的样本。
在本申请第十种典型的实施方式中，提供了一种测序试剂盒，上述测序试剂盒包括上述DNA聚合酶。
在一种优选的实施例中，测序试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：1)用于与接头序列互补配对的引物；2)双脱氧核苷酸；3)dNTPs；4)核酸探针；5)用于测序的酶，包括DNA连接酶和/或内切酶；6)用于洗脱核酸探针和/或dNTPs的缓冲液；7)含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
优选地，上述修饰包括但不限于3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括但不限于3’-O-叠氮甲基修饰。
在本申请第十一种典型的实施方式中，提供了一种测序方法，包括：利用上述DNA聚合酶或上述测序试剂盒进行测序。
在一种优选的实施例中，测序方法包括：利用上述DNA聚合酶对待测序样本进行PCR扩增，获得DNA文库，利用测序技术对DNA文库进行测序，获得测序结果；优选地，上述测序方法还包括：在进行PCR扩增过程中利用所述DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
优选地，上述修饰包括但不限于3’-O-阻断修饰；优选地，3’-O-阻断修饰包括但不限于3’-O-叠氮甲基修饰。
利用上述测序试剂盒和/或测序方法，能够通过现有技术中Sanger测序、二代测序或三代测序等方法实现对于待测序样本的测序。在测序中，利用本申请上述DNA聚合酶，能够实现乳液PCR、桥式PCR、滚环扩增技术等现有测序技术中常见的PCR反应。上述乳液PCR可以参考ABI公司的Soild测序方法中的乳液PCR操作、或参考Roche 454测序方法中的乳液PCR操作。上述桥式PCR可以参考illumina公司的Solexa测序方法中的桥式PCR操作。上述滚环扩增技术可以参考华大基因的MGI测序方法中的滚环扩增技术(RCA)扩增制备DNA纳米球(DNB)的方法。
利用上述DNA聚合酶，能够实现对于目标样本或序列的PCR扩展、文库构建或高通量测序。尤其是利用上述对修饰单碱基(包括但不限于对3’-O-阻断修饰的脱氧核糖核苷酸)具有聚合活性的DNA聚合酶(DNA聚合酶突变体)，能够在PCR扩增或建库阶段利用含有阻断修饰的核苷酸进行DNA聚合，实现对于目标序列的标记。或在测序阶段，利用上述DNA聚合酶突变体，能够实现对于含有阻断修饰的核苷酸的DNA的扩增，从而完成对于含有阻断修饰的核苷酸的DNA的测序。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。在本申请实施例中进行如下探究：
(1).将22°S DNA聚合酶序列基因合成后，构建入pET-28a(+)载体内(插入位点为Nde I/Xho I)，并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中进行异源表达。
(2).采用镍柱和离子柱进行纯化。
(3).通过功能活性测定，确定该酶具有较好的热稳定性、5’-3’聚合活性及3’-5’外切活性。
(4).通过功能PCR测试，该酶可直接应用于PCR反应。
(5).对22°S DNA聚合酶进行定点突变和突变体蛋白诱导表达、纯化，获得22°S-Mut DNA聚合酶。
(6).对22°S-Mut DNA聚合酶在酶标仪上进行3’-O-阻断修饰的脱氧核糖核苷酸的聚合活性 测试。
实施例1 序列比对
采用Clustal Omega在线序列比对网站，将本发明所披露的22°S DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶以及Pfu DNA聚合酶进行多重序列比对，比对结果显示22°S DNA聚合酶和KOD及Pfu DNA聚合酶的序列一致性分别为40.28％和42.52％，具体比对结果如图1所示。
Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，KOD DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
SEQ ID NO：5：
SEQ ID NO：6：
实施例2 结构模型
对该序列进行基于AlphaFold的蛋白结构模型预测，通过结构分析，可见22°S DNA聚合酶 具有B家族DNA聚合酶典型的结构域特征，包括N-端域、核酸外切域、掌域、指域及拇指域。22°S DNA聚合酶结构域特征分析图如图2所示。
实施例3 22°S DNA聚合酶重组质粒构建及蛋白表达纯化
1.22°S DNA聚合酶质粒构建与转化
含有22°S DNA聚合酶基因序列的表达质粒pET-28a(+)/22°S委托常州新一产生命科技有限公司进行合成构建，克隆位点为Nde I和Xho I。pET-28a(+)/22°S重组质粒转化入购买自天根生化科技(北京)有限公司的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(货号：CB105)中，进行后续表达纯化。转化步骤为：取0.5μL 50ng/μL的pET-28a(+)/22°S质粒加入100μL BL21(DE3)感受态细胞中，轻弹混匀并于冰上放置5分钟；42℃热激1分钟后再次于冰上放置5分钟；加入400μL无抗性LB，37℃摇床220rpm震荡1小时；取100μL培养物涂于卡那霉素抗性LB平板，37℃孵育12-16小时。
2.22°S DNA聚合酶蛋白表达与纯化
(1).挑取平板上长势良好的单菌落3-6个，接种至50/250mL的LB液体锥形瓶中，37℃培养5-7h，OD600达到0.6-4.0。随后以1％的接种量将上述菌液接种至2L/5L的LB培养基中，37℃培养2-4小时，待OD600达到0.6-0.8。将原摇床预冷至16℃。向培养基中加入IPTG，使其终浓度为0.5mM。16℃的摇床内，220rpm、诱导表达12-16小时。
(2).诱导表达后，所有菌液采用8000g转速，离心10min收集菌体。随后按1:10比例加入Ni柱亲和A液进行菌体重悬，并采用超声的方法，在冰浴环境中进行菌体破碎。
(3).加热处理：水浴锅预热至75-80℃，将已破碎菌体放入水浴锅中，摇动混匀，用干净的温度计检测菌液内部温度到达75℃时，计时30min，期间每10min摇动混匀1次，使受热均匀。
(4).将热处理后的超声破碎液在12000rpm转速下4℃离心60min，将上清用0.22μM滤膜进行过滤，作为AKTA(pureTM25T纯化系统，Cytiva)纯化柱上样样品。
将上述样品以2.5mL/min的流速上样进预处理后的镍层析柱(HisTrap FF，5mL柱)。上样完成后，继续用Ni柱亲和A液冲洗20个柱体积(20CV)。随后进行Ni柱亲和B液占比0-70％、10.5CV的线性洗脱。紫外吸收峰达到50mAu时收集洗脱蛋白，紫外吸收峰下降到200mAu时停止收集。将收集的样品进行SDS-PAGE电泳分析确定蛋白纯度。22°S DNA聚合酶纯化样品SDS-PAGE电泳分析结果图如图3所示。
(5).将收集的蛋白洗脱峰样品在4℃透析过夜。透析完成后测定蛋白浓度，并储存在储存液中保存于-20℃冰箱，用于后续功能活性分析，酶储浓度0.18mg/mL。
纯化过程中所用缓冲液具体组分如下所示：
Ni柱亲和A液：20mM Tris-HCl(2.43g/L)，500mM NaCl(29.22g/L)，20mM Imidazole(咪唑，1.36g/L)，5％Glycerol(甘油，62.5g/L),pH 7.5。
Ni柱亲和B液：20mM Tris-HCl(2.43g/L)，500mM NaCl(29.22g/L)，500mM Imidazole(34.04g/L)，5％Glycerol(62.5g/L)，pH 7.5@25℃。
2×透析液：40mM Tris-HCl(4.86g/L)，200mM KCl(14.91g/L)，2mM DTT(二硫苏糖醇，0.3085g/L)，0.2mM EDTA-2Na(0.0744g/L)，5％Glycerol(62.5g/L)，pH 8.0@25℃。
储存液:10mM Tris-HCl(1.21g/L)，100mM KCl(7.455g/L)，1mM DTT(0.15425g/L)，0.1mM EDTA-2Na(0.0372g/L)，50％Glycerol(625g/L)，pH 7.5@25℃。
实施例4 22°S DNA聚合酶热稳定性测定
采用购买自赛默飞公司的Protein Thermal ShiftTM染料试剂盒(货号：4461146)对22°S DNA聚合酶进行蛋白稳定性测定。对照采用KOD DNA聚合酶(SEQ ID NO：6)和Pfu DNA聚合酶(SEQ ID NO：5)，测试反应体系为：5μL Protein Thermal Shift Buffer、2μL待测蛋白、2.5μL 8×Protein Thermal Shift Dye、10.5μL无核酸酶水。将上述反应体系混匀后置于StepOneTM实时荧光定量PCR系统(Applied BiosystemsTM)上进行25-99℃升温实验，监测ROX荧光信号变化，结果如表1所示。
表1
实施例5 22°S DNA聚合酶聚合活性测定
采用Primed M13mp18Single-stranded DNA(NEB，货号：N4040S)底物进行聚合活性测定，具体原理如图4所示。在聚合活性存在的情况下Primed M13ssDNA上的引物会按照5’→3’的方向沿着ssDNA进行延伸生成dsDNA。生成的dsDNA可通过QubitTM dsDNA HS定量试剂盒(赛默飞，货号:Q32854)进行定量检测。基于Primed M13ssDNA的聚合活性检测原理示意图如图4所示。具体反应体系及组分如表2所示。
表2

将上述反应液在72℃反应5min后，加入2μL 0.5M的EDTA终止反应，并用QubitTM dsDNA HS定量试剂盒进行dsDNA浓度测定。阴性对照以同体积的酶储存液替代22°S DNA聚合酶。以实验组的Qubit值减去阴性对照组的Quibt值作为ΔQubit值表征聚合活性。结果如表3所示，22°S DNA聚合酶在72℃具有聚合活性。
表3
实施例6 22°S DNA聚合酶外切活性测定
采用末端错配荧光探针的方法，对22°S DNA聚合酶进行外切活性定性测试，探针序列为ATCAGCAGGCCACACGTTAAACTGT-BHQ2(SEQ ID NO：7)和FAM-5’-TGTCTTTAAC GTGTGGCCTGCTGAT(SEQ ID NO：8)，两者按照等摩尔量混合(终浓度10μM)并进行退火处理，作为外切活性测试的荧光探针底物。外切活性测试所采用的反应体系(总体积25μL)如下：2.5μLReaction Buffer、0.25μL 10μM荧光探针底物、2μL的22°S DNA聚合酶(酶浓度为0.18mg/mL)、20.25μL的无核酸酶水。阳性对照组KOD DNA聚合酶。阴性对照组将其中的酶液组分用同体积的酶储存液进行替换。反应体系在冰上配置，配制完成后转移到384孔板并置于酶标仪(BioTek Synergy H1，Agilent)中进行荧光信号的检测。激发光和发射光分别设置为492nm和518nm，反应温度37℃，每间隔30s收集一次荧光信号，整个反应时长为1小时。22°S DNA聚合酶外切活性测试结果如图5所示(荧光数值均已减去对应空白对照值)，22°S DNA聚合酶外切活性与KOD DNA聚合酶相当。
实施例7 22°S DNA聚合酶PCR潜力评估
采用5种具有代表性的PCR反应Buffer测试22°S DNA聚合酶应用于PCR的潜力。所用5种反应Buffer(缓冲液)组分如表4所示。
表4
采用大肠杆菌基因组为模板进行16s基因的扩增，所用上下游引物为E16S-27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO：9)和E16S-1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO：10)，PCR反应体系如表5所示。
表5
PCR循环为：95℃预变性3min；95℃20s，58℃15s，72℃1.5min，30个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，所用分子marker为天根100bp DNA ladder(货号：MD109-01),22°S DNA聚合酶PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。22°S DNA聚合酶在这5个Buffer条件下均能进行PCR扩增，其中在Buffer 4条件下扩增最好、产量最高。
实施例8-22°S DNA聚合酶突变体载体构建
以22°S DNA聚合酶野生型表达质粒pET-28a/22°S为模板，构建了包含6个突变位点的突变体22°S-Mut。以下表6所列3对引物对，通过三轮快速PCR扩增，在相应位点引入突变。
快速PCR反应体系为：5μL Pfu DNA聚合酶10X Buffer with MgSO4，1μL dNTP Mix(10mM each)，1.5μL正向引物(10μM)，1.5μL反向引物(10μM)，50ng模板DNA，0.5μL的Pfu DNA聚合酶(3U/μL，Promega，货号：M7741)，加入去核酸酶水至总体积50μL。快速PCR反应程序设定为：95℃预变性2min；95℃30s，58℃30s，72℃8min，16个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
在PCR产物中加入1μL DpnI(20U/μL，NEB，货号：R0176V)，37℃金属浴2h，消化模板。之后反应产物转化到购买自天根的大肠杆菌DH5α感受态细胞(货号：CB101)中。转化步骤为：取10μL反应产物加入100μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀并于冰上放置30分钟；42℃热激1分钟后再次于冰上放置10分钟；加入400μL无抗性LB，37℃摇床220rpm/min震荡1小时。培养物于3000g离心3min后，弃去部分上清，约留100μL，重悬混匀后涂于卡那霉素抗性LB平板，37℃孵育12-16小时。
分别挑取若干个单菌落于37℃摇床过夜培养后进行质粒DNA小量提取。质粒寄送到北京六合华大基因科技有限公司进行Sanger测序以验证突变位点是否正确引入。将同时带有D147A+E149A+L424A+Y425A+P426I+A503L共6个突变位点的测序正确的质粒pET-28a/22°S-Mut转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化过程参照实施例3，获得表达突变体22°S-Mut的重组大肠杆菌菌株。
表6
实施例9 22°S DNA聚合酶突变体蛋白表达纯化
22°S DNA聚合酶突变体22°S-Mut(D147A+E149A+L424A+Y425A+P426I+A503L)的表达纯化参照实施例3，对收集的蛋白洗脱峰样品进行SDS-PAGE电泳分析确定蛋白纯度，22°S-Mut DNA聚合酶纯化样品SDS-PAGE电泳分析结果如图7所示。22°S-Mut储存在储存液中，酶储浓度0.25mg/mL。
实施例10 22°S DNA聚合酶突变体对修饰单碱基参入的聚合活性检测
利用带Cy5荧光染料标记和3’-O-叠氮甲基阻断基团修饰的dATP作为底物，以带Cy3荧光染料标记的DNA双链作为模板引物，模拟高通量测序过程中参入阻断修饰核苷酸。通过在酶标仪上检测底物聚合到模板链上时因Cy3与Cy5处于相互作用距离内而产生的FRET-Cy5荧光信号，进行22°S-Mut DNA聚合酶对修饰单碱基参入的聚合活性检测。
检测方法如下：10X反应Buffer为200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mM KCl、20mM MgSO4、pH 8.5@25℃。50μL反应体系按如下进行配制，5μL 10X反应Buffer、40μM dT/G/GTP、0.1mg/mL BSA(牛血清蛋白)、1μM Cy3-DNA双链模板(结构如图8所示)、4μM Cy5修饰的3’-O-AzidoMethyl-dATP(3’-O-叠氮甲基-dATP)、0.5μg 22°S DNA聚合酶或22°S-Mut DNA聚合酶，无核酸酶水补齐反应体系至50μL。
其中，Cy3-DNA双链模板的正义链为5’-CGTGTATGCGTAATAGGATCCCGACTCACTA TGGACG-3’(SEQ ID NO：17)；反义链为5’-CGTGTATCGTCCATAGTGAGTCGGGATC  CTATTACGC-3’(SEQ ID NO：18)，正义链和反义链的5’端均有Cy3修饰。
反应体系在冰上配置，配制完成后转移到384孔板并置于酶标仪(BioTek Synergy H1，Agilent)中进行荧光信号的检测。反应温度40℃，每间隔30s收集一次530/568nm和630/676nm(FRET Cy5)荧光信号，整个反应时长为2小时。阴性对照以等体积的酶储存液替换22°S-Mut DNA聚合酶。反应结束后，导出原始数据并计算最大斜率，即单位时间内的ΔFRET-Cy5荧光值(ΔRFU)，用以表征聚合酶对修饰单碱基参入的聚合活性。
实验结果如下表7所示，22°S DNA聚合酶实验组的荧光信号曲线与阴性对照组一样，并没有检测到FRET Cy5荧光信号的检测。22°S-Mut DNA聚合酶实验组能检测到荧光信号上升，其聚合速率为1.4ΔRFU/min。通过突变改造获得的22°S-Mut DNA聚合酶对修饰单碱基具有聚合活性。通过对22°S DNA聚合酶进行有效突变，可为高通量测序提供具有很大应用潜力的突变体。
表7
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：相较于现有的B家族DNA聚合酶或其他DNA聚合酶，上述DNA聚合酶为新型DNA聚合酶，且该聚合酶野生型已具备较好的热稳定性和PCR扩增能力，原始酶学性能较好，可以较好地进行PCR扩增；序列新颖性好，可为DNA聚合酶不同应用场景的改造需求提供全新的酶骨架，可根据不同的应用场景进行进一步体系优化和改造，具有较大提升空间和应用潜力。进一步地，通过上述野生型的DNA聚合酶进行简单的突变改造，能够获得对3’-O-叠氮甲基等阻断修饰的脱氧核糖核苷酸具有聚合活性的DNA聚合酶突变体，在基于3’-O-叠氮甲基等阻断修饰的脱氧核糖核苷酸的高通量测序技术中具有应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (23)

  1. 一种DNA聚合酶，其特征在于，包括如下任一种蛋白：
    (a)具有SEQ ID NO：1所示的序列的蛋白；
    (b)在SEQ ID NO：1所示的序列中，如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸的蛋白：D147、E149、L424、Y425、P426和A503；或
    (c)与(a)或(b)中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％以上同源性、且具有DNA聚合酶活性的蛋白。
  2. 根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶具有热稳定性；
    优选地，所述DNA聚合酶的热稳定性优于KOD DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶；
    优选地，所述DNA聚合酶具有3’-5’核酸外切活性。
  3. 根据权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述(b)中，各位点取代的氨基酸类型包括以下至少一种：
    D147A、
    E149A、
    L424A/G/H/I/K/L/M/N/Q/S/T/V、
    Y425A/G/S/T/V、
    P426I/A/D/G/L/P/S/T/V或
    A503L/C/D/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/Y。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述DNA聚合酶包括：
    具有SEQ ID NO：3所示的序列的蛋白，或
    与SEQ ID NO：3所示的序列具有70％以上同源性、具有DNA聚合活性、且对修饰的脱氧核糖核苷酸具有聚合活性的蛋白；
    优选地，所述修饰包括3’-O-阻断修饰；
    优选地，所述3’-O-阻断修饰包括3’-O-叠氮甲基修饰。
  5. 一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子包含编码权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶的多核苷酸。
  6. 根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
  7. 一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含有权利要求5或6所述的DNA分子。
  8. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞内含有权利要求5或6所述的DNA分子、或权利要求7所述的重组载体。
  9. 根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；
    优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌。
  10. 一种PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒包括权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶。
  11. 根据权利要求10所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：
    1)用于提供PCR扩增环境的缓冲液；
    2)PCR引物；
    3)用于提取目标DNA的试剂。
  12. 根据权利要求11所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～9.4，20～80mM KCl，1.0～3.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
    优选地，所述缓冲液包括如下任意一种或多种：
    9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～8.6，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
    9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～8.6，70～80mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
    9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.2～8.6，70～80mM KCl，2.01～3.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
    9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 8.61～9.0，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；或
    9.5～10.5mM Tris-HCl，pH 9.01～9.4，20～30mM KCl，1.0～2.0mM MgCl2，35～45mM TMAC，0.05～0.15％Triton X-100；
    更优选地，所述缓冲液包括如下任意一种或多种：
    10mM Tris-HCl，pH 8.4，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
    10mM Tris-HCl，pH 8.4，75mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
    10mM Tris-HCl，pH 8.4，75mM KCl，2.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；
    10mM Tris-HCl，pH 8.8，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100；或
    10mM Tris-HCl，pH 9.2，25mM KCl，1.5mM MgCl2，40mM TMAC，0.1％Triton X-100。
  13. 权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶或权利要求10至12中任一项所述的PCR试剂盒在PCR扩增、文库构建或测序中的应用。
  14. 一种PCR扩增方法，其特征在于，所述PCR方法包括：利用权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶或权利要求10至12中任一项所述的PCR试剂盒进行PCR扩增。
  15. 根据权利要求14所述的PCR扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增方法包括：在扩增过程中利用所述DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸；
    优选地，所述修饰包括3’-O-阻断修饰；
    优选地，所述3’-O-阻断修饰包括3’-O-叠氮甲基修饰。
  16. 一种文库构建试剂盒，其特征在于，所述文库构建试剂盒中包括权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶。
  17. 根据权利要求16所述的文库构建试剂盒，其特征在于，所述文库构建试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：
    1)用于文库构建的接头序列；
    2)用于提供文库构建环境的缓冲液；
    3)用于构建文库的酶，包括DNA打断酶、末端修复酶或连接酶中的一种或多种；
    4)含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
  18. 一种文库构建方法，其特征在于，所述文库构建方法包括：利用权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶或权利要求16或17所述的文库构建试剂盒进行文库构建。
  19. 根据权利要求18所述的文库构建方法，其特征在于，所述文库构建方法包括：
    利用所述DNA聚合酶对连接有测序接头的待测序片段进行PCR扩增，获得DNA文库；
    优选地，所述文库构建方法还包括：在进行DNA扩增过程中利用所述DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
  20. 一种测序试剂盒，其特征在于，所述测序试剂盒包括权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶。
  21. 根据权利要求20所述的测序试剂盒，其特征在于，所述测序试剂盒中还包括如下任意一种或多种成分：
    1)用于与接头序列互补配对的引物；
    2)双脱氧核苷酸；
    3)dNTPs；
    4)核酸探针；
    5)用于测序的酶，包括DNA连接酶和/或内切酶；
    6)用于洗脱所述核酸探针和/或dNTPs的缓冲液；
    7)含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
  22. 一种测序方法，其特征在于，所述测序方法包括：利用权利要求1至4中任一项所述的DNA聚合酶或权利要求20或21所述的测序试剂盒进行测序。
  23. 根据权利要求22所述的测序方法，其特征在于，所述测序方法包括利用所述DNA聚合酶对待测序样本进行PCR扩增，获得DNA文库；
    利用测序技术对所述DNA文库进行测序，获得测序结果；
    优选地，所述测序方法还包括：
    在进行PCR扩增过程中利用所述DNA聚合酶掺入含有修饰的脱氧核糖核苷酸。
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