WO2024252453A1 - サンプル溶液分離デバイス、サンプル溶液分離システム、及びサンプル溶液分離方法 - Google Patents

サンプル溶液分離デバイス、サンプル溶液分離システム、及びサンプル溶液分離方法 Download PDF

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solid phase
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樹生 中川
惟夫 香村
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    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum

Definitions

  • the present invention relates to a sample solution separation device, a sample solution separation system, and a sample solution separation method for separating a sample solution.
  • Digital PCR (Polymerase Chain Reaction) is a technology that detects nucleic acids with high sensitivity, and compared to conventional real-time quantitative PCR, it can detect low-frequency gene mutations.
  • Patent Document 1 discloses a method in which a port is sealed to create a vacuum inside the container and the sample solution is drawn into the container.
  • Non-Patent Document 1 discloses a method in which the container is degassed, the outlet valve is closed, and the inlet valve is opened to put in the solution.
  • Patent Document 2 discloses a configuration in which a gas-liquid separation filter is used to eject the solution without wasting it.
  • a sample solution containing the target DNA is separated into multiple compartments, and PCR is performed on each compartment to determine the type of DNA present in each compartment.
  • the target DNA can be measured with high sensitivity.
  • one suitable application is liquid biopsy to detect cell-free DNA (cfDNA), which exists in trace amounts in blood.
  • Cell-free DNA may contain ctDNA (circulating tumor DNA), which is DNA derived from tumors, and by measuring the type and proportion of mutations in ctDNA, it is expected to be used in cancer diagnosis, treatment selection, and monitoring of treatment effectiveness.
  • cfDNA and ctDNA are present in blood in minute quantities, they need to be measured with high sensitivity.
  • digital PCR the sample solution is separated into multiple micro-volume chambers for measurement. In this process, not all of the sample solution can be used, and some solution cannot be separated into micro-volume chambers and cannot be measured; this results in dead volume.
  • To measure with high sensitivity it is necessary to measure as much of the collected sample solution as possible. In other words, it is necessary to reduce the dead volume of the sample solution.
  • the present invention has been made in consideration of the above, and one of its objectives is to provide a sample solution separation device, a sample solution separation system, and a sample solution separation method that can reduce the dead volume of the sample solution.
  • the sample solution separation device of the present invention is a sample solution separation device that separates a sample solution, and includes a plurality of microchambers, a flow path connecting the plurality of microchambers, a first opening that is an inlet for the sample solution to the flow path, a valve provided between the first opening and the plurality of microchambers, a second opening that is an inlet for a separation liquid to the flow path separating the plurality of microchambers in which the sample solution is contained and is provided on the opposite side of the first opening across the plurality of microchambers, and a solid phase provided between the second opening and the plurality of microchambers, the solid phase being breathable, water repellent to the sample solution, and permeable to the separation liquid.
  • the sample solution separation system of the present invention is a sample solution separation device that separates a sample solution, and includes a plurality of microchambers, a flow path connecting the plurality of microchambers, a first opening that is an inlet for the sample solution to the flow path, a valve provided between the first opening and the plurality of microchambers, a second opening that is an inlet for a separation liquid to the flow path separating the plurality of microchambers in which the sample solution is contained and is provided on the opposite side of the first opening across the plurality of microchambers, and a solid phase provided between the second opening and the plurality of microchambers, the solid phase being breathable, water repellent to the sample solution, and permeable to the separation liquid, a pump that degasses the air in the plurality of microchambers and the flow path through the solid phase from the second opening, valve control means that opens the valve, and separation liquid introduction means that introduces the separation liquid from the second opening.
  • the sample solution separation method of the present invention includes preparing a sample solution separation device that separates a sample solution, the sample solution separation device including a plurality of microchambers, a flow path connecting the plurality of microchambers, a first opening that is an inlet for the sample solution to the flow path, a valve provided between the first opening and the plurality of microchambers, a second opening that is an inlet for a separation liquid to the flow path separating the plurality of microchambers in which the sample solution is contained and is provided on the opposite side of the first opening across the plurality of microchambers, and a solid phase provided between the second opening and the plurality of microchambers, the solid phase being breathable, water repellent to the sample solution, and permeable to the separation liquid; degassing the plurality of microchambers and the flow path through the solid phase; opening the valve to introduce the sample solution into the plurality of microchambers and the flow path from the first opening; and introducing the separation liquid into the flow path from the second opening through
  • sample solution separation device sample solution separation system, and sample solution separation method of the present invention, it is possible to reduce the dead volume of the sample solution when separating the sample solution into a plurality of microchambers.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a sample solution separation device 101 according to a first embodiment.
  • 1 is a diagram showing a state in which a sample solution 201 and a separation liquid 202 are introduced into a sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a state in which a sample solution 201 and a separation liquid 202 are introduced into a sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a state in which a sample solution 201 and a separation liquid 202 are introduced into a sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a state in which a sample solution 201 and a separation liquid 202 are introduced into a sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a state in which a sample solution 201 and a separation liquid 202 are introduced into a sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a state in which a sample solution 201 and
  • FIG. 1 is a flow diagram when a sample solution 201 and a separation liquid 202 are introduced into the sample solution separation device 101 according to Example 1, and the sample solution 201 is separated into a microchamber 105.
  • FIG. FIG. 4 is a configuration diagram of a sample solution separation system 400 that separates and introduces a sample solution 201 to a sample solution separation device 101 according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a configuration diagram of a sample solution separation device 501 according to a second embodiment.
  • FIG. 6 is a top view of a sample solution separation device 601 according to a third embodiment.
  • FIG. 11 is a side view of a sample solution separation device 601 according to a third embodiment.
  • FIG. 7 is a configuration diagram of a sample solution separation system 700 that separates and introduces a sample solution 201 into a sample solution separation device 601 according to a third embodiment.
  • FIG. 11 is a configuration diagram of a sample solution separation device 801 according to a fourth embodiment.
  • FIG. 13 is a configuration diagram of a digital PCR system 900 according to a fifth embodiment.
  • FIG. 13 is an operation flow diagram of the digital PCR system 900 according to the fifth embodiment.
  • Example 1 A sample solution separation device 101 according to Example 1 will be described with reference to Fig. 1 to Fig. 4.
  • Fig. 1 is a configuration diagram of the sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • the sample solution separation device 101 is a device that separates and stores a sample solution in a plurality of microchambers 105.
  • the sample solution separation device 101 includes a first opening 102, a valve 103, a flow path 104, a plurality of microchambers 105, a solid phase 106, and a second opening 107.
  • the flow path 104 is connected to the first opening 102 via the valve 103.
  • a plurality of microchambers 105 are connected to the flow path 104.
  • the flow path 104 is also connected to the second opening 107 via the solid phase 106. That is, the flow path 104 connects the first opening 102, the plurality of microchambers 105, and the second opening 107.
  • the first opening 102 is an inlet for the sample solution to enter the flow path 104.
  • the valve 103 is provided between the first opening 102 and the multiple microchambers 105.
  • the second opening 107 is an inlet to the flow path 104 of the separation liquid that separates the multiple microchambers 105 in which the sample solution is contained. This second opening 107 is provided on the opposite side of the first opening 102, sandwiching the multiple microchambers 105 between them.
  • the solid phase 106 is provided between the second opening 107 and the multiple microchambers 105.
  • the solid phase 106 is breathable, water repellent to the sample solution, and permeable to the separation liquid.
  • FIGS. 2A to 2D are diagrams showing the introduction of a sample solution 201 and a separation liquid 202 into the sample solution separation device 101 according to Example 1.
  • the sample solution 201 is introduced into the first opening 102.
  • the valve 103 is closed (FIG. 2A).
  • the air inside the flow channel 104 and the microchamber 105 is degassed from the second opening 107 through the solid phase 106.
  • the flow channel 104 and the microchamber 105 are put into a vacuum state.
  • the solid phase 106 is a solid that is breathable, hydrophobic, and lipophilic.
  • the breathability of the solid phase 106 allows air to pass through, and as described above, the flow path 104 and the microchamber 105 can be placed in a vacuum state.
  • the hydrophobicity of the solid phase 106 repels aqueous solutions such as the sample solution 201, preventing the sample solution 201 from passing through.
  • the sample solution 201 drawn into the flow channel 104 stops when it reaches the solid phase 106. Since the inside of the microchamber 105 is in a vacuum state, the sample solution 201 continues to be drawn in. Then, the inside of the microchamber 105 becomes filled with the sample solution 201 ( Figure 2C).
  • the separation liquid 202 used to separate the multiple microchambers 105 containing the sample solution 201 is a liquid (e.g., oil) that has physical properties that make it immiscible with the sample solution 201.
  • the solid phase 106 is lipophilic, allowing it to pass through the separation liquid 202.
  • the sample solution 201 in the flow channel 104 is replaced with the separation liquid 202.
  • the separation liquid 202 is introduced from the second opening 107. Since the solid phase 106 is lipophilic and has the property of passing the separation liquid 202, the separation liquid 202 is introduced from the second opening 107 through the solid phase 106 into the flow channel 104.
  • the sample solution 201 in the flow channel 104 is pushed back toward the first opening 102, and the flow channel 104 is filled with the separation liquid 202 ( Figure 2D). At this time, the sample solution 201 remains in the microchamber 105, so the sample solution 201 in the multiple microchambers 105 is separated by the separation liquid 202 in the flow channel 104.
  • the solid phase 106 that is breathable, hydrophobic, and lipophilic, it is possible to remove air from within the flow channel 104 and the microchamber 105, and to stop the sample solution 201 at the position of the solid phase 106.
  • the solid phase 106 can introduce the separation liquid 202 into the flow channel 104 and divide and encapsulate the sample solution 201 within the microchamber 105.
  • FIG. 3 is a flow diagram showing the process of introducing a sample solution 201 and a separation liquid 202 into the sample solution separation device 101 according to the first embodiment, and separating the sample solution 201 into the microchamber 105.
  • the sample solution 201 is placed in the first opening 102 (S301). At this time, the valve 103 closes the flow path 104.
  • the pump 403 (see FIG. 4) connected to the second opening 107 is driven, and the air in the flow channel 104 and the multiple microchambers 105 is discharged through the solid phase 106 and the second opening 107 (S302). As a result, the flow channel 104 and the multiple microchambers 105 are placed in a vacuum state.
  • the valve 103 opens the flow path 104, and the sample solution 201 is introduced from the first opening 102 through the valve 103 into the flow path 104 and the multiple microchambers 105 (S303).
  • the pump 405 (see FIG. 4) connected to the second opening 107 is driven, and the separation liquid 202 is introduced into the flow path 104 through the second opening 107 and the solid phase 106 (S304).
  • the sample solution 201 in the flow path 104 is pushed back toward the first opening 102 by the separation liquid 202, and the sample solution 201 in the flow path 104 is replaced by the separation liquid 202, and the multiple microchambers 105 are separated by the separation liquid 202.
  • the valve 103 may be closed to prevent the sample solution 201 in the multiple microchambers 105 and the separation liquid 202 in the flow path 104 from moving.
  • FIG. 4 is a configuration diagram of a sample solution separation system 400 that separates and introduces a sample solution 201 into a sample solution separation device 101 according to the first embodiment.
  • the sample solution separation system 400 includes a valve control mechanism 401, an opening contact portion 402, a pump 403, an opening contact portion 404, a pump 405, a moving mechanism 406, and the sample solution separation device 101.
  • the valve control mechanism 401 (valve control means) controls the opening and closing of the valve 103.
  • the valve control mechanism 401 changes the valve 103 from a closed state to an open state.
  • the opening contact portion 402 is connected to the second opening 107 of the sample solution separation device 101.
  • the opening contact portion 402 is also connected to a pump 403 that draws a vacuum in the flow path 104 and the multiple microchambers 105.
  • the movement mechanism 406 moves the opening contact portion 402 to connect it to the second opening 107 when drawing a vacuum in the flow path 104 and the multiple microchambers 105.
  • the pump 403 degass the air in the flow path 104 and the microchambers 105 through the second opening 107 and the solid phase 106, and draws a vacuum in the flow path 104 and the multiple microchambers 105.
  • the opening contact portion 404 is connected to the second opening 107 of the sample solution separation device 101.
  • the opening contact portion 404 is also connected to a pump 405 that introduces the separation liquid 202 into the flow path 104.
  • the moving mechanism 406 (switching means) connects the opening contact part 402 to the second opening 107 when degassing the flow path 104 and the multiple microchambers 105.
  • the moving mechanism 406 also moves the opening contact part 404 to connect it to the second opening 107 when introducing the separation liquid 202 into the flow path 104. In other words, the moving mechanism 406 switches the connection destination of the second opening 107 to the pump 403 or the pump 405.
  • the pump 405 (separation liquid introduction means) introduces the separation liquid 202 from the second opening 107 through the solid phase 106 into the flow path 104.
  • the pump 403 used to draw the vacuum is a pump that can reduce the pressure from atmospheric pressure to, for example, about 5 kPa to 0.01 kPa. If the degree of vacuum is high, more air can be expelled from the microchamber 105, and more sample solution 201 can be put in.
  • the pump 405 for introducing the separation liquid 202 may be, for example, a syringe pump.
  • the syringe pump pushes out the separation liquid 202 that has been installed in advance, and introduces the separation liquid 202 into the flow path 104.
  • the pump 405 may be one that sucks up the separation liquid 202 in a container that has been installed in advance, and pushes the aspirated separation liquid 202 into the flow path 104.
  • the pump 405 may be one that pressurizes the separation liquid 202 to introduce it into the flow path, and may be, for example, a constant volume discharge pump, a diaphragm pump, or a rotary pump. By pressurizing the separation liquid 202 when introducing it into the flow path 104, it is possible to push the separation liquid 202 in even when there is resistance from the solid phase 106 or flow path resistance.
  • the solid phase 106 is a porous membrane.
  • the solid phase 106 is made of PTFE (polytetrafluoroethylene).
  • the solid phase 106 is porous and breathable, allowing air to pass through, is water-repellent, allowing the sample solution 201 to stop, and is lipophilic, allowing the separation liquid 202 to pass through.
  • the solid phase 106 may also be made of PFA (perfluoroalkoxyalkylene), FEP (fluoroethylenepropylene), ETFE (ethylenetetrafluoroethylene), or a fluorine-based water-repellent membrane, a silicon-based water-repellent membrane, a polymer-based water-repellent membrane, or a nanoporous membrane.
  • the solid phase 106 does not have to be a membrane, and may be made of hydrophobic beads packed into the flow path 104.
  • the beads are hydrophobic, and can repel the sample solution 201 and stop it.
  • As the porous membrane a hydrophobic membrane with a contact angle with water of, for example, 80 degrees or more may be used.
  • the solid phase 106 is made of a material that is lipophilic and allows the separation liquid 202 to permeate and pass through so that the separation liquid 202 can pass through.
  • Non-Patent Document 1 a valve was used instead of the solid phase 106, as in the method disclosed in, for example, Non-Patent Document 1.
  • the sample solution can be stopped by closing the valve, and air can be removed or a separation liquid can be introduced by opening the valve.
  • the valve is a pinch valve that crushes the tube, a volume is required for the part from the flow path to the tube and for the sample solution to pass through the tube.
  • the sample solution remaining in this tube cannot be used for measurement, and becomes a dead volume. This dead volume reduces the amount of measurable target DNA, leading to a decrease in detection sensitivity.
  • the solid phase 106 of Example 1 the solid phase 106 can be placed near the microchamber 105, and the dead volume of the sample solution 201 can be reduced.
  • the solid phase 106 of Example 1 can be mounted on the flow path 104, so that dead volume such as that of a valve can be suppressed.
  • the sample solution 201 remaining in the flow path 104 can become dead volume, the volume of the sample solution 201 remaining in the flow path 104 can be minimized by designing and processing the cross-sectional area of the flow path 104 to be small, and the dead volume of the sample solution 201 can be reduced.
  • the valve 103 is used before the sample solution 201 is introduced into the flow path 104.
  • the valve 103 is closed during vacuuming and is open when the sample solution 201 is introduced.
  • a one-time valve that is opened only once when the sample solution 201 is introduced into the flow path 104 can be used as the valve 103.
  • a resin film is used as the valve, which is normally closed and is opened by breaking the film when the sample solution 201 is introduced. In this way, it is possible to provide a low-cost and small device.
  • the valve 103 may be an electromagnetic valve or a pinch valve that crushes a tube.
  • the separation liquid 202 a liquid having physical properties that are not miscible with the sample solution 201 is used.
  • the separation liquid 202 can be an oil such as silicone oil or mineral oil, paraffin wax, or a photocurable resin.
  • the separation liquid 202 may be a photocurable resin.
  • the photocurable resin is introduced in a liquid state into the flow path 104.
  • the photocurable resin is then solidified by irradiation with light such as ultraviolet light, and the sample solution 201 can be separated and sealed in the multiple microchambers 105 in which it is contained.
  • multiple types of separation liquids may be used instead of one type.
  • the photocurable resin and oil are introduced in this order from the second opening 107.
  • the photocurable resin reaches the vicinity of the valve 103, and the flow path 104 is filled with oil.
  • the photocurable resin is then hardened to seal the end of the flow path 104 with the photocurable resin, and the microchambers 105 are separated by oil.
  • the sample solution 201 is, for example, a solution containing the DNA to be measured, polymerase, buffer, primers, and probes.
  • the volume of the solution is adjusted to about 10 ⁇ L to about 50 ⁇ L.
  • Example 1 the dead volume of the sample solution 201 can be reduced compared to a conventional configuration in which valves are used on both sides of the flow path. Therefore, most of the prepared sample solution 201 can be used for measurement, enabling highly sensitive detection.
  • another liquid such as oil may be introduced in succession to the sample solution 201.
  • another liquid such as oil
  • This allows the inside of the flow channel 104 to be filled with separation liquid such as oil, so that the dead volume of the sample solution 201 in the flow channel 104 can be further reduced.
  • the separation liquid 202 is introduced, the liquid pushed back into the first opening 102 becomes oil (separation liquid) and acts as a lid, making it possible to prevent the nucleic acid in the sample solution 201 from diffusing into the atmosphere.
  • the sample solution separation device 101 in which the sample solution 201 is separated and introduced into the multiple microchambers 105 undergoes a PCR thermal cycle.
  • the target DNA is amplified by PCR in the multiple microchambers 105 through the thermal cycle.
  • the thermal cycle is set, for example, at a high temperature of 95°C for 20 seconds and a low temperature of 60°C for 40 seconds, with the double strand dissociated at the high temperature and annealed and extended at the low temperature, resulting in PCR amplification.
  • the target DNA that has been separated and introduced into the multiple microchambers 105 can be detected by measuring the fluorescence of the amplified product.
  • the volume of the microchambers 105 is, for example, about several pL to several nL, and the number of microchambers 105 is about several thousand to several million.
  • the target DNA is divided among many microchambers 105, thereby reducing the amount of background DNA and enabling the target DNA to be detected with high sensitivity.
  • the opening contact portion 402 and the opening contact portion 404 are switched using the moving mechanism 406 (switching means), but the flow path may also be switched using an electromagnetic valve or the like.
  • the microchambers 105 and the flow channels 104 are connected by a thin connecting flow channel that branches off from the main flow channel.
  • This thin connecting flow channel robustly separates the multiple microchambers 105.
  • the connecting flow channel has a smaller flow channel cross-sectional area than the main flow channel. Also, since the microchambers 105 beyond the connecting flow channel are filled with the sample solution 201, the separation liquid 202 does not enter the microchambers 105 from the connecting flow channel, but flows through the main flow channel.
  • the sample solution 201 becomes droplets in the microchambers 105, and the multiple microchambers 105 are separated by the separation liquid 202.
  • the separation liquid 202 does not enter the microchambers 105 but passes through the channel 104, allowing the sample solution 201 to be separated.
  • FIG. 5 is a configuration diagram of a sample solution separation device 501 according to a second embodiment.
  • the sample solution separation device 501 includes a first opening 102, a valve 103, a flow channel 104, a plurality of microchambers 105, a plurality of solid phases 506a to 506d, and a second opening 107. Note that the same description as in the first embodiment will be omitted as appropriate.
  • the flow channel 104 is branched to connect to a large number of microchambers 105.
  • a plurality of branch flow channels 104a to 104d branched from the main flow channel are connected to a large number of microchambers 105, and then merge again and are connected to the second opening 107.
  • the solid phases 501a to 501d that allow air to pass, stop the sample solution 201, and allow the separation liquid 202 to pass can be installed at a plurality of locations between the microchambers 105 and the second opening 107.
  • 5, solid phases 501a to 501d are provided in each of a plurality of branch flow paths 104a to 104d of the flow path 104.
  • the number of the branch flow paths 104a to 104d and the number of the solid phases 501a to 501d are not limited to four, and may be two to three, or five or more.
  • Example 2 by arranging the solid phases 501a to 501d closer to the microchamber 105 than in Example 1, the amount of sample solution 201 remaining in the flow channel 104 can be reduced, and the dead volume of the sample solution 201 can be reduced.
  • Example 3 The sample solution separation device 601 of Example 3 will be described with reference to FIGS. 6A, 6B, and 7.
  • FIG. 6A is a top view of the sample solution separation device 601 according to Example 3
  • FIG. 6B is a side view of the sample solution separation device 601 according to Example 3.
  • the sample solution separation device 601 includes a first opening 602, a valve 603, a flow path 604, a plurality of microchambers 605, a solid phase 606, and a second opening 607. Note that the same explanation as in Examples 1 and 2 will be omitted as appropriate.
  • the flow path 604 and the microchamber 605 are processed in a substrate 608.
  • through-holes 610 and 611 penetrating the substrate 608 are formed.
  • the through-hole 610 is connected to the first opening 602 through the valve 603, and the through-hole 611 is connected to the second opening 607 through the solid phase 606.
  • the side of the substrate 608 on which the multiple microchambers 605 and the flow channels 604 are formed is sealed with a film 609 .
  • the flow path 604 of the sample solution separation device 601 of Example 3 has a horizontal flow path 604a that is connected to multiple microchambers 605 and extends horizontally, and a vertical flow path 604b (through holes 610 and 611) that is connected to the horizontal flow path 604a and extends vertically.
  • the solid phase 606 is provided at the upper end of the vertical flow path 604b (through hole 611).
  • the material of the substrate 608 or the film 609 is resin, but the present invention is not limited to this.
  • the material of the substrate 608 or the film 609 may be COP (cycloolefin polymer) or COC (cycloolefin copolymer), which have low autofluorescence.
  • the material of the substrate 608 or the film 609 may be polycarbonate, polypropylene, PMMA (methacrylic resin), or the like.
  • a part of the substrate 608 or the film 609 may be a metal such as aluminum, which has high thermal conductivity, or a material such as carbon, which can suppress light reflection.
  • the valve 603 is a normally-closed seal arranged to block the through-hole 610, and is a one-time valve that changes from a closed state to an open state when a hole is made.
  • a first opening 602 having a volume capable of receiving the sample solution 201 is arranged on the top of this valve 603.
  • the solid phase 606 is in the form of a membrane and arranged to block the through-hole 611.
  • a second opening 607 having a volume capable of receiving the separation liquid 202 is arranged on the top of the solid phase 606.
  • the sample solution separation system 700 includes a vacuum pump 701, a pressure sensor 702, a filter 703, an electromagnetic valve 704, a moving mechanism 705, an opening contact portion 706, an opening contact portion 707, an electromagnetic valve 708, a liquid pump 709, a container 710, a filter 711, a pressure sensor 712, a pressure pump 713, a valve control mechanism 714, an opening cover 715, a light source 717, a temperature regulator 718, a controller 719, and a sample solution separation device 601.
  • the sample solution 201 is filled in advance in the first opening 602 and is placed so as to be in contact with the top of the valve 603. At this time, the valve 603 is in a closed state.
  • An opening lid 715 is provided on the first opening 602.
  • a pointed part 716 that has a sharp tip and can break the seal (valve 603) is provided on the inside of the upper surface of the opening lid 715.
  • the upper surface of the opening lid 715 is made of an elastic material, such as an elastomer or rubber.
  • the second opening 607 of the sample solution separation device 601 and the opening contact part 706 are connected by controlling the moving mechanism 705 (switching means).
  • the solenoid valve 704 connects or disconnects the vacuum pump 701 and the opening contact part 706.
  • the vacuum pump 701 evacuates the flow path 604 and the multiple microchambers 605 of the sample solution separation device 601.
  • the valve control mechanism 714 (valve control means) presses the upper part of the opening lid 715, causing the pointed part 716 to break the valve 603. This causes the valve 603 to be in an open state.
  • the valve 603 is formed of a thin film seal such as aluminum or resin, and can be broken by the pointed part 716. Because the flow channel 604 and the multiple microchambers 605 are depressurized, the sample solution 201 is drawn into the flow channel 604 and the multiple microchambers 605, and the flow channel 604 and the multiple microchambers 605 are filled with the sample solution 201. Because the solid phase 606 is water repellent, the sample solution 201 passing through the flow channel 604 stops at the solid phase 606.
  • the inside of the flow channel 604 and the microchambers 605 can be negatively pressurized by the vacuum pump 701 until the tip of the sample solution 201 reaches the solid phase 606, and the degree of vacuum can be increased.
  • the solenoid valve 704 is used to seal the flow path 604, connect the vacuum pump 701 to the opening contact part 706, and open to the atmosphere.
  • the flow path 604 of the sample solution separation device 601 is opened to atmospheric pressure.
  • the movement mechanism 705 then connects the opening contact part 707 to the second opening 607.
  • the solenoid valve 708 connects the opening contact part 707 to the liquid pump 709.
  • the liquid pump 709 sucks the separation liquid 202 placed in advance in the container 710 and discharges it toward the opening contact part 707.
  • the separation liquid 202 is introduced into the flow path 604 through the second opening 607 and the solid phase 606.
  • the solenoid valve 708 switches the connection of the second opening 607 from the liquid pump 709 to the pressure pump 713.
  • the pressure pump 713 pressurizes the separation liquid 202 and pushes it into the flow path 604.
  • the pressure pump 713 introduces the separation liquid 202 into the flow path 604 by pressurizing it with a pressure that exceeds the flow path resistance of the flow path 604 and the resistance when passing through the solid phase 606.
  • the pressure when pressurizing is determined by the separation liquid 202, the size of the flow path 604, the properties of the solid phase 606, etc., and is, for example, about 10 kPa to 200 kPa.
  • the sample solution 201 in the flow path 604 is pushed back to the first opening 602 side, and the flow path 604 is filled with the separation liquid 202. In this way, the sample solution 201 remains in each microchamber 605 and is separated by the separation liquid 202. In addition, by applying pressure to introduce the separation liquid 202 into the flow path 604, the expansion of any air bubbles remaining for some reason can be suppressed and the separation liquid 202 can be introduced into the flow path 604.
  • the separation liquid 202 may also be a photocurable resin.
  • a photocurable resin that is not miscible with the sample solution 201, the sample solution 201 can be separated into each microchamber 605.
  • the photocurable resin is cured using the light source 717. This allows the sample solution 201 to be sealed within the microchamber 605.
  • the temperature of the sample solution separation device 601 can also be controlled using the temperature regulator 718.
  • the viscosity of the sample solution 201 or separation liquid 202 decreases when the temperature is high. Therefore, by heating the sample solution 201 or separation liquid 202 compared to room temperature, the viscosity of the sample solution 201 or separation liquid 202 decreases, making it easier for the sample solution 201 or separation liquid 202 to enter the flow path 604 or microchamber 605. This makes it possible to shorten the time required to introduce the solutions (sample solution 201 and separation liquid 202) and to robustly introduce the sample solution 201 into all microchambers 605.
  • the pressure when the vacuum pump 701 is drawing a vacuum is monitored and controlled by the pressure sensor 702.
  • the pressure when the pressure pump 713 is applying pressure is monitored and controlled by the pressure sensor 712.
  • Filters 703 and 711 also prevent dust and other particles from getting into the sample solution 201 and the separation solution 202.
  • the series of operations described above is controlled by a controller 719.
  • the controller 719 has a processor 720, a memory 721, and an interface 722.
  • the processor 720 executes various programs on the memory 721, and outputs control signals for controlling the operations described above via the interface 722.
  • the valve control mechanism 714 is, for example, a solenoid that moves when a current flows through it, thereby opening the valve 603.
  • the movement mechanism 705 is, for example, a two-axis motor drive mechanism with horizontal and vertical axes.
  • the solid phase 606 which is breathable, hydrophobic, and lipophilic, it is possible to control the vacuuming of the flow path 604, the stopping of the sample solution 201, and the passage of the separation liquid 202 without using a valve. In addition, it is possible to place the solid phase 606 close to the microchamber 605, so that the sample solution 201 can be divided and placed in the microchamber 605 without wasting the sample solution 201.
  • valve 603 By using a one-time valve configured to make a hole in a thin film as the valve 603, a valve with a simple configuration can be implemented. Since the valve 603 comes into contact with the sample solution 201, it needs to be disposable to prevent carryover, so a one-time valve is useful. Also, since the valve 603 has a simple configuration, it can be provided at low cost. Also, by using a photocurable resin as the separation liquid 202 and putting it in the flow path 604 in liquid form and then solidifying it, the microchamber 605 can be sealed. This eliminates the need to close the first opening 602 and the second opening 607, making it possible to simplify the configuration.
  • the valve 603 may be perforated with a pipette tip.
  • the sample solution separation device 601 according to the third embodiment may also be applied to an automated system that is connected to sample pretreatment, such as nucleic acid extraction, reagent mixing, and dispensing.
  • sample pretreatment such as nucleic acid extraction, reagent mixing, and dispensing.
  • a specimen collected in a blood collection tube is centrifuged to extract plasma, and the plasma is purified to extract nucleic acid in the plasma.
  • the nucleic acid is mixed with a reagent, and the target nucleic acid is detected by digital PCR.
  • a dispensing system that aspirates and discharges the mixed sample solution with a pipette tip is used to inject the sample solution 201 into the first opening 602.
  • the valve may be broken with the tip of the pipette tip, and the sample solution 201 may be introduced into the flow path.
  • the dead volume of the sample solution 201 can be further reduced. Specifically, after the sample solution 201 is introduced into the microchamber 605 by negative pressure, the oil (separation liquid) continuously enters the flow channel 604, so that the sample solution 201 remaining in the flow channel 604 can be reduced. In this state, by introducing the separation liquid 202 from the second opening 607 in the opposite direction to the sample solution 201, the sample solution 201 in the flow channel 604 can be completely replaced with the separation liquid 202, and the multiple microchambers 605 can be separated.
  • the oil (separation liquid) introduced continuously with the sample solution 201 plays the role of a lid that prevents the nucleic acid in the sample solution 201 from becoming an aerosol and being released into the atmosphere. By doing so, the dead volume of the sample solution 201 can be further reduced compared to the case where only the sample solution 201 is introduced from the first opening 602.
  • the separation liquid 202 in the container 710 is introduced into the flow path 604 through the second opening 607, but the present invention is not limited to this.
  • the separation liquid 202 may be filled in the sample solution separation device 601 in advance, and the separation liquid 202 filled in the sample solution separation device 601 may be introduced into the flow path 604.
  • FIG. 8 is a configuration diagram of a sample solution separation device 801 according to a fourth embodiment.
  • the solid phase 806 of the sample solution separation device 801 according to the fourth embodiment is a plurality of particles having air permeability, hydrophobicity, and lipophilicity.
  • the plurality of particles are packed in the through-hole 611 (vertical flow channel) to form the solid phase 806.
  • the particles are, for example, beads having a size of 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the particles are easier to introduce into the flow channel 604 than a membrane.
  • air can pass between the particles, so that vacuum drawing is possible.
  • the particles are water repellent, so that the sample solution 201 can be stopped.
  • the particles are lipophilic, so that they can pass through the separation liquid 202.
  • the valve 603 is a one-time valve, but the present invention is not limited to this.
  • the valve 803 of the sample solution separation device 800 according to the fourth embodiment may be an elastic tube. The tube is stretched to connect with the through-hole 610 of the substrate 608 to form the valve 803.
  • the valve 803 is a silicone tube. The silicone tube is compressed to form a pinch valve that stops the flow in the tube. By using the pinch valve, it can be opened and closed multiple times. The valve 803 is closed when drawing a vacuum, and the valve 803 is opened when introducing the sample solution 201. After the introduction of the separation liquid 202, the valve 803 is closed to seal the sample solution 201 and the separation liquid 202.
  • Example 5 The sample solution separation device of the present invention can be used for digital PCR.
  • Fig. 9 is a configuration diagram of a digital PCR system 900 according to Example 5.
  • the digital PCR system 900 includes a sample solution separation device 601, a valve control mechanism 901, a pump 902, a liquid pump 903, a temperature regulator 913, an optical system 914 (measurement means), and an analysis unit 912.
  • the optical system 914 includes a light source 904, a lens 905, a lens 908, a lens 910, a bandpass filter 906, a bandpass filter 909, a dichroic mirror 907, and a CMOS sensor 911.
  • the sample solution 201 is placed in the sample solution separation device 601 through the first opening 602.
  • the air in the flow path 604 and the microchamber 605 is degassed through the second opening 607, creating a negative pressure.
  • the valve control mechanism 901 opens the valve 603, and the sample solution 201 is introduced into the flow path 604 and the microchamber 605.
  • the separation liquid 202 is introduced into the flow path 604 via the second opening 607. In this way, the sample solution 201 can be separated and introduced into multiple microchambers 605.
  • the sample solution 201 is a PCR reaction solution containing the DNA to be detected, polymerase, buffer, primers, and probe.
  • a thermal cycle process is performed on a device in which the sample solution 201, which is the PCR reaction solution, is separated and placed in a number of microchambers 605.
  • the temperature regulator 913 is controlled to a temperature range in which denaturation, annealing, and extension are performed.
  • the temperature regulator 913 is composed of a heater, Peltier element, etc., but the present invention is not limited to this. If the DNA to be measured is present in the microchambers 605, the target DNA is amplified by the thermal cycle process.
  • the optical system 914 measures the target nucleic acid in the PCR-amplified sample solution 201.
  • the light emitted from the light source 904 is collimated by the lens 905, the bandpass filter 906 transmits light of a specific wavelength, is reflected by the dichroic mirror 907, passes through the lens 908, and is irradiated onto the sample solution separation device 601.
  • the fluorescence from the microchamber 605 of the sample solution separation device 601 passes through the lens 908, the dichroic mirror 907, the bandpass filter 909, and the lens 910, and is imaged by the CMOS sensor 911.
  • the analysis unit 912 performs an analysis based on the image captured by the CMOS sensor 911, and detects the target DNA in each microchamber.
  • FIG. 10 is an operational flow diagram of the digital PCR system 900 according to the fifth embodiment.
  • the valve control mechanism 901 opens the valve 603 and introduces the sample solution 201 set in the first opening 602 into the sample solution separation device 601 (S1001).
  • the liquid pump 903 introduces the separation liquid 202 from the second opening 607 into the sample solution separation device 601 (S1002). This causes the sample solution 201 to be separated and introduced into the multiple microchambers 605.
  • the temperature regulator 913 subjects the sample solution separation device 601 to a thermal cycle (S1003).
  • the optical system 914 irradiates the sample solution separation device 601 with light and measures the fluorescence intensity of each microchamber 605 (S1004).
  • the analysis unit 915 analyzes the fluorescence intensity measured by the optical system 914 to detect the target DNA in the sample solution 201 (S1005).
  • the sample solution 201 and the separation liquid 202 may be heated. This changes the viscosity of the sample solution 201 and the separation liquid 202, making it easier to introduce them into the flow path 604. In addition, the time required to introduce the sample solution 201 and the separation liquid 202 can be shortened.
  • the temperature regulator that heats the sample solution 201 and the separation liquid 202 may be the temperature regulator 913 that performs a thermal cycle, or may be a temperature regulator separate from the temperature regulator 913.
  • Asymmetric PCR can be performed by varying the concentrations of the forward primer and reverse primer in the PCR reaction solution, so that one of the single-stranded DNAs is amplified more in the amplified products. In this way, single-stranded DNA is detected using a molecular beacon.
  • the temperature of the sample solution separation device is controlled during fluorescence measurement, and melting curve analysis is performed. Fluorescence measurement is performed in multiple colors using multiple filters. Highly multiplexed and highly sensitive measurements can be achieved by identifying the target DNA using the fluorescence color, fluorescence intensity, and melting temperature of each microchamber.
  • sample solution separation method a method for separating the sample solution 201 into a plurality of microchambers 105 will be described.
  • the sample solution separation method includes the following steps: Preparing the above-mentioned sample solution separation device 101; Degassing the air in the plurality of microchambers 105 and the flow channel 104 via the solid phase 106; The method includes opening a valve 103 and introducing a sample solution 201 from a first opening 102 into the multiple microchambers 105 and the flow channel 104, and introducing a separation liquid 202 from a second opening 107 into the flow channel 104 via the solid phase 106.
  • the sample solution separation device 101 to be prepared may be the sample solution separation device 501, 601 or 801.
  • the sample solution separation method is as follows: carrying out a thermal cycle of PCR (polymerase chain reaction) on the sample solution separation device 101 in which the sample solution 201 is separated into the multiple microchambers 105; The method further includes measuring the fluorescence intensity of the plurality of microchambers 105, and analyzing the fluorescence intensity to detect the target DNA in the sample solution 201.
  • PCR polymerase chain reaction
  • introducing the sample solution 201 from the first opening 102 into the multiple microchambers 105 and the flow path 104 includes introducing the sample solution 201 and oil (separation liquid) following the sample solution 201 from the first opening 102.
  • the present disclosure is not limited to the above-described embodiments, and includes various modified examples.
  • the above-described embodiments have been described in detail to clearly explain the present disclosure, and are not necessarily limited to those having all of the configurations described.
  • it is possible to replace a part of the configuration of one embodiment with the configuration of another embodiment and it is also possible to add the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment.
  • a separation liquid is used to separate the multiple microchambers 105, but the present invention is not limited to this, and a separation gas may also be used.
  • the solid phase only needs to have physical properties that allow the separation gas to pass through.

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Abstract

デッドボリュームの少ないサンプル溶液分離デバイスを提供する。サンプル溶液分離デバイス（１０１）は、複数のマイクロチャンバ（１０５）と、複数のマイクロチャンバ（１０５）を接続する流路（１０４）と、サンプル溶液の流路（１０４）への導入口である第一の開口部（１０２）と、第一の開口部（１０２）と複数のマイクロチャンバ（１０５）との間に設けられたバルブ（１０３）と、サンプル溶液が収容される複数のマイクロチャンバ（１０５）間を分離する分離液の流路への導入口であって、複数のマイクロチャンバを挟んで第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部（１０７）と、第二の開口部（１０７）と複数のマイクロチャンバ（１０５）との間に設けられる固相（１０６）と、を備え、固相（１０６）は、通気性を有し、サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ分離液に対して通過性を有する。

Description

サンプル溶液分離デバイス、サンプル溶液分離システム、及びサンプル溶液分離方法
　本発明は、サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイス、サンプル溶液分離システム、及びサンプル溶液分離方法に関する。
　デジタルＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）は、核酸を高感度に検出する技術であり、従来のリアルタイム定量ＰＣＲと比較して、低頻度な遺伝子変異を検出することができる。
　デジタルＰＣＲは、サンプル溶液を微小な体積に分割した後、分割された溶液内でＰＣＲを実施し、計測対象のＤＮＡを増幅し、計測する。サンプル溶液を微小な容器に入れる方法として、特許文献１には、ポートをシールして容器内を真空化し、サンプル溶液を容器内に引き込む方法が開示されている。また、非特許文献１には、容器内を脱気し、アウトレット側のバルブを閉じ、インレット側のバルブを開けて溶液を入れる方法が開示されている。特許文献２には、気液分離フィルタを用いて、溶液を無駄にすることなく吐出する構成が開示されている。
米国特許第１１３０５２７６号明細書 特許第４８８８７７３号公報
Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ　２０２０，　１１，　１０２５；　ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｉ１１１２１０２５
　デジタルＰＣＲでは、検出対象のＤＮＡを含むサンプル溶液を多数の区画に分離し、各々の区画に対してＰＣＲを行い、各区画内に存在するＤＮＡの種類の判別を行う。各区画内に分離した後にＰＣＲを行うことにより、高感度に対象ＤＮＡを計測できることが特徴である。例えば、血液中に微量に存在するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出する液体生検が適した応用の一つである。セルフリーＤＮＡには腫瘍由来のＤＮＡであるｃｔＤＮＡ（ｃｉｒｃｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ）が含まれる場合があり、ｃｔＤＮＡの変異の種類や割合を計測することにより、がんの診断、治療選択及び治療効果のモニタリングへの応用が期待されている。
　ｃｆＤＮＡやｃｔＤＮＡは血液中に微量に存在するため、高感度に計測する必要がある。デジタルＰＣＲでは、サンプル溶液を複数の微小体積のチャンバに分離して計測する。その際に、サンプル溶液の全てを使用できるものではなく、微小体積のチャンバに分離できず、計測することができない溶液、すなわち、デッドボリュームが生じる。高感度に計測するためには、収集したサンプル溶液を可能な限り多く計測する必要がある。すなわち、サンプル溶液のデッドボリュームを削減する必要がある。
　本発明は、このようなことに鑑みてなされたものであり、その目的の一つは、サンプル溶液のデッドボリュームを削減することが可能なサンプル溶液分離デバイス、サンプル溶液分離システム、及びサンプル溶液分離方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明のサンプル溶液分離デバイスは、サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイスであって、複数のマイクロチャンバと、複数のマイクロチャンバを接続する流路と、サンプル溶液の流路への導入口である第一の開口部と、第一の開口部と複数のマイクロチャンバとの間に設けられるバルブと、サンプル溶液が収容される複数のマイクロチャンバ間を分離する分離液の流路への導入口であって、複数のマイクロチャンバを挟んで第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部と、第二の開口部と複数のマイクロチャンバとの間に設けられる固相と、を備え、固相は、通気性を有し、サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ分離液に対して通過性を有する。
　また、本発明のサンプル溶液分離システムは、サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイスであって、複数のマイクロチャンバと、複数のマイクロチャンバを接続する流路と、サンプル溶液の流路への導入口である第一の開口部と、第一の開口部と複数のマイクロチャンバとの間に設けられるバルブと、サンプル溶液が収容される複数のマイクロチャンバ間を分離する分離液の流路への導入口であって、複数のマイクロチャンバを挟んで第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部と、第二の開口部と複数のマイクロチャンバとの間に設けられる固相と、を備え、固相は、通気性を有し、サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ分離液に対して通過性を有する、サンプル溶液分離デバイス、複数のマイクロチャンバ及び流路内の空気を第二の開口部から固相を通じて脱気するポンプ、及びバルブを開放するバルブ制御手段と、第二の開口部から分離液を導入する分離液導入手段、を有する。
　また、本発明のサンプル溶液分離方法は、サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイスであって、複数のマイクロチャンバと、複数のマイクロチャンバを接続する流路と、サンプル溶液の流路への導入口である第一の開口部と、第一の開口部と複数のマイクロチャンバとの間に設けられるバルブと、サンプル溶液が収容される複数のマイクロチャンバ間を分離する分離液の流路への導入口であって、複数のマイクロチャンバを挟んで第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部と、第二の開口部と複数のマイクロチャンバとの間に設けられる固相と、を備え、固相は、通気性を有し、サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ分離液に対して通過性を有する、サンプル溶液分離デバイス、を準備すること、固相を介して、複数のマイクロチャンバ及び流路内の空気を脱気すること、バルブを開放し、第一の開口部からサンプル溶液を複数のマイクロチャンバ及び流路に導入すること、及び第二の開口部から固相を介して分離液を流路に導入すること、を有する。
　本発明のサンプル溶液分離デバイス、サンプル溶液分離システム、及びサンプル溶液分離方法によれば、複数のマイクロチャンバにサンプル溶液を分離する際に、サンプル溶液のデッドボリュームを削減することが可能となる。
　その他の課題と新規な特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明らかになるであろう。
実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１の構成図である。 実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入する様子を示した図である。 実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入する様子を示した図である。 実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入する様子を示した図である。 実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入する様子を示した図である。 実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入し、サンプル溶液２０１をマイクロチャンバ１０５に分離する際のフロー図である。 実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１を分離して導入するサンプル溶液分離システム４００の構成図である。 実施例２に係るサンプル溶液分離デバイス５０１の構成図である。 実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１の上面図である。 実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１の側面図である。 実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１にサンプル溶液２０１を分離して導入するサンプル溶液分離システム７００の構成図である。 実施例４に係るサンプル溶液分離デバイス８０１の構成図である。 実施例５に係るデジタルＰＣＲシステム９００の構成図である。 実施例５に係るデジタルＰＣＲシステム９００の動作フロー図である。
　以下の実施の形態においては便宜上その必要があるときは、複数のセクション又は実施の形態に分割して説明するが、特に明示した場合を除き、それらは互いに無関係なものではなく、一方は他方の一部又は全部の変形例、詳細、補足説明等の関係にある。また、以下の実施の形態において、要素の数等（個数、数値、量、範囲等を含む）に言及する場合、特に明示した場合及び原理的に明らかに特定の数に限定される場合等を除き、その特定の数に限定されるものではなく、特定の数以上でも以下でも良い。
　さらに、以下の実施の形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合及び原理的に明らかに必須であると考えられる場合等を除き、必ずしも必須のものではないことは言うまでもない。同様に、以下の実施の形態において、構成要素等の形状、位置関係等に言及するときは、特に明示した場合及び原理的に明らかにそうでないと考えられる場合等を除き、実質的にその形状等に近似又は類似するもの等を含むものとする。このことは、上記数値及び範囲についても同様である。
　なお、実施の形態を説明するための全図において、同一の部材には原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する。
（実施例１）
　実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１について、図１～図４を用いて説明する。図１は、実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１の構成図である。サンプル溶液分離デバイス１０１は、サンプル溶液を複数のマイクロチャンバ１０５に分離して収容するデバイスである。サンプル溶液分離デバイス１０１は、第一の開口部１０２、バルブ１０３、流路１０４、複数のマイクロチャンバ１０５、固相１０６、及び第二の開口部１０７を備える。
　流路１０４は、バルブ１０３を介して第一の開口部１０２に接続される。流路１０４には、複数のマイクロチャンバ１０５が接続される。また、流路１０４は、固相１０６を介して第二の開口部１０７に接続される。すなわち、流路１０４は、第一の開口部１０２、複数のマイクロチャンバ１０５、及び第二の開口部１０７を接続する。
　第一の開口部１０２は、サンプル溶液の流路１０４への導入口である。
　バルブ１０３は、第一の開口部１０２と複数のマイクロチャンバ１０５との間に設けられる。
　第二の開口部１０７は、サンプル溶液が収容される複数のマイクロチャンバ１０５間を分離する分離液の流路１０４への導入口である。この第二の開口部１０７は、複数のマイクロチャンバ１０５を挟んで第一の開口部１０２の反対側に設けられる。
　固相１０６は、第二の開口部１０７と複数のマイクロチャンバ１０５との間に設けられる。固相１０６は、通気性を有し、サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ分離液に対して通過性を有する。
　図２Ａ～図２Ｄは、実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入する様子を示した図である。
　まず、サンプル溶液２０１は、第一の開口部１０２に導入される。サンプル溶液２０１が第一の開口部１０２に導入される時点では、バルブ１０３は閉鎖している（図２Ａ）。バルブ１０３を閉鎖したその後、第二の開口部１０７から、固相１０６を通じて、流路１０４及びマイクロチャンバ１０５の内部の空気を脱気する。すなわち、流路１０４及びマイクロチャンバ１０５を真空状態にする。
　流路１０４及びマイクロチャンバ１０５を真空状態にして、バルブ１０３を開けることにより、サンプル溶液２０１は、流路１０４及びマイクロチャンバ１０５に引き込まれる（図２Ｂ）。
　ここで、固相１０６は、通気性、疎水性、親油性を有する固体である。固相１０６の通気性により、空気を通過させることが可能となり、上記したように、流路１０４及びマイクロチャンバ１０５を真空状態にすることができる。また、固相１０６の疎水性により、サンプル溶液２０１のような水溶液を撥水させて、サンプル溶液２０１が通過するのを防止することができる。
　従って、流路１０４内に引き込まれたサンプル溶液２０１は、固相１０６に到達した時点で停止する。マイクロチャンバ１０５内は真空状態であるため、サンプル溶液２０１は、継続して引き込まれる。そして、マイクロチャンバ１０５内は、サンプル溶液２０１により満たされる（図２Ｃ）。
　サンプル溶液２０１が収容された複数のマイクロチャンバ１０５間を分離するための分離液２０２（図２Ｄ参照）は、サンプル溶液２０１と混和しない物性を有するもの（例えば、オイル）を用いる。固相１０６は、親油性を有することにより、この分離液２０２を通過させることができる。
　次に、流路１０４内にあるサンプル溶液２０１は、分離液２０２に置き換えられる。分離液２０２は、第二の開口部１０７より導入される。固相１０６は、親油性を有し、分離液２０２を通過させる性質を有するため、分離液２０２は、第二の開口部１０７から、固相１０６を通じて、流路１０４へと導入される。流路１０４内にあるサンプル溶液２０１は、第一の開口部１０２側へと押し戻され、流路１０４が分離液２０２により満たされる（図２Ｄ）。このとき、サンプル溶液２０１は、マイクロチャンバ１０５内に残るため、流路１０４の分離液２０２により、複数のマイクロチャンバ１０５内のサンプル溶液２０１が分離される。
　このように、通気性、疎水性、親油性を有する固相１０６を用いることにより、流路１０４及びマイクロチャンバ１０５内の空気を抜くことができ、かつ、サンプル溶液２０１を固相１０６の位置で停止させることができる。また、固相１０６は、分離液２０２を流路１０４に導入し、サンプル溶液２０１をマイクロチャンバ１０５内に分割して封入することができる。
　図３は、実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１及び分離液２０２を導入し、サンプル溶液２０１をマイクロチャンバ１０５に分離する際のフロー図である。
　まず、サンプル溶液２０１は、第一の開口部１０２にセットされる（Ｓ３０１）。このとき、バルブ１０３は、流路１０４を閉鎖している。
　その後、第二の開口部１０７に接続されるポンプ４０３（図４参照）が駆動されることにより、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５内の空気が固相１０６及び第二の開口部１０７を介して排出される（Ｓ３０２）。これにより、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５が真空状態となる。
　流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５が真空状態となった後、バルブ１０３が流路１０４を開放することにより、サンプル溶液２０１が第一の開口部１０２からバルブ１０３を介して、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５内に導入される（Ｓ３０３）。
　その後、第二の開口部１０７に接続されるポンプ４０５（図４参照）が駆動されることにより、分離液２０２が第二の開口部１０７及び固相１０６を介して、流路１０４に導入される（Ｓ３０４）。流路１０４内のサンプル溶液２０１は、分離液２０２によって第一の開口部１０２の方向に押し戻され、流路１０４内がサンプル溶液２０１から分離液２０２に置き換わり、複数のマイクロチャンバ１０５間が分離液２０２によって分離される。なお、分離液２０２を流路１０４に導入した後、複数のマイクロチャンバ１０５内のサンプル溶液２０１及び流路１０４内の分離液２０２が移動しないように、バルブ１０３を閉鎖してもよい。
　図４は、実施例１に係るサンプル溶液分離デバイス１０１にサンプル溶液２０１を分離して導入するサンプル溶液分離システム４００の構成図である。サンプル溶液分離システム４００は、バルブ制御機構４０１、開口部コンタクト部４０２、ポンプ４０３、開口部コンタクト部４０４、ポンプ４０５、移動機構４０６、及びサンプル溶液分離デバイス１０１を備える。
　バルブ制御機構４０１（バルブ制御手段）は、バルブ１０３の開閉を制御する。サンプル溶液２０１を複数のマイクロチャンバ１０５内に導入する際には、バルブ制御機構４０１は、バルブ１０３を閉鎖状態から開放状態にする。
　開口部コンタクト部４０２は、サンプル溶液分離デバイス１０１の第二の開口部１０７に接続される。また、開口部コンタクト部４０２は、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５の真空引きを行うポンプ４０３に接続される。移動機構４０６は、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５の真空引きを行う際に、開口部コンタクト部４０２を移動して、第二の開口部１０７に接続する。
　ポンプ４０３は、流路１０４及びマイクロチャンバ１０５内の空気を第二の開口部１０７から固相１０６を通じて脱気し、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５の真空引きを行う。
　開口部コンタクト部４０４は、サンプル溶液分離デバイス１０１の第二の開口部１０７に接続される。また、開口部コンタクト部４０４は、流路１０４に分離液２０２を導入するポンプ４０５に接続される。
　移動機構４０６（切替手段）は、流路１０４及び複数のマイクロチャンバ１０５から空気を脱気する際に、開口部コンタクト部４０２を第二の開口部１０７に接続する。また、移動機構４０６は、流路１０４に分離液２０２を導入する際に、開口部コンタクト部４０４を移動して、第二の開口部１０７に接続する。すなわち、移動機構４０６は、第二の開口部１０７の接続先をポンプ４０３又はポンプ４０５に切り替える。
　ポンプ４０５（分離液導入手段）は、第二の開口部１０７から固相１０６を通じて流路１０４に分離液２０２を導入する。
　真空引きを行うポンプ４０３は、大気圧から、例えば、５ｋＰａ～０．０１ｋＰａ程度まで減圧可能なポンプを用いる。真空度が高ければ、マイクロチャンバ１０５内からより多くの空気を逃がすことができ、より多くのサンプル溶液２０１を入れることができる。
　また、分離液２０２を導入するポンプ４０５は、例えば、シリンジポンプが用いられる。シリンジポンプは、あらかじめ設置されている分離液２０２を押し出して、分離液２０２を流路１０４へと導入する。なお、ポンプ４０５は、あらかじめ設置されている容器内の分離液２０２を吸引し、吸引した分離液２０２を流路１０４に押し出すものであってもよい。ポンプ４０５は、加圧して分離液２０２を流路へ導入するものであってもよく、例えば、定量吐出ポンプ、ダイヤフラムポンプ、ロータリポンプなどであってもよい。分離液２０２を流路１０４に導入する際に分離液２０２を加圧することにより、固相１０６の抵抗や流路抵抗がある状態でも分離液２０２を押し入れることが可能となる。
　固相１０６は、具体的には、多孔質膜が用いられる。例えば、固相１０６は、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）が用いられる。固相１０６は、多孔質で通気性を有するため空気を通過させることができ、撥水性を有するためサンプル溶液２０１を停止させることができ、親油性を有するため分離液２０２を通過させることができる。また、固相１０６は、ＰＦＡ（パーフルオロアルコキシアルキレン）、ＦＥＰ（フルオロエチレンプロピレン）、ＥＴＦＥ（エチレンテトラフルオロエチレン）などや、フッ素系撥水膜、シリコン系撥水膜、ポリマー系撥水膜、ナノ多孔質膜を用いてもよい。また、固相１０６は、膜でなくてもよく、疎水性を持つビーズを流路１０４に詰めたものであってもよい。ビーズは、疎水性を有するため、サンプル溶液２０１を撥水させて停止させることができる。多孔質の膜として、水との接触角が、例えば、８０度以上の疎水性の膜を用いてもよい。また、固相１０６は、分離液２０２を通すことができるように、親油性であり、分離液２０２が染み込み通過できる材質のものを用いる。
　従来は、例えば、非特許文献１に開示されている方法のように、上記した固相１０６ではなく、バルブを用いていた。非特許文献１では、バルブを閉鎖するとサンプル溶液を停止させることができ、開放すると空気を抜くことや分離液を導入することができる。しかしながら、例えば、当該バルブがチューブをつぶすようなピンチバルブである場合、流路からチューブまでの部分及びチューブにサンプル溶液が通過する体積が必要となる。このチューブに残るサンプル溶液は、計測に用いることができないため、デッドボリュームとなる。このデッドボリュームによって、計測可能な対象ＤＮＡが減り、検出感度の低下につながる。一方で、実施例１の固相１０６を用いることにより、固相１０６をマイクロチャンバ１０５の近くに配置することができ、サンプル溶液２０１のデッドボリュームを削減することができる。
　上記したように、実施例１の固相１０６を用いることにより、流路１０４上に固相１０６を実装することができるため、バルブのようなデッドボリュームを抑制することができる。流路１０４に残ったサンプル溶液２０１は、デッドボリュームとなりうるものの、流路１０４の断面積を小さく設計及び加工することにより、流路１０４に残ったサンプル溶液２０１の体積を最小限に抑えることができ、サンプル溶液２０１のデッドボリュームを低減できる。
　また、実施例１では、サンプル溶液２０１を流路１０４に導入する前に、バルブ１０３を用いる。バルブ１０３は、真空引きをしている際には閉鎖状態となり、サンプル溶液２０１を導入する際には開放状態となる。バルブ１０３には、サンプル溶液２０１を流路１０４に導入する際に、一度だけ開放されるワンタイムバルブを使用することもできる。具体的には、例えば、樹脂のフィルムをバルブとして用いて、通常時は閉鎖状態とし、サンプル溶液２０１を導入するときに当該フィルムを破ることにより、開放状態とする。このようにすることで、低コストかつ小型なデバイスを提供することが可能となる。なお、バルブ１０３としては、電磁バルブや、チューブを押しつぶすピンチバルブを用いてもよい。
　分離液２０２としては、サンプル溶液２０１と混和しない物性を有する液体が用いられる。具体的には、例えば、分離液２０２は、シリコーンオイル、ミネラルオイル等のオイル、パラフィンワックス、光硬化樹脂などを用いることができる。
　分離液２０２は、光硬化樹脂であってもよい。光硬化樹脂を用いてサンプル溶液２０１を分離する場合、光硬化樹脂を液体の状態で流路１０４に導入する。その後、紫外線などの光照射により、光硬化樹脂を固化させ、サンプル溶液２０１が収容された複数のマイクロチャンバ１０５内に分離して密閉することができる。また、分離液は１種類でなく、複数種類を用いてもよい。具体的には、例えば、第二の開口部１０７より、光硬化樹脂とオイルをこの順に導入する。光硬化樹脂はバルブ１０３付近まで到達し、流路１０４はオイルにて満たされる。その後、光硬化樹脂を硬化することにより、流路１０４の端を光硬化樹脂にて密閉し、各マイクロチャンバ１０５間はオイルにて分離する構成とすることができる。
　サンプル溶液２０１は、例えば、計測対象のＤＮＡ、ポリメラーゼ、バッファ、プライマー、プローブを含む溶液である。その溶液量は、１０μＬ程度から５０μＬ程度に調整される。
　実施例１では、従来のように流路の両側にバルブを用いる構成と比較し、サンプル溶液２０１のデッドボリュームを削減することができる。そのため、調整したサンプル溶液２０１の大部分を計測に使用することができ、高感度な検出が可能となる。
　なお、第一の開口部１０２にサンプル溶液２０１を導入する際に、サンプル溶液２０１と連続してオイルなどの別の液体（分離液）を入れてもよい。このようにすることにより、オイルでサンプル溶液２０１をマイクロチャンバ１０５に押し込むことが可能となる。これにより、流路１０４内をオイルなどの分離液で満たすことができるので、流路１０４内のサンプル溶液２０１のデッドボリュームをさらに削減することができる。また、分離液２０２を導入した際に、第一の開口部１０２に押し戻される液体がオイル（分離液）となり、蓋の役割を果たすため、サンプル溶液２０１中の核酸が大気中に拡散することを防ぐことが可能となる。
　このようにして、サンプル溶液２０１が多数のマイクロチャンバ１０５に分離して導入されたサンプル溶液分離デバイス１０１は、ＰＣＲのサーマルサイクルが実施される。サーマルサイクルによって、対象ＤＮＡは、複数のマイクロチャンバ１０５内でＰＣＲにより増幅される。サーマルサイクルは、例えば、高温９５℃を２０秒、低温６０℃を４０秒のように設定され、高温時に二本鎖が解離され、低温時にアニーリング、エクステンションされて、ＰＣＲ増幅される。増幅産物を蛍光計測することにより、複数のマイクロチャンバ１０５に分離導入された対象ＤＮＡを検出することができる。
　なお、マイクロチャンバ１０５の体積は、例えば、数ｐＬから数ｎＬ程度であり、マイクロチャンバ１０５の数は、数千個から数百万個程度である。デジタルＰＣＲでは、多数のマイクロチャンバ１０５に対象ＤＮＡを分割することにより、バックグラウンドとなるＤＮＡの量を減らし、対象ＤＮＡを高感度に検出することが可能となる。
　なお、本実施例では、移動機構４０６（切替手段）を用い、開口部コンタクト部４０２及び開口部コンタクト部４０４を切り替えたが、電磁弁などで流路を切り替えてもよい。
　マイクロチャンバ１０５と流路１０４とは、メインの流路から分岐した細い接続用流路により接続される。この細い接続用流路により、複数のマイクロチャンバ１０５間がロバストに分離される。流路１０４に分離液２０２が導入される際には、マイクロチャンバ１０５内に導入されるサンプル溶液２０１は、メイン流路を流れる。接続用流路は、流路断面積がメイン流路よりも小さい。また、接続用流路の先のマイクロチャンバ１０５にはサンプル溶液２０１が満たされているため、分離液２０２は、接続用流路からマイクロチャンバ１０５へは入り込まず、メイン流路を流れる。また、サンプル溶液２０１と分離液２０２との間には、界面張力が働くため、サンプル溶液２０１がマイクロチャンバ１０５内で液滴状になり、分離液２０２により複数のマイクロチャンバ１０５間が分離される。このように、メイン流路よりも断面積の小さい接続用流路を複数のマイクロチャンバ１０５に接続することにより、分離液２０２は、マイクロチャンバ１０５内には入らず、流路１０４を通過し、サンプル溶液２０１を分離することができる。
（実施例２）
　実施例１では、固相１０６が、流路１０４の一か所に配置されている例を説明したが、本発明は、これに限るものではない。図５は、実施例２に係るサンプル溶液分離デバイス５０１の構成図である。サンプル溶液分離デバイス５０１は、第一の開口部１０２、バルブ１０３、流路１０４、複数のマイクロチャンバ１０５、複数の固相５０６ａ～５０６ｄ、及び第二の開口部１０７を備える。なお、実施例１と同様の説明は適宜省略する。流路１０４は、多数のマイクロチャンバ１０５に接続するため分岐される。メイン流路から分岐した複数の分岐流路１０４ａ～１０４ｄは、多数のマイクロチャンバ１０５に接続された後に、再度合流し、第二の開口部１０７に接続される。空気を通過させ、サンプル溶液２０１を停止させ、且つ分離液２０２を通過させる固相５０１ａ～５０１ｄは、マイクロチャンバ１０５と第二の開口部１０７の間の複数個所に設置することができる。図５の例では、流路１０４の複数の分岐流路１０４ａ～１０４ｄのそれぞれに、固相５０１ａ～５０１ｄが設けられる。複数の分岐流路１０４ａ～１０４ｄの個数及び固相５０１ａ～５０１ｄの個数は、４個に限定されず、２～３個であってもよいし、５個以上であってもよい。
　実施例２のように、実施例１と比較して、固相５０１ａ～５０１ｄをよりマイクロチャンバ１０５に接近させて配置することにより、流路１０４に残るサンプル溶液２０１を減らすことができ、サンプル溶液２０１のデッドボリュームを削減することができる。
（実施例３）
　実施例３のサンプル溶液分離デバイス６０１について、図６Ａ、図６Ｂ及び図７を用いて説明する。図６Ａは、実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１の上面図であり、図６Ｂは、実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１の側面図である。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、サンプル溶液分離デバイス６０１は、第一の開口部６０２、バルブ６０３、流路６０４、複数のマイクロチャンバ６０５、固相６０６、及び第二の開口部６０７を備える。なお、実施例１及び実施例２と同様の説明は適宜省略する。流路６０４及びマイクロチャンバ６０５は、基板６０８に加工される。また、流路６０４の一方端及び他方端には、基板６０８を貫通した貫通孔６１０及び６１１が形成される。貫通孔６１０は、バルブ６０３を通じて第一の開口部６０２と接続され、貫通孔６１１は、固相６０６を通じて第二の開口部６０７に接続される。また、基板６０８の複数のマイクロチャンバ６０５及び流路６０４を加工した側は、フィルム６０９により封止される。
　すなわち、実施例３のサンプル溶液分離デバイス６０１の流路６０４は、複数のマイクロチャンバ６０５が接続され、水平方向に延びる水平方向流路６０４ａと、水平方向流路６０４ａに接続され、垂直方向に延びる垂直方向流路６０４ｂ（貫通孔６１０及び６１１）と、を有する。そして、固相６０６は、垂直方向流路６０４ｂ（貫通孔６１１）の上端部に設けられる。
　基板６０８又はフィルム６０９の材質は、樹脂が用いられるが、本発明は、これに限るものではない。例えば、基板６０８又はフィルム６０９の材質は、自家蛍光の低いＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）であってもよいし、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）であってもよい。また、基板６０８又はフィルム６０９の材質は、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ＰＭＭＡ（メタクリル樹脂）などであってもよい。また、基板６０８又はフィルム６０９の一部は、熱伝導性の高いアルミなどの金属、光の反射を抑制できるカーボンなどの材料であってもよい。
　バルブ６０３は、貫通孔６１０を塞ぐように配置されるノーマリークローズのシールであって、穴が空くことによって閉鎖状態から開放状態となるワンタイムバルブである。このバルブ６０３の上部には、サンプル溶液２０１を受け入れることができる容積を持った第一の開口部６０２が配置される。また、固相６０６は、膜状であり、貫通孔６１１を塞ぐように配置される。固相６０６の上部には、分離液２０２を受け入れることができる容積を持つ第二の開口部６０７が配置される。このような構成にすることにより、基板６０８上に、バルブ６０３及び固相６０６を容易に配置できる。また、固相６０６を流路６０４の近くに配置できるため、サンプル溶液２９１のデッドボリュームを削減することができる。
　図７は、実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１にサンプル溶液２０１を分離して導入するサンプル溶液分離システム７００の構成図である。サンプル溶液分離システム７００は、真空ポンプ７０１、圧力センサ７０２、フィルタ７０３、電磁弁７０４、移動機構７０５、開口部コンタクト部７０６、開口部コンタクト部７０７、電磁弁７０８、液体ポンプ７０９、容器７１０、フィルタ７１１、圧力センサ７１２、加圧ポンプ７１３、バルブ制御機構７１４、開口部用蓋７１５、光源７１７、温調器７１８、コントローラ７１９、及びサンプル溶液分離デバイス６０１を備える。
　サンプル溶液２０１は、あらかじめ第一の開口部６０２に充填され、バルブ６０３の上部に接するように設置されている。このとき、バルブ６０３は閉鎖状態である。第一の開口部６０２には、開口部用蓋７１５が設けられている。開口部用蓋７１５の上面内側には、先端が尖っており、シール（バルブ６０３）を破ることができる尖頭部品７１６が設置されている。開口部用蓋７１５の上面は、伸縮性のある材質、例えば、エラストマーやゴムでできている。
　サンプル溶液分離デバイス６０１の第二の開口部６０７と開口部コンタクト部７０６とは、移動機構７０５（切替手段）を制御することにより、接続される。また、電磁弁７０４は、真空ポンプ７０１と開口部コンタクト部７０６とを接続する、又は非接続にする。真空ポンプ７０１は、サンプル溶液分離デバイス６０１の流路６０４及び複数のマイクロチャンバ６０５を真空引きする。流路６０４及び複数のマイクロチャンバ６０５が十分に減圧された後に、バルブ制御機構７１４（バルブ制御手段）が開口部用蓋７１５の上部を押すことにより、尖頭部品７１６は、バルブ６０３を破る。これにより、バルブ６０３が開放状態となる。ここで、バルブ６０３は、上記したように、アルミや樹脂等の薄膜のシールで形成されており、尖頭部品７１６により破ることができる。流路６０４及び複数のマイクロチャンバ６０５が減圧されているため、サンプル溶液２０１が流路６０４及び複数のマイクロチャンバ６０５に引き込まれ、流路６０４及び複数のマイクロチャンバ６０５にサンプル溶液２０１が満たされる。固相６０６が撥水性を有するため、流路６０４を通過するサンプル溶液２０１は、固相６０６で停止する。また、固相６０６は通気性を有するため、サンプル溶液２０１の先端が固相６０６に到達するまで、流路６０４及びマイクロチャンバ６０５内を真空ポンプ７０１により陰圧化することができ、真空度を上げることができる。
　電磁弁７０４は、流路６０４の密閉、真空ポンプ７０１と開口部コンタクト部７０６との接続、及び大気開放に用いる。第二の開口部６０７を大気に開放することにより、サンプル溶液分離デバイス６０１の流路６０４は、大気圧に開放される。その後、移動機構７０５は、開口部コンタクト部７０７と第二の開口部６０７とを接続する。電磁弁７０８は、開口部コンタクト部７０７と液体ポンプ７０９とを接続する。液体ポンプ７０９は、容器７１０内に予め設置された分離液２０２を吸引し、開口部コンタクト部７０７に向けて吐出する。分離液２０２は、第二の開口部６０７及び固相６０６を通じて、流路６０４へと導入される。
　また、電磁弁７０８は、第二の開口部６０７との接続先を、液体ポンプ７０９から加圧ポンプ７１３に切り替える。加圧ポンプ７１３は、分離液２０２を加圧し、流路６０４内に押し込む。加圧ポンプ７１３は、流路６０４の流路抵抗や固相６０６を通過する際の抵抗を超える圧力で加圧することにより、分離液２０２を流路６０４に導入する。加圧する際の圧力は、分離液２０２、流路６０４のサイズ、固相６０６の性質等により決まり、例えば、１０ｋＰａから２００ｋＰａ程度である。流路６０４にあるサンプル溶液２０１は、第一の開口部６０２側へと押し戻され、流路６０４が分離液２０２で満たされる。このようにして、サンプル溶液２０１が各マイクロチャンバ６０５内に残り、分離液２０２により分離される。また、加圧して分離液２０２を流路６０４に導入することにより、何等かの理由により残存した気泡の膨張を抑制して分離液２０２を流路６０４に導入することができる。
　また、分離液２０２は、光硬化樹脂であってもよい。サンプル溶液２０１と混和しない光硬化樹脂を用いることにより、サンプル溶液２０１を各マイクロチャンバ６０５内に分離することができる。この場合、液体状態の光硬化樹脂を流路６０４に導入した後に、光源７１７を用いて、光硬化樹脂を硬化させる。これにより、サンプル溶液２０１をマイクロチャンバ６０５内に密閉することができる。
　また、サンプル溶液２０１や分離液２０２を導入する際に、温調器７１８を用いて、サンプル溶液分離デバイス６０１の温度を制御することも可能である。一般に、サンプル溶液２０１や分離液２０２は、高温にすると粘性が低くなる。従って、室温と比べて加温することにより、サンプル溶液２０１や分離液２０２の粘性が下がり、サンプル溶液２０１や分離液２０２は、流路６０４やマイクロチャンバ６０５に入りやすくなる。これにより、溶液（サンプル溶液２０１及び分離液２０２）導入時間の短縮が可能となり、且つ全てのマイクロチャンバ６０５にロバストにサンプル溶液２０１を入れることが可能となる。温調器７１８による制御は、例えば、３５℃～７０℃程度に加温することが好適である。
　また、真空ポンプ７０１で真空引きをしている際の圧力は、圧力センサ７０２でモニタして制御を行う。加圧ポンプ７１３で加圧している際の圧力は、圧力センサ７１２でモニタして制御を行う。また、フィルタ７０３及びフィルタ７１１は、サンプル溶液２０１や分離液２０２にゴミ等が混入するのを防ぐ。
　上記した一連の動作の制御は、コントローラ７１９により行われる。コントローラ７１９は、プロセッサ７２０、メモリ７２１、及びインターフェース７２２を有する。プロセッサ７２０は、メモリ７２１上で各種プログラムを実行し、インターフェース７２２を介して上記した動作の制御を行うための制御信号を出力する。
　なお、バルブ制御機構７１４は、例えば、ソレノイドであり、電流が流れることにより移動し、バルブ６０３の開放を行う。また、移動機構７０５は、例えば、水平方向と垂直方向の２軸のモータ駆動機構である。
　通気性、疎水性、親油性を持つ固相６０６を用いることにより、バルブを用いることなく、流路６０４の真空引き、サンプル溶液２０１の停止、分離液２０２の通過を制御することが可能となる。また、固相６０６をマイクロチャンバ６０５の近くに配置することが可能となり、サンプル溶液２０１を無駄にすることなく、サンプル溶液２０１をマイクロチャンバ６０５に分割して入れることができる。
　また、バルブ６０３として、薄膜に穴をあける構成のワンタイムバルブを用いることにより、シンプルな構成のバルブを実装できる。バルブ６０３には、サンプル溶液２０１が接するため、キャリーオーバーを防ぐためには、使い捨てにする必要があるため、ワンタイムバルブが有用である。また、バルブ６０３は、シンプルな構成のバルブであるので、低コストでバルブを提供することができる。また、分離液２０２として光硬化樹脂を用いて、液状で流路６０４に入れた後に、固化することにより、マイクロチャンバ６０５を密閉できる。これにより、第一の開口部６０２及び第二の開口部６０７を閉じる必要もなくなり、構成を簡略化することが可能となる。
　なお、バルブ６０３は、ピペットチップで穴をあけてもよい。実施例３に係るサンプル溶液分離デバイス６０１は、核酸の抽出、試薬の混合、分注などを行うサンプル前処理と接続するような自動化システムにも適用可能である。例えば、採血管に採取された検体を遠心分離して血漿を取り出し、血漿を精製することにより血漿内の核酸を抽出する。その核酸を試薬と混合し、デジタルＰＣＲにより対象の核酸を検出する。この際、混合したサンプル溶液をピペットチップにより吸引して吐出する分注システムを用い、第一の開口部６０２にサンプル溶液２０１を注入する。その際に、ピペットチップの先端でバルブを破り、サンプル溶液２０１が流路に導入されるようにしてもよい。
　また、第一の開口部６０２から、サンプル溶液２０１と連続してオイル（分離液）を導入することにより、サンプル溶液２０１のデッドボリュームをより削減することができる。具体的には、陰圧によりサンプル溶液２０１がマイクロチャンバ６０５に導入された後、連続してオイル（分離液）が流路６０４内に入るため、流路６０４内に残存するサンプル溶液２０１を減らすことができる。この状態で第二の開口部６０７から分離液２０２をサンプル溶液２０１とは逆向きに入れることにより、流路６０４内のサンプル溶液２０１を完全に分離液２０２に置き換え、複数のマイクロチャンバ６０５間を分離することができる。また、このサンプル溶液２０１と連続して導入したオイル（分離液）は、サンプル溶液２０１内の核酸がエアロゾルとなり大気中に放出されることを防ぐ蓋の役割を持つ。このようにすることにより、第一の開口部６０２からサンプル溶液２０１のみを導入する場合と比べて、よりサンプル溶液２０１のデッドボリュームをより削減することができる。
　なお、本実施例では、容器７１０内の分離液２０２を第二の開口部６０７を通じて流路６０４内に入れる説明をしたが、本発明はこれに限るものではない。例えば、分離液２０２があらかじめサンプル溶液分離デバイス６０１内に充填されており、このサンプル溶液分離デバイス６０１内に充填された分離液２０２を流路６０４内に導入してもよい。
（実施例４）
　上記した実施例３では、基板６０８の貫通孔６１１の上端部に薄膜の固相６０６を設置したが、本発明はこれに限るものではない。図８は、実施例４に係るサンプル溶液分離デバイス８０１の構成図である。実施例４に係るサンプル溶液分離デバイス８０１の固相８０６は、通気性、疎水性、親油性を有する複数の微粒子である。複数の微粒子は、貫通孔６１１（垂直方向流路）に詰められて、固相８０６を形成する。微粒子は、例えば、０．１μｍから１０μｍのサイズを持つビーズである。微粒子は、膜よりも流路６０４内へと導入しやすい。また、微粒子の間を空気が通過することができるため、真空引きが可能となる。また、微粒子は、撥水性を有するため、サンプル溶液２０１を停止することができる。また、微粒子は、親油性を有するため、分離液２０２を通過することができる。
　また、実施例３では、バルブ６０３がワンタイムバルブであるとしたが、本発明はこれに限るものではない。例えば、実施例４に係るサンプル溶液分離デバイス８００のバルブ８０３は、伸縮性のあるチューブであってもよい。チューブは、基板６０８の貫通孔６１０と接続するために延ばされ、バルブ８０３を形成する。例えば、バルブ８０３は、シリコーンチューブである。シリコーンチューブは、圧縮されることにより、チューブ内のフローを停止するピンチバルブを形成する。ピンチバルブを用いることにより、開閉を複数回行うことができる。真空引きする際にはバルブ８０３を閉じ、サンプル溶液２０１を入れる際にはバルブ８０３を開ける。また、分離液２０２の導入後は、バルブ８０３を閉じて、サンプル溶液２０１及び分離液２０２を密閉する。
（実施例５）
　本発明のサンプル溶液分離デバイスは、デジタルＰＣＲに用いることができる。図９は、実施例５に係るデジタルＰＣＲシステム９００の構成図である。デジタルＰＣＲシステム９００（サンプル溶液分離システム）は、サンプル溶液分離デバイス６０１、バルブ制御機構９０１、ポンプ９０２、液体ポンプ９０３、温調器９１３、光学系９１４（計測手段）、及び解析部９１２を備える。光学系９１４は、光源９０４、レンズ９０５、レンズ９０８、レンズ９１０、バンドパスフィルタ９０６、バンドパスフィルタ９０９、ダイクロイックミラー９０７、及びＣＭＯＳセンサ９１１を有する。
　サンプル溶液分離デバイス６０１には、第一の開口部６０２からサンプル溶液２０１がセットされる。ポンプ９０２の駆動により、流路６０４及びマイクロチャンバ６０５内の空気が第二の開口部６０７を通じて脱気され、陰圧化される。バルブ制御機構９０１は、バルブ６０３を開放し、サンプル溶液２０１が流路６０４及びマイクロチャンバ６０５内に導入される。その後、液体ポンプ９０３の駆動により、分離液２０２が第二の開口部６０７経由で流路６０４に導入される。このようにすることにより、サンプル溶液２０１を複数のマイクロチャンバ６０５内に分離して導入できる。
　ここで、サンプル溶液２０１は、検出対象であるＤＮＡ、ポリメラーゼ、バッファ、プライマー、プローブを含むＰＣＲ反応液である。ＰＣＲ反応液であるサンプル溶液２０１が多数のマイクロチャンバ６０５に分離して入れられたデバイスに対し、サーマルサイクル処理が行われる。サーマルサイクル処理では、温調器９１３がディネーチャ、アニーリング、エクステンションが行われる温度帯に制御される。温調器９１３は、ヒーター、ペルチェ素子等から構成されるが、本発明はこれに限るものではない。サーマルサイクル処理により、計測対象のＤＮＡがマイクロチャンバ６０５内に存在する場合、対象ＤＮＡが増幅される。
　光学系９１４（計測手段）は、ＰＣＲ増幅がなされたサンプル溶液２０１内の対象の核酸を計測する。光源９０４から照射された光は、レンズ９０５によってコリメートされ、バンドパスフィルタ９０６で所定の波長の光を透過させ、ダイクロイックミラー９０７で反射され、レンズ９０８を通過してサンプル溶液分離デバイス６０１に照射される。サンプル溶液分離デバイス６０１のマイクロチャンバ６０５からの蛍光は、レンズ９０８を通り、ダイクロイックミラー９０７、バンドパスフィルタ９０９、レンズ９１０を通過して、ＣＭＯＳセンサ９１１にて撮像される。解析部９１２は、ＣＭＯＳセンサ９１１で撮像された画像に基づいて解析を実施し、各マイクロチャンバ内の対象ＤＮＡを検出する。
　図１０は、実施例５に係るデジタルＰＣＲシステム９００の動作フロー図である。
　バルブ制御機構９０１は、バルブ６０３を開放し、第一の開口部６０２にセットされたサンプル溶液２０１をサンプル溶液分離デバイス６０１に導入する（Ｓ１００１）。
　液体ポンプ９０３は、分離液２０２を第二の開口部６０７からサンプル溶液分離デバイス６０１に導入する（Ｓ１００２）。これにより、サンプル溶液２０１が複数のマイクロチャンバ６０５に分離して導入される。
　次に、温調器９１３は、サンプル溶液分離デバイス６０１をサーマルサイクルにかける（Ｓ１００３）。
　光学系９１４は、サンプル溶液分離デバイス６０１に光を照射し、各マイクロチャンバ６０５の蛍光強度を計測する（Ｓ１００４）。
　そして、解析部９１５は、光学系９１４によって計測された蛍光強度を解析して、サンプル溶液２０１内のターゲットＤＮＡを検出する（Ｓ１００５）。
　なお、サンプル溶液２０１や分離液２０２を導入する際に、サンプル溶液２０１や分離液２０２を加温してもよい。サンプル溶液２０１や分離液２０２の粘性が変わり、流路６０４への導入が容易になる。また、サンプル溶液２０１や分離液２０２を導入する時間を短縮することができる。また、サンプル溶液２０１や分離液２０２を加温する温調器は、サーマルサイクルを実施する温調器９１３であってもよいし、温調器９１３とは別の温調器であってもよい。
　ＰＣＲ反応液として、フォワード側のプライマーとリバース側のプライマーの濃度を変えて、非対称ＰＣＲを行い、増幅産物の内、片方の一本鎖ＤＮＡが多く増幅されるようにしてもよい。このようにして、分子ビーコンにより一本鎖ＤＮＡを検出する。また、蛍光計測時にサンプル溶液分離デバイスの温度を制御し、融解曲線解析を行う。蛍光計測は、複数のフィルタを用い、複数の色で計測する。各マイクロチャンバの蛍光の色、蛍光強度と融解温度を用いて、対象のＤＮＡを特定することにより、高マルチプレックス、かつ、高感度な計測が実現できる。
（サンプル溶液分離方法）
　ここで、サンプル溶液２０１を複数のマイクロチャンバ１０５に分離する方法を説明する。サンプル溶液分離方法は、
　上記したサンプル溶液分離デバイス１０１を準備こと、
　固相１０６を介して、複数のマイクロチャンバ１０５及び流路１０４内の空気を脱気すること、
　バルブ１０３を開放し、第一の開口部１０２からサンプル溶液２０１を複数のマイクロチャンバ１０５及び流路１０４に導入すること、及び
　第二の開口部１０７から固相１０６を介して分離液２０２を流路１０４に導入すること、を有する。
　なお、準備するサンプル溶液分離デバイス１０１は、サンプル溶液分離デバイス５０１、６０１又は８０１であってもよい。
　また、サンプル溶液分離方法は、
　複数のマイクロチャンバ１０５にサンプル溶液２０１が分離されたサンプル溶液分離デバイス１０１に対してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のサーマルサイクルを実施すること、
　複数のマイクロチャンバ１０５の蛍光強度を計測すること、及び
　蛍光強度を解析し、サンプル溶液２０１内のターゲットＤＮＡを検出すること、をさらに有する。
　なお、上記した第一の開口部１０２からサンプル溶液２０１を複数のマイクロチャンバ１０５及び流路１０４に導入することは、第一の開口部１０２からサンプル溶液２０１、及びサンプル溶液２０１に続くオイル（分離液）を導入することを含む。
（変形例）
　本開示は、前述した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前述した実施形態は本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　例えば、上記した実施例では、複数のマイクロチャンバ１０５間を分離するために分離液を用いたが、本発明はこれに限らず、分離気体であってもよい。この場合、固相は、分離気体を通過させる物性をもっていればよい。
　１０１，５０１，６０１，８０１　サンプル溶液分離デバイス
　１０２　第一の開口部
　１０３　バルブ
　１０４　流路
　１０５　マイクロチャンバ
　１０６　固相
　１０７　第二の開口部
　２０１　サンプル溶液
　２０２　分離液
　４００，７００　サンプル溶液分離システム
　４０１　バルブ制御機構
　４０２，４０４　開口部コンタクト部
　４０３，４０５　ポンプ
　４０６　移動機構
　５０６ａ，５０６ｂ，５０６ｃ，５０６ｄ　固相
　６０２　第一の開口部
　６０３　バルブ
　６０４　流路
　６０４ａ　水平方向流路
　６０４ｂ　垂直方向流路
　６０５　マイクロチャンバ
　６０６　固相
　６０７　第二の開口部
　６０８　基板
　６０９　フィルム
　６１０，６１１　貫通孔
　７０１　真空ポンプ
　７０２，７１２　圧力センサ
　７０３，７１１　フィルタ
　７０４，７０８　電磁弁
　７０５　移動機構
　７０６，７０７　開口部コンタクト部
　７０９　液体ポンプ
　７１０　容器
　７１３　加圧ポンプ
　７１４　バルブ制御機構
　７１５　開口部用蓋
　７１６　尖頭部品
　７１７　光源
　７１８　温調器
　７１９　コントローラ
　７２０　プロセッサ
　７２１　メモリ
　７２２　インターフェース
　８０３　バルブ
　８０６　固相
　９００　デジタルＰＣＲシステム
　９０１　バルブ制御機構
　９０２　ポンプ
　９０３　液体ポンプ
　９０４　光源
　９０５，９０８、９１０　レンズ
　９０６，９０９　バンドパスフィルタ
　９０７　ダイクロイックミラー
　９１１　ＣＭＯＳセンサ
　９１２　解析部
　９１３　温調器
　９１４　光学系

Claims (16)

  1. 　サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイスであって、
    　複数のマイクロチャンバと、
    　前記複数のマイクロチャンバを接続する流路と、
    　前記サンプル溶液の前記流路への導入口である第一の開口部と、
    　前記第一の開口部と前記複数のマイクロチャンバとの間に設けられるバルブと、
    　前記サンプル溶液が収容される前記複数のマイクロチャンバ間を分離する分離液の流路への導入口であって、前記複数のマイクロチャンバを挟んで前記第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部と、
    　前記第二の開口部と前記複数のマイクロチャンバとの間に設けられる固相と、を備え、
    　前記固相は、通気性を有し、前記サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ前記分離液に対して通過性を有する
    　ことを特徴とするサンプル溶液分離デバイス。
  2. 　前記流路は、前記マイクロチャンバがそれぞれ接続される複数の分岐流路を有し、
    　前記固相は、前記複数の分岐流路のそれぞれに設けられる
    　ことを特徴とする請求項１に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  3. 　前記流路は、
    　前記複数のマイクロチャンバが接続され、水平方向に延びる水平方向流路と、
    　前記水平方向流路に接続され、垂直方向に延びる垂直方向流路と、を有し、
    　前記固相は、前記垂直方向流路の上端部に設けられる
    　ことを特徴とする請求項１に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  4. 　前記流路は、
    　前記複数のマイクロチャンバが接続され、水平方向に延びる水平方向流路と、
    　前記水平方向流路に接続され、垂直方向に延びる垂直方向流路と、を有し、
    　前記固相は、前記垂直方向流路内に設けられた複数の微粒子である
    　ことを特徴とする請求項１に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  5. 　前記バルブは、前記サンプル溶液を前記流路に導入する際に１度だけ開放されるワンタイムバルブである
    　ことを特徴とする請求項１に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  6. 　前記固相は、前記サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ前記分離液に対して通過性を有する多孔質膜である
    　ことを特徴とする請求項１に記載にサンプル溶液分離デバイス。
  7. 　前記多孔質膜の材料は、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）である
    　ことを特徴とする請求項６に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  8. 　前記分離液は、光硬化樹脂であって、
    　前記分離液は、前記流路内で光照射によって硬化する
    　ことを特徴とする請求項１に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  9. 　前記分離液は、前記サンプル溶液と混和しない物性を有するオイルである
    　ことを特徴する請求項１に記載のサンプル溶液分離デバイス。
  10. 　サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイスであって、複数のマイクロチャンバと、前記複数のマイクロチャンバを接続する流路と、前記サンプル溶液の前記流路への導入口である第一の開口部と、前記第一の開口部と前記複数のマイクロチャンバとの間に設けられるバルブと、前記サンプル溶液が収容される前記複数のマイクロチャンバ間を分離する分離液の流路への導入口であって、前記複数のマイクロチャンバを挟んで前記第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部と、前記第二の開口部と前記複数のマイクロチャンバとの間に設けられる固相と、を備え、前記固相は、通気性を有し、前記サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ前記分離液に対して通過性を有する、サンプル溶液分離デバイス、
    　前記複数のマイクロチャンバ及び前記流路内の空気を前記第二の開口部から前記固相を通じて脱気するポンプ、
    　前記バルブを開放するバルブ制御手段、及び
    　前記第二の開口部から分離液を導入する分離液導入手段、を有する
    　ことを特徴とするサンプル溶液分離システム。
  11. 　前記第二の開口部の接続先を前記ポンプ又は前記分離液導入手段に切り替える切替手段、をさらに有する
    　ことを特徴とする請求項１０に記載のサンプル溶液分離システム。
  12. 　前記分離液を加圧して、前記流路に導入する加圧ポンプ、をさらに有する
    　ことを特徴とする請求項１０に記載のサンプル溶液分離システム。
  13. 　前記マイクロチャンバ内でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）が実施された前記サンプル溶液内の対象の核酸を計測する計測手段、をさらに有する
    　ことを特徴とする請求項１０に記載のサンプル溶液分離システム。
  14. 　サンプル溶液を分離するサンプル溶液分離デバイスであって、複数のマイクロチャンバと、前記複数のマイクロチャンバを接続する流路と、前記サンプル溶液の前記流路への導入口である第一の開口部と、前記第一の開口部と前記複数のマイクロチャンバとの間に設けられるバルブと、前記サンプル溶液が収容される前記複数のマイクロチャンバ間を分離する分離液の流路への導入口であって、前記複数のマイクロチャンバを挟んで前記第一の開口部の反対側に設けられる第二の開口部と、前記第二の開口部と前記複数のマイクロチャンバとの間に設けられる固相と、を備え、前記固相は、通気性を有し、前記サンプル溶液に対して撥水性を有し、且つ前記分離液に対して通過性を有する、サンプル溶液分離デバイス、を準備すること、
    　前記固相を介して、前記複数のマイクロチャンバ及び前記流路内の空気を脱気すること、
    　前記バルブを開放し、前記第一の開口部から前記サンプル溶液を前記複数のマイクロチャンバ及び前記流路に導入すること、及び
    　前記第二の開口部から前記固相を介して前記分離液を流路に導入すること、を有する
    　ことを特徴とするサンプル溶液分離方法。
  15. 　前記複数のマイクロチャンバに前記サンプル溶液が分離された前記サンプル溶液分離デバイスに対してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のサーマルサイクルを実施すること、
    　前記複数のマイクロチャンバの蛍光強度を計測すること、及び
    　前記蛍光強度を解析し、前記サンプル溶液内のターゲットＤＮＡを検出すること、をさらに有する
    　ことを特徴とする請求項１４に記載のサンプル溶液分離方法。
  16. 　前記第一の開口部から前記サンプル溶液を前記複数のマイクロチャンバ及び前記流路に導入することは、前記第一の開口部から前記サンプル溶液、及び前記サンプル溶液に続く分離液を導入することを含む
    　ことを特徴とする請求項１４に記載のサンプル溶液分離方法。
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