WO2025115397A1 - バイオセンサ、認識分子の再生方法 - Google Patents

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渉 岩崎
裕樹 芦葉
宏忠 平間
由佳子 千賀
真宏 渡邊
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor and a method for regenerating a recognition molecule in a biosensor.
  • a biosensor is a sensor that uses a recognition molecule (antibody, enzyme, aptamer, etc.) that specifically binds to a specific biomarker.
  • a biosensor detects specific proteins in blood, etc., using the intermolecular interaction between the biomarker and the recognition molecule.
  • a first recognition molecule is fixed to a substrate in advance. Then, a sample such as a liquid containing a biomarker is poured, and the biomarker is captured by the first recognition molecule.
  • a second recognition molecule modified with a labeling substance is bound to the biomarker, and the biomarker is sandwiched between the first recognition molecule and the second recognition molecule.
  • the specific biomarker in the sample is quantified by measuring the absorbance, fluorescence intensity, and mass change of the second recognition molecule (label), and the absorbance and redox current of the reaction product of the labeling substance (enzyme) and the substrate.
  • biomarkers that can be detected by wearable devices with built-in biosensors include lifestyle-related disease markers.
  • tumor markers that suggest the presence of cancer include CEA and AFP (alpha-fetoprotein).
  • biomarkers that suggest heart disease include oxidized LDL and C-reactive protein (CRP).
  • biomarkers that suggest dementia include amyloid beta.
  • Typical biosensors include, for example, sensors that use ELISA (a method for quantifying trace amounts of biological substances using an antigen-antibody reaction), sensors that use immunochromatography such as in pregnancy tests, sensors that use surface plasmon resonance (SPR) (see, for example, Non-Patent Document 1), and sensors that use enzymes and aptamers.
  • ELISA a method for quantifying trace amounts of biological substances using an antigen-antibody reaction
  • SPR surface plasmon resonance
  • the present invention was made in consideration of the above circumstances, and aims to provide a biosensor that can be used repeatedly and continuously and can be further miniaturized, and a method for regenerating the recognition molecules in the biosensor.
  • the present invention has the following aspects.
  • a flow path for flowing a sample solution containing a biomarker a sensor portion disposed in the flow channel and having a recognition molecule; a first electrode and a second electrode spaced apart from each other within the flow channel; a current applying means for applying a current to the first electrode and the second electrode; A detection means for detecting the biomarker captured by the recognition molecule.
  • the biosensor described in [1] further comprising a pH detection unit for detecting the pH of the sample solution present in an area including the first electrode and its surrounding area.
  • the method for regenerating a recognition molecule according to [3] or [4] wherein the pH of the sample solution present in the region including the first electrode and its periphery is controlled to be 1 or more and 3.5 or less.
  • the present invention provides a biosensor that can be used repeatedly and continuously and can be further miniaturized, and a method for regenerating the recognition molecules in the biosensor.
  • Flow path 2 is a flow path through which a sample solution 120 containing a biomarker 110 flows.
  • the first electrode 4 and the second electrode 5 are disposed apart from each other in the flow path 2.
  • the first electrode 4 and the second electrode 5 are disposed in the flow path 2 along the flow direction of the sample solution 120 (the length direction of the flow path 2) so as to sandwich the sensor unit 3.
  • the first electrode 4 and the second electrode 5 may be disposed in the flow path 2 along a direction perpendicular to the flow direction of the sample solution 120 (the inner circumferential direction of the flow path 2) so as to sandwich the sensor unit 3.
  • the substrate 31 of the sensor unit 3 may be the first electrode 4. There is almost no difference in the regeneration ability of the biosensor 1 for the recognition molecule 32 whether the first electrode 4 and the second electrode 5 are arranged to sandwich the sensor part 3 or whether the substrate 31 of the sensor part 3 is the first electrode 4.
  • the current application means 6 is connected to the first electrode 4 and the second electrode 5, and applies a current to these two electrodes with the first electrode 4 as the anode, thereby oxidizing chloride ions and hydroxide ions in the sample solution 120 on the surface 4a of the first electrode 4, generating chlorine and oxygen, and creating a high concentration of hydrogen ions (H + ) area near the surface 4a of the first electrode 4, or applies a current with the first electrode 4 as the cathode, thereby reducing hydrogen ions in the sample solution 120 on the surface 4a of the first electrode 4, generating hydrogen, and creating a high concentration of hydroxide ions (OH - ) area near the surface 4a of the first electrode 4.
  • the detection means 7 detects the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32.
  • the pH detection unit 8 detects the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery.
  • the pH detection unit 8 is connected to the reading unit 10.
  • the region ⁇ including the first electrode 4 and its surroundings may be within 10 centimeters, within 7 centimeters, or within 5 centimeters from the downstream end of the first electrode 4 in the direction in which the sample solution 120 flows, in a cross section along the height direction of the biosensor.
  • the flow channel 2 is not particularly limited as long as it can pass the sample solution 120 containing the biomarker 110, but is preferably a microchannel formed in the flow channel substrate 11 by, for example, a hydrogel molding method, a microfabrication method such as photolithography, soft lithography, cutting, bonding, or a combination of these microfabrication methods.
  • a microchannel is a flow channel with an inner diameter (maximum diameter) on the order of nanometers to millimeters. Since the flow channel 2 is a microchannel, the biomarker 110 can be detected with high sensitivity by the biosensor 1. In addition, the biomarker 110 bound to the recognition molecule 32 can be easily dissociated by a regeneration method described later.
  • the flow path substrate 11 may be made of, for example, silicone rubber, various resins other than silicone rubber, glass, or the like.
  • the first electrode 4 is not particularly limited as long as it is not deteriorated by the sample solution 120 and ions such as hydrogen ions and hydroxide ions, and in some cases, can immobilize the recognition molecule 32 on its surface 4a.
  • the first electrode 4 include metal electrodes made of metals such as gold and platinum, and carbon-based electrodes.
  • the carbon-based electrodes include electrodes printed with carbon ink, glassy carbon electrodes, and boron-doped diamond electrodes.
  • the second electrode 5 is not particularly limited as long as it is not deteriorated by the sample solution 120 and ions such as hydrogen ions and hydroxide ions.
  • Examples of the second electrode 5 include metal electrodes made of metals such as gold and platinum, and carbon-based electrodes.
  • the carbon-based electrodes include electrodes printed with carbon ink, glassy carbon electrodes, and boron-doped diamond electrodes.
  • the current application means 6 is not particularly limited as long as it can apply a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • the current application means 6 is not particularly limited as long as it functions as a current generation source, and examples of the current application means include a current generator, a voltage/current generator, and the like.
  • the substrate 31 is not particularly limited as long as it is capable of immobilizing the recognition molecule 32 on its surface 31a and is not deteriorated by the sample solution 120 and ions such as hydrogen ions, hydroxide ions, etc.
  • Examples of the substrate 31 include a metal film made of a metal such as gold or platinum, a carbon film, etc.
  • the recognition molecule 32 is not particularly limited as long as it can capture the biomarker 110 contained in the sample solution 120, and examples thereof include antibodies, enzymes, and aptamers.
  • the detection means 7 is not particularly limited as long as it functions as a detector, and a detection means according to the application of the biosensor 1, i.e., the type of biomarker 110 to be detected by the biosensor 1, is used.
  • a detection means according to the application of the biosensor 1, i.e., the type of biomarker 110 to be detected by the biosensor 1, is used.
  • a method is used in which a second recognition molecule modified with a labeling substance is bound to the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32 (first recognition molecule), or a method is used that does not use a second recognition molecule modified with a labeling substance.
  • a detection method that can perform a detection method corresponding to the second recognition molecule is used as the detection means 7.
  • Examples of the detection means 7 include a device that measures the fluorescence emitted by the second recognition molecule (label), a device that measures the absorbance of a substance generated by the reaction of the second recognition molecule (label) with a substrate, and a device that measures the redox current of a substance generated by the reaction of the second recognition molecule (label) with a substrate.
  • Examples of methods that do not use a second recognition molecule that is, methods that directly measure the amount of binding of the biomarker 110 to the recognition molecule 32, include surface plasmon resonance, quartz crystal microbalance, electrochemical impedance measurement, and surface acoustic wave measurement. Fig.
  • the detection means 7 has a light source 71 that irradiates the sensor unit 3 with white light, and a detector 72 that detects the amount of change in the wavelength of light attenuated by surface plasmon resonance due to binding of the biomarker 110 to the recognition molecule 32.
  • pH detection unit 8 An example of the pH detection unit 8 is a pH meter. By providing the pH detection unit 8, it is not necessary to use a pH indicator to detect the pH of the sample solution 120. Furthermore, by providing the pH detection unit 8, the pH of the sample solution 120 can be detected instantly, and the application of a current to the first electrode 4 and the second electrode 5 by the current application means 6 can be adjusted, making it easier to control the pH of the sample solution 120.
  • the substrate 9 is not particularly limited as long as the flow path substrate 11 can be provided on one surface 9a of the substrate 9, and examples of the substrate 9 include a glass substrate, a resin substrate, etc.
  • the sensor unit 3 is composed only of the recognition molecule 32 fixed to the inner surface 2a of the flow path 2 (the inner surface 11a of the flow path substrate 11)
  • the flow path substrate 11 is not particularly limited as long as the recognition molecule 32 can be fixed to the inner surface 11a and the substrate 11 is not deteriorated by the sample solution 120 and ions such as hydrogen ions and hydroxide ions.
  • biomarkers 110 include, but are not limited to, tumor markers that suggest the presence of cancer, such as CEA and AFP (alpha-fetoprotein), biomarkers that suggest heart disease, such as oxidized LDL and C-reactive protein (CRP), and biomarkers that suggest dementia, such as amyloid beta.
  • tumor markers that suggest the presence of cancer
  • AFP alpha-fetoprotein
  • biomarkers that suggest heart disease such as oxidized LDL and C-reactive protein (CRP)
  • CRP C-reactive protein
  • biomarkers that suggest dementia such as amyloid beta.
  • the sample solution 120 is a solution containing the biomarker 110.
  • Specific examples of the sample solution 120 include body fluids such as blood, interstitial fluid, sweat, and saliva, and physiological saline such as phosphate buffered saline and Tris buffered saline.
  • a sample solution 120 containing a biomarker 110 is caused to flow through the flow channel 2.
  • the biomarker 110 contained in the sample solution 120 is captured by the recognition molecule 32 of the sensor unit 3.
  • the biomarker 110 is qualitatively or quantitatively determined by the detection means 7. Specifically, white light is irradiated onto the sensor section 3 from the light source 71, and the amount of change in the wavelength of the light attenuated by surface plasmon resonance due to binding between the biomarker 110 and the recognition molecule 32 is detected by the detector 72, thereby qualitatively or quantitatively determining the biomarker 110.
  • the current application means 6 applies a current to the first electrode 4 as an anode and the second electrode 5 as a cathode, and a high concentration hydrogen ion (H + ) region is generated near the surface 4a of the first electrode 4.
  • the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery in the flow channel 2 becomes less than 7 (acidic).
  • the flow of the sample solution 120 flowing in the flow channel 2 causes the hydrogen ions (H + ) near the surface 4a of the first electrode 4 to flow in the direction of the recognition molecule 32.
  • the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32 is dissociated by the acidic sample solution 120, and the recognition molecule 32 is regenerated to a state in which the biomarker 110 is not bound to it. This makes it possible for the recognition molecule 32 to capture the biomarker 110 contained in the sample solution 120 again.
  • the current application means 6 applies a current with the first electrode 4 as an anode and the second electrode 5 as a cathode, and the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery can be made less than 7.
  • the acidic sample solution 120 can dissociate the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32, and the recognition molecule 32 can be restored to a state in which the biomarker 110 is not bound.
  • the current application means 6 applies a current with the first electrode 4 as a cathode and the second electrode 5 as an anode, and the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery in the flow path 2 can be made to exceed 7.
  • the alkaline sample solution 120 can dissociate the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32, and the recognition molecule 32 can be restored to a state in which the biomarker 110 is not bound.
  • the biosensor 1 can be used repeatedly and continuously without being disposable.
  • the recognition molecule 32 can be regenerated without using large-scale equipment, the biosensor 1 can be made smaller.
  • a method for regenerating a recognition molecule according to one embodiment of the present invention is a method for regenerating a recognition molecule in the biosensor according to one embodiment of the present invention described above.
  • the current applied to the first electrode 4 and the second electrode 5 is not particularly limited, but is preferably, for example, 30 ⁇ A or more and 1 mA or less, and more preferably 50 ⁇ A or more and 200 ⁇ A or less. If the current is less than 30 ⁇ A, the amount of reaction of chloride ions and oxygen ions is small, making it difficult to manipulate the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery. If the current exceeds 1 mA, the amount of gas generated near the first electrode 4 increases, or the pH becomes too low, increasing the risk of damage to the recognition molecule 32.
  • the flow rate of the sample solution 120 flowing through the flow channel 2 is not particularly limited, but is preferably, for example, 1 ⁇ l/min or more and 1 ml/min or less, and more preferably 10 ⁇ l/min or more and 200 ⁇ l/min or less.
  • the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery is preferably controlled to 1 to 3.5, and more preferably to 2 to 3.
  • the pH of the sample solution 120 is controlled to 1 to 3.5, and more preferably to 2 to 3.
  • the sample solution 120 may contain a pH indicator.
  • the pH indicator There are no particular limitations on the pH indicator as long as it can indicate a range from alkaline (pH 14) to acidic (pH 1), but examples include thymol blue, methyl red, and phenolphthalein. Thymol blue is yellow when neutral and turns red when acidic. Thymol blue is yellow when the pH is 3, and the closer to red the color is, the lower the pH and the higher the acidity.
  • the sample solution 120 contains a pH indicator, the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its surroundings can be confirmed by applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • the pH indicator can be used to determine whether to continue applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5, or to stop applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • the biosensor 1 may also include a pH detection unit 8, such as a pH meter, that detects the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery. If the biosensor 1 is provided with the pH detection unit 8, the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery can be confirmed by applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • the pH detection unit 8 makes it possible to instantly determine whether to continue applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5, or to stop applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • a current is applied to the first electrode 4 and the second electrode 5, and the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery is controlled to less than 7, thereby dissociating the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32 and regenerating the recognition molecule 32 to a state in which the biomarker 110 is not bound.
  • the recognition molecule 32 can be regenerated easily. Therefore, the biosensor 1 can be used repeatedly and continuously.
  • the recognition molecule 32 can be regenerated without using large-scale equipment.
  • “Second playback method” In the method for regenerating the recognition molecule of this embodiment, for example, in the biosensor 1, a current is applied by the current application means 6 to the first electrode 4 as an anode and the second electrode 5 as a cathode, a high concentration hydrogen ion region is generated near the surface 4 a of the first electrode 4, and the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery in the flow path 2 is controlled to be less than 7.
  • a current is applied by the current application means 6 to the first electrode 4 as a cathode and the second electrode 5 as an anode, thereby generating a high concentration hydroxide ion region near the surface 5 a of the second electrode 5, and controlling the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery in the flow path 2 to be greater than 7.
  • the current applied to the first electrode 4 and the second electrode 5 is not particularly limited, but is preferably, for example, 30 ⁇ A or more and 1 mA or less, and more preferably 50 ⁇ A or more and 200 ⁇ A or less. If the current is less than 30 ⁇ A, the amount of hydrogen ions reacting is small, making it difficult to sufficiently manipulate the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery. If the current exceeds 1 mA, the amount of gas generated near the first electrode 4 increases, or the pH becomes too high, increasing the risk of damage to the recognition molecule 32.
  • the flow rate of the sample solution 120 flowing through the flow channel 2 is not particularly limited, but is preferably, for example, 1 ⁇ l/min or more and 1 ml/min or less, and more preferably 10 ⁇ l/min or more and 200 ⁇ l/min or less.
  • the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery is preferably controlled to 10 or higher, more preferably 10 to 12, and even more preferably 11 to 12.
  • the pH of the sample solution 120 is controlled to 10 or higher, more preferably 10 to 12, and even more preferably 11 to 12.
  • the sample solution 120 may contain a pH indicator.
  • the pH indicator There are no particular limitations on the pH indicator as long as it can indicate the range from alkaline (pH 14) to acidic (pH 1), but examples include alizarin yellow, thymol blue, methyl red, and phenolphthalein. Alizarin yellow is yellow when neutral and changes color to orange when alkaline. Alizarin yellow is yellow when the pH is 10, and the closer to orange the color is, the higher the pH and the higher the alkalinity.
  • the sample solution 120 contains a pH indicator, the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery can be confirmed by applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • the pH indicator can be used to determine whether to continue applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5, or to stop applying a current to the first electrode 4 and the second electrode 5.
  • the biosensor 1 may also be provided with a pH detection unit 8, such as a pH meter, that detects the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ that includes the first electrode 4 and its periphery.
  • a pH detection unit 8 such as a pH meter
  • a current is applied to the first electrode 4 and the second electrode 5, and the pH of the sample solution 120 present in the region ⁇ including the first electrode 4 and its periphery is controlled to be greater than 7, thereby dissociating the biomarker 110 captured by the recognition molecule 32 and regenerating the recognition molecule 32 to a state in which the biomarker 110 is not bound.
  • the recognition molecule 32 can be regenerated easily. Therefore, the biosensor 1 can be used repeatedly and continuously.
  • the recognition molecule 32 can be regenerated without using large-scale equipment.
  • Example 2 Using the biosensor shown in Figure 1, a current was applied to the first and second electrodes while a sample solution was flowing through a flow path, and the change in pH of the sample solution was measured. A pH meter was used to measure the pH of the sample solution. The sample solution used was a 0.9% aqueous sodium chloride solution. The flow rate of the sample solution was set to 10 ⁇ l/min to 20 ⁇ l/min. The current applied to the first electrode and the second electrode was set to 50 ⁇ A to 200 ⁇ A. The results are shown in Figure 2. From the results shown in FIG. 2, it was confirmed that the pH of the sample solution could be controlled to 2 to 3, which is effective for regenerating the recognition molecule.
  • the biosensor of the present invention can be used repeatedly and continuously, making it possible to miniaturize the biosensor and realize a wearable device with a built-in biosensor.

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Abstract

バイオマーカー（１１０）を含む試料溶液（１２０）を流す流路（２）と、流路（２）内に配置され、認識分子（３２）を有するセンサ部（３）と、流路（２）内にて、互いに離間して配置された第１電極（４）および第２電極（５）と、第１電極（４）と第２電極（５）に電流を印加する電流印加手段（６）と、認識分子（３２）が捕捉したバイオマーカー（１１０）を検出する検出手段（７）と、を備える、バイオセンサ（１）。

Description

バイオセンサ、認識分子の再生方法
　本発明は、バイオセンサ、およびバイオセンサにおける認識分子の再生方法に関する。
　本願は、２０２３年１１月２９日に、日本に出願された特願２０２３－２０１８５４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　高度予防医療を実現するためのウェアラブル端末として、バイオセンサを内蔵したスマートウォッチ等の開発が進められている。バイオセンサとは、特定のバイオマーカーと特異的に結合する認識分子（抗体、酵素、アプタマー等）を用いたセンサのことである。バイオセンサは、血液中等の特定のタンパク質を、バイオマーカーと認識分子の分子間相互作用を用いて検出するものである。バイオセンサでは、基板に第１の認識分子を予め固定化する。その後、バイオマーカーを含む液体等の検体を流して、第１の認識分子でバイオマーカーを捕捉する。さらに、標識となる物質を修飾した第２の認識分子をバイオマーカーに結合させて、第１の認識分子と第２の認識分子でバイオマーカーを挟み込む。この状態で、第２の認識分子（標識）の吸光度、蛍光強度、質量変化、標識物質（酵素）と基質の反応生成物の吸光度や酸化還元電流等を測定することにより、検体中の特定のバイオマーカーを定量する。
　バイオセンサを内蔵したウェアラブル端末で検出するバイオマーカーとしては、例えば、生活習慣病マーカーが挙げられる。癌の存在を示唆する腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）等が挙げられる。心疾患を示唆するバイオマーカーとしては、例えば、酸化ＬＤＬ、Ｃ反応性プロテイン（ＣＲＰ）等が挙げられる。認知症を示唆するバイオマーカーとしては、例えば、アミロイドβ等が挙げられる。
　現在、超高齢社会となった日本では、対処療法的医療体制が限界となっている。そこで、健康長寿社会の構築、生活習慣病の予防、対処療法的医療からの脱却が望まれている。このような課題を解決する手段としては、日常的に使用者（装着者）の健康管理を行うことができる、バイオセンサを内蔵したウェアラブル端末が有効であると考えられる。
　代表的なバイオセンサとしては、例えば、ＥＬＩＳＡ（抗原抗体反応を利用して微量生体物質を定量する方法）を用いたセンサ、妊娠検査薬等のイムノクロマトグラフィーを用いたセンサ、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いたセンサ（例えば、非特許文献１参照）、酵素、アプタマーを用いたセンサ等が挙げられる。
Ｍａｚｈｅｒ－Ｉｑｂａｌ　Ｍｏｈａｍｍｅｄ，Ｍａｒｃ　Ｐ．Ｙ　Ｄｅｓｍｕｌｌｉｅｚ，"Ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ　ｂａｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｄｉａｃ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：　ａ　ｒｅｖｉｅｗ"，Ｌａｂ　ｏｎ　ａ　ｃｈｉｐ　２０１１，１１，５６９－５９５．
　従来のバイオセンサは、基本的に使い捨てであり、連続して使用することができない。なぜならば、バイオマーカーを検出した後に、認識分子からバイオマーカーを解離させて、バイオセンサを再生するためには、送液ポンプやバルブを用いて、バイオセンサ内に、再生液（酸やアルカリ等）を送液する必要があった。このようなバイオマーカーを解離させる方法は、バイオセンサの複雑化や大型化を助長すると共に、試薬の消耗（交換の必要性）を生じていた。すなわち、従来の再生方法は、バイオセンサの小型化を阻害していた。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、繰り返し、かつ連続的に使用することができ、さらに小型化できるバイオセンサ、およびバイオセンサにおける認識分子の再生方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の態様を有する。
［１］バイオマーカーを含む試料溶液を流す流路と、
　前記流路内に配置され、認識分子を有するセンサ部と、
　前記流路内にて、互いに離間して配置された第１電極および第２電極と、
　前記第１電極と前記第２電極に電流を印加する電流印加手段と、
　前記認識分子が捕捉したバイオマーカーを検出する検出手段と、を備える、バイオセンサ。
［２］前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを検出するｐＨ検出部を備える、［１］に記載のバイオセンサ。
［３］［１］または［２］に記載のバイオセンサにおける認識分子の再生方法であって、
　前記電流印加手段により、前記第１電極と前記第２電極に電流を印加し、前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを制御する、認識分子の再生方法。
［４］前記認識分子として抗体を用いる、［３］に記載の認識分子の再生方法。
［５］前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを１以上３．５以下に制御する、［３］または［４］に記載の認識分子の再生方法。
［６］前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを１０以上に制御する、［３］または［４］に記載の認識分子の再生方法。
　本発明によれば、繰り返し、かつ連続的に使用することができ、さらに小型化できるバイオセンサ、およびバイオセンサにおける認識分子の再生方法を提供することができる。
本発明の一実施形態に係るバイオセンサの概略構成を示し、バイオセンサの高さ方向に沿う断面を示す模式図である。 実施例において、印加電流と試料溶液のｐＨとの関係を示す図である。
　本発明のバイオセンサ、およびバイオセンサにおける認識分子の再生方法の実施の形態について説明する。
　なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
［バイオセンサ］
　図１は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサの概略構成を示し、バイオセンサの高さ方向に沿う断面を示す模式図である。
　図１に示すように、本実施形態のバイオセンサ１は、流路２と、センサ部３と、第１電極４と、第２電極５と、電流印加手段６と、検出手段７と、を備える。本実施形態のバイオセンサ１は、ｐＨ検出部８を備えていてもよい。センサ部３は、基材３１と、基材３１の表面３１ａに固定された認識分子３２と、を有する。なお、センサ部３は、流路２の内面２ａに固定された認識分子３２のみから構成されていてもよい。
　また、本実施形態のバイオセンサ１は、流路２を支持する基板９を備えていてもよい。
　流路２は、バイオマーカー１１０を含む試料溶液１２０を流す流路である。
　第１電極４および第２電極５は、流路２内にて、互いに離間して配置されている。第１電極４および第２電極５は、例えば、図１に示すように、流路２内において、試料溶液１２０の流れる方向（流路２の長さ方向）に沿って、センサ部３を挟むように配置されている。また、第１電極４および第２電極５は、流路２内において、試料溶液１２０の流れる方向と垂直方向（流路２の内周方向）に沿って、センサ部３を挟むように配置されていてもよい。また、センサ部３の基材３１が、第１電極４であってもよい。
　第１電極４と第２電極５が、センサ部３を挟むように配置されている場合と、センサ部３の基材３１が第１電極４である場合も、バイオセンサ１による、認識分子３２の再生能力にはほとんど差異がない。
　電流印加手段６は、第１電極４と第２電極５に接続され、これら２つの電極に第１電極４を陽極として電流を印加して、第１電極４の表面４ａで試料溶液１２０内の塩素イオンや水酸化物イオンを酸化し、塩素や酸素を発生させ、第１電極４の表面４ａ近傍に高濃度の水素イオン（Ｈ＋）領域を生成するか、または第１電極４を陰極として電流を印加して、第１電極４の表面４ａで試料溶液１２０内の水素イオンを還元し、水素を発生させ、第１電極４の表面４ａ近傍に高濃度の水酸化物イオン（ＯＨ－）領域を生成させる。
　検出手段７は、認識分子３２が捕捉したバイオマーカー１１０を検出する。
　ｐＨ検出部８は、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを検出する。ｐＨ検出部８は、読取部１０に接続されている。
　前記第１電極４およびその周辺を含む領域αは、バイオセンサの高さ方向に沿う断面において、第１電極４の、試料溶液１２０の流れる方向の下流側の端から、１０センチメートル以内であってよく、７センチメートル以内であってよく、５センチメートル以内であってよい。
［流路］
　流路２は、バイオマーカー１１０を含む試料溶液１２０を流すことができれば特に限定されないが、例えば、ハイドロゲルモールディング法や、フォトリソグラフィー、ソフトリソグラフィー、切削加工、接合等の微細加工法、または、これらの微細加工法を組み合わせた方法によって、流路基材１１に形成されたマイクロ流路であることが好ましい。マイクロ流路は、内径（最大径）がナノメートルからミリメートルのオーダーの流路である。流路２がマイクロ流路であることにより、バイオセンサ１によりバイオマーカー１１０を高感度に検出することができる。また、後述する再生方法により、認識分子３２に結合したバイオマーカー１１０を容易に解離させることができる。
　流路基材１１としては、例えば、シリコーンゴム、シリコーンゴム以外の種々の樹脂、ガラス等が挙げられる。
［第１電極］
　第１電極４としては、試料溶液１２０、および水素イオン、水酸化物イオン等のイオンによって劣化しないものであり、場合によって、その表面４ａに認識分子３２を固定化することができるものであれば、特に限定されない。第１電極４としては、例えば、金、白金等の金属からなる金属電極、炭素系電極等が挙げられる。炭素系電極としては、例えば、カーボンインクを印刷した電極、グラッシーカーボン電極、ボロンドープダイヤモンド電極等が挙げられる。
［第２電極］
　第２電極５としては、試料溶液１２０、および水素イオン、水酸化物イオン等のイオンによって劣化しないものであれば、特に限定されない。第２電極５としては、例えば、金、白金等の金属からなる金属電極、炭素系電極等が挙げられる。炭素系電極としては、例えば、カーボンインクを印刷した電極、グラッシーカーボン電極、ボロンドープダイヤモンド電極等が挙げられる。
［電流印加手段］
　電流印加手段６は、第１電極４と第２電極５に電流を印加することができるものであれば、特に限定されない。電流印加手段６としては、電流発生源として機能すれば特に限定されず、例えば、電流発生器、電圧電流発生器等が挙げられる。
［基材］
　基材３１としては、その表面３１ａに認識分子３２を固定化することができると共に、試料溶液１２０、および水素イオン、水酸化物イオン等のイオンによって劣化しないものであれば、特に限定されない。基材３１としては、例えば、金、白金等の金属からなる金属膜、炭素膜等が挙げられる。
［認識分子］
　認識分子３２は、試料溶液１２０に含まれるバイオマーカー１１０を捕捉することができるものであれば、特に限定されないが、例えば、抗体、酵素、アプタマー等が挙げられる。
［検出手段］
　検出手段７は、検出器として機能すれば特に限定されず、バイオセンサ１の用途、すなわち、バイオセンサ１によって検出するバイオマーカー１１０の種類に応じたものが用いられる。バイオマーカー１１０を検出するには、認識分子３２（第１の認識分子）によって捕捉されたバイオマーカー１１０に、標識となる物質が修飾された第２の認識分子を結合させる方法や、標識となる物質が修飾された第２の認識分子を用いない方法が用いられる。
　第２の認識分子を用いる方法では、検出手段７としては、その第２の認識分子に応じた検出方法を行うことができるものが用いられる。検出手段７としては、例えば、第２の認識分子（標識）が発する蛍光を測定する装置、第２の認識分子（標識）と基質の反応により生成する物質の吸光度を測定する装置、第２の認識分子（標識）と基質の反応により生成する物質の酸化還元電流を測定する装置等が挙げられる。
　第２の認識分子を用いない方法、すなわち、認識分子３２へのバイオマーカー１１０の結合量を直接測定する方法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、電気化学インピーダンス測定法、表面弾性波測定法等が挙げられる。図１では、表面プラズモン共鳴法によって、認識分子３２へのバイオマーカー１１０の結合量を直接測定する場合を例示する。この場合、検出手段７は、センサ部３に白色光を照射する光源７１と、表面プラズモン共鳴により減衰する光の波長が、バイオマーカー１１０と認識分子３２の結合により変化する量を検出する検出器７２とを有する。
［ｐＨ検出部］
　ｐＨ検出部８としては、例えば、ｐＨメータ等が挙げられる。ｐＨ検出部８を備えることにより、試料溶液１２０のｐＨを検出するためにｐＨ指示薬を用いる必要がない。また、ｐＨ検出部８を備えることにより、即時に試料溶液１２０のｐＨを検出することができ、電流印加手段６による第１電極４と第２電極５への電流の印加を調節して、試料溶液１２０のｐＨの制御をより容易に行うことができる。
［基板］
　基板９は、その一方の面９ａに流路基材１１を設けることができるものであれば、特に限定されないが、例えば、ガラス基板、樹脂基板等が挙げられる。センサ部３が、流路２の内面２ａ（流路基材１１の内面１１ａ）に固定された認識分子３２のみから構成される場合、流路基材１１としては、その内面１１ａに認識分子３２を固定化することができると共に、試料溶液１２０、および水素イオン、水酸化物イオン等のイオンによって劣化しないものであれば、特に限定されない。
［バイオマーカー］
　バイオマーカー１１０としては、特に限定されないが、例えば、ＣＥＡ、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）等の癌の存在を示唆する腫瘍マーカー、酸化ＬＤＬ、Ｃ反応性プロテイン（ＣＲＰ）等の心疾患を示唆するバイオマーカー、アミロイドβ等の認知症を示唆するバイオマーカー等が挙げられる。
［試料溶液］
　試料溶液１２０は、バイオマーカー１１０を含む溶液である。試料溶液１２０としては、具体的には、血液、間質液、汗、唾液等の体液やリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水等の生理食塩水等が挙げられる。
［バイオセンサの使用方法］
　本実施形態のバイオセンサ１の使用方法を説明する。
　流路２内にバイオマーカー１１０を含む試料溶液１２０を流す。流路２内に試料溶液１２０を流すと、センサ部３の認識分子３２に、試料溶液１２０に含まれるバイオマーカー１１０が捕捉される。
　次いで、検出手段７により、バイオマーカー１１０を定性または定量する。具体的には、光源７１から白色光をセンサ部３に照射し、表面プラズモン共鳴により減衰する光の波長が、バイオマーカー１１０と認識分子３２の結合により変化する量を検出器７２で検出し、バイオマーカー１１０を定性または定量する。
　バイオマーカー１１０の検出が終了した後、電流印加手段６により、第１電極４を陽極、第２電極５を陰極として電流を印加し、第１電極４の表面４ａ近傍に高濃度の水素イオン（Ｈ＋）領域が生成する。これにより、流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨが７未満（酸性）になる。また、流路２内を流れる試料溶液１２０の流れにより、第１電極４の表面４ａ近傍の水素イオン（Ｈ＋）が認識分子３２方向に流される。その結果、酸性の試料溶液１２０によって、認識分子３２に捕捉されたバイオマーカー１１０が解離して、認識分子３２はバイオマーカー１１０が結合されていない状態に再生される。これにより、再び、認識分子３２に、試料溶液１２０に含まれるバイオマーカー１１０を捕捉することが可能となる。
　本実施形態のバイオセンサ１によれば、電流印加手段６により、第１電極４を陽極、第２電極５を陰極として電流を印加し、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７未満とすることができる。その結果、酸性の試料溶液１２０によって、認識分子３２に捕捉されたバイオマーカー１１０を解離して、認識分子３２をバイオマーカー１１０が結合されていない状態に再生することができる。また、本実施形態のバイオセンサ１によれば、電流印加手段６により、第１電極４を陰極、第２電極５を陽極として電流を印加し、流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７超とすることができる。その結果、アルカリ性の試料溶液１２０によって、認識分子３２に捕捉されたバイオマーカー１１０を解離して、認識分子３２をバイオマーカー１１０が結合されていない状態に再生することができる。また、従来のように、認識分子３２を再生するために、送液ポンプやバルブを用いて、認識分子３２が配置された流路２内に、酸やアルカリ等の再生液を送液する必要がないため、認識分子３２の再生を簡便に行うことができる。従って、バイオセンサ１を使い捨てにすることなく、繰り返し、かつ連続的に使用することができる。また、大規模な設備を用いることなく、認識分子３２の再生を行うことができるため、バイオセンサ１を小型化することができる。
［認識分子の再生方法］
　本発明の一実施形態に係る認識分子の再生方法は、上述の本発明の一実施形態に係るバイオセンサにおける認識分子の再生方法である。
「第１の再生方法」
　本実施形態の認識分子の再生方法は、例えば、バイオセンサ１において、電流印加手段６により、第１電極４を陽極、第２電極５を陰極として、電流を印加し、第１電極４の表面４ａ近傍に高濃度の水素イオン領域を生成し、流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７未満に制御する。
　第１電極４と第２電極５に印加する電流は、特に限定されないが、例えば、３０μＡ以上１ｍＡ以下であることが好ましく、５０μＡ以上２００μＡ以下であることがより好ましい。電流が３０μＡ未満では、塩素イオンや酸素イオンの反応量が少なく、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０に対してｐＨの操作が難しくなる。電流が１ｍＡを超えると、第１電極４近傍からのガス発生量が増えたり、ｐＨが低くなり過ぎたりすることにより、認識分子３２が損傷するリスクが高くなる。
　流路２内を流れる試料溶液１２０の流速は、特に限定されないが、例えば、１μｌ／ｍｉｎ以上１ｍｌ／ｍｉｎ以下であることが好ましく、１０μｌ／ｍｉｎ以上２００μｌ／ｍｉｎ以下であることがより好ましい。
　流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを１～３．５に制御することが好ましく、２～３に制御することがより好ましい。試料溶液１２０のｐＨを１～３．５に制御することにより、認識分子３２からバイオマーカー１１０を解離することをより促進できる。
　試料溶液１２０は、ｐＨ指示薬を含んでいてもよい。ｐＨ指示薬としては、アルカリ性（ｐＨ１４）から酸性（ｐＨ１）の範囲を指示することができるものであれば、特に限定されないが、例えば、チモールブルー、メチルレッド、フェノールフタレイン等が挙げられる。チモールブルーは、中性では黄色を示し、酸性では赤色に変色する。チモールブルーは、ｐＨが３では黄色を示し、赤色に近い程、ｐＨが小さく、酸性度が高いことを示す。試料溶液１２０がｐＨ指示薬を含んでいれば、第１電極４と第２電極５への電流の印加によって、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを確認することができる。ｐＨ指示薬により、第１電極４と第２電極５への電流の印加を継続するか、または第１電極４と第２電極５への電流の印加を停止するかについて判断することができる。
　また、バイオセンサ１は、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを検出するｐＨメータ等のｐＨ検出部８を備えていてもよい。ｐＨ検出部８を備えていれば、第１電極４と第２電極５への電流の印加によって、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを確認することができる。ｐＨ検出部８により、第１電極４と第２電極５への電流の印加を継続するか、または第１電極４と第２電極５への電流の印加を停止するかについて即時に判断することができる。
　本実施形態の認識分子の再生方法によれば、第１電極４と第２電極５に電流を印加して、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７未満に制御することにより、認識分子３２に捕捉されたバイオマーカー１１０を解離して、認識分子３２をバイオマーカー１１０が結合されていない状態に再生することができる。また、従来のように、認識分子３２を再生するために、送液ポンプやバルブを用いて、認識分子３２が配置された流路２内に、酸やアルカリ等の再生液を送液する必要がないため、認識分子３２の再生を簡便に行うことができる。従って、バイオセンサ１を繰り返し、かつ連続的に使用することができる。また、大規模な設備を用いることなく、認識分子３２の再生を行うことができる。
「第２の再生方法」
　本実施形態の認識分子の再生方法は、例えば、バイオセンサ１において、電流印加手段６により、第１電極４を陽極、第２電極５を陰極として電流を印加し、第１電極４の表面４ａ近傍に高濃度の水素イオン領域を生成し、流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７未満に制御する。
　本実施形態の認識分子の再生方法は、バイオセンサ１において、電流印加手段６により、第１電極４を陰極、第２電極５を陽極として電流を印加し、第２電極５の表面５ａ近傍に高濃度の水酸化物イオン領域を生成し、流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７超に制御する。
　第１電極４と第２電極５に印加する電流は、特に限定されないが、例えば、３０μＡ以上１ｍＡ以下であることが好ましく、５０μＡ以上２００μＡ以下であることがより好ましい。電流が３０μＡ未満では、水素イオンの反応量が少なく、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０に対して十分なｐＨの操作が難しくなる。電流が１ｍＡを超えると、第１電極４近傍からのガス発生量が増えたり、ｐＨが高くなりすぎたりすることにより、認識分子３２が損傷するリスクが高くなる。
　流路２内を流れる試料溶液１２０の流速は、特に限定されないが、例えば、１μｌ／ｍｉｎ以上１ｍｌ／ｍｉｎ以下であることが好ましく、１０μｌ／ｍｉｎ以上２００μｌ／ｍｉｎ以下であることがより好ましい。
　流路２内において、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを１０以上に制御することが好ましく、１０～１２に制御することがより好ましく、１１～１２に制御することがさらに好ましい。試料溶液１２０のｐＨを１０以上１２に制御することにより、認識分子３２からバイオマーカー１１０を解離することをより促進できる。
　試料溶液１２０は、ｐＨ指示薬を含んでいてもよい。ｐＨ指示薬としては、アルカリ性（ｐＨ１４）から酸性（ｐＨ１）の範囲を指示することができるものであれば、特に限定されないが、例えば、アリザリンイエロー、チモールブルー、メチルレッド、フェノールフタレイン等が挙げられる。アリザリンイエローは、中性では黄色を示し、アルカリ性では橙色に変色する。アリザリンイエローは、ｐＨが１０では黄色を示し、橙色に近い程、ｐＨが大きく、アルカリ性度が高いことを示す。試料溶液１２０がｐＨ指示薬を含んでいれば、第１電極４と第２電極５への電流の印加によって、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを確認することができる。ｐＨ指示薬により、第１電極４と第２電極５への電流の印加を継続するか、または第１電極４と第２電極５への電流の印加を停止するかについて判断することができる。
　第２の再生方法においても、第２の再生方法と同様に、バイオセンサ１は、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを検出するｐＨメータ等のｐＨ検出部８を備えていてもよい。
　本実施形態の認識分子の再生方法によれば、第１電極４と第２電極５に電流を印加して、第１電極４およびその周辺を含む領域αに存在する試料溶液１２０のｐＨを７超に制御することにより、認識分子３２に捕捉されたバイオマーカー１１０を解離して、認識分子３２をバイオマーカー１１０が結合されていない状態に再生することができる。また、従来のように、認識分子３２を再生するために、送液ポンプやバルブを用いて、認識分子３２が配置された流路２内に、酸やアルカリ等の再生液を送液する必要がないため、認識分子３２の再生を簡便に行うことができる。従って、バイオセンサ１を繰り返し、かつ連続的に使用することができる。また、大規模な設備を用いることなく、認識分子３２の再生を行うことができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例］
　図１に示すバイオセンサを用いて、流路内に試料溶液を流動させながら、第１電極と第２電極に電流を印加し、試料溶液のｐＨの変化を測定した。試料溶液のｐＨの測定には、ｐＨ計を用いた。
　試料溶液としては、０．９％塩化ナトリウム水溶液を用いた。
　試料溶液の流量を、１０μｌ／ｍｉｎ～２０μｌ／ｍｉｎとした。
　第１電極と第２電極に印加する電流を、５０μＡ～２００μＡとした。
　結果を図２に示す。
　図２に示す結果から、試料溶液のｐＨを認識分子の再生に有効な２～３に制御できることが確認された。
　以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。
　本発明のバイオセンサは、繰り返し、かつ連続的に使用することができるため、バイオセンサを小型化することができ、バイオセンサを内蔵したウェアラブル端末を実現することができる。
１　バイオセンサ
２　流路
３　センサ部
４　第１電極
５　第２電極
６　電流印加手段
７　検出手段
８　ｐＨ検出部
９　基板
１０　読取部
１１　流路基材
３２　認識分子
１１０　バイオマーカー
１２０　試料溶液

Claims (6)

  1. 　バイオマーカーを含む試料溶液を流す流路と、
    　前記流路内に配置され、認識分子を有するセンサ部と、
    　前記流路内にて、互いに離間して配置された第１電極および第２電極と、
    　前記第１電極と前記第２電極に電流を印加する電流印加手段と、
    　前記認識分子が捕捉したバイオマーカーを検出する検出手段と、を備える、バイオセンサ。
  2. 　前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを検出するｐＨ検出部を備える、請求項１に記載のバイオセンサ。
  3. 　請求項１または２に記載のバイオセンサにおける認識分子の再生方法であって、
    　前記電流印加手段により、前記第１電極と前記第２電極に電流を印加し、前記流路内において、前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを制御する、認識分子の再生方法。
  4. 　前記認識分子として抗体を用いる、請求項３に記載の認識分子の再生方法。
  5. 　前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを１以上３．５以下に制御する、請求項３に記載の認識分子の再生方法。
  6. 　前記第１電極およびその周辺を含む領域に存在する前記試料溶液のｐＨを１０以上に制御する、請求項３に記載の認識分子の再生方法。
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