WO2025014308A1 - Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2025014308A1
WO2025014308A1 PCT/KR2024/009970 KR2024009970W WO2025014308A1 WO 2025014308 A1 WO2025014308 A1 WO 2025014308A1 KR 2024009970 W KR2024009970 W KR 2024009970W WO 2025014308 A1 WO2025014308 A1 WO 2025014308A1
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WO
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tie2
cells
endothelial cells
ang1
vascular endothelial
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PCT/KR2024/009970
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English (en)
French (fr)
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황창모
김수미
김지연
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Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Original Assignee
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal neovascular disease, comprising vascular endothelial cells overexpressing Tie2 as an active ingredient.
  • eye diseases that cause blindness in millions of people worldwide each year are primarily caused by angiogenesis.
  • representative examples of various eye diseases that result from abnormal blood vessels include age-related macular degeneration and diabetic retinopathy.
  • Age-related macular degeneration is a disease name that refers to the collapse or destruction of the macula that occurs along with the aging process, and it mainly occurs in people over 50 years of age.
  • This disease is divided into non-exudative (dry type) in which the macula atrophies and visual function is lost as small waste products called drusen accumulate, and exudative (wet type) in which exudate leaks from abnormal new blood vessels caused by hypoxia and accumulation of oxidative stress in the retina and choroid, causing macular edema, and if this process is repeated, the photoreceptor cells and retinal pigment epithelial cell layer in the macular area permanently degenerate, causing visual acuity decline.
  • wet macular degeneration has a high incidence of leading to blindness, and the prevalence rate in Korea is estimated to be 37 per 10,000 people.
  • the cause of macular degeneration is not yet known exactly, but age is known as a risk factor, and other notable environmental factors include smoking, high blood pressure, obesity, genetic predisposition, excessive exposure to ultraviolet rays, and low blood antioxidant levels.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • other treatments such as laser photocoagulation, photodynamic therapy, and vitreous ablation are known, but there is still no complete cure.
  • Angiopoietin-1 is an agonist of Tie2 and competes with an antagonistic ligand angiopoietin-2 (Ang2) for binding to Tie2 on vascular endothelial cells.
  • Ang1 a ligand that activates the Tie2 receptor, acts as a key regulator of vascular stability by maintaining the barrier function of vascular endothelial cells.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • vascular endothelial cells are activated and vascular permeability increases.
  • Ang1 promotes the junctional integrity of vascular endothelial cells, thereby inducing endothelial cell stabilization and reducing vascular permeability.
  • Treatments for wet AMD include antibody injection therapy for vascular endothelial growth factor (VEGF) (Anti-VEGF therapy), therapy using anti-Ang2 antibodies that specifically bind to Ang2 and, together with Ang2, bind to Tie2 receptors, and therapy using recombinant proteins or antibodies that directly bind to Tie2 receptors to induce phosphorylation and activation (Anti-Ang-2 therapy).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Anti-VEGF therapy therapy using anti-Ang2 antibodies that specifically bind to Ang2 and, together with Ang2, bind to Tie2 receptors
  • Anti-Ang-2 therapy therapy using recombinant proteins or antibodies that directly bind to Tie2 receptors to induce phosphorylation and activation
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Anti-VEGF therapy therapy using anti-Ang-2 antibody
  • Anti-Ang-2 therapy have the inconvenience of requiring intraocular injections at intervals of 4 to 8 weeks.
  • short-cycle intraocular injections can cause side effects such as eye pain, eye hemorrhage or vascular rupture, eye inflammation or infection, vision changes, and intraocular pressure changes, which is a great burden to patients. Therefore, there is an urgent need for the development of a cell therapy agent for inhibiting retinal angiogenesis using vascular endothelial cells with increased expression of Tie2 and cells with enhanced Ang1 production function, which can have a long-lasting effect with a single intraocular injection.
  • One aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal neovascular disease, comprising vascular endothelial cells overexpressing Tie2 as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a kit for preventing or treating intraretinal neovascular disease, comprising the pharmaceutical composition.
  • Another aspect provides a use of the composition for preventing or treating intraretinal neovascular disease.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating intraretinal neovascular disease, comprising administering an effective amount of the composition to a subject in need thereof.
  • Another aspect provides a use of the composition for the manufacture of a medicament for preventing or treating neovascular diseases in the retina.
  • One aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal neovascular disease, comprising vascular endothelial cells overexpressing Tie2 as an active ingredient.
  • Tie2 (Tyrosine Kinase Receptor 2) refers to Tyrosine Kinase Receptor 2, a receptor present on the surface of vascular endothelial cells.
  • the Tie2 regulates signal transduction pathways related to retinal angiogenesis and maintenance of normal blood vessel function, and affects vascular stability and permeability, vascular disorders related to angiogenesis and inflammation, etc. Deficiency or dysfunction of Tie2 can cause problems related to vascular instability, abnormal vascular proliferation, blood coagulation, etc., and overexpression of Tie2 can improve vascular stability and suppress abnormal angiogenesis.
  • endothelial cells may refer to cells that form a layer covering the inside of a blood vessel as one of the components of the blood vessel wall.
  • the vascular endothelial cells exist in various types of blood vessels such as veins, arteries, and lymphatic vessels, and are responsible for functions such as material exchange between blood and tissue, blood coagulation regulation, and vascular permeability regulation, and may also be involved in angiogenesis and tissue regeneration.
  • the endothelial cells may be genetically engineered to overexpress Tie2.
  • the genetically engineered endothelial cells may comprise a recombinant vector into which a gene encoding Tie2 has been introduced.
  • overexpression or increased expression herein may mean a higher level of expression of the same type of protein compared to the endogenous expression of the same protein in a given genetically unmodified parental cell (e.g., wild type).
  • genetic engineering or “genetically engineered” as used herein may refer to the act of introducing one or more genetic modifications into a cell.
  • the genetically engineered endothelial cells may comprise a recombinant vector into which an exogenous gene encoding Tie2 has been introduced.
  • vascular endothelial cells overexpressing Tie2 can be produced using a viral vector into which an exogenous gene encoding Tie2 has been introduced.
  • the exogenous gene may be expressed in an amount sufficient to increase the activity of Tie2 in the vascular endothelial cells or host cells compared to the parent cell.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell via an expression vector.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell in the form of a linear polynucleotide.
  • the exogenous gene may be expressed from an expression vector (e.g., a plasmid) within the cell.
  • the exogenous gene may be expressed by being inserted into a genetic material (e.g., a chromosome) within the cell for stable expression.
  • the exogenous gene may be appropriately regulated by an exogenous promoter operably linked to the gene.
  • the enhanced expression amount of the polynucleotide may be due to modification by substitution or mutation of an expression control sequence, introduction of a mutation in the polynucleotide sequence itself, replacement of an initiation codon, increase in the copy number by insertion into a chromosome or introduction via a vector, or a combination thereof.
  • vector may refer to a polynucleotide product containing a regulatory sequence and base sequence of a gene so as to express a target gene in a suitable host cell. Or, it may refer to a polynucleotide product containing a base sequence capable of homologous recombination so as to change a regulatory sequence of an endogenous gene in the genome of the host when introduced into the host cell, or to insert a target gene capable of expression into a specific site in the genome.
  • the vector may further include a selection marker to confirm whether it has been introduced into the host or inserted into a chromosome.
  • the selection marker may be a marker that confers a selectable phenotype such as drug resistance, nutritional requirement, cytotoxic agent resistance, or expression of a surface protein. In an environment treated with a selection agent, only cells expressing the selection marker survive or exhibit other phenotypic traits, so that transformed cells can be selected.
  • the above vector may include a plasmid vector, a lentiviral vector, a cosmid vector, and a viral vector such as a bacteriophage vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector, and an adeno-associated virus vector.
  • the vector that can be used as the above recombinant vector can be produced by manipulating a plasmid (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX series, pET series, and pUC19, etc.), a phage (e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, and M13, etc.) or a virus (e.g., SV40, etc.) that is often used in the art.
  • a plasmid e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79,
  • the above recombinant vector can be constructed as a vector for cloning or a vector for expression.
  • the expression vector can be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the above recombinant vector can be constructed by various methods known in the art.
  • the vascular endothelial cells may be any one selected from the group consisting of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), human induced pluripotent stem cell differentiated endothelial cells (iPSC differentiated endothelial cells), retinal endothelial cells, mesenchymal stem cell differentiated endothelial cells, and vascular progenitor cell differentiated endothelial cells, but are not limited thereto.
  • HUVECs human umbilical vein endothelial cells
  • iPSC differentiated endothelial cells induced pluripotent stem cell differentiated endothelial cells
  • retinal endothelial cells vascular endothelial cells
  • mesenchymal stem cell differentiated endothelial cells vascular progenitor cell differentiated endothelial cells
  • active ingredient may mean a cell population or composition that is effective in alleviating, inhibiting the progression of, or preventing a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof.
  • treatment refers to or includes the alleviation, inhibition of progression, or prevention of a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof.
  • prevention means any action that inhibits or delays the progression of an eye disease by administering a composition according to the present invention.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal neovascular disease comprising vascular endothelial cells overexpressing Tie2 as an active ingredient may be a pharmaceutical composition further comprising cells expressing Ang1.
  • angiopoietin-1 used herein is a ligand of the Tie-2 receptor that specifically exists in vascular endothelial cells, and acts as a major regulator that maintains the stability of blood vessels by causing cells surrounding vascular endothelial cells to migrate toward the endothelial cells to form blood vessels and maintaining the barrier function of vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial growth factor When vascular endothelial growth factor is overexpressed or in an inflammatory state, vascular endothelial cells are activated and vascular permeability increases, and Ang1 promotes the junctional integrity of vascular endothelial cells, thereby inducing stabilization of vascular endothelial cells and reducing vascular permeability.
  • the Ang1-expressing cell may be genetically engineered to express or overexpress Ang1. More specifically, the genetically engineered Ang1-expressing cell may comprise a recombinant vector into which a gene encoding Ang1 has been introduced.
  • the cell expressing Ang1 may be any one selected from the group consisting of pericytes, mesenchymal stem cells (MSCs), endothelial cells (ECs), fibroblasts, retinal pigment epithelium (RPE), photoreceptors, horizontal cells, Muller cells, amacrine cells, astrocytes, etc., but is not limited thereto.
  • mesenchymal stem cells may refer to stem cells existing in cartilage, bone tissue, adipose tissue, and the stroma of bone marrow, differentiated from the mesoderm formed by the division of a fertilized egg, and may include mesenchymal stem cells of animals including mammals, for example, humans.
  • Mesenchymal stem cells maintain stemness and self-renewal and have the ability to differentiate into various cells, including chondrocytes, osteoblasts, muscle cells, and adipocytes, and can be extracted from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, synovial membrane, trabecular bone, muscle, infrapatellar fat pad, and the like.
  • Mesenchymal stem cells have immunomodulatory abilities that suppress the activity and proliferation of T lymphocytes and B lymphocytes, inhibit the activity of natural killer cells (NK cells), and regulate the functions of dendritic cells and macrophages, making them cells that can be used for allotransplantation and xenotransplantation.
  • NK cells natural killer cells
  • isolated cell e.g., "isolated mesenchymal stem cell” or "derived cell”, e.g., “derived mesenchymal stem cell”, as used herein, means a cell that is substantially separated from the tissue from which the cell originates, e.g., umbilical cord blood.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from any one selected from the group consisting of, but not limited to, umbilical cord, cord blood, placenta, bone marrow, adipose tissue, muscle, amniotic fluid, amniotic membrane, and dental pulp.
  • the above umbilical cord can mean a cord that connects the mother and the abdomen so that the fetus of a mammal can grow in the placenta, and it can mean a tissue that is generally composed of three blood vessels, namely two umbilical arteries and one umbilical vein, surrounded by Wharton's jelly, and is also properly called that.
  • the above umbilical cord blood may refer to blood collected from the umbilical vein connecting the placenta and the fetus of a mammal.
  • the above umbilical cord blood can be easily collected from the umbilical vein of a donor at the time of birth. Specifically, in the case of normal vaginal delivery, it can be collected from the umbilical vein that has been expelled while the placenta is still in the uterus after birth, and in the case of cesarean section, it can be collected from the umbilical vein that has been expelled while the placenta has also been expelled outside the uterus after birth.
  • the cells expressing Ang1 may exhibit reduced immunogenicity.
  • immunogenicity in this specification refers to the degree and nature of the immune system's response to an antigen that has entered from the outside. It refers to the ability of an antigen to be recognized by the immune system and to induce an antigen-antibody reaction or a cell-based immune response. An antigen with high immunogenicity is more likely to induce a strong response from the immune system, and an antigen with low immunogenicity is not detected or is weakly recognized by the immune system, and does not induce a strong response from the immune system.
  • reduced immunogenicity or “hypoimmunogenicity” as used herein means a case where, when measured before and after administration of a cell therapy agent, changes in white blood cell counts, changes in the ratio of lymphocyte counts (e.g., CD4, CD8, etc.), changes in cytokines (e.g., IL- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ , etc.) secreted by reacting the cell therapy agent with the patient's immune cells, a case where the white blood cell count is reduced, the CD4/CD8 ratio is reduced, or the secretion of inflammatory cytokines such as IL- ⁇ , IL-2, and TNF- ⁇ is reduced.
  • lymphocyte counts e.g., CD4, CD8, etc.
  • cytokines e.g., IL- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ , etc.
  • the cells expressing Ang1 and the vascular endothelial cells overexpressing Tie2 may be co-cultured, but are not limited thereto.
  • the ratio of the cells expressing Ang1 to the Tie2-overexpressing endothelial cells may be 1:0.1 to 1:10.
  • the cell number ratio may be 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:2.1, 1:3.1, 1:4.1, 1:5.1, 1:6.1, 1:7.1, 1:8.1, 1:9.1, 1:10.
  • the ratio of the cells expressing Ang1 to the Tie2-overexpressing endothelial cells may be 1:0.5 to 1:3.
  • it can be 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2.0, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3.0.
  • intraretinal neovascular disease refers to a disease in which blood vessels in the retina grow abnormally or are deformed.
  • the intraretinal neovascular disease can cause symptoms such as decreased visual acuity, loss of central vision, and leakage of blood vessels along the retina.
  • the neovascularization refers to the process in which new blood vessels are formed from existing blood vessels.
  • the intraretinal neovascular disease is Retinal Pigment Epithelial Dystrophy, Choroidal Neovascularization, Choroidal Vascular Expansion, Choroidal Vascular Occlusion, Choroidal Neovascular Membrane, Choroidal Vascular Occlusive Disease, Choroidal Hemorrhage, Choroidal Effusion, Proliferative Diabetic Retinopathy (PDR), Macular Telangiectasia, Age-related Macular Degeneration (AMD), Hypertensive Retinopathy It may be any one selected from the group consisting of, but is not limited to, hypertensive retinopathy, diabetic retinopathy, dry macular degeneration (Dry AMD), and wet macular degeneration (Wet AMD).
  • Dry AMD dry macular degeneration
  • Wet AMD wet macular degeneration
  • angiogenic factor may mean a growth factor that promotes the development of blood vessels, angiogenesis, endothelial cell growth, vascular stability, and/or vasculogenesis.
  • Vascular Endothelial Growth Factor VEGF
  • PlGF Placental Growth Factor
  • PDGF Platelet-Derived Growth Factor
  • FGF fibroblast growth factor family
  • TIE ligands angiopoietins
  • ephrins Developmental Endothelial Locus-1 (Del-1)
  • fibroblast growth factors acidic (aFGF) and alkaline (bFGF)
  • horristatin granulocyte colony-stimulating factor
  • G-CSF hepatocyte growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SF interleukin-8
  • leptin leptin, midkine, placental growth factor, platelet-derived endothelial cell growth factor
  • kits for preventing or treating intraretinal neovascular disease comprising the composition.
  • vascular endothelial cells overexpressing Tie2 “cells expressing Ang1”, “intraretinal neovascular disease”, etc. are as described above.
  • Another aspect provides a method of treating angiogenic diseases in the retina, comprising administering to a subject in need thereof a composition comprising, as an active ingredient, vascular endothelial cells overexpressing an effective amount of Tie2 (Tyrosine Kinase Receptor 2).
  • composition contains pharmaceutically suitable and pharmaceutically acceptable carriers, excipients and vehicles.
  • carriers are aqueous or alcoholic/aqueous solutions, emulsions or suspensions, and specifically include saline and buffered media such as phosphate buffered saline (PBS).
  • Parenteral vehicles may include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's or fixed oils.
  • excipients such as preservatives and other additives may be provided, examples of which include antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents and inert gases.
  • Suitable pharmaceutical preparations, carriers, other excipients and methods of preparing pharmaceutical compositions are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, 14th Ed., Mack Publishing Co., 1970, especially Part VIII, "Pharmaceutical Preparation and Their Manufacture", pages 1461-1762.
  • administering may refer to placement of a composition according to one embodiment into a subject by a method or route that results in at least partial localization of the composition to a desired site in accordance with one embodiment.
  • Administration may be by any suitable route that delivers at least a portion of the cells or cellular components of the composition according to one embodiment to a desired location in a viable subject.
  • the survival period of the cells following administration to a subject may be as short as several hours, for example 24 hours to several days to as long as several years.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a patient in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • the above “therapeutically effective amount” or “pharmaceutically effective amount” means an amount of a cell population or composition that is effective in preventing or treating angiogenic neovascular disease in the retina, and is sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and does not cause side effects.
  • the level of the above effective amount may be determined based on factors including the patient's health condition, the type and severity of the disease, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the method of administration, the time of administration, the route of administration and the excretion rate, the duration of treatment, the drugs used in combination or simultaneously, and other factors well known in the medical field.
  • the above pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects by taking all of the above factors into consideration, and this can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the Tie2-overexpressing vascular endothelial cells in the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and the pharmaceutical composition may be administered once or repeatedly.
  • the range is not limited thereto, as it may increase or decrease depending on the route of administration, severity of the disease, sex, weight, age, etc.
  • the composition may further comprise cells expressing Ang1.
  • a pharmaceutical composition comprising vascular endothelial cells overexpressing Tie2 as an active ingredient may be co-administered with a pharmaceutical composition comprising cells expressing Ang1.
  • compositions comprising vascular endothelial cells overexpressing Tie2 (Tyrosine Kinase Receptor 2) as an active ingredient for preventing or treating neovascular diseases in the retina.
  • Tie2 Tie2
  • Another aspect provides the use of Tie2-overexpressing endothelial cells for the manufacture of a medicament for the treatment of neovascular diseases in the retina.
  • endothelial cells overexpressing Tie2 and cells expressing Ang1 can be used together for the manufacture of a medicament for treating neovascular diseases in the retina.
  • vascular endothelial cells overexpressing Tie2 “cells expressing Ang1”, “intraretinal neovascular disease”, etc. are as described above.
  • a pharmaceutical composition containing vascular endothelial cells overexpressing Tie2 according to one aspect as an active ingredient has the effect of preventing or treating retinal neovascular disease by inducing stabilization of vascular endothelial cells and reducing vascular permeability even in a state of overexpression of vascular endothelial growth factor (VEGF) or inflammation, thereby slowing down or inhibiting neovascularization in the retina.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the composition has the effect of reducing invasiveness during treatment, enhancing vascular stability, and enabling early diagnosis and treatment of retinal neovascular disease.
  • Figure 1 shows the vector structure for producing Tie2-overexpressing human umbilical vein endothelial cells (HUVEC_Tie2) and the results of confirming Tie2 gene expression in HUVEC_Tie2:
  • Figure 1a is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV encoding mCherry as a control vector
  • Figure 1b is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV encoding human Tie2 and mCherry
  • Figure 1c is a photograph showing the results of detecting mCherry in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC_Tie2) transfected with the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV under a fluorescence microscope
  • Figure 1d is a diagram showing the correlation between Tie2 gene expression levels in non-transfected HUVEC (control) and Tie2-overexpressing vascular endotheli
  • Figure 2 shows the vector structure for producing Ang1-overexpressing mesenchymal stem cells (MSC_Ang1) and the results of confirming Tie2 gene expression in MSC_Ang1:
  • Figure 2a is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-EGFP-CMV encoding EGFP
  • Figure 2b is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-EGFP-CMV encoding human Angiopoietin-1 and EGFP
  • Figure 2c is a photograph showing the results of detecting GFP by fluorescence microscopy in human mesenchymal stem cells (hMSCs) transfected with the lentiviral vector pLV-EGFP-CMV
  • Figure 2d is a graph showing the results of analyzing the Ang1 gene expression level in non-transfected human mesenchymal stem cells (control) and Ang1-overexpressing human mesenchymal stem cells (hMSC_Ang1) as a relative quantification of GAP
  • Figure 3 is a photograph showing the results of staining vascular cells that moved under the filter with crystal violet.
  • Figure 4 is a graph showing the results of measuring the absorbance at 595 nm using a spectrofluorometer after dissolving the stained cells with acetic acid.
  • Figure 5 is a confocal microscope image of HUVEC cells moving into the RPE layer, divided into the normal group (NC), disease group, cell therapy group #1, and cell therapy group #2.
  • Figure 6 is a photograph showing the results of staining the vascular cells that migrated under the filter with crystal violet after culturing HUVECs for 24 hours at 37°C, adding hMSCs on top of HUVECs, co-culturing for 6 to 8 hours at 37°C, adding VEGF 20 ng/ml, and performing a migration assay after 18 to 20 hours in a 37°C incubator:
  • Figure 6a is a photograph showing the results of a cell mobility evaluation conducted after co-culture of HUVECs that do not overexpress Tie2 (HUVEC-Cont.) and hMSCs that do not overexpress Ang1 (hMSC-Cont.)
  • Figure 6b is a photograph showing the results of a cell mobility evaluation conducted after co-culture of HUVECs that do not overexpress Tie2 (HUVEC-Cont.) and hMSCs that do not overexpress Ang1 (hMSC-Cont.)
  • Figure 6c is a photograph showing the results of a cell mobility evaluation conducted after co-culture of HUVECs that do not overexpress Tie2 (HUVEC_Tie2) and hMSCs that do not overexpress Ang1 (hMSC_Ang1), and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and.
  • Figure 7 is a graph showing the results of measuring the absorbance at 595 nm in a spectrophotometer by dissolving cells stained with crystal violet in acetic acid.
  • Figure 8 is a photograph showing the result of real-time time-lapse imaging of tubular structures after HUVEC cells and hMSC cells were attached to Matrigel at a ratio of 2:1, and images were taken every hour for 3 hours.
  • Figure 9 is a graph showing the area covered by the tube over time.
  • Example 1 Production of Tie2 overexpressing vascular endothelial cells (HUVEC_Tie2)
  • Human umbilical vein endothelial cells were purchased from Life Technologies (Gibco; C-003-5C) and used in the experiments at passage 1–8. Cells were cultured at 37°C in EBM-2 basal medium (Lonza) supplemented with EGM-2 SingleQuot Kit.
  • vascular endothelial cell control human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were transfected with a lentiviral vector encoding mCherry using lentivirus.
  • lentiviral vector encoding mCherry using lentivirus.
  • Tie2-overexpressing vascular endothelial cells (HUVEC_Tie2)
  • human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were transfected using lentivirus, and the expression of the Tie2 gene in the transfected HUVEC was confirmed.
  • the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV was purchased prepackaged into viral particles from VectorBuilder.
  • the structure of the viral vector is shown in Fig. 1a.
  • Figure 1a is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV encoding mCherry.
  • Figure 1b is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV encoding human Tie2 and mCherry.
  • HUVEC cells were seeded at 1x105 cells per well in a 6-well plate. The cells were infected with 1 ml of virus per well at a multiplicity of infection (MOI) of 15, and the medium was replaced with 2 ml after transfection for 24 hours. To evaluate the transfection efficiency, mCherry was detected under a fluorescence microscope, and the results are shown in Fig. 1b.
  • MOI multiplicity of infection
  • Figure 1c is a photograph showing the result of detecting mCherry by fluorescence microscopy in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC_Tie2) transfected with the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV.
  • mCherry was detected in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) transfected using lentivirus, which means that the Tie2 gene was expressed in HUVEC (HUVEC_Tie2) transfected with the lentiviral vector.
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • Tie2 gene expression was observed in Tie2-overexpressing vascular endothelial cells (HUVEC_Tie2) transfected with lentivirus according to Example 1.2. Tie2 gene expression was detected using RT-PCR and FACS analysis.
  • RNA concentration and purity were confirmed by Nanodrop.
  • RT-PCR analysis was performed using the 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems) to detect mRNA expression of Tie2.
  • the primers used were purchased from IDT, and the primer sequences are shown in Table 1.
  • Figure 1d is a graph showing the results of analyzing the level of Tie2 gene expression relative to GAPDH expression in non-transfected HUVEC (control) and Tie2-overexpressing vascular endothelial cells (HUVEC_Tie2) using RT-PCR.
  • Fig. 1d it was confirmed that the amount of Tie2 gene expression was higher in Tie2-overexpressing vascular endothelial cells (HUVEC_Tie2) compared to non-transfected HUVEC (control).
  • Tie2 gene expression in Tie2-overexpressing endothelial cells (HUVEC_Tie2) transfected with lentivirus according to Example 1.2
  • FACS analysis was performed using BD Trucount® Absolute Counting Tube.
  • the Tie2 antibody used for FACS analysis was BD Pharmingen® Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Human Tie2 (CD202b).
  • the efficiency of Tie2 expression in transfected HUVEC is shown in Fig. 1d.
  • FIG. 1e is a drawing showing the results of FACS analysis of HUVEC_NC, HUVEC_Cont., and HUVEC_Tie2.
  • HUVEC_NC refers to a negative control without antibody
  • HUVEC_Cont. refers to a control in which antibody was added to cells that did not overexpress Tie2
  • HUVEC_Tie2 refers to HUVEC in which Tie2 was overexpressed.
  • Tie2 was confirmed to be overexpressed in HUVEC_Tie2 transfected with the lentiviral vector pLV-mCherry-CMV.
  • Example 2 Production of Ang1-expressing mesenchymal stem cells (MSC_Ang1)
  • Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells were obtained from the Stem Cell Center of Seoul Asan Medical Center. hMSCs used in the experiment were passages 5 to 12. The cells were cultured at 37°C using DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin solution.
  • hMSC_Cont. human mesenchymal stem cells (hMSCs) were transfected with a lentiviral vector encoding EGFP using lentivirus.
  • Ang1 Angiopoietin-1-overexpressing mesenchymal stem cells (MSC_Ang1)
  • hMSCs human mesenchymal stem cells (hMSCs) were transfected using lentivirus, and the expression of the Ang1 gene in the transfected hMSCs was confirmed.
  • the lentiviral vector pLV-EGFP-CMV encoding EGFP was purchased from VectorBuilder in a prepackaged state in viral particles.
  • the structure of the viral vector is shown in Fig. 2a.
  • Fig. 2b is a schematic diagram showing the structure of the lentiviral vector pLV-EGFP-CMV encoding human Angiopoietin-1 and EGFP.
  • hMSCs were seeded at 1x105 cells per well in a 6-well plate. 1 ml of virus was infected per well at a multiplicity of infection (MOI) of 10, and the medium was replaced with 2 ml after transfection for 24 hours. To evaluate the transfection efficiency, GFP was detected under a fluorescence microscope, and the results are shown in Fig. 2b.
  • Figure 2c is a photograph showing the results of detecting GFP by fluorescence microscopy in human mesenchymal stem cells (hMSCs) transfected with the lentiviral vector pLV-EGFP-CMV.
  • hMSCs human mesenchymal stem cells
  • hMSCs-Ang1 human mesenchymal stem cells
  • Ang1 gene expression was detected in Ang1-overexpressing human mesenchymal stem cells (hMSC_Ang1) transfected with lentivirus according to Example 2.2.
  • RT-PCR and ELISA analyses were used to detect Ang1 gene expression.
  • Figure 2d is a graph showing the results of analyzing the level of Ang1 gene expression relative to GAPDH expression in non-transfected human mesenchymal stem cells (control) and Ang1-overexpressing human mesenchymal stem cells (hMSC_Ang1) using RT-PCR.
  • Ang1 human mesenchymal stem cells
  • hMSC_control human mesenchymal stem cells
  • Ang1 gene expression was detected through ELISA analysis for Ang1-overexpressing human mesenchymal stem cells (hMSC_Ang1) transfected with lentivirus according to Example 2.1.
  • Ang1-specific ELISA was performed using Quantikine Human Angiopoietin-1 Immunoassay (R&D Systems). Culture samples of hMSC_Ang1 from 6-well plates were collected and analyzed at 2-day intervals for up to 10 days after transfection.
  • Figure 2e is a graph showing the results of ELISA analysis performed at 2-day intervals for up to 10 days after transfection for NC, Lv-cont., and Lv-Ang1.
  • the NC refers to a negative control of hMSCs that were not transfected
  • the Lv-cont. refers to a control transfected with a lentiviral vector that does not contain Ang1
  • the Lv-Ang1 refers to a control transfected with a lentiviral vector that contains Ang1.
  • Ang1 was confirmed to be overexpressed in human mesenchymal stem cells (hMSCs-Ang1) transfected with pLV[Exp]-EGFP:T2A:PuroCMV>hANGPT1.
  • Example 3 Manufacturing of cell therapy using co-culture method of HUVEC and hMSC
  • a cell therapy product was manufactured by co-culturing HUVEC cells and hMSC cells. Co-culture was performed considering the size difference between HUVEC cells and hMSC cells and the difference in the expression of Tie2 and Ang1 expressed in each cell. Specifically, HUVECs were seeded at 3x104 cells/ml in Transwell and cultured in a 37°C incubator for 24 hours. hMSCs were co-cultured on HUVEC cells at 1.5x104 cells/ml (0.5 times the number of HUVECs), and VEGF 20ng/ml was added after culturing for 6 to 8 hours at 37°C. Migration assay was performed 18 to 20 hours after incubation in a 37°C incubator.
  • a Transwell chamber (CorningCostar) containing a 6.5 mm diameter polycarbonate filter with a pore size of 8 ⁇ m was used.
  • HUVECs that did not overexpress Tie2 (HUVEC-Cont.) or HUVECs that overexpressed Tie2 (HUVEC_Tie2) were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells/ml and treated with the culture medium of hMSCs that did not overexpress Ang1 (hMSC-Cont.) or hMSCs that overexpressed Ang1 (hMSC_Ang1) for 24 h. After the culture, 20 ng/ml of VEGF was added and the filter was cultured in an incubator for 24 h.
  • the cells on the filter were wiped off using a cotton swab, and the cells that migrated under the filter were washed with PBS, fixed with methanol for 20 min, and stained with 1% crystal violet for 20 min. After washing with PBS, the migrated cells were observed under a microscope. Cells stained with 1% acetic acid were dissolved and measured for absorbance at 595 nm using a spectrofluorometer, and the measurement results are shown in Figures 3 and 4.
  • Figure 3 is a photograph showing the results of staining vascular cells that moved under the filter with crystal violet. As shown in Figure 3, the amount of vascular cell movement varied depending on whether VEGF was added and the amount added, but it was confirmed that there was no significant difference in the amount of vascular cell movement when VEGF 20 ng/ml and VEGF 40 ng/ml were added.
  • Figure 4 is a graph showing the results of measuring the absorbance at 595 nm using a spectrofluorometer after dissolving the stained cells with acetic acid.
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cells
  • a retinal tissue model was established by culturing retinal pigment epithelial cells (RPE) and vascular endothelial cells (HUVEC) to confirm the migration-reducing effect of Tie2-overexpressing vascular endothelial cells (HUVEC).
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • HAVEC vascular endothelial cells
  • RPE cells were seeded on the bottom surface of the Transwell by fixing the Transwell upside down on a 6-well plate coated with Vitronectin (VTN).
  • VTN Vitronectin
  • RPE cells were seeded in a drop shape on the bottom of the Transwell at 1x105 cells/ml in 100ul of medium and cultured in a 37°C incubator for 2 hours.
  • the Transwell was turned over to the normal position and placed on a 24-well plate containing the medium.
  • HUVECs were seeded on the inner surface of the Transwell at 1x105 cells/ml and cultured for 24 hours.
  • 20ng/ml of VEGF was added and cultured for 24 hours. Images of HUVEC cell migration into the RPE layer were obtained using a confocal microscope.
  • Figure 5 is a confocal microscope photograph of HUVEC cells migrating toward the RPE layer, divided into a normal group (NC), a disease group, cell therapy group #1, and cell therapy group #2.
  • the normal group (NC) is a group that is not treated with VEGF in HUVECs that do not overexpress Tie2
  • the disease group is a group treated with 20 ng/ml of VEGF
  • cell therapy group #1 is a group that is treated with 20 ng/ml of VEGF in HUVECs (HUVEC_Tie2) that overexpress Tie2
  • cell therapy group #2 is a group that is treated with 20 ng/ml of VEGF in MSC Lv-Ang-1 culture medium in HUVECs (HUVEC_Tie2) that overexpress SMS Tie2.
  • Vascular endothelial cells express red fluorescence, and the more red fluorescence is distributed, the more the migration of vascular endothelial cells increases.
  • HUVEC cells were first cultured on one side of a porous transwell capable of cell migration, and then hMSC cells were cultured at 0.5 times the number. HUVEC cells were cultured first to stabilize the tight junction between cells, and then hMSC cells were added at 0.5 times the number of cells and co-cultured on top of the HUVEC cells.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Figure 6 is a photograph showing the results of staining the vascular cells that moved under the filter with crystal violet after culturing HUVECs at 37°C for 24 hours, adding hMSCs on top of HUVECs, co-culturing for 6 to 8 hours at 37°C, adding VEGF 20 ng/ml, and performing a migration assay after 18 to 20 hours in a 37°C incubator:
  • Figure 6a is a photograph showing the results of evaluating cell mobility after co-culturing HUVECs that did not overexpress Tie2 (HUVEC-Cont.) and hMSCs that did not overexpress Ang1 (hMSC-Cont.)
  • Figure 6b is a photograph showing the results of evaluating cell mobility after co-culturing HUVECs that did not overexpress Tie2 (HUVEC-Cont.) and hMSCs that did not overexpress Ang1 (hMSC-Cont.), and adding VEGF.
  • 6c is a photograph showing the results of evaluating cell mobility by co-culturing HUVECs that overexpress Tie2 (HUVEC_Tie2) and hMSCs that overexpress Ang1 (hMSC_Ang1) and then adding VEGF.
  • Figure 7 is a graph showing the results of measuring the absorbance at 595 nm in a spectrofluorometer after dissolving cells stained with crystal violet in acetic acid.
  • endothelial cells (HUVEC) were cultured on gels and capillary-like tube formation assays were performed. Specifically, tube formation assay kits (Abcam) were used for the tube formation assay of HUVEC cells. 50 ⁇ l/well of extracellular matrix solution (ECM) was added to a 96-well plate, and the solution was allowed to solidify at 37°C for 1 hour to form a gel. Then, 2 ⁇ 10 4 cells/100 ⁇ l of HUVEC (HUVEC_Cont.
  • ECM extracellular matrix solution
  • HUVEC_Tie2 HUVEC_Tie2 cells and 1 ⁇ 10 4 cells/100 ⁇ l of hMSC (hMSC-Cont. or hMSC_Ang1) cells were mixed and added to each well, and 20 ng/ml VEGF was added. To allow tube formation of cells, they were cultured at 37°C for 10 h. The formation of vascular-like structures was observed on a Juli Stage Real-Time History Recorder (NanoEnTek). The area covered by the tubes over time was measured using the Image J program, and the results are shown in Figs. 8 and 9.
  • Figure 8 is a photograph showing the result of real-time time-lapse imaging of tubular structures after HUVEC cells and hMSC cells were attached to Matrigel at a ratio of 2:1, and images were taken every hour for 3 hours.
  • Figure 9 is a graph showing the area covered by the tube over time.
  • the normal group As shown in Figures 8 and 9, the normal group (Control) rapidly formed a tube-forming structure in the VEGF environment (disease environment) and it was confirmed that the final tube-forming area decreased.
  • the experimental group (cell therapy group) confirmed that tube formation progressed slowly even in the VEGF environment. This is thought to be due to the slowing down of angiogenesis by the formation of tight junctions by Tie2 of vascular endothelial cells and Ang1 of mesenchymal stem cells. This means that the cell therapy agent of vascular endothelial cells overexpressing Tie2 and mesenchymal stem cells overexpressing Ang1 is effective in inhibiting angiogenesis in the retina by slowing down angiogenesis.

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Abstract

일 양상에 따른 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 과발현 또는 염증상태에서도 혈관내피세포의 안정화를 유도하고 혈관 투과성을 감소시켜 망막 내 혈관 신생을 늦추거나 억제함으로써 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료하는 효과가 있다. 또한 4~8주 간격 안구 내 주사가 필요한 기존 항체 치료법에 비하여 치료시 침습성이 감소하고, 혈관 안정성이 강화되며, 망막 내 혈관신생 질환의 조기 진단 및 치료가 가능한 효과가 있다.

Description

TIE2을 과발현하는 혈관내피세포를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 조성물
Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환은 혈관신생이 주된 원인이다. 특히, 비정상적인 혈관으로부터 기인하는 다양한 안구질환 중 대표적인 예로는 연령관련황반변성, 당뇨망막병증 등이 있다.
연령관련황반변성(age-related macular degeneration)은 노화과정에 동반되어 나타나는 황반의 붕괴 혹은 파괴를 지칭하는 질환명으로서, 50세 이상의 연령층에서 주로 발생한다. 이 질환은 드루젠이라고 불리워지는 작은 노폐물이 축적되면서 황반의 위축이 진행되어 시기능이 소실되는 비삼출성(건성 유형)과 망막 및 맥락막의 저산소증 및 산화스트레스의 축적으로 인하여 발생한 비정상적인 신생 혈관으로부터 삼출물이 새어 나와 황반의 부종이 유발되고 이 과정이 반복되면서 황반부의 시각세포 및 망막색소상피세포층이 영구적으로 변성되어 시력 저하를 일으키는 삼출성(습성 유형)으로 나뉘어진다. 특히, 습성황반변성의 경우는 실명에 이르는 빈도가 높으며, 우리나라에서 유병률이 인구 1만명 당 37명에 달하는 것으로 추산되고 있다. 황반변성의 원인에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나 위험인자로 알려져 있는 것은 나이이며, 그 외 주목받는 환경적 요인으로는 흡연, 고혈압, 비만, 유전적 소인, 과도한 자외선 노출, 낮은 혈중 항산화제 농도 등이 있다. 현재, 습성황반변성에 대한 치료법으로는 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 대한 항체주사 치료가 주를 이루고 있으며, 기타 레이저 광응고술, 광역학요법 및 초자체 절제술 등의 치료법이 알려져 있으나, 아직까지 완전한 치료법은 존재하지 않는 실정이다.
안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang1)은 Tie2의 작용물질(agonist)로서, 혈관내피세포에 존재하는 수용체 Tie2의 길항적인 리간드(antagonistic ligand) 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2; Ang2)와 Tie2 결합에 대해 경쟁한다. Tie2 수용체를 활성화 시키는 리간드인 Ang1은 혈관내피세포의 장벽기능(barrier function)을 유지시킴으로써 혈관의 안정성을 유지하는 주요한 조절자로 작용한다. 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 과발현 또는 염증상태에서는 혈관내피세포가 활성화되며, 혈관 투과성이 증가되는데, Ang1은 혈관내피세포의 접합부통합(junctional integrity)을 촉진함으로써 혈관내피세포의 안정화를 유도하고 혈관 투과성을 감소시킨다.
연령관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD) 중 하나인 습성황반변성(wet AMD)에 대한 치료법으로는 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)에 대한 항체주사 치료법(Anti-VEGF therapy), Ang2에 특이적으로 결합하고, Ang2와 함께 Tie2 수용체에 결합하는 항 Ang2 항체를 이용한 치료법, Tie2 수용체에 직접 결합하여 인산화 및 활성화를 유도하는 재조합 단백질이나 항체들을 이용한 치료법(Anti-Ang-2 therapy) 등을 이용되고 있다.
그러나, 혈관내피세포성장인자(VEGF)에 대한 항체주사 치료법(Anti-VEGF therapy)이나 항 Ang2 항체를 이용한 치료법(Anti-Ang-2 therapy) 등은 4 내지 8 주 간격으로 안구 내 주사를 해야하는 불편이 있다. 또한 짧은 주기의 안구 내 주사는 안구통증, 안구출혈 또는 혈관 파열, 안구염증 또는 감염, 시력변화 및 안구 내 압력 변화 등의 부작용을 일으킬 수 있어 환자에게 큰 부담이 된다. 이에 한 번의 안구 내 주사로 효과가 오래 지속 될 수 있는 Tie2의 발현이 증가된 혈관내피세포와 Ang1 생성기능이 향상된 세포를 이용한 망막혈관신생 억제용 세포치료제의 개발이 시급한 실정이다.
일 양상은 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 조성물의 망막 내 혈관신생 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 의약 제조에 사용하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
일 양상은 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)"는 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 수용체인 티로신 키나제 수용체 2(Tyrosine Kinase Receptor 2)를 의미한다. 상기 Tie2는 망막 혈관 신생 및 혈관의 정상적인 기능 유지에 관련된 신호 전달 경로를 조절하고, 혈관의 안정성과 투과성, 혈관 신생 및 염증과 관련된 혈관 장애 등에 영향을 준다. Tie2의 결핍 또는 기능 이상은 혈관의 불안정성, 비정상적인 혈관 증식, 혈액 응고 등과 관련된 문제를 초래할 수 있고, Tie2의 과발현은 혈관 안정성을 향상시키고 비정상적인 혈관 신생을 억제할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "혈관내피세포 (Endothelial cells; EC) "는 혈관벽의 구성 요소 중 하나로서 혈관 내부를 덮고 있는 층을 이루는 세포를 의미할 수 있다. 상기 혈관내피세포는 맥락이나 동맥, 림프관 등 다양한 혈관 유형에 존재하며, 혈액과 조직 사이의 물질 교환, 혈액 응고 조절, 혈관 투과성 조절 등의 기능을 담당하고, 혈관 신생과 조직 재생에도 관여하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 혈관내피세포는 Tie2을 과발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 혈관내피세포는 Tie2를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 벡터를 포함하는 것 일 수 있다.
본 명세서의 용어, 과발현(overexpression) 또는 발현(expression) 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예를 들어, 야생형)가 갖는 내재적 단백질의 발현과 비교하여, 동일한 타입의 단백질의 발현이 보다 더 높은 수준을 갖는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서의 용어, "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위를 의미할 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 혈관내피세포는 Tie2를 암호화하는 외인성 유전자(exogenous gene)가 도입된 재조합 벡터를 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, Tie2를 암호화하는 외인성 유전자가 도입된 바이러스 벡터를 이용하여 Tie2를 과발현하는 혈관내피세포를 제조할 수 있다.
상기 외인성 유전자(exogenous gene)는, 상기 혈관내피세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 Tie2의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질(예를 들어, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 유전자에 작동 가능하게 연결된 외인성 프로모터에 의해 적절히 조절되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현량 강화는 발현 조절 서열의 치환 또는 돌연변이에 의한 변형, 폴리뉴클레오티드 서열 자체의 변이 도입, 개시 코돈의 교체, 염색체에 삽입하는 것 또는 벡터를 통해 도입하는 것에 의한 카피수 증가, 또는 이의 조합에 의한 것일 수 있다.
본 명세서의 용어, "벡터"는 적합한 숙주 세포 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전자의 조절 서열과 염기서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미할 수 있다. 혹은 숙주 세포 내로 도입시켜 숙주의 게놈상의 내생적(endogenous) 유전자의 조절 서열을 바꾸거나, 게놈상의 특정 부위에 발현 가능한 목적 유전자를 삽입할 수 있도록 상동 재조합이 가능한 염기서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미할 수 있다. 상기 벡터는 숙주 내로의 도입 혹은 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 의한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능한 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 렌티바이러스 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λ△z1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 혈관내피세포(EC)는 인간탯줄정맥내피세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell; HUVEC), 인간 유도만능 줄기세포 분화 내피세포(iPSC differentiated endothelial cell), 망막내피세포(retinal endothelial cell), 중간엽줄기세포에서 분화된 내피세포(Mesenchymal stem cell differentiated endothelial cell), 혈관전구세포 분화 내피세포(Vascular progenitor cell differentiated endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어, "유효성분"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 유효한 세포 집단 또는 조성물을 의미할 수 있다.
본 명세서의 용어, "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함한다.
본 명세서의 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 안 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 Ang1을 발현하는 세포를 더 포함하는 약학적 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang1)"은 혈관 내피세포에 특이하게 존재하는 Tie-2 수용체의 리간드로서, 혈관 내피세포 주위의 세포들을 내피세포 쪽으로 이동시켜 혈관을 형성하게 하고 혈관내피세포의 장벽기능(barrier function)을 유지시킴으로써 혈관의 안정성을 유지하는 주요한 조절자로 작용한다. 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor)의 과발현 또는 염증상태에서는 혈관내피세포가 활성화되며, 혈관 투과성이 증가되는데 Ang1은 혈관내피세포의 접합부통합(junctional integrity)을 촉진함으로써 혈관내피세포의 안정화를 유도하고 혈관 투과성을 감소시키는 기능을 한다.
일 구체예에 있어서, 상기 Ang1을 발현하는 세포는 Ang1을 발현하거나 과발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 유전적으로 조작된 Ang1을 발현하는 세포는 Ang1를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 벡터를 포함하는 것일 수 있다.
상기 "과발현(overexpression)", "유전적으로 조작된(genetically engineered)", "재조합 벡터" 등은 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 Ang1을 발현하는 세포는 혈관주변세포(pericyte), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC), 내피세포(Endothelial cell, EC), 섬유아세포(fibroblast), 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelium, RPE), 광수용체(photoreceptor), 수평세포(horizontal cell), 뮐러세포(Muller cell), 무축삭 세포(amacrine cell), 별상세포(astrocytes) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem cells, MSCs)"는 수정란이 분열하여 생긴 중배엽에서 분화된 연골, 골조직, 지방조직, 골수의 기질(stroma) 등에 존재하는 줄기세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 줄기세포능(stemness)과 자기재생능(self-renewal)을 유지하고 연골세포, 조골세포, 근육세포, 지방세포를 포함한 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지며, 골수(bone marrow), 지방조직(adipose tissue), 재대혈(umbilical cord blood), 활막(synovial membrane), 골조직(trabecular bone), 근육, 슬개건하 지방(infrapatellar fat pad) 등에서 추출할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 T 림프구, B 림프구의 활성, 증식을 억제하며, 자연 살해 세포(natural killer cell, NK cell)의 활성을 억제하고, 수지상세포(dendritic cell)와 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 면역조절 능력을 가지고 있으므로 동종이식(allotransplantation)과 이종이식(xenotransplantation)이 가능한 세포이다.
본 명세서의 용어 "분리된 세포", 예를 들어, "분리된 중간엽 줄기세포" 또는 "유래된 세포", 예를 들어, "유래된 중간엽 줄기세포"등은 세포가 기원하는 조직, 예를 들어, 제대혈로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포(MSC)는 탯줄, 제대혈, 태반, 골수, 지방조직, 근육, 양수, 양막 및 치수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탯줄(umbilical cord)은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있으며, 제대로 불리기도 한다.
상기 제대혈은 포유 동물의 태반과 태아를 연결하는 탯줄정맥으로부터 채취된 혈액을 의미할 수 있다. 상기 제대혈은 출산시 공여자의 탯줄정맥으로부터 용이하게 채취할 수 있다. 구체적으로, 정상 질식 분만의 경우에는 출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 채취할 수 있으며, 제왕 절개의 경우에는 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에서 제대정맥으로부터 채취할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Ang1을 발현하는 세포는 감소된 면역원성을 나타내는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "면역원성(immunogenicity)"은 외부로부터 들어온 항원(antigen)에 대해 면역체계가 반응하는 정도와 성질을 의미한다. 항원이 면역체계에 의해 인식되고 항원-항체 반응이나 세포 기반의 면역반응을 유발할 수 있는 능력을 의미하며, 면역원성이 높은 항원은 면역체계에서 강력한 반응을 유도할 가능성이 높아지고, 면역원성이 낮은 항원은 면역체계에 의해 감지되지 않거나 약하게 인식되어 면역체계에 의한 강력한 반응이 발생하지 않는다.
본 명세서의 용어, "감소된 면역원성" 또는 "저면역원성 (hypoimmunogenic)은 세포치료제 투여 전후, 백혈구 수 변화, 림프구 수 비율 변화(예, CD4, CD8 등), 환자의 면역세포에 세포치료제를 반응시켜 분비되는 사이토카인(예, IL-γ, IL-2, TNF-α 등) 변화 등을 측정한 결과, 백혈구 수가 감소하거나, CD4/CD8 비율이 감소, 염증성 사이토카인인 IL-γ, IL-2, TNF-α 등의 분비가 감소하는 경우를 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 Ang1을 발현하는 세포와 상기 Tie2 과발현 혈관내피세포는 공배양시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 Ang1을 발현하는 세포와 상기 Tie2 과발현 혈관내피세포의 비율은 1:0.1 내지 1:10인 것일 수 있다. 예를 들어, 1:0.1, 1:0.2, 1:0.3, 1:0.4, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:2.1, 1:3.1, 1:4.1, 1:5.1, 1:6.1, 1:7.1, 1:8.1, 1:9.1, 1:10의 세포 수 비율일 수 있다. 바람직하게는 상기 Ang1을 발현하는 세포와 상기 Tie2 과발현 혈관내피세포의 비율은 1:0.5 내지 1:3 일 수 있다. 예를 들어, 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1.0, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2.0, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3.0 일 수 있다.
본 명세서의 용어, "망막 내 혈관신생 질환"은 망막의 혈관이 비정상적으로 성장하거나 변형되는 질환을 의미한다. 상기 망막 내 혈관신생 질환은 시력 저하, 중앙 시력 손실, 왜관을 따라 오는 혈관의 누출 등의 증상을 일으킬 수 있다. 상기 혈관 신생이란, 새로운 혈관이 기존의 혈관으로부터 생기는 과정을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 망막 내 혈관신생 질환은 망막색소변성증 (Retinal Pigment Epithelial Dystrophy), 망막색소상피하 피질하 봉막증 (Choroidal Neovascularization), 망막색소상피하혈관확장증 (Choroidal Vascular Expansion), 망막색소상피하혈관문신증 (Choroidal Vascular Occlusion), 망막색소상피하 신생혈관증 (Choroidal Neovascular Membrane), 망막색소상피하혈관폐쇄증 (Choroidal Vascular Occlusive Disease), 망막색소상피하 출혈증 (Choroidal Hemorrhage), 망막색소상피하이완증 (Choroidal Effusion) 색소성 망막병증 (Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR), 황반의 결막병증 (Macular Telangiectasia), 연령 관련성 황반변성 (Age-related Macular Degeneration, AMD), 고혈압성 망막병증 (Hypertensive Retinopathy), 당뇨성 망막병증 (Diabetic Retinopathy), 건성 황반변성 (Dry AMD), 습식 황반변성 (Wet AMD)등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어, "혈관신생인자"란, 혈관의 발생, 혈관 신생, 내피세포 성장, 혈관의 안정성, 및/또는 맥관 형성 등을 촉진하는 성장 인자를 의미할 수 있다. 예를 들어, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 및 VEGF 패밀리 멤버, PlGF(Placental Growth Factor), PDGF(Platelet-Derived Growth Factor) 패밀리, 섬유아세포 성장 인자 패밀리(FGF), TIE 리간드(앤지오포에틴), 에프린(ephrin), Del-1(Developmental Endothelial Locus-1), 섬유아세포 성장 인자(산성(aFGF) 및 알칼리성(bFGF)), 호리스타틴, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 간세포 성장 인자(HGF)/산란 인자(SF), 인터류킨-8(IL-8), 렙틴, 미드카인 (midkine), 태반 성장 인자, 혈소판 유래 내 가죽 세포 성장 인자(PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 프레이오토로핀(PTN), 프로그라뉴린, 프로리페린, 형질전환 성장 인자 성장 인자-알파(TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 종양괴사 인자-알파(TNF-알파), 혈관내가죽 성장 인자(VEGF)/혈관 투과 인자(VPF) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는, 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 "Tie2를 과발현하는 혈관내피세포", "Ang1을 발현하는 세포", "망막 내 혈관신생 질환" 등은 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은 유효량의 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)를 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 조성물은 약물학적으로 적당하고 약학적으로 허용성인 담체, 부형제 및 비히클을 함유한다. 일반적으로, 이러한 담체에는 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 있고, 구체적으로 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 식염수 및 완충 매질이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 락트산첨가 링거 또는 고정유가 포함될 수 있다. 또한, 방부제 및 다른 첨가물과 같은 부형제가 제공될 수도 있으며, 그 예에는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등이 있다. 적당한 조제 보조제, 담체, 다른 부형제 및 약제학적 조성물의 조제 방법에 대해서는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 14th Ed., Mack Publishing Co., 1970, 특히 Part VIII, "Pharmaceutical Preparation and Their Manufacture", pages 1461-1762]에 개시되어 있다.
본 명세서의 용어, "투여하는" "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구현예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구현예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구현예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.
상기 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 망막 내 혈관 신생 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 세포 집단 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물에서 상기 Tie2 과발현 혈관내피세포의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 상기 약학적 조성물을 단회 혹은 반복하여 투여할 수 있다. 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로, 범위는 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 Ang1을 발현하는 세포를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 상기 Ang1을 발현하는 세포를 포함하는 약학적 조성물과 병용투여 될 수 있다.
또 다른 양상은 망막 내 혈관신생 질환을 예방 또는 치료하기 위한 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 망막 내 혈관신생 질환 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, Tie2을 과발현하는 혈관내피세포와 Ang1을 발현하는 세포를 함께 망막 내 혈관신생 질환 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 용도로 사용할 수 있다.
상기 "Tie2를 과발현하는 혈관내피세포", "Ang1을 발현하는 세포", "망막 내 혈관신생 질환" 등은 전술한 바와 같다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)의 과발현 또는 염증상태에서도 혈관내피세포의 안정화를 유도하고 혈관 투과성을 감소시켜 망막 내 혈관 신생을 늦추거나 억제함으로써 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료하는 효과가 있다. 또한 4~8주 간격 안구 내 주사가 필요한 기존 항체 치료법에 비하여 치료시 침습성이 감소하고, 혈관 안정성이 강화되며, 망막 내 혈관신생 질환의 조기 진단 및 치료가 가능한 효과가 있다.
도 1은 Tie2 과발현 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC_Tie2)의 제조를 위한 벡터 구조 및 HUVEC_Tie2에서 Tie2 유전자 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다: 도 1a는 control vector로서 mCherry가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-mCherry-CMV의 구조를 나타낸 모식도이며, 도 1b는 human Tie2와 mCherry가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-mCherry-CMV의 구조를 나타낸 모식도이고, 도 1c은 lentiviral vector pLV-mCherry-CMV로 형질 감염시킨 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC_Tie2)에서 형광 현미경으로 mCherry를 검출한 결과를 나타낸 사진이며, 도 1d는 RT-PCR을 통해 형질감염시키지 않은 HUVEC(control)과 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)에서 Tie2 유전자 발현량을 GAPDH발현에 대한 상대정량으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 1e는 HUVEC_NC와 HUVEC_Cont. 및 HUVEC_Tie2의 FACS 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 2은 Ang1 과발현 중간엽 줄기세포(MSC_Ang1)의 제조를 위한 벡터 구조 및 MSC_Ang1에서 Tie2 유전자 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다: 도 2a는 EGFP가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-EGFP-CMV의 구조를 나타낸 모식도이며, 도 2b는 human Angiopoietin-1와 EGFP가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-EGFP-CMV의 구조를 나타낸 모식도이고, 도 2c는 lentiviral vector pLV-EGFP-CMV로 형질감염시킨 인간 중간엽 줄기세포 (hMSCs)에서 형광 현미경으로 GFP를 검출한 결과를 나타낸 사진이며, 도 2d는 RT-PCR을 통해 형질감염시키지 않은 인간 중간엽 줄기세포(control)과 Ang1 과발현 인간 중간엽 줄기세포(hMSC_Ang1)에서 Ang1 유전자 발현량을 GAPDH발현에 대한 상대정량으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 2e은 NC, Lv-cont. 및 Lv-Ang1에 대해 형질감염 후 최대 10일 동안 2일 간격으로 ELISA분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 필터 아래로 이동한 혈관세포를 crystal violet으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 염색된 세포들을 acetic acid로 녹여 Spectrofluorometer에서 595nm 흡광도로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 정상군(NC), 질환군, 세포치료군#1, 세포치료군#2로 나누어 HUVEC세포가 RPE층으로 이동하는 이미지를 공초점 현미경으로 찍은 사진이다.
도 6은 HUVEC을 37℃에서 24시간 배양 후 hMSC를 HUVEC 위에 넣고 37°C에서 6~8시간 공배양 후 VEGF 20ng/ml를 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 18~20시간 후에 migration assay를 수행하여 필터 아래로 이동한 혈관세포를 crystal violet으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다:
도 6a은 Tie2를 과발현 시키지 않은 HUVEC(HUVEC-Cont.)과 Ang1을 과발현시키지 않은 hMSC(hMSC-Cont.)을 공배양시킨 후 세포이동성평가를 실시한 결과 사진이고, 도 6b는 Tie2를 과발현 시키지 않은 HUVEC(HUVEC-Cont.)과 Ang1을 과발현시키지 않은 hMSC(hMSC-Cont.)을 공배양시킨 후, VEGF를 배양액에 첨가하여 세포 이동성평가를 실시한 결과 사진이며, 도 6c는 Tie2를 과발현 시킨HUVEC(HUVEC_Tie2)과 Ang1을 과발현시킨 hMSC(hMSC_Ang1)을 공배양시킨 후, VEGF를 배양액에 첨가하여 세포 이동성평가를 실시한 결과 사진이다.
도 7은 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색된 세포들을 acetic acid 로 녹여 분광광도계(spectrophotometer)에서 595nm 흡광도로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 HUVEC세포와 hMSC 세포를 2:1비율로 Matrigel위에 세포 부착 후 관형 구조의 이미지를 실시간 time lapse 이미징으로 3시간 동안 매 1시간 간격 촬영한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9은 시간에 따라 튜브로 덮인 면적을 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2) 제조
1.1 세포 배양(cell culture)
인간탯줄정맥내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)는 Life Technologies(Gibco; C-003-5C)에서 구입했으며 계대 1~8 사이의 세포로 실험에 사용하였다. 세포는 EGM-2 SingleQuot Kit가 보충된 EBM-2 기초 배지(Lonza)에서 37°에서 배양하였다.
1.2 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)의 제조
혈관내피세포 control(HUVEC_Cont.)를 제조하기 위해, 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC)에 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용하여 mCherry가 encoding되어있는 lentiviral vector를 형질감염시켰다. 또한, Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2) 제조하기 위해, 인간탯줄정맥내피 세포(HUVEC)에 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용하여 형질감염시키고, 상기 형질감염시킨 HUVEC에 Tie2 유전자 발현 여부를 확인하였다.
구체적으로, lentiviral vector pLV-mCherry-CMV는 VectorBuilder에서 바이러스입자에 사전 포장된 상태로 구입했다. 상기 바이러스 벡터의 구조는 도 1a에 나타내었다.
도 1a는 mCherry가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-mCherry-CMV의 구조를 나타낸 모식도이다. 또한, 도 1b는 human Tie2와 mCherry가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-mCherry-CMV의 구조를 나타낸 모식도이다.
6well plate에 HUVEC 세포를 well당 1x105cells를 seeding하였다. well당 1ml에 바이러스를 multiplicity of infection (MOI) 15으로 감염시키고 24시간동안 형질 감염시킨 후에 배지를 2ml로 교체하였다. 형질감염 효율을 평가하기 위해 형광 현미경으로 mCherry를 검출하였고, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
도 1c은 lentiviral vector pLV-mCherry-CMV로 형질감염시킨 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC_Tie2)에서 형광 현미경으로 mCherry를 검출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용하여 형질감염시킨 인간탯줄정맥 내피 세포(HUVEC)에서 mCherry가 검출됨을 확인하였고, 이는 상기 lentiviral vector로 형질감염시킨 HUVEC(HUVEC_Tie2)에서 Tie2 유전자가 발현됨을 의미한다.
1.3 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)의 Tie2 유전자 발현 확인
실시예 1.2에 따라 렌티바이러스(Lentivirus)로 형질감염시킨 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)에서 Tie2 유전자 발현 여부를 확인하기 위해, RT-PCR과 FACS분석을 사용하여 Tie2 유전자 발현을 검출하였다.
구체적으로, RT-PCR를 위해 제조업체의 지침에 따라 Total RNA Isolation Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 배양된 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA농도 및 순도는 Nanodrop으로 확인하였다. Tie2의 mRNA발현을 검출하기 위해 RT-PCR분석은 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었다. 사용된 primer는 IDT에서 구입하였고, primer 염기서열은 표 1에 나타내었다.
서열 서열번호
Primer1(Tie2) 5'-GAGGCAATCAGGATACGAACC-3' 1
Primer2(Tie2) 5'-TCTCCCTTGTCCACAGTCAT-3' 2
각 샘플을 GAPDH발현에 대한 상대정량으로 분석하였고, 그 결과를 도 1c에 나타내었다.
도 1d는 RT-PCR을 통해 형질감염시키지 않은 HUVEC(control)과 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)에서 Tie2 유전자 발현량을 GAPDH발현에 대한 상대정량으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d에 나타낸 바와 같이, Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)에서 형질감염시키지 않은 HUVEC(control)에 비하여 Tie2 유전자 발현량이 많은 것을 확인하였다.
한편, 실시예 1.2에 따라 렌티바이러스(Lentivirus)로 형질감염시킨 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)에서 Tie2 유전자 발현 효율을 평가하기 위해 BD Trucount쪠 Absolute Counting Tube을 사용하여 FACS로 분석하였다. FACS 분석시 사용한 Tie2 antibody는 BD Pharmingen쪠 Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Human Tie2 (CD202b)이다. 형질감염시킨 HUVEC의 Tie2 발현 효율을 도 1d에 나타내었다.
도 1e는 HUVEC_NC와 HUVEC_Cont. 및 HUVEC_Tie2의 FACS 분석 결과를 나타낸 그림이다. HUVEC_NC는 antibody를 넣지 않은 negative control를 의미하는 것이고, HUVEC_Cont.는 Tie2를 과발현시키지 않은 세포에 antibody를 넣은 control를 의미하는 것이며, HUVEC_Tie2는 HUVEC에서 Tie2를 과발현 시킨 것을 의미한다.
도 1e에 나타낸 바와 같이, lentiviral vector pLV-mCherry-CMV를 이용하여 형질감염시킨 HUVEC_Tie2에서 Tie2가 과 발현됨을 확인하였다.
실시예 2. Ang1 과 발현 중간엽 줄기세포(MSC_Ang1) 제조
2.1 세포 배양(cell culture)
인체 제대유래 중간엽 줄기세포 (Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells, UC-MSCs)는 서울아산병원 줄기세포센터에서 확보했다. 실험에 사용된 hMSCs는 계대 5~12 사이의 세포로 실험에 사용하였다. 세포는 10%FBS와 1%penicillin-streptomycin solution이 들어간 DMEM배지를 사용하여 37°C에서 배양하였다.
2.2 Ang1 과발현 중간엽 줄기세포(MSC_Ang1)의 제조
중간엽 줄기세포 control(hMSC_Cont.)를 제조하기 위해, 인간 중간엽 줄기세포 (hMSC)에 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용하여 EGFP가 encoding되어있는 lentiviral vector를 형질감염시켰다. 또한, Ang1(Angiopoietin-1) 과발현 중간엽 줄기세포(MSC_Ang1)를 제조하기 위해, 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)에 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용하여 형질감염시키고, 상기 형질감염시킨 hMSCs에 Ang1 유전자 발현 여부를 확인하였다.
구체적으로, EGFP가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-EGFP-CMV는 VectorBuilder에서 바이러스입자에 사전 포장된 상태로 구입하였다. 상기 바이러스 벡터의 구조는 도 2a에 나타내었다. 또한, 도 2b는 human Angiopoietin-1와 EGFP가 encoding되어있는 lentiviral vector pLV-EGFP-CMV의 구조를 나타낸 모식도이다.
6well plate에 hMSCs를 well당 1x105cells를 seeding하였다. well당 1ml에 바이러스를 multiplicity of infection (MOI) 10으로 감염시키고 24시간동안 형질 감염시킨 후에 배지를 2ml로 교체하였다. 형질감염 효율을 평가하기 위해 형광 현미경으로 GFP를 검출하였고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2c는 lentiviral vector pLV-EGFP-CMV로 형질감염시킨 인간 중간엽 줄기세포 (hMSCs)에서 형광 현미경으로 GFP를 검출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2c에서 본 바와 같이, 렌티바이러스(Lentivirus)를 이용하여 형질감염시킨 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)에서 GFP가 검출됨을 확인하였고, 이는 상기 lentiviral vector로 형질감염시킨 인간 중간엽 줄기세포 (hMSCs-Ang1)에서 Ang1 유전자가 발현됨을 확인하였다.
2.3 Ang1 과발현 중간엽 줄기세포(MSCs-Ang1)의 Ang1 유전자 발현 확인
실시예 2.2에 따라 렌티바이러스(Lentivirus)로 형질감염시킨 Ang1 과발현 인간 중간엽 줄기세포(hMSC_Ang1)에서 Ang1 유전자 발현 여부를 확인하기 위해 RT-PCR과 ELISA분석을 사용하여 Ang1 유전자 발현을 검출하였다.
구체적으로, RT-PCR을 수행하기 위해 제조업체의 지침에 따라 Total RNA Isolation Kit (Macherey-Nagel)를 사용하여 배양된 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA농도 및 순도는 Nanodrop으로 확인하였다. Ang1의 mRNA발현을 검출하기 위해 RT-PCR분석은 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었다. 사용된 primer는 IDT에서 구입하였고, primer 염기서열은 표 2에 나타내었다.
서열 서열번호
Primer 1 (Ang1) 5'-AACCAGCCTCCTCTCTCAG-3' 3
Primer 2 (Ang1) 5'-GCAGCTGTATCTCAAGTCGAG-3' 4
각 샘플은 GAPDH발현에 대한 상대정량으로 분석하였고, 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
도 2d는 RT-PCR을 통해 형질감염시키지 않은 인간 중간엽 줄기세포(control)과 Ang1 과발현 인간 중간엽 줄기세포(hMSC_Ang1)에서 Ang1 유전자 발현량을 GAPDH발현에 대한 상대정량으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2d에 나타낸 바와 같이, Ang1 과발현 인간 중간엽 줄기세포(hMSC_Ang1)에서 Ang1을 과발현 시키지 않은 인간 중간엽 줄기세포(hMSC_control)에 비하여 Ang1 유전자 발현량이 많은 것을 확인하였다.
한편, 실시예 2.1에 따라 렌티바이러스(Lentivirus)로 형질감염시킨 Ang1 과발현 인간 중간엽 줄기세포(hMSC_Ang1)에 대해 ELISA분석 통해 Ang1 유전자 발현을 검출하였다.
Ang1-특이적 ELISA는 Quantikine Human Angiopoietin-1 Immunoassay (R&D Systems)를 사용하여 수행되었다. 형질감염 후 최대 10일 동안 2일 간격으로 6well plate의 hMSC_Ang1 배양액 샘플을 수집하여 분석하였다.
Ang1-특이적 ELISA를 수행한 결과를 도 2d에 나타내었다.
도 2e은 NC, Lv-cont. 및 Lv-Ang1에 대해 형질감염 후 최대 10일 동안 2일 간격으로 ELISA분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 NC는 형질감염을 시키지 않은 hMSC로 negative control를 의미하는 것이고, 상기 Lv-cont.는 Ang1를 포함고 있지 않은 lentiviral vector를 형질감염 시킨 control를 의미하는 것이며, 상기 Lv-Ang1는 Ang1을 포함하고 있는 lentiviral vector를 형질감염 시킨것을 의미하는 것이다.
도 2e에 나타낸 바와 같이, pLV[Exp]-EGFP:T2A:PuroCMV>hANGPT1를 이용하여 형질감염시킨 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs-Ang1)에서 Ang1이 과발현됨을 확인하였다.
실시예 3. HUVEC와 hMSC의 공배양 방법을 이용한 세포치료제 제조
HUVEC 세포와 hMSC 세포를 공배양하는 방법으로 세포치료제를 제조하였다. HUVEC 세포와 hMSC 세포의 간의 크기 차이 및 각 세포에서 발현하는 Tie2와 Ang1의 발현 차이를 고려하여 공배양하였다. 구체적으로, HUVEC을 Transwell에 3x104cells/ml을 seeding 하여 24시간동안 37°C 인큐베이터에서 배양 하였다. hMSC를 1.5x104cells/ml(HUVEC 대비 0.5배의 수)로 HUVEC세포 위에 공배양 하였고 37°C에서 6~8시간 배양 후 VEGF 20ng/ml를 첨가하였다. 37°C 인큐베이터에서 18~20시간 후에 migration assay를 수행하였다.
실험예 1. Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC)의 이동감소효과 확인
1.1 Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)의 이동 분석(Migration assay)
구멍 크기가 8um인 6.5mm 직경의 폴리카보네이트 필터가 포함된 Transwell챔버 (CorningCostar)를 사용하였다. Tie2를 과발현 시키지 않은 HUVEC(HUVEC-Cont.) 또는 Tie2를 과발현 시킨 HUVEC(HUVEC_Tie2)를 5x104cells/ml으로 seeding을 하고, Ang1을 과발현시키지 않은 hMSC(hMSC-Cont.) 또는 Ang1을 과발현시킨 hMSC(hMSC_Ang1)의 배양액을 24시간 처리한 후 VEGF 20ng/ml를 첨가하여 24시간 동안 인큐베이터에서 배양되었다. 배양 후 필터 위의 세포를 면봉을 이용하여 닦아내고 필터 아래로 이동한 세포를 PBS로 세척 한 후 메탄올로 20분 동안 고정하고, 1% crystal violet으로 20분 동안 염색하였다. PBS로 세척 한 후 이동한 세포를 현미경으로 관찰하였다. 1% acetic acid로 염색된 세포들을 녹여 Spectrofluorometer에서 595nm 흡광도로 측정하였고, 측정한 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3은 필터 아래로 이동한 혈관세포를 crystal violet으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, VEGF 첨가여부 및 첨가량에 따라 혈관세포의 이동량이 달라졌으나, VEGF 20ng/ml과 VEGF 40ng/ml 첨가시 혈관세포 이동량에 별 차이가 없음을 확인하였다.
도 4는 염색된 세포들을 acetic acid로 녹여 Spectrofluorometer에서 595nm 흡광도로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3및 도 4에 나타낸 바와 같이, HUVEC 이동이 VEGF 첨가시 정상군(A)에 비해 유의미하게 증가함을 확인하였고(B: 질환군), VEGF첨가 및 Ang-1 없는 배양액에서 Tie2 발현된 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)의 이동성이 질환군(B)에 비해 감소함을 확인하였다(C: 세포치료제#1). 또한, VEGF첨가 및 Ang-1 있는 배양액에서 질환군(B)에 비해 Tie2발현 혈관내피세포 이동성 현저히 감소 및 정상군(A)과 비슷한 수준임을 확인하였다(D: 세포치료제#1+Ang_1).
1.2 망막색소상피세포(RPE)와 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC)의 공동 배양을 통한 망막조직 모델 구축
Transwell 시스템을 이용하여, Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC)의 이동감소효과를 확인하기 위한 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cell, RPE)와 혈관내피세포(HUVEC)를 배양한 망막조직 모델을 구축하였다.
구체적으로, RPE세포는 Transwell 바닥면에 세포를 seeding하게 위해 Vitronectin (VTN)으로 코팅한 Transwell을 6well plate에 거꾸로 고정하였다. RPE 세포를 100ul배지에 1x105cells/ml이 되도록 하여 방울형태로 transwell 바닥면에 seeding하고 37°C 인큐베이터 안에서 2시간동안 배양하였다. RPE세포들이 잘 붙어있는 것을 확인하고 Trnaswell을 정상 위치로 뒤집어 배지가 담아있는 24well plate에 장착하였다. HUVEC을 Transwell안쪽 면에 1x105cells/ml으로 seeding 하고 24시간동안 배양하였다. hMSC (hMSC-Cont. or hMSC_Ang1)세포의 배양액을 넣고 다시 24시간동안 배양한 후 VEGF 20ng/ml를 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 공초점 현미경으로 HUVEC세포가 RPE층으로 이동하는 이미지를 획득하였다.
1.3 망막조직 모델에서 혈관내피세포 이동성 평가
상기 실험예 1.2의 방법으로 구축한 Transwell 시스템을 사용하여, HUVEC세포의 이동에 대한 Ang1-Tie2 시스템의 효과를 확인하였다. 공초점 현미경으로 HUVEC세포가 RPE층으로 이동하는 이미지를 도 5에 나타내었다.
도 5는 정상군(NC), 질환군, 세포치료군#1, 세포치료군#2로 나누어 HUVEC세포가 RPE층으로 이동하는 이미지를 공초점 현미경으로 찍은 사진이다. 정상군(NC)는 Tie2를 과발현 시키지 않은 HUVEC에 VEGF를 처리하지 않은 군이고, 질환군은 VEGF를 20ng/ml처리한 군이고, 세포치료군#1은 Tie2를 과발현 시킨 HUVEC(HUVEC_Tie2)에 VEGF를 20ng/ml처리한 군이며, 세포치료군 #2SMS Tie2를 과발현시킨 HUVEC(HUVEC_Tie2)에 MSC Lv-Ang-1 배양액을 넣고, VEGF를 20ng/ml처리한 군을 의미한다. 혈관내피세포는 빨간색 형광을 발현하고, 빨간색 형광의 분포가 많이 보일수록 혈관내피세포의 이동이 증가한 것이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 질환군에서 빨간색 분포가 많은 것을 알 수 있고, Tie2를 과발현시킨 HUVEC_Tie2를 사용한 세포치료제군은 모두 빨갠색 분포가 많지 않은 것을 확인하였다. 이는 질환군에서 혈관내피세포의 이동이 증가하고, 세포치료제군(HUVEC_Tie2)에서 이동한 혈관내피세포 수가 질환군에 비해 현저히 적음을 의미하며, VEGF환경에서도 혈관신생 억제효과가 일어남을 의미한다.
1.4. HUVEC 세포와 hMSC 세포의 공배양시 세포 이동 세포이동성 평가
두 세포 간의 크기 차이와 각각의 세포에서 발현하는 Ang1과 Tie2의 발현 차이를 고려하여 실시예 3과 같이, 세포이동이 가능한 다공성 트렌스웰의 한쪽에 먼저 HUVEC 세포를 배양 후 hMSC 세포를 0.5배의 수로 배양하였다. HUVEC 세포를 먼저 배양하여 세포와 세포 간의 tight junction 안정 후 hMSC 세포를 0.5배의 세포 수로 넣어 HUVEC세포 위에 공배양한 후, 혈관유래성장인자(VEGF)를 첨가하여 혈관유래성장인자(VEGF)환경에서 세포의 이동 정도를 비교 평가하였고, 그 결과를 도 6 및 도7에 나타내었다.
도 6은 은 HUVEC을 37℃에서 24시간 배양 후 hMSC를 HUVEC 위에 넣고 37°C에서 6~8시간 공 배양 후 VEGF 20ng/ml를 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 18~20시간 후에 migration assay를 수행하여 필터 아래로 이동한 혈관세포를 crystal violet으로 염색한 결과를 나타낸 사진이다: 도 6a은 Tie2를 과발현 시키지 않은 HUVEC(HUVEC-Cont.)과 Ang1을 과발현시키지 않은 hMSC(hMSC-Cont.)을 공배양시킨 후 세포이동성평가를 실시한 결과 사진이고, 도 6b는 Tie2를 과발현 시키지 않은 HUVEC(HUVEC-Cont.)과 Ang1을 과발현시키지 않은 hMSC(hMSC-Cont.)을 공배양시킨 후, VEGF를 첨가하여 세포 이동성평가를 실시한 결과 사진이며, 도 6c는 Tie2를 과발현 시킨HUVEC(HUVEC_Tie2)과 Ang1을 과발현시킨 hMSC(hMSC_Ang1)을 공배양시킨 후, VEGF를 첨가하여 세포 이동성평가를 실시한 결과 사진이다.
도 7은 crystal violet으로 염색된 세포들을 acetic acid로 녹여 분광광도계(Spectrofluorometer)에서 595nm 흡광도로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6및 도 7에 나타낸 바와 같이, 질환환경(VEGF 함유배양액)에서 일반 HUVEC은 매우 높은 세포이동성을 보이는 것을 확인하였고, 질환환경(VEGF 함유배양액)에서 HUVEC_Tie2와 MSC_Ang1 공배양 시 세포 이동이 정상군과 유사한 결과를 보임을 확인하였다. 이는 HUVEC_Tie2와 MSC_Ang1 공배양한 세포치료제의 경우질환환경에서도 혈관신생이 정상인과 비슷한 수준으로 억제됨을 의미한다.
실험예 2. Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)의 체외 혈관신생(Angiogenesis) 억제능 확인
Tie2 과발현 혈관내피세포(HUVEC_Tie2)의 체외 혈관신생(Angiogenesis) 억제능 평가하기 위하여, 혈관내피세포(HUVEC)를 젤에 배양하여 HUVEC 세포의 모세관 유사 관 형성 분석(tube formation assay)을 실시하였다. 구체적으로, HUVEC 세포의 모세관 유사 관 형성 분석(tube formation assay)은 tube formation assay kit(Abcam)를 사용하였다. 96well plate에 50ul/well의 extracellular matrix solution(ECM)을 첨가하여 용액이 겔을 형성하도록 37°C에서 1시간 동안 굳힌 후 각 well당 2Х104cells/100μl의 HUVEC(HUVEC_Cont. or HUVEC_Tie2)세포와 1Х104cells/100μl의 hMSC(hMSC-Cont. or hMSC_Ang1)세포를 mix하여 넣어주고 20ng/ml VEGF를 첨가하였다. 세포의 튜브 형성을 허용하기 위해 37°C에서 10시간 동안 배양하였다. 혈관과 같은 구조의 형성은 Juli쪠 Stage Real-Time History Recorder (NanoEnTek)에서 관찰하였다. 시간에 따른 튜브로 덮인 면적을 Image J 프로그램을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8은 HUVEC세포와 hMSC 세포를 2:1비율로 Matrigel위에 세포 부착 후 관형 구조의 이미지를 실시간 time lapse 이미징으로 3시간 동안 매 1시간 간격 촬영한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9은 시간에 따라 튜브로 덮인 면적을 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상군(Control)은 VEGF 환경(질환 환경)에서 빠르게 관 형성 구조를 만들고, 최종 관 형성 면적이 감소하는 것을 확인하였다. 실험군(세포치료제군)은 VEGF 환경에서도 관 형성이 천천히 진행되는 것을 확인하였고, 이는 혈관내피세포의 Tie2와 중간엽줄기세포의 Ang1 의한 Tight junction 형성으로 혈관신생을 늦추는 것으로 판단된다. 이는 Tie2를 과발현시킨 혈관내피세포와 Ang1을 과발현시킨 중간엽줄기세포의 세포치료제가 혈관신생을 늦추어 망막 내 혈관신생억제에 효과가 있음을 의미한다.

Claims (17)

  1. Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 혈관내피세포는 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하도록 유전적으로 조작된 것인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 혈관내피세포는 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 벡터를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 혈관내피세포는 인간탯줄정맥내피세포 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC), 인간 유도만능 줄기세포 분화 내피세포(iPSC differentiated endothelial cell), 망막내피세포(retinal endothelial cell), 중간엽줄기세포에서 분화된 내피세포(Mesenchymal stem cell differentiated endothelial cell), 혈관전구세포 분화 내피세포(Vascular progenitor cell differentiated endothelial cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포를 더 포함하거나 병용투여 되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포는 Ang1을 발현하거나 과발현하도록 유전적으로 조작된 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포는 Ang1(Angiopoietin-1)를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 벡터를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포는 혈관주변세포(pericyte), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC), 내피세포(Endothelial cell, EC), 섬유아세포(fibroblast), 망막색소상피세포(Retinal Pigment Epithelium, RPE), 광수용체(photoreceptor), 수평세포(horizontal cell), 뮐러세포(Muller cell), 무축삭 세포(amacrine cell), 별상세포(astrocytes) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포(MSC)는 탯줄, 제대혈, 태반, 골수, 지방조직, 근육, 양수, 양막 및 치수로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에서 유래된 것인, 약학적 조성물.
  10. 청구항 5에 있어서, 상기 Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포는 감소된 면역원성을 나타내는 것인, 약학적 조성물.
  11. 청구항 5에 있어서, 상기 Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포와 상기 Tie2 과발현 혈관내피세포는 공배양시킨 것인, 약학적 조성물.
  12. 청구항 5에 있어서, 상기 Ang1(Angiopoietin-1)을 발현하는 세포와 상기 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2) 과발현 혈관내피세포의 비율은 1:0.1 내지 1:10인 것인, 약학적 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 망막 내 혈관신생 질환은 망막색소변성증 (Retinal Pigment Epithelial Dystrophy), 망막색소상피하 피질하 봉막증 (Choroidal Neovascularization), 망막색소상피하혈관확장증 (Choroidal Vascular Expansion), 망막색소상피하혈관문신증 (Choroidal Vascular Occlusion), 망막색소상피하 신생혈관증 (Choroidal Neovascular Membrane), 망막색소상피하혈관폐쇄증 (Choroidal Vascular Occlusive Disease), 망막색소상피하 출혈증 (Choroidal Hemorrhage), 망막색소상피하이완증 (Choroidal Effusion) 색소성 망막병증 (Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR), 황반의 결막병증 (Macular Telangiectasia), 연령 관련성 황반변성 (Age-related Macular Degeneration, AMD), 고혈압성 망막병증 (Hypertensive Retinopathy), 당뇨성 망막병증 (Diabetic Retinopathy), 건성 황반변성 (Dry AMD), 습식 황반변성 (Wet AMD)등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 키트.
  15. 망막 내 혈관신생 질환을 예방 또는 치료하기 위한 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
  16. 유효량의 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료 방법.
  17. 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 의약 제조에 사용하기 위한 Tie2(Tyrosine Kinase Receptor 2)을 과발현하는 혈관내피세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
PCT/KR2024/009970 2023-07-11 2024-07-11 Tie2을 과발현하는 혈관내피세포를 포함하는 망막 내 혈관신생 질환 예방 또는 치료용 조성물 Pending WO2025014308A1 (ko)

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