WO2024252053A1 - Matrices extracelulares para su uso en ingeniería tisular - Google Patents

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WO2024252053A1
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distilled water
tissue
decellularization
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Víctor Sebastián Carriel Araya
Fernando CAMPOS SÁNCHEZ
David SÁNCHEZ PORRAS
Óscar Darío GARCÍA GARCÍA
Jesús CHATO ASTRAIN
Claudia LLINARES MONLLOR
Sandra ESCALANTE QUIRÓS
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Universidad de Granada
Servicio Andaluz de Salud
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Universidad de Granada
Servicio Andaluz de Salud
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    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
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    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials

Definitions

  • the present invention is part of the field of tissue engineering, a discipline that applies principles of biology, medicine and engineering to develop strategies aimed at repairing, replacing and/or improving damaged tissues or organs.
  • biofabrication processes usually employ 3 basic elements: cells (either stem cells or differentiated cells), biomaterials (substances designed to interact with biological systems for medical purposes) and/or various factors that stimulate cell and tissue growth (bioreactors and growth factors).
  • cells either stem cells or differentiated cells
  • biomaterials substrates designed to interact with biological systems for medical purposes
  • bioreactors and growth factors various factors that stimulate cell and tissue growth
  • biomaterials play a crucial role, since they imitate the structure and physical, biological and chemical properties of the native extracellular matrix (ECM), which promotes tissue regeneration processes and stimulates cell function.
  • ECM extracellular matrix
  • biomaterials The fundamental properties that a biomaterial must present vary according to its application. In general, they must have certain biomechanical properties, measured as viscoelasticity, memory, deformation, resistance; structural properties, such as porosity, 3D organization, alignment; and biological properties that are given by biodegradability, biocompatibility and capacity to be proregenerative. In addition, the chemical and molecular composition of biomaterials must favor cellular function (adhesion, migration, proliferation and differentiation) and avoid adverse reactions.
  • Synthetic biomaterials provide adequate biomechanical properties and allow controlled degradation, but they are usually very rigid, hydrophobic and the products of their biodegradation can be toxic. In contrast, natural biomaterials are more biocompatible, promote a high degree of cell-biomaterial interaction, and are usually hydrophilic. and promote cellular processes and therefore tissue regeneration. However, some natural biomaterials, especially those highly purified, have poor biomechanical properties, simple chemical-molecular composition and are rapidly degraded.
  • ECM extracellular matrix
  • Non-absorbable biomaterials used in clinical settings such as silicones, resins, and metals, often induce a mild and transient inflammatory response, characterized by the formation of a connective tissue capsule around the biomaterial.
  • This encapsulation process which is generally an undesired response, may provide a new strategy for the generation of native 3D matrices for various biomedical applications, including tissue engineering.
  • encapsulation was induced around polyvinyl chloride (PVC) tubes implanted next to the sciatic nerve of rats and removed after a period of time. The resulting matrix, formed at the implant site, was used as a conduit for the repair of a 1.5 cm long nerve injury caused to the adjacent nerve.
  • PVC polyvinyl chloride
  • biomechanical and structural properties of various biomaterials can be improved by crosslinking techniques, a process by which two or more molecules are chemically linked by a covalent bond.
  • GP glutaraldehyde and genipin
  • This agent has been successfully used for the cross-linking of various biomaterials (chitosan, collagen, fibrin-agarose, etc.) and decellularized ECM with an evident improvement of the biomechanical properties and a better biocompatibility and biological properties than glutaraldehyde [9, 10].
  • the present invention provides a new advanced therapy product generated by new tissue engineering techniques, in particular, it describes a 3D natural extracellular matrix (ECM) for clinical use in the field of biomedicine, regenerative medicine and surgery.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM extracellular matrix
  • the animal model used for the implantation of the mould can vary in size and characteristics depending on the technical needs of each case, and is generally a non-human mammal.
  • Various animal models can be used (bovine, pig, goat, etc.) and, therefore, large-scale production of these products can be carried out. This would not affect the welfare of the animals used or their destination, so animals intended for the food industry or belonging to research projects can be used. Special preference would be given to the use of those species that have a higher percentage of genetic and molecular homology.
  • the moulds implanted in animal models are made of biomaterials for clinical use, which have no impact on animal welfare.
  • the implantation procedure is simple, inexpensive and fast.
  • These moulds can be made of different inert and non-absorbent materials such as PVC, silicone, aluminium, titanium, etc.
  • the implantation of biomaterials with these characteristics induces the formation of connective tissue around them, which is removed after 1 or 2 months, depending on the degree of maturation of the tissue required.
  • the biological tissues obtained by subcutaneous implantation of the moulds have controlled dimensions and thickness, with a variable morphology, according to the needs of the desired product.
  • This connective tissue is composed of various elements of the ECM, among which are various fibres and non-fibrillar elements.
  • the resulting ECM in addition to having a predefined thickness, dimensions and 3D structure, is properly structured and is characterised by an adequate proportion and organisation of its molecules, ensuring a high degree of biomimicry. This represents a considerable advantage compared to conventional ECMs.
  • the use of conventional biomanufacturing methods such as 3D printing and/or electrospinning is also possible.
  • the matrices thus obtained lack biomimicry, have lower biocompatibility and do not achieve the degree of chemical-molecular complexity described here.
  • the complexity of the biomanufacturing processes is considerably reduced compared to conventional ones, since complex equipment (such as 3D printers, electrospinning and/or bioreactors) is not required.
  • the use of biomaterials for the generation of the matrices is reduced, compounds that generally require being highly purified and are available in very scarce quantities. An example of a tubular structure obtained by this method is described in this report.
  • ECMs are subjected to a new decellularization procedure that reduces immunogenicity, is able to effectively eliminate cellular elements, and at the same time ensures the preservation of the main elements of the ECM, such as the fibrillar components (collagen fibers) and non-fibrillar components (proteoglycans and glycoproteins) with a microstructural pattern suitable for use in vivo.
  • This is a novel chemical decellularization protocol based on the combination of detergents and enzymatic agents (DNAses and RNAses), which allows obtaining an extracellular matrix completely free of cellular elements.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • FBS fetal bovine serum
  • the novel decellularization process of the invention consists of the following steps: a) causing cell lysis, preferably by osmotic shock with distilled water, as it is minimally aggressive to the tissue structure, b) removing cytoplasmic and cellular material, preferably with an anionic surfactant detergent, such as sodium dodecyl sulfate (SDS), and removing detergent residues by washing with distilled water, c) dissociating lipid interactions, preferably with a non-anionic surfactant detergent, such as Triton X-100, and removing detergent residues by washing with distilled water, d) dissociate intracellular proteins, preferably with an anionic detergent, more preferably with one different from that previously used in step c), such as sodium deoxycholate (SDC), and remove detergent residues by washing with distilled water, and e) degrade RNA and DNA, preferably with RNase and DNase and inactivate the enzymatic agents and remove enzyme and detergent residues by washing with phosphate buffered
  • step b) to e) The removal of detergent residues and enzymatic agents used in step b) to e), by washing with water or PBS as appropriate, is preferably carried out cold, specifically at 4 ° C, to block digestive and enzymatic activity.
  • the enzymatic digestion in step e) is preferably carried out at 37 ° C, while the rest of the process can be carried out at room temperature.
  • the detergents in steps b), c) and d) are preferably solubilized in distilled water, while the degradation of RNA and DNA in step e) is preferably carried out with RNase and DNase in a phosphate buffer solution with sodium and magnesium.
  • step b) and the exposure to detergents in steps b) to d) are preferably carried out under stirring.
  • antibiotics and/or antimycotics in the last step e) together with the PBS used for washing to inactivate the enzymatic agents and remove the remains of enzymes and detergent.
  • the preferred antibiotics are those with a broad spectrum, and mixtures of penicillin and streptomycin are preferably used.
  • the preferred antimycotics are those with a broad spectrum, and amphotericin B is preferably used.
  • the acellular MECs obtained by this procedure are highly biocompatible and non-immunogenic, presenting a low risk of rejection, since the elements capable of inducing an immune response, the cells, have been eliminated during decellularization.
  • the ECM generated by this decellularization process still presents a high level of structural and chemical complexity, which is an important advantage compared to conventional biomanufacturing processes.
  • the ECM can be subjected to a subsequent chemical cross-linking process with genipin (GP) or another agent with similar characteristics, which provides biomechanical and structural stability to the generated product.
  • GP genipin
  • the acellular three-dimensional matrices treated with GP have increased biomechanical properties, structural stability and reduced in vivo biodegradability, maintaining a high degree of ex vivo and in vivo biocompatibility, which makes them ideal candidates for use in various tissue engineering protocols.
  • the method of the invention starts from biological tissues grown by the subcutaneous or intramuscular implantation of an inert, non-absorbable material of defined structure and dimensions in an animal model.
  • the connective tissue capsule spontaneously generated by the animal after 1, 2 or more months from the implantation of the implant is subsequently collected together with the implanted material.
  • the implants are washed and stored in phosphate buffer solution (PBS) with 5% antibiotics for at least 24 hours and then the biomaterial generated from the implanted device is released.
  • PBS phosphate buffer solution
  • This isolated biological tissue can be preserved until use by cryopreservation techniques in a 10% solution of dimethyl sulfoxide (DMSO) in fetal bovine serum or similar at -80 ° C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the biological tissue or biomaterial thus obtained is subjected to the decellularization process of the present invention, which is carried out as previously described.
  • decellularized MEC can be stored cold, preferably at 4 ° C, in sterile PBS and optionally supplemented with antibiotics for a period of 7 days.
  • Acellular extracellular matrices can be functionalized by the addition of various cell types, growth factors, extracellular vesicles, biomolecules and/or essential sequences to induce tissue regeneration and cellular function in each case.
  • ECMs can be functionalized with RGD (Arg-Gly-Asp) sequences, quite common sequences in cell surface binding proteins, or by the incorporation of ECM molecules such as laminin, fibronectin or hyaluronic acid and nanoparticles among others.
  • the method of the present invention allows to control the biomechanical properties of the matrices obtained, and after the decellularization and cross-linking process it provides a very resistant material and, therefore, easy to handle from the surgical point of view. Therefore, the present invention describes acellular extracellular matrices generated from biological tissues, preferably biological tissues grown by controlled induction of the extracellular matrix synthesis processes in non-human mammalian animals, allowing to obtain biological tissues of predetermined dimensions and shapes.
  • the starting biological tissue is not particularly limited, and the decellularization treatment of the present invention can be applied to any isolated biological tissue.
  • the decellularization process of the present invention allows to obtain acellular extracellular matrices that have the biomechanical and biological properties necessary for their application in tissue engineering, since the biomechanical properties of the starting biological tissues are not altered. Subsequently, the acellular extracellular matrices obtained can be optionally treated with the cross-linking agent GP to improve their properties. Finally, these acellular extracellular matrices can be prepared for storage or functionalized with various cell types, growth factors or essential biomolecules.
  • acellular extracellular matrices as described herein constitute a new advanced therapy product for clinical use.
  • acellular extracellular matrices of the present invention are very diverse, since they are natural biomaterials whose structure, dimensions and biomechanics can be controlled according to needs. They can be used in tissue engineering protocols for research purposes; also for clinical use, with a high potential for application in various pathologies and structural lesions that affect different tissues.
  • moulds of certain dimensions and morphology it is possible to generate extracellular matrices that respond to specific anatomical needs, such as peripheral nerves, blood vessels, tendons, ocular tunic, urethra or bladder, or such as the tubular structure described in the exemplary embodiment of this invention.
  • these acellular extracellular matrices can serve as platforms for the generation of more complex substitutes, which can be functionalized with various cellular sources and/or growth factors, considerably improving their future biomedical applications.
  • a first aspect of the invention describes a method for obtaining an acellular extracellular matrix ex vivo from a connective tissue previously isolated from a non-human mammalian animal, or method of the invention, characterized in that it comprises a decellularization process comprising washing the biological tissue, cell lysis by osmotic shock and the application of a combination of anionic and non-anionic surfactant detergents, and enzymatic agents to degrade DNA and RNA.
  • a washing phase is preferably included after the application of detergents and enzymatic agents.
  • the steps of the decellularization process comprise: a) cell lysis with distilled water, b) use of an anionic surfactant detergent, and subsequent washing with distilled water, c) use of a non-anionic surfactant detergent, and subsequent washing with distilled water, d) use of an anionic detergent, identical or different from that of step c), and subsequent washing with distilled water, and e) use of RNase and DNase, and subsequent washing with a solution comprising saline phosphate buffer.
  • the anionic surfactant detergent in step b) is sodium dodecyl sulfate.
  • the non-anionic surfactant detergent in step c) is Triton X-100.
  • the anionic detergent in step d) is sodium deoxycholate.
  • the washing with distilled water in steps b) to d) and the washing with phosphate buffered saline in step e) is carried out cold, preferably at 4 ° C, the application of RNase and DNase in step e) is carried out at 37 ° C, and the rest of the procedure is carried out at room temperature.
  • step a) and the application of detergents in steps b), c) and d) are carried out under stirring.
  • the solution comprising phosphate buffered saline also comprises antibiotics and/or antimycotics.
  • the cell lysis is caused by washing in distilled water for 7 hours at room temperature with shaking
  • the treatment with sodium dodecyl sulfate is 0.1% for 24 hours at room temperature, with shaking and the subsequent wash with distilled water consists of 3 washes of 30 min each at 4 ° C
  • the treatment with Triton X-100 is 0.6% for 24 hours, at room temperature, with shaking, and the subsequent wash with distilled water consists of 3 washes of 30 min each at 4 ° C
  • the treatment with sodium deoxycholate is 1% for 24 hours at room temperature, with shaking and the subsequent wash with distilled water consists of 3 washes of 30 min each at 4 ° C
  • the enzymatic digestion is carried out with 100 mg/l DNase + 20 mg/l R
  • an additional step f) of chemical crosslinking is additionally carried out, preferably with genipin, and subsequent washing.
  • the isolated biological tissue has been subjected to cryopreservation before its decellularization.
  • the biological tissue is washed with distilled water.
  • the acellular extracellular matrix obtained after step e) of decellularization or after step f) of cross-linking is functionalized by the addition of cell types and/or growth factors and/or essential biomolecules to induce tissue regeneration and cell function.
  • the isolated starting biological tissue has grown in the non-human mammalian animal thanks to the implantation of a mold composed of non-resorbable biomaterials. In an even more preferred embodiment, the isolated starting biological tissue of the non-human mammalian animal has grown around a mold composed of non-resorbable biomaterials.
  • a second aspect of the invention describes an acellular extracellular matrix obtainable by the process of the invention.
  • the acellular extracellular matrix has a tubular, saccular, flat or meshed structure.
  • a third aspect of the invention describes the use of the acellular extracellular matrix of the invention in tissue engineering, preferably in the repair and/or replacement of damaged native material and more preferably for repairing and/or replacing peripheral nerves, blood vessels, urethra, bladder, tendons, ocular tunic, abdominal wall, mucosa or epithelial surfaces.
  • Figure 1 Implantation and removal of silicone ducts in the subcutaneous tissue of rodents.
  • FIG. Transparency test and DNA quantification of native and decellulased bioconduits at 1 month (T1 M) and 2 months (T2M).
  • T1 M time
  • T2M time
  • A Macroscopic images of T1 M and T2M bioconduits representative of each condition: control (CTR) and decellulased (D).
  • CTR control
  • D decellulased
  • D decellulased
  • C Graphic results of DNA quantification and
  • C transparency analysis of native and decellulased nerves at T1 M and T2M.
  • FIG. 3 Mechanical tensile results of the 1-month-old native and 2-month-old control (T1 M-CTR and T2M-CTR), decellulized (T1 M-D and T2M-D) and decellulized and genipin-crosslinked (T1 M-DG and T2M-DG) bioconduits. Graphical representation of the results of (A) Young’s modulus, (B) tensile strain and (C) breaking strength.
  • FIG. 4 Histological analysis of 1- and 2-month-old tissues (T1 M and T2M) under control, decellulased, and decellulased and genipin-crosslinked conditions (CTR, D, and DG), performed on histological sections stained with HE and DAPI. Structural analysis of T1 M-CTR, T1 M-D, T1 M- DG, T2M-CTR, T2M-D, and T2M-DG using SEM. (A) HE staining images at 4x magnification. Dense connective tissue defining a tubular structure is observed. (B) HE staining images at 20x magnification. No nuclei are observed in T1 M and T2M samples D and DG.
  • C DAPI staining images showing many nuclei in T1 M-CTR and T2M-CTR and their absence in the D and DG condition.
  • D General view of CTR, D and DG in the T1 M and T2M bioconduits obtained with the scanning electron microscopy technique.
  • E SEM images showing the fibrillar organization of the dense connective tissue in each condition in T1 M and T2M.
  • Figure 5 Histological analysis of the extracellular matrix components of native, decellulased, and genipin-crosslinked decellulased bioconduits at T1 M and T2M.
  • A Alcian blue staining under all conditions and times
  • B Orcein staining in the different matrices generated
  • C Picrosirius histochemical images show the preservation of collagen fibers in all groups.
  • FIG. 6 Results of quantitative histological analysis for T1 M-CTR, T1 M-D, T2M- CTR, T2M-D.
  • the graphs show the results of the Alcian Blue intensity test (A, B) and Picrosirius intensity test (C, D) in T1 M and T2M in each condition, loose vs dense connective tissue.
  • ADMSC allogeneic adipose tissue mesenchymal stem cells
  • a silicone conduit is implanted in the subcutaneous tissue of Wistar rats. The procedure is performed under general anesthesia. After implantation, the animals are kept in the laboratory and after 1 to 2 months, the animals are sacrificed for sample collection.
  • the antibiotic cocktail (100x), of commercial origin, contains: 10,000 units of penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 pg of amphotericin B per ml.
  • Decellularized bioconduits are generally whiter and more transparent than their respective control bioconduits (CTR) that still retain some blood residue inside, which generates a pinkish tone in the bioconduit.
  • CTR control bioconduits
  • dsDNA double-stranded DNA
  • GP is a cross-linking agent capable of inducing the formation of molecular interactions between the components of the ECM, increasing their biomechanical properties (DG) with respect to decellularized tissues (D) and also with respect to controls (CTR) ( Figure 3).
  • the decellularized matrices not treated with GP although their biomechanical characteristics are not improved, maintain values very similar to those of the control tissues, not subjected to any treatment, so we can conclude that the decellularization process does not negatively affect any of the parameters measured.
  • HE staining revealed that the generated bioconduit-shaped matrix presents a homogeneous structure after 1 and 2 months of implantation of the non-resorbable material (silicone) that is maintained after decellularization and treatment with GP ( Figure 4A and 4B).
  • Bioconduits are composed of a dense inner part, in contact with the implanted silicone moulds, and a less dense outer layer of connective tissue in the rest of the material. In general, a well-structured connective tissue is observed that presents a state of maturation and greater compaction in the second month, which after decellularization lacks cell nuclei.
  • Histology reveals that neither the decellularization process (observing the decellularized clusters (D)) nor the chemical cross-linking process with GP (DG) affect the pattern and structural definition of the generated matrix.
  • the generated matrices were subjected to a biocompatibility analysis.
  • allogeneic adipose tissue mesenchymal stem cells (ADMSC) were cultured on the decellularized matrices and on the decellularized and GP-cross-linked matrices. After 72 hours of culture, the cell-biomaterial interaction was determined using the WST-1 assay (Roche Laboratories, Switzerland) and the Live/Dead® Cell Viability Assay (L/D) (Thermo-Fisher Scientific, USA).

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Abstract

La presente invención describe un procedimiento de descelularización para la generación de matrices extracelulares acelulares, de estructura y dimensiones específicas, que incluye opcionalmente un tratamiento entrecruzante con agentes químicos. Se describen tratamientos adicionales para su almacenamiento o funcionalización. La presente invención también se refiere a las matrices extracelulares acelulares obtenidas por dicho método y el uso de dichas matrices, preferente en la clínica, para la reparación de tejidos dañados.

Description

MATRICES EXTRACELULARES PARA SU USO EN INGENIERÍA TISULAR
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca en el campo de la ingeniería tisular, disciplina que aplica principios de la biología, la medicina y la ingeniería para el desarrollo de estrategias encaminadas a la reparación, reemplazo, y/o mejora de tejidos u órganos dañados.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Gracias al desarrollo tecnológico, hoy en día existen diversas técnicas de biofabricación de tejidos y órganos que permiten generar sustitutos bioartificiales para uso clínico. Los procesos de biofabricación convencional suelen emplear 3 elementos básicos: células (bien células madre o bien diferenciadas), biomateñales (sustancias diseñadas para interactuar con los sistemas biológicos con un propósito médico) y/o diversos factores de estimulación del crecimiento celular y tisular (bioreactores y factores de crecimiento). En este contexto, los biomateñales juegan un rol crucial, ya que imitan la estructura y propiedades físicas, biológicas y químicas de la matriz extracelular (MEC) nativa, lo cual promueve los procesos de regeneración tisular y estimula la función celular.
Las propiedades fundamentales que debe presentar un biomateñal varían de acuerdo a su aplicación. En general, deben poseer ciertas propiedades biomecánicas, medidas como visco- elasticidad, memoria, deformación, resistencia; propiedades estructurales, tales como porosidad, organización 3D, alineación; y propiedades biológicas que vienen dadas por la biodegradabilidad, biocompatibilidad y capacidad de ser proregenerativos. Además, la composición química y molecular de los biomateñales debe favorecer la función celular (adhesión, migración, proliferación y diferenciación) y evitar reacciones adversas.
Si bien, existe una gran variedad de biomateñales (naturales, sintéticos o mixtos) el componente ideal no existe, y por tanto la generación de nuevos biomateñales para su uso clínico sigue siendo un reto importante en el ámbito de la ingeniería tisular.
Los biomateñales sintéticos aportan propiedades biomecánicas adecuadas y permiten una degradación controlada, pero suelen ser muy rígidos, hidrófobos y los productos de su biodegradación pueden ser tóxicos. Por el contrario, los biomateñales naturales son más biocompatibles, promueven un alto grado de interacción célula-biomateñal, suelen ser hidrófilos y favorecen los procesos celulares y por tanto la regeneración tisular. No obstante, algunos biomateriales naturales, sobre todo aquellos altamente purificados, presentan escasas propiedades biomecánicas, composición químico-molecular simple y son degradados rápidamente.
La alta complejidad estructural y de composición químico-molecular de la matriz extracelular (MEC), esencial para los procesos de regeneración tisular y protocolos de ingeniería tisular, es extremadamente difícil de reproducir en laboratorio por las técnicas de biofabricación convencionales. A día de hoy, los biomateriales, ya sea sintéticos o naturales, rara vez son capaces de recrear la estructura, composición y propiedades biomecánicas de una matriz nativa. En este sentido, es fundamental poder generar matrices naturales que estén constituidas por los elementos principales de la MEC nativa.
Los biomateriales no reabsórbales que se utilizan a nivel clínico, como siliconas, resinas y metales, suelen inducir una respuesta inflamatoria leve y transitoria, la cual se caracteriza por la formación de una capsula de tejido conectivo alrededor del biomaterial. Este proceso de encapsulación, que generalmente es una respuesta no deseada, puede constituir una nueva estrategia para la generación de matrices 3D nativas para diversas aplicaciones biomédicas, incluida la ingeniería tisular. En un estudio previo [1], se indujo la encapsulación alrededor de tubos de cloruro de polivinilo (PVC) implantados junto al nervio ciático de ratas y, que se extrajeron al cabo de un tiempo. La matriz resultante, formada en la zona del implante, fue utilizada como conducto para la reparación de una lesión nerviosas de 1 ,5 cm de longitud causada en el nervio adyacente. Este trabajo demostró la utilidad del tejido fibroso formado alrededor del biomaterial no reabsorbible en la reparación neural. Sin embargo, la estrategia utilizada en ese estudio no tiene aplicación clínica, ya que no es posible inducir la formación de este tipo de matrices en humanos y que estas estén disponibles clínicamente para aplicaciones concretas. En el caso de las lesiones de nervios periféricos, la reparación quirúrgica debe ser realizada de urgencia, en una ventana de tiempo breve de aproximadamente 48-72 horas, con lo que esta no es una estrategia viable. Recientemente, conductos similares fueron generados y descelularizados para la reparación de segmentos vasculares. No obstante, no existen datos suficientes de las características de las matrices generadas, de sus propiedades biomecánicas y de la composición químico-molecular de su MEC [2-4],
La generación in vivo de matrices naturales a través de la encapsulación de biomateriales inertes ha resultado ser una alternativa prometedora en ingeniería tisular a nivel experimental, pero con limitada aplicación clínica. Este método induce la formación de una MEC nativa, compuesta por diversas moléculas, las cuales podrán adquirir la morfología deseada (membranas, conductos, mallas, estructuras saculares, etc.), siendo una gran ventaja en comparación a los biomateriales sintéticos e incluso la mayoría de los polímeros naturales comúnmente utilizados (fibrina, colágeno, alginato, quitosan, etc.). Este método permite generar una estructura con un nivel de organización y complejidad celular difícil de obtener mediante los procedimientos de biofabricación convencionales.
Dadas las limitaciones para aplicar este método a nuestra especie, se utilizan modelos animales, y por tanto, las matrices xenogénicas generadas deben ser sometidas a un proceso de descelularización eficiente, que asegure reducir la inmunogenicidad y preserve gran parte de las moléculas de MEC [5]. Gracias a este proceso se pueden generar nuevas matrices acelulares tejido-específicas que proporcionan una adecuada MEC debidamente organizada que provee un microambiente idóneo para la regeneración tisular. Esto ha sido demostrado mediante el uso de aloinjertos nerviosos en un modelo de lesión y reparación neural [6].
Sin embargo, los procesos de descelularización a menudo resultan en una alteración irreversible de la estructura, composición y biomecánica de la MEC lo que limita considerablemente sus aplicaciones biomédicas. Así pues, las actuales matrices acelulares comerciales de origen animal no presentan un patrón estructural definido y cuentan con escasas propiedades biomecánicas.
Las propiedades biomecánicas y estructurales de diversos biomateriales, incluidas las matrices descelularizadas, pueden ser mejoradas mediantes técnicas de entrecruzamiento o crosslinking, proceso por el cual se unen químicamente dos o más moléculas mediante un enlace covalente.
Dentro de los métodos entrecruzamiento los hay físicos como la nanoestructuración [8,9] y químicos como el uso de glutaraldehído y de genipín (GP) [6, 8]. El GP es un glucósido iridoide natural, extraído y purificado de la Gardenia jasminoides, el cual ha surgido como alternativa al glutaraldehído [8]. Este agente ha sido utilizado con éxito para el entrecruzamiento de diversos biomateriales (quitosano, colágeno, fibrina-agarosa, etc.) y MEC descelularizadas con una evidente mejora de las propiedades biomecánicas y una mejor biocompatibilidad y propiedades biológicas que el glutaraldehído [9, 10]. Recientemente, se ha aplicado GP para inducir el entrecruzamiento de los componentes de la MEC en nervios descelularizados logrando un incremento significativo de las propiedades biomecánicas y manteniendo un alto grado de biocompatibilidad y su patrón estructural [11]. También se han desarrollado diversos métodos químicos de descelularización tisular, los cuales han sido aplicados a la generación de nervios descelularizados con resultados ex vivo e in vivo [5] muy prometedores.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un nuevo producto de terapia avanzada generado por nuevas técnicas de ingeniería tisular, en concreto, describe una matriz extracelular (MEC) natural 3D para uso clínico en el campo de la biomedicina, medicina regenerativa y la cirugía.
Para ello, se parte de una técnica de síntesis in vivo de matriz extracelular (MEC) natural, mediante el implante en modelos animales de moldes inertes, con estructura y dimensiones definidas, que permiten generar MEC naturales complejas con forma y dimensiones variables.
El modelo animal utilizado para la implantación del molde puede vahar en su tamaño y características en función de las necesidades técnicas de cada caso, siendo, de forma general, un mamífero no humano. Se pueden utilizar diversos modelos animales (bovinos, cerdos, cabras, etc.) y, por tanto, llevar a cabo una producción a gran escala de estos productos. Esto no afectaría al bienestar de los animales utilizados ni al destino de estos, por lo que se pueden utilizar animales destinados a la industria alimenticia, o pertenecientes a proyectos de investigación. Se tendría especial preferencia por el uso de aquellas especies que tengan un mayor porcentaje de homología genética y molecular.
Los moldes implantados en los modelos animales están constituidos por biomateriales de uso clínico, los cuales no tienen impacto alguno en el bienestar animal. El procedimiento de implantación es simple, económico y rápido. Estos moldes pueden ser de distintos materiales inertes y no absorbióles tales como PVC, silicona, aluminio, titanio, etc. La implantación de biomateriales con estas características induce la formación de tejido conjuntivo alrededor de los mismos, que se extrae tras 1 o 2 meses, dependiendo del grado de maduración del tejido requerido.
Así, los tejidos biológicos obtenidos por la implantación subcutánea de los moldes tienen unas dimensiones y un espesor controlado, con una morfología variable, atendiendo a las necesidades del producto deseado. Este tejido conjuntivo está compuesto por diversos elementos de la MEC, entre los que se encuentran diversas fibras y elementos no fibrilares. La MEC resultante además de tener un espesor, dimensiones y estructura 3D predefinidos, está debidamente estructurada y se caracteriza por una adecuada proporción y organización de sus moléculas, asegurando un alto grado de biomimicidad. Esto supone una ventaja considerable en comparación con los métodos de biofabricación convencionales como la impresión 3D y/o el electrospinning. Si bien estos métodos permiten regular diversos parámetros estructurales y de degradación, las matrices así obtenidas carecen de biomimicidad, tienen menor biocompatibilidad y no logran un grado de complejidad químico-molecular como el aquí descrito. Además, se reduce considerablemente la complejidad de los procesos de biofabricación respecto a los convencionales, ya que no se requiere de un equipamiento complejo (como impresoras 3D, electrospinning y/o bioreactores). Asimismo, se reduce el uso de biomateriales para la generación de las matrices, compuestos que en general requieren ser altamente purificados y están disponibles en cantidades muy escasas. En la presente memoria se describe un ejemplo una estructura tubular obtenida mediante este método.
Estas MEC se someten a un nuevo procedimiento de descelularización que disminuye la inmunogenicidad, capaz de eliminar eficazmente los elementos celulares, y que a su vez asegura la preservación de los principales elementos de la MEC, como son los componentes fibrilares (fibras colágenas) y no fibrilares (proteoglicanos y glicoproteínas) con un patrón microestructural adecuado para su utilización in vivo. Se trata de un protocolo novedoso de descelularización química basado en la combinación de detergentes y agentes enzimáticos (DNAsas y RNAsas), que permite obtener una matriz extracelular totalmente libre de elementos celulares.
De forma previa a someter a los tejidos biológicos aislados al proceso de descelularización puede ser necesario realizar un paso previo de eliminación del dimetilsulfóxido (DMSO) si la muestra ha estado preservada por congelación hasta su uso en una solución de criopreservación que contiene DMSO, siendo de forma habitual 10%DMSO en solución de suero fetal bovino (FBS). Así pues, en esos casos se procede de forma previa al procedimiento de descelularización de la invención, a la eliminación DMSO de la muestra, preferentemente mediante lavado con agua destilada.
El nuevo procedimiento de descelularización de la invención consta de las siguientes etapas: a) provocar la lisis celular, preferentemente por choque osmótico con agua destilada, ya que resulta mínimamente agresivo para la estructura de los tejidos, b) eliminar material citoplasmático y celular, preferentemente con un detergente tensoactivo aniónico, como el dodecilsulfato sódico (SDS), y retirar los restos de detergente mediante lavado con agua destilada, c) disociar interacciones lipídicas, preferentemente con un detergente tensoactivo no aniónico, como Tritón X-100, y retirar los restos de detergente mediante lavado con agua destilada, d) disociar las proteínas intracelulares, preferentemente con un detergente aniónico, más preferentemente con uno distinto al utilizado previamente en el paso c), como el desoxicolato sódico (SDC), y retirar los restos de detergente mediante lavado con agua destilada, y e) degradar ARN y ADN, preferentemente con RNasa y DNasa e inactivar los agentes enzimáticos y retirar los restos de enzimáticos y detergente mediante lavado con tampón fosfato salino (PBS).
La retirada de los restos de detergentes y agentes enzimáticos utilizados en el paso b) a e), mediante lavado con agua o con PBS según corresponda, se realiza preferentemente en frió, en concreto a 4eC de temperatura, para bloquear la actividad digestiva y enzimática. La digestión enzimática del paso e) se realiza a preferentemente a 37eC, mientras que el resto del proceso se puede realizar a temperatura ambiente.
Los detergentes de los pasos b), c) y d) se solubilizan preferentemente en agua destilada, mientras que la degradación de ARN y ADN del paso e), se realiza preferentemente con RNasa y DNasa en disolución de tampón fosfato con sodio y magnesio.
La agitación acelera los procesos de lisis del paso b) y facilita el uso eficaz de los detergentes en los pasos b), c) y d). Este agente físico para acelerar los procesos puede ser sustituido por otros métodos como la sonicación (que requiere optimización) o no utilizar ninguna, pero incrementando las horas o días de duración de cada paso. En tal caso puede ser necesario un incremento de la temperatura en la que se llevan a cabo dichos procesos. Por tanto, se pueden combinar los siguientes factores: tiempo de exposición, temperatura, concentraciones de los detergentes y agentes enzimáticos utilizados y la aplicación o no de agentes físicos (agitación o sonicación), para la optimización del procedimiento. En la presente invención el paso a) y la exposición a detergentes de los pasos b) a d) se realizan preferentemente en agitación.
Cabe la posibilidad de añadir en el último paso e) antibióticos y/o antimicóticos junto con el PBS con el que se realiza el lavado para inactivar los agentes enzimáticos y retirar los restos de enzimáticos y detergente. Entre los antibióticos de preferencia están los de amplio espectro, y preferentemente se utilizan mezclas de penicilina y estreptomicina. Entre los antimicóticos de preferencia están los de amplio espectro, y preferentemente se utiliza anfotehcina B.
Un ejemplo detallado de cómo llevar a cabo el protocolo de descelulahzación se describe a continuación en la Tabla 1. Tanto los tiempos de exposición como las concentraciones de los detergentes y agentes enzimáticos se pueden variar para ajustarlos a las características concretas de los tejidos a tratar. Tabla 1. Protocolo detallado de descelularización a partir de una muestra crioprservada.
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TA: Temperatura Ambiente.
Las MEC acelulares obtenidas por dicho procedimiento son altamente biocompatibles y no inmunogénicas, presentando un bajo riesgo de rechazo, ya que los elementos capaces de inducir una respuesta inmunológica, las células, han sido eliminadas durante la descelularización.
La MEC generada mediante este proceso de descelularización sigue presentando un alto nivel de complejidad estructural y química, lo que supone una ventaja importante en comparación a los procesos de biofabricación convencionales. La MEC una vez descelularizada puede ser sometida a un proceso posterior de entrecruzamiento químico con genipín (GP) u otro agente de similares características, el cual otorga estabilidad biomecánica y estructural al producto generado. Las matrices tridimensionales acelulares tratadas con GP ven incrementadas sus propiedades biomecánicas, estabilidad estructural y reducida su biodegradabilidad in vivo, manteniendo un alto grado de biocompatibilidad ex vivo e in vivo, lo que las convierte en candidatas idóneas para su utilización en diversos protocolos de ingeniería tisular. Por resumir, el procedimiento de la invención parte de tejidos biológicos crecidos por la implantación subcutánea o intramuscular de un material inerte no reabsorbible de estructura y dimensiones definidas en un modelo animal. La cápsula de tejido conectivo generada espontáneamente por el animal tras 1 , 2 o más meses desde la implantación del implante es posteriormente recolectado junto con material implantado. Los implantes son lavados y almacenados en solución buffer fosfato (PBS) con 5% de antibióticos por al menos 24 hrs para después proceder a la liberación del biomaterial generado del dispositivo implantado. Este tejido biológico aislado puede ser conservado hasta su uso mediante técnicas de criopreservación en una solución al 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en suero bovino fetal o similar a -80eC.
El tejido biológico o biomaterial así obtenido se somete al proceso de descelularización de la presente invención, el cual se lleva cabo tal y como se ha descrito previamente.
Posteriormente cabe la posibilidad de someter la matriz extracelular acelular a un entrecruzamiento químico con agentes químicos como el genipín, tras el cual se procede a un lavado de la matriz, preferentemente en PBS 0.1 M pH 7.2-7.4.
Tanto el proceso de descelularización, como el de entrecruzamiento que aquí se describen son procedimientos simples y no requieren de equipamiento específico.
Para su uso a corto plazo las MEC descelularizadas se pueden almacenar en frió, preferentemente a 4eC, en PBS estéril y opcionalmente suplementado con antibióticos por un período de 7 días.
Las matrices extracelulares acelulares, bien tras la descelularización o bien tras el entrecruzamiento químico, pueden ser funcionalizadas mediante la adición de diversos tipos celulares, factores de crecimiento, vesículas extracelulares, biomoléculas y/o secuencias esenciales para inducir la regeneración tisular y función celular en cada caso. Por ejemplo, las MEC pueden funcionalizarse con secuencias RGD (Arg-Gly-Asp), secuencias bastante comunes en las proteínas de unión a la superficie celular, o mediante la incorporación de moléculas de la MEC como laminina, fibronectina o ácido hialurónico y nanopartículas entre otros.
Todos estos pasos se realizan bajo condiciones de esterilidad.
El método de la presente invención permite controlar las propiedades biomecánicas de las matrices obtenidas, y tras el proceso de descelularización y entrecruzamiento proporciona un material muy resistente y, por tanto, fácil de manejar desde el punto de vista quirúrgico. Por tanto, la presente invención describe matrices extracelulares acelulares, generadas a partir de tejidos biológicos, preferentemente tejidos biológicos crecidos por inducción controlada de los procesos de síntesis de matriz extracelular en animales mamíferos no humanos permitiendo obtener tejidos biológicos de dimensiones y formas predeterminadas. El tejido biológico de partida no se ve particularmente limitado, pudiéndose aplicar el tratamiento de descelularización de la presente invención a cualquier tejido biológico aislado. El procedimiento de descelularización de la presente invención permite obtener matrices extracelulares acelulares que presentan las propiedades biomecánicas y biológicas necesarias para su aplicación en ingeniería tisular, ya que no se alteran las propiedades biomecánicas de los tejidos biológicos de partida. Posteriormente, las matrices extracelulares acelulares obtenidas pueden ser opcionalmente tratadas con el agente entrecruzante GP para la mejora de sus propiedades. Finalmente, estas matrices extracelulares acelulares pueden ser preparadas para su almacenamiento o funcionalizadas con diversos tipos celulares, factores de crecimiento o biomoléculas esenciales.
En definitiva, las matrices extracelulares acelulares tal y como se describen en la presente memoria constituyen un nuevo producto de terapia avanzada para uso clínico.
Las aplicaciones de las matrices extracelulares acelulares de la presente invención son muy diversas, ya que se trata de biomateriales naturales cuya estructura, dimensiones y biomecánica puede ser controlada en función de las necesidades. Pueden ser utilizadas en protocolos de ingeniería tisular con fines de investigación; también para uso clínico, con un alto potencial de aplicación en diversas patologías y lesiones estructurales que afecten a distintos tejidos.
Además, utilizando moldes de determinadas dimensiones y morfología es posible generar matrices extracelulares que respondan a necesidades anatómicas concretas, como pueden ser nervios periféricos, vasos sanguíneos, tendones, túnica ocular, uretra o vejiga, o como la estructura tubular que se describe en el ejemplo de realización de esta invención.
La implantación de estas matrices promueve la regeneración tisular en el tiempo. Su implantación en combinación con células y factores de crecimiento potencia la adhesión y proliferación celular, de modo que el biomaterial resultante puede llegar a sustituir al material nativo, cumpliendo sus funciones fisiológicas de forma satisfactoria. Así pues, estas matrices extracelulares acelulares pueden servir de plataformas para la generación de sustitutos más complejos, los cuales pueden ser funcionalizados con diversas fuentes celulares y/o factores de crecimiento mejorando considerablemente sus futuras aplicaciones biomédicas. Un primer aspecto de la invención describe un procedimiento para la obtención ex vivo de una matriz extracelular acelular a partir de un tejido conectivo previamente aislado de un animal mamífero no humano, o procedimiento de la invención, caracterizado por que comprende un proceso de descelularización que comprende el lavado del tejido biológico, la lisis celular por choque osmótico y la aplicación de una combinación de detergentes tensoactivos aniónicos y no aniónicos, y de agentes enzimáticos para degradar ADN y ARN.
Preferentemente se incluye una fase lavado tras la aplicación de los detergentes y los agentes enzimáticos.
Preferentemente, las etapas del proceso de descelularización comprenden: a) lisis celular con agua destilada, b) uso de un detergente tensoactivo aniónico, y posterior lavado con agua destilada, c) uso de un detergente tensoactivo no aniónico, y posterior lavado con agua destilada, d) uso de un detergente aniónico, idéntico o distinto al del paso c), y posterior lavado con agua destilada, y e) uso de RNasa y DNasa, y posterior lavado con una solución que comprende tampón fosfato salino.
En una realización preferida el detergente tensoactivo aniónico del paso b) es dodecilsulfato sódico. En otra realización preferida el detergente tensoactivo no aniónico del paso c) es Tritón X-100. En otra realización preferida el detergente aniónico del paso d) es desoxicolato sódico.
En otra realización preferida el lavado con agua destilada de los pasos b) a d) y el lavado con tampón fosfato salino del paso e) se realiza en frió, preferentemente a 4eC de temperatura, la aplicación de RNasa y DNasa del paso e) se realiza a 37eC, y el resto del procedimiento se realiza a temperatura ambiente.
En otra realización preferida el paso a) y la aplicación de detergentes de los pasos b), c) y d) se realizan en agitación.
En otra realización preferida en el paso e) la solución que comprende tampón fosfato salinoademás comprende antibióticos y/o antimicóticos. En otra realización aún más preferida en el paso a) la lisis celular se provoca con un lavado en agua destilada de 7 horas, a temperatura ambiente con agitación, en el paso b) el tratamiento con dodecilsulfato sódico es al 0,1% durante 24 horas a temperatura ambiente, con agitación y el posterior lavado con agua destilada consiste en 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC, en el paso c) el tratamiento con Tritón X-100 es al 0,6% durante 24 horas, a temperatura ambiente, con agitación, y el posterior lavado con agua destilada consiste en 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC, en el paso d) el tratamiento con desoxicolato sódico es al 1% durante 24 horas a temperatura ambiente, con agitación y el posterior lavado con agua destilada consiste en 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC, en el paso e) la digestión enzimática se lleva a cabo con 100mg/l DNasa + 20mg/l RNasa por 45 min, a 37eC, y posterior el lavado con tampón fosfato salino 0.1 M (pH 7.2-7.4) con 2% antibióticos y antimicóticos consiste en 5 lavados de 15 min cada uno a 4eC.
En otra realización aún más preferida adicionalmente se lleva a cabo un paso adicional f) de entrecruzamiento químico, preferentemente con genipín, y posterior lavado.
En otra realización aún más preferida el tejido biológico aislado ha sido sometido antes de su descelularización a criopreservación. En ese caso, preferentemente de forma previa al procedimiento de descelularización se realiza el lavado de tejido biológico con agua destilada.
En otra realización aún más preferida la matriz extracelular acelular obtenida tras el paso e) de la descelularización o tras el paso f) del entrecruzamiento es funcionalizada mediante la adición de tipos celulares y/o factores de crecimiento y/o biomoléculas esenciales para inducir la regeneración tisular y función celular.
En una realización aún más preferida el tejido biológico aislado de partida ha crecido en el animal mamífero no humano gracias a la implantación de un molde compuesto de biomateriales no reabsorbióles. En una realización aún más preferida el tejido biológico aislado del animal mamífero no humano de partida ha crecido alrededor de un molde compuesto de biomateriales no reabsorbióles.
Un segundo aspecto de la invención describe una matriz extracelular acelular obtenible por el procedimiento de la invención.
Preferentemente, la matriz extracelular acelular tiene una estructura tubular, sacular, plana o mallada. Un tercer aspecto de la invención describe el uso de la matriz extracelular acelular de la invención en ingeniería tisular, preferiblemente en la reparación y/o la sustitución del material nativo dañado y más preferiblemente para reparar y/o sustituir nervios periféricos, vasos sanguíneos, uretra, vejiga, tendones, túnica ocular, pared abdominal, mucosas o superficies epiteliales.
Un experto en la materia podría introducir cambios o modificaciones en los ejemplos o realizaciones particulares de realización descritos sin salirse de esta invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Implante y extirpación de conductos de silicona en el tejido subcutáneo de roedores.
Figura 2. Prueba de transparencia y cuantificación del ADN de los bioconductos nativos y descelulañzados de 1 mes (T1 M) y 2 meses (T2M). (A) Imágenes macroscópicas de bioconductos de T1 M y T2M representativos de cada condición: control (CTR) y descelulañzados (D). (B) Resultados gráficos la cuantificación del ADN y (C) el análisis de la transparencia de los nervios nativos y descelulañzados en T1 M y T2M.
Figura 3. Resultados mecánicos de tracción de los bioconductos nativos de 1 mes y de 2 meses control (T1 M-CTR y T2M-CTR), descelulañzados (T1 M-D y T2M- D) y descelulañzados y entrecruzados con genipín (T1 M-DG y T2M-DG). Representación gráfica de los resultados del (A) Módulo de Young, (B) la deformación por tracción y (C) el esfuerzo a la rotura.
Figura 4: Análisis histológico de tejidos de 1 y 2 meses (T1 M y T2M) en condiciones control, descelulañzados y descelulañzados y entrecruzados con genipín (CTR, D y DG), realizado en secciones histológicas teñidas con HE y DAPI. Análisis estructural de T1 M-CTR, T1 M-D, T1 M- DG, T2M-CTR, T2M-D y T2M-DG con técnica SEM. (A) Imágenes de tinción HE a 4x de aumento. Se observa un tejido conectivo denso que define una estructura tubular. (B) Imágenes de tinción HE a 20 aumentos. En las muestras D y DG de T1 M y T2M no se observa ningún núcleo. (C) Imágenes de la tinción con DAPI donde se observan muchos núcleos en T1 M-CTR y T2M-CTR y la ausencia de estos en la condición D y DG. (D) Vista general de CTR, D y DG en los bioconductos T1 M y T2M obtenida con la técnica microscopía electrónica de barrido. (E) Imágenes de la técnica SEM que aprecian la organización fibrilar del tejido conectivo denso en cada condición en T1 M y T2M.
Figura 5: Análisis histológico de los componentes de la matriz extracelular de los bioconductos nativos, descelulañzados y descelulañzados y entrecruzados con genipín en T1 M y T2M. (A) Tinción con azul Alcian en todas las condiciones y tiempos (B) Tinción con orceína en las distintas matrices generadas (C) Las imágenes del método histoquímico Picrosirius muestran la conservación de las fibras de colágeno en todos los grupos. (D) Las imágenes de Picrosirius con luz polarizada demuestran la modificación de la disposición de las fibras de colágeno tras el entrecruzamiento con genipín. Barra de escala= 100pm.
Figura 6: Resultados del análisis histológico cuantitativo para T1 M-CTR, T1 M-D, T2M- CTR, T2M-D. Los gráficos muestran los resultados de la prueba de intensidad (A, B) de Azul Alcian y de intensidad de Picrosirius (C, D) en T1 M y T2M en cada condición, tejido conectivo laxo vs denso.
Figura 7: Evaluación de la citocompatibilidad ex vivo. Se muestra el comportamiento de las células mesenquimales alogénicas de la grasa (ADMSC) cultivadas sobre las matrices generadas para (A) el análisis Live&Dead (L/D) y (B) el ensayo metabólico WST-1. Para el ensayo L/D se incluyeron controles técnicos en 2D, donde se aprecian las células vivas en color verde y las muertas en color rojo. Barra de escala = 500 pm. Para WST-1 se graficaron los valores medios con sus respectivas barras de error que corresponden a las desviaciones estándar. Las diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) se determinaron con la prueba de Mann- Whitney como sigue: # = frente a CTR - 2D; * = frente a CTR + 2D; a = T1 M-D vs T2M-D; b = frente su homólogo entrecruzado con genipín.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A continuación, se detallan brevemente las principales características histológicas, biomecánicas, bioquímicas y de biocompatibilidad de las distintas matrices de tejido conectivo generadas in vivo (en este caso en forma de bioconducto) mediante la encapsulación de material no reabsorbible por parte del animal de experimentación. Posteriormente se describen los procesos de descelularización y entrecruzamiento o crosslinking químico, en este caso con el agente natural genipín (GP).
Generación de las matrices
Para la generación de las matrices, se procede a la implantación de un conducto de silicona en el tejido subcutáneo en ratas Wistar. El procedimiento se realiza mediante anestesia general. Tras la implantación, los animales son mantenidos en laboratorio y transcurrido 1 y 2 meses, los animales son sacrificados para la recolección de muestras.
Descelularización tisular Las matrices fueron descelularizadas mediante un método combinado que se detalla a continuación:
1 . Lavado en agua destilada: 8 lavados de 5 min cada uno y un lavado de 7 horas, a temperatura ambiente con agitación.
2. Tratamiento con dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1 % durante 24 horas a temperatura ambiente, con agitación.
3. Lavado en agua destilada: 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC.
4. T ratamiento con T ritón X-100 al 0,6% durante 24 horas, a temperatura ambiente, con agitación.
5. Lavado en agua destilada: 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC.
6. Tratamiento con desoxicolato sódico (SDC) al 1 % durante 24 horas a temperatura ambiente, con agitación.
7. Lavado en agua destilada: 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC.
8. Digestión enzimática: 100mg/L DNasa + 20mg/L RNasa por 45 min, a 37eC.
9. Lavado en PBS 0.1 M (pH 7.2-7.4) con 2% de un coctel de antibióticos y antimicóticos: al menos 5 lavados de 15 min cada uno a 4eC. El coctel de antibióticos (100x), de origen comercial, contiene: 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 pg de anfotericina B por mi.
Análisis de la descelularización de los bioconductos
En primer lugar, se realizó un análisis de la descelularización de los bioconductos generados en ambos tiempos (Figura 2). Para ello se realizó una evaluación del porcentaje de transparencia y un análisis de la cantidad de ADN de los bioconductos nativos al mes (T1 M) y a los 2 meses (T2M).
Los bioconductos descelularizados son en general más blancos y transparentes que sus respectivos bioconductos control (CTR) que conservan aún algún residuo sanguíneo en su interior lo que genera un tono rosáceo del bioconducto.
Posteriormente, y con el fin de alcanzar los criterios establecidos por Crapo et al. [12] para el tejido descelularizado, <50ng de ADN de doble cadena (dsDNA) por mg de peso de MEC, se cuantificó el ADN de los bioconductos antes y después del proceso de descelularización y se comprobó cómo el proceso de descelularización satisfactoriamente generó matrices correctamente descelularizadas con un contenido de ADN mucho menor que su respectivo control cumpliendo con los criterios establecidos en la literatura científica.
Análisis biomecánicos
Con el fin de mejorar las propiedades biomecánicas de los bioconductos generados, se realizaron procesos de entrecruzamiento químico con una solución acuosa de Genipin (GP) al 0.1 % de acuerdo con protocolos establecidos [8,11]. En este sentido, las muestras fueron sumergidas en una solución estéril de GP durante 72 horas a 37eC.
GP es un agente entrecruzante capaz de inducir la formación de interacciones moleculares entre los componentes de la MEC, incrementando las propiedades biomecánicas de los mismos (DG) respecto a los tejidos descelularizados (D) y también respecto a los controles (CTR) (Figura 3).
Este proceso de entrecruzamiento generó matrices con diferencias significativas con respecto al tejido descelularizado no entrecruzado. Aumentó significativamente el módulo de Young (Figura 3A) y el esfuerzo de tracción a la rotura (Figura 3C) en los tiempos estudiados (T1 M y T2M), lo que nos indica que la reticulación de la MEC aumentó la rigidez en nuestros bioconductos aumentando así su capacidad de resistencia ante las fuerzas externas o deformación por tracción (Figura 3B).
Cabe destacar que las matrices descelularizadas pero no tratadas con GP, si bien no ven mejoradas sus características biomecánicas, mantienen valores muy similares a los tejidos control, no sometidos a ningún tratamiento, con lo que podemos concluir que el proceso de descelularización no afecta negativamente a ninguno de los parámetros medidos.
Análisis histológicos y ultraestructurales
Los análisis histológicos se centraron en la evaluación de la MEC generada a los 1 y 2 meses tanto en el momento previo a su descelularización (T 1 M-CTR y T2M-CTR), como tras el proceso de descelularización (T 1 M-D y T2M-D), y tras el procedimiento de entrecruzamiento químico con genipin (T 1 M-DG y T2M-DG).
En primer lugar, la tinción con hematoxilina-eosina (HE) reveló que la matriz generada con forma de bioconducto presenta una estructura homogénea tras 1 y 2 meses de implantación del material no reabsorbióle (silicona) que se mantiene tras la descelularización y el tratamiento con GP (Figura 4Ay 4B). Los bioconductos se componen de una parte interna densa, en contacto con los moldes de silicona implantados, y una capa externa de tejido conectivo menos densa en el resto del material. En general, se observa un tejido conectivo bien estructurado que presenta un estado de maduración y compactación mayor en el segundo mes, que tras la descelularización carece de núcleos celulares.
Además, la tinción con DAPI, un marcador fluorescente que se une al ADN, reveló específicamente una gran cantidad de núcleos celulares, celularidad, dentro de la pared de los bioconductos (Figura 3C), que parecen en el segundo tiempo, y que en cualquier caso desaparecen en ambos tiempos tras la descelularización (T1 M-D y T2M-D), lo que da muestra de la efectividad del procedimiento de descelularización confirmando los resultados de HE.
La histología revela que ni el proceso de descelularización (observando los grupos descelularizados (D)) ni el proceso de entrecruzamiento químico con GP (DG) afectan al patrón y definición estructural de la matriz generada.
El análisis con microscopio electrónico de barrido (SEM) mostró claramente un aumento de la cantidad de tejido conectivo y de la densidad de los bioconductos generados si se comparan las muestras crecidas 1 y 2 meses (CTR). El proceso de descelularización (D) y entrecruzamiento (DG) de los bioconductos no afectó a la estructura, composición y organización 3D de la matriz extracelular en cada periodo en comparación con el grupo control (Figura 4D y 4E).
Para determinar el impacto de la descelularización y del entrecruzamiento con genipín en la conservación de la matriz extracelular, realizamos tinciones con azul Alcian (Figura 5A), orceína (Figura 5B) y Picrosirius (Figura 5C y5D). La tinción con azul Alcian reveló la presencia de proteoglicanos en el tejido denso de los bioconductos generados en las tres condiciones y dos períodos de tiempo. Curiosamente, no se observa ninguna fibra elástica con la tinción de Orceína en la pared de todas las matrices generadas. La tinción histoquímica de Picrosirius fue positiva en las partes laxas y densas de la pared de todos los bioconductos, confirmando la presencia de abundantes fibras de colágeno. Además, la microscopía de luz polarizada mostró birrefringencia en la mayoría de los bioconductos generados, haciendo evidente el alto grado de organización de las fibras de colágeno (Figura 5D).
Posteriormente se realizó un estudio cuantitativo de los elementos principales de la matriz extracelular de los bioconductos antes (CTR) y después del proceso de descelularización (D) (Figura 6). Estos resultados mostraron una ligera disminución de las fibras de colágeno y de los proteoglicanos ácidos para los bioconductos descelularizados que no resultan en ningún caso significativos.
Biocompatibilidad de los biomateriales generados
Para comprobar los posibles efectos citotóxicos producidos en las matrices tras el proceso de descelularización y/o entrecruzamiento químico, las matrices generadas fueron sometidas a un análisis de biocompatibilidad. Para ello, células madre mesenquimales alogénicas de la grasa (ADMSC) fueron cultivadas sobre las matrices descelularizadas y las descelularizadas y entrecruzadas con GP. Tras 72 horas de cultivo, se determinó la interaccione célula-biomaterial mediante los ensayos WST-1 (Laboratorios Roche, Suiza) y Live/Dead® Cell Viability Assay (L/D) (Thermo-Fisher Scientific, EE.UU.).
Brevemente, en el L/D las muestras con células y los controles se incubaron con la solución de trabajo compuesta por calceína/homodímero de etidio-1 durante 15 minutos a 37°C, mostrando las células viables y metabólicamente activas en color verde en todos los grupos de estudio, con una morfología similar control positivo en 2D (Figura 7A). Por otro lado, las distintas matrices no presentaron células muertas, que se muestran en color rojo en el control negativo en 2D, ya que tras ser tratadas con Tritón X-100 permitieron que el agente intercalante etidio entrara al núcleo. Por otro lado, la actividad metabólica de las ADSC sembradas en las diferentes matrices generadas se midió cuantitativamente con el ensayo de la sal de tetrazolio soluble en agua (WST- 1 ) (Figura 7.B). Tras ser incubadas con el reactivo de la solución de trabajo durante 4 h a 37°C, todos los grupos experimentales presentaron signos claros de actividad metabólica, siendo mayor en el grupo de T1 M. El tratamiento con GP resultó en una disminución de los valores metabólicos, pero no acompañado de muerte celular (L/D), lo que sugiere que un número menor de células han interactuado con la matriz generada.
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12. Crapo, P.M.; Gilbert, T.W.; Badylak, S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials 2011 , 32, 3233-3243, doi : 10.1016/j. biomaterials.2011 .01 .057.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Procedimiento para la obtención ex vivo de una matriz extracelular acelular a partir de un tejido conectivo previamente aislado de un animal mamífero no humano adecuado para su uso como xenoinjertos, caracterizado por que comprende un proceso de descelularización del tejido biológico que comprende las siguientes etapas: a) provocar la lisis celular con agua destilada, b) aplicar un detergente tensoactivo aniónico, y posteriormente lavar con agua destilada, c) aplicar un detergente tensoactivo no aniónico, y posteriormente lavar con agua destilada, d) aplicar un detergente aniónico, idéntico o distinto al del paso c), y posteriormente lavar con agua destilada, y e) aplicar RNasa y DNasa, y posteriormente lavar con una solución que comprende tampón fosfato salino.
2. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado por que el detergente tensoactivo aniónico del paso b) es dodecilsulfato sódico.
3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el detergente tensoactivo no aniónico del paso c) es Tritón X-100.
4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el detergente aniónico del paso d) es desoxicolato sódico.
5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el lavado con agua destilada de los pasos b) a d) y el lavado con tampón fosfato salino del paso f) se realiza en frió, la aplicación de RNasa y DNasa del paso e) se realiza a 37eC, y el resto del procedimiento se realiza a temperatura ambiente.
6. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado por que el lavado con agua destilada de los pasos b) a d) y el lavado con la solución que comprende tampón fosfato salino del paso e) se realizan a 4eC de temperatura.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el paso a) y la aplicación de detergentes de los pasos b), c) y d) se realizan en agitación.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que en el paso e) la solución de lavado que comprende tampón fosfato salino además comprende antibióticos y/o antimicóticos.
9. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado por que en el paso a) la lisis celular se provoca con un lavado en agua destilada de 7 horas, a temperatura ambiente con agitación, en el paso b) el tratamiento con dodecilsulfato sódico es al 0,1% durante 24 horas a temperatura ambiente, con agitación y el posterior lavado con agua destilada consiste en 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC, en el paso c) el tratamiento con Tritón X-100 es al 0,6% durante 24 horas, a temperatura ambiente, con agitación, y el posterior lavado con agua destilada consiste en 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC, en el paso d) el tratamiento con desoxicolato sódico es al 1% durante 24 horas a temperatura ambiente, con agitación y el posterior lavado con agua destilada consiste en 3 lavados de 30 min cada uno a 4eC, en el paso e) la digestión enzimática se lleva a cabo con 100mg/l DNasa + 20mg/l RNasa por 45 min, a 37eC, y posterior el lavado con tampón fosfato salino 0.1 M (pH 7.2-7.4) con 2% antibióticos y antimicóticos consiste en 5 lavados de 15 min cada uno a 4eC.
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que comprende un paso adicional f) de entrecruzamiento químico y posterior lavado.
1 1. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado por que el agente entrecruzante químico utilizado es genipín.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el tejido biológico aislado de partida ha sido sometido antes de su descelularización a criopreservación.
13. El procedimiento según la reivindicación anterior caracterizado por que de forma previa al procedimiento de descelularización se realiza el lavado de tejido biológico con agua destilada.
14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que la matriz extracelular acelular obtenida tras el paso e) o f) es funcionalizada mediante la adición de tipos celulares y/o factores de crecimiento y/o biomoléculas esenciales para inducir la regeneración tisular y función celular.
15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el tejido biológico aislado de un animal mamífero no humano de partida es el crecido alrededor de un molde compuesto de biomateriales no reabsórbales.
16. Matriz extracelular acelular obtenible por el procedimiento de obtención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. La matriz extracelular acelular según la reivindicación anterior caracterizada por tener estructura tubular, sacular, plana o mallada.
18. Uso de la matriz extracelular acelular según cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17 en ingeniería tisular.
19. El uso según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende la reparación y/o la sustitución del material nativo dañado.
20. El uso según la reivindicación anterior caracterizado por que los tejidos a reparar y/o sustituir son nervios periféricos, vasos sanguíneos, uretra, vejiga, tendones, túnica ocular, pared abdominal, mucosas o superficies epiteliales.
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