WO2024257844A1 - ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ベクター並びにこれらを用いたゲノム編集方法及び視細胞製造方法 - Google Patents

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    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron

Definitions

  • the present disclosure relates to zinc finger nucleases, vectors, and genome editing methods and cell production methods using the same. More specifically, the present disclosure relates to zinc finger nucleases for genome editing of the rhodopsin (RHO) gene locus.
  • RHO rhodopsin
  • Human rhodopsin protein is a light-sensitive G protein-coupled receptor (GPCR) specific to rod photoreceptors, consisting of approximately 348 amino acids.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the rhodopsin (RHO) gene locus that codes for rhodopsin protein consists of five exons and is approximately 6.7 kb long (chr3:129,528,639-129,535,344) including the intron region. Mutations in the rhodopsin gene cause retinitis pigmentosa, and approximately 110 types of gene mutations have been reported so far.
  • Patent Document 1 proposes a technology to treat retinitis pigmentosa caused by mutations in the rhodopsin gene by genome editing using designer nucleases such as TALE nuclease (TALEN), zinc-finger nuclease (ZFN), and Cas nuclease.
  • designer nucleases such as TALE nuclease (TALEN), zinc-finger nuclease (ZFN), and Cas nuclease.
  • ZFN consists of FokI-ND, a nucleic acid cleavage domain, zinc finger protein (ZFP), a nucleic acid binding domain, and a linker connecting them.
  • Patent Document 2 discloses ZFN that contains nucleic acid cleavage domains called nuclease domain 1 (ND1) and nuclease domain 2 (ND2) instead of FokI-ND.
  • ND1 is said to be a nuclease domain derived from Bacillus SGD-V-76
  • ND2 is said to be a nuclease domain derived from Clostridium botulinum.
  • ND1 and ND2 are said to be superior to the conventional FokI-ND in terms of functionality such as cleavage activity, specificity, and target sequence selectivity.
  • the primary objective of this disclosure is to provide a technique useful for genome editing of the RHO locus using ZFNs.
  • [1] A combination of a pair of zinc finger nucleases (ZFNs) for genome editing of the rhodopsin (RHO) locus, the combination being selected from the following group: (1) A combination of a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2. (2) A combination of a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:5 and a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:6.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • the nucleic acid cleavage domain of ZFN is The amino acid sequence of positions 391 to 585 of SEQ ID NO:52; The amino acid sequence of SEQ ID NO:57; or Amino acid sequence of SEQ ID NO:58; The combination of [4], [6] Any combination of [1] to [4], wherein the RHO locus is a human RHO locus.
  • a vector comprising a nucleic acid sequence encoding any one of a pair of ZFNs according to [1] to [6].
  • a bidirectional expression vector A nucleic acid sequence encoding a sense strand ZFN and a promoter sequence that controls the transcription of the nucleic acid sequence; A nucleic acid sequence encoding an antisense strand ZFN and a promoter sequence that controls the transcription of the nucleic acid sequence, The vector according to [7], wherein the two promoter sequences are arranged contiguously without a spacer sequence between them.
  • the vector according to [8], wherein the two promoters are a CMV promoter and a human EF1a (Elongation Factor alpha-1) promoter.
  • a therapeutic agent for a disease caused by the RHO gene comprising any one of the vectors [7]-[9].
  • a genome editing method for the RHO locus comprising the step of introducing any one of the vectors according to [7] to [9] into photoreceptor cells in vivo or in vitro, preferably in vitro.
  • a method for producing photoreceptor cells having a genome edited RHO gene comprising the step of introducing any one of the vectors [7] to [9] into photoreceptor cells in vivo or in vitro, preferably in vitro.
  • This disclosure provides a technology useful for genome editing of the RHO locus using ZFNs.
  • EGFP fluorescence indicates cleavage of the candidate ZF binding target sequence by ZF-ND1.
  • the structures of bicistronic, dual promoter and bidirectional promoter plasmid vectors are shown. These are EGFP fluorescence images of HEK293 cells transfected with a bicistronic, dual promoter or bidirectional promoter and an EGFP fragment expression plasmid containing a candidate ZF binding target sequence.
  • EGFP fluorescence indicates cleavage of the candidate ZF binding target sequence by ZF-ND1.
  • the positive control was transfected with a ZF-ND1 expression plasmid (5461S, 5562AS).
  • the results of Cel-I analysis of the target RHO sequence in HEK293 cells transfected with bicistronic or bidirectional promoters are shown.
  • the 220 bp and 130 bp bands indicate InDel (Insertion and Deletion).
  • the ZF-ND1 expression plasmid (5461S, 5562AS) was used as a positive control.
  • Tide Track of Indels by DEcomposition
  • the ZF-ND1 expression plasmid (5461S, 5562AS) was used as a positive control.
  • Zinc finger nuclease The ZFN according to the present disclosure can be used for genome editing of the rhodopsin (RHO) locus, and is a combination of ZFNs having a zinc finger array that recognizes a specific nucleic acid sequence.
  • the zinc finger array is composed of a plurality of zinc fingers (ZFs) that recognize a three-base sequence.
  • the zinc finger array may contain two or more ZFs, for example, 3-9, preferably 4-8, more preferably 5-7, typically 6 ZFs.
  • the relationship between the amino acid sequence of ZF and the three-base sequence recognized by ZF is publicly known, and for the amino acid sequence of ZF, the amino acid sequence described in, for example, Supplemental Table 1 of Non-Patent Document 1 can be used depending on the three-base sequence to be recognized. Since there are multiple amino acid sequences of ZF that recognize the same three-base sequence, these ZFs that recognize the same three-base sequence can be used interchangeably.
  • the ZFNs of the present disclosure have a zinc finger array selected from the following combinations (see Table 1 below). (1) A combination of a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2. (2) A combination of a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:5 and a ZFN having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:6.
  • the recognition sequence of the zinc finger array of each ZFN, its sequence number, and the amino acid sequence of the zinc finger array are shown in Table 1.
  • the pair of ZFNs in (1) above is a combination of a sense strand ZFN 4350S having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence (ATTCTTGGGTGGGAGCAG) of SEQ ID NO: 1 and an antisense strand ZFN 4350AS having a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence (AAGGCCTGAGCTCAGCCA) of SEQ ID NO: 2.
  • ZFN 4350S consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59
  • ZFN 4350AS consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60.
  • the ZFN disclosed herein is preferably any combination of the above (2), (4), (5), (10), (12), (13), or (14) due to its high cleavage activity.
  • the ZFN disclosed herein recognizes and binds to a nucleic acid sequence upstream of the start codon of exon 1 of the RHO gene (RHO locus 5'UTR) using a zinc finger array at the RHO locus, and causes a DNA double-strand break (DSB) by the nucleic acid cleavage domain.
  • the length of the spacer between the nucleic acid sequences recognized by the two zinc finger arrays of the ZFN disclosed herein is not particularly limited, but is, for example, 1-20 bp, preferably 3-8 bp, 5 bps, or 6 bps in length.
  • the nucleic acid sequence of the spacer is uniquely defined as the nucleic acid sequence between the nucleic acid sequence recognized by one zinc finger array and the nucleic acid sequence recognized by another zinc finger array.
  • the ZFN cleaves the double-stranded DNA within the spacer sequence.
  • the pair of ZFNs in (1) above cleaves a double-stranded DNA in the spacer sequence (CGCAGC) between the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 (ATTCTTGGGTGGGAGCAG), which is the binding sequence of the sense strand ZFN, and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 (AAGGCCTGAGCTCAGCCA), which is the binding sequence of the antisense strand ZFN.
  • the nucleic acid cleavage domain of the ZFN according to the present disclosure is not particularly limited, and may be FokI-ND, ND1 and ND2 described in Patent Document 2, or modified versions thereof.
  • the amino acid sequence of a full-length protein (derived from Bacillus SGD-V-76) containing ND1 is shown in SEQ ID NO: 52, and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 53.
  • the amino acid sequence of a full-length protein (derived from Clostridium botulinum) containing ND2 is shown in SEQ ID NO: 54, and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 55.
  • ND1 is typically a partial peptide corresponding to positions 391 to 585 of SEQ ID NO: 52
  • ND2 is typically a partial peptide corresponding to positions 389 to 579 of SEQ ID NO: 54.
  • the nucleic acid cleavage domain is preferably ND1.
  • the ND1 and ND2 variants may be polypeptides that contain an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in positions 391 to 585 of SEQ ID NO:52 or positions 389 to 579 of SEQ ID NO:54, and have nuclease activity.
  • “one or several” means, for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, e.g., 1, 2, 3, 4 or 5.
  • the ND1 and ND2 variants may be polypeptides that contain an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence shown at positions 391 to 585 of SEQ ID NO:52 or positions 389 to 579 of SEQ ID NO:54, and have nuclease activity.
  • sequence identity of an amino acid sequence is determined by comparing two sequences aligned in a state in which the sequence match is maximized. Methods for determining the numerical value (%) of sequence identity are known to those skilled in the art.
  • any algorithm known to those skilled in the art e.g., BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.
  • the sequence identity of an amino acid sequence is determined, for example, using sequence analysis software such as BLASTP and FASTA.
  • ND1 and ND2 variants include variants (DDD type variants) containing aspartic acid (D483, D487, and D496) at positions corresponding to positions 483, 487, and 496 in the amino acid sequence of FokI, and variants (RRR type variants) containing arginine (R483, R487, and R537) at positions corresponding to positions 483, 487, and 537 in the amino acid sequence of FokI.
  • DDD type variant of ND1 (ND1DDD) has an amino acid sequence in which the 103rd and 113th amino acids in a partial peptide corresponding to positions 391 to 585 of SEQ ID NO:52 are replaced with aspartic acid (SEQ ID NO:57).
  • the RRR type variant of ND1 (ND1RRR) has an amino acid sequence in which the 100th and 154th amino acids in a partial peptide corresponding to positions 391 to 585 of SEQ ID NO:52 are replaced with arginine (SEQ ID NO:58).
  • the nucleic acid cleavage domain of the ZFN of the present disclosure may be a polypeptide that includes modified amino acids and/or unnatural amino acids.
  • Modified amino acids include, but are not limited to, methylation, esterification, amidation, acetylation, alkylation, halogenation, and the like.
  • the modified amino acids and unnatural amino acids can be introduced by known methods.
  • the nucleic acid cleavage domain and the zinc finger protein (ZFP) including the zinc finger array may be directly linked or linked via a linker.
  • the linker may be composed of, for example, two or more amino acid residues, and may be, for example, 2 to 20 amino acids long, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, or 20 amino acids long, although the length is not particularly limited.
  • the type of linker is also not particularly limited, but an example is TGGS (SEQ ID NO: 56). The presence or absence of a linker and the length and type of the linker are appropriately selected by those skilled in the art, taking into consideration the type of nucleic acid binding domain, etc.
  • the ZFNs disclosed herein may have other effector domains instead of a nucleic acid cleavage domain.
  • effector domains include cytosine base editor (UGI, APOBEC), adenine base editor (TadA), transcriptional activator (VP16)/repressor (SID), epigenomic editor (DNMT3A, TET1), imaging protein (Dye, fluorescent protein), transposase (PiggyBac), recombinase (Flippase), etc.
  • the ZFNs disclosed herein can be produced in vitro or in vivo by methods known in the art. Examples include artificial synthesis based on amino acid sequence information, or artificial synthesis of nucleic acid encoding the ZFN, insertion into an appropriate expression vector, and then introduction into an appropriate host cell to express the ZFN in the cell.
  • vector according to the present disclosure comprises a nucleic acid sequence encoding the pair of ZFNs described above.
  • the vector according to the present disclosure is a bidirectional expression vector, in which the sense strand ZFN and the antisense strand ZFN of the pair of ZFNs are expressed under the control of separate promoters, and the two promoters are arranged in opposite directions.
  • the bidirectional expression vector according to the present disclosure comprises a nucleic acid sequence encoding a sense strand ZFN and a promoter sequence controlling the transcription of the nucleic acid sequence, and a nucleic acid sequence encoding an antisense strand ZFN and a promoter sequence controlling the transcription of the nucleic acid sequence, and it is preferable that the two promoter sequences are arranged consecutively without a spacer sequence between them.
  • the two promoters may be any conventionally known promoter, such as a CMV promoter, a human EF1a (Elongation Factor alpha-1) promoter, or a PGK (phosphoglycerate kinase) promoter.
  • the two promoters are preferably a CMV promoter and a human EF1a.
  • the vectors disclosed herein may contain elements present in conventional gene expression vectors in addition to the nucleic acid sequence encoding the ZFN and the promoter sequence.
  • Such elements include, for example, polyA addition sequences (SV40 pA, HGH pA, rabbit globin pA, etc.).
  • the vector is not particularly limited and may be selected from vectors used in the field.
  • vectors include phage vectors, plasmid vectors, viral vectors, retroviral vectors, chromosomal vectors, episomal vectors, virus-derived vectors (bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, etc.), yeast chromosomal elements, viruses (baculoviruses, papovaviruses, vaccinia viruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, avian poxviruses, pseudorabies viruses, herpes viruses, lentiviruses, retroviruses, etc.), and vectors derived from combinations of these (cosmids, phagemids, etc.).
  • plasmid vectors are preferred from the viewpoint of their versatility.
  • viral vectors are preferred, and adeno-associated virus vectors (AAV vectors) are more preferred.
  • AAV vectors adeno-associated virus vectors
  • Genome editing method, etc. also provides a genome editing method for the RHO locus of photoreceptor cells, including a procedure for introducing the above-mentioned vector into photoreceptor cells in vivo or in vitro, preferably in vitro, as well as a method for producing genome-edited photoreceptor cells.
  • a genome editing system using ZFN is composed only of proteins. Therefore, in a genome editing system using ZFN, it is easy to achieve tissue-specific genome editing of the desired tissue by using a tissue-specific promoter, a drug-responsive promoter, or the like.
  • Introduction of a vector into photoreceptor cells can be carried out by a conventionally known method.
  • the introduction method include, but are not limited to, electroporation, particle gun method, microinjection method, lipofection method, protein transduction method, etc.
  • donor DNA may be introduced into the cell together with the vector.
  • the donor DNA may be, for example, donor DNA encoding a normal RHO gene.
  • the donor DNA may be configured so that the normal RHO gene can be introduced into the gene locus by utilizing a repair mechanism such as nonhomologous endjoining (NHEJ) or homologous recombination (HR) at the site of DNA double-strand break by ZFN.
  • NHEJ nonhomologous endjoining
  • HR homologous recombination
  • the break site is primarily repaired by NHEJ. Because NHEJ is error-prone, deletion, insertion, or substitution of at least one nucleotide, or a combination thereof, may occur during repair of the break. In this way, the RHO locus is modified at the break site.
  • the photoreceptor cells may be from humans or non-human animals.
  • Non-human animals include even-toed ungulates (such as cattle, wild boars, pigs, sheep, and goats), odd-toed ungulates (such as horses), rodents (such as mice, rats, hamsters, and squirrels), lagomorphs (such as rabbits), and carnivores (such as dogs, cats, and ferrets).
  • the present disclosure also provides a therapeutic agent for a disease caused by the RHO gene, comprising the above-mentioned vector.
  • the therapeutic agent may comprise a donor DNA encoding the above-mentioned normal RHO gene.
  • the genome-edited photoreceptor cells obtained by the above-mentioned genome editing method can be formulated as a cell medicine. Such a cell medicine can also be used as a therapeutic agent for diseases caused by the RHO gene.
  • the therapeutic agent can be formulated according to conventional methods. Specifically, it can be formulated by compounding the above-mentioned vector and, optionally, the above-mentioned donor DNA with pharmaceutical additives, or by compounding the genome-edited photoreceptor cells with pharmaceutical additives.
  • pharmaceutical additives refers to substances other than the active ingredients contained in the formulation.
  • Pharmaceutical additives are included in the formulation for the purpose of facilitating formulation, stabilizing quality, and enhancing usefulness.
  • examples of pharmaceutical additives include excipients, binders, disintegrants, lubricants, flow agents (solid prevention agents), colorants, capsule membranes, coating agents, plasticizers, flavoring agents, sweeteners, flavoring agents, solvents, dissolution aids, emulsifiers, suspending agents (adhesives), thickeners, pH adjusters (acidifiers, alkalizers, buffers), wetting agents (solubilizers), antibacterial preservatives, chelating agents, suppository bases, ointment bases, hardeners, softeners, medical water, propellants, stabilizers, preservatives, etc.
  • These pharmaceutical additives are readily selected by those skilled in the art according to the intended dosage form and route of administration, as well as standard pharmaceutical practice.
  • Therapeutic agents may take any dosage form.
  • dosage forms include eye drops, tablets, capsules, oral preparations, topical preparations, suppositories, injections, and inhalants.
  • Therapeutic agents may be prescribed as appropriate at the discretion of a physician or medical professional. Furthermore, the dosage and administration schedule of therapeutic agents may also be determined as appropriate at the discretion of a physician or medical professional.
  • the administration route of the therapeutic agent is appropriately selected depending on factors such as the dosage form of the therapeutic agent and the type and severity of the disease to be treated.
  • Examples of administration routes that are preferably used include subretinal injection, vitreous injection, and suprachoroidal injection.
  • Example 1 Identification of target sequences for ZF.
  • Search for candidate sequences We searched for a region in which ZFNs could induce double-stranded DNA breaks in the 100-bp region upstream of the start codon of exon 1 of the RHO gene. The 100-bp region was selected as a region with low evolutionary sequence conservation.
  • ZFFinger Tools https://www.scripps.edu/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php
  • the binding target sequence of each zinc finger array of the ZFN dimer is 18 bp (composed of 6 ZFs). When the base length between the binding target sequences (spacer) was set to 6 bp or 5 bp, 34 pairs of binding target candidate sequences were presented (see Table 1).
  • each ZF was that described in the literature ("Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly", Wright et al., Nature Protocols, 2006, Vol.1, No.3, p.1637-52, Supplemental Table 1).
  • a zinc finger array was created by linking one ZF for every three base sequences on the 3' end of the target sequence (total of six).
  • the sense strand ZFN 4350S which has a zinc finger array that recognizes the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:1 (ATTCTTGGGTGGGAGCAG), has an amino acid sequence in which ZF91, ZF62, ZF106, ZF58, ZF103, and ZF88 (see the above literature, Supplemental Table 1), which recognize CAG, GAG, TGG, GGG, CTT, and ATT, respectively, are linked in order from the N-terminus.
  • SSA single strand annealing
  • ZF-ND1 expression plasmid (pCMV-ZF-ND1DDD, pCMV-ZF-ND1RRR) This is a plasmid that expresses "ZF-ND1" under the control of the CMV promoter.
  • ZF-ND1 indicates one of the sense and antisense strand ZFNs of the 34 ZFN pairs listed in Table 1
  • ND1 indicates one of the subunits of the ND1 heterodimer (ND1DDD and ND1RRR).
  • ND1DDD was used as the sense strand ZFN
  • ND1RRR was used as the antisense strand ZFN.
  • EGFP fragment expression plasmid (pCAG-EGxxFP) This is a plasmid that expresses EGFP under the control of the CAG promoter.
  • EGxxFP consists of a 1-600 bp fragment of the EGFP gene, a stop codon, a multicloning site, and a 120-720 bp fragment of the EGFP gene, and a candidate binding target sequence is inserted into the multicloning site.
  • the pCAG-EGxxFP plasmid is not cleaved by ZF-ND1, it expresses incomplete GFP due to the stop codon immediately after the 1-600bp fragment of the EGFP gene.
  • pCMV-ZF-ND1DDD pCMV-ZF-ND1RRR and pCAG-EGxxFP were introduced into HEK293 cells using transfection reagent (FuGene6 (Promega) or Viafect (Promega)) according to the attached protocol. Fluorescence images were taken 48 hours after transfection. The results are shown in Figure 1. Green EGFP fluorescence was observed in 16 pairs (1, 3-8, 16, 18-23, 30, 32) out of 34 pairs of candidate binding target sequences, confirming that cleavage by ZF-ND1 had occurred in the binding target sequences. High fluorescence intensity was observed in pairs 3, 5, 6, 19, and 21-23, confirming particularly high cleavage activity.
  • Example 2 Study of high expression vector constructs
  • two methods for expressing two types of genes one in which two types of genes are expressed by one promoter (bicistronic expression), and the other in which each gene is expressed by two different promoters.
  • a plasmid vector hereinafter referred to as "Bicistronic" was prepared in which ZF-S-ND1DDD and ZF-AS-ND1RRR were linked and incorporated with an autolytic peptide (Furin-P2A) under the control of a CMV promoter.
  • a plasmid vector (hereinafter referred to as "Dual promoter") in which a CMV promoter and a human EF1a (Elongation Factor alpha-1) promoter are arranged in the same direction (Dual promoter) and a plasmid vector (hereinafter referred to as "Bidirectional promoter") in which they are arranged in the opposite direction were prepared.
  • the structure of each plasmid vector is shown in FIG. 2.
  • the Dual promoter and Bidirectional promoter express ZF-S-ND1DDD under the control of the EF1a promoter and express ZF-AS-ND1RRR under the control of the CMV promoter.
  • ZF target binding sequence ZF-S, ZF-AS
  • the pair 22 5461S, 5562AS
  • the dual promoter contains an insulator sequence to prevent interference between the expression of the two genes.
  • SSA analysis was performed in the same manner as in Example 1 using the bicistronic, dual promoter, and bidirectional promoter plasmid vectors.
  • ZF-ND1 expression plasmid positive control
  • the frequency of InDel (Insertion and Deletion) in the target RHO sequence was compared by Cel-I analysis using each of the bicistronic and bidirectional promoter plasmid vectors.
  • As a positive control the ZF-ND1 expression plasmid (positive control) pair 22 from Example 1 was used.
  • Cel-I analysis was performed using the genomic DNA of HEK293 cells transfected with each plasmid construct, according to the protocol recommended by the GeneArt Genomic Cleavage Detection kit (ThermoFisher Scientific).
  • the target RHO sequence amplified by PCR was treated with Cel-I nuclease and electrophoresed, and the results are shown in Figure 4.
  • Figure 5 shows a histogram of InDels, where 0 on the X-axis indicates the same sequence as WT (no InDels), the positive direction indicates the number of inserted bases, the negative direction indicates the number of deleted bases, and the Y-axis indicates the frequency (percentage). Total eff indicates the sum of the InDel frequencies (%).
  • SEQ ID NO:1 ZFN 4350S zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:2 ZFN 4350AS zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:3 ZFN 4653S zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:4 ZFN 4653AS zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:5 ZFN 4956S zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:6 ZFN 4956AS zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:7 ZFN 5158S zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:8 ZFN 5158AS zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:9 ZFN 5259S zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:10 ZFN 5259AS zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:12 ZFN
  • SEQ ID NO:13 ZFN 5562S zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:14 ZFN 5562AS zinc finger array recognition sequence
  • SEQ ID NO:15 ZFN 57

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Abstract

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いたロドプシン（RHO）遺伝子座のゲノム編集に有用な技術として、RHO遺伝子座のゲノム編集のための、１対のZFNの組み合わせであって、特定の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNの組み合わせが提供される。

Description

ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ベクター並びにこれらを用いたゲノム編集方法及び視細胞製造方法
　本開示は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ベクター並びにこれらを用いたゲノム編集方法及び細胞製造方法に関する。より詳しくは、ロドプシン（RHO）遺伝子座のゲノム編集のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ等に関する。
　ヒトロドプシンタンパク質は、約348アミノ酸から構成される、杆体視細胞に特異的な光感受性Ｇ蛋白質共役受容体（GPCR）である。ロドプシンタンパク質をコードしているロドプシン（RHO）遺伝子座は、5つのエキソンから構成され、イントロン領域を含めると約6.7kb長（chr3:129,528,639-129,535,344）である。ロドプシン遺伝子の変異は網膜色素変性の原因となり、これまでに110種類程度の遺伝子変異が報告されている。特許文献１には、TALEヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-finger nuclease；ZFN）及びCasヌクレアーゼなどのデザイナー・ヌクレアーゼを用いたゲノム編集によりロドプシン遺伝子の変異を原因とする網膜色素変性を治療する技術が提案されている。
　ZFNは、核酸切断ドメインであるFokI-ND、核酸結合ドメインであるジンクフィンガータンパク質（Zinc-finger protein；ZFP）及びそれらをつなぐリンカーからなる。特許文献２には、FokI-NDに替えてヌクレアーゼドメイン１（ND1）及びヌクレアーゼドメイン２（ND２）と称される核酸切断ドメインを含むZFNが開示されている。ND1はバチルス属SGD-V-76由来のヌクレアーゼドメイン、ND2はボツリヌス菌由来のヌクレアーゼドメインとされている。ND1及びND2は、従来のFokI-NDよりも、切断活性や特異性、標的配列の選択性等の機能性において優れるとされている。
国際公開第２０２１／０１０３０３号 国際公開第２０２０／０４５２８１号
"Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly", Wright et al., Nature Protocols, 2006, Vol.1, No.3, p.1637-52
　本開示は、ZFNを用いたRHO遺伝子座のゲノム編集に有用な技術を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本開示は、以下の［１］－［１２］を提供する。
［１］　ロドプシン（RHO）遺伝子座のゲノム編集のための、１対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）の組み合わせであって、以下の群から選択される組み合わせ。
（１）配列番号１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（２）配列番号５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（３）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（４）配列番号９の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（５）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（６）配列番号１３の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（７）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（８）配列番号３１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（９）配列番号３５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１０）配列番号３７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１１）配列番号３８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１２）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１３）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１４）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１５）配列番号４５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１６）配列番号４７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
［２］　以下の群から選択される、［１］の組み合わせ。
（２）配列番号５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（４）配列番号９の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（５）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１０）配列番号３７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１２）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１３）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１４）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
［３］　２つのジンクフィンガーアレイが認識する核酸配列間のスペーサーが５ｂｐｓ又は６ｂｐｓである、［１］又は［２］の組み合わせ。
［４］　ZFNの核酸切断ドメインが、ND1である、［１］－［３］のいずれかの組み合わせ。
［５］　ZFNの核酸切断ドメインが、
配列番号５２の391～585位のアミノ酸配列、
配列番号５７のアミノ酸配列、又は、
配列番号５８のアミノ酸配列、
を含んでなる、［４］の組み合わせ。
［６］　RHO遺伝子座が、ヒトＲＨＯ遺伝子座である、［１］－［４］のいずれかの組み合わせ。
［７］　［１］－［６］のいずれかの１対のZFNをコードする核酸配列を含むベクター。
［８］　バイディレクショナル発現ベクターであり、
　センス鎖ZFNをコードする核酸配列と該核酸配列の転写を制御するプロモーター配列と、
　アンチセンス鎖ZFNをコードする核酸配列と該核酸配列の転写を制御するプロモーター配列と、を含み、
前記２つのプロモーター配列が、それらの間にスペーサー配列を有さずに連続して配列する、［７］のベクター。
［９］　２つのプロモーターが、CMVプロモーターとヒトEF1a（Elongation Factor alpha-1）プロモーターである、［８］のベクター。
［１０］　［７］－［９］のいずれかのベクターを含む、RHO遺伝子に由来する疾患の治療剤。
［１１］　［７］－［９］のいずれかのベクターをin vivo又はin vitroで、好ましくはin vitroで、視細胞に導入する手順を含む、RHO遺伝子座のゲノム編集方法。
［１２］　［７］－［９］のいずれかのベクターをin vivo又はin vitroで、好ましくはin vitroで、視細胞に導入する手順を含む、RHO遺伝子がゲノム編集された視細胞の製造方法。
　本開示により、ZFNを用いたRHO遺伝子座のゲノム編集に有用な技術が提供される。
ZF-ND1発現プラスミドと、ZF結合標的候補配列を挿入したEGFP断片発現プラスミドとを導入したHEK293細胞のEGFP蛍光像である。EGFPの蛍光は、ZF-ND1によるZF結合標的候補配列の切断を示す。 Bicistronic、Dual promoter及びBidirectional promoterの各プラスミドベクターの構成を示す。 Bicistronic、Dual promoter又はBidirectional promoterと、ZF結合標的候補配列を挿入したEGFP断片発現プラスミドとを導入したHEK293細胞におけるEGFP蛍光像である。EGFPの蛍光は、ZF-ND1によるZF結合標的候補配列の切断を示す。positive controlは、ZF-ND1発現プラスミド（5461S, 5562AS）を導入した。 Bicistronic又はBidirectional promoterをトランスフェクションしたHEK293細胞の標的RHO配列のCel-I解析の結果を示す。220bp及び130bpのバンドがInDel (Insertion and Deletion)を示す。positive controlには、ZF-ND1発現プラスミド（5461S, 5562AS）を用いた。 Bicistronic又はBidirectional promoterをトランスフェクションしたHEK293細胞の標的RHO配列のTide（Tracking of Indels by DEcomposition)解析の結果を示す。ヒストグラムのX軸の0はWTと同じ配列（InDel無し）、正方向はInsertion塩基数、負方向はDeletion塩基数を示し、Y軸はその頻度（百分率）を表す。Total effはInDelの頻度の合計（%)を示す。positive controlには、ZF-ND1発現プラスミド（5461S, 5562AS）を用いた。
１．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）
　本開示に係るZFNは、ロドプシン（RHO）遺伝子座のゲノム編集のために用いられ得るものであり、特定の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNの組み合わせである。ジンクフィンガーアレイは、３塩基配列を認識する１つのジンクフィンガー（ZF)が複数配列されてなる。ジンクフィンガーアレイは、２個以上のZFを含んでいてよく、例えば3-9個、好ましくは4-8個、より好ましくは5-7個、典型的には6個のZFからなるものであってよい。
　ZFのアミノ酸配列とZFが認識する３塩基配列との関係は公知であり、ZFのアミノ酸配列には、認識対象とする３塩基配列に応じて例えば非特許文献１のSupplemental Table 1に記載のアミノ酸配列を用いることができる。同一の３塩基配列に対して当該配列を認識するZFのアミノ酸配列は複数存在するため、同一の３塩基配列を認識するこれらのZFは互換的に用いられ得る。
　本開示に係るZFNは、以下の組み合わせから選択されるジンクフィンガーアレイを有する（後掲表１参照）。
（１）配列番号１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（２）配列番号５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（３）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（４）配列番号９の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（５）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（６）配列番号１３の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（７）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（８）配列番号３１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（９）配列番号３５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１０）配列番号３７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１１）配列番号３８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１２）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１３）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１４）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１５）配列番号４５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
（１６）配列番号４７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
　それぞれのZFNのジンクフィンガーアレイの認識配列とその配列番号、及びジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列を表１に示す。
　例えば、上記（１）の１対のZFNは、配列番号１の核酸配列（ATTCTTGGGTGGGAGCAG）を認識するジンクフィンガーアレイを有するセンス鎖ZFN 4350Sと、配列番号２の核酸配列（AAGGCCTGAGCTCAGCCA）を認識するジンクフィンガーアレイを有するアンチセンス鎖ZFN 4350ASの組み合わせである。ZFN 4350Sは配列番号５９のアミノ酸配列からなり、ZFN 4350ASは配列番号６０のアミノ酸配列からなる。
　例えばZFN 4350Sのジンクフィンガーアレイは、CAG, GAG, TGG, GGG, CTT及びATTをそれぞれ認識するZF91, ZF62, ZF106, ZF58, ZF103, ZF88（非特許文献１、Supplemental Table 1参照）をN末端側から順に連結したアミノ酸配列を有する。
　本開示に係るZFNは、切断活性の高さから、上記（２）（４）（５）（１０）（１２）（１３）（１４）のいずれかの組み合わせであることがより好ましい。
　本開示に係るZFNは、RHO遺伝子座において、RHO遺伝子のエキソン1の開始コドンよりも上流（RHO遺伝子座５‘UTR）の核酸配列をジンクフィンガーアレイにて認識して結合し、核酸切断ドメインによるDNA二本鎖の切断（DNA double-strand break；DSB）をもたらす。
　本開示に係るZFNの２つのジンクフィンガーアレイが認識する核酸配列間のスペーサーの長さは、特に限定されないが、例えば、1-20bp、好ましくは3-8bp、5bps又は6bpsの長さである。スペーサーの核酸配列は、１のジンクフィンガーアレイが認識する核酸配列と、他の１のジンクフィンガーアレイが認識する核酸配列との間の核酸配列として一義的に定まるものである。ZFNは、スペーサー配列中でDNA二本鎖を切断する。
　例えば、上記（１）の１対のZFNは、センス鎖ZFNの結合配列である配列番号１の核酸配列（ATTCTTGGGTGGGAGCAG）と、アンチセンス鎖ZFNの結合配列である配列番号２の核酸配列（AAGGCCTGAGCTCAGCCA）との間のスペーサー配列（CGCAGC）中でDNA二本鎖を切断する。
　本開示に係るZFNの核酸切断ドメインは、特に限定されず、FokI-NDや、特許文献２に記載されるND1及びND2並びにこれらの改変体であってよい。ND1を含む全長タンパク質（バチルス属SGD-V-76由来）のアミノ酸配列を配列番号５２に、その塩基配列を配列番号５３に示す。ND２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列を配列番号５４に、その塩基配列を配列番号５５に示す。ND１は、典型的には、配列番号５２の391～585位に相当する部分ペプチドであり、ND２は、典型的には、配列番号５４の389～579位に相当する部分ペプチドである。核酸切断ドメインは、ND1とされることが好ましい。
　ND1及びND2の改変体は、配列番号５２の391～585位または配列番号５４の389～579位に示されるアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加されているアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。ここで、「１ないし数個」とは、例えば1～10個、好ましくは1～6個であり、例えば、１個、２個、３個、４個または５個である。
　ND1及びND2の改変体は、配列番号５２の391～585位または配列番号５４の389～579位に示されるアミノ酸配列に対し、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「配列同一性」とは、配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）を求める方法は、当業者に公知である。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者に既知のいずれかのアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズム等）を利用すればよい。アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、BLASTP、FASTA等の配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
　ND1及びND2の改変体として、具体的には、FokIのアミノ酸配列における483位、487位及び496位に相当する位置にアスパラギン酸（D483、D487及びD496）を含む改変体（DDD型変異体）、又はFokIのアミノ酸配列における483位、487位及び537位に相当する位置にアルギニン（R483、R487及びR537）を含む改変体（RRR型変異体）が挙げられる。ND1のDDD型変異体（ND1DDD）は、配列番号５２の391～585位に相当する部分ペプチドにおいて103番目及び113番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列を有する（配列番号５７）。また、ND1のRRR型変異体（ND1RRR）は、配列番号５２の391～585位に相当する部分ペプチドにおいて100番目及び154番目のアミノ酸がアルギニンに置換されたアミノ酸配列を有する（配列番号５８）。
　本開示に係るZFNの核酸切断ドメインは、修飾アミノ酸および／または非天然アミノ酸を含むポリペプチドであってもよい。修飾アミノ酸としては、限定するものではないが、例えば、メチル化、エステル化、アミド化、アセチル化、アルキル化、ハロゲン化等が挙げられる。該修飾アミノ酸および非天然アミノ酸は、公知の方法によって導入することができる。
　核酸切断ドメインと、ジンクフィンガーアレイを含むジンクフィンガープロテイン（ZFP)は、直接連結されていてもよく、またはリンカーを介して連結されていてもよい。リンカーは、例えば、２以上のアミノ酸残基からなり、長さは特に限定されないが、例えば、2～20アミノ酸長、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12戸、13個、14個、14個、16個、17個、18個、19個または20個のアミノ酸長であってよい。リンカーの種類もまた特に限定されないが、例えば、TGGS（配列番号５６）が挙げられる。リンカーの有無およびリンカーの長さおよび種類は、核酸結合ドメインの種類等を考慮して当業者によって適宜選択される。
　本開示に係るZFNは、核酸切断ドメインに替えて、他のエフェクタードメインを有していてもよい。このようなエフェクタードメインとしては、Cytosine base editor (UGI, APOBEC)、Adenine base editor (TadA)、transcriptional activator (VP16)/repressor (SID)、 epigenomic editor (DNMT3A, TET1)、imaging protein (Dye, fluorescent protein)、transposase (PiggyBac)、recombinase (Flippase)等が挙げられる。
　本開示に係るZFNは、当該分野で既知の方法によってin vitro又はin vivoで製造することができる。例えば、アミノ酸配列情報を基に人工合成する方法や、ZFNをコードする核酸を人工合成し、適当な発現ベクター中に挿入し、次いで適当な宿主細胞中に導入して、該細胞内でZFNを発現させる方法が挙げられる。
２．ベクター
　本開示に係るベクターは、上述の１対のZFNをコードする核酸配列を含む。本開示に係るベクターは、一実施形態においてバイディレクショナル発現ベクターとされ、1対のZFNのうちセンス鎖ZFNとアンチセンス鎖ZFNとが別個のプロモーターの制御下で発現され、かつ、それら２つのプロモーターが逆向きに配列される。より具体的には、本開示に係るバイディレクショナル発現ベクターは、センス鎖ZFNをコードする核酸配列と該核酸配列の転写を制御するプロモーター配列と、アンチセンス鎖ZFNをコードする核酸配列と該核酸配列の転写を制御するプロモーター配列と、を含み、前記２つのプロモーター配列が、それらの間にスペーサー配列を有さずに連続して配列することが好ましい。
　本開示に係るベクターにおいて、２つのプロモーターには、従来公知のプロモーターを用いることができ、例えばCMVプロモーターやヒトEF1a（Elongation Factor alpha-1）プロモーター、PGK（phosphoglycerate kinase）プロモーター等を用いることができる。２つのプロモーターは、CMVプロモーターとヒトEF1aであることが好ましい。
　本開示に係るベクターは、ZFNをコードする核酸配列とプロモーター配列に加えて、従来の遺伝子発現ベクターが備える要素を含んでいてもよい。このような要素として、例えばpolyA付加配列（SV40 pA, HGH pA、ウサギグロビン pA等）が挙げられる。
　ベクターとしては、特に限定されず、当該分野で使用されるベクターから選択すればよい。ベクターの具体例としては、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクター（細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソームなど）、酵母染色体エレメント、ウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、これらの組み合わせに由来するベクター（コスミド、ファージミドなど）などが挙げられる。上述した中でも、汎用性の高さと言う観点からはプラスミドベクターが好ましい。また、臨床応用が進んでいるという観点からは、ウイルスベクターが好ましく、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）がより好ましい。
３．ゲノム編集方法等
　本開示は、上述のベクターをin vivo又はin vitroで、好ましくはin vitroで、視細胞に導入する手順を含む、視細胞のRHO遺伝子座のゲノム編集方法、並びに、ゲノム編集された視細胞の製造方法をも提供する。ZFNによるゲノム編集システムでは、gRNAのユビキタスな発現を伴うCasヌクレアーゼによるゲノム編集システムとは異なり、タンパク質にのみにより構成される。このため、ZFNによるゲノム編集システムでは、組織特異的プロモーターや薬剤応答型プロモーター等を利用することで目的とする組織特異的なゲノム編集を実現し易い。
　視細胞へのベクターの導入は、従来公知の手法によって行うことができる。導入方法としては、限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、パーティンクルガン法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、プロテイントランスダクション法等が挙げられる。
　ゲノム編集の目的に応じて、ベクターとともに、ドナーDNAが細胞に導入されてもよい。ドナーDNAは、例えば、正常なRHO遺伝子をコードするドナーDNAであってよい。ドナーDNAは、ZFNによるDNA二本鎖の切断部位における非相同末端連結修復（nonhomologous endjoining；NHEJ）あるいは相同組換え修復（homologous recombination；HR）等の修復機構を利用して正常RHO遺伝子を遺伝子座に導入し得るように構成されたものとできる。
　ドナーDNAを用いないゲノム編集の場合、切断部位は、主にNHEJにより修復される。NHEJはエラーが発生しやすいため、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。このようにして、RHO遺伝子座が切断部位において改変される。
　視細胞は、ヒト又は非ヒト動物由来のものであってよい。非ヒト動物は、偶蹄類（ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）などが挙げられる。
４．治療剤
　本開示は、上述のベクターを含む、RHO遺伝子に由来する疾患の治療剤をも提供する。治療剤は、上述した正常なRHO遺伝子をコードするドナーDNAを含み得る。
　また、上述のゲノム編集方法により得られたゲノム編集された視細胞は、細胞医薬として製剤化され得る。このような細胞医薬も、RHO遺伝子に由来する疾患の治療剤となり得る。
　治療剤は、常法に従って製剤することができる。具体的には、上述のベクター及び任意に上述のドナーＤＮＡを医薬品添加物と調合することによって、あるいは、ゲノム編集された視細胞を医薬品添加物と調合することによって、製剤することができる。
　医薬品添加物とは、製剤に含まれる有効成分以外の物質を意図する。医薬品添加物は、製剤化を容易にする、品質の安定化を図る、有用性を高めるなどの目的のために、製剤に含まれている。医薬品添加物の例としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤（固形防止剤）、着色剤、カプセル被膜、コーティング剤、可塑剤、矯味剤、甘味剤、着香剤、溶剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤（粘着剤）、粘稠剤、ｐＨ調整剤（酸性化剤、アルカリ化剤、緩衝剤）、湿潤剤（可溶化剤）、抗菌性保存剤、キレート剤、坐剤基材、軟膏基剤、硬化剤、軟化剤、医療用水、噴射剤、安定剤、保存剤等が挙げられる。これらの医薬品添加物は、意図された剤型および投与経路、ならびに標準的な薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択される。
　治療剤は、任意の剤型を取り得る。剤型の例としては、点眼剤、錠剤、カプセル剤、内用剤、外用剤、坐剤、注射剤、吸入剤が挙げられる。
　治療剤は、医師または医療従事者の判断により、適宜処方されうる。また、治療剤の投与量および投与計画も、医師または医療従事者の判断により、適宜決定されうる。
　治療剤の投与経路は、治療剤の剤型、処置しようとする疾患の種類および重篤度などの要素により、適宜選択される。投与経路の例としては、網膜下投与（Subretinal injection）、硝子体投与（Vitreous injection）および上脈絡膜腔投与（Suprachoroidal injection）が好適に採用される。
［実施例１：ZFの標的配列の同定］
１．候補配列の検索
　RHO遺伝子のエキソン1の開始コドンよりも上流に位置する100bpの領域において、ZFNによる2本鎖DNA切断を生じ得る領域を検索した。100bpの領域は、進化的な配列保存性が低い領域として選択した。
　ZFNが結合し得る候補配列の検索にはScripps研究所Barbas研究室より公開されているZFFinger Tools (https://www.scripps.edu/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php)を用いた。ZFN2量体のそれぞれのジンクフィンガーアレイの結合標的配列は18bp（6個のZFで構成）である。結合標的配列間（スペーサー）の塩基長を6bpもしくは5bpとした場合、34ペアの結合標的候補配列が提示された（表1参照）。
　各ZFのアミノ酸配列には、文献（“Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly", Wright et al., Nature Protocols, 2006, Vol.1, No.3, p.1637-52, Supplemental Table 1）に記載のアミノ酸配列を用いた。標的配列の3'末端側の3塩基配列毎に１個のZFを連結（合計6個）させてジンクフィンガーアレイとした。例えば、配列番号１の核酸配列（ATTCTTGGGTGGGAGCAG）を認識するジンクフィンガーアレイを有するセンス鎖ZFN 4350Sは、CAG, GAG, TGG, GGG, CTT及びATTをそれぞれ認識するZF91, ZF62, ZF106, ZF58, ZF103, ZF88（上記文献、SupplementalTable 1参照）をN末端側から順に連結したアミノ酸配列を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
２．結合標的候補配列に対するZFNの切断活性の評価
　ヌクレアーゼとして、ND1のDDD型変異体（ND1DDD、配列番号５７）及びRRR型変異体（ND1RRR、配列番号５８）を用いて、SSA(Single strand annealing)解析により各結合標的候補配列に対する切断活性を評価した。
　SSA解析は、細胞内のDNA切断が起きた場合の遺伝子修復機構である遺伝子相同組換えやシングルストランドアニーリング（SSA）を利用して、結合標的配列に対するZFNの切断活性を定量評価するものである。解析には、HEK293細胞と、以下の発現ベクターを用いた。
（１）ZF-ND1発現プラスミド（pCMV-ZF-ND1DDD, pCMV-ZF-ND1RRR）
　CMVプロモーターの制御下に「ZF-ND1」を発現するプラスミドである。
　「ZF-ND1」との表記において、「ZF」は表1に掲げる34組のZFNペアのセンス鎖及びアンチセンス鎖のZFNの一方を示し、「ND1」はND1ヘテロ2量体のサブユニット（ND1DDD及びND1RRR）の一方を示す。センス鎖ZFNにはND1DDDを用い、アンチセンス鎖ZFNにはND1RRRを用いた。「ZF」の５′側には核移行シグナル（NLS）を結合し、「ZF」と「ND1」はリンカー配列（Thr-Gly- Gly -Ser：配列番号５６）で連結した。「ND1」の３′側にはpolyA配列を付加した。polyA配列には、ウサギbeta-globinのpolyA配列を用いた。
（２）EGFP断片発現プラスミド（pCAG-EGxxFP）
　CAGプロモーターの制御下にEGFPを発現するプラスミドである。
　EGxxFPは、EGFP遺伝子の1-600bpの断片、停止コドン、マルチクローニングサイト、及びEGFP遺伝子の120-720bpの断片で構成され、マルチクローニングサイトに結合標的候補配列が挿入される。
　pCAG-EGxxFPプラスミドは、結合標的候補配列がZF-ND1で切断されない場合はEGFP遺伝子の1-600bpの断片直後の停止コドンにより不完全なGFPを発現する。一方、結合標的候補配列がZF-ND1で切断させる場合は、EGFP遺伝子の120-720bpの断片の重複配列間で遺伝子相同組換えやシングルストランドアニーリング（SSA）が起き、完全なEGFP遺伝子が発現し、EGFP蛍光を生じる。
　トランスフェクション試薬（FuGene6 (Promega)もしくはViafect (Promega)）を使用し添付プロトコールに準拠して、pCMV-ZF-ND1DDD、pCMV-ZF-ND1RRR及びpCAG-EGxxFPをHEK293細胞に導入した。トランスフェクション48時間後に蛍光像を撮影した。結果を図１に示す。34組の結合標的候補配列のうち16ペア（1, 3-8, 16, 18-23, 30, 32番）でEGFPの緑色蛍光を認め、結合標的配列においてZF-ND1による切断が生じていることが確認された。3，5，6，19，21-23番のペアでは高い蛍光強度を認め、特に高い切断活性が確認された。
［実施例２：高発現ベクターコンストラクトの検討］
　ZFNの高発現プラスミドベクターを検討した。
　一般に、2種類の遺伝子を発現させる手法として、1つのプロモーターで2種類の遺伝子を発現させる手法（Bicistronic発現）と、異なる2つのプロモーターでそれぞれの遺伝子を発現させる手法がある。
　本実施例では、前者の例としてCMVプロモーターの制御下にZF-S-ND1DDD及びZF-AS-ND1RRRを自己消化ペプチド（Furin-P2A)で連結して組み込んだプラスミドベクター（以下「Bicistronic」と称する）を作成した。また、後者の例として、CMVプロモーターとヒトEF1a（Elongation Factor alpha-1）プロモーターを同一方向（Dual promoter）に配列したプラスミドベクター（以下「Dual promoter」と称する）と、逆方向に配列したプラスミドベクター（以下「Bidirectional promoter」と称する）を作成した。各プラスミドベクターの構成を図２に示す。Dual promoter及びBidirectional promoterは、EF1aプロモーターの制御下にZF-S-ND1DDDを発現し、CMVプロモーターの制御下にZF-AS-ND1RRRを発現する。ZFの標的結合配列（ZF-S, ZF-AS）には、表１の22番のペア（5461S, 5562AS）を用いた。Dual promoterでは、2つの遺伝子発現の干渉を防ぐためのインスレーター配列を配置した。
　Bicistronic、Dual promoter及びBidirectional promoterの各プラスミドベクターを用いて、実施例１と同様にしてSSA解析を実施した。ポジティブコントロールとして、実施例１の22番のペアのZF-ND1発現プラスミド（positive control）を用いた。
　結果を図３に示す。Dual promoterではEGFP発現がほとんど認められなかった。また、Bicistronicではpositive controlに比してEGFPシグナルの減弱を認めた。一方、Bidirectional promoterではpositive controlと同等のEGFP発現が認められた。
　Bicistronic及びBidirectional promoterの各プラスミドベクターを用いて、Cel-I解析より標的RHO配列におけるInDel (Insertion and Deletion)頻度を比較した。ポジティブコントロールとして、実施例１の22番のペアのZF-ND1発現プラスミド（positive control）を用いた。各プラスミドコンストラクトをトランスフェクションしたHEK293細胞のゲノムDNAを用い、GeneArt Genomic Cleavage Detection kit (ThermoFisher Scientific)の推奨プロトコールによりCel-I解析を実施した。PCRにより増幅した標的RHO配列をCel-Iヌクレアーゼにより処理し、電気泳動した結果を図４に示す。また、PCR増幅産物をダイレクトシークエンスし、得られたElectrophenogramをTide（Tracking of Indels by DEcomposition)解析サイト（http://shinyapps.datacurators.nl/tide/）で定量した結果を図５に示す。図５はInDelのヒストグラムを示し、X軸の0はWTと同じ配列（InDel無し）、正方向はInsertion塩基数、負方向はDeletion塩基数を示し、Y軸はその頻度（百分率）を表す。Total effはInDelの頻度の合計（%)を示す。
　非トランスフェクション細胞のゲノムDNAでは、345bpにバンドが確認される（図４レーン2参照）。positive controlでは、InDelが起きているためCel-Iヌクレアーゼによる切断に起因する2本のバンド（220bp, 130bp）が認められ（図４レーン3, 5参照）、InDelの頻度は25.7％であった（図５参照）。Bicistronicでは、positive controlに比して切断DNA量が減少し（図４レーン4参照）、InDelの頻度も4.6％と低かった（図５参照）。一方、Bidirectional promoterでは、positive controlと同量の切断DNA量（図４レーン6参照）と、同等頻度のInDelが認められた（図５参照）。
　本実施例の結果から、Bidirectional promoterによれば、2種類の遺伝子を1つのコンストラクトに統合でき、AAV遺伝子治療製剤等の産業利用に有用であることが示された。
配列番号１：ZFN 4350Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２：ZFN 4350ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３：ZFN 4653Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４：ZFN 4653ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号５：ZFN 4956Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号６：ZFN 4956ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号７：ZFN 5158Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号８：ZFN 5158ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号９：ZFN 5259Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１０：ZFN 5259ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１１：ZFN 5461Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１２：ZFN 5461ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１３：ZFN 5562Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１４：ZFN 5562ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１５：ZFN 5764Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１６：ZFN 5764ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１７：ZFN 5865Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１８：ZFN 5865ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号１９：ZFN 6067Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２０：ZFN 6067ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２１：ZFN 6168Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２２：ZFN 6168ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２３：ZFN 7178Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２４：ZFN 7178ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２５：ZFN 7481Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２６：ZFN 7481ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２７：ZFN 7784Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２８：ZFN 7784ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号２９：ZFN 8087Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３０：ZFN 8087ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３１：ZFN 8289Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３２：ZFN 8289ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３３：ZFN 8592Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３４：ZFN 8592ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３５：ZFN 8895Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３６：ZFN 8895ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３７：ZFN 4955Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３８：ZFN 5157Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号３９：ZFN 6874Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４０：ZFN 6874ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４１：ZFN 7177Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４２：ZFN 7480Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４３：ZFN 7783Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４４：ZFN 8086Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４５：ZFN 8288Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４６：ZFN 8591Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４７：ZFN 8892Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４８：ZFN 9197Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号４９：ZFN 9197ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号５０：ZFN 9410Sのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号５１：ZFN 9410ASのジンクフィンガーアレイの認識配列
配列番号５２：ND1を含む全長タンパク質（バチルス属SGD-V-76由来）のアミノ酸配列
配列番号５３：ND1を含む全長タンパク質（バチルス属SGD-V-76由来）のヌクレオチド配列
配列番号５４：ND２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列
配列番号５５：ND２を含む全長タンパク質（ボツリヌス菌由来）のアミノ酸配列のヌクレオチド配列
配列番号５６：ペプチドリンカーのアミノ酸配列
配列番号５７：ND1DDDのアミノ酸配列
配列番号５８：ND1RRRのアミノ酸配列
配列番号５９：ZFN 4350Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６０：ZFN 4350ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６１：ZFN 4653Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６２：ZFN 4653ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６３：ZFN 4956Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６４：ZFN 4956ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６５：ZFN 5158Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６６：ZFN 5158ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６７：ZFN 5259Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６８：ZFN 5259ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号６９：ZFN 5461Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７０：ZFN 5461ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７１：ZFN 5562Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７２：ZFN 5562ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７３：ZFN 5764Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７４：ZFN 5764ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７５：ZFN 5865Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７６：ZFN 5865ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７７：ZFN 6067Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７８：ZFN 6067ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号７９：ZFN 6168Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８０：ZFN 6168ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８１：ZFN 7178Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８２：ZFN 7178ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８３：ZFN 7481Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８４：ZFN 7481ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８５：ZFN 7784Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８６：ZFN 7784ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８７：ZFN 8087Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８８：ZFN 8087ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号８９：ZFN 8289Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９０：ZFN 8289ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９１：ZFN 8592Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９２：ZFN 8592ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９３：ZFN 8895Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９４：ZFN 8895ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９５：ZFN 4955Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９６：ZFN 5157Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９７：ZFN 6874Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９８：ZFN 6874ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号９９：ZFN 7177Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１００：ZFN 7480Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０１：ZFN 7783Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０２：ZFN 8086Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０３：ZFN 8288Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０４：ZFN 8591Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０５：ZFN 8892Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０６：ZFN 9197Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０７：ZFN 9197ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０８：ZFN 9410Sのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列
配列番号１０９：ZFN 9410ASのジンクフィンガーアレイのアミノ酸配列

Claims (7)

  1. 　ロドプシン（RHO）遺伝子座のゲノム編集のための、１対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）の組み合わせであって、以下の群から選択される組み合わせ。
    （１）配列番号１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （２）配列番号５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （３）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （４）配列番号９の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （５）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （６）配列番号１３の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （７）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （８）配列番号３１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （９）配列番号３５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１０）配列番号３７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１１）配列番号３８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１２）配列番号７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１０の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１３）配列番号１１の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１４の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１４）配列番号１５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号１８の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１５）配列番号４５の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３２の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
    （１６）配列番号４７の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNと、配列番号３６の核酸配列を認識するジンクフィンガーアレイを有するZFNとの組み合わせ。
  2. 　ZFNの核酸切断ドメインが、ND1である、請求項１に記載の組み合わせ。
  3. 　請求項１に記載の１対のZFNをコードする核酸配列を含むベクター。
  4. 　バイディレクショナル発現ベクターであり、
    　センス鎖ZFNをコードする核酸配列と該核酸配列の転写を制御するプロモーター配列と、
    　アンチセンス鎖ZFNをコードする核酸配列と該核酸配列の転写を制御するプロモーター配列と、を含み、
    前記２つのプロモーターが、それらの間にスペーサー配列を有さずに連続して配列する、請求項３に記載のベクター。
  5. 　請求項３又は４に記載のベクターを含む、RHO遺伝子に由来する疾患の治療剤。
  6. 　請求項３又は４に記載のベクターを視細胞に導入する手順を含む、RHO遺伝子座のゲノム編集方法。
  7. 　請求項３又は４に記載のベクターを視細胞に導入する手順を含む、RHO遺伝子がゲノム編集された視細胞の製造方法。
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