WO2024248166A1 - 一本鎖ｄｎａ連結用組成物 - Google Patents

Abstract

効率的な一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する新規な酵素組成物等を提供する。本発明は、１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結用組成物であって、（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は、（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質を含む、前記組成物等に係るものである。

Description

一本鎖ＤＮＡ連結用組成物

　本発明は、アクセプターとしての一本鎖ＤＮＡとドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結用組成物、一本鎖ＤＮＡ連結剤、一本鎖ＤＮＡ連結用キット等に関する。

　強力な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）連結活性をもつ酵素があれば、多くの応用が期待できるが、現在のところそのような酵素は知られていない。しかし、一本鎖ＤＮＡ連結技術に対する需要が大きいことはシーケンスライブラリー調製を考えれば容易に理解できる。最近、さまざまな種類の一本鎖ＤＮＡが注目されており、それらの効率的な配列決定が望まれている。例えば血液の無細胞分画に含まれる短い一本鎖ＤＮＡは、ヌクレオソームサイズのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）とは異なる特徴を持っていることが明らかになっており、その分析に期待が寄せられている（非特許文献１~３参照）。また、数千年前の遺跡から発掘された骨から抽出されたＤＮＡは、一般的に著しく分解が進行し、損傷を受けて一本鎖になっている（非特許文献４参照）。配列決定が必要な一本鎖ＤＮＡの例は他にも沢山あるはずである。しかしながら、現在市販されているライブラリー調製キットは、二本鎖ＤＮＡのみに対応しているものが殆どであり、一本鎖ＤＮＡに対応したものは限られており、その一本鎖ＤＮＡに対応したもの及びプロトコールもライブラリー調製効率はそれほど実用的であるとはいえない（非特許文献１、５及び６参照）。

　このような一本鎖ＤＮＡ同士を高効率に連結する手法が得られない状態を打破するため、本発明者は最近になって、ＴＡＣＳライゲーション法と称する技術を開発した（非特許文献７参照）。この方法では、最初にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて標的一本鎖ＤＮＡの３′末端にいくつかのアデニル酸を付加する（非特許文献８参照）。この短いＲＮＡストレッチ（リボテイル）は、ＲＮＡリガーゼの格好の基質となり、そのライゲーション活性を増大させるコネクターとなる（非特許文献９参照）。その結果、ＴｄＴ存在下のＲＮＡリガーゼの一本鎖ＤＮＡ連結活性は最適な条件下で８０％を超える（非特許文献７参照）。このＴＡＣＳライゲーションの原理を用いると、その高い一本鎖ＤＮＡ連結活性によって血中セルフリーＤＮＡ（非特許文献１参照）や古代人骨から抽出された分解の進行したＤＮＡからも高効率なシーケンスライブラリー調製を行うことができる。しかしながら、その過程で導入されるリボテイルは、塩基挿入やＲＮＡの存在が不利になるような技術の開発では利用できないという制約があった。
　先行技術文献

非特許文献
Ｈｉｓａｎｏ，Ｏ．，Ｉｔｏ，Ｔ．ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ，Ｆ．（２０２１）Ｓｈｏｒｔ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡｓ　ｗｉｔｈ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｃｏｍｐｒｉｓｅ　ａ　ｎｅｗ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ＤＮＡ．ＢＭＣ　Ｂｉｏｌ，１９，２２５． Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｍｏｒｓｅｌｌｉ，Ｍ．，Ｈｕａｎｇ，Ｗ．−Ｌ．，Ｈｅｏ，Ｙ．Ｊ．，Ｐｉｎｈｅｉｒｏ−Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｔ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｗｅｉ，Ｆ．，Ｃｈｉａ，Ｄ．，Ｋｉｍ，Ｙ．，Ｈｅ，Ｈ．−Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（２０２２）Ｐｌａｓｍａ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｔｏ　ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ＤＮＡ．ｉＳｃｉｅｎｃｅ，２５，１０４５５４． Ｈｕｄｅｃｏｖａ，Ｉ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｇ．，Ｈａｎｓｅｌ−Ｈｅｒｔｓｃｈ，Ｒ．，Ｃｈｉｌａｍａｋｕｒｉ，Ｃ．Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．，Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎ，Ａ．，Ｈｅｉｄｅｒ，Ｋ．，Ｃｈａｎｄｒａｎａｎｄａ，Ｄ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｗ．Ｎ．，Ｇａｌｅ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．（２０２２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｏｒｉｇｉｎ，ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ　ｐｌａｓｍａ　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ＤＮＡ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，２１５−２２７． Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．，Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇａｎｓａｕｇｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｒａｃｉｍｏ，Ｆ．，Ｍａｌｌｉｃｋ，Ｓ．，Ｓｃｈｒａｉｂｅｒ，Ｊ．Ｇ．，Ｊａｙ，Ｆ．，Ｐｒｕｆｅｒ，Ｋ．，ｄｅ　Ｆｉｌｉｐｐｏ，Ｃ．ｅｔ　ａｌ．（２０１２）Ａ　ｈｉｇｈ−ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ａｎ　ａｒｃｈａｉｃ　Ｄｅｎｉｓｏｖａｎ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３８，２２２−２２６． Ｇａｎｓａｕｇｅ，Ｍ．Ｔ．ａｎｄ　Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．（２０１３）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ａｎｃｉｅｎｔ　ｏｒ　ｄａｍａｇｅｄ　ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８（４），７３７−７４８． Ｇａｎｓａｕｇｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｇｅｒｂｅｒ，Ｔ．，Ｇｌｏｃｋｅ，Ｉ．，Ｋｏｒｌｅｖｉｃ，Ｐ．，Ｌｉｐｐｉｋ，Ｌ．，Ｎａｇｅｌ，Ｓ．，Ｒｉｅｈｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．ａｎｄ　Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．（２０１７）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｈｉｇｈｌｙ　ｄｅｇｒａｄｅｄ　ＤＮＡ　ｕｓｉｎｇ　Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（１０），ｅ７９． Ｍｉｕｒａ，Ｆ．，Ｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．，Ｍｉｕｒａ，Ｍ．，Ｓａｎｇａｔｓｕｄａ，Ｙ．，Ｈｉｓａｎｏ，Ｏ．，Ａｒａｋｉ，Ｈ．ａｎｄ　Ｉｔｏ，Ｔ．（２０１９）Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｌｏｗ−ｉｎｐｕｔ　ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ　ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｐｏｓｔ−ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　ａｄａｐｔｏｒ　ｔａｇｇｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７（１５），ｅ８５． Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｍ．ａｎｄ　Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗ．（１９９６）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｔａｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ（ＣＲＴＣ）ｂｙ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ａ　ｎｅｗ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｉｎ　ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，１７８９−１７９１． Ｂｌｏｎｄａｌ，Ｔ．，Ｔｈｏｒｉｓｄｏｔｔｉｒ，Ａ．，Ｕｎｎｓｔｅｉｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｕ．，Ｈｊｏｒｌｅｉｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．，Ａｅｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．，Ｅｒｎｓｔｓｓｏｎ，Ｓ．，Ｆｒｉｄｊｏｎｓｓｏｎ，Ｏ．Ｈ．，Ｓｋｉｒｎｉｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．，Ｗｈｅａｔ，Ｊ．Ｏ．，Ｈｅｒｍａｎｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ａ．Ｇ．ｅｔ　ａｌ．（２００５）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　１　ｆｒｏｍ　ａ　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ＴＳ２１２６　ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，１３５−１４２． Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｈ．ａｎｄ　Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．（１９９６）Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｔ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　５′−ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４，９９０−９９１． Ｔｅｓｓｉｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｒ．ａｎｄ　Ｖｅｒｎｅｔ，Ｔ．（１９８６）Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｂｙ　Ｔ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１５８，１７１−１７８． Ｂｌｏｎｄａｌ，Ｔ．，Ｈｊｏｒｌｅｉｆｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．Ｈ．，Ｆｒｉｄｊｏｎｓｓｏｎ，Ｏ．Ｆ．，Ａｅｖａｒｓｓｏｎ，Ａ．，Ｓｋｉｒｎｉｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．，Ｈｅｒｍａｎｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ａ．Ｇ．，Ｈｒｅｇｇｖｉｄｓｓｏｎ，Ｇ．Ｏ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｖ．ａｎｄ　Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．（２００３）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　Ｔ４　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，７２４７−７２５４． Ｚｈｅｌｋｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ　ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌ．Ａ．（２０１２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　ＡＴＰ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ．ＢＭＣ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，１３，２４． Ｍｉｕｒａ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０１２，４０，ｅ１３６ Ｍｉｕｒａ　Ｆ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ　Ｎ，Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｍ，Ｕｅｍａｔｓｕ　Ｃ，Ｋｉｔｏ　Ｋ，Ｓａｋａｋｉ　Ｙ，Ｉｔｏ　Ｔ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｕｄｄｉｎｇ　ｙｅａｓｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ａｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡｓ．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８；９：５７４． Ｍｉｕｒａ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．，Ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｃｈｅｍｅ　ｆｏｒ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，１３，１３９１３，２０２３

　このような状況下において、リボテイルを付加せずとも、効率的な一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する新規な酵素組成物等の開発が望まれていた。

　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、一本鎖ＤＮＡ連結用組成物、一本鎖ＤＮＡ連結剤、一本鎖ＤＮＡ連結用キット等を提供するものである。

［１］１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結用組成物であって、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を含む、前記組成物。
［２］前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、前記［１］に記載の組成物。
［３］さらにＰＥＧを含む、前記［１］に記載の組成物。

［４］１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結剤であって、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を含む、前記連結剤。
［５］前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、前記［４］に記載の連結剤。
［６］さらにＰＥＧを含む、前記［４］に記載の連結剤。

［７］１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結用キットであって、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を含む、前記キット。
［８］前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、前記［７］に記載のキット。
［９］さらにＰＥＧを含む、前記［７］に記載のキット。

［１０］１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡ、及び１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡに、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を接触させ、該アクセプターＤＮＡと該ドナーＤＮＡとを連結させることを含む、連結された一本鎖ＤＮＡの製造方法。
［１１］１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡ、及び１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡに、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を接触させ、該アクセプターＤＮＡと該ドナーＤＮＡとを連結させることを含む、一本鎖ＤＮＡ連結方法。

［１２］前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、前記［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］前記［１０］又は［１１］に記載の方法における、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
の使用。
［１４］前記［１０］又は［１１］に記載の方法において使用するための、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質。

［１５］一本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法であって、
　（Ａ）標的一本鎖ＤＮＡフラグメントに対して、５’末端がリン酸化されている一本鎖アダプター配列をライゲーションするステップ；
　（Ｂ）ライゲーション後の配列のアダプターを起点にＤＮＡ複製を行って二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
　（Ｃ）二本鎖ＤＮＡのアダプター配列が付加されていない末端に、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列をライゲーションするステップ；
　（Ｄ）ライゲーション後の二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップ
を含み、
　前記（Ａ）のステップにおけるライゲーションが、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を用いたライゲーション法により行われる、
前記調製方法。

［１６］本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法であって、
　（ｉ）両末端が脱リン酸化されている一本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端に、５’末端がリン酸化されている一本鎖アダプター配列Ａ１をライゲーションし、アダプター付加一本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
　（ｉｉ）前記アダプター付加一本鎖ＤＮＡに含まれるアダプター配列Ａ１部分に、一本鎖アダプター配列Ａ２をアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼにより前記アダプター配列Ａ２の３’末端を伸長させて、アダプター付加二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
　（ｉｉｉ）一方の５’末端のみがリン酸化され、当該５’末端に相補的な３’末端を含む領域にトポイソメラーゼの認識配列を有する、二本鎖アダプター配列Ｂ１に、トポイソメラーゼを反応させて、前記認識配列の３’末端にトポイソメラーゼをコンジュゲートさせた、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２を生成するステップ；
　（ｉｖ）前記アダプター付加二本鎖ＤＮＡのアダプター配列が付加されていない末端に、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２をライゲーションして、両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；及び
　（ｖ）前記両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップ
を含み、
　前記（ｉ）のステップにおけるライゲーション及び生成が、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を用いたライゲーション法により行われる、
前記調製方法。

　ここで、上記［１６］に記載の調製方法において、
　前記トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２は、
　未反応の前記一本鎖アダプター配列Ａ１と、未反応の前記一本鎖アダプター配列Ａ２とがアニーリングして生成される二本鎖アダプター配列Ｃとは、ライゲーションしないものであることが好ましい。
　また、前記二本鎖アダプター配列Ｂ１は、リン酸化されている５’末端を含む領域にニックを有し、かつ、前記一本鎖アダプター配列Ａ１は、当該配列中にウラシル又はｄＳｐａｃｅｒを有するものであることが好ましい。
　また、前記（ｉｖ）のステップは、前記生成後の反応系にエンドヌクレアーゼを添加することを含むことが好ましい。

［１７］上記［１５］又は［１６］に記載の調製方法により得られる、二本鎖ＤＮＡライブラリー。

　本発明によれば、効率的な一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する新規な酵素組成物としての一本鎖ＤＮＡ連結用組成物、一本鎖ＤＮＡ連結剤、一本鎖ＤＮＡ連結用キット等を提供することができる。本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物等を用いることにより、リボテイルを付加せずとも、ドナー及びアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡを連結することができ、例えば、高効率なシーケンスライブラリー調製を行うことができる点で有用なものである。

［図１］一本鎖ＤＮＡリガーゼの同定に関する図である。
　Ａ．ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼに相同なタンパク質の系統樹。破線のボックス内を右側のパネルで拡大表示している。
　Ｂ．使用したアッセイのデザイン。反応中のＴｄＴは、アクセプターの３′末端に対しいくつかのアデニル酸を連結する。このＲＮＡがＲＮＡリガーゼのライゲーション活性を高める。これがいわゆるＴＡＣＳライゲーションであり、ＴｄＴの存在下で高効率に連結反応が起こっている例がいくつか確認された。ＴｄＴの非存在下で連結が起こればその酵素は本物の一本鎖ＤＮＡ連結活性を有することを意味する。
　Ｃ．実際にスクリーニングを行った際のゲル画像。ライゲーションが起こるとバンドは上部にシフトする。
［図２］候補タンパク質間の系統関係を示す図である。
　Ａ．部分系統樹。ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼと相同なタンパク質のアミノ酸配列の相同関係。図１Ａの拡大部分と同じものを示している。
　Ｂ．Ａで示したアミノ酸配列のマルチプルアラインメント。ＷＰ＿１７２９５９１５６とＲＴＩ０２５２５はＮ末端の伸長を除いて完全に同じアミノ酸配列を持つ。ＷＰ＿０８１８９２７３５とＷＰ＿０３８０６９７９２についても同様。
［図３］６つの候補タンパク質のデュアルアフィニティ精製を示す図である。
　Ａ．精製戦略。
　Ｂ~Ｄ．精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析結果。レーン番号の意味はＡに示した通り。精製前のライセートと精製後のタンパク質をａｎｙＫｄミニプロテアンＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で分析した。電気泳動後、ゲルをＢｕｌｌｅｔ　ＣＢＢ　Ｓｔａｉｎ　Ｏｎｅ（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ　Ｔｏｕｃｈイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で撮影した。
［図４］ＡＹＪ７３９７０の最適反応温度を示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。斜体フォントの数字はオリゴヌクレオチドの長さを示す。
　Ｂ，Ｃ．反応後の変性ゲル電気泳動による分析画像。５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、１６％（ｗ／ｖ）　ＰＥＧ６０００、５ｐｍｏｌアクセプターＤＮＡ（Ｎ５０、表１参照）、５０ｐｍｏｌのドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、表１参照）、および３μｇのＳＤＬ（ＡＹＪ７３９７０）を含む２５μＬの反応液を用意し、それぞれの温度で１時間インキュベートした。コントロールとして、リガーゼを含まないレーンを用意した。反応後、２０μＬのＢｕｆｆｅｒ　Ｂ２（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、５０℃で１５分間インキュベートした。次いで、反応物に２μＬのＳｅｒａ−Ｍａｇカルボキシレートビーズ（Ｃｙｔｉｖａ、マールボロ、マサチューセッツ州）と５０μＬのエタノールを加えて、室温で５分間インキュベートした。ビーズを２００μＬの７０％　エタノールですすいだ後、精製したＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。精製ＤＮＡと等容積のホルムアミドを混合し、７０℃で５分間加熱した後、１０％　Ｎｏｖｅｘ　ＴＢＥ−尿素ゲル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）にロードした。電気泳動後のゲルはＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄゲル染色（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ　Ｔｏｕｃｈイメージングシステムで画像を撮影した。
　なお、本願の図４以降（図４~１４）において、「ＳＤＬ」との表記は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｐｈａｇｅ　ｐｈｉＬｏに由来するリガーゼ（Ｔｐｈ　ｓｓＤＮＡリガーゼ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹＪ７３９７０）を意味するものとし、単に「ＡＹＪ７３９７０」と表記することもある。
［図５］さまざまな分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が及ぼす影響を示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。
　Ｂ~Ｄ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、５ｐｍｏｌアクセプターＤＮＡ（Ｎ５０）、５０ｐｍｏｌドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、表１参照）、３μｇのＳＤＬ、および示された濃度の各ＰＥＧを含む２５μＬ中の反応液を用意し、３７℃で１時間インキュベートした。対照として、リガーゼを含まない反応液を用意した。反応結果の分析手法は図４と同じ。
［図６］反応ｐＨと緩衝系の最適化示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。
　Ｂ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。５０ｍＭの表示された緩衝成分、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、１６％（ｗ／ｖ）　ＰＥＧ６０００、５ｐｍｏｌアクセプターＤＮＡ（Ｎ５０）、５０ｐｍｏｌドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、表１参照）および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬ中の反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。対照として、リガーゼを含まない反応液を用意した。反応結果の分析手法は図４と同じ。
［図７］ｓｓＤＮＡリガーゼの最適イオン濃度を示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。
　Ｂ，Ｃ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。表示されたイオンに加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、１６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、５ｐｍｏｌアクセプターＤＮＡ（Ｎ５０）、５０ｐｍｏｌのドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、表１参照）、および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬの反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。反応結果の分析手法は図４と同じ。
［図８］ｓｓＤＮＡリガーゼの最適塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）濃度を示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。
　Ｂ，Ｃ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。表示されたマグネシウム濃度に加え、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、１６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、５ｐｍｏｌアクセプターＤＮＡ（Ｎ５０）、５０ｐｍｏｌのドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、表１参照）、および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬの反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。反応結果の分析手法は図４と同じ。
［図９］ｓｓＤＮＡリガーゼのドナーとアクセプターの最小サイズの検討を示す図である。
　Ａ，Ｃ．ドナー（Ａ）とアクセプター（Ｃ）に必要なヌクレオチド長を検討するためのアッセイデザイン。
　Ｂ，Ｄ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、３２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ６００、オリゴヌクレオチド（後述）、および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬの反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。反応物をホルムアミドで１：９の比率で希釈し、９５℃で３分間熱変性させ、１０％　Ｎｏｖｅｘ　ＴＢＥ−尿素ゲルにロードした。電気泳動後、染色せずにＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＴｏｕｃｈイメージングシステムでＦＡＭの蛍光シグナルを撮影した。ドナーの長さを調べるアッセイでは５０ｐｍｏｌのアクセプターＤＮＡ（ＦＡＭ−Ｎ４０、表１参照）と１００ｐｍｏｌのドナーＤＮＡ（４種類の塩基の混合配列を化学合成したもの）を使用した。アクセプターの長さの検討では、５０ｐｍｏｌのドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−ＦＡＭ、表１参照）と１００ｐｍｏｌアクセプターＤＮＡ（５’末端と３’末端の両方がリン酸化修飾された４種類の塩基の混合配列を化学合成したもの）を使用した。
［図１０］ＲＮＡに対するｓｓＤＮＡリガーゼの反応性を示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。
　Ｂ，Ｃ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、３２％（ｖ／ｖ）　ＰＥＧ６００、ドナー（ＤＮＡあるいはＲＮＡ、ＦＡＭ−Ｎ４０あるいはＦＡＭ−ｒＮ４０、表１参照）、アクセプター（ＤＮＡあるいはＲＮＡ、Ｎ２０あるいはｒＮ２０、表１参照）、および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬの反応液を用意し、３７℃で１時間インキュベートした。反応液（１μＬ）を１０μＬのホルムアミドと混合し、７０℃で５分間インキュベートし、１０％　Ｎｏｖｅｘ　ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルにロードした。電気泳動後、染色せずにＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＴｏｕｃｈイメージングシステムでＦＡＭの蛍光シグナルを撮影した（Ｂ）。その後、ＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄで染色し、再びその画像を撮影した（Ｃ）。
［図１１］ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡに対するＳＤＬのライゲーション活性を示す図である。
　Ａ．アッセイデザイン。ｄｓＤＮＡはＰＣＲにより調製した。ＰＣＲ後、半量をそのまま、もう一方にはＫｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔを加えて末端を平滑化した。それ以外の１本鎖のアクセプターＤＮＡは化学合成により準備した。
　Ｂ．反応産物の変性ゲル電気泳動画像。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、３２％　（ｖ／ｖ）　ＰＥＧ６００、５０ｐｍｏｌのドナー（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、表１参照）、８０ｎｇのアクセプターＤＮＡ（１本鎖あるいは２本鎖、Ｎ５０、Ｎ１００、Ｍ１３ＦＲ、ｄｓＤＮＡについては後述）、および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬの反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。反応液を１μＬ取り、１０μＬのホルムアミドと混合し、７０℃で５分間インキュベートしてからそれぞれを１０％　Ｎｏｖｅｘ　ＴＢＥ−Ｕｒｅａ　Ｇｅｌにロードした。電気泳動後、ゲルをＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄ染色で染色し、ゲル画像を撮影した。
　２本鎖のモデルＤＮＡの調製は以下のように実施した。５μＬのＥｘＴａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ、４μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２０ｐｍｏｌのＭ１３ＦおよびＭ１３ＲＶ（表１参照）、１０ｐｇのｐＵＣ１９ベクター、５ＵのＥｘＴａｑを含む５０μＬの反応液を調製し、９５℃で１分間インキュベーションした後、９５℃を１５秒、５５℃を３０秒、７２℃を３０秒の３ステップのインキュベーションを３０サイクル実施し、最後に７２℃で１分間インキュベーションした。Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉを１μＬ加えて３７℃で１５分インキュベーションした後、必要に応じてＫｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　（ＮＥＢ）を１μＬ加えてさらに１５分間インキュベーションした。ついで、ＱｉａＱｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製した。
［図１２］ｓｓＤＮＡから配列決定ライブラリーの調製（ＳＤＬ−ＴＯＰＯスキーム）を示す図である。
　Ａ，Ｂ．ＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ（Ａ）およびＳＤＬ−ＴＯＰＯ（Ｂ）のライブラリー調製スキーム。ＴＡＣＳ−ＴＯＰＯライブラリーにはＲＮＡが含まれているため、バイサルファイト処理を適用することができない。
　Ｃ~Ｈ．ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法で調製されたライブラリーのシーケンスリードの分析結果。Ｎ５０（Ｃ~Ｅ）および血液由来セルフリーＤＮＡ（Ｇ，Ｈ）に対してバイサルファイト処理を行わなかったもの（Ｄ，Ｅ）およびバイサルファイトを施した（Ｇ，Ｈ）ライブラリーの配列決定の結果を示す。バイサルファイト処理の結果、塩基組成に大きな変化が生じていることが分かる。バイサルファイト処理ＤＮＡの相補鎖の配列を分析している。つまり、バイサルファイト処理により塩基Ｇの含量が激減し、その分塩基Ａの含量が増えている。ライブラリー調製の詳細（ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法）は、以下の通りである。
　＜ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法＞
　標的１本鎖ＤＮＡ、２．５μＬの１０×ＳＤＬバッファー、１μＬの１００ｍＭ　ＡＴＰ、２５ｐｍｏｌのアダプター（ネイティブの場合はＰ−ＡＲ−ｔｈｉｏ５−ＮＨ２、バイサルファイト処理を行う場合は２５μＭ　Ｐ−ＡＲ−Ｂｓ−ｔｈｉｏ５−ＮＨ２、表１参照）、７．５μＬのＰＥＧ６００、および３μｇのＳＤＬを含む２５μＬ用意し、３７℃で１時間インキュベートした。９５℃で５分間の加熱を行って酵素を失活させた後、反応液に５μＬの１０×ＥｘＴａｑバッファー、４μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌプライマーオリゴ（ネイティブの場合はＮＨ２−ＡＦ、バイサルファイト処理を行う場合はＮＨ２−ＡＦ−Ｂｓ、表１参照）、および１μＬのＨｏｔ−Ｓｔａｒｔ　Ｇｅｎｅ　Ｔａｑ（ニッポンジーン、富山、日本）を加え、５０μＬの反応液を用意した。これを９５℃で３分間、４５℃で５分間、および６５℃で１５分間連続的にインキュベートした。次に、反応液に４５μＬのＢｕｆｆｅｒ　Ｂ２（Ｑｉａｇｅｎ）と５μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｑｉａｇｅｎ）を加えて、５０℃で１５分間インキュベートした。反応液に１００μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを加えて室温で５分間インキュベートした後、ビーズを２００μＬの５０−ｂｐカットオフ溶液で２回洗浄した。ビーズを７０％（ｖ／ｖ）エタノールですすいだ後、ＤＮＡを４５μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅで溶出した。
　精製したＤＮＡを含む溶液４５μＬに対し５μＬの１０×ＥｘＴａｑバッファーと１μＬの１５０ｎｇ／μＬ　ＶＯＣを加え、２５℃で１５分間インキュベートした。ここではこの後バイサルファイト処理を行うものにはバイサルファイト用ＶＯＣを、そうでないものに対してはネイティブ用ＶＯＣを使用した。このアダプター連結反応の後、反応液に４５μＬのＢｕｆｆｅｒ　Ｂ２（Ｑｉａｇｅｎ）と５μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、５０℃で１５分間インキュベートした。次に、反応液に５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを加え、室温で５分間インキュベートした。ビーズを、２００μＬの５０−ｂｐカットオフ溶液で２回、２００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄した後、ライブラリーを２０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅで溶出した。必要に応じて、溶出したライブラリーに対してバイサルファイト処理を実施した。
　得られたライブラリーに、２５μＬの２×ＫＯＤ　Ｏｎｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）、それぞれ１０ｐｍｏｌのＰｒｉｍｅｒ−３とＩｎｄｅｘ−１（表１）を追加した後、反応物を９５℃で１分間インキュベートし、続いて９５℃で１５秒、５５℃で１５秒、７２℃で３０秒の３段階のインキュベーションを適切なサイクル数実施し、最後に７２℃で３分間のインキュベーションを行った。増幅したライブラリーを２％　Ｅ−Ｇｅｌ　Ｅｘにロードし、増幅状況を確認した。
［図１３］ＳＤＬを用いる全ゲノムバイサルファイトシークエンシングのためのライブラリー調製を示す図である。
　Ａ~Ｃ．ポストバイサルファイトアダプタータギング（ＰＢＡＴ）戦略のライブラリー調製の概略。　オリジナルのＰＢＡＴ法（ＰＢＡＴまたはｒＰＢＡＴ法、Ｍｉｕｒａ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，２０１２（前掲の非特許文献１４）参照）では、アダプター配列を導入するために２回のランダムプライミング（ＲＰ）を行う（Ａ）。ただ、ＲＰは繰り返すほどインサートが短くなる。そこでＰＢＡＴの２番目のバージョンでは、２つのＲＰのうち後者をＴＡＣＳライゲーションで置き換えた（ｔＰＢＡＴ、Ｍｉｕｒａ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．、２０１９（前掲の非特許文献７）参照）（Ｂ）。ＳＤＬによりｔＰＢＡＴのＴＡＣＳライゲーションを置き換えることで新しいプロトコールｓＰＢＡＴが実現できた（Ｃ）。
　Ｄ．ｓＰＢＡＴとｔＰＢＡＴのライブラリー収量の比較。ＩＭＲ−９０細胞およびヒト女性の末梢血に由来するゲノムＤＮＡをモデルとして使用した。３回実験を行い、その平均収量を示した。エラーバーは結果のブレ（標準偏差）を示す。ｓＰＢＡＴプロトコールの詳細は、以下の通りである。
　＜ｓＰＢＡＴプロトコール＞
　バイサルファイト処理後のＤＮＡ（ＢＳ−ＤＮＡ）に対して５μＬの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ　２、４μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ、１μｌの１００μＭ　ＰＥＡ２−Ｎ４を加えて９５℃で３分間、４℃で５分間インキュベーションした。ランダムプライミングは、１μＬの５ｍｇ／ｍｌ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメントｅｘｏ（−）を添加することで開始した。反応液を４℃で１５分間インキュベートした後、＋１℃／ｍｉｎの速度で３７℃まで昇温させ、さらに３７℃で３０分間のインキュベーションを行った。７０℃で１０分間インキュベートすることにより反応を停止させた。次いで５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを加えて室温で５分間インキュベートした。ビーズを２００μＬの３００ｂｐカットオフ溶液で２回、２００μＬの７０％　エタノールで１回洗浄した後、精製したＤＮＡを１０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。
　精製したＤＮＡ　１０μＬに対して２．５μＬの１０×ＳＤＬ、１μＬの１００ｍＭ　ＡＴＰ、２５ｐｍｏｌのアダプター（Ｐ−ＰＥＡ１−ｔｈｉｏ５−ＮＨ２）、７．５μＬのＰＥＧ６００を加え、９５℃で５分間インキュベートし、次いで、反応液を３７℃で５分間平衡化した。次いで５μｇのＳＤＬを反応液に加え、３７℃で１時間のインキュベーションを行った。９５℃で５分間加熱することで反応を停止した後、反応液に２５μＬの水と５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを加えて室温で５分間インキュベートした。ビーズを７０％エタノールで洗浄した後、ライブラリーを２５μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。
　この精製ＤＮＡに対して２５μＬの２×ＫＯＤ　Ｏｎｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）、それぞれ１０ｐｍｏｌのＰｒｉｍｅｒ−３とＩｎｄｅｘ−１（表１）を加えて５０μＬの反応液を調製した。次に、反応液を９５℃で１分間インキュベーションした後、９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間の３段階のインキュベーションを２サイクル実施し、最後に７２℃のインキュベーションを１分間加えた。反応液に５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを添加して、室温で５分間インキュベートした後、ビーズを２００μＬの４００ｂｐカットオフ溶液で２回、２００μＬの７０％　エタノールで１回洗浄し、最終的に精製されたライブラリーを２０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。ライブラリーのモル濃度は、Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．のＬｉｂｒａｒｙ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用して決定した。
　Ｅ．ＩＭＲ−９０ライブラリーのメチロームデータの基本統計。配列決定は、ＩＭＲ−９０から調製したライブラリーに対してのみ実施した。
　Ｆ．ＩＭＲ−９０のライブラリーで算出されたＤＮＡメチル化レベルをゲノム全体で比較したプロット。１０００ｂｐ−ｂｉｎのＣｐＧ部位の平均メチル化レベルをｓＰＢＡＴとｔＰＢＡＴの間で比較した。この計算には、少なくとも５回のリードでカバーされたＣｐＧサイトのみを使用した。
　Ｇ，Ｈ．ＩＭＲ−９０ライブラリーのＧＣコンテンツ依存的なカバレッジバイアスの比較を行った。ｔＰＢＡＴ（Ｇ）およびｓＰＢＡＴ（Ｈ）のライブラリーについて示している。このグラフの横軸は１０００ｂｐビンのＧＣ率を、縦軸はカバレッジの頻度（オレンジ色のボックスのボックスプロット、スケールは左側）とビンのゲノム分布（緑色のバー、スケールは右側）を示す。
［図１４］ＳＤＬは、ｃＤＮＡの分析に有効であることを示す図である。
　Ａ．トータルＲＮＡから両端に増幅用のアダプター配列が連結されたｃＤＮＡライブラリーを調製する手順。
　Ｂ．ブラウザー　ショットは、リファレンスゲノム上にマップされたリードの分布を示す。Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）を使用した。ライブラリー調製のプロトコールの詳細は、以下の通りである。
　＜ライブラリー調製のプロトコール：出芽酵母ｃＤＮＡのロングリードシーケンシング＞
　（ｉ）トータルＲＮＡ抽出
　トータルＲＮＡは、以前に報告した方法で抽出した（Ｍｉｕｒａ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，２００８（前掲の非特許文献１５）参照）。ＹＰＤ培地で培養された増殖期の出芽酵母株Ｓ２８８Ｃから抽出した。
　（ｉｉ）ｃＤＮＡ合成
　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）による逆転写反応にｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉによる余分なプライマーの酵素的除去を組み合わせて実施した。３μｇのトータルＲＮＡに対して、５０ｐｍｏｌのＰＥＡ１−ｄＴ２０Ｖ（表１）を加えて水で１０μＬとし、７０℃で５分間加熱した。ついで氷上で５分間冷却した後、４μＬの５×ＳＳＩＶ緩衝液、４μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１μＬの１００ｍＭ　ＤＴＴ、および１μＬのｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｉ（ＮＥＢ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。この反応液に１μＬの２００Ｕ／μＬ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶを追加し、４２℃で１５分、５０℃で４５分、８０℃で１０分間のインキュベーションを行った。この反応液に１μＬの５０Ｕ／μＬ　ＲＮａｓｅ　Ｉｆ（ＮＥＢ）を添加し、３７℃で３０分間、８０℃で１０分間インキュベーションした。さらに３０μＬの水と５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを加えて室温で５分間インキュベートした後、ビーズを２００μＬの３００−ｂｐカットオフ溶液で２回、２００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄し、精製されたｃＤＮＡを１０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。
　（ｉｉｉ）ＳＤＬによる２回目のアダプター連結
　１０μＬの精製ｃＤＮＡ溶液に対して２．５μＬの１０×ＳＤＬバッファー、１μＬの１００ｍＭ　ＡＴＰ、２５ｐｍｏｌのＰ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、１０μＬのＰＥＧ６００、３μｇのＳＤＬを含む２５μＬの反応液を準備した。そして反応液を３７℃で１時間、８０℃で１０分間インキュベーションした。次に、反応液に５μＬの１０×ＥｘＴａｑ　バッファー、４μＬの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのＰＥＡ２、および１μＬの５Ｕ／μＬ　ＥｘＴａｑ　ＨＳを加えて、９５℃で３分、５５℃で５分、７２℃で３０分インキュベーションを行った。４５μＬのバッファーＢ２と５μＬのプロテイナーゼＫを加え、５０℃で１５分間インキュベーションした後、５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎを加え、室温で５分間インキュベーションし、さらにビーズを２００μＬの３００−ｂｐカットオフ溶液で２回、２００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄した。最終的にライブラリーは２５μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。
　（ｉｖ）ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
　２５μＬで溶出したアダプター連結済みのｃＤＮＡに対し、２５μＬの２×ＫＯＤ　Ｏｎｅと、それぞれ１０ｐｍｏｌのＰｒｉｍｅｒ−３とＩｎｄｅｘ−１を加えた。９５℃で１分間のインキュベーションの後、９５℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分間の３ステップのインキュベーションを１２サイクル実施した。７２℃で３分間の最終インキュベーションの後、反応液を５０μＬのＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　ｃｌｅａｎと混合し、室温で５分間インキュベートした。ビーズ２００μＬの３００−ｂｐカットオフ溶液で２回、２００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールで１回洗浄した後、増幅されたｃＤＮＡを２０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。この増幅後のｃＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＢＲキットで決定した。
　（ｖ）ナノポアシーケンシング
　シーケンシングは、増幅された８００ｎｇのｃＤＮＡを用いて行った。Ｆｌｏｎｇｌｅ　Ｆｌｏｗ　Ｃｅｌｌ　（ＦＬＯ−ＦＬＧ００１，オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）をＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　（ＳＱＫ−ＬＳＫ１１０，オックスフォードナノポアテクノロジーズ社）と組み合わせ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｍｐｌｉｃｏｎｓのプロトコールに従って実施した。ｆａｓｔｑ形式で出力したリードをＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて出芽酵母参照ゲノムｓａｃＣｅｒ３にマッピングした後、そのアライメントをＢＥＤ形式でエクスポートしてＩＧＶによる視覚化を行った。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる、特願２０２３−０８８９６７号明細書（令和５年（２０２３年）５月３０日出願）の全体を包含する。
　本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

１．本発明の概要
　強力な一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する酵素が存在すれば分子生物学における様々なアプリケーション開発に役立つと考えられる。しかし、これまで知られている酵素では限られた活性しか得られなかった。本発明者は、既知酵素の中では最も高い一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する「ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼ」（前掲の非特許文献９参照）に対して相同なアミノ酸配列群をデータベースから検索し、その中から優れた一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するものを同定した。とりわけ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｐｈａｇｅ　ｐｈｉＬｏに由来するリガーゼ（Ｔｐｈ　ｓｓＤＮＡリガーゼ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹＪ７３９７０）は、ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼよりも明らかに高い一本鎖ＤＮＡ連結活性を示した。このＴｐｈ　ｓｓＤＮＡリガーゼなど、本発明者により見出された一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する酵素タンパク質は、配列決定のためのライブラリー調製をはじめ様々なアプリケーション開発に役立つものである。なお、本発明及び本明細書など本願の全体においては、上記酵素（Ｔｐｈ　ｓｓＤＮＡリガーゼ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹＪ７３９７０）を、「ＳＤＬ」と称する。

２．一本鎖ＤＮＡ連結用組成物等
　本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物は、１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる組成物であり、下記（ａ）及び／又は（ｂ）のタンパク質（一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する酵素としての機能を有するタンパク質；以下、「本発明に係るタンパク質」ともいう）を含むものである。

　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質。
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質。

　配列番号２に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）アクセッション番号：ＡＹＪ３７９７０に登録されている。配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、当該アミノ酸配列に基づいて合成された各種塩基配列が挙げられ、例えば、配列番号１に示す塩基配列が好ましく挙げられる。

　配列番号４に示すアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＷＰ＿１１９３６０９０２に登録されている。配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、当該アミノ酸配列に基づいて合成された各種塩基配列が挙げられ、例えば、配列番号３に示す塩基配列が好ましく挙げられる。
　当該配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する酵素としての機能を有するタンパク質として、本発明者により初めて同定されたものである。

　本発明に係るタンパク質は、当該配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質には限定されず、当該配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質も包含される。
　本発明に係るタンパク質としては、例えば、配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質（いわゆる変異型のタンパク質）も、好ましく挙げられる。

　ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個~１０個程度、好ましくは１~数個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、又は１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であることが好ましい。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ^ＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　ｋｉｔ、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されているかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。

　また、本発明に係るタンパク質としては、例えば、配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を含み、かつ一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質（いわゆる変異型のタンパク質）も、好ましく挙げられる。
　ここで、上記同一性は、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることがより好ましい。

　本発明においては、「一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する」とは、ドナーＤＮＡ及びアクセプターＤＮＡがいずれも一本鎖ＤＮＡであるものを互いに直接連結させる活性（ライゲーション活性）を少なくとも有することを意味する。ここでいう、互いに直接連結させる活性とは、例えば、ドナーＤＮＡ及びアクセプターＤＮＡのいずれかの末端（他方と結合する末端）にリボテイル（いくつかのアデニル酸等のＲＮＡ構成塩基）が付加されたような一本鎖ＤＮＡどうしを連結させる活性は除く意味であるが、本発明に係るタンパク質は、このような活性も併せて有するものであってもよく、限定はされない。本発明に係るタンパク質が、当該「一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する」ことの確認は、例えば、後述の実施例で述べるようなｓＰＢＡＴ法により確認することができる。

　本発明に係るタンパク質は、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされない。
　天然物由来のタンパク質は、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該タンパク質（前述した変異型のタンパク質も含む）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に作製することもでき、例えば、当該コードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴ^ＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−Ｍａｔｅ^ＴＭ（東洋紡）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により本発明に係るタンパク質を産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。

　また、化学合成タンパク質は、公知のタンパク質合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のタンパク質合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてタンパク質を精製することができる。

　本発明においては、前述した本発明に係るタンパク質とともに、又はそれに代えて、当該タンパク質の誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、当該タンパク質に由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。

　また本発明においては、前述した本発明に係るタンパク質、及び／又は、当該タンパク質の誘導体とともに、あるいはそれに代えて、当該タンパク質及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。

　当該塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコールを用いて処理することにより調製することができる。

　本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物により連結される、アクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、ドナーとしての一本鎖ＤＮＡとしては、例えば、アクセプターＤＮＡの塩基長は１２塩基以上（又は、１４塩基以上、１６塩基以上、１８塩基以上、２０塩基以上、２２塩基以上、２４塩基以上、２６塩基以上、２８塩基以上、３０塩基以上、３２塩基以上、３４塩基以上、３６塩基以上、３８塩基以上、若しくは４０塩基以上であってもよい）が好ましく、ドナーＤＮＡの塩基長は１０塩基以上（又は、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、若しくは２０塩基以上であってもよい）が好ましい。アクセプターＤＮＡ及びドナーＤＮＡの塩基長が上記範囲であることにより、安定した一本鎖ＤＮＡ連結活性を実現し得る。

　本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物は、限定はされないが、さらにＰＥＧを含むものであることが好ましい。ＰＥＧの種類は、限定されず、例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、及びＰＥＧ６０００から選択される１種又は２種以上を用いることができる。ＰＥＧ４００及びＰＥＧ６００の場合は、当該組成物に対して例えば３０~６０重量％（又は、３０~５０重量％や、３０~４０重量％であってもよい）で用いることが好ましく、ＰＥＧ１５４０及びＰＥＧ２０００の場合は、当該組成物に対して例えば２０重量％以上（又は、２５重量％以上や、３０重量％以上であってもよい）で用いることが好ましく、ＰＥＧ４０００及びＰＥＧ６０００の場合は、当該組成物に対して例えば１５重量％以上（又は、２０重量％以上や、２５重量％以上であってもよい）で用いることが好ましい。

　本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物を用いて、アクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、ドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結反応させる際の反応温度は、限定はされないが、例えば、２０~４９℃（又は、３０~４５℃、３５~４５℃、３７~４２℃であってもよい）であることが好ましく、より好ましくは３７℃である。

　また、当該連結反応時の反応溶液のｐＨは、限定はされないが、例えば、ｐＨ７．５~９．５（又は、ｐＨ８．０~９．５や、ｐＨ７．５~９．０であってもよい）であることが好ましい。
　さらに、当該反応溶液中に含まれ得る他の成分としては、限定はされないが、例えば、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ＡＴＰなどが挙げられる。ＭｇＣｌ_２は、反応溶液中に必須であることが望ましく、例えば、１．０~２０．０ｍＭの濃度（又は、２．５~２０ｍＭや、５~２０ｍＭであってもよい）であることが好ましい。硫酸アンモニウムは、例えば、２０ｍＭ未満（又は、１６ｍＭ未満や、１２ｍＭ未満であってもよい）であることが好ましく、塩化ナトリウム及び塩化カリウムは、合計で５０ｍＭ以下であることが好ましい。なお、当該他の成分については、当該連結反応時の反応溶液中に含まれるものであってもよいし、本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物の構成成分として予め包含されているものであってもよく、限定はされない。

　本発明おいては、前述した本発明に係るタンパク質（ひいては本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物）を、１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡ、及び１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡに接触させ、該アクセプターＤＮＡと該ドナーＤＮＡとを連結させることを含む、連結された一本鎖ＤＮＡの製造方法、又は一本鎖ＤＮＡ連結方法も提供され得る。これら方法を実施する際の各種条件については、前述の本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物に関する詳細な説明を適宜適用することができる。

　本発明においては、前述した一本鎖ＤＮＡ連結用組成物に係る発明と同様に、１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる、一本鎖ＤＮＡ連結剤や一本鎖ＤＮＡ連結用キットに係る発明も包含される。当該連結剤やキットにおける含有成分や構成成分の詳細については、前述した一本鎖ＤＮＡ連結用組成物における各種説明が適宜適用され得る。

　また、本発明においては、前述の、連結された一本鎖ＤＮＡの製造方法、又は一本鎖ＤＮＡ連結方法において使用するための本発明に係るタンパク質や、当該方法における本発明に係るタンパク質の使用、などに係る発明も、包含される。

　さらに、本発明においては、本発明に係るタンパク質を用いる、一本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法に係る発明、及び、当該調製方法により得られる二本鎖ＤＮＡライブラリーに係る発明も包含される。

　前記二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法の一態様（調製方法Ｉ）としては、例えば、
　一本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法であって、
　（Ａ）標的一本鎖ＤＮＡフラグメントに対して、５’末端がリン酸化されている一本鎖アダプター配列をライゲーションするステップ；
　（Ｂ）ライゲーション後の配列のアダプターを起点にＤＮＡ複製を行って二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
　（Ｃ）二本鎖ＤＮＡのアダプター配列が付加されていない末端に、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列をライゲーションするステップ；
　（Ｄ）ライゲーション後の二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップ
を含み、
　前記（Ａ）のステップにおけるライゲーションが、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を用いたライゲーション法により行われる、
前記調製方法が、挙げられる。

　また、より詳細な、前記二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法の一態様（調製方法ＩＩ）としては、例えば、
　一本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法であって、
　（ｉ）両末端が脱リン酸化されている一本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端に、５’末端がリン酸化されている一本鎖アダプター配列Ａ１をライゲーションし、アダプター付加一本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
　（ｉｉ）前記アダプター付加一本鎖ＤＮＡに含まれるアダプター配列Ａ１部分に、一本鎖アダプター配列Ａ２をアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼにより前記アダプター配列Ａ２の３’末端を伸長させて、アダプター付加二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
　（ｉｉｉ）一方の５’末端のみがリン酸化され、当該５’末端に相補的な３’末端を含む領域にトポイソメラーゼの認識配列を有する、二本鎖アダプター配列Ｂ１に、トポイソメラーゼを反応させて、前記認識配列の３’末端にトポイソメラーゼをコンジュゲートさせた、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２を生成するステップ；
　（ｉｖ）前記アダプター付加二本鎖ＤＮＡのアダプター配列が付加されていない末端に、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２をライゲーションして、両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；及び
　（ｖ）前記両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップ
を含み、
　前記（ｉ）のステップにおけるライゲーション及び生成が、
　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
を用いたライゲーション法により行われる、
前記調製方法が挙げられる。

　ここで、上記の二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法の各態様（調製方法Ｉ、ＩＩ）における、前記（ａ）及び／又は（ｂ）のタンパク質、並びに当該タンパク質を用いたライゲーション法の詳細については、前述した本発明に係るタンパク質に関する説明、並びに、前述した、連結された一本鎖ＤＮＡの製造方法に関する説明、及び一本鎖ＤＮＡ連結方法に関する説明を、適宜適用することができる。また、上記の各態様（調製方法Ｉ、ＩＩ）いずれにおいても、上述された各ステップを含むことのみには限定はされず、任意の他のステップを含んでいてもよい。

　以下、上記の二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法の各態様（調製方法Ｉ、ＩＩ）のうち、調製方法ＩＩに係る態様について、より詳しく説明する。なお、調製方法Ｉに係る態様の詳細については、調製方法ＩＩに係る態様の詳細を適宜参照して理解することができる。

・ステップ（ｉ）について
　ライブラリー調製における所謂インサートＤＮＡとなる「一本鎖ＤＮＡフラグメント」は、両末端（５’末端及び３’末端）が脱リン酸化されたものを用いる。次に、当該一本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端に、５’末端がリン酸化されている一本鎖ＤＮＡである「一本鎖アダプター配列Ａ１」をライゲーションする。当該ライゲーションは、前述したとおり、本発明に係るタンパク質を用いたライゲーション法により行う。当該ライゲーションを経て「アダプター付加一本鎖ＤＮＡ」が生成される。ステップ（ｉ）のアダプター付加一本鎖ＤＮＡの生成の経緯の詳細（各種反応の条件等を含む）については、適宜選択でき、特に限定はされない。

・ステップ（ｉｉ）について
　ステップ（ｉ）で生成されたアダプター付加一本鎖ＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡにするステップである。詳しくは、生成されたアダプター付加一本鎖ＤＮＡ中のアダプター配列Ａ１部分に、一本鎖ＤＮＡである「一本鎖アダプター配列Ａ２」をアニーリングさせる。一本鎖アダプター配列Ａ２（特にその３’末端側の部分）は、アダプター配列Ａ１部分の塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有するものであることが好ましい。当該アニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼにより、前記アダプター配列Ａ２の３’末端を伸長させる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定はされないが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ等が好ましい。このようにして、二本鎖ＤＮＡとなった「アダプター付加二本鎖ＤＮＡ」が生成される。ステップ（ｉｉ）のアダプター付加二本鎖ＤＮＡの生成の経緯の詳細（各種反応の条件等を含む）については、前掲の非特許文献１（ＢＭＣ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０２１）に開示されている、「ＴＡＣＳ−Ｔ４」ライブラリー調製法の一部のステップを適宜参照することができる。

・ステップ（ｉｉｉ）について
　いわゆるセカンドライゲーション（具体的には次のステップ（ｉｖ））に用いる二本鎖ＤＮＡのアダプター配列である「二本鎖アダプター配列Ｂ１」を調製するステップである。まず、二本鎖アダプター配列Ｂ１は、片方の一本鎖ＤＮＡの５’末端はリン酸化されているが、もう片方の一本鎖ＤＮＡの５’末端はリン酸化されておらず、さらに、そのリン酸化されている方の５’末端に相補的な３’末端を含む領域にトポイソメラーゼの認識配列を有する。当該トポイソメラーゼは、トポイソメラーゼＩであることが好ましく、ワクシニアウイルス由来のトポイソメラーゼＩ（ＶＴｏｐｏＩ）であることがより好ましい。また当該ＶＴｏｐｏＩの認識配列は、限定はされないが、５’−ＣＣＴＴＴ−３’、又は５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−３’が挙げられる。ＶＴｏｐｏＩは、これらの５塩基からなる配列を特異的に認識し、その３’−Ｔのリン酸基と共有結合を形成する。そして当該形成とともに、上記認識配列の３’−Ｔよりも３’側にある塩基配列は切断される。二本鎖アダプター配列Ｂ１のリン酸化されている方の５’末端を含む領域には、ニック（塩基配列の切れ目）を有していることが好ましく、当該ニックは、限定はされないが、例えば、ＶＴｏｐｏＩの認識配列に相補的な配列の５’側の塩基に存在することが好ましく、当該相補的な配列の１塩基５’側の塩基に存在することがより好ましい。当該ニックがあることで、前記認識配列の３’−Ｔよりも３’側にある塩基配列が切断される際に、その切断配列に相補的な配列を含む配列も、あわせて、二本鎖アダプター配列Ｂ１から切断される。このようにして、「トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２」が生成される。二本鎖アダプター配列Ｂ１中に前記ニックを有していた場合、当該ニック又は当該ニックに対応する欠失部分は、二本鎖アダプター配列Ｂ２において残存していることが好ましい。

・ステップ（ｉｖ）について
　ステップ（ｉｉ）で生成されたアダプター付加二本鎖ＤＮＡの、アダプター配列が付加されていない方の末端に、ステップ（ｉｉｉ）で生成されたトポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２をライゲーションする。トポイソメラーゼ（ＶＴｏｐｏＩ）は、自身が共有結合している３’−Ｔのリン酸基（つまりリン酸化された３’末端）と、アダプター付加二本鎖ＤＮＡの脱リン酸化されている５’末端（つまり当該５’末端の水酸基）とをライゲーションさせる活性を有する。これにより、「両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡ」が生成される。他方、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２は、前述の一本鎖アダプター配列Ａ１と一本鎖アダプター配列Ａ２とがアニーリングした（つまり遊離の配列Ａ１と配列Ａ２がアニーリングした）二本鎖の未反応アダプター（両鎖とも５’末端はリン酸化されている）とは、原理的にはライゲーションしない。そのため、当該未反応アダプターと、アダプター配列Ｂ２とのダイマー形成が、効果的に抑制される。偶発的に、当該ダイマーが形成されることがあったとしても、例えば、二本鎖アダプター配列Ｂ１が前記ステップ（ｉｉｉ）で述べたようにニックを有し（なお、二本鎖アダプター配列Ｂ２においても当該ニック又は当該ニックに対応する欠失部分は残存している）、かつ、前記一本鎖アダプター配列Ａ１が当該配列中にウラシルを有するようにしている場合、「両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡ」の生成後の反応系にＤＮＡエンドヌクレアーゼを添加することにより、前記ダイマーが分解され、前記ダイマーが形成されていないのと同様の状態にすることもできる。当該ＤＮＡエンドヌクレアーゼとしては、ウラシルにおけるＮ−グリコシド結合を加水分解したり、ウラシルの５’側のＤＮＡ主鎖にニックを入れる活性を有するものが挙げられ、例えば、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）、ＡＰＥ１（ヒト由来アプリン／アピリミジン（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ：ＡＰ）エンドヌクレアーゼ）、及びＥｎｄｏＱ（エンドヌクレアーゼＱ）等が好ましい。ＤＮＡエンドヌクレアーゼによるウラシル除去やウラシル近傍でのニックと、二本鎖アダプター配列Ｂ２中に有するニック（より詳しくは、二本鎖アダプター配列Ｂ２との連結部位に有するニック）とにより、形成されたアダプターダイマーが分解（分裂）され、結果として反応系から除去され得る。また、前記一本鎖アダプター配列Ａ１中のウラシルに代えて、スペーサー修飾オリゴＤＮＡとしての「ｄＳｐａｃｅｒ」を導入することもできる。ここで、スペーサー修飾オリゴＤＮＡとは塩基を持たない構造体で、ＤＮＡ鎖のホスホジエステル結合骨格中に導入することができ、塩基のみを欠いたタイプや、塩基とデオキシリボース環の両方を欠いたタイプがあり、そのスペーサーアーム数は様々選択することができる。ｄＳｐａｃｅｒは塩基部を欠いたものであり、挿入された配列部分の二本鎖の安定性を和らげることができ、組み込まれる部位や構造により、二本鎖の安定性をコントロールすることもできる。上記のようにｄＳｐａｃｅｒを導入した場合、アダプターダイマーが生じにくくなる効果があるとともに、酵素的に分解することでアダプターダイマーを容易に除去することもできる。なお、当該ｄＳｐａｃｅｒに代えて又は併用により、「エチニルｄＳｐａｃｅｒ」（通常のオリゴＤＮＡ鎖において塩基が結合している糖の１’位にアルキン構造が結合しているもの）を採用することもできる。

・ステップ（ｖ）について
　生成された両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行うことにより、当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップである。ＰＣＲの反応条件や、得られたＰＣＲ産物（ライブラリー）の精製条件等については、適宜設定することができるが、前掲の非特許文献１（ＢＭＣ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０２１）に開示されている、「ＴＡＣＳ−Ｔ４」ライブラリー調製法の一部のステップを適宜参照することができる。

　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜材料及び方法の説明＞
（１）人工遺伝子合成、タンパク質発現、およびその精製
　ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）アクセッション番号：ＡＹＪ３７９７０、ＷＰ＿１１９３６０９０２、ＲＴＴ０２５２５、ＷＰ＿０８１８９２７３５、ＷＰ＿１１０５３２３０８、およびＷＰ＿１２６２０６４８４に登録されている各タンパク質をコードする遺伝子は、それぞれ、Ｔｗｉｓｔ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）によって、大腸菌Ｋ−１２株のコドン使用頻度に最適化された上で合成された（配列番号１（ＡＹＪ３７９７０）、配列番号３（ＷＰ＿１１９３６０９０２）、配列番号５（ＲＴＴ０２５２５）、配列番号６（ＷＰ＿０８１８９２７３５）、配列番号７（ＷＰ＿１１０５３２３０８）、配列番号８（ＷＰ＿１２６２０６４８４））。これらの遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ａ−ＳｔｒｅｐＳＬ（配列番号９）にサブクローニングし、挿入配列をサンガーシーケンスで確認した上で発現誘導に使用した。

　上記発現ベクターの大腸菌形質転換体の培養、タンパク質発現の誘導、および組換えタンパク質の精製は、ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼの精製に関する以前の研究で用いられた方法を踏襲した（前掲の非特許文献１参照）。すなわち、Ｈｉｓ６タグおよびＳｔｒｅｐタグの２つのタグを用いたデュアルアフィニティストラテジーを用いて高度に精製されたタンパク質を得た（前掲の非特許文献１参照）。

（２）一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する酵素のスクリーニング
　２ｐｍｏｌのアクセプターＤＮＡ（Ｎ１００、下記表１参照）、２５ｐｍｏｌのドナーＤＮＡ（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、下記表１参照）、４００μＭ　ＡＴＰ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００、および２μｇのＲＮＡリガーゼを含む２５μＬの反応液を用意し、３７℃、４５℃、５５℃、６５℃でそれぞれ３０分間ずつ連続してインキュベートした後、９５℃で５分間加熱して酵素を失活させた。ついで、２５μＬの水、４５μＬのバッファーＢ２（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、および５μＬのプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、さらに５０℃で１５分間インキュベートした。反応液に対してイソプロパノールを１００μＬとＳｅｒａ−Ｍａｇ　Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｂｅａｄｓ（Ｃｙｔｉｖａ、マールボロ、マサチューセッツ州）２μＬとを加え、混合し５分間静置した後、磁気ビーズを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、精製したＤＮＡを１０μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０で溶出した。このＤＮＡを１０％変性アクリルアミドゲルで展開し、ＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄ染色の後、写真を撮影した。

（３）一本鎖ＤＮＡからのシーケンスライブラリーの調製
　シーケンスライブラリーの調製の詳細は以下の通りである。
　ヒト血清はコージンバイオ株式会社（埼玉県、日本）から入手した。５μＬの血清からのセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の精製は、前述したＰＰＡＰ法（前掲の非特許文献１参照）を使用した。精製ｃｆＤＮＡ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、４００μＭ　ＡＴＰ、アダプター（Ｐ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ２−ｔｈｉｏ５−Ｐ、前記表１参照）２５ｐｍｏｌ、４０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ６００、酵素タンパク質（一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する酵素としてスクリーニングされたもの）３μｇを含む２５μＬの反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。９５℃で５分間加熱して酵素を殺菌した後、反応を５μＬの１０×ＥｘＴａｑバッファー、４μＬの２．５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌのプライマーオリゴ（ＰＥＡ２、前記表１参照）、および１μＬのＨｏｔ−Ｓｔａｒｔ　ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン、富山、日本）で補足した。反応は９５℃で３分間、４５℃で５分間、６５℃で１５分間、連続的にインキュベートした。反応のために、前述のように調製した５００ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＮａＯＨ、ｐＨ８．０の５μＬ、および１ｍｇ／ｍｌのＶＴｏｐｏＩ−オリゴヌクレオチド複合体（ＶＯＣ）１μＬを補充し、２５℃で１５分間インキュベートした。

　その後、ＡｘｙＰｒｅｐ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を５０μＬ、常温で５分間インキュベートした。ビーズを、３２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ４００、１Ｍ　ＮａＣｌ、および５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む２００μＬ溶液で２回洗浄した。ビーズを７０％（ｖ／ｖ）エタノールでリンスした後、ライブラリーを２５μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅで溶出した。精製ライブラリーに、１０×ＥｘＴａｑバッファー５μＬ、２．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ−３およびＩｎｄｅｘ−１（前記表１参照）各１０ｐｍｏｌ、ＥｘＴａｑ　ＨＳ　１μＬを添加した。その後、７２℃で５分間、９５℃で１分間インキュベートした後、９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間の３段階インキュベーションを１２サイクル行い、７２℃で１分間の最終インキュベーションを行った。増幅したライブラリーを２％　Ｅ−Ｇｅｌ　Ｅｘに負荷し、ゲルイメージを撮影した。
　なお、前記のＶＴｏｐｏＩ−オリゴヌクレオチド複合体（ＶＯＣ）の形成の詳細は以下の通りである。

　＜ワクシニアウイルストポイソメラーゼＩ（ＶＴｏｐｏＩ）−オリゴヌクレオチド複合体（ＶＯＣ）の形成＞
　ＶＴｏｐｏＩおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４　ＰＮＫ）は、以前の報告に記載した方法で精製した（前掲の非特許文献１６：Ｍｉｕｒａ　Ｆ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　１３，　１３９１３，　２０２３）。ＶＴｏｐｏＩで活性化するアダプターのためのＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド；オリゴＤＮＡ）は、表１に詳細がある。ＯＤＮには２種類の組み合わせを用いた。１組目はＰＥＡ１−３Ｃ２Ｔ−Ｅｘｔ、１Ａ３Ｇ１Ａ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ１、およびＡｎｔｉ−Ｅｘｔ−１の非バイサルファイト処理用（ネイティブ用）のセットで、２組目はＰＥＡ１−１Ｔ−３Ｃ２Ｔ−Ｅｘｔ−ｍｅｔ、１Ａ３Ｇ１Ａ−ａｎｔｉ−ＰＥＡ１、およびＡｎｔｉ−Ｅｘｔ−１のバイサルファイト処理に対応したセットを用いた。

　１０μＭのネイティブあるいはバイサルファイト用ＯＤＮセットと１×Ｏｌｉｇｏ　Ｈｙｂ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１６０ｍＭ　ＮａＣｌ）を含む１ｍｌの溶液を調製し、９５℃で５分間、５５℃で１０分間のインキュベーションを行い、その後３０℃で保持した。次に、１ｍＬの５×ＴＯＰＯ活性化バッファー、５００μＬの１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ、１００μＬの１００ｍＭ　ＡＴＰと１００μＬの１ｍｇ／ｍｌのＴ４　ＰＮＫを追加し、水で容量を５ｍＬに調整した。３０℃で１０分間反応液を平衡化した後、５０ｎｍｏｌのＶＴｏｐｏＩを添加し、さらに３０℃で１時間インキュベートした。生成されたＶＯＣは、ヘパリンアフィニティー精製カラムを用いて以下のように精製した。

　すべてのクロマトグラフィー精製は、５ｍＬのルアーロックシリンジ（テルモ、東京、日本）とシリンジポンプ（ＹＳＰ１０１、ＹＭＣ、京都、日本）を組み合わせてマニュアル操作により実施した。最初に、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を５ｍＬのＢｕｆｆｅｒ　３００で平衡化した。次に、ＶＴｏｐｏＩの反応物をカラムにロードし、さらにカラムを５ｍＬのＢｕｆｆｅｒ　３００で洗浄した。最後に５ｍＬのＢｕｆｆｅｒ　４００によってＶＯＣを溶出した。この際の流速は常に２ｍＬ／ｍｉｎを維持した。その後、この溶出液をＡｍｉｃｏｎ−４　３０ｋＤａデバイスに移し、Ｂｕｆｆｅｒ　１０００を用いてバッファー交換とＤＮＡの濃度調整を行った。ＶＯＣの最終濃度は、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＢＲキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定し、１５０ｎｇ／μＬに調整した。

＜本実施例の具体的内容＞
　標的一本鎖ＤＮＡの３′末端にいくつかのアデニル酸（すなわちリボテイル）の付加をすることなく、より強力な一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する新しい酵素を特定することを目的に、ＲＮＡリガーゼのスクリーニングを行った。まず、ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼをシードとして、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のアミノ酸配列データベースを検索し、多くの相同タンパク質を同定した。これらの中には、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（前掲の非特許文献１０及び１１参照）、ＲＭ３７８　ＲＮＡリガーゼ（前掲の非特許文献１２参照）、およびＭｔｈ　ＲＮＡリガーゼ（前掲の非特許文献１３参照）などが含まれていた（図１Ａ）。これらのアミノ酸配列を用いて描画した系統樹では、一本鎖ＤＮＡ連結活性が知られている既知タンパク質はＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼからは相対的にかけ離れていることが明らかになった。その一方で８種のタンパク質（具体的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹＪ７３９７０、ＷＰ＿１１９３６０９０２、ＷＰ＿１１０５３２３０８、ＷＰ＿１２６２０６４８４、ＷＰ＿１７２９５９１５６、ＷＰ＿０３８０６９７９２、ＷＰ＿０８１８９２７３５、およびＲＴＩ０２５２５に登録されている８種のタンパク質）が、ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼに対してより高い相同性を示していた（図１Ａ）。これらの８種のタンパク質は、さまざまな目的のゲノム配列決定プロジェクトで同定されたものであり、一本鎖ＤＮＡ連結活性は当然調べられていない。そこで、本発明者は、これらのタンパク質の一本鎖ＤＮＡ連結活性を調べた。ただし、８種のタンパク質のうち、２つのペア（具体的には、ＷＰ＿１７２９５９１５６とＲＴＩ０２５２５のペアと、ＷＰ＿０８１８９２７３５とＷＰ＿０３８０６９７９２のペア）は互いにほぼ同一のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端の伸長部分のみ構造が異なっていたため（図２）、当該２つのペアに係る４種のタンパク質についてはＮ末端に伸張のある２種のみ（ＲＴＩ０２５２５、ＷＰ＿０８１８９２７３５）を調べた。

　まず、これらの酵素タンパク質をコードする遺伝子を人工的に合成したものを、発現ベクターにクローニングし、コードされたタンパク質を精製した（図３）。次に、これらのタンパク質におけるＴＡＣＳライゲーション（リボテイルあり）および一本鎖ＤＮＡ連結活性（リボテイルなし）の両方について確認した（図１Ｂ）。その結果、６種のタンパク質のうち３種が強いＴＡＣＳライゲーション活性を示すことが判明した（図１Ｃ）。このうち２種（ＡＹＪ７３９７０、及びＷＰ＿１１９３６０９０２）は、ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼよりも強い一本鎖ＤＮＡ連結活性を示した（図１Ｃ）。特に、ＡＹＪ７３９７０は、より優れた一本鎖ＤＮＡ連結活性を有していたため（図１Ｃ）、ＡＹＪ７３９７０についてさらに調べた。なお、ＷＰ＿１１９３６０９０２の酵素タンパク質についても、以下に示すＡＹＪ７３９７０の酵素タンパク質に係る各種結果及び効果と、同程度またはそれに近い結果及び効果を示し得るものであり、有用と考えられる。

　ＡＹＪ７３９７０は、２０~４９℃で一本鎖ＤＮＡ連結活性があり、３７℃が最適温度であった（図４）。その一本鎖ＤＮＡ連結活性には、さまざまな分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共存が必要不可欠であった（図５）。反応溶液のｐＨは７．５~９．５が適しており、ＴｒｉｓベースとＴＡＰＳベースの両方の緩衝液で活性が確認された（図６）。ＡＹＪ７３９７０は、１０ｍＭ程度の塩化アンモニウム共存下で活性を失った（図７）。その一方で、より低濃度が好まれるものの、５０ｍＭ塩化ナトリウムまたは塩化カリウムの存在下で活性を示した（図７）。最適なマグネシウム濃度は７．５~１２．５ｍＭだった（図８）。ドナーとアクセプターがそれぞれ１６および３０ヌクレオチド以上のときに、より強い一本鎖ＤＮＡ連結活性が確認された（図９）。ＡＹＪ７３９７０は、ＤＮＡアクセプターとＲＮＡアクセプターの両方に対して同等の活性を示したが、ドナーに対してはＲＮＡよりもＤＮＡを好む傾向があった（図１０）。ＡＹＪ７３９７０は、一本鎖ＤＮＡアダプターを二本鎖ＤＮＡに連結することもできるが、その効率は一本鎖ＤＮＡに連結するよりもはるかに低いものであった（図１１）。ＡＹＪ７３９７０は、バクテリオファージＴｈｅｒｍｕｓファージｐｈｉＬｏのゲノム配列中に同定された（つまり、この酵素はＴｐｈ　ｓｓＤＮＡリガーゼと呼ばれるべきであろう。）。本実施例では、この酵素（ＡＹＪ７３９７０）を一本鎖ＤＮＡリガーゼの英語の頭文字をとって、「ＳＤＬ」と称する。

　ＳＤＬは一本鎖ＤＮＡに対して強力な連結活性を持つ最初のリガーゼであるため、さまざまな応用に期待できる。そこで、代表的なアプリケーションのいくつかにＳＤＬを使用した。本発明者は、以前、ＴＡＣＳライゲーションを基に、一本鎖ＤＮＡからのシークエンシングライブラリー調製法のプロトコールを確立している。この方法では、アダプターダイマーの形成を抑制するために、標的一本鎖ＤＮＡに対する１つ目のアダプター連結を行い、そのアダプターを起点にＤＮＡ複製を行って二本鎖化し、最後にワクシニアウイルストポイソメラーゼＩ（ＴＯＰＯ）を用いた２回目のアダプター連結反応を行う（ＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ法、図１２Ａ）。このＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ法を用いると、ヒト血液のセルフリー画分中に存在する短い一本鎖ＤＮＡを高感度に分析することが可能であった。また、ＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ法により、古代人骨からのライブラリー調製の収量を１桁以上改善することができている。そこで、このＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ法におけるＴＡＣＳライゲーションの工程を、ＳＤＬを用いる工程で置き換える方法（ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法）を試み、実施した（図１２）。

　ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法を用いるとＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ法と同等の効率で一本鎖ＤＮＡからのライブラリー調製を行うことができたが、それ以上の利点があることも明らかになった。例えば、ＲＮＡはアルカリ条件に感受性であるが、アルカリによる脱スルホン化処理はバイサルファイト処理にとって不可欠な操作であるため、ＴＡＣＳ−ＴＯＰＯ法で調製されたリボテイルを含むシークエンシングライブラリーに対してはバイサルファイト処理を適用することができなかった。他方、ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法で調製されたライブラリーにはＲＮＡが含まれないため、ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法で調製されたライブラリーに対してはバイサルファイト処理を適用することが可能である。つまり、ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法で調製されたライブラリーはそのインサートＤＮＡ中のシトシンの５−メチル化状態を調べることができる（図１２）。実際に、ＳＤＬ−ＴＯＰＯ法で調製されたライブラリーに対してバイサルファイト処理（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＥＺ　ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　Ｇｏｌｄキットを使用し、製造元の指示に従って実施した。以下同様。）を適用した結果、そのリードからは殆どシトシンが無くなる一方で、得られたリード長の分布はバイサルファイト処理の有無により変動が確認されなかった。これらの結果は、ＳＤＬ−ＴＯＰＯを用いると血中セルフリーＤＮＡの高感度なメチローム解析が実現できることを意味している（図１２）。

　ＳＤＬは、ゲノムスケールでのＤＮＡメチル化レベルの定量、いわゆるメチローム解析のためのシークエンシングライブラリー調製でも有効性が確認されている。本発明者は、最近ＴＡＣＳライゲーションを用いた全ゲノムバイサルファイトシークエンシングのためのライブラリー調製法であるｔＰＢＡＴ法を報告している（前掲の非特許文献７参照）。ｔＰＢＡＴ法では、バイサルファイト処理後のＤＮＡを鋳型としてランダムプライミングを行うことで１つ目のアダプター配列を導入する。次に、この第１鎖ＤＮＡに対してＴＡＣＳライゲーションを適用して２つ目のアダプターを連結することでライブラリー調製を完成させる。このｔＰＢＡＴ法のＴＡＣＳライゲーションも、ＳＤＬで置換することができる（ｓＰＢＡＴ法）。その結果、ｓＰＢＡＴ法を用いると、ｔＰＢＡＴと比べて２~３倍多くのライブラリーが得られた（図１３）。ｓＰＢＡＴで得られたリードの質はｔＰＢＡＴのそれと同等であり、ＤＮＡメチル化レベルの定量で両者はほぼ同じ結果をもたらした（図１３）。ｔＰＢＡＴに比べてｓＰＢＡＴはより操作が簡略化されており、ライブラリー収量も高いことから、より実用的で高感度なメチロームデータの生産が可能になったといえる（図１３）。ここで、ｓＰＢＡＴプロトコールの詳細については、前述の図１３の説明（図面の簡単な説明欄）において記載したとおりである。以下、ｔＰＢＡＴとｓＰＢＡＴの比較について説明する。

　＜ｔＰＢＡＴとｓＰＢＡＴの比較＞
　ＩＭＲ−９０細胞株（ＪＣＲＢ９０５４、日本研究生物資源コレクションセルバンク）から精製した、あるいはヒト女性の末梢血に由来する（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００ナノグラムのゲノムＤＮＡに対して１ｎｇの非メチル化ラムダＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、これをバイサルファイト処理に供した。ｔＰＢＡＴは以前に報告した手法により実施し（Ｍｉｕｒａ　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，２０１９（非特許文献７）参照）、ｓＰＢＡＴは前述したプロトコールで実施した。異なるインデックスで標識された同モル量のｔＰＢＡＴおよびｓＰＢＡＴライブラリーをＰｈｉＸコントロール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ライブラリーの　２０％）と混合し、ＨｉＳｅｑ　Ｘ　Ｔｅｎシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による１５０×２のペアエンドモードでの配列決定を実施した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ　Ｊａｐａｎ、東京、日本）。

　ＳＤＬの用途は、メチローム解析に限定されない。例えば、ＳＤＬはｃＤＮＡの増幅にも利用できる。そのためにはまず、５′末端に増幅用のアダプター配列が連結されたオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡの合成を行う。次に、合成されたｃＤＮＡの３′末端に対してＳＤＬを用いてもう一つのアダプターを連結する。こうすれば、ＳＤＬの反応後にはｃＤＮＡは両端に異なるアダプターが連結されていることになるため、ＰＣＲで増幅することが可能となる（図１４）。実際に、増幅されたｃＤＮＡはロングリードシーケンサーでその配列を決定することができている。多くのリードが遺伝子全体をカバーしており、実用的なｃＤＮＡの分析が可能であった（図１４）。

　本実施例では、既知の酵素よりも優れた一本鎖ＤＮＡ連結活性を持つ酵素として、ＳＤＬ（ＡＹＪ７３９７０）を同定した。また、その応用例として４種のシークエンシングライブラリー調製への利用を説明した。しかし、ＳＤＬの応用先はこのようなシークエンシングライブラリーの調製に限定されるわけではない。例えばＳＤＬはコンビナトリアルインデックスの導入にも役立つだろう。標的ＤＮＡに対して５′末端がリン酸化された化学合成ＤＮＡの混合液を連結する操作をＳＤＬで実現すれば、より簡便にインデックスによる細胞のラベリングを実施することも可能になる。また、人工遺伝子ライブラリーの合成にもＳＤＬが貢献できる可能性が高い。ランダムに混合したアミノ酸コドンや特定のアミノ酸配列モジュールのシャフリング等にもＳＤＬは適している考えられる。その他多くのアプリケーションの実現にも、ＳＤＬは貢献し得るものである。

　なお、ＳＤＬ（ＡＹＪ７３９７０）とともに、ＴＳ２１２６　ＲＮＡリガーゼよりも強い一本鎖ＤＮＡ連結活性を有することが示されたＷＰ＿１１９３６０９０２の酵素タンパク質についても、上述したようなＳＤＬと同様の応用例（４種のシークエンシングライブラリー調製）に利用可能であり、考えられるその他の各種応用先にも利用可能と考えられる。

　本発明によれば、効率的な一本鎖ＤＮＡ連結活性を有する新規な酵素組成物としての一本鎖ＤＮＡ連結用組成物、一本鎖ＤＮＡ連結剤、一本鎖ＤＮＡ連結用キット等を提供することができる。本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物等を用いることにより、リボテイルを付加せずとも、ドナー及びアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡを連結することができ、例えば、高効率なシーケンスライブラリー調製を行うことができる点で、本発明に係る一本鎖ＤＮＡ連結用組成物等は有用なものである。

　配列番号１、３、５~１２、１４~１６及び１８~３１：合成ＤＮＡ
　配列番号１３及び１７：合成ＲＮＡ

Claims (17)

1. 　１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結用組成物であって、
   　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
   　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
   を含む、前記組成物。
2. 　前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、請求項１に記載の組成物。
3. 　さらにＰＥＧを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 　１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結剤であって、
   　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
   　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
   を含む、前記連結剤。
5. 　前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、請求項４に記載の連結剤。
6. 　さらにＰＥＧを含む、請求項４に記載の連結剤。
7. 　１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡと、１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡとを連結させるために用いられる一本鎖ＤＮＡ連結用キットであって、
   　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
   　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
   を含む、前記キット。
8. 　前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、請求項７に記載のキット。
9. 　さらにＰＥＧを含む、請求項７に記載のキット。
10. 　１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡ、及び１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡに、
    　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
    　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
    を接触させ、該アクセプターＤＮＡと該ドナーＤＮＡとを連結させることを含む、連結された一本鎖ＤＮＡの製造方法。
11. 　１種以上のアクセプターとしての一本鎖ＤＮＡ、及び１種以上のドナーとしての一本鎖ＤＮＡに、
    　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
    　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
    を接触させ、該アクセプターＤＮＡと該ドナーＤＮＡとを連結させることを含む、一本鎖ＤＮＡ連結方法。
12. 　前記アクセプターＤＮＡの塩基長が１２以上であり、及び／又は、前記ドナーＤＮＡの塩基長が１０以上である、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 　請求項１０又は１１に記載の方法における、
    　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
    　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
    の使用。
14. 　請求項１０又は１１に記載の方法において使用するための、
    　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
    　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質。
15. 　一本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法であって、
    　（Ａ）標的一本鎖ＤＮＡフラグメントに対して、５’末端がリン酸化されている一本鎖アダプター配列をライゲーションするステップ；
    　（Ｂ）ライゲーション後の配列のアダプターを起点にＤＮＡ複製を行って二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
    　（Ｃ）二本鎖ＤＮＡのアダプター配列が付加されていない末端に、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列をライゲーションするステップ；
    　（Ｄ）ライゲーション後の二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップ
    を含み、
    　前記（Ａ）のステップにおけるライゲーションが、
    　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
    　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
    を用いたライゲーション法により行われる、
    前記調製方法。
16. 　一本鎖ＤＮＡフラグメントからの二本鎖ＤＮＡライブラリーの調製方法であって、
    　（ｉ）両末端が脱リン酸化されている一本鎖ＤＮＡフラグメントの３’末端に、５’末端がリン酸化されている一本鎖アダプター配列Ａ１をライゲーションし、アダプター付加一本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
    　（ｉｉ）前記アダプター付加一本鎖ＤＮＡに含まれるアダプター配列Ａ１部分に、一本鎖アダプター配列Ａ２をアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼにより前記アダプター配列Ａ２の３’末端を伸長させて、アダプター付加二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；
    　（ｉｉｉ）一方の５’末端のみがリン酸化され、当該５’末端に相補的な３’末端を含む領域にトポイソメラーゼの認識配列を有する、二本鎖アダプター配列Ｂ１に、トポイソメラーゼを反応させて、前記認識配列の３’末端にトポイソメラーゼをコンジュゲートさせた、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２を生成するステップ；
    　（ｉｖ）前記アダプター付加二本鎖ＤＮＡのアダプター配列が付加されていない末端に、トポイソメラーゼ複合二本鎖アダプター配列Ｂ２をライゲーションして、両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを生成するステップ；及び
    　（ｖ）前記両末端アダプター付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより当該二本鎖ＤＮＡを複数含むライブラリーを得るステップ
    を含み、
    　前記（ｉ）のステップにおけるライゲーション及び生成が、
    　（ａ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、及び／又は
    　（ｂ）配列番号２若しくは４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡ連結活性を有するタンパク質
    を用いたライゲーション法により行われる、
    前記調製方法。
17. 　請求項１５又は１６に記載の調製方法により得られる、二本鎖ＤＮＡライブラリー。