WO2024253141A1 - ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶブレイクスルー感染症状の予測 - Google Patents

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WO2024253141A1
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breakthrough
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哲也 中面
太郎 齊藤
有基 片山
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Minaris Medical Co Ltd
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National Cancer Center Japan
Minaris Medical Co Ltd
National Cancer Center Korea
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present disclosure relates to vaccination against SARS-associated coronavirus. More specifically, the present disclosure relates to an assay that is useful for predicting symptoms of infection after vaccination in recipients of a SARS-associated coronavirus vaccine.
  • SARSr-CoV includes SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2, which are the same SARSr-CoV species but are different lineages that suddenly emerged in different years.
  • SARSr-CoV Both have a single-stranded, positive-stranded RNA genome of approximately 30,000 bases, can infect human cells using human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as a receptor, and share common characteristics as the same type of virus, including the ability to cause severe respiratory disease in humans.
  • ACE2 human angiotensin-converting enzyme 2
  • SARSr-CoV-2 caused a pandemic for several years after its sudden outbreak in 2019, and continues to infect people as of the time of filing this application.
  • SARSr-CoV is a coronavirus that has four major structural proteins, specifically the spike (S) protein, the envelope (E) protein, the membrane (M) protein, and the nucleocapsid (N) protein.
  • the spike protein is a large type I transmembrane protein consisting of two regions called S1 and S2, with S1 mainly containing the receptor-binding domain that recognizes receptors on the cell surface, and S2 containing elements necessary for membrane fusion.
  • cellular immunity is an immune response system that recognizes foreign substances, such as pathogens, that have invaded the body, and activates CD4 + T cells and/or CD8 + T cells via antigen-presenting cells, thereby eliminating the foreign substances (or cells that contain the foreign substances, such as infected cells).
  • foreign substances such as pathogens
  • CD4 + T cells and/or CD8 + T cells via antigen-presenting cells, thereby eliminating the foreign substances (or cells that contain the foreign substances, such as infected cells).
  • Different individuals may have different cellular immune response capabilities, depending on, for example, their infection or vaccination history with the pathogen of interest or a pathogen structurally related thereto, or on biological or environmental individual differences whose details have yet to be elucidated.
  • Cellular immune response activity can be measured by adding an antigen derived from a pathogen or the like to a sample containing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) derived from a subject to stimulate white blood cells such as T cells contained in the PBMCs, and then detecting effector molecules such as cytokines (e.g., interferon- ⁇ ) produced by the stimulated white blood cells, or by detecting white blood cells expressing effector molecules.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Non-Patent Document 1 ELISpot technology
  • Non-Patent Document 2 ELISA
  • Non-Patent Document 3 a method using flow cytometry technology
  • SARSr-CoV infection can experience symptoms that range from mild, similar to the common cold, to severe, including severe respiratory problems due to pneumonia and potentially fatal illness.
  • SARS-CoV-2 infection COVID-19
  • COVID-19 SARS-CoV-2 infection
  • the SARSr-CoV vaccination is, of course, provided with the aim of preventing infection.
  • infection can occur after vaccination despite being vaccinated, which is called breakthrough infection.
  • breakthrough infection even if a breakthrough infection does occur after vaccination, the symptoms may be milder than in cases of infection without vaccination.
  • the present disclosure provides a method for collecting data to predict symptoms in a breakthrough infection of SARSr-CoV.
  • the present disclosure includes the following embodiments.
  • [1] 1.
  • the plurality of peptides correspond to a plurality of fragments of the amino acid sequence of the SARSr
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • FIG. 1 shows the relationship between the spike protein coverage rate of the peptide pool used to stimulate a specimen and the sensitivity of the cellular immune response activity assay based on the measurement of interferon- ⁇ mRNA expression level.
  • FIG. 2 shows a comparison of interferon- ⁇ mRNA expression levels (a, c) measured by stimulating samples from breakthrough infected individuals with different symptoms with different peptide pools according to the method of an embodiment of the present disclosure, and ROC curve analysis (b, d) based on the measurement results.
  • Figure 3 shows a comparison of the amount of interferon- ⁇ protein secreted by ELISpot, a conventional cellular immune assay, when samples from breakthrough infected individuals with different symptoms were stimulated with different peptide pools (a, c), and the ROC curve analysis based on the measurement results (b, d).
  • Figure 4 shows (a) the results of measuring and comparing anti-spike protein antibody titers in samples from breakthrough infected individuals with different symptoms, and (b) the ROC curve analysis based on the measurement results.
  • FIG. 1 shows a comparison of the amount of interferon- ⁇ protein secreted by ELISpot, a conventional cellular immune assay, when samples from breakthrough infected individuals with different symptoms were stimulated with different peptide pools (a, c), and the ROC curve analysis based on the measurement results (b, d).
  • Figure 4 shows (a) the results of measuring and comparing anti-spike protein antibody titers in samples from breakthrough infected individuals with different symptoms, and (b) the ROC
  • FIG. 5 shows a comparison of interferon- ⁇ (a), CXC motif chemokine ligand 9 (c), CXC motif chemokine ligand 10 (e), and interleukin-1A (g) mRNA expression levels measured by stimulating samples from breakthrough infected individuals with different symptoms with a peptide pool (PepGen Sf) corresponding to the spike protein of the SARS-CoV-2 standard strain according to the method of the embodiment of the present disclosure, as well as ROC curve analysis based on each measurement result (interferon- ⁇ (b), CXC motif chemokine ligand 9 (d), CXC motif chemokine ligand 10 (f), interleukin-1A (h)).
  • FIG. 6 shows a comparison of interferon- ⁇ (a) and CXC motif chemokine ligand 9 (c) mRNA expression levels measured by stimulating samples from breakthrough infected individuals with different symptoms with a peptide pool (PepGen So) corresponding to the spike protein of the SARS-CoV-2 Omicron strain according to the method of an embodiment of the present disclosure, as well as ROC curve analysis based on each measurement result (interferon- ⁇ (b), CXC motif chemokine ligand 9 (d)).
  • the present disclosure provides a method for collecting data in a subject vaccinated with SARSr-CoV to predict symptoms of breakthrough infection following vaccination.
  • a subject vaccinated with SARSr-CoV is also referred to simply as a "vaccinatee.”
  • the spike (S) protein is the protein responsible for initiating infection into human cells, and SARSr-CoV vaccines typically induce an immune response against the spike protein.
  • SARSr-CoV vaccines typically contain the spike protein or a portion thereof, or the genetic material (e.g., mRNA) encoding them. It will be understood by those skilled in the art that the sequences of these proteins or portions thereof, or the genetic material encoding them, in the vaccine may include those that have been modified compared to the authentic virus, so long as they are capable of inducing an immune response against the spike protein.
  • the vaccine recipient may be a recipient who has received one, two, three, or four or more vaccinations.
  • the sample may be collected, for example, within three years, within two years, within one year, within six months, or within three months after any vaccination.
  • the SARSr-CoV may be, for example, SARS-CoV-1. Although SARS-CoV-1 infections have not been reported substantially since 2004, re-emergence cannot be ruled out, and embodiments may be contemplated in which previously cryopreserved specimens are used to perform the disclosed methods for some validation.
  • the SARSr-CoV may be, for example, SARS-CoV-2, in which case the SARSr-CoV infection may be referred to as COVID-19.
  • the method of this embodiment includes: (1) preparing a specimen containing white blood cells collected from the subject; (2) adding a plurality of peptides to the sample and incubating the sample with the plurality of peptides in an aqueous medium; (3) After step (2), measuring the expression level of mRNA of any T cell function-related marker selected from the group consisting of interferon-gamma (hereinafter referred to as IFN-gamma or IFNG), CXC motif chemokine ligand 9 (hereinafter referred to as CXCL9), CXC motif chemokine ligand 10 (hereinafter referred to as CXCL10), and interleukin-1A (hereinafter referred to as IL-1A) in the leukocytes.
  • IFN-gamma or IFNG interferon-gamma
  • CXCL9 CXC motif chemokine ligand 9
  • CXCL10 CXC motif chemokine ligand 10
  • IL-1A interle
  • the method is carried out ex vivo using a sample derived from a subject.
  • the subject in the present disclosure is a mammal, preferably a primate, and particularly preferably a human.
  • the above markers IFN-gamma, CXCL9, CXCL10, and IL-1A are shown by their human names, but the same markers may be called by different names depending on the animal species or the context.
  • the specimen containing white blood cells may be, for example, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) separated from blood, or even further purified white blood cells themselves.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • whole blood can be advantageously used as the specimen, eliminating the time and effort required for isolating PBMCs.
  • a specimen that is whole blood may contain an anticoagulant such as heparin.
  • a specimen "collected from a subject” means a specimen derived from a subject, and may be a specimen "collected from a subject” even after undergoing, for example, anticoagulation treatment or PBMC separation.
  • a specimen such as whole blood collected from a subject is usually stored in a blood collection tube. Examples of blood collection tubes include EDTA blood collection tubes and sodium heparin blood collection tubes. Sodium heparin blood collection tubes are more preferable because EDTA may affect the cell activity of lymphocytes.
  • step (1) refers to the stage of obtaining or preparing a sample that can be used for carrying out step (2) and subsequent steps.
  • the preliminary step of directly collecting a sample from the subject's body e.g., drawing blood
  • step (1) it does not matter whether the person who carried out the preliminary step was the person who carried out the method of this embodiment.
  • examples of white blood cells include lymphocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, and monocytes.
  • Monocytes differentiate into macrophages or dendritic cells, so macrophages and dendritic cells belong to white blood cells.
  • lymphocytes include T cells, B cells, and natural killer cells.
  • the specimen containing white blood cells of the present disclosure such as whole blood, PBMC, etc., may contain antigen-presenting cells such as B cells, monocytes, macrophages, and dendritic cells.
  • the T cells in the specimen may include CD4 + T cells and CD8 + T cells.
  • multiple peptides refers to a group of peptides of 8 to 30 amino acids in length that includes multiple types of peptides in the sense that they differ from each other in their amino acid sequences. For example, even if two peptides share part of the same sequence, if one or more amino acid residues not present in the first peptide are added to the end of the second peptide, these two peptides can be said to have "different amino acid sequences from each other.”
  • the multiple peptides used in this embodiment are multiple peptides that correspond to multiple fragments of the amino acid sequence of the SARSr-CoV spike protein.
  • each of the peptides included in the multiple peptides is a peptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence of the spike protein that constitutes the SARSr-CoV virus. It is not necessary that these peptides are fragments obtained by fragmentation processing of the spike protein, and in fact, the peptides in this embodiment can typically be chemically synthesized peptides.
  • the multiple peptides "cover 40% or more of the full length amino acid sequence of the SARSr-CoV spike protein" means that when all peptides in the multiple peptides are aligned to their corresponding positions in the full length amino acid sequence of the spike protein, 40% or more of the amino acid residue positions in the full length amino acid sequence (1273 residues in total in the SARS-CoV2 Wuhan-Hu-1 strain) are covered.
  • the percentage representing how many of the total amino acid residues in the full length amino acid sequence are covered by the peptides when all peptides contained in the multiple peptides are aligned to their corresponding positions in the full length amino acid sequence of the corresponding target protein is called the "coverage rate.”
  • the coverage rate Conventionally, lymphocytes have been stimulated with peptides that cover less than 40% of the full length amino acid sequence (e.g., a set of known MHC class I or II restricted peptides, a peptide-based vaccine or vaccine candidate, etc.) to measure T cell activation, but in a system for predicting breakthrough infection symptoms based on mRNA levels, this coverage is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more or 80% or more, and a coverage of 90% or more allows for highly reliable prediction. A coverage of 100% is particularly preferable.
  • the multiple peptides covering 40% or more of the full length amino acid sequence of the SARSr-CoV spike protein are preferably multiple peptides corresponding to fragments of the amino acid sequence of the SARSr-CoV spike protein that are 15 to 20 amino acids long.
  • the peptides in the "multiple peptides" in this embodiment are preferably 15 to 20 amino acids long, more preferably 15 to 18 amino acids long, and even more preferably 15 amino acids long.
  • MHC molecules expressed on the surface of antigen-presenting cells are highly diverse, and the sequences and lengths of peptides that can bind vary greatly between individuals. For this reason, it is preferable to use peptide chains of 15 amino acids or more rather than peptide chains of 14 amino acids or less that contain Class I or Class II peptides that can bind directly to MHC molecules.
  • peptide chains of 15 amino acids or more By mixing a peptide chain of 15 amino acids or more with antigen-presenting cells contained in a specimen, it is believed that it will be taken up by the antigen-presenting cells, broken down into Class I or Class II peptides within the cells, presented as an antigen on the cell surface, and become recognizable by antigen-specific T cells contained in the same specimen.
  • adjacent peptides overlap each other by 10 to 14 amino acids along the amino acid sequence of the spike protein.
  • This may mean that, on the amino acid sequence of the SARSr-CoV spike protein, the N-terminal residue of the nth peptide is located upstream of the N-terminal residue of the adjacent n+1th peptide, but the sequence of 10 to 14 residues after the N-terminal residue of the n+1th peptide is common to both peptides.
  • This overlap may be, for example, 10 to 11 amino acids, with an overlap of 11 amino acids being a particularly preferred example.
  • the "adjacent peptide” may mean the peptide closest to the reference peptide (i.e., the peptide that provides the shortest N-terminus-N-terminus distance) that has an N-terminus that overlaps with the reference peptide (i.e., the peptide that provides the shortest C-terminus-C-terminus distance).
  • the reference peptide i.e., the peptide that provides the shortest N-terminus-N-terminus distance
  • the peptide that provides the shortest C-terminus-C-terminus distance i.e., the peptide that provides the shortest C-terminus-C-terminus distance
  • Adding a plurality of peptides to a specimen means combining the specimen with the plurality of peptides, and is synonymous with "adding a specimen to a plurality of peptides.”
  • These peptides incubated with the specimen are taken up by antigen-presenting cells in the specimen, and in some cases are further decomposed into shorter peptides, and presented on the cell surface as antigens together with MHC class I or class II molecules, which can be recognized by T cells.
  • the plurality of peptides may include peptides containing an amino acid sequence recognized by CD4 + lymphocytes and peptides containing an amino acid sequence recognized by CD8 + lymphocytes.
  • ICS intracellular cytokine staining
  • peptide uptake, antigen presentation, and antigen recognition by living cells can be performed in an aqueous medium in vitro or ex vivo, and a person skilled in the art can select or prepare an aqueous medium suitable for the purpose based on common knowledge.
  • the aqueous medium can be, for example, a liquid medium for cell culture. Whole blood is typically maintained in an aqueous medium, and the aqueous medium may be used as the aqueous medium in the method of this embodiment.
  • step (2) of the method of this embodiment the sample and the multiple peptides that satisfy the above conditions added to the aqueous medium are incubated.
  • the incubation may be performed at a temperature in the range of 30°C to 40°C, and preferably at 37°C ⁇ 0.5°C.
  • the incubation time may be, for example, in the range of 1 hour to 8 hours.
  • the incubation may be for 1 hour to 2 hours, 2 hours to 3 hours, 3 hours to 4 hours, 4 hours to 5 hours, 5 hours to 6 hours, 6 hours to 7 hours, 6 hours to 8 hours, 1 hour to 4 hours, or 2 hours to 6 hours, and is preferably 2 to 4 hours.
  • the concentration of the multiple peptides as a whole may be, for example, 0.1 to 20 ⁇ g/mL, 0.2 to 10 ⁇ g/mL, or 0.5 to 5 ⁇ g/mL.
  • peptide uptake, antigen presentation, and antigen recognition by live cells occurred, and it was further found that differences in mRNA levels occurred that could correlate with symptoms in breakthrough infection. Because post-transcriptional regulation can also contribute to increased expression of T cell effector molecules (Immunology.
  • the method of the present embodiment may be able to particularly accurately detect specific cellular immune system states that correlate with the presence or absence of symptoms in breakthrough infections.
  • the method of this embodiment may further include, after the above-mentioned step (2) and before step (3), a step (2a) of freezing the sample, and a step (2b) of thawing the sample frozen in step (2a).
  • step (1) includes freezing and thawing the sample before peptide stimulation.
  • IFN ⁇ , CXCL9, CXCL10, and IL-1A are known T cell function-related markers. These markers are induced to be expressed in stimulated white blood cells as part of cellular immunity, and serve as indicators of cellular immune response activity.
  • Non-limiting examples of techniques that can measure the mRNA levels of these markers include hybridization-based methods such as Northern blots and microarrays, RNase protection methods, and RNA-Seq (sequencing) methods. In terms of speed, simplicity, reliability, etc., reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) methods are preferred, and real-time RT-PCR methods are particularly preferred because of their excellent quantitative properties.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • RT-PCR methods examples include the SYBR (registered trademark) Green method and the TaqMan (registered trademark) method.
  • SYBR registered trademark
  • TaqMan registered trademark
  • PCR devices With the spread of SARS-CoV-2, PCR devices have become increasingly popular for infection testing, so it is advantageous to be able to carry out the method of this embodiment using the RT-PCR method.
  • the loop mediated isothermal amplification (LAMP) method the helicase dependent amplification method, the rolling circle amplification method, the recombinase polymerase amplification method, the invader assay method, and the like, which are constant temperature nucleic acid amplification methods that can be used easily and quickly in clinical settings, are also preferred.
  • the digital droplet PCR method and the digital droplet LAMP method which have higher quantitative properties, are also preferred.
  • red blood cells and blood components other than white blood cells may be removed from the whole blood sample, if desired.
  • whole blood is used without removal or isolation of any particular cell type.
  • the markers may be measured after RNA is extracted from the whole blood using a Total RNA extraction method using common commercially available magnetic beads, centrifugal columns, etc.
  • white blood cells are isolated through the use of a device for isolating and amplifying mRNA. An embodiment of this device is described in more detail in U.S. Patent Nos. 7,745,180, 7,968,288, 7,939,300, 7,981,608, and 8,076,105, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • step (3) may be an RT-PCR method comprising the following steps (a) to (d): (a) removing red blood cells and non-leukocyte blood components from whole blood by filtration through a filter membrane to obtain white blood cells on the filter membrane; (b) lysing the leukocytes to produce a lysate containing mRNA; (c) transferring the lysate to an oligo(dT)-immobilized substrate (e.g., an oligo(dT)-immobilized plate) to capture the mRNA onto the oligo(dT); and (d) measuring the mRNA levels by RT-PCR.
  • an oligo(dT)-immobilized substrate e.g., an oligo(dT)-immobilized plate
  • the sample containing the specimen after incubation obtained in step (2) is added to a sample introduction well of a filter plate, incubated, and filtered using centrifugal force.
  • leukocytes can be captured on the filter membrane.
  • a suitable example of a filter membrane that is a leukocyte capture filter is a polybutylene terephthalate (PBT) fiber membrane.
  • the incubation can be performed at a temperature in the range of 20°C to 40°C.
  • the incubation time can vary from 1 second to 1 hour.
  • the incubation can be for 1 second to 1 minute, 1 minute to 1 hour, 1 minute to 20 minutes, 2 minutes to 20 minutes, 5 minutes to 15 minutes, or 7 minutes to 12 minutes.
  • Step (b) may be a step of lysing the cells using a cell lysis buffer.
  • Cell lysis buffers capable of lysing the cells to release intracellular RNA are known to those skilled in the art.
  • Step (c) is a step of transferring the lysate obtained in step (b) to an oligo(dT)-immobilized substrate and incubating for, for example, 1 hour, 1 to 3 hours, 1 to 24 hours, or 16 to 24 hours to capture mRNA onto the oligo(dT).
  • Step (d) is (i) adding primers and reverse transcriptase to the mRNA isolated via capture on oligo(dT) in (c) to create complementary DNA (cDNA); and (ii) contacting the cDNA with sense and antisense primers specific to the nucleic acid sequence of any T cell function associated marker selected from the group consisting of IFN ⁇ , CXCL9, CXCL10, and IL-1A, and with DNA polymerase to create amplified DNA.
  • the term "primer” refers to an oligonucleotide primer.
  • the mRNA of the T cell function-associated marker (represented by the amount of detected PCR-amplified cDNA) is quantified.
  • the quantification is calculated by comparing the amount of the mRNA encoding the T cell function-associated marker with a reference value.
  • the reference value is the expression level of a gene, e.g., a housekeeping gene, whose expression is not induced or suppressed by a stimulant (e.g., an antigenic peptide).
  • the expression level of ⁇ -actin is used as the reference value. Any of a number of other housekeeping genes known in the art may also be used as the reference value.
  • the expression level of the mRNA can be evaluated based on the cycle threshold (Ct value) obtained by the real-time RT-PCR method.
  • Ct value cycle threshold
  • the expression amount of the marker between samples can be easily compared by normalizing the Ct value of the marker of interest with the Ct value of the housekeeping gene.
  • the detection amounts of the marker gene to be measured and the housekeeping gene are measured, the marker gene is normalized using the Ct value of the housekeeping gene, and the normalized Ct value is converted to the gene expression level, thereby making it possible to roughly estimate the amount of marker gene mRNA whose expression has changed (e.g., increased) due to a stimulus.
  • Gene expression level 2 (-Ct value[marker]+Ct value[housekeeping gene])
  • log 2 (Gene expression level) -Ct value [marker] + Ct value [housekeeping gene]
  • the expression level of any T cell function-associated marker selected from the group consisting of IFN ⁇ , CXCL9, CXCL10, and IL-1A induced by a stimulant can be compared with the expression level of the same T cell function-associated marker from a non-induced (solvent control) sample to evaluate a change in the expression level of the T cell function-associated marker due to stimulation.
  • the degree of induction can be estimated by a fold increase (F.I.) value or a value derived therefrom, which is obtained by comparing the gene expression level of the induced marker with the gene expression level of the non-induced marker. For example, log2F . I.
  • the peptide antigen stimulation-specific mRNA expression level can be calculated as log 2 F.I.
  • the log 2 F.I. is an index for evaluating how many times the mRNA expression level of a stimulated sample is compared with the mRNA expression level of an unstimulated sample. For example, when the log 2 F.I.
  • mRNA expression level if the expression level of mRNA of any T cell function-related marker selected from the group consisting of IFN ⁇ , CXCL9, CXCL10, and IL-1A (hereinafter simply referred to as "mRNA expression level") is equal to or higher than the predicted reference level, it is predicted that the subject will be asymptomatic in the event of breakthrough infection, and if it is below the predicted reference level, it is predicted that the subject will develop symptoms in the event of breakthrough infection.
  • the symptoms referred to here are symptoms that an infected person can sense. Symptoms of SARSr-CoV infection that an infected person can sense include fever, cough, shortness of breath, chills, shivering with chills, muscle pain, headache, sore throat, taste disorder, smell disorder, pneumonia symptoms, and difficulty breathing.
  • the predicted reference level can be set appropriately by the practitioner depending on the specific type of assay measuring mRNA expression levels and the strictness of prediction required for each embodiment. For example, a higher predicted reference level will increase the specificity of the prediction that breakthrough infection will result in asymptomatic outcomes, making it more useful, for example, for screening subjects who should be particularly wary of asymptomatic infections. A lower predicted reference level will increase the sensitivity of the prediction that breakthrough infection will result in asymptomatic outcomes, improving the ability to predict without missing subjects who may have asymptomatic infections.
  • the predicted reference level may be a predefined value.
  • the predicted reference level may be a predefined value based on corresponding mRNA expression levels of a plurality of breakthrough infected individuals (also referred to in this disclosure as reference breakthrough infected individuals) in which it has been determined whether the breakthrough infection after sample collection was asymptomatic or symptomatic. It is preferable to use a predicted reference level determined based on mRNA expression measurements of at least 7 or more, 8 or more, 10 or more, 20 or more, or 50 or more asymptomatic or symptomatic breakthrough infected individuals.
  • the "corresponding mRNA expression level" here refers to the mRNA expression level in a sample collected from the reference breakthrough infected individual after vaccination and before breakthrough infection.
  • Corresponding means that the type of sample and the type of assay for measuring the mRNA expression level are the same as those of the predicted individual.
  • the plurality of reference breakthrough infected individuals may be breakthrough infected individuals belonging to a common category, such as a particular country, region, age range, sex, or any combination thereof. It is preferable that the predicted reference level is determined based on the mRNA expression levels of a plurality of breakthrough infected individuals belonging to the same category as the vaccinee to be predicted.
  • the predicted reference level is a value selected from a range that is lower than the median (or average) of the mRNA expression levels of multiple reference breakthrough infected individuals who were determined to be asymptomatic, and higher than the median (or average) of the measured mRNA expression levels of multiple reference breakthrough infected individuals who were determined to be symptomatic.
  • the predicted reference level is a cutoff value obtained by ROC (Receiver Operating Characteristic) curve analysis of the mRNA expression levels of these multiple reference breakthrough infected individuals.
  • an AUC (area under the curve) of at least 0.7 is typically obtained in ROC curve analysis. It is preferable to set the standard value based on a reference group of breakthrough infected individuals that produces an AUC of 0.7 or more, more preferably based on a reference group of breakthrough infected individuals that produces an AUC of 0.8 or more, and even more preferably based on a reference group of breakthrough infected individuals that produces an AUC of 0.9 or more.
  • the method may further include printing the predicted result that the subject will be asymptomatic if the subject has breakthrough infection, or will be symptomatic if the subject has breakthrough infection, on a solid medium and/or displaying the predicted result on an electronic display device.
  • the solid medium may be, for example, paper, a resin film, etc.
  • the electronic display device may be, for example, a liquid crystal display, a light emitting diode display, an electroluminescence display, etc.
  • kits for predicting or collecting data for predicting symptoms of breakthrough infection following vaccination against SARSr-CoV in a subject vaccinated against said vaccine, comprising: (1) a peptide set comprising the above-mentioned multiple peptides; (2) a measurement reagent for measuring the expression level of mRNA of any T cell function-associated marker selected from the group consisting of IFN ⁇ , CXCL9, CXCL10, and IL-1A (e.g., an RT-PCR reagent containing a primer specific to the T cell function-associated marker); and (3) an instruction manual explaining that if the measured mRNA expression level of the T cell function-associated marker is equal to or higher than a predicted reference level, the subject is predicted to be asymptomatic if the subject develops a breakthrough infection, and that if the measured mRNA expression level is lower than the predicted
  • Kit 2 The same as Kit 1 above, but in addition to the components of Kit 1, (4) Reagents and/or equipment for isolating leukocytes from blood (e.g., filter membranes that are leukocyte-trapping filters); (5) Reagents and/or tools for purifying RNA from white blood cells (e.g., cell lysis buffer); and (6) Reagents and/or tools for isolating mRNA from total RNA (e.g., oligo(dT) or oligo(dT)-immobilized substrate).
  • a kit comprising one or more of the following:
  • kits embodiments can also be applied to the kit embodiments.
  • a numerical range indicated using “ ⁇ " indicates a range that includes the numerical values before and after " ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively, and also includes the disclosure of a range that excludes the minimum and/or maximum values.
  • the upper or lower limit of one described numerical range can be arbitrarily combined with the upper or lower limit of another described numerical range to define a separate numerical range, and such separate numerical ranges are also included in this disclosure.
  • the performance of a "process” may include not only cases where a clearly separate and independent process is performed, but also cases where the intended event of the process is achieved even if it cannot be clearly separated from other processes.
  • SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein also referred to as PepGen Sf
  • peptides an overlapping peptide pool product from GenScript
  • SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein B an overlapping peptide pool product from GenScript
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • PBS buffer phosphate buffered saline
  • LPS lipopolysaccharide, a phenol extract derived from Escherichia coli O111
  • Tween 20 polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate
  • M-MLV Reverse Transcriptase M-MLV (Promega) RNasinTM Ribonucleotide Inhibitor (hereinafter referred to as RNasin)
  • RNasin Venoinject II vacuum blood collection tube heparin sodium (hereinafter referred to as heparin sodium blood collection tube) (manufactured by Terumo Corporation)
  • heparin sodium blood collection tube 96-well transparent round-bottom cell culture surface-treated micro
  • Example 1 Measurement method of cellular immune response activity (1) Peptide pool for stimulation PepGen Sf, an overlapping peptide pool product created based on the amino acid sequence of the spike protein constituting the standard Wuhan-Hu-1 strain SARS-CoV-2, and PepGen So, an overlapping peptide pool product created based on the amino acid sequence of the spike protein constituting the mutant Omicron B. 1.1.529 strain SARS-CoV-2, were used as stimulating antigens. Each of these peptide pools is composed of multiple peptides corresponding to a 15 amino acid fragment of the amino acid sequence of the spike protein, and adjacent peptides overlap each other by 11 amino acids to cover the entire length of the spike protein (coverage rate 100%).
  • PepGenSo contains the following amino acid mutations compared to PepGenSf: A67V, H69-, V70-, T95I, G142-, V143-, Y144-, Y145D, N211-, L212I, "EPE" insertion between 214R and 215D, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y5 05H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, L981F.
  • peptide stimulation plate Each peptide pool was dissolved in antigen dilution solution (PBS buffer containing 20% DMSO) to 20 ⁇ g/mL. 5 ⁇ L of each peptide pool solution was dispensed into different wells of a cell culture plate. In addition to the peptide pool solution, the above antigen dilution solution alone was prepared as a negative control, and an antigen dilution solution containing 20 ⁇ g/mL LPS was prepared as a positive control to confirm the stimulation of immune cells, and 5 ⁇ L of each was dispensed into different wells of a cell culture plate. The cell culture plate into which these solutions were dispensed (hereinafter referred to as peptide stimulation plate) was frozen and stored in a -80°C freezer.
  • peptide stimulation plate The cell culture plate into which these solutions were dispensed
  • the sense primer sequence for ACTB is SEQ ID NO: 1
  • the antisense primer sequence for ACTB is SEQ ID NO: 2
  • the sense primer sequence for IFNG is SEQ ID NO: 3
  • the antisense primer sequence for IFNG is SEQ ID NO: 4
  • the sense primer sequence for CXCL9 is SEQ ID NO: 5
  • the antisense primer sequence for CXCL9 is SEQ ID NO: 6
  • the sense primer sequence for CXCL10 is SEQ ID NO: 7
  • the antisense primer sequence for CXCL10 is SEQ ID NO: 8
  • the sense primer sequence for IL-1A is SEQ ID NO: 9
  • the antisense primer sequence for IL-1A is SEQ ID NO: 10.
  • the measured value of each gene obtained by real-time PCR was expressed as a Ct value, which is the number of cycles that meets the reaction threshold.
  • the Ct value of the ACTB gene which is a housekeeping gene, was used to normalize the Ct value of the detection target gene (IFNG, CXCL9, CXCL10, IL-1A), and the normalized Ct value was converted to the gene expression level to estimate the amount of mRNA whose expression was increased by stimulation. That is, the estimated mRNA expression level was compared with the mRNA expression level of an unstimulated sample to determine the mRNA expression level specific to peptide stimulation, and the result was expressed as log 2 F.I. For example, when log 2 F.I.
  • FIG. 1 shows the results of investigating the sensitivity of the IFN ⁇ mRNA measurement method used in this embodiment to detect positive cellular immunity based on multiple samples with positive cellular immune response activity from individuals who have been vaccinated against SARS-CoV-2, may have a history of COVID-19 infection, and have been confirmed to have cellular immunity against SARS-CoV-2 spike protein by conventional methods.
  • Example 2 Measurement of breakthrough infection specimen 1 (IFN ⁇ ) (1) Obtaining Breakthrough Infection Samples From approximately 100 vaccine recipients who received COVID-19 mRNA vaccines at least twice, the first blood sample was taken approximately 3 months after the last vaccination, and then the second and third blood samples were taken approximately every 3 months. Regardless of whether or not additional vaccinations were received during this approximately 9-month period, this schedule of three blood samples taken at approximately 3-month intervals was maintained. A sodium heparin blood collection tube was used for blood collection.
  • the presence or absence of infection after vaccination i.e., breakthrough infection
  • the presence or absence of anti-nucleocapsid protein antibodies which increase in plasma due to infection with SARS-CoV-2 independently of vaccination, was confirmed in the samples. Even if there was no diagnosis between the previous blood sample and the current blood sample, the fact of breakthrough infection was determined by detecting the presence of these antibodies in plasma.
  • ELISpot assay measures cellular immune response activity by capturing IFN ⁇ protein secreted from stimulated cells with an antibody coated on a plate well, and visualizing and quantifying the IFN ⁇ protein secretion site (spot).
  • spot IFN ⁇ protein secretion site
  • PepGen Sf and PepGen So were used as stimulating antigens.
  • BD commercially available kit
  • peptide stimulation and detection of IFN ⁇ protein were performed according to the product's instruction manual.
  • spot intensity As a negative control, wells not stimulated with peptide were prepared. The density of the spots (spot intensity) formed on the wells in the ELISpot assay was measured, and the spot intensity in the negative control was subtracted from the spot intensity in the peptide-stimulated sample to determine ⁇ Spot Intensity.
  • Example 3 Measurement of breakthrough infection samples 2 (IFNG, CXCL9, CXCL10, IL-1A) (1) Breakthrough infection specimens The same specimens as in Example 2 (listed in Table 2) were used. However, because the specimen volume from breakthrough infection subject 1 in Table 2 was insufficient and the specimen from that infected subject could not be used, the seven cases excluding "breakthrough infection subject 1" were used as specimens from asymptomatic subjects.
  • the cutoff value for IFN ⁇ was 5.090 (sensitivity: 0.571, specificity: 1.000), and the AUC was 0.768 (CI: 0.5047-1.0000) ( Figure 6b).
  • the cutoff value for CXCL9 was 6.967 (sensitivity: 0.714, specificity 1.000), and the AUC was 0.821 (CI: 0.5406-1.0000) ( Figure 6d).

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Abstract

ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた被験者においてブレイクスルー感染における症状を予測するためのデータを収集する方法であって、被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程と、検体に複数のペプチドを添加する工程と、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程とを含む方法が提供される。複数のペプチドは、スパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーする。該Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルが予測参照レベル以上である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、ブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測される。

Description

ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶブレイクスルー感染症状の予測
　本開示は、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ　Ａｃｕｔｅ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）関連コロナウイルスのワクチン接種に関する。より具体的には本開示は、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスのワクチン接種者における、接種後の感染の症状を予測することに有用となるアッセイに関する。
　ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ；以下、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶという略称を用いる）は、ベータコロナウイルス属に分類されるコロナウイルスの種（ｓｐｅｃｉｅｓ）である（国際ウイルス分類委員会；https://ictv.global/taxonomy/taxondetails?taxnode_id=20181868）。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶにはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれ、これらは同じＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ種であるが異なる年に突発した別系統であるという関係にあり、いずれも約３００００塩基からなる一本鎖・プラス鎖ＲＮＡゲノムを持ち、ヒトのアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を受容体として利用してヒト細胞に感染でき、ヒトにおいて重篤な呼吸器疾患を引き起こすことを含め、同種のウイルスとして共通した特性を有している。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶが社会に及ぼす負の影響は甚大となり得、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年の突発後から数年に亘ってパンデミックを引き起こし、本願出願時でもなお感染者を出し続けている。
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶは、４つの主要な構造タンパク質、具体的にはスパイク（Ｓ）タンパク質と、エンベロープ（Ｅ）タンパク質と、膜（Ｍ）タンパク質と、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質とを有するコロナウイルスである。スパイクタンパク質は、Ｓ１及びＳ２と呼ばれる２つの領域からなる大きなＩ型膜貫通型タンパク質であり、Ｓ１には主に、細胞表面の受容体を認識する受容体結合ドメインが、Ｓ２には膜融合に必要な要素が含まれている。
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶに対する生体の防御機能として、抗体が中心的役割を果たす液性免疫のほか、細胞性免疫がある。細胞性免疫は、体内に侵入した病原体等の異物を認識し、抗原提示細胞を介してＣＤ４＋　Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋　Ｔ細胞を活性化することで異物（あるいは異物を含む細胞、例えば感染細胞）の排除をもたらす、免疫応答系である。異なる個体は、例えば目的の病原体若しくはそれに構造的に関連する病原体についての感染履歴若しくはワクチン接種歴、又は詳細が未解明である生物学的若しくは環境的な個体差に応じて、異なる細胞性免疫応答能力を有し得る。
　細胞性免疫応答活性の測定は、被験者に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料に、病原体等由来の抗原を添加することでＰＢＭＣに含まれるＴ細胞等の白血球を刺激した後、刺激された白血球によって産生されるサイトカイン（例えばインターフェロンγ）などのエフェクター分子を検出するか、又は、エフェクター分子を発現している白血球を検出することで行うことができる。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶに対する被験者の細胞性免疫応答の活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用いる方法（非特許文献１）、ＥＬＩＳＡ法を用いる方法（非特許文献２）、フローサイトメトリー技術を用いる方法（非特許文献３）が報告されている。これらはいずれも、特異的抗体を用いてタンパク質産物としてのエフェクター分子を検出するものである。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）のようなＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ感染症の患者は、人によって、一般的な風邪に似た症状である軽症から、重症（肺炎に起因する重度の呼吸障害を含み、致死の可能性も含む）に至るまで、幅のある症状を示し得る。しかし、無症状である感染者、またそれゆえ感染の事実について無自覚のままとなる感染者も多い。
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種は、当然ながら感染の予防を目的として提供されるものである。しかしながらワクチン接種したにも関わらず接種後に感染することがあり、これをブレイクスルー感染という。しかし、ワクチン接種後は、仮にブレイクスルー感染になった場合にも、ワクチン非接種の場合の感染と比べてその症状がより穏やかで済む可能性がある。
International Journal of Infectious Diseases, Vol 113. pp 155-162, 2021 International Journal of Infectious Diseases, Vol 106. pp 338-347, 2021 medRxiv 2020 Nov 3;2020.10.30.20223099.
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた人にとって、その後にＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ感染症の不快な症状で苦しむ可能性がどれほどあるかを知ることは関心事項である。また、無症状及び無自覚の感染者が自己隔離せず通常の社会生活を送り続けることにより感染が拡大するという問題がある。従って、ブレイクスルー感染の際の症状の有無を予測しておくことには意義がある。しかしながら従来、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのブレイクスルー感染における症状を感染前に予測するための具体的な手段が知られていなかった。
　本開示は、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのブレイクスルー感染における症状を予測するためのデータを収集する方法を提供する。本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた被験者において、前記ワクチン接種後のブレイクスルー感染における症状を予測するためのデータを収集する方法であって、
　（１）前記被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程と、
　（２）前記検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、前記検体と前記複数のペプチドとをインキュベートする工程と、
　（３）工程（２）の後、前記白血球における、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）及びインターロイキン－１Ａ（ＩＬ－１Ａ）から成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程と
を含み、
　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、かつ、前記スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしており、
　前記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルが、予測参照レベル以上である場合には、前記被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、前記被験者はブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測される、方法。
［２］
　前記複数のペプチドが、前記スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５～２０アミノ酸長の断片に相当する複数のペプチドである、［１］に記載の方法。
［３］
　前記複数のペプチドは、前記スパイクタンパク質のアミノ酸配列に沿って隣接するペプチドが互いに１０～１４アミノ酸オーバーラップしている、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記検体は全血である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
　前記工程（３）において、前記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
　［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキットであって、
　（１）前記複数のペプチドを含むペプチドセット；
　（２）ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定するための測定試薬；及び
　（３）測定される前記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルが、予測参照レベル以上である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測されることを説明する、説明書
を含む、キット。
[規則91に基づく訂正 14.06.2024]
図１は、検体を刺激するために用いられるペプチドプールのスパイクタンパク質カバー率と、インターフェロンγ　ｍＲＮＡ発現レベル測定による細胞性免疫応答活性アッセイの感度との関係を示す。 図２は、本開示の実施形態の方法に従い、異なる症状のブレイクスルー感染者の検体を異なるペプチドプールで刺激して測定した、インターフェロンγ　ｍＲＮＡ発現レベルの比較（ａ，ｃ）、及びその測定結果に基づくＲＯＣ曲線分析（ｂ，ｄ）を示す。 図３は、異なる症状のブレイクスルー感染者の検体を異なるペプチドプールで刺激して、従来型の細胞性免疫アッセイであるＥＬＩＳｐｏｔにより測定した、インターフェロンγタンパク質分泌量の比較（ａ，ｃ）、及びその測定結果に基づくＲＯＣ曲線分析（ｂ，ｄ）を示す。 図４は、異なる症状のブレイクスルー感染者の検体において抗スパイクタンパク質抗体価を測定して比較した結果（ａ）、及びその測定結果に基づくＲＯＣ曲線分析（ｂ）を示す。 図５は、本開示の実施形態の方法に従い、異なる症状のブレイクスルー感染者の検体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標準株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプール（ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆ）で刺激して測定した、インターフェロンγのｍＲＮＡ発現レベルの比較（ａ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド９のｍＲＮＡ発現レベルの比較（ｃ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０のｍＲＮＡ発現レベルの比較（ｅ）及びインターロイキン－１ＡのｍＲＮＡ発現レベルの比較（ｇ）、並びに、それぞれの測定結果に基づくＲＯＣ曲線分析（インターフェロンγ（ｂ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド９（ｄ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ｆ）、インターロイキン－１Ａ（ｈ））。を示す。 図６は、本開示の実施形態の方法に従い、異なる症状のブレイクスルー感染者の検体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプール（ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏ）で刺激して測定した、インターフェロンγのｍＲＮＡ発現レベルの比較（ａ）及びＣＸＣモチーフケモカインリガンド９のｍＲＮＡ発現レベルの比較（ｃ）、並びに、それぞれの測定結果に基づくＲＯＣ曲線分析（インターフェロンγ（ｂ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド９（ｄ））を示す。
　一側面において本開示は、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた被験者において、該ワクチン接種後のブレイクスルー感染における症状を予測するためのデータを収集する方法を提供する。本明細書において、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた被験者を単に「ワクチン接種者」ともいう。
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶの構造のうち、スパイク（Ｓ）タンパク質は、ヒト細胞への感染の開始を担うタンパク質であり、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチンは典型的にはスパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導するものである。従ってＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチンは、通常、スパイクタンパク質若しくはその一部又はそれらをコードする遺伝子物質（例えばｍＲＮＡ）を含む。スパイクタンパク質に対する免疫応答を誘導できる限り、ワクチン中のこれらのタンパク質若しくはその一部又はそのコード遺伝子物質の配列は、本物のウイルスと比べて改変が加えられたものが含まれ得ることが当業者に理解される。
　本実施形態におけるワクチン接種者は、ワクチン接種を１回、２回、３回、又は４回以上受けた接種者であり得る。検体は、いずれかの回のワクチン接種後例えば３年以内、２年以内、１年以内、６カ月以内、または３カ月以内に採取され得る。
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶは、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染症は、２００４年より後には実質的に報告されていないが、再発生の可能性は排除できず、また、過去に凍結保存された検体を使用して本開示の方法を行って何らかの検証を行う実施形態も企図され得る。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶは、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であってもよく、その場合のＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ感染症はＣＯＶＩＤ－１９と呼ばれ得る。
　本実施形態の方法は、
　（１）前記被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程と、
　（２）前記検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、前記検体と前記複数のペプチドとをインキュベートする工程と、
　（３）工程（２）の後、前記白血球における、インターフェロンγ（以下、ＩＦＮγ又はＩＦＮＧという）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド９（以下、ＣＸＣＬ９という）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（以下、ＣＸＣＬ１０という）及びインターロイキン－１Ａ（以下、ＩＬ－１Ａという）から成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程と
を含む。すなわち本方法は、被験者に由来する検体を使用してｅｘ　ｖｉｖｏで実施されるものである。本開示における被験者は哺乳類動物であり、好ましくは霊長目であり、特に好ましくはヒトである。上記マーカー（ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａ）はヒトにおける名称で表示しているが、動物種によっては、又は文脈によっては、同じマーカーが別の名称で呼ばれることもあり得る。
　白血球を含む検体は、例えば血液から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、あるいはさらに精製された白血球そのものであってもよいが、本実施形態では有利なことに、ＰＢＭＣを分離する手間と時間を排除して、全血を検体として利用することができる。当業者に理解されるように、全血である検体は、ヘパリン等の抗凝固剤を含み得る。「被験者から採取された」検体とは、被験者に由来する検体を意味し、例えば抗凝固処理やＰＢＭＣ分離等を経た後のものも「被験者から採取された」検体である。被験者から採取された全血等の検体は、通常、採血管に保存される。採血管としては、例えばＥＤＴＡ採血管、及びヘパリンナトリウム採血管が挙げられる。ＥＤＴＡはリンパ球の細胞活性に影響を及ぼす可能性があるため、ヘパリンナトリウム採血管がより好ましい。
　工程（１）の「検体を準備する工程」とは、工程（２）以降の実施のために使用可能な検体を取得又は調製する段階を表す。被験者の身体から検体を直接採取（例えば採血）する事前工程はこの工程（１）には含まれず、その事前工程を行った人物が、本実施形態の方法の実施者であったか否かは問わない。
　本開示において、白血球としては、例えばリンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、及び単球が挙げられる。単球はマクロファージ又は樹状細胞へ分化するため、マクロファージ及び樹状細胞は白血球に属する。リンパ球としては、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞が挙げられる。また、本開示の白血球を含む検体、例えば全血、ＰＢＭＣ等は、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞を含み得る。また、検体中のＴ細胞には、ＣＤ４＋　Ｔ細胞及びＣＤ８＋　Ｔ細胞が含まれ得る。
　本開示において、「複数のペプチド」とは、互いにアミノ酸配列が異なるという意味において複数種類のペプチドが含まれている、８～３０アミノ酸長のペプチドの集団を表す。例えば２つのペプチドが同じ配列を部分的に共有していても、第一のペプチドにはない１つ以上のアミノ酸残基が第二のペプチドの末端に追加されていたら、これら２つのペプチドは「互いにアミノ酸配列が異なる」と言える。本実施形態で使用される複数のペプチドは、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドである。すなわち、当該複数のペプチドに含まれるペプチドのそれぞれが、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶウイルスを構成するスパイクタンパク質のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドである。これらのペプチドがスパイクタンパク質から断片化処理して得られる断片であることは要せず、実際、本実施形態のペプチドは典型的には化学合成されたペプチドであり得る。
　本実施形態で使用される複数のペプチドは、ペプチドの集団として、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーするものである。このことが、後述するｍＲＮＡ発現レベル測定を通じたブレイクスルー感染症状予測の信頼性をより高め得る。複数のペプチドが「ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーする」とは、当該複数のペプチド中の全ペプチドをスパイクタンパク質の全長アミノ酸配列上の対応位置に宛てがって並べていった場合に、全長アミノ酸配列中にあるアミノ酸残基位置（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２　Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株では全部で１２７３残基）の４０％以上が覆われることを意味する。本開示では、複数のペプチドに含まれる全ペプチドを、対応する目的タンパク質（例えばＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質）の全長アミノ酸配列の対応位置に宛てがって並べたときに、その全長アミノ酸配列の全アミノ酸残基のうちのどれだけがペプチドによってカバーされるかを表す百分率を「カバー率」と呼ぶ。従来、アミノ酸配列全長の４０％に満たないカバー率のペプチド（例えば既知のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ拘束性ペプチドのセットや、ペプチドベースのワクチン又はワクチン候補等）を用いてリンパ球を刺激してＴ細胞活性化を測定することも行われてきたが、ｍＲＮＡレベルに基づくブレイクスルー感染症状予測の系においては、このカバー率は好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上又は８０％以上でもあり得、９０％以上とすると極めて信頼性の高い予測が可能となる。カバー率を１００％とすることは特に好ましい。
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーする複数のペプチドは、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５～２０アミノ酸長の断片に相当する複数のペプチドであることが好ましい。換言すると、本実施形態における「複数のペプチド」中のペプチドは１５～２０アミノ酸長であることが好ましく、より好ましくは１５～１８アミノ酸長、さらに好ましくは１５アミノ酸長である。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしており上記アミノ酸長範囲内である複数のペプチドが、検体に添加され又は検体とインキュベートされる際に、上記アミノ酸長の範囲外の長さの追加的ペプチドが共存していてもよい。
　抗原提示細胞表面に発現しているＭＨＣ分子は非常に多様性に富んでおり、結合できるペプチドの配列及び長さは個体間での差が非常に大きい。そのため、ＭＨＣ分子上に直接結合できるＣｌａｓｓ Ｉ又はＣｌａｓｓ ＩＩペプチドを含む１４アミノ酸以下のペプチド鎖を使用するよりも、１５アミノ酸以上のペプチド鎖を使用することが好ましい。１５アミノ酸以上のペプチド鎖を、検体中に含まれる抗原掲示細胞と混ぜることにより、抗原提示細胞に取り込まれ、細胞内でＣｌａｓｓ Ｉ又はＣｌａｓｓ ＩＩペプチドまで分解され、抗原として細胞表面に提示され、同じ検体内に含まれる抗原特異的なＴ細胞にて認識可能な状態になると考えられる。
　好ましくは、当該複数のペプチドは、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列上のそれぞれの対応位置に並べられた場合に、スパイクタンパク質のアミノ酸配列に沿って隣接するペプチドが互いに１０～１４アミノ酸オーバーラップする。これはすなわち、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列上で、ｎ番目のペプチドのＮ末端残基が、隣接するｎ＋１番目のペプチドのＮ末端残基よりも上流に位置するが、ｎ＋１番目のペプチドのＮ末端残基以降の１０～１４残基の配列は両ペプチドに共通することを意味し得る。このオーバーラップは例えば１０～１１アミノ酸であってもよく、１１アミノ酸のオーバーラップは特に好適な一例である。あるペプチドを基準として、それに「隣接するペプチド」とは、その基準となるペプチドのＣ末端側と配列上重なるＮ末端側を有するペプチドのうち直近のもの（すなわち最短のＮ末端－Ｎ末端距離を与えるもの）、又は、その基準となるペプチドのＮ末端側と配列上重なるＣ末端側を有するペプチドのうち直近のもの（すなわち最短のＣ末端－Ｃ末端距離を与えるもの）を意味し得る。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしており上記オーバーラップ条件を満たす複数のペプチドが、検体に添加され又は検体とインキュベートされる際に、上記オーバーラップ条件を満たさない追加的ペプチドが共存していてもよい。
　「検体に複数のペプチドを添加する」とは、検体とその複数のペプチドとを組み合わせることを意味し、「複数のペプチドに検体を添加する」と同義である。検体とインキュベートされたこれらのペプチドは、検体中の抗原提示細胞に取り込まれ、場合によってはさらに短く分解され、抗原としてＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子と共に細胞表面に提示され、それがＴ細胞によって認識され得る。このように、当該複数のペプチドは、ＣＤ４＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチド、及びＣＤ８＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチドを含み得る。ＣＤ４＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチド又はＣＤ８＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列を含むペプチドを同定する方法は当業者に知られており、例えば細胞内サイトカイン染色法（ＩＣＳ：intracellular cytokine staining）によって容易に達成され得る。例えば、刺激されたＴ細胞によって発現されるサイトカインタンパク質は公知であるから、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ－Ａの存在下でペプチドと検体のインキュベーションを行って、フローサイトメトリーによりＣＤ４又はＣＤ８とそのサイトカインとについて共染色されるリンパ球の存在を確認すれば、ペプチドにＣＤ４＋又はＣＤ８＋リンパ球によって認識されるアミノ酸配列が含まれていたことが確認される。
　このように、生細胞によるペプチドの取り込み、抗原提示、及び抗原認識をｉｎ　ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ　ｖｉｖｏの水性媒体中で行えること自体は本技術分野で確立されており、当業者はその目的に適した水性媒体を通常の知識に基づいて選択又は調製することができる。水性媒体は例えば細胞培養用の液体培地であり得る。全血は典型的に水性媒体中に維持されるが、その水性媒体を本実施形態の方法における水性媒体として使用してもよい。
　本実施形態の方法の工程（２）では、水性媒体中に添加された、上記条件を満たす複数のペプチドと検体とがインキュベートされる。インキュベーションは、３０℃～４０℃の範囲の温度で実施され得、好ましくは３７℃±０．５℃で実施され得る。インキュベートする時間は、例えば１時間～８時間までの範囲内とし得る。インキュベーションは、１時間～２時間、２時間～３時間、３時間～４時間、４時間～５時間、５時間～６時間、６時間～７時間、６時間～８時間、１時間～４時間、又は２時間～６時間であってもよく、好ましくは２～４時間である。インキュベーションの際の、検体と複数のペプチドとを含む混合物において、当該複数のペプチド全体としての濃度は、例えば０．１～２０μｇ／ｍＬ、０．２～１０μｇ／ｍＬ、又は０．５～５μｇ／ｍＬであり得る。このインキュベーションのあいだに、生細胞によるペプチドの取り込み、抗原提示、及び抗原認識が起こることが理解され、さらに、ブレイクスルー感染における症状と相関し得るｍＲＮＡレベル差が起こることが見出された。Ｔ細胞エフェクター分子の発現上昇には転写後調節も寄与し得るため（Immunology. 2021;164:57-72）、ｍＲＮＡレベルで信頼性の高い細胞性免疫活性の判定を行えること自体も必ずしも自明なことではなく、また、ブレイクスルー感染の症状予測に関し特定のペプチド条件でそのような有意なｍＲＮＡレベル差を起こさせることができることは全く知られていなかった。
　ＥＬＩＳｐｏｔのような従来型の細胞性免疫測定法、又はスパイクタンパク質に対する抗体若しくは偽ウイルス（pseudovirus）中和抗体を検出する液性免疫測定法では、ワクチン接種者の検体においてその後のブレイクスルー感染における症状の有無を有意に予測し分けることができなかった。これらの異なるアッセイは、互いに免疫活性の異なる側面を捉えるスナップショットであると考えられる。液性免疫が細胞性免疫とは異質であることはいうまでもないが、細胞性免疫のなかにも著しい複雑さが存在する。例えば、スパイクタンパク質ペプチドでの刺激に応答して、直ちにＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１Ａ等の分泌体勢に入ることができる細胞の能力と、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１Ａ等の生産態勢に入ることができる細胞の能力とは、非同一であり得る。特定の態様のペプチド刺激及びｍＲＮＡ発現レベル測定を組み合わせる本実施形態の方法は、ブレイクスルー感染における症状の有無に相関する特定の細胞性免疫系の状態を特に正確に検知することができる可能性がある。
　本実施形態の方法は、上述した工程（２）の後、かつ工程（３）の前に、検体を凍結する工程（２ａ）、及び工程（２ａ）で凍結された検体を融解する工程（２ｂ）をさらに含み得る。これらの工程は、ペプチド刺激後の検体の安定化、長期保管、輸送等のために有利となる。工程（１）が、ペプチド刺激前の検体を凍結し、融解することを含むことも可能である。
　ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａは、公知のＴ細胞機能関連マーカーである。これらのマーカーは細胞性免疫の一部として、刺激された白血球において発現が誘導され、細胞性免疫応答活性の指標となる。これらマーカーのｍＲＮＡレベルを測定できる技術の非限定的な例としては、ノザンブロットやマイクロアレイ等のハイブリダイゼーションに基づく方法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＲＮＡ－Ｓｅｑ（配列決定）法等が挙げられるが、迅速性、簡便性、信頼性等の観点から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法が好ましく、特にリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法は優れた定量性を有するため好ましい。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法としては、例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ法、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）法が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の蔓延に伴って、感染検査のためにＰＣＲ装置の普及が一層進んでいるため、ＲＴ－ＰＣＲ法により本実施形態の方法を実施できることは有利である。同様に、臨床現場などで簡便かつ迅速に使用できる、定温核酸増幅法のＬｏｏｐ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（ＬＡＭＰ）　法、Ｈｅｌｉｃａｓｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｉｎｖａｄｅｒ　ａｓｓａｙ法、なども好ましい。さらに、より定量性の高い、Ｄｉｇｉｔａｌ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ＰＣＲ法やＤｉｇｉｔａｌ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ＬＡＭＰ法なども好ましい。
　工程（３）の一つの実施形態では、必要に応じて、赤血球、及び白血球以外の血液成分が、全血サンプルから除去されてよい。他の実施形態では、全血は、特定のいずれの細胞型の除去又は単離をも行わずに用いられる。いくつかの実施形態では、全血から、一般的な市販の磁気ビーズ、遠心カラムなどを利用したＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出法にてＲＮＡが抽出された後、上記マーカーが測定されてよい。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡの単離及び増幅のためのデバイスの使用を通じて白血球が単離される。このデバイスの実施形態は、各々その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，７４５，１８０号、同第７，９６８，２８８号、同第７，９３９，３００号、同第７，９８１，６０８号、及び同第８，０７６，１０５号により詳細に記載されている。
　工程（３）の一実施形態は、以下の（ａ）～（ｄ）を含むＲＴ－ＰＣＲ法であり得る。
　（ａ）フィルターメンブレンを通す濾過により全血から赤血球と非白血球血液成分とを除去して、フィルターメンブレン上に白血球を得ること；
　（ｂ）白血球を細胞溶解して、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させること；
　（ｃ）溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化基材（例えばオリゴ（ｄＴ）固定化プレート）に移して、オリゴ（ｄＴ）上にｍＲＮＡを捕捉すること；及び
　（ｄ）ｍＲＮＡレベルをＲＴ－ＰＣＲ法で測定すること。
　工程（ａ）の一実施形態は、工程（２）で得られたインキュベーション後の検体を含むサンプルを、フィルタープレートのサンプル導入ウェルに添加し、インキュベートし、遠心力を利用してフィルタレーションをする工程である。その結果、フィルターメンブレン上に白血球を捕捉することができる。白血球捕捉フィルターであるフィルターメンブレンの好適な一例は、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）繊維膜である。インキュベーションは、２０℃～４０℃の範囲の温度で実施され得る。インキュベートの時間は、１秒間から１時間までで様々であってよい。インキュベーションは、１秒間～１分間、１分間～１時間、１分間～２０分間、２分間～２０分間、５分間～１５分間又は７分間～１２分間であってよい。
　工程（ｂ）は、細胞溶解バッファーを用いて細胞を溶解する工程であり得る。細胞を溶解して細胞内ＲＮＡを放出させることができる細胞溶解バッファーは当業者に知られている。
　工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた溶解物を、オリゴ（ｄＴ）固定化基材に移して、例えば１時間、１時間～３時間、１時間～２４時間、又は１６時間～２４時間インキュベートして、オリゴ（ｄＴ）上にｍＲＮＡを捕捉する工程である。
　工程（ｄ）は、
　（ｉ）（ｃ）でオリゴ（ｄＴ）上の捕捉を介して単離されたｍＲＮＡに、プライマー及び逆転写酵素を添加して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作り出すこと；並びに
　（ｉｉ）ｃＤＮＡを、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーの核酸配列に特異的であるセンス及びアンチセンスプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとに接触させて、増幅されたＤＮＡを作り出すこと、
を含む方法によって実施され得る。これらの文脈において「プライマー」という用語はオリゴヌクレオチドプライマーを表す。これらの工程によって、上記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定することができる。
　ＰＣＲ反応の完了後、又はＰＣＲ反応の進行中に、Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡ（ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの検出量で表される）が定量される。特定の実施形態では、定量は、Ｔ細胞機能関連マーカーをコードするｍＲＮＡの量を参照値と比較することによって算出される。いくつかの実施形態では、参照値は、ハウスキーピング遺伝子を例とする、刺激剤（例えば抗原ペプチド）によって発現が誘導も抑制もされない遺伝子の発現レベルである。特定のそのような実施形態では、β－アクチンの発現レベルが参照値として用いられる。本技術分野にて公知である数多くのその他のハウスキーピング遺伝子のいずれかも、参照値として用いられてよい。一つの実施形態として、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で得られるサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｃｔ値）に基づいて、ｍＲＮＡの発現レベルを評価することができる。当業者に一般的に知られているように、関心対象のマーカーのＣｔ値をハウスキーピング遺伝子のＣｔ値にてノーマライズすることで、検体間でのマーカーの発現量を容易に比較することができる。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法では、測定対象となるマーカー遺伝子とハウスキーピング遺伝子との検出量を測定し、ハウスキーピング遺伝子のＣｔ値を用いて、マーカー遺伝子をノーマライズし、ノーマライズされたＣｔ値を遺伝子発現量（ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ）へ換算することで、刺激により発現変化（例えば増加）したマーカー遺伝子ｍＲＮＡ量を概算することができる。例えば、
Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　=２（－Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｍａｒｋｅｒ］＋Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ］）、
ｌｏｇ２（Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ）＝－Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｍａｒｋｅｒ］＋Ｃｔ　ｖａｌｕｅ［ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ　ｇｅｎｅ］
などの式を用いることができる。
　本開示の方法の実施形態において、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーの、刺激剤にて誘導された発現レベルを、非誘導（溶媒コントロール）サンプルからの同じＴ細胞機能関連マーカーの発現レベルと比較することで、刺激によるＴ細胞機能関連マーカーの発現レベル変化を評価することができる。ひとつの実施形態として、当業者には理解されるように、誘導されたマーカーの遺伝子発現量を非誘導されたマーカーの遺伝子発現量と比較したＦｏｌｄ　ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｆ．Ｉ．）値又はそれから派生した値にて誘導の度合いを概算することができる。例えば、
ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．＝Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ［ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅ］÷Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ［ｓｏｌｖｅｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ］）、
ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．＝－Ｃｔ［ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｓａｍｐｌｅ］）＋Ｃｔ［ｓｏｌｖｅｎｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ］）
などの式を用いることができる。つまり、概算したｍＲＮＡ発現量を、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と比較することで、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．としてペプチド抗原刺激特異的なｍＲＮＡ発現量を算出することができる。ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．は、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の何倍であるかを評価する指標であり、例えば、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が０のときは、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量とが同じであることを意味し、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が１のときは、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の２倍であることを意味する。従って、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が大きいほど、ペプチド刺激で誘導されたｍＲＮＡ発現量が増加したことを意味する。
　本実施形態の方法では、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベル（以下、単に「ｍＲＮＡ発現レベル」ともいう）が、予測参照レベル以上である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測される。ここでいう症状とは、感染者が自覚できる症状である。感染者が自覚できるＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ感染の症状には、発熱、咳、息切れ、悪寒、悪寒を伴う震え、筋肉痛、頭痛、咽頭痛、味覚障害、嗅覚障害、肺炎症状、及び呼吸困難が含まれる。
　予測参照レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルを測定するアッセイの具体的な種類及び個々の実施形態で求められる予測の厳格さに応じて、実施者が適宜設定できることが理解されるべきである。例えば、予測参照レベルを高めにすれば、ブレイクスルー感染した場合に無症状となるという予測についての特異度が上がり、例えば無症状感染を特に警戒すべき被験者を見出すためのスクリーニングに、より有用となる。予測参照レベルを低めにすれば、ブレイクスルー感染した場合に無症状となるという予測についての感度が上がり、無症状感染の可能性がある被検者を見逃さず予測する能力がより高まる。
　予測参照レベルは事前に定められた値であり得る。例えば、予測参照レベルは、検体採取後のブレイクスルー感染が無症状又は有症状のいずれであったかが決定された複数のブレイクスルー感染者（本開示において参照（reference）ブレイクスルー感染者ともいう）の対応するｍＲＮＡ発現レベルに基づいて事前に定められた値であり得る。少なくともそれぞれ７人以上、８人以上、１０人以上、２０人以上、又は５０人以上の、無症状又は有症状のブレイクスルー感染者のｍＲＮＡ発現測定値に基づいて定められた予測参照レベルを用いることが好ましい。ここでいう「対応するｍＲＮＡ発現レベル」は、ワクチン接種後かつブレイクスルー感染前にその参照ブレイクスルー感染者から採取された検体中のｍＲＮＡ発現レベルである。「対応する」とは、ｍＲＮＡ発現レベルを測定する検体の種類及びアッセイの種類が予測対象者の場合と共通していることを意味する。これら複数の参照ブレイクスルー感染者は、特定の国、地域、年齢範囲、性別、又はこれらのいずれかの組合せのような、共通のカテゴリーに属するブレイクスルー感染者であり得る。予測対象となるワクチン接種者と同じカテゴリーに属する複数のブレイクスルー感染者のｍＲＮＡ発現レベルに基づいて予測参照レベルが定められることが好ましい。
　一実施形態では、予測参照レベルは、無症状であったことが決定された複数の参照ブレイクスルー感染者のｍＲＮＡ発現レベルの中央値（又は平均値）より低く、かつ、有症状であったことが決定された複数の参照ブレイクスルー感染者のｍＲＮＡ発現レベルの測定値の中央値（又は平均値）より高い範囲の中から選択される値である。
　別の実施形態では、予測参照レベルは、これら複数の参照ブレイクスルー感染者のｍＲＮＡ発現レベルについてのＲＯＣ（受信者操作特性）曲線分析により得られるカットオフ値である。ＲＯＣ曲線分析及びカットオフ値の決定は当業者によく知られている。すなわち、上向きの縦軸に感度（つまり真陽性率）を、縦軸の下端から右に伸びる横軸に（１－特異度）（つまり偽陽性率）をプロットし、グラフの左上隅の点（感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）＝１、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）＝１となる理想点）に対して最短距離となる点、又は、Ｙｏｕｄｅｎ　Ｉｎｄｅｘ（感度＋特異度－１）が最大になる点がカットオフ値である。ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶワクチン接種者について血液検体中ＩＦＮγのｍＲＮＡの発現レベルをバイオマーカーとしてブレイクスルー感染時の症状の有無を予測し分ける場合、ＲＯＣ曲線分析において少なくとも０．７以上のＡＵＣ（曲線下面積）が典型的に得られるところ、０．７以上のＡＵＣを生じる参照ブレイクスルー感染者群に基づいて基準値が定められることが好ましく、０．８以上のＡＵＣを生じる参照ブレイクスルー感染者群に基づいて基準値が定められることがより好ましく、０．９以上のＡＵＣを生じる参照ブレイクスルー感染者群に基づいて基準値が定められることがさらに好ましい。
　一実施形態の方法は、被験者がブレイクスルー感染した場合に無症状となる、又はブレイクスルー感染した場合に症状が出るという予測結果を、固形媒体上に印刷すること、及び／又は、電子的表示装置に表示する工程をさらに含み得る。固形媒体は例えば紙、樹脂フィルム等であり得る。電子的表示装置は例えば液晶ディスプレイ、発光ダイオードディスプレイ、エレクトロルミネセンスディスプレイ等であり得る。
　本開示の方法のいくつかの実施形態は、以下のいずれかのキットを用いて実施することができる。従って本開示は以下のキットの実施形態も提供する。
＜キット１＞
　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた被験者において、該ワクチン接種後のブレイクスルー感染における症状を予測するための、又はその予測用のデータを収集するためのキットであって、
　（１）上記複数のペプチドを含むペプチドセット；
　（２）ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定するための測定試薬（例えば当該Ｔ細胞機能関連マーカーに特異的なプライマー等を含むＲＴ－ＰＣＲ試薬）；及び
　（３）測定される前記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルが、予測参照レベル以上である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測されることを説明する、説明書
を含む、キット。
＜キット２＞
　上記キット１と同じであるが、キット１の構成要素に加えて、さらに、
　（４）血液から白血球を単離するための試薬及び／又は器具（例えば白血球捕捉フィルターであるフィルターメンブレン）；
　（５）白血球からＲＮＡを精製するための試薬及び／又は器具（例えば細胞溶解バッファー）；及び
　（６）Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｍＲＮＡを単離するための試薬及び／又は器具（例えばオリゴ（ｄＴ）又はオリゴ（ｄＴ）固定化基材）
のうちの１つ以上を含む、キット。
　方法の実施形態に関連して提供された説明（例えば複数のペプチド、試薬、細胞及び核酸ならびにそれらの単離、測定等に関すること）は、キットの実施形態にも適用することができる。
　本明細書において、「～」（「…から…まで」の意）を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示し、また、その最小値及び／又は最大値を除外した範囲の開示も包含する。複数の数値範囲が記載されている場合は、或る記載された数値範囲の上限値又は下限値は、別の記載された数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせて別個の数値範囲を規定することができ、そのような別個の数値範囲も本開示に含まれる。「工程」が行われることは、明確に分離して独立した工程が行われる場合だけでなく、他の工程と明確に分離できなくてもその工程の所期の事象が達成される場合も含まれ得る。
　以下、実施例を示して本開示の実施形態をさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は代表的な実験結果の例示に過ぎず、発明の実施形態がこれらの詳細に限定されるわけではないことが理解されるべきである。
　実施例において以下の試薬及び器具を使用した。
　・ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製のオーバーラップペプチドプール製品（「複数のペプチド」）であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＰｅｐＧｅｎ Ｓｆとも記す）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　Ｓｐｉｋｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂ．１．１．５２９－Ｏｍｉｃｒｏｎ（ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏとも記す）
　・ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す）；リン酸緩衝生理食塩水（－）（以下、ＰＢＳバッファーと記す）；リポポリサッカリド、大腸菌Ｏ１１１由来フェノール抽出品（以下、ＬＰＳと記す）；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、Ｔｗｅｅｎ２０と記す）（以上、富士フイルム和光純薬社製）
　・Ｍ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ－ＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
　・ＲＮａｓｉｎ（商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（以下、ＲＮａｓｉｎと記す）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）
　・ベノインジェクトＩＩ真空採血管ヘパリンナトリウム（以下、ヘパリンＮａ採血管と記す）（テルモ社製）
　・９６ウェル　透明　丸底　細胞培養表面処理　マイクロプレート（以下、細胞培養プレートと記す）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
　・ＭｉｃｒｏＡｍｐＴＭ　Ｆａｓｔ　Ｏｐｔｉｃａｌ　９６－Ｗｅｌｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｐｌａｔｅ，　０．１　ｍＬ（以下、ＰＣＲ用プレートと記す）（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
　・ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）
［実施例１］
細胞性免疫応答活性の測定方法
（１）刺激用のペプチドプール
　標準型Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成するスパイクタンパク質のアミノ酸配列を元に作製されたオーバーラップペプチドプール製品である、ＰｅｐＧｅｎ Ｓｆ、及び変異型オミクロンＢ．１．１．５２９株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を構成するスパイクタンパク質のアミノ酸配列を元に作製されたオーバーラップペプチドプール製品である、ＰｅｐＧｅｎ Ｓｏを刺激抗原として使用した。これらのペプチドプールはそれぞれ、スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５アミノ酸長断片に相当する複数のペプチドから構成され、隣接するペプチドが互いに１１アミノ酸オーバーラップして、スパイクタンパク質の全長をカバーしている（カバー率１００％）。
　ＰｅｐＧｅｎＳｏには、ＰｅｐＧｅｎＳｆと比較して、以下のアミノ酸変異が含まれている：Ａ６７Ｖ、Ｈ６９－、Ｖ７０－、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２－、Ｖ１４３－、Ｙ１４４－、Ｙ１４５Ｄ, Ｎ２１１－、Ｌ２１２Ｉ、２１４Ｒと２１５Ｄの間の“ＥＰＥ”挿入、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ, Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ。
（２）ペプチド刺激用プレートの準備及び保管
　それぞれのペプチドプールを、抗原希釈液（２０％のＤＭＳＯを含むＰＢＳバッファー）中に２０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。各ペプチドプール溶液を５μＬずつ、細胞培養プレートの異なるウェルに分注した。また、ペプチドプール溶液の他、陰性コントロールとして上記抗原希釈液単独を、及び、免疫細胞の刺激を確認するための陽性コントロールとして２０μｇ／ｍＬのＬＰＳを含む抗原希釈液を調製し、それぞれ５μＬずつ細胞培養プレートの異なるウェルに分注した。これらの溶液が分注された細胞培養プレート（以下、ペプチド刺激用プレートと記す）を、－８０℃のフリーザーで凍結し保管した。
（３）全血のペプチド刺激
　凍結保管していたペプチド刺激用プレートを２５℃で保持し、ペプチドプール溶液を融解した。ヘパリンＮａ採血管中に採取された、採血後２４時間以内の全血を、ペプチド刺激用プレートの各ウェルに１２０μＬずつ添加し、攪拌し混合した。その後、３７℃で４時間インキュベートすることにより、全血に含まれる白血球の刺激を行った。刺激後の全血サンプルを－８０℃で凍結し保管した。
（４）全血に含まれる白血球の捕捉
　（３）で凍結したペプチド刺激用プレートを、３７℃で１５分間保持し、全血サンプルを融解した。ポリブチレンテレフタレート繊維膜のフィルターを各ウェルに有するマルチウェルフィルタープレートのウェルに、フィルター洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳバッファー）を１５０μＬずつ添加し、２５００ｇ、４℃で１分間遠心分離した。その後、上記全血サンプルをウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１０分間静置した後、２５００ｇ、４℃で２分間遠心分離を行い、フィルター上に白血球を捕捉した。なお、この実施例の文脈では、「遠心分離」とは、遠心分離機でプレートを回転させてプレートの底方向に遠心力を掛けることを意味する。
（５）ｍＲＮＡの溶出及び捕捉
　細胞溶解バッファーを、上記フィルタープレートの各ウェルのフィルター上に６０μＬずつ添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、フィルター上の白血球を溶解した。オリゴ（ｄＴ）が各ウェルに固定化されている別のマルチウェルプレート（以下、ｍＲＮＡ捕捉用プレートという）を、上記フィルタープレートの下に配置して両プレートのウェルを上下に重ならせ、２５００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。フィルタープレートを取り外し、細胞溶解液をウェル中に受け入れたｍＲＮＡ捕捉用プレートを４℃で１～２４時間インキュベートした。インキュベーション後、洗浄バッファーを用いて各ウェルを洗浄し、細胞溶解液中に含まれていたオリゴ（ｄＴ）非結合性物質を取り除いた。
（６）ｃＤＮＡの合成
　逆転写酵素を含む逆転写バッファーを、ｍＲＮＡ捕捉用プレートの各ウェルに３０μＬずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。この操作により、ｍＲＮＡ捕捉用プレートに捕捉されていたポリＡテール化ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が合成された。
（７）ｑＰＣＲ
　ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘに、各遺伝子（アクチンベータ：ＡＣＴＢ、インターフェロンガンマ：ＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１Ａ）用のプライマー対（表１に配列を示す）を混合し、ＰＣＲ用プレートの各ウェルに６μＬずつ分注した。上記（６）で得られたｃＤＮＡ溶液を４μＬずつウェルに添加し、７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、当該システムの取扱説明書に従い、下記のサイクルでリアルタイムＰＣＲを行った。
　Ｓｔａｇｅ１：９５℃　１０：００，　
　Ｓｔａｇｅ２：４０ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　９５℃　００：３０　ａｎｄ　６５℃　１：００，　
　Ｓｔａｇｅ３：Ｍｅｌｔｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ
　ここで、ＡＣＴＢのセンス（Sense）プライマー配列は配列番号１、ＡＣＴＢのアンチセンス（Antisense）プライマー配列は配列番号２、ＩＦＮＧのセンスプライマー配列は配列番号３、ＩＦＮＧのアンチセンスプライマー配列は配列番号４、ＣＸＣＬ９のセンスプライマー配列は配列番号５、ＣＸＣＬ９のアンチセンスプライマー配列は配列番号６、ＣＸＣＬ１０のセンスプライマー配列は配列番号７、ＣＸＣＬ１０のアンチセンスプライマー配列は配列番号８、ＩＬ－１Ａのセンスプライマー配列は配列番号９、ＩＬ－１Ａのアンチセンスプライマー配列は配列番号１０である。
（８）測定結果の解析方法
　リアルタイムＰＣＲにより得られた各遺伝子の測定値は、反応の閾値を満たすサイクル数であるＣｔ値で表された。また、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ遺伝子のＣｔ値を用いて、検出対象遺伝子（ＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１Ａ）のＣｔ値をノーマライズし、ノーマライズされたＣｔ値を遺伝子発現量へ換算することで、刺激により発現増加したｍＲＮＡ量を概算した。すなわち、概算したｍＲＮＡ発現量を、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と比較することで、ペプチド刺激特異的なｍＲＮＡ発現量を決定し、結果はｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．で表現した。例えば、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が０のときは、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量と刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量とが同じであることを意味し、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が１のときは、刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量が、未刺激サンプルのｍＲＮＡ発現量の２倍であることを意味する。従って、ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．が大きいほど、ペプチド刺激で誘導されたｍＲＮＡ発現量が増加したことを意味する。
（９）ＩＦＮγ　ｍＲＮＡ測定法の感度とペプチドカバー率の関係
　臨床検査において、陽性検体を検査した場合に当該陽性検体が陽性と判断される割合を感度といい、感度が高いほど、陽性者を陽性として正しく判定する可能性が高い検査法であるということができる。臨床検査において、一般的に、感度が７０％以上となることが要求される。図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種を受け、場合によってはＣＯＶＩＤ－１９感染歴もあり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する細胞性免疫保持が従来法でも確認された個体からの、細胞性免疫応答活性が陽性である複数の検体に基づいて、本実施形態で使用されるＩＦＮγ　ｍＲＮＡ測定法が細胞性免疫陽性を検出する感度を調べた結果を示す。この実験では、スパイクタンパク質のカバー率が異なるペプチドプールを用いて、上述のように検体の刺激を行い、さらに上述のようにリアルタイムＰＣＲによりＩＦＮγのｍＲＮＡレベルを測定した。図１に示されるように、カバー率と感度は相関しており、約４０％以上のカバー率であるペプチドプールを使用することにより約７０％以上の感度が得られた。
［実施例２］
ブレイクスルー感染検体の測定１（ＩＦＮγ）
（１）ブレイクスルー感染検体の入手
　ＣＯＶＩＤ－１９　ｍＲＮＡワクチンを２回以上接種した約１００人のワクチン接種者から、最後のワクチン接種の約３か月後に１回目の採血を行い、その後約３か月ごとに２回目及び３回目の採血を行った。この約９カ月の間にさらに追加のワクチン接種を受けたか否かに関わらず、この約３カ月間隔３回の採血スケジュールを保った。採血にはヘパリンＮａ採血管を使用した。ワクチン接種後の感染すなわちブレイクスルー感染の有無は、まず、採血時の問診により、前回採血から今回採血までのあいだに新たにＣＯＶＩＤ－１９の陽性診断歴（より具体的には、ＰＣＲ検査による陽性判明）があった否かを確認することにより決定した。またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染によりワクチン接種とは独立に血漿中に増加する抗ヌクレオカプシドタンパク質抗体の有無を検体において確認した。前回採血から今回採血までのあいだに診断歴がなくとも、血漿中にこの抗体の存在を検出することにより、ブレイクスルー感染の事実が決定された。
　約１００例のワクチン接種者のうち、２回目又は３回目の採血の際に過去約３カ月のあいだのブレイクスルー感染の事実が確認されたワクチン接種者が１６例見出された。これら１６例を以下の表２に示す。表２において、灰色で示された箇所は、前回の採血時から今回の採血時の間にブレイクスルー感染があったことを示している。これらの例のブレイクスルー感染において発症していた症状は、日本の厚生労働省の「新型コロナウイルス感染症　ＣＯＶＩＤ－１９　診療の手引き（第８．０版）」として公開された重症度分類に基づいて「軽症」と判断された。表２において、「無自覚」と表記されたブレイクスルー感染者は、無症状であったがＰＣＲ検査で感染が判明した者、又は無症状でありかつ検査もしていなかった者と推定される。
＊ブレイクスルー感染者６は、２回目採血の前の約４カ月のあいだにブレイクスルー感染の事実がＰＣＲ検査により確認されたが、２回目採血の時点では検体中の抗ヌクレオカプシドタンパク質抗体価（表中「抗核抗体」）が低下していたと見られた。
（２）ブレイクスルー感染前の誘導ＩＦＮγのｍＲＮＡ発現レベルと感染後の症状との関係
　３回の採血のうち、ブレイクスルー感染が確認された回の直前の回で得られた検体から測定されたＩＦＮγのｍＲＮＡ発現レベル（すなわち検体のペプチド刺激によって誘導されたＩＦＮγのｍＲＮＡ発現レベル）と、ブレイクスルー感染後の症状との関係を解析した。実施例１の方法に従いＩＦＮγのｍＲＮＡ発現レベルを測定した。症状発症者及び無自覚者の測定値の分布を図２ａ，ｃに示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標準株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプールであるＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆで刺激された場合の検体のＩＦＮγ　ｍＲＮＡ発現レベル（ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．）に対しＳｔｕｄｅｎｔ－ｔ－検定を実施した結果、無自覚者（「Unnoticed」）のブレイクスルー感染前のＩＦＮγ　ｍＲＮＡ発現レベル（図２ａ左）が、症状発症者（「Mild」）のブレイクスルー感染前のＩＦＮγ　ｍＲＮＡ発現レベル（図２ａ右）に比べて高い傾向にあることが判明した（図２ａ；片側ｐ値＝０．０３６, 両側ｐ値＝０．０７４）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプールであるＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを用いて検体の刺激を行った場合も、同様の結果が得られた（図２ｃ；片側ｐ値＝０．０３５、両側ｐ値＝０．０７１）。
　さらに、ＲＯＣ分析を実施した結果、ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆを検体の刺激に用いた場合のカットオフ値は２．３１０（感度：０．８７５、特異度０．６２５）であり、ＡＵＣは０．７５０（ＣＩ：０．４９６４－１．００００）であった（図２ｂ）。また、ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを検体の刺激に用いた場合のカットオフ値は５．０９０（感度：０．５７１、特異度：１．０００）であり、ＡＵＣは０．７６７９（ＣＩ：０．５０４７－１．００００）であった（図２ｄ）。これらのカットオフ値は、上記方法で測定されるＩＦＮγのｍＲＮＡの発現レベルに基づいてブレイクスルー感染時に無症状となる可能性を予測することについてのカットオフ値であると解することができる。
（３）従来法による細胞性免疫応答活性の測定
　上記（２）と同じブレイクスルー感染者の検体を用いて、細胞性免疫応答活性測定の従来法であるＥＬＩＳｐｏｔアッセイも行った。このＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、刺激された細胞から分泌されるＩＦＮγタンパク質を、プレートウェル上にコーティングされた抗体で捕捉し、ＩＦＮγタンパク質分泌箇所（スポット）を可視化して定量化することにより、細胞性免疫応答活性を測定するものである。この場合もＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆ及びＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを刺激抗原として使用した。市販キットであるＢＤ（商標）ＥＬＩＳｐｏｔ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、当該製品の取扱説明書に従って、ペプチド刺激及びＩＦＮγタンパク質の検出を行った。陰性コントロールとして、ペプチドで刺激しないウェルを準備した。ＥＬＩＳｐｏｔ法のウェル上に生じたスポットの濃さ（スポット強度）を測定し、陰性コントロールにおけるスポット強度を、ペプチド刺激したサンプルのスポット強度から差し引いたΔＳｐｏｔ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを求めた。
　ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆで刺激した検体でＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定された細胞性免疫活性（ＤＳｐｏｔ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、症状発症者と無自覚者との間で差はなく（両側ｐ値＝０．３７１）、症状の有無と細胞性免疫活性測定値との間に関連性は見出されず、測定された細胞性免疫活性は中央値だけを見るとむしろ症状発症者の方が高かった（図３ａ）。ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏで刺激した検体の場合も、症状発症者と無自覚者との間で差はなく（両側ｐ値＝０．４４６）、症状の有無と細胞性免疫活性測定値との間に関連性は見出されなかった（図３ｃ）。ＲＯＣ解析を実施したところ、ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆを刺激に使用した場合の細胞性免疫活性のカットオフ値は２１．６３５（感度：０．６２５、特異度０．７５０）となり、ＡＵＣは０．６２５（ＣＩ：０．３１７９－０．９３２１）となった（図３ｂ）。ＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを刺激に使用した場合の細胞性免疫活性のカットオフ値は４６．０７５（感度：０．７５０、特異度：０．６２５）となり、ＡＵＣは０．６０９４（ＣＩ：０．３０２７－０．９１６４）となった（図３ｄ）。
（４）抗体検査によるブレイクスルー感染検体の液性免疫の測定
　上記（２）と同じブレイクスルー感染者の検体を用いて、液性免疫の度合いを示す抗体検査も行った。市販キットであるＡＩＡ（商標）－ＣＬ用 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳＰ－ＩｇＧ抗体測定試薬（東ソー社製）を、当該キットの取扱説明書に従って使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するＩｇＧの血漿レベルを測定した。抗スパイクタンパク質抗体価（ＩＵ／ｍＬ）は、症状発症者と無自覚者との間で差はなく（両側ｐ値＝０．５０９）、症状の有無と測定値との間に関連性は見出されなかった（図４ａ）。ＲＯＣ解析を実施したところ、カットオフ値は２２．４５０（感度：０．６２５、特異度０．７５０）となり、ＡＵＣは０．５６２５（ＣＩ：０．２４８５－０．８７６５）となった（図４ｂ）。
［実施例３］
ブレイクスルー感染検体の測定２（ＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１Ａ）
（１）ブレイクスルー感染検体
　実施例２と同じ検体（表２に記載）を使用した。但し、表２のブレイクスルー感染者１の検体量が足りずに当該感染者の検体が使用できなかったため、「ブレイクスルー感染者１」を除く７症例を無自覚者の検体として使用した。
（２）ブレイクスルー感染前の誘導されたＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡ発現レベルと感染後の症状との関係
　実施例２（２）と同様の方法で、３回の採血のうち、ブレイクスルー感染が確認された回の直前の回で得られた検体から測定されたＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡのｍＲＮＡ発現レベル（すなわち検体のペプチド刺激によって誘導されたＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡ発現レベル）と、ブレイクスルー感染後の症状との関係を解析した。実施例１の方法に従いＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡのｍＲＮＡ発現レベルを測定した。なお、刺激用のペプチドプールとしてＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆを用いてペプチド刺激を行った。症状発症者及び無自覚者の測定値の分布を図５ａ（ＩＦＮγ）、図５ｃ（ＣＸＣＬ９）、図５ｅ（ＣＸＣＬ１０）、図５ｇ（ＩＬ－１Ａ）に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標準株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプールであるＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆで刺激された場合の検体のＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡのｍＲＮＡ発現レベル（ｌｏｇ２Ｆ．Ｉ．）に対しＷｅｌｃｈ’ｓ－ｔ－検定を実施した結果、無自覚者（「Unnoticed」）のブレイクスルー感染前のＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡのｍＲＮＡ発現レベル（それぞれ図５ａ左、図５ｃ左、図５ｅ左、及び図５ｇ左）が、症状発症者（「Mild」）のブレイクスルー感染前のＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡｍＲＮＡ発現レベル（それぞれ図５ａ右、図５ｃ右、図５ｅ右、及び図５ｇ右）に比べて高い傾向にあることが判明した（図５ａ：片側ｐ値＝０．０４９, 両側ｐ値＝０．０９８、図５ｃ：片側ｐ値＝０．００６, 両側ｐ値＝０．０１２、図５ｅ：片側ｐ値＝０．０４６, 両側ｐ値＝０．０９２、図５ｇ：片側ｐ値＝０．０４０, 両側ｐ値＝０．０８０）。
　さらに、ＲＯＣ分析を実施した結果を図５ｂ（ＩＦＮγ）、図５ｄ（ＣＸＣＬ９）、図５ｆ（ＣＸＣＬ１０）及び図５ｈ（ＩＬ－１Ａ）に示す。ＩＦＮγのカットオフ値は５．８２２（感度：０．４２９、特異度１．０００）となり、ＡＵＣは０．７１４（ＣＩ：０．４３４１－０．９９４５）となった（図５ｂ）。ＣＸＣＬ９のカットオフ値は６．３８５（感度：０．８５７、特異度０．８７５）となり、ＡＵＣは０．８５７（ＣＩ：０．６０９８－１．００００）となった（図５ｄ）。ＣＸＣＬ１０のカットオフ値は６．２３４（感度：０．７１４、特異度０．８７５）となり、ＡＵＣは０．７５０（ＣＩ：０．４４９０－１．００００）となった（図５ｆ）。ＩＬ－１Ａのカットオフ値は４．６７３（感度：０．８５７、特異度０．６２５）となり、ＡＵＣは０．７６８（ＣＩ：０．５１０６－１．００００）となった（図５ｈ）。
（３）刺激用のペプチドプールとしてＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを用いる細胞性免疫応答活性の測定　刺激用のペプチドプールとして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプールであるＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを用いて、実施例３（１）及び（２）と同じ方法で、ブレイクスルー感染前の誘導されたＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡのｍＲＮＡ発現レベルと感染後の症状との関係を解析した。ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１ＡのｍＲＮＡ発現レベルは、実施例１の方法に従い測定した。症状発症者及び無自覚者の測定値の分布を図６ａ（ＩＦＮγ）、図６ｃ（ＣＸＣＬ９）に示す。図６ａ及び図６ｃの通り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプールであるＰｅｐＧｅｎ　Ｓｏを用いて検体の刺激を行った場合も、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標準株のスパイクタンパク質に対応するペプチドプールであるＰｅｐＧｅｎ　Ｓｆで刺激された場合と同様の結果が得られた（図６ａ：片側ｐ値＝０．０３６, 両側ｐ値＝０．０７１、図６ｃ：片側ｐ値＝０．０３５, 両側ｐ値＝０．０７１）。さらに、ＲＯＣ解析の結果を図６ｂ（ＩＦＮγ）、図６ｄ（ＣＸＣＬ９）に示す。ＩＦＮγのカットオフ値は５．０９０（感度：０．５７１、特異度１．０００）となり、ＡＵＣは０．７６８（ＣＩ：０．５０４７－１．００００）となった（図６ｂ）。ＣＸＣＬ９のカットオフ値は６．９６７（感度：０．７１４、特異度１．０００）となり、ＡＵＣは０．８２１（ＣＩ：０．５４０６－１．００００）となった（図６ｄ）。
関連出願への相互参照
　本願は、２０２３年６月８日に出願された日本国特許出願第２０２３－０９４６５０号、及び２０２３年１０月１９日に出願された日本国特許出願第２０２３－１８０３５０号の利益を主張し、これらの出願は参照によりその全体がここに組み入れられる。

Claims (6)

  1. 　ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶのワクチン接種を受けた被験者において、前記ワクチン接種後のブレイクスルー感染における症状を予測するためのデータを収集する方法であって、
    　（１）前記被験者から採取された、白血球を含む検体を準備する工程と、
    　（２）前記検体に複数のペプチドを添加し、水性媒体中で、前記検体と前記複数のペプチドとをインキュベートする工程と、
    　（３）工程（２）の後、前記白血球における、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）、ＣＸＣモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）及びインターロイキン－１Ａ（ＩＬ－１Ａ）から成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程と
    を含み、
    　前記複数のペプチドは、ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶスパイクタンパク質のアミノ酸配列の複数の断片に相当する複数のペプチドであり、かつ、前記スパイクタンパク質のアミノ酸配列全長の４０％以上をカバーしており、
    　前記ＩＦＮγのｍＲＮＡの発現レベルが、予測参照レベル以上である場合には、前記被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、前記被験者はブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測される、方法。
  2. 　前記複数のペプチドが、前記スパイクタンパク質のアミノ酸配列の１５～２０アミノ酸長の断片に相当する複数のペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記複数のペプチドは、前記スパイクタンパク質のアミノ酸配列に沿って隣接するペプチドが互いに１０～１４アミノ酸オーバーラップしている、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記検体は全血である、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記工程（３）において、前記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）法である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキットであって、
    　（１）前記複数のペプチドを含むペプチドセット；
    　（２）ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＩＬ－１Ａから成る群より選択されるいずれかのＴ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルを測定するための測定試薬；及び
    　（３）測定される前記Ｔ細胞機能関連マーカーのｍＲＮＡの発現レベルが、予測参照レベル以上である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に無症状となると予測され、予測参照レベル未満である場合には、被験者はブレイクスルー感染した場合に症状が出ると予測されることを説明する、説明書
    を含む、キット。
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COSMA CHIARA, GALLA LUISA, PADOAN ANDREA, FURLAN GIULIA, MARCHIORO LUCIO, ZANINOTTO MARTINA, BASSO DANIELA, PLEBANI MARIO: "SARS-CoV-2 specific T-cell humoral response assessment after COVID-19 vaccination using a rapid direct real-time PCR amplification", CLINICAL CHEMISTRY AND LABORATORY MEDICINE, DE GRUYTER, DE, vol. 61, no. 9, 1 August 2023 (2023-08-01), DE , pages 1652 - 1660, XP093246134, ISSN: 1434-6621, DOI: 10.1515/cclm-2023-0129 *
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