WO2024162452A1 - Ｈｐｖ陽性がん又はｈｐｖ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物、及び組換えアデノウイルスベクター - Google Patents

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acid molecule
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透 清野
知美 中原
泉 齋藤
友子 田中
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National Cancer Center Japan
Juntendo Educational Foundation
National Cancer Center Korea
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Microbial Chemistry Research Foundation
National Cancer Center Japan
Juntendo Educational Foundation
National Cancer Center Korea
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions, and a recombinant adenovirus vector.
  • HR-HPV human papillomavirus
  • cervical cancer and its precursor lesion, cervical dysplasia develop are becoming younger, creating a need for treatments that can preserve fertility.
  • oropharyngeal cancer due to swallowing, eating, and speech disorders, there is a need to develop non-invasive treatments.
  • the CRISPR/Cas9 system is a genome editing technology that efficiently rewrites gene sequences and is expected to be used clinically in the treatment of cancer and genetic diseases.
  • the basic CRISPR/Cas9 system is composed of the Cas9 protein, which cleaves double-stranded DNA, the CRISPR RNA (crRNA) that determines the position specificity on the target genome, and a guide RNA (gRNA) consisting of an activating RNA (trans-activating crRNA: tracrRNA) that is partially complementary to the crRNA and serves as a scaffold for binding to the Cas9 protein.
  • the guide RNA consisting of the crRNA and tracrRNA can also be supplied as a single guide RNA (sgRNA) that is a fusion of the two.
  • the guide RNA can be expressed in the target cell using an appropriate vector containing DNA that encodes it.
  • the CRISPR/Cas9 system brings about site-specific genome cleavage, its accuracy is not perfect and the genome may be cleaved at a location other than the originally intended genomic region (off-target cleavage), resulting in off-target mutations. Because the human genome is huge, at approximately 3,000 megabases, if the CRISPR/Cas9 system were applied directly to human genome editing therapy, there is a possibility that hundreds of sites other than the target would be cleaved, making it impossible to put into practical use as a therapeutic method.
  • two guide RNAs In the double nicking system, two guide RNAs (guide RNA pairs) must be used to create a single DNA double-strand break site on the genome, and two guide RNA pairs, i.e., four guide RNAs, are required to delete a single DNA region from the genome by cleaving both ends.
  • two guide RNA pairs i.e., four guide RNAs
  • the present invention aims to solve the above-mentioned conventional problems and achieve the following objectives. That is, the present invention aims to provide a pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions that has an excellent therapeutic effect against HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions, and a superior recombinant adenovirus vector for use in gene therapy, etc.
  • a nucleic acid molecule encoding a Cas guide RNA or a Cas 9 nickase The pharmaceutical composition for gene therapy of human papillomavirus (HPV)-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions is characterized in that the Cas guide RNA or the nucleic acid molecule encoding the same comprises a pair or a combination of pairs of Cas guide RNAs or nucleic acid molecules encoding the same selected from the following (1) to (33): (1) A pair of a Cas guide RNA targeting a sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a nucleic acid molecule encoding the same, and a Cas guide RNA targeting a sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the 3rd to 21st bases of the sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid molecule encoding the same; A combination of a Cas
  • ⁇ 2> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to ⁇ 1>, wherein the nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA and the nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase are carried in a nucleic acid vector.
  • the nucleic acid vector is a recombinant adenovirus vector or a recombinant lentivirus vector.
  • ⁇ 4> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to ⁇ 3>, wherein the recombinant adenovirus vector is a recombinant adenovirus vector lacking a 12.4K gene sequence in an L4/E3 region and having an L4 poly A region sequence.
  • ⁇ 5> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to ⁇ 4> above, which has a nucleic acid molecule encoding a total of four or more Cas guide RNAs on a vector genome, the nucleic acid molecule being divided into two or more sites.
  • ⁇ 6> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to ⁇ 5> above, which has a nucleic acid molecule encoding a total of six or more Cas guide RNAs on a vector genome, the nucleic acid molecule being divided into two or more sites.
  • ⁇ 7> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to ⁇ 5> above, which has a nucleic acid molecule encoding a total of eight or more Cas guide RNAs on a vector genome, the nucleic acid molecule being divided into two or more sites.
  • ⁇ 8> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 7>, wherein the maximum number of consecutive nucleic acid molecules encoding the Cas guide RNA is 6.
  • ⁇ 9> The pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 8>, wherein the nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase is located downstream of a truncated EF promoter represented by SEQ ID NO:87.
  • the nucleic acid vector is a recombinant adenovirus vector.
  • ⁇ 12> A recombinant adenovirus vector characterized in that a 12.4K gene sequence is deleted in the L4/E3 region and that the vector has an L4 poly A region sequence.
  • ⁇ 13> The recombinant adenovirus vector according to ⁇ 12>, wherein the L4/E3 region is deleted from bases 27,864 to 28,137 and from base 28,200 onwards in terms of the positioning of adenovirus type 5.
  • ⁇ 14> A recombinant adenovirus vector having a total of four or more Cas guide RNA expression units separated into two or more sites on the vector genome.
  • ⁇ 15> The recombinant adenovirus vector according to ⁇ 14>, wherein the Cas guide RNA expression unit is divided and carried at two or more sites sandwiching at least a part of an essential region of the adenovirus.
  • ⁇ 16> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 15>, wherein the Cas guide RNA expression unit is divided and carried in two or more sites selected from the group consisting of the E1 region, the E3 region, and the E4 region of the adenovirus vector.
  • ⁇ 17> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 16>, having a total of six or more Cas guide RNA expression units on the vector genome.
  • ⁇ 18> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 17>, having a total of eight or more Cas guide RNA expression units on the vector genome.
  • ⁇ 19> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 18>, wherein the maximum number of consecutive Cas guide RNA expression units is six.
  • ⁇ 20> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 19>, which has a Cas protein expression unit.
  • ⁇ 21> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 20>, wherein the recombinant adenovirus vector is the recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 13>.
  • ⁇ 22> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 21>, comprising a Cas guide RNA expression unit targeting human papillomavirus (HPV).
  • HPV human papillomavirus
  • a recombinant adenovirus vector characterized in that it has a total of six or more short hairpin RNA expression units separated into two or more sites on the vector genome.
  • ⁇ 24> The recombinant adenovirus vector according to ⁇ 23>, wherein the short hairpin RNA expression unit is divided and carried at two or more sites sandwiching at least a part of an essential region of adenovirus.
  • ⁇ 25> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 23> to ⁇ 24>, wherein the short hairpin RNA expression unit is divided and carried in two or more sites selected from the group consisting of an E1 region, an E3 region, and an E4 region of the adenovirus vector.
  • ⁇ 26> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 23> to ⁇ 25>, wherein the vector genome has a total of eight or more short hairpin RNA expression units.
  • ⁇ 27> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 23> to ⁇ 26>, wherein the maximum number of consecutive short hairpin RNA expression units is four.
  • ⁇ 28> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 23> to ⁇ 27>, wherein the recombinant adenovirus vector is the recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 13>.
  • ⁇ 29> A recombinant adenovirus vector having two or more Cas guide RNA expression units and two or more short hairpin RNA expression units on a vector genome.
  • ⁇ 30> The recombinant adenovirus vector according to ⁇ 29>, wherein a target of the Cas guide RNA is a safe harbor region and a target of the short hairpin RNA is Cypor mRNA.
  • ⁇ 31> The recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 29> to ⁇ 30>, wherein the recombinant adenovirus vector is the recombinant adenovirus vector according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 13>.
  • the present invention can solve the above-mentioned problems and achieve the above-mentioned objectives, and can provide a pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions that has an excellent therapeutic effect against HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions, and a superior recombinant adenovirus vector for use in gene therapy, etc.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the HPV16 gene.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining double nicking.
  • FIG. 3 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 1.
  • FIG. 4 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 1.
  • FIG. 5 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 1.
  • FIG. 6 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 1 set of 2 (1 pair)).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the HPV16 gene.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining double nicking.
  • FIG. 3 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 1.
  • FIG. 4 shows the results of investigating the cleavage efficiency of g
  • FIG. 7 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 2 sets of 4 (2 pair combinations)).
  • FIG. 8 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 3 sets of 6 (3 pair combinations)).
  • FIG. 9 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 4 sets, 8 pieces (combinations of 4 pairs)).
  • FIG. 10 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 4 sets, 8 pieces (combinations of 4 pairs)).
  • FIG. 11 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 1 set of 2 (1 pair)).
  • FIG. 12 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: one set of two (one pair) or two sets of four (two pairs of combinations)).
  • FIG. 13 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: one set of two (one pair) or two sets of four (two pairs of combinations)).
  • FIG. 14 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (gRNA: 1 set of 2 (1 pair) or 2 sets of 4 (2 pair combinations)
  • FIG. 15 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV16(+) cervical cancer cells in Test Example 1 (96-well plate stained with Acid Red).
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the structure of the HPV18 gene.
  • FIG. 17 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 2.
  • FIG. 18 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 2.
  • FIG. 19 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 2.
  • FIG. 20 shows the results of investigating the cleavage efficiency of gRNA candidates in a test tube in Test Example 2.
  • FIG. 21 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV18(+) cervical cancer cells in Test Example 2 (gRNA: 1 set of 2 (1 pair)).
  • FIG. 22 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV18(+) cervical cancer cells in Test Example 2 (gRNA: 2 sets of 4 (2 pair combinations)).
  • FIG. 23 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV18(+) cervical cancer cells in Test Example 2 (gRNA: 3 sets of 6 (3 pair combinations)).
  • FIG. 21 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV18(+) cervical cancer cells in Test Example 2 (gRNA: 1 set of 2 (1 pair)).
  • FIG. 22 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV18(+) cervical cancer cells in Test Example 2 (gRNA: 2 sets of 4 (2 pair combinations
  • FIG. 24 shows the results of an investigation of double-nicking gRNA using HPV18(+) cervical cancer cells in Test Example 2 (gRNA: 4 sets, 8 pieces (combinations of 4 pairs)).
  • FIG. 25 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenoviral vector carrying an 8-fold guide RNA expression unit used in the experiment.
  • FIG. 26 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenoviral vector carrying an 8-fold guide RNA expression unit used in the experiment.
  • FIG. 27 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenoviral vector carrying an 8-fold guide RNA expression unit used in the experiment.
  • FIG. 28 is a diagram illustrating the extension of the L4/E3 deletion that restored the L4 polyA sequence.
  • FIG. 29 is a diagram showing the results of Test Example 4.
  • FIG. 30 is a diagram showing the results of Test Example 5.
  • FIG. 31 is a diagram showing the results of Test Example 6.
  • FIG. 32 is a diagram showing the results of Test Example 7.
  • FIG. 33 is a diagram showing the results of Test Example 8.
  • FIG. 34 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 10.
  • FIG. 35 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 10.
  • FIG. 36 is a diagram showing the results of Test Example 10.
  • FIG. 37 shows the results of Test Example 10.
  • FIG. 38 is a diagram showing the results of Test Example 10.
  • FIG. 39 is a diagram showing the results of Test Example 10.
  • FIG. 40 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 11.
  • FIG. 41 is a diagram showing the results of Test Example 11.
  • FIG. 42 is a diagram showing the results of Test Example 11.
  • FIG. 43 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 12.
  • FIG. 44 is a diagram showing the results of Test Example 12.
  • FIG. 45 is a diagram showing the results of Test Example 12.
  • FIG. 46 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 47 shows the results of Test Example 13.
  • FIG. 48 shows the results of Test Example 13.
  • FIG. 49 shows the results of Test Example 13.
  • FIG. 50 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 51 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 52 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 53 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 54 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 55 is a diagram showing the results of Test Example 13.
  • FIG. 56 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 14.
  • FIG. 57 is a diagram showing the results of Test Example 14.
  • FIG. 58 is a diagram showing the results of Test Example 14.
  • FIG. 59 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 15.
  • FIG. 60 is a diagram showing the results of Test Example 15.
  • FIG. 61 is a diagram showing the results of Test Example 15.
  • FIG. 62 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 16.
  • FIG. 63 is a diagram showing the results of Test Example 16.
  • FIG. 64 is a diagram showing the results of Test Example 16.
  • FIG. 65 is a schematic diagram illustrating the structure of the adenovirus vector used in Test Example 17.
  • FIG. 66 is a diagram showing the results of Test Example 17.
  • FIG. 67 is a diagram showing the results of Test Example 17.
  • FIG. 68 shows the state of the mice in Test Example 18.
  • FIG. 69 shows the results of measuring the tumor size over time in Test Example 18.
  • FIG. 70 is a schematic diagram of the knock-in vector used in Test Example 19.
  • FIG. 71 is a schematic diagram of the knock-in vector used in Test Example 19.
  • FIG. 72 is a schematic diagram illustrating a gene encoding mouse phenylalanine hydroxylase.
  • FIG. 73 is a diagram showing the results of Test Example 20.
  • FIG. 74 is a diagram for explaining an outline of the experiment of Test Example 21.
  • FIG. 75 is a diagram for explaining donor DNA in Test Example 21.
  • FIG. 76 shows the results of PCR in Test Example 21.
  • FIG. 77 is a diagram showing the results of Test Example 22.
  • FIG. 78 is a diagram showing the results of Test Example 22.
  • FIG. 79 is a diagram showing the results of Test Example 22.
  • FIG. 80 shows the results of Test Example 22.
  • FIG. 81 is a diagram showing the results of Test Example 22.
  • FIG. 82 is a diagram for explaining an outline of the experiment in Test Example 23.
  • FIG. 83 shows the results of measuring blood phenylalanine concentrations at week 6 in Test Example 23.
  • FIG. 83 shows the results of measuring blood phenylalanine concentrations at week 6 in Test Example 23.
  • FIG. 84 shows the results of measuring blood phenylalanine concentrations at week 13 in Test Example 23.
  • FIG. 85 shows the results of examining knock-in efficiency in Test Example 23.
  • FIG. 86 shows the results of examining knock-in efficiency in Test Example 23.
  • FIG. 87 shows the results of mismatch detection by T7E1 assay in Test Example 23.
  • FIG. 88 is a schematic diagram for explaining point mutation repair and cDNA knock-in.
  • FIG. 89 is a schematic diagram for explaining the vector used in Test Example 24.
  • FIG. 90 is a diagram showing the results of Test Example 25.
  • FIG. 91 is a diagram showing the results of Test Example 25.
  • FIG. 92 is a diagram showing the results of Test Example 26.
  • FIG. 93 is a schematic diagram for explaining the safe harbor region and donor DNA in Test Example 27.
  • FIG. 94 shows the results of PCR in Test Example 27.
  • Figure 95 shows the results of digesting PCR DNA with BamHI in Test Example 27.
  • the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion of the present invention contains at least a Cas guide RNA or a nucleic acid molecule encoding the same, and a Cas9 nickase or a nucleic acid molecule encoding the same, and further contains other components as necessary.
  • HPV-positive cancer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples include cervical cancer and oropharyngeal cancer.
  • the HPV-positive precancerous lesion is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples include cervical dysplasia.
  • HPV is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, examples of which include HPV16 and HPV18.
  • the Cas guide RNA or the nucleic acid molecule encoding the same includes a pair or a combination of pairs of Cas guide RNAs or nucleic acid molecules encoding the same selected from the following (1) to (33):
  • the Cas guide RNA or the nucleic acid molecule encoding the same may consist of only a Cas guide RNA or a combination of nucleic acid molecules encoding the same selected from the following (1) to (33), or may further include another Cas guide RNA or a nucleic acid molecule encoding the same.
  • the following (1) to (13) and (24) to (33) can be suitably used against HPV16.
  • the following (14) to (23) can be suitably used for HPV18.
  • (14) A pair of a Cas guide RNA targeting a sequence represented by SEQ ID NO: 16 or a nucleic acid molecule encoding the same and a Cas guide RNA targeting a sequence represented by SEQ ID NO: 17 or a nucleic acid molecule encoding the same;
  • the E6 and E7 regions of the HPV genome can be safely and completely destroyed by cleavage using the double nicking method, making it possible to treat HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions.
  • the Cas guide RNA or the nucleic acid molecule encoding it may be in the form of RNA or a nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA, but a nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA, particularly a DNA, is preferred.
  • the content of the Cas guide RNA or the nucleic acid molecule encoding the same in the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the Cas nickase or the nucleic acid molecule encoding it is not particularly limited, and any known Cas nickase or a nucleic acid molecule encoding it can be used.
  • the Cas9 nickase or the nucleic acid molecule encoding it may be in the form of a protein or a nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase, with the latter being preferred.
  • the content of the Cas9 nickase or the nucleic acid molecule encoding it in the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA and the nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase are preferably carried on a nucleic acid vector.
  • the nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA and the nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase may be carried on the same nucleic acid vector or on different nucleic acid vectors, but are preferably carried on the same nucleic acid vector.
  • the nucleic acid vector means a molecule consisting of nucleic acid, which is used to deliver a foreign gene or the like into a target cell.
  • the nucleic acid vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include plasmids, viral vectors such as DNA viral vectors and RNA viral vectors.
  • Non-viral vector systems also include methods using lipid nanoparticles (LNPs) and electroporation.
  • the viral vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include recombinant adenovirus vectors, recombinant adeno-associated virus vectors, recombinant lentivirus vectors, recombinant baculovirus vectors, recombinant Sendai virus vectors, recombinant vaccinia virus vectors, and recombinant herpes virus vectors. Among these, recombinant adenovirus vectors and recombinant lentivirus vectors are preferred.
  • the recombinant adenovirus vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the recombinant adenovirus vector of the present invention described below is preferred.
  • the arrangement of the nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA on the recombinant adenovirus vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. It may be arranged entirely at one site, or may be divided and arranged at two or more sites.
  • nucleic acid molecules encoding the Cas guide RNA When a total of four or more nucleic acid molecules encoding the Cas guide RNA are used, it is preferable to divide and place them at two or more sites on the recombinant adenovirus vector.
  • the nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA is divided and arranged at two or more sites, it is preferable to arrange it in the same manner as the Cas guide RNA expression unit in the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit of the present invention described below.
  • the nucleic acid molecule encoding the Cas guide RNA can be used together with an expression regulatory region, such as a promoter, that regulates its expression, in the same manner as the Cas guide RNA expression unit in the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit of the present invention described below.
  • an expression regulatory region such as a promoter
  • the nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase can be used together with a promoter, polyA, etc., in the same manner as the Cas protein expression unit in the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit of the present invention described below.
  • the nucleic acid molecule encoding the Cas9 nickase is preferably arranged in the same manner as the Cas protein expression unit in a recombinant adenovirus vector having a Cas guide RNA expression unit of the present invention described below.
  • the method for producing the nucleic acid vector is not particularly limited, and it can be produced by a method commonly used by those skilled in the art.
  • the other components are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • pharma- ceutical acceptable carriers can be mentioned.
  • a pharma- ceutically acceptable carrier refers to a substance that aids in the administration of an agent (such as Cas nickase, Cas guide RNA, etc.) to a cell, organism, or subject.
  • the pharma- ceutically acceptable carrier is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include water, NaCl, physiological saline, lactated Ringer's solution, normal sucrose, normal glucose, binders, bulking agents, disintegrants, lubricants, coating agents, sweeteners, flavorings, colorants, etc. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the amount of the other components contained in the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesion is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, and may include, for example, oral administration, topical contact, administration as a suppository, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intrathecal, intranasal, or subcutaneous administration.
  • the route of administration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, and may be, for example, any route including parenteral and transmucosal (e.g., buccal, sublingual, palate, gingival, nasal, vaginal, rectal, or transdermal).
  • the parenteral administration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, and may include, for example, intravenous, intramuscular, intraarteriolar, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, intraventricular, or intracranial.
  • Other modes of delivery include, but are not limited to, the use of liposome preparations, intravenous injection, and transdermal patches.
  • an "effective amount” or a "sufficient amount” refers to an amount of an agent (e.g., a Cas protein such as Cas nickase, a Cas guide RNA, etc.) that is sufficient to produce a beneficial or desired result.
  • an agent e.g., a Cas protein such as Cas nickase, a Cas guide RNA, etc.
  • a therapeutically effective amount may vary depending on one or more of the subject and disease state being treated, the weight and age of the subject, the severity of the disease state, the mode of administration, etc., and can be readily determined by one of skill in the art.
  • a particular amount may vary depending on one or more of the particular agent selected, the target cell type, the location of the target cells in the subject, the dosing regimen to be followed, whether it is administered in combination with other agents, the timing of administration, and the physical delivery system in which it is delivered.
  • the present invention also relates to a method for treatment by genome editing (gene therapy method) characterized by administering to a subject the pharmaceutical composition for gene therapy of HPV-positive cancer or HPV-positive precancerous lesions of the present invention, or a method for treatment by genome editing (gene therapy method) using the recombinant adenovirus vector of the present invention or a recombinant adenovirus vector having a Cas guide RNA expression unit of the present invention, which will be described later.
  • genome editing genome editing
  • adenovirus vector refers to an adenovirus that contains in its genome a base sequence that is different from the base sequence inherent to adenovirus.
  • the origin of the recombinant adenovirus vector is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but is preferably an adenovirus of human origin.
  • human-derived adenoviruses types 2 and 5 classified as type C are more preferable.
  • the recombinant adenovirus vector of the present invention is a novel recombinant adenovirus vector that lacks a 12.4K gene sequence in the L4/E3 region and has an L4 polyA region sequence.
  • the recombinant adenovirus vector has a modified backbone, making it possible to carry a longer nucleic acid region as a payload.
  • the recombinant adenovirus vector preferably lacks bases 27,864 to 28,137 and 28,200 and beyond in the L4/E3 region, as positioned in adenovirus type 5.
  • the recombinant adenovirus vector preferably includes the entire region from the left end of the genome to base 358 in the E1 region as positioned in adenovirus type 5.
  • the recombinant adenovirus vector can be produced by any method known in the art, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, it can be produced by using an existing adenovirus vector as a base and introducing a deletion or insertion of a desired sequence using standard gene recombination techniques commonly used by those skilled in the art.
  • the existing adenovirus vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the adenovirus vector described in Miyake S, Saito I et al. (PNAS, 93:1320-1324, 1996) is preferred.
  • the adenovirus vector described in Miyake S, Saito I et al. has a deletion of bases 455 to 3,328 in the E1 region and a deletion of bases 28,593 to 30,470 in the E3 region, and also has a site (cloning site) for inserting foreign DNA in the E4 region.
  • the recombinant adenovirus vector can be amplified using, for example, 293 cells, which are typically used in combination with the Ad5 adenovirus vector.
  • the recombinant adenovirus vector can be equipped with human therapeutic genes, so-called reporter genes such as the GFP gene, genes encoding proteins such as recombinase, regulatory genes such as promoters and polyA sequences, and base sequences that have no function.
  • reporter genes such as the GFP gene
  • genes encoding proteins such as recombinase
  • regulatory genes such as promoters and polyA sequences
  • base sequences that have no function.
  • the insertion site of the gene or the like carried in the recombinant adenovirus vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples include the E1 region, E3 region, E4 region, etc.
  • the gene or the like may be inserted at one site or at two or more sites.
  • the recombinant adenovirus vector can be suitably used for genome editing using the CRISPR/Cas system.
  • gene editing refers to a series of genetic manipulations in which DNA is inserted, replaced, or removed from a target DNA, e.g., the genome of a cell, using one or more nucleases and/or nickases.
  • the nuclease creates a specific double-stranded break at a desired location in the genome and utilizes the cell's endogenous machinery to repair the induced break by homology-directed repair (HDR) or non-homologous end joining (NHEJ).
  • HDR homology-directed repair
  • NHEJ non-homologous end joining
  • the nickase creates a specific single-stranded break at a desired location in the genome.
  • two nickases can be used to create two single-stranded breaks in opposing strands of the target DNA, thereby generating blunt or overhanging ends.
  • Any suitable nuclease can be introduced to induce genomic editing of the target DNA sequence, including, but not limited to, CRISPR-associated protein (Cas) nuclease, Cpf1, zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), meganuclease, other endo- or exo-nucleases, variants thereof, fragments thereof, and combinations thereof.
  • Cas CRISPR-associated protein
  • ZFN zinc finger nuclease
  • TALEN transcription activator-like effector nuclease
  • meganuclease other endo- or exo-nucleases, variants thereof, fragments thereof, and combinations thereof.
  • gene cleavage or “genome cleavage” means that both strands of the double-stranded nucleic acid that constitutes the genome are cleaved in association with the above-mentioned genome editing.
  • the cleavage of the double-stranded nucleic acid may be performed by cleavage at corresponding base pairs in the sense strand and the antisense strand to produce blunt ends, or may be performed by cleavage at different positions where the sense strand and the antisense strand are adjacent to each other to produce protruding ends.
  • CRISPR/Cas system refers to a system that utilizes CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) nucleic acid and Cas protein (CRISPR-associated protein), which are immune mechanisms possessed by prokaryotes.
  • CRISPR/Cas systems are classified into class 1 and class 2, and class 2 "CRISPR/Cas systems” are further classified into type II, type V, and type VI (Yamano et al., Molecular Cell, 2017, Vol. 67, pp. 633-645).
  • a system using Cas9 as a Cas protein uses the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes, a guide RNA (gRNA) consisting of CRISPR RNA (crRNA) and a trans-activating RNA (tracrRNA) that is partially complementary to the crRNA and serves as a scaffold for binding to the Cas9 protein.
  • the crRNA and tracrRNA may be supplied as a fused single RNA molecule (single guide RNA) or as separate RNA molecules (sometimes referred to as "non-single guide RNA").
  • the "CRISPR/Cas9 system” is supplied to a target cell as a DNA fragment encoding the Cas9 protein, a DNA fragment encoding the crRNA, and a DNA fragment expressing the tracrRNA.
  • the "CRISPR/Cas9 system” is supplied as a DNA fragment encoding the Cas9 protein and a DNA fragment encoding a single guide RNA.
  • these DNA fragments are supplied to the target cell using a viral vector. These DNA fragments can be supplied to the target cell by a single viral vector or by separate viral vectors.
  • the DNA encoding the tracrRNA is not particularly limited and can be appropriately selected from known DNAs, for example, a plasmid (pX260) manufactured by Addgene.
  • the recombinant adenovirus vector can be suitably used as a recombinant adenovirus vector having one or more types selected from the group consisting of a Cas guide RNA expression unit, a short hairpin RNA expression unit, a Cas protein expression unit, and a donor DNA expression unit.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit of the present invention has at least a total of four or more Cas guide RNA expression units divided into two or more sites on the vector genome, and may further have other components as necessary. By dividing the Cas guide RNA expression unit into two or more locations and incorporating it, deletion can be prevented even when the gene contains eight or more units.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit can stably retain the Cas guide RNA expression unit in animal cells.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit can be suitably used for genome editing using the CRISPR/Cas system.
  • the Cas guide RNA expression unit (hereinafter, sometimes referred to as "guide RNA expression unit”) means a DNA building block for expressing Cas guide RNA (sometimes referred to as “guide RNA") used in the CRISPR/Cas system.
  • the Cas guide RNA expression unit comprises a DNA nucleic acid sequence that is transcribed into a Cas guide RNA.
  • Cas guide RNA examples include a “single Cas guide RNA” that uses a single guide RNA in which crRNA and tracrRNA are fused together, and a “non-single Cas guide RNA” that uses a non-single guide RNA in which crRNA and tracrRNA are separate.
  • the "Cas guide RNA expression unit” may be in the form of a "single Cas guide RNA expression unit” for expressing a single Cas guide RNA, a “crRNA expression unit” for expressing crRNA, or a “tracrRNA expression unit” for expressing tracrRNA.
  • the "Cas guide RNA expression unit” may consist of only a “single Cas guide RNA expression unit”, or may consist of a “crRNA expression unit” and a “tracrRNA expression unit”, or may include a "single Cas guide RNA expression unit", a "crRNA expression unit", and a "tracrRNA expression unit”.
  • the number of the Cas guide RNA expression units is counted as one for each of a "single Cas guide RNA expression unit,” a “crRNA expression unit,” and a “tracrRNA expression unit.” In other words, when one "crRNA expression unit” and one "tracrRNA expression unit” are used, the number of the Cas guide RNA expression units is two.
  • the number of "crRNA expression units” and “tracrRNA expression units” may be the same or different. Examples of cases in which the numbers of the two are different include an embodiment in which the "tracrRNA expression units" are 2 and the “crRNA expression units” are 6; an embodiment in which the "tracrRNA expression units” are 4 and the “crRNA expression units” are 4; an embodiment in which the “tracrRNA expression units” are 6 and the “crRNA expression units” are 2; an embodiment in which the "tracrRNA expression units” are 4 and the “crRNA expression units” are 8, etc.
  • the arrangement of the Cas guide RNA expression units on the vector genome is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose, as long as a total of four or more Cas guide RNA expression units are arranged in two or more divided sites.
  • the total number of the Cas guide RNA expression units on the vector genome is not particularly limited as long as it is 4 or more, and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 or more. Among these, a total of 6 or more is preferred, a total of 8 or more is more preferred, a total of 10 or more is even more preferred, and a total of 12 or more is particularly preferred.
  • the sites on the vector where the Cas guide RNA expression unit is placed there are no particular limitations on the sites on the vector where the Cas guide RNA expression unit is placed, so long as there are two or more sites, and these can be selected appropriately depending on the purpose, but it is preferable that the unit is divided into two or more sites sandwiching at least a portion of the essential region of the adenovirus.
  • the essential regions of adenovirus refer to the E1A, E1B, E2A, E2B and E4 regions of the early gene group, and the L1 to L4 regions of the late gene group. Furthermore, “sandwiching at least a portion of the essential region of the adenovirus” means that at least a portion of the essential region of the adenovirus is present between the divided and mounted Cas guide RNA expression units, and all of the essential region of the adenovirus may be present.
  • the Cas guide RNA expression unit is preferably divided and mounted in two or more regions selected from the group consisting of the E1 region (hereinafter sometimes referred to as the "E1 region”), the E3 region (hereinafter sometimes referred to as the "E3 region”), and the E4 region (hereinafter sometimes referred to as the "E4 region”) of the adenovirus vector.
  • E1 region the E1 region
  • E3 region the E3 region
  • E4 region hereinafter sometimes referred to as the "E4 region of the adenovirus vector.
  • the E1 region of the adenovirus is deleted.
  • the function is complemented by 293 cells having DNA of the E1 region.
  • the E1 region deleted in the adenovirus vector may be referred to as the "E1 deleted region" or "E1 deleted integration site.”
  • the E1 region also includes the deleted E1 region.
  • the deletion of a certain region includes both the case where the entire region is deleted and the case where only a part of the region is deleted.
  • the E3 gene group in adenovirus is not essential for viral replication. Therefore, it is preferable that the E3 region is deleted in the adenovirus vector.
  • the E3 region deleted in the adenovirus vector may be referred to as the "E3 deleted region” or "E3 deleted integration site.” In this specification, the E3 region also includes the deleted E3 region.
  • the E4 region in the adenovirus vector is a region that has the E4 gene group of adenovirus.
  • the E4 region may or may not be gene-deleted.
  • the E4 region is a region that includes a site that allows the integration of foreign DNA without necessarily involving deletion (hereinafter, sometimes referred to as the "E4 integration site").
  • the E4 region also includes an E4 region that is deleted.
  • the number of Cas guide RNA expression units in one placement site is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11 or more. Among these, 2 or more is preferable, 4 or more is more preferable, and 6 or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the number of Cas guide RNA expression units (the maximum number of consecutive Cas guide RNA expression units) at one placement site and it can be selected appropriately depending on the purpose, but six is preferable, and eight is more preferable.
  • the lower limit of the number of Cas guide RNA expression units in one site (the minimum number of consecutive Cas guide RNA expression units) and it can be selected appropriately depending on the purpose, but two is preferable.
  • Examples of the Cas guide RNA expression units being split into two locations include 1:3 or more, 2:2 or more, etc., and more specifically, 2:2, 2:4, 2:6, 2:8, 3:3, 3:6, 4:4, 4:6, 4:8, 6:6, 6:8, 8:8, etc.
  • Examples of the arrangement of the Cas guide RNA expression units divided into three locations include 1:1:2 or more, and more specifically, 2:2:2, 2:2:4, 2:2:6, 2:2:8, 3:3:3, 3:3:6, 4:4:4, 4:4:6, 4:4:8, 6:6:6, 8:8:8, etc.
  • the Cas guide RNA expression unit may contain, in addition to the DNA encoding the Cas guide RNA, an expression regulatory region such as a promoter that regulates its expression.
  • the promoter is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples of the promoter include the U6 promoter, H1 promoter, tRNA promoter, and adenovirus VA promoter. Among the promoters, the truncated U6 promoter (SEQ ID NO: 88) described below is preferred.
  • a vector typically contains multiple guide RNA expression units, they are arranged adjacent to each other in tandem so that they have the same transcription direction.
  • the target of the Cas guide RNA is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples include, but are not limited to, human papillomavirus (HPV) and hepatitis B virus (HBV).
  • HPV human papillomavirus
  • HBV hepatitis B virus
  • the Cas guide RNA expression unit may target one type of gene, or may target two or more types of genes.
  • HBV Hepatitis B virus
  • expressing multiple guide RNAs (expressing many different guide RNAs) by a vector targeting the viral genome not only enhances the therapeutic effect by simultaneously destroying many essential viral sites, but also has the following effects: (1) one vector drug can become a broad-spectrum drug that is effective against viruses in a wide range of patients with mutant viruses, (2) it destroys each of the various viruses that persistently infect a single patient, thereby reducing the amount of residual virus, and (3) by simultaneously destroying many sites on the viral genome, it does not allow the virus to have the number of passages at which it can acquire resistance through mutation, thereby not allowing the emergence of resistant viruses.
  • the same effect is also expected for cancer.
  • the simultaneous destruction of many cellular genes that favor the proliferation of cancer cells will not only enhance the therapeutic effect, but (2) one vector drug will be effective in different patients whose cancer cells have been transformed by different genomic mutations, making it a broad-spectrum drug that is effective against the cancers of a wide range of patients; (3) even within a single patient, it may be possible to destroy a variety of cancer cells, such as cancer cells that have mutated at different genomic sites and acquired the ability to metastasize, or, conversely, cancer cells that grow slowly and become resistant to drugs; and (4) the simultaneous destruction of many mutated sites on the genome of cancer cells will not allow the emergence of resistant cancer cells, as cancer cells will not be given the passage number at which they can acquire resistance through mutations.
  • the vector is also useful for treating genetic diseases. Therefore, the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the vector of the present invention.
  • the hereditary disease is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples of the hereditary disease include phenylketonuria, ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency, carbamyl phosphate synthase (CPS) deficiency, methylmalonic acidemia, and ⁇ 1-antitrypsin deficiency.
  • recombinant adenovirus vectors having a short hairpin RNA expression unit as described below, and recombinant adenovirus vectors having a Cas guide RNA expression unit and a short hairpin RNA expression unit can also be suitably used for similar purposes.
  • the other components are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • Examples of the other components include a Cas protein expression unit and a donor DNA unit.
  • the Cas protein expression unit contains at least a gene encoding a Cas protein, and optionally has other components such as a promoter and polyA.
  • the Cas protein refers to a protein and its derivatives that function as an effector molecule constituting the "CRISPR/Cas system".
  • the "Cas protein” refers to the Cas9 protein, the Cpf1 protein, and mutants thereof having DNA cleavage activity.
  • the "Cas protein” is a Cas nuclease having DNA double strand cleavage activity.
  • the "Cas protein” is a Cas nickase having an activity of cleaving only one strand of a DNA double strand.
  • the Cas nickase may be a Cas9 (D10A) nickase (Jinek et al., 2012, Science, 2012, Vol. 337, no. 6096, pp. 816-821) having a mutation in the RuvC domain.
  • Cas9 nuclease and Cas9 nickase are preferred, and Cas9 nickase is more preferred.
  • the promoter is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include the CB promoter (CB pro), the PGK promoter (PGK pro), and the human EF1 ⁇ promoter (sometimes referred to as the "EF promoter”). Among these, the shortened EF promoter (SEQ ID NO: 87) (hereinafter sometimes referred to as the "EFd promoter”) is preferred.
  • the poly A is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose.
  • poly A derived from bovine growth hormone can be used.
  • the site where the Cas protein expression unit is placed is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include the E1 region, the E3 region, the E4 region, etc. Among these, the E4 region is preferred.
  • the site where the Cas protein expression unit is placed may be the same as or different from the site (region) where the Cas guide RNA expression unit is placed.
  • the donor DNA unit contains at least the donor DNA sequence to be knocked in, and, if necessary, has other configurations such as a left arm sequence and a right arm sequence, which will be described later.
  • the donor DNA sequence may be a sequence that codes for a gene or a sequence that does not code for a gene.
  • knock-in is required to replace abnormal gene sequences with normal gene sequences, and the DNA fragments used for knock-in have normal base sequences on both sides (upstream and downstream) of the abnormal sequence that are used for homologous recombination. Generally, these sequences are called the left arm sequence (upstream) and the right arm sequence (downstream).
  • the site where the donor DNA unit is located is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples of the site include the E1 region, E3 region, and E4 region.
  • the site where the Cas protein expression unit is placed may be the same as or different from the site (region) where the Cas guide RNA expression unit and the Cas protein expression unit are placed.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit can be made into an "integrated Cas adenovirus vector" (sometimes called an "all-in-one Cas adenovirus vector") by further incorporating at least one of the Cas protein expression unit and the donor DNA unit.
  • the number of Cas guide RNA expression units, Cas protein expression units, and donor DNA units contained in the "integrated Cas adenovirus vector" is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose. For example, it may contain four or more of the above-mentioned Cas guide RNA expression units together with one copy of the Cas protein expression unit.
  • Examples of the embodiment include an embodiment including four or more single guide RNA expression units and one Cas protein expression unit, an embodiment including two or more tracrRNA expression units, six or more crRNA expression units and one Cas protein expression unit, an embodiment including four or more tracrRNA expression units, four or more crRNA expression units and one Cas protein expression unit, an embodiment including six or more tracrRNA expression units, two or more crRNA expression units and one Cas protein expression unit, and the like.
  • the integrated Cas adenovirus vector containing the donor DNA unit can introduce the donor DNA sequence into a specific position on the genome with extremely high efficiency.
  • the integrated Cas knock-in nucleic acid vector is composed of a set (two) of Cas guide RNA expression units for generating double nicking, one donor DNA sequence, and one gene encoding a Cas protein, but is not limited to this configuration.
  • the method for producing a recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the vector can be produced by a method in which the Cas guide RNA expression unit and, if necessary, the other components are inserted into a cosmid vector containing a part of the adenovirus genome DNA, and then the vector is transfected into 293 cells to obtain a recombinant adenovirus vector (full-length DNA introduction method: Fukuda et al., Microbiol. Immunol. 2006, Vol. 50, pp. 463-454).
  • the culture period using 293 cells is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferable that the culture period be continued for 11 days, 12 days, 13 days, 14 days, 15 days, 16 days, 17 days, 18 days, 19 days, 20 days, 21 days, 22 days, 23 days, or 24 days or more.
  • the adenovirus vector that can be used as the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the recombinant adenovirus vector of the present invention described above can be preferably used.
  • the genome editing activity of the Cas protein may occur in the host cell, so it is preferable to culture the vector under culture conditions that make it difficult for the activity to occur. It is also preferable to culture the vector under conditions that can suppress the expression of the Cas protein.
  • the expression of the Cas protein can be suppressed by introducing a vector that expresses an siRNA that suppresses the expression of the Cas protein into the cultured cells.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit is preferably configured so that the Cas guide RNA expression unit induces double nicking.
  • the Cas guide RNA expression unit is "configured to induce double nicking" means that at least two Cas guide RNA expression units are selected to induce single-strand breaks, or "nicks," in the sense and antisense strands, respectively, at adjacent positions on the genome, thereby cleaving the two strands of the genomic DNA near the two nicks.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit is preferably configured to induce at least four double nicking events to cause genome cleavage at at least four sites.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit is preferably designed to knock down the sequence by inducing two double nicks in adjacent regions upstream of the sequence to be knocked down from the genome, and further inducing two double nicks in adjacent regions downstream of the sequence to be knocked down. This makes it possible to knock down the sequence of interest extremely safely and reliably.
  • the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit can be used in genome editing experiments by applying an effective amount to cultured cells, and can also be used in genome editing experiments or disease treatment by administering an effective amount to animals other than humans, and in genome editing disease treatment by administering an effective amount to humans.
  • the recombinant adenovirus vector having a short hairpin RNA expression unit of the present invention has at least a total of six or more short hairpin RNA expression units divided into two or more sites on the vector genome, and may further have other components as necessary.
  • the recombinant adenovirus vector carrying the short hairpin RNA expression unit is capable of stably retaining the short hairpin RNA expression unit in animal cells.
  • the short hairpin RNA expression unit means a DNA building block for expressing a short hairpin RNA.
  • the short hairpin RNA expression unit comprises a DNA nucleic acid sequence that is transcribed into a short hairpin RNA.
  • the short hairpin RNA is an RNA having a length of 55 to 65 bases.
  • the structure of the short hairpin RNA has a sense strand of a 21-base target sequence, a 9-base loop sequence, an antisense strand, and a terminating poly U. After being transcribed, the short hairpin RNA forms a hairpin structure and is processed to become an siRNA.
  • the sequence and length of the loop sequence and the termination poly U are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the arrangement of the short hairpin RNA expression units on the vector genome is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose, as long as a total of six or more short hairpin RNA expression units are arranged divided into two or more sites.
  • the total number of the short hairpin RNA expression units on the vector genome is not particularly limited as long as it is 6 or more, and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 or more. Among these, a total of 8 or more is preferred, a total of 10 or more is more preferred, and a total of 12 or more is even more preferred.
  • the sites on the vector where the short hairpin RNA expression unit is located there are no particular limitations on the sites on the vector where the short hairpin RNA expression unit is located, so long as there are two or more sites, and these can be selected appropriately depending on the purpose, but it is preferable that the short hairpin RNA expression unit is divided into two or more sites sandwiching at least a part of the essential region of the adenovirus.
  • the short hairpin RNA expression unit is preferably divided and mounted in two or more sites selected from the group consisting of the E1 region, the E3 region, and the E4 region of the adenovirus vector.
  • the number of short hairpin RNA expression units in one placement site is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11 or more. Among these, 2 or more is preferred, 4 or more is more preferred, and 6 or more is particularly preferred.
  • the upper limit of the number of short hairpin RNA expression units in one placement site (the maximum number of consecutive short hairpin RNA expression units) and it can be selected appropriately depending on the purpose, but four is preferable.
  • the lower limit of the number of short hairpin RNA expression units in one site (the minimum number of consecutive short hairpin RNA expression units) and it can be appropriately selected depending on the purpose, but two is preferable.
  • Examples of when the short hairpin RNA expression unit is divided and placed in two or three locations are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, it can be placed in the same manner as the above-mentioned Cas guide RNA expression unit.
  • the short hairpin RNA expression unit can contain, in addition to the DNA encoding the short hairpin RNA, an expression control region such as a promoter that controls its expression.
  • RNA expression units usually, when a vector contains multiple short hairpin RNA expression units, they are arranged adjacent to each other in tandem so that they have the same transcription direction.
  • the sequence of the DNA encoding the short hairpin RNA is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose.
  • the other components are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a donor DNA unit can be mentioned.
  • the adenovirus vector that can be used as the recombinant adenovirus vector having the short hairpin RNA expression unit is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the recombinant adenovirus vector of the present invention described above can be preferably used.
  • the recombinant adenovirus vector having a Cas guide RNA expression unit and a short hairpin RNA expression unit of the present invention has at least two or more Cas guide RNA expression units and two or more short hairpin RNA expression units on the vector genome, and may further have other components as necessary.
  • the Cas guide RNA expression unit is the same as the Cas guide RNA expression unit described in the section on recombinant adenovirus vectors having a Cas guide RNA expression unit described above.
  • the target of the Cas guide RNA in the Cas guide RNA expression unit is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but a safe harbor region is preferable.
  • the safe harbor region is a gene region in which the inserted gene is unlikely to be suppressed in expression and is known not to have a deleterious effect on cells even if it is deleted.
  • the sequence of the Cas guide RNA that targets the safe harbor region is not particularly limited and can be appropriately selected from the safe harbor region according to the purpose.
  • the short hairpin RNA expression unit is the same as the short hairpin RNA expression unit described above in the section on recombinant adenovirus vectors having a short hairpin RNA expression unit.
  • the target of the short hairpin RNA in the short hairpin RNA expression unit is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but Cypor mRNA is preferred.
  • Cypor is cytochrome P450 reductase, an enzyme that transfers electrons from NADPH to P450.
  • the sequence of the short hairpin RNA targeting the Cypor mRNA is not particularly limited and can be appropriately selected from the Cypor mRNA depending on the purpose.
  • the total number of the Cas guide RNA expression units on the vector genome is not particularly limited as long as it is 2 or more, and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 or more. Among these, a total of 2 or more is preferred, a total of 4 or more is more preferred, a total of 6 or more is even more preferred, and a total of 8 or more is particularly preferred.
  • the total number of the short hairpin RNA expression units on the vector genome is not particularly limited as long as it is 2 or more, and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 or more. Among these, a total of 2 or more is preferred, a total of 4 or more is more preferred, a total of 6 or more is even more preferred, and a total of 8 or more is particularly preferred.
  • the arrangement of the Cas guide RNA expression unit and the short hairpin RNA expression unit on the vector genome is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose, so long as there are two or more Cas guide RNA expression units and two or more short hairpin RNA expression units, and they may be arranged together at one site or divided and arranged at two or more sites.
  • the sites on the vector where the Cas guide RNA expression unit and the short hairpin RNA expression unit are placed are not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but it is preferable to place them at one or more sites selected from the group consisting of the E1 region, E3 region, and E4 region of the adenovirus vector.
  • the sites on the vector are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferable that they are divided and placed at two or more sites sandwiching at least a part of the essential region of the adenovirus.
  • the Cas guide RNA expression unit and the short hairpin RNA expression unit are arranged in two or more separate locations, it is preferable that the Cas guide RNA expression unit and the short hairpin RNA expression unit are mounted in two or more separate locations selected from the group consisting of the E1 region, the E3 region, and the E4 region of the adenovirus vector.
  • the total number of Cas guide RNA expression units and short hairpin RNA expression units in one placement site is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or 11 or more. Among these, a total of 2 or more is preferred, a total of 4 or more is more preferred, a total of 6 or more is even more preferred, and a total of 8 or more is particularly preferred.
  • the upper limit of the number of Cas guide RNA expression units (the maximum number of consecutive Cas guide RNA expression units) at one placement site and it can be selected appropriately depending on the purpose, but six is preferable, and eight is more preferable.
  • the lower limit of the number of Cas guide RNA expression units in one site (the minimum number of consecutive Cas guide RNA expression units) and it can be selected appropriately depending on the purpose, but two is preferable.
  • the upper limit of the number of short hairpin RNA expression units in one placement site (the maximum number of consecutive short hairpin RNA expression units) and it can be selected appropriately depending on the purpose, but four is preferable.
  • the lower limit of the number of short hairpin RNA expression units in one site (the minimum number of consecutive short hairpin RNA expression units) and it can be appropriately selected depending on the purpose, but two is preferable.
  • Examples of cases in which the Cas guide RNA expression unit and the short hairpin RNA expression unit are divided and placed in two or three locations are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, they can be placed in the same manner as the above-mentioned Cas guide RNA expression unit.
  • the other components are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the other components may be the same as those described in the above-mentioned section on recombinant adenovirus vectors having a Cas guide RNA expression unit and recombinant adenovirus vectors having a short hairpin RNA expression unit.
  • the adenovirus vector that can be used as the recombinant adenovirus vector having the Cas guide RNA expression unit and the short hairpin RNA expression unit is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the recombinant adenovirus vector of the present invention described above can be preferably used.
  • Test examples of the present invention are described below, but the present invention is not limited to these test examples.
  • Test Example 1 Selection of HPV16 targeting guide RNA
  • gRNA double-nicking guide RNA
  • Figure 1 shows the structure of the HPV16 gene.
  • CB-NC9 adenovirus
  • lentiviral vectors expressing 20 pairs of promising double-nicking gRNAs were constructed.
  • the lentiviruses prepared in 4 above were singly or co-infected into the HPV16-positive cervical cancer cell line SiHa to establish SiHa cells expressing 1 to 5 sets (2 to 10) of gRNAs.
  • the cells prepared in the above item 5 were infected with adenovirus (CB-NC9) to examine the cell proliferation inhibitory effect.
  • CB-NC9 adenovirus
  • gRNA double-nicking guide RNA
  • nicking cutting> In wild-type Cas9, one Cas9 cleaves an on-target site (a desired target site) and an off-target site (upper left and upper right in Figure 2). In cleavage by Cas9 nickase, two nickases nick the adjacent front and back strands at the on-target site (target site) and cleave them (lower left of Figure 2). On the other hand, at off-target sites, only one Cas nickase nicks the nick, so the nick is immediately repaired and no cleavage occurs (lower right of Figure 2). Therefore, double nicking cleavage can be said to be safe.
  • the following 24 gRNA candidates were examined for their growth inhibition activity in SiHa cells by the introduction of a single gRNA-expressing retrovirus and wild-type Cas9.
  • the growth inhibition activity results below show the growth of SiHa cells when mock is taken as 100%.
  • 16_AS507G Target sequence GCAACAAGACATACATCGAC (SEQ ID NO: 8)
  • Cutting efficiency results: ⁇ , ⁇ Antiproliferative activity: 13% SNP: - (17)
  • Antiproliferative activity 12% SNP: -
  • 16_AS810g Target sequence gTCCTAGTGTGCCCATTAAC (SEQ ID NO: 62) Growth inhibition activity: 68% SNP: - (28) 16_AS840g+ Target sequence: gATGGTTTCTGAGAACAGATG (SEQ ID NO: 10) Cutting efficiency results: ⁇ , ⁇ SNP: A4/QG-U/SCC90/SKGIIIb (29) 16_AS841g+ Target sequence: gTATGGTTTCTGAGAACAGAT (SEQ ID NO: 41) Cutting efficiency results: ⁇ , ⁇ SNP: A4/QG-U/SCC90/SKGIIIb (30) 16_AS842g+ Target sequence: gTTATGGTTTCTGAGAACAGA (SEQ ID NO: 42) Cutting efficiency results: ⁇ , ⁇ SNP: A4/QG-U/SCC90/SKGIIIb
  • 16_AS1543G Target sequence GTTGATTTATTACTTTAAA (SEQ ID NO: 6)
  • lentiviral vectors expressing 16 pairs of promising double-nicking gRNAs were prepared as described below.
  • Three entry vectors were constructed to place two gRNA expression units and one drug resistance gene expression unit in a lentiviral vector.
  • Lentiviral vector (CSII-RfA vector) (attR1-ccdB-attR2 destination vector) 2) Sense strand gRNA expression cassette plasmid (attL4-U6-gRNA-attL1 entry vector) 3) Antisense strand gRNA expression cassette plasmid (attR4r-U6-gRNA-attR3r entry vector) 4) Drug resistance gene expression cassette plasmid (attL3-PGK-drug resistance gene-attL2 entry vector)
  • CSII-RfA vector Preparation of lentiviral vector (CSII-RfA vector) (attR1-ccdB-attR2 destination vector)
  • the lentiviral vector (CSII-RfA vector) used in this experiment was prepared by removing the EF promoter of CSII-EF-RfA (RDB04387; https://dnaconda.riken.jp/search/RDB_clone/RDB04/RDB04387.html) developed by Hiroyuki Miyoshi of RIKEN BRC by cleaving it with AgeI (nt 2668 and 3760) and then self-ligating it to prepare the CSII-RfA vector.
  • the CSII-RfA vector has an RfA sequence at the foreign gene insertion site, and an insert can be inserted by the LR recombination reaction of the Gateway system (ThermoFisher Scientific).
  • a total of 16 bases (5'-tggaaaggacgaaaca-3' (SEQ ID NO: 64)) of the 3' end 10 bases of the U6 promoter and 6 bases up to the gRNA sequence were mutated to 5'-atgagaccactcttttc-3' (SEQ ID NO: 65), and then the gRNA scaffold sequence from the U6 promoter was amplified by PCR using primers containing the attB4 sequence and the attB1 sequence, and inserted into pDONR221 P1-P4 (ThermoFisher Scientific) by BP recombination reaction (ThermoFisher Scientific), to create the L1-U6-gRNA-GFP-T2-L4 expression cassette plasmid.
  • U6-gRNA-GFP-T2 The sequence of U6-gRNA-GFP-T2 is as follows. gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacacaaagatattagtacaaatacgtgacgtagaa agtaataatttctttgggtagttttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggcttatatatcttg AT ga G a CC ac TCTTTC ccggagcgcaccatcttctttcagttttttagagctagaaatagcaagtttaaataaggctagtcgt
  • An entry vector plasmid having an L4-U6-gRNA-L1 cassette with a gRNA sequence of interest was prepared by PCR of the L1-U6-gRNA-GFP-T2-L4 expression cassette plasmid using a primer set having the gRNA sequence of interest and mutation by in fusion reaction (TAKARA Bio).
  • the infusion reaction involves adding 2 ⁇ L of 5 ⁇ In-Fusion HD Enzyme Premix (TAKARA In-Fusion HD Cloning Kit, cat#639648) to the linear DNA obtained by PCR (50-100 ng/8 ⁇ L) and incubating for 15 minutes at 50° C. This results in the linear DNA being repaired at the common overlapping sequence portions at both ends to generate circular DNA.
  • a plasmid containing an attL4-attL1 cassette was amplified using a primer set consisting of a target sequence and a primer binding sequence, and circularized by an in-fusion reaction (TAKARA Bio) with a sequence overlapping a new target sequence portion to obtain an attL4-attL1 cassette plasmid containing the new target sequence.
  • TAKARA Bio in-fusion reaction
  • the sequence of the attL4-attL1 cassette in the L1-U6-S893G-L4 cassette plasmid is shown below.
  • the sequence of the cassette was confirmed to be correct by Sanger sequencing using the M13F primer (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO:68)) and the M13R primer (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO:69)).
  • a plasmid containing attR4r-attR3r cassette was amplified by a set of primers consisting of a target sequence and a primer binding sequence, and circularized with a sequence overlapping with a new target sequence portion by in-fusion reaction (TAKARA Bio), to obtain an attR4r-attR3r cassette plasmid containing a new target sequence.
  • In-fusion reaction is added 2 ⁇ L of 5x In-Fusion HD Enzyme Premix (TAKARA In-Fusion HD Cloning Kit, cat # 639648) to the linear DNA obtained by PCR (50-100ng / 8 ⁇ L), and incubated at 50 ° C. for 15 minutes.
  • TAKARA In-Fusion HD Cloning Kit cat # 639648
  • the sequence of the attR3r-attR4r cassette in the R4r-U6-AS859G-R3r cassette plasmid is shown below.
  • the sequence of the cassette was confirmed to be correct by Sanger sequencing using the M13F primer (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO:68)) and the M13R primer (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO:69)).
  • the sequence of the attL3-attL2 cassette is as follows: In the sequence below, a hygromycin resistance gene is described as an example of a drug resistance gene.
  • Preparation of a lentiviral vector expressing a double-nicking gRNA A method for preparing a lentiviral vector expressing a double-nicking gRNA will be described using "H1" (sense strand: 16_S893G, antisense strand: 16_AS859G, see below) as an example.
  • the gRNA expression cassette "L1-U6-16_S893G-L4" targets the sense strand of HPV
  • the gRNA expression cassette "R4r-U6-16_AS859G-R3r” targets the antisense strand of HPV
  • the drug resistance gene expression cassette "L3-PGK-Hyg-L2" were recombined and introduced into a promoterless lentiviral vector (CSII-RfA) using a multisite Gateway LR reaction (ThermoFisher scientific) to produce a lentiviral vector (H1:16S893G-AS859G) expressing two gRNAs and a drug resistance gene.
  • AttR1-ccdB-attR2 ⁇ attL4-U6-gRNA-attL1 ⁇ attR4r-U6-gRNA-attR3r ⁇ attL3-PGK-drug resistance gene-attL2 ⁇ attB1-gRNA-U6-attB4-gRNA-U6-attB3-PGK-drug resistance gene-attB2 (expression vector)
  • Combinations of attR and attL that cause recombination are attR1 and attL1, attL4 and attR4r, attR3r and attL3, and attL2 and attR2.
  • the transcription direction of the drug resistance gene and the transcription direction of the gRNA are arranged in opposite directions.
  • lentiviral vector having two gRNA expression units targeting HPV16 and one drug resistance gene expression unit.
  • the sequences of sublineages (A1, A2, A3, A4, B1, B2, C, D1, D2, D3) of HPV16 variant lineages (A-D) registered with NCBI were aligned with the sequences of HPV16 in HPV16-positive cancer cells such as SiHa, and those containing SNPs within the 18-base core sequence on the 5' side in two or more sublineages were excluded.
  • target sequences The nomenclature of the target sequences is as follows: “16_”: indicates that HPV16 is targeted. “S”: indicates that the sense strand is the target sequence. “AS”: indicates that the antisense strand is the target sequence. “Number”: indicates the position of the putative cleavage end (5'-overhang end) in the HPV16 prototype sequence (GenBank K02718.1). “G”: 20 bases are the target sequence, and the G at the 5' end matches the target sequence. “G+”: 21 bases are the target sequence, and the G at the 5' end matches the target sequence. “g”: 20 bases are the target sequence, and the g at the 5' end does not match the target sequence.
  • g+ 21 bases are the target sequence, and the g at the 5' end does not match the target sequence.
  • gA+ has 22 bases as a target sequence, and the g at the 5' end does not match the target sequence.
  • the established cells were infected with lentiviruses with different drug resistance and then drug selected to establish SiHa cells expressing double-nicking gRNA pairs against HPV16, ranging from one set of two to four sets of eight (some had five sets of ten).
  • N1 represents the case where one pair of gRNAs of N1 described above is used
  • B1Z2 represents the case where a combination of the pair of gRNAs of B1 and Z2 described above (a combination of two pairs) is used
  • H1B1P1 represents the case where a combination of the pair of gRNAs of H1, B1, and P1 described above (a combination of three pairs)
  • H1B1P3Z1 represents the case where a combination of the pair of gRNAs of H1, B1, P3, and Z1 described above (a combination of four pairs) is used.
  • Figure 15 shows a 96-well plate stained with Acid Red.
  • gRNA pairs N3, N5, N6, N7, B1, P1, P3, H1, Z1, and Z2 are preferred.
  • the following combinations of gRNA pairs are preferred: N5 and P3, N5 and Z2, B1 and H2, B1 and Z2, P1 and H1, P1 and Z2, N5, P3 and H1, N5, P3 and Z1, B1, P1 and H1, B1, P3 and H1, B1, H2 and Z1, P3, H1 and Z1, and P3, H2 and Z1.
  • H1 or H2, B1, and P1 or P3 is preferred, and the combination of H1, B1, and P1 is more preferred because H2 has a SNP in sublineage A4, which is common in Japanese people, and P3 has a SNP at the 5' end of sublineages D2 and D3.
  • Z1 or Z2, or N3 or N5 is also preferable as the fourth combination of the above three combinations, and among these, Z2 without SNP is more preferable.
  • B1, B2, P1, P2, P3, H1, H2, and H1 are preferable as gRNA pairs.
  • B1, B2, P1, P2, and H1, which have no SNP in the sub-lineage, are more preferable.
  • H2 has a SNP in sublineage A4 which is common in Japanese people
  • N5 has a SNP in sublineage A5 which is common in Japanese people
  • P3 has SNPs at the 5' ends of sublines D2 and D3, and N1, N3, Z1, and H3 have SNPs in sublineage C, so the combinations of H1 and P1, H1 and P2, H1 and B1, H1 and B2, B1 and P1, B1 and Z2, and P1 and Z2 are more preferred.
  • triple combinations of gRNA pairs the combination of H1, P1, and B1, the combination of H1, P1, and B2, the combination of H1, P2, and B1, and the combination of H1, P2, and B2 are preferred.
  • the combination of H1, P1, B1 and Z2, the combination of H1, P1, B2 and Z2, the combination of H1, P2, B1 and Z2, and the combination of H1, P2, B2 and Z2 are preferred, which are the three combinations of gRNA pairs plus Z2.
  • Test Example 2 Selection of HPV18 targeting guide RNA
  • the outline of this test example is as follows. [1] We investigated 83 gRNA candidates capable of double nicking in the LCR to E1 region including the E6E7 genes. Figure 16 shows the structure of the HPV18 gene. [2] The cleavage efficiency of 19 genes that were initially deemed promising was examined in vitro. [3] Based on the above [2] and the presence or absence of SNP, lentiviral vectors expressing 14 pairs of promising double-nicking gRNAs were constructed.
  • the lentivirus prepared in [3] above was used to infect or co-infect the HPV18-positive cervical cancer cell line HeLa, to establish HeLa cells expressing one to four sets (two to eight) of gRNAs.
  • the cells prepared in [4] above were infected with adenovirus (CB-NC9) to examine the cell proliferation inhibitory effect.
  • gRNA candidates listed above were examined for their cleavage efficiency in a test tube. Specifically, crRNA and tracrRNA having the above-mentioned gRNA sequence were synthesized, and these were mixed with the substrate HPV18 DNA, and the Cas9 protein was added to examine the cleavage efficiency. Note that the cleavage efficiency was intentionally lowered because it is difficult to tell the difference if the cleavage efficiency is too good.
  • the substrate DNA for cleavage was a 2.3 kb fragment obtained by amplifying the HPV18 genome with the following primers: [Primer] HPV18-E6u70L1d17-F-34hnt: ggttgcgccctagtgagtaacaactgtatttgtg (SEQ ID NO: 74) HPV18-E7d84XbaI0-R-32hnt: ccccatttacagtctagacattgaatatgggc (SEQ ID NO: 75)
  • lentiviral vectors expressing 14 pairs of promising double-nicking gRNAs were prepared in the same manner as in Test Example 1.
  • the lentiviral vector prepared has two gRNA expression units targeting HPV18 and one drug resistance gene expression unit, as shown below.
  • the target sequence is 20 bases
  • the 5'-end sequence is G
  • g is added to the 5'-end to make it 21 bases long.
  • 18_S358g when the target sequence is 20 bases long, the 5'-end sequence C is replaced with g, leaving it at 20 bases.
  • target sequences are as follows: “18_”: indicates that HPV18 is targeted. “S”: indicates that the sense strand is the target sequence. “AS”: indicates that the antisense strand is the target sequence. “Number”: indicates the position of the putative cleavage end (5'-overhang end) in the HPV18 prototype sequence (GenBank X05015.1). “G”: 20 bases are the target sequence, and the G at the 5' end matches the target sequence. “G+”: 21 bases are the target sequence, and the G at the 5' end matches the target sequence. “g”: 20 bases are the target sequence, and the g at the 5' end does not match the target sequence.
  • ⁇ Drug resistance gene is G418 resistance gene> (1) N1 gRNA expression cassette 18_S125G+ with the sense strand as the target sequence Target sequence: GCGCGCTTTGAGGATCCAACA (SEQ ID NO: 16) ⁇ gRNA expression cassette with antisense strand as target sequence 18_AS49G+ Target sequence: GTTTTCGGTCCCGACCGTTTT (SEQ ID NO: 17) (2) N2 gRNA expression cassette 18_S125G+ with the sense strand as the target sequence Target sequence: GCGCGCTTTGAGGATCCAACA (SEQ ID NO: 16) ⁇ gRNA expression cassette with antisense strand as target sequence 18_AS65g+ Target sequence: gTCTTTTATATACACCGTTTT (SEQ ID NO: 20)
  • ⁇ Vector containing the Zeocin resistance gene as drug resistance gene Z1 ⁇ gRNA expression cassette with the sense strand as the target sequence 18_S358g Target sequence: gATTATTCAGACTCTGTGTA (SEQ ID NO: 21) ⁇ gRNA expression cassette with antisense strand as target sequence 18_AS291g+ Target sequence: gCATTTATGGCATGCAGCATG (SEQ ID NO: 22)
  • Each type of cell was seeded in 12 wells of a 96-well plate at 1,000 cells/well, and the next day, the cells were infected in triplicate with an adenovirus vector expressing Cas9 nickase (Cas9D10A) at four levels of MOI from 0 to 1,000.
  • H1 was the most effective alone, followed by P3, N1 (N2), P2, B1, and H2 (Z1).
  • N1 and N2 were equally effective when used alone, and also showed good results in combination with B1 and P3.
  • P1 to P6 P1 to P3 were superior to P4 to P6.
  • P1 to P3 P1 was slightly less efficient.
  • P2 and P3 had the same cleavage site and almost the same effect.
  • B1 to B4 B1 and B2 were preferred, with B1 being the most preferred.
  • the combination of N1 and P3, the combination of N2 and P3, the combination of N2 and H2, and the combination of B2 and H2 were highly effective.
  • the combination of N1, B1, and P2, the combination of N1, H1, and Z1, the combination of N2, B1, and P2, the combination of N2, B1, and P3, the combination of B1, P2, and H2, and the combination of B1, P3, and H2 were highly effective.
  • a combination of (i) H1 and (ii) three types selected from the group consisting of P2 or P3, N1 or N2, B1, and Z1 is preferred.
  • the adenovirus vector (Adex vector) used in this experiment was that described in Miyake S, Saito I et al. (PNAS, 93:1320-1324, 1996). Specifically, it has a deletion of base positions 455 to 3,328 in the E1 region (deletion length 2,874 bases) and a deletion of base positions 28,593 to 30,470 in the E3 region (deletion length 1,878 bases). Based on this adenovirus vector, the deletion range of the L4/E3 region was expanded to increase the vector capacity, as described in the section below titled "Extension of L4/E3 deletion with restoration of L4 polyA sequence.”
  • the deletions in the vector commonly used worldwide are from base position 342 to 3,528 in the E1 region (3,187 bases deleted) and from base position 28,133 to 30,818 in the E3 region (2,686 bases deleted).
  • the region used when the adenovirus genome is packaged into particles is from base position 194 to 358, which in Bett AJ et al. is 148 bases shorter than the sequence used in the present invention. Due to this difference, there are seven functional sequences from A1 to E7 (Grable M and Hearing P, J Virol, 66:723-731, 1992), but in Bett et al.
  • the vector of Miyake S et al. lacks the A5, A6, and A7 sequences.
  • the vector of Miyake S et al. used in the present invention has a structural difference in that it retains all seven functional sequences.
  • 25 to 27 are schematic diagrams illustrating the structure of the adenoviral vector carrying the 8-fold guide RNA expression unit used in the experiment.
  • the adenovirus vector used in this experiment was prepared by a method of inserting a gene of interest into a cosmid vector containing the full length of the adenovirus genome, followed by transfection into 293 cells to obtain a recombinant adenovirus vector (full-length DNA transfer method: Fukuda H, Saito I et al., Microbiol Immunol, 50:643-654, 2006).
  • a cosmid containing the full length of the vector genome was transfected into 293 cells in a 96-well plate, and a virus clone was isolated after two weeks.
  • FIG. 25 shows the structure of an adenovirus vector expressing Cas9 nickase from the CB promoter (CB pro).
  • CB pro CB promoter
  • the E1 cloning site near the left end of the viral genome has a Cas9 nickase expression unit that expresses Cas9 nickase from the CB promoter
  • the E4 site has an 8-fold guide RNA expression unit (8gRNA) that expresses 8-fold guide RNA from a truncated U6 promoter.
  • 26 shows the structure of an adenovirus vector expressing Cas9 nickase from the PGK promoter (PGK pro).
  • FIG. 27 shows the structure of a vector that expresses Cas9 nickase from the EF promoter (EFd pro).
  • the E1 cloning site has a Cas9 nickase expression unit that expresses Cas9 nickase from the EF promoter, a quadruple guide RNA expression unit (4gRNA) that expresses a quadruple guide RNA from a shortened U6 promoter inside the Cas9 nickase expression unit, and the E4 site has a quadruple guide RNA expression unit (4gRNA) that expresses a quadruple guide RNA different from the quadruple guide RNA mounted in the E1 site from a shortened U6 promoter. That is, the 8-fold guide RNA expression unit is incorporated in the E1 site and the E4 site in a bisected form.
  • the Cas9 nickase expression unit is integrated facing outward, and all guide RNA expression units are integrated facing left.
  • the promoter and multiple guide units are generally inserted into the E1 region.
  • the E3 region is not used in the present invention because it is not preferable since it is affected by the surrounding adenovirus genes (Suzuki M, Saito I et al., Gene Ther, 1-9, 2015).
  • the E4 region is located at the end of the vector genome, similar to the E1 region, and has the advantage that only the E4 side is affected by adenoviral genes (i.e., the E3 site is affected from both sides or inside).
  • the E4 insertion site was developed by Saito, one of the present inventors (Miyake S, Saito I et al., PNAS, 93:1320-1324, 1996, as mentioned above), and is a unique site that is not used anywhere else in the world.
  • the transcription directions of the three promoters were all used in the outward direction, since at least the E1 region, outward direction hardly induces an immune response (Nakai M, Saito I, et al., Hum Gene Ther, 18:925-936, 2007).
  • the viral genome expands by the size of the E1 gene, and this is used to reduce the generation of RCA.
  • the vector genome is designed to be close to the upper limit of the packaging size of the adenovirus genome, so that the resulting RCA genome exceeds this size.
  • FIG. 28 shows the sequence of bases 27801 to 28200 (SEQ ID NO: 81) in the positioning of adenovirus type 5 as a sequence related to the L4/E3 region of adenovirus, and the amino acid sequence of the protein of the 12.4K gene (SEQ ID NO: 82).
  • the inventors attempted to develop a new vector in which the L4/E3 deletion was expanded more than that of the vector of Bett et al., and succeeded in this ( Figure 28).
  • the 5' end of the deletion was located upstream of the L4 polyA sequence, and this was deleted (bottom row of Figure 28, 3dB and L4 polyA sequence), while the almost full length of the 12.4K gene of unknown function from the start codon to just before the stop codon (bottom row of Figure 28) was preserved.
  • the L4/E3 deletion was similar to that of Bett et al.
  • the reverse primer sequence (SEQ ID NO:83) used for this deletion is shown below.
  • the underlined portion is the BglII sequence added as the 5' end of the primer.
  • Ax3dP-CBNC9 with a 3dP deletion and expressing Cas9 nickase from the CB promoter
  • a vector with the same structure but a 3dB deletion (Ax3dB-CBNC9) were constructed.
  • Ax3dP-HPV8g-CBNC9 ( Figure 25), which expresses Cas9 nickase from the CB promoter and has eight guide units, was created by incorporating eight guide units into this cassette vector Ax3dP-CBNC9.
  • the size of this vector was 37.9 kb, exceeding the upper limit of approximately 37.7 kb. Therefore, this result indicates that the reported upper limit of 37.7 kb may not always be correct.
  • Vectors with PGK and EFd promoters ( Figures 26 and 27) were created by changing the type and position of the promoter of the unit expressing Cas9 nickase based on Ax3dP-CBNC9.
  • the sequence of the Cas9 nickase expression unit that expresses the above-mentioned Cas9 nickase from the CB promoter (SEQ ID NO:84) is in pX335 at https://www.addgene.org/42335/sequences/.
  • SEQ ID NO:84 the 1st to 805th are the CB promoter, the 806th to 5,026th are the Cas nickase, and the 5,027th to 5,249th are polyA (derived from bovine growth hormone).
  • the Cas9 nickase expression unit that expresses the above-mentioned Cas9 nickase from the PGK promoter had the same configuration, except that the CB promoter in SEQ ID NO: 84 was replaced with the PGK promoter of the following sequence (SEQ ID NO: 85), and the poly A was replaced with the poly A (derived from avian ⁇ -globin) of the following sequence (SEQ ID NO: 86).
  • the Cas9 nickase expression unit that expresses the above-mentioned Cas9 nickase from the human EF1 ⁇ promoter (sometimes referred to as the "EF promoter") had the same configuration, except that the CB promoter in SEQ ID NO: 84 was replaced with a shortened EF promoter (SEQ ID NO: 87) (EFd promoter) of the following sequence.
  • sequence of the truncated U6 promoter used in the multiple guide RNA expression unit described above is as follows: CAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACTGTACGTACAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATATCTTGTGGAAAGGACGAGGATCC (SEQ ID NO: 88)
  • Test Example 4 [Effect of integrated adenovirus vector on HPV16-positive cancer cells] Based on the results of the above Test Example 2, an integrated adenovirus vector (Set2-PGK-NC9) was prepared carrying the following gRNA expression cassette (Set2) in a preferred embodiment as 4 sets of 8 gRNAs.
  • the adenovirus vector used was the one shown in FIG.
  • HPV16-positive cervical cancer cell lines SiHa, CaSki, SKBIIIb, QG-H, and QG-U
  • HPV16-positive oropharyngeal cancer cell lines SCC90, VU147T, UM-SCC-47, UM-SCC-104 ⁇ Two lines of normal epithelial cells derived from the cervix: HCK1T, HFF2T
  • Test Example 6 [Performance comparison between Set 2-PGK-NC9 and Set 2-EFd-NC9]
  • an integrated adenovirus vector (Set2-PGK-NC9) carrying 4 sets of 8 gRNAs (Set2) was prepared.
  • an integrated adenovirus vector (Set2-EFd-NC9) carrying 4 sets of 8 gRNAs (Set2) was prepared using the adenovirus vector shown in Figure 27. Note that the gRNAs were divided into E1 and E4, with 4 gRNAs in each.
  • Test Example 8 [Effect of the integrated vector (Set A-EFd-NC9) on HPV16-positive cancer cells]
  • An integrated adenovirus vector (Set A-EFd-NC9) was prepared in the same manner as in Test Example 6, except that 4 sets of 8 gRNAs (P1B1H1Z1, see below, gRNAs were arranged in E1 and E4, with 4 gRNAs in each group) were loaded. The following cell lines were infected with this integrated adenovirus vector, and the proliferation inhibitory effect was examined.
  • the guide RNA expression unit had the following structure: U6 promoter-target base-guide RNA base
  • the sequence of the U6 promoter was as follows: AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAA ATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATAT CTTGTGGAAAGGACGAAACACC (SEQ ID NO: 112)
  • the guide RNA base sequences were as follows: GTTTTAGAGCTAGAAAATAGCAAGTTAAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTG (SEQ ID NO: 113)
  • the target base sequences were as follows: ⁇ 8 consecutive guide RNA expression
  • clones 5 and 6 which seem to be relatively stable with 8 and 12 consecutive units, were selected, respectively, and 293 cells were infected with the virus stock to prepare third passage stocks (3rd) and fourth passage stocks (4th), which were examined in the same manner ( Figures 38-39).
  • 5.5 kb DNA is produced from the genome of a vector in which the 12 consecutive units are completely maintained, but this DNA is not produced from the genome of a vector in which the units are deleted. Therefore, the intensity of the 5.5 kb band is reduced in stocks containing vectors in which the units are deleted.
  • the guide RNA expression unit had the following structure: U6 promoter-target base-guide RNA scaffold
  • the sequence of the U6 promoter was the same as SEQ ID NO: 112, except that the 3' end was GGATCC (BamHI, SEQ ID NO: 156).
  • the sequence of the guide RNA base was sequence number 113, similar to Test Example 10.
  • the target base sequences were as follows: (1) GGCGCCTCCTGAGCACACGGG (SEQ ID NO: 126) (2) GTGATCTGCGATGGCTGCAA (SEQ ID NO: 127) (3) GAAGAAGCTCGAAAACTGGAA (SEQ ID NO: 128) (4) gAGTTGAAGAGCTGCTTACTA (SEQ ID NO: 129) (5) GTGGGGCTTCATCAACGACA (SEQ ID NO: 130) (6) GAGCAAACGACTAGCTGCC (SEQ ID NO: 131) (7) GGGCAAAGTAACCCACATGA (SEQ ID NO: 132) (8) gCAACAAATCAGCTAAACAGC (SEQ ID NO: 133) (9) GTTCAGACACGATGCCCAAC (SEQ ID NO: 134) (10) GCAGCTCAAGCTGAAACTCCAG (SEQ ID NO: 135)
  • Test Example 12 Simultaneous knockout of 5 genes using a vector incorporating 10 guide RNA expression units divided into 2 and 8)
  • a vector was prepared in which two of the 10 guide RNA expression units in Test Example 11 (SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135) were integrated into the E1 site, and eight of them (SEQ ID NO: 126 to SEQ ID NO: 133) were integrated into the E4 site ( Figure 43), and the vector was examined in the same manner as in the case of 10 consecutive units.
  • the 4.3 kb band containing 8 consecutive units was slightly reduced in density compared to the band below it in all six clones ( Figure 44).
  • Test Example 13 Simultaneous knockout of 5 genes using a vector in which 10 guide RNA expression units are divided into 2 and 8)
  • 10 guide RNAs used in Test Example 12 actually have the activity of knocking out genes.
  • the 10 guide RNAs are paired in pairs and are designed to perform double nicking cleavage of 5 genes (p62, NBR1, OPTN, TAX1BP1, NDP52).
  • the vectors used in Test Example 12 which have units divided into 2 and 8, were mixed with a vector expressing Cas9 by the CB promoter (AxCBCas9) or a vector expressing Cas9 nickase (AxCBNC9) (Nakanishi T et al., Sci Rep, 11:3961), co-infected into HepG2 cells, and total cell DNA was extracted 3 days later.
  • the infection conditions for both vectors were a multiplicity of infection (MOI) of 30 or 60.
  • MOI multiplicity of infection
  • a fragment containing the cleavage site was amplified by PCR, and insertions/deletions (indels) that occurred in the target gene were detected by T7E1 assay.
  • 1st and 2nd indicate the results of two independent experiments.
  • Test Example 14 Stability when 12 guide RNA expression units are divided into two groups of 6 and integrated
  • a vector was prepared in which 6 of the 12 guide RNA expression units were integrated into the E1 site and another 6 into the E4 site ( Figure 56).
  • the 2nd passage stock was examined in the same manner as in the 2 and 8 cases, and a clone without deletion was selected to prepare a 3rd passage stock, a 4th passage stock, and a 5th passage stock.
  • the results of digestion with BspEI and NgoMIV are shown in Figures 57 and 58.
  • the 2.7 kb band containing the 6 units of the E4 site was slightly darker in all three lanes than the band derived from the vector backbone below it, indicating that no deletion had occurred.
  • the 6.8 kb band containing these 6 units in the BspEI digestion should be 1.55 times darker than the 4.4 kb band derived from the backbone below it if there was no deletion.
  • the actual density of the 6.8 kb band was sufficiently darker than 1.55 times, and it was thought that even if deletion had occurred, it was small.
  • Test Example 12 when the multiple guide unit was divided into two, one of the units was slightly deleted when it contained eight consecutive units. Considering this result, it was suggested that at least six consecutive units on the vector genome could be deleted without deletion.
  • Test Example 15 Stability of 8 consecutive guide RNA units in an integrated vector using the EF1 ⁇ promoter
  • a unit expressing Cas9 nickase from the CB promoter or PGK promoter is incorporated.
  • Cas9 nickase is expressed from the CB promoter, a small amount of deletion occurs, and when the PGK promoter is used, deletion does not occur much.
  • an integrated vector having a unit (EFdNC9) expressing Cas9 nickase from the shortened EF promoter (SEQ ID NO: 87) (EFd promoter) described above was prepared and used as the Cas9 nickase expression promoter ( Figure 59).
  • the configuration of the guide RNA expression unit was the same as that of Test Example 11, except that the arrangement position and the sequence of the target base were as follows.
  • E4 site (1) GCAACAAGACATACATCGAC (SEQ ID NO: 148) (2) gAACCCAGCTGTAATCATGCA (SEQ ID NO: 149) (3) GAAAAGGTTACAATATTGTA (SEQ ID NO: 150) (4) GCAAGTGTGACTCTACGCTT (SEQ ID NO: 151) E1 site (1) GGATCAGCCATGGTAGATTA (SEQ ID NO: 152) (2) GCAGGTACCAATGGGGAAGA (SEQ ID NO: 153) (3) gACTAAAACTAGTAATGCAA (SEQ ID NO: 154) (4) gACATTTAAAATATTTGTAAG (SEQ ID NO: 155)
  • Test Example 16 Stability when eight guide RNA expression units are divided into two groups of four and integrated into an integrated vector using the EF1 ⁇ promoter
  • a vector was prepared in which four of the eight guide RNA units were integrated into the E1 site together with the nickase expression unit, and the other four were integrated into the E4 site ( Figure 62), and an investigation was carried out using the primary stock ( Figure 63).
  • the eight units were integrated consecutively at one site, so they were included in one band by restriction enzyme cleavage, but in this Test Example 16, they were integrated at two sites, four units each, so they were included in two different bands.
  • shRNA short hairpin RNA
  • shRNA is an approximately 60-base RNA consisting of a 21-base sense strand, an approximately 9-base loop, a 21-base antisense strand, and a transcription termination polyU, which is processed in the cell nucleus to become a single antisense RNA, and suppresses expression or inhibits the proliferation of RNA viruses by pairing with mRNA or RNA virus genomes.
  • clone 5 which showed no deletions, was selected to prepare 3rd passage stocks, 4th passage stocks, and 5th passage stocks, and the results of digestion with SmaI are shown in Figure 67. Neither the 2.4 kb band derived from the E1 site nor the 2.1 kb band derived from the E4 site showed a decrease in intensity compared to the nearby backbone bands. Therefore, it was revealed that by using the multiple shRNA unit 2 division method, the multiple units are extremely stably maintained even in the 5th passage stock.
  • SCC90 cells are cells derived from human tongue cancer that have approximately 300 copies of HPV DNA on their chromosomes, and form tumors in nude mice due to the expression of HPV E6 and E7 genes.
  • xenografts sheets of cells of different species
  • the total amount of vector administered per time was 6 x 1010 pfu, 8 x 1010 pfu, and 1 x 1011 pfu, respectively.
  • the target base sequences of the guide RNA used are SEQ ID NO: 148 to SEQ ID NO: 155.
  • mice on day 41 are shown in Figure 68.
  • the tumor size of all three mice (“AdV-1”, “AdV-2”, and “AdV-3” in Figure 68) was clearly reduced, and a significant tumor growth suppression effect was observed.
  • Figure 69 also shows the results of measuring the tumor size over time.
  • ⁇ represents the results for "AdV-1”
  • ⁇ represents the results for "AdV-2”
  • ⁇ represents the results for "AdV-3”
  • ⁇ represents the results for "PBS”.
  • the tumor size of the mice that received the vector on days 38 and 41 was significantly reduced. From the above, it was demonstrated that the vector, which stably carries eight guide RNA expression units divided into two sets of four, has a significant tumor growth suppression effect.
  • Test Example 19 Structure of a vector used in a treatment experiment of a phenylketonuria model mouse having 8 guide RNA expression units divided into 6 and 2
  • the incidence of phenylketonuria (PKU) in Caucasians is 1 in 9,000, with 150,000 patients in Europe and the United States alone.
  • the mutated enzyme is phenylalanine hydroxylase, and in the model mouse, it is a single base mutation from " TTC " to " TCC ,” in which phenylalanine is mutated to serine.
  • the "g(6+2) vector” is co-infected with the "AxCas9" vector that expresses the original Cas9, and cuts one site with high efficiency without double nicking, resulting in knock-in replacement.
  • guide d which was the most efficient of the five types of guide RNA (guides a-e) described below, was used in all six expression units. Therefore, the base sequences of the six expression units ("six guides") are the same.
  • Truncation 1 gAACGGCGTCAATTGCATGCA (SEQ ID NO: 157)
  • Truncation 2 gCGTCAATTGCATGCAAGGTC (SEQ ID NO: 158)
  • RNA expression units in the "DN(3+1) vector two are located at the E1 site and are guides that cleave the left end of the donor DNA by double nicking (terminal cleavage b and terminal cleavage t).
  • This vector is used in co-infection with the vector "AxNC9" that expresses Cas9 nickase.
  • the length between the 5' ends of the pair of guide RNAs used for double nicking is called the offset, and the three pairs of double nicking are called “double nicking-1,” “double nicking 2,” and “double nicking 0" depending on the difference in offset length.
  • the guide RNAs are also called guides a to e ( Figure 72).
  • the normal sequence shown in FIG. 72 is the base sequence from base 48,424 to base 48,500 of the gene encoding mouse phenylalanine hydroxylase (SEQ ID NO: 178 below).
  • TTCCGCCTCCGTCCTGTTGCTGGCTTACTGTCGTCTCGAGATTTCTTGGGTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTG SEQ ID NO: 1778
  • sequence containing the restriction enzyme (AvrII, StuI) sites shown in FIG. 72 is "CCTAGGAGGCCTAG" (sequence number 179).
  • guide d is the front strand of "double nicking 2", but it is the same as the six guide RNAs that perform single cleavage in the "g(6+2) vector".
  • mice mouse mutant PAH sequence is the sequence on the cell line with the PKU mutation, and is the normal mouse base sequence shown in FIG. 72 with one base of the PKU mutation (T ⁇ C) added to the box. If mouse-derived cells are used as a cell line to examine the knock-in efficiency in vitro, not only will the introduction efficiency of the adenovector, whose host is a human cell, be low, but human cells are also required to compare the knock-in efficiency with future ex vivo therapeutic models.
  • a fragment of more than 4 kb with a PKU mutation in the center and slightly wider upstream and downstream than the donor DNA fragment was prepared from the tissue of a model mouse by PCR (black thick line in "PKU mouse mutant PAH sequence"), and a human HepG2 cell line (PAH/HepG2 cell line) with the fragment in the chromosome was produced.
  • PAH is the name of a gene.
  • the donor DNA held by the therapeutic vector is shown in the middle of Figure 74 ("Donor DNA") with a thick black line. If a normal mouse fragment or the DNA introduced into PAH/HepG2 described above with one mutated base normalized is used as the donor DNA, only one target base is different from the sequence of the PKU model mouse, so it is not easy to examine the knock-in efficiency. In addition, if a normal fragment is used, there is a problem that the target sequence of the multiple guide RNA cuts the donor DNA.
  • the donor DNA was designed so that not only the PKU mutated base is a normal base, but also has four artificial mutations in the donor sequence ("4n” in the central box of "Donor DNA” and “Repair Sequence” in Figure 74, and the four bases C, A, A, A in "Changes in Donor” in the lower right of Figure 72).
  • the artificial mutation to the PKU mutation (the last base c) is shown in a box.
  • amino acid sequence of a PKU mouse (SEQ ID NO: 180), the nucleotide sequence of a PKU mouse (SEQ ID NO: 181), the nucleotide sequence of a donor (SEQ ID NO: 182), and the amino acid sequence of a donor (SEQ ID NO: 183) are shown.
  • AvrII and StuI represent the respective restriction enzyme sites.
  • This artificial mutation has AvrII and StuI cleavage sequences without changing the amino acid sequence, so that cellular DNA successfully repaired by knock-in will have these restriction enzyme sites, facilitating its detection. Furthermore, because these four bases are a specific sequence found only in donor DNA, they have no complementarity with the mouse genome, making it possible to design PCR primers that detect only donor DNA. Furthermore, three of the four bases (C, A, A) overlap with the 20-base target sequence of therapeutic guide RNAs guides c, d, and e, preventing these guide RNAs from cleaving the donor DNA.
  • PAH/HepG2 cell line was infected with "g(6+2) vector” or "DN(3+1) vector” and "Cas9 expression vector” or “Cas9 nickase expression vector” at MOI 10, and after 3 days, total cell DNA was extracted and PCR was performed upstream and downstream of the four-base mutation of the donor.
  • the upstream and downstream results suggest knock-in efficiency by homologous recombination in the L arm region and R arm region, respectively.
  • the base sequences of the PCR primers used are shown below.
  • the upstream reverse primer and downstream forward primer retain the four-base donor DNA-specific artificial base sequence shown in underline and do not pair with mouse DNA.
  • Upstream primer 140F ACAATATGAACCAACAAGTAACCTCC (SEQ ID NO: 166)
  • Upstream primer 115R CGGAAGGC T AGGCC TCC TAG ( SEQ ID NO: 167)
  • Downstream primer 113F GAGATTTCCT AGGAGGCCT A (SEQ ID NO : 168)
  • Downstream primer 143R CCATGATCCCAGCTAGCCATCTGTG (SEQ ID NO: 169)
  • abnormal three-dimensional structures were shown in the R-arm region, such as the inability to be cut with a restriction enzyme, the inability of the downstream primer 143R to function in the next experiment, and the presence of single-stranded DNA suggested in another experiment, which may have led to a decrease in the knock-in efficiency of the downstream region.
  • StuI (AGGCCT (SEQ ID NO: 184) is included in the sequences of primers 115R and 113R in the lower part of FIG. 74, and cleaves the full-length PCR fragment at this position.
  • primer 193R was set outside it and used (lower part of FIG. 74). The results are shown in FIG. 77. The base sequence of primer 193R is also shown below.
  • Downstream primer 193R CACAGGACAGCCTCATAGCTTGTCC (SEQ ID NO: 170)
  • StuI is introduced by knock-in.
  • the efficiency was slightly increased when vanillin, L755507, and SCR7, which are non-homologous inhibitors or homologous recombination promoters, were used ( Figures 78-80).
  • Test Example 23 In vivo knock-in efficiency of knock-in vector for treating PKU and reduction in blood phenylalanine level
  • the vector was administered at 4 x 108 pfu/mouse at birth and 4 x 108 pfu/mouse at 8 weeks, and 100 mg/kg vanillin was continuously administered from the 8th week onwards.
  • Blood phenylalanine concentrations were measured using a Sigma kit 6 weeks (first dose only) and 13 weeks after administration ( Figures 83 and 84). Blood phenylalanine concentrations were slightly lower than in control mice at 6 weeks, and had dropped by up to approximately 30% at 13 weeks. These results suggest the usefulness of two doses. However, although the coat color of c57BL/6 mice is gray in PKU due to a decrease in melanin, no change in coat color was observed throughout the entire process.
  • This donor DNA consists of a Pah normal gene expression unit (2.3 kb) or a GFP expression unit (1.8 kb) (upper left row of FIG. 89) sandwiched between a right arm DNA of 1.7 kb and a left arm DNA of 1.9 kb (center left row of FIG. 89), and two shRNA expression units targeting the mouse Cypor gene (two diamonds ( ⁇ ) in the middle left row of FIG. 89). These were incorporated into the E1 site of the vector. The total length of both arms is very large at 3.6 kb, which is unparalleled in previous vectors other than the point mutation repair experiment (total 4 kb) already mentioned.
  • the length of the unit incorporated by knock-in was 2.3 kb and 1.8 kb, respectively, but it was expected that knock-in incorporating such a long DNA would be very difficult.
  • the shRNA targeting the Cypor gene was the same as that used in the in vivo selection method mediated by acetaminophen (Tiyaboonchai A, Grompe M et al., Nat Commun, 13:7391, 2022).
  • Two guide RNA expression units targeting safe harbor regions for knock-in are integrated into the E4 site of the vector (two boxes on the right side of Figure 89).
  • the same target sequence (20 bases) is integrated into the right end of the donor DNA, and the donor DNA is cleaved at this position (scissors in the center of Figure 89), increasing the knock-in efficiency.
  • the target base sequences of the guide RNAs are shown below.
  • Guide RNAs targeting safe harbor regions and donor DNA ends GACTGGAGTTGCAGATCACG (sequence number 171).
  • Test Example 25 Stability of two shRNA expression units integrated into the E1 site and two guide RNA expression units integrated into the E4 site
  • This vector has a total of four U6 promoter expression units, two shRNA expression units and two guide RNA expression units, and whether these units are maintained without deletion on the vector genome was examined in the same manner as in Figure 41 of Test Example 11 ( Figure 90 ("Pah (2+2)" vector) and Figure 91 ("GFP (2+2)” vector)). As a result, no loss of units was detected in any of the six clones in either vector, and the four units were stably maintained.
  • this vector is a knockdown/knock-in vector (KD/KI multi-unit vector) carrying both multiple shRNA expression units and multiple guide RNA expression units. No vectors with a structure having multiple shRNA expression units and multiple guide RNA expression units have been reported so far. In general terms, if gene DNA can be knocked out and mRNA knocked down at the same time to block gene expression, additive or synergistic effects can be expected by simultaneously blocking expression using different mechanisms.
  • a single vector can perform a combination of knocking out or knocking in genes using guide RNA while selectively growing cells in which genome editing has been performed by simultaneous expression of Cypor shRNA, efficient genome editing can be expected. This is difficult to do with AAV vectors due to size restrictions.
  • the activity of the multiple guide RNA expressed by this vector is evident from the knock-in that occurs.
  • Hepa1-6 cells were infected with the Pah (2+2) vector, the GFP (2+2) vector, or the 1w1 vector without an expression unit together with the Cas9 expression vector at an MOI of 30, and total cellular RNA was extracted three days later.
  • cDNA was prepared using 2 ⁇ g of this RNA by the random primer method, and the expressed Cypor mRNA was quantified. The results are shown in Figure 92.
  • the amount of detected Cypor mRNA was reduced to 4% for the Pah (2+2) vector and 3% for the GFP (2+2) vector, compared to infection with the control 1w1 vector.
  • the Pah (2+2) vector was 99% of the control
  • the GFP (2+2) vector was 80% of the control, showing no significant difference.
  • the shRNA used in this experiment and the target base sequence of the primer used for detection are shown below.
  • the underlined parts of the shRNA sequence indicate the front and back strands of the 21 bases of the shRNA target.
  • the non-underlined part between the front and back strands is a loop sequence, and the seven A's at the end are sequences that code for a termination poly U.
  • Cypor shRNA 1 GAAGAAGTGTCTCTATTCAGC TTCAAGAACGCTGAATAGAGACACTTCTTC AAAAAA (SEQ ID NO: 172)
  • Cypor shRNA 2 GAACATTATTGTATTCTATGGG TTCAAGAAAC CCATAGAAATACAATAATGTTC AAAAAA (SEQ ID NO: 173)
  • Cypor mRNA detection primer 268-F GGGACTCTCACGAAGACAACCAGTGCC (SEQ ID NO: 174)
  • Cypor mRNA detection primer 269-R CCACGTGATCTCCAGATTCATACCTG (SEQ ID NO: 175)
  • TFRC mRNA detection primer 270-F ATGATGGATCAAGCCAGATCAGC (SEQ ID NO: 176)
  • TFRC mRNA detection primer 271-R TGTATGTATTCTGGCTCAGCTGC (SEQ ID NO: 177)
  • Figure 93 shows the structures of the mouse genome of the safe harbor region (Rosa26 region) before knock-in (top row of Figure 93), the donor DNA on the knock-in vector (middle row of Figure 93), and the donor DNA on the mouse genome after knock-in (bottom row of Figure 93).
  • Hepa1-6 a mouse liver-derived cell line
  • the Pah(2+2) vector or the GFP(2+2) vector together with the Cas9 expression vector AxCBCas9 at an MOI of 100
  • total cell DNA was extracted and subjected to 35 cycles of PCR using the 277F and 279R primers shown in Figure 93.
  • These primers are located outside the donor DNA sequence, and generate a band of 6.9 kb when knock-in is performed with the Pah(2+2) vector, 6.4 kb when knock-in is performed with the GFP(2+2) vector, and 3.8 kb when knock-in is not performed.
  • the results are shown in Figure 94.
  • the highest efficiency in the in vitro knock-in experiment of point mutation repair of the Pah gene was in the 3% range, but the total arm length was about 4 kb in the point mutation repair of the Pah gene region and about 3.6 kb in the knock-in of the mouse safe harbor region in this experiment, so it was actually slightly shorter in this experiment.
  • This high efficiency is difficult to explain only by the effect of the method of cutting the ends of the donor DNA. Rather, it was thought that in the point mutation repair experiment, it was more likely that the efficiency was reduced due to a sequence that generates an abnormal secondary structure downstream of the target mutation site.

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Abstract

ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子とを含み、前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子が、特定のＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア又はペアの組合せを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。

Description

ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物、及び組換えアデノウイルスベクター
　本発明は、ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物、及び組換えアデノウイルスベクターに関する。
　世界の全がんの新規罹患者数の約４．５％は、高リスク型ヒトパピローマウイルス（ＨＲ－ＨＰＶ）感染が原因である。子宮頸がんは、年間約５０万人が罹患し２７万人が死亡している。また、中咽頭がんは、年間約１０万人（約４０％はＨＰＶ陽性）が罹患し、５万人が死亡している。
　子宮頸がんやその前駆病変である子宮頸部異形成の発症年齢は若年化しており、妊孕性が温存できる治療法が求められている。また、中咽頭がんは、嚥下・摂食・構音障害などにより手術後のＱＯＬの維持が極めて困難であるため、非侵襲的な治療法の開発が求められている。
　原核生物の有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、遺伝子配列を効率よく書き換えるゲノム編集技術として、がんや遺伝病の治療などへの臨床応用が期待されている。基本的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡ二本鎖を切断するＣａｓ９タンパク質と、標的ゲノム上の位置特異性を決定するＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びこれと一部相補性を有し、Ｃａｓ９タンパク質への結合の足場となる活性化ＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とから構成される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡからなるガイドＲＮＡは、これらを融合した単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ）として供給することも可能である。そして、当該ガイドＲＮＡは、これをコードするＤＮＡを含む適当なベクターを用いて、標的細胞内で発現することができる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは部位特異的なゲノム切断をもたらすものの、その精度は完全ではなく、本来意図したゲノム領域以外の位置でゲノムを切断（オフターゲット切断）することがあり、当該切断によるオフターゲット変異が生じる。ヒトのゲノムは３０００Ｍ塩基程度の巨大なサイズを有するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをそのままヒトのゲノム編集治療に適用すると、標的以外の部位を数百カ所で切断する可能性があるため、治療方法として実用化することができない。
　これまで、Ｃａｓ９タンパク質のオフターゲット変異を抑制するために様々な開発が行われてきた。例えば、ＤＮＡの一方の鎖のみを切断する（ニックを入れる）Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｎｉｃｋａｓｅ）用い、近接する位置（例えば２個のガイドＲＮＡの５’端から３０塩基対程度以内）で、２本鎖ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖にニック（一本鎖切断）を生じることにより、これら２つの位置でニックが形成された時に初めて当該部位でゲノムが切断されるように構成することで（ダブルニッキングシステム）、オフターゲット変異の頻度を大幅に低下させる試みがなされている。
　ここで、ダブルニッキングシステムでは、ゲノム上に一カ所のＤＮＡ２重鎖切断部位を作成するために、２個のガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡペア）を用いる必要があり、ゲノムから１つのＤＮＡ領域をその両端を切断して欠失させるためには、２つのガイドＲＮＡペア、すなわち４個のガイドＲＮＡが必要となる。しかしながら、単一の核酸ベクターから複数のガイドＲＮＡを同時に発現させることは困難であることが知られている。
　これまでに、単一の核酸ベクターから複数のガイドＲＮＡを同時に発現させる技術として、アデノウイルスベクターを用いた技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
　前記提案の技術によれば、複数のガイドＲＮＡを同時に発現することができる。一方で、ガイドＲＮＡの数を多くすると、アデノウイルスの調製の段階で欠失が生じてしまうこともあり、ガイドＲＮＡの数を多くした場合でも欠失を抑制することができる技術の開発が強く求められている。
国際公開第２０２０／０６７００４号
　本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変に対し、優れた治療効果を奏するＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物、及び遺伝子治療等に用いられる、より優れた組換えアデノウイルスベクターを提供することを目的とする。
　本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子とを含み、
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子が、下記（１）～（３３）から選択されるＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア又はペアの組合せを含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である：
（１）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（３）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（４）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（５）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（６）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（７）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（８）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（９）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１０）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１１）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１２）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１３）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１４）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１５）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１６）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１７）　配列番号２３で表される配列若しくは配列番号２３で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２４で表される配列若しくは配列番号２４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１８）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（１９）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２０）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２１）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２２）　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２３）　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２４）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア；
（２５）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア；
（２６）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア；
（２７）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２８）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（２９）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（３０）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（３１）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（３２）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
（３３）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ。
　＜２＞　前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子及び前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子が、核酸ベクターに搭載されている前記＜１＞に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜３＞　前記核酸ベクターが、組換えアデノウイルスベクター又は組換えレンチウイルスベクターである前記＜２＞に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜４＞　前記組換えアデノウイルスベクターが、Ｌ４／Ｅ３領域において、１２．４Ｋ遺伝子配列を欠失し、かつＬ４ポリＡ領域配列を有する組換えアデノウイルスベクターである前記＜３＞に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜５＞　ベクターゲノム上で合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して有する前記＜４＞に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜６＞　ベクターゲノム上で合計６個以上のＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して有する前記＜５＞に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜７＞　ベクターゲノム上で合計８個以上のＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して有する前記＜５＞に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜８＞　ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子の最多の連続数が６個である前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜９＞　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子が、配列番号８７で表される短縮されたＥＦプロモーターの下流に位置する前記＜２＞から＜８＞のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜１０＞　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子と、前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子とを同一ベクター上に有する前記＜２＞から＜９＞のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜１１＞　前記核酸ベクターが組換えアデノウイルスベクターであり、
　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子が、前記アデノウイルスベクターのＥ４領域に搭載されている前記＜４＞から＜１０＞のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物である。
　＜１２＞　Ｌ４／Ｅ３領域において、１２．４Ｋ遺伝子配列を欠失し、かつＬ４ポリＡ領域配列を有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１３＞　Ｌ４／Ｅ３領域において、アデノウイルス５型の位置付けで、第２７，８６４番塩基～第２８，１３７番塩基、及び第２８，２００番塩基以降が欠失している前記＜１２＞に記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１４＞　ベクターゲノム上で合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１５＞　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されている前記＜１４＞に記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１６＞　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されている前記＜１４＞から＜１５＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１７＞　ベクターゲノム上で合計６個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する前記＜１４＞から＜１６＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１８＞　ベクターゲノム上で合計８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する前記＜１４＞から＜１７＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜１９＞　ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数が６個である前記＜１４＞から＜１８＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２０＞　Ｃａｓタンパク質発現ユニットを有する前記＜１４＞から＜１９＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２１＞　組換えアデノウイルスベクターが前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである前記＜１４＞から＜２０＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２２＞　ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する前記＜１４＞から＜２１＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２３＞　ベクターゲノム上で合計６個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２４＞　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されている前記＜２３＞に記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２５＞　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットが、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されている前記＜２３＞から＜２４＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２６＞　ベクターゲノム上で合計８個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する前記＜２３＞から＜２５＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２７＞　ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数が４個である前記＜２３＞から＜２６＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２８＞　組換えアデノウイルスベクターが前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである前記＜２３＞から＜２７＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜２９＞　ベクターゲノム上で、２個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、２個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターである。
　＜３０＞　ＣａｓガイドＲＮＡの標的がセーフハーバー領域であり、ショートヘアピンＲＮＡの標的がＣｙｐｏｒ　ｍＲＮＡである前記＜２９＞に記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　＜３１＞　組換えアデノウイルスベクターが前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである前記＜２９＞から＜３０＞のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである。
　本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変に対し、優れた治療効果を奏するＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物、及び遺伝子治療等に用いられる、より優れた組換えアデノウイルスベクターを提供することができる。
図１は、ＨＰＶ１６の遺伝子の構造を示す模式図である。 図２は、ダブルニッキングを説明するための図である。 図３は、試験例１におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図４は、試験例１におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図５は、試験例１におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図６は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：１組２個（１ペア））。 図７は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：２組４個（２ペアの組合せ））。 図８は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：３組６個（３ペアの組合せ））。 図９は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：４組８個（４ペアの組合せ））。 図１０は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：４組８個（４ペアの組合せ））。 図１１は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：１組２個（１ペア））。 図１２は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：１組２個（１ペア）又は２組４個（２ペアの組合せ））。 図１３は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：１組２個（１ペア）又は２組４個（２ペアの組合せ））。 図１４は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：１組２個（１ペア）又は２組４個（２ペアの組合せ） 図１５は、試験例１におけるＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（Ａｃｉｄ　Ｒｅｄで染色した９６ウェルプレート）。 図１６は、ＨＰＶ１８の遺伝子の構造を示す模式図である。 図１７は、試験例２におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図１８は、試験例２におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図１９は、試験例２におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図２０は、試験例２におけるｇＲＮＡ候補の試験管内における切断効率を調べた結果を示す図である。 図２１は、試験例２におけるＨＰＶ１８（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：１組２個（１ペア））。 図２２は、試験例２におけるＨＰＶ１８（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：２組４個（２ペアの組合せ））。 図２３は、試験例２におけるＨＰＶ１８（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：３組６個（３ペアの組合せ））。 図２４は、試験例２におけるＨＰＶ１８（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討の結果を示す図である（ｇＲＮＡ：４組８個（４ペアの組合せ））。 図２５は、実験に用いた８重ガイドＲＮＡ発現ユニット搭載アデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図２６は、実験に用いた８重ガイドＲＮＡ発現ユニット搭載アデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図２７は、実験に用いた８重ガイドＲＮＡ発現ユニット搭載アデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図２８は、Ｌ４ポリＡ配列を回復したＬ４／Ｅ３欠失の延長を説明するための図である。 図２９は、試験例４の結果を示す図である。 図３０は、試験例５の結果を示す図である。 図３１は、試験例６の結果を示す図である。 図３２は、試験例７の結果を示す図である。 図３３は、試験例８の結果を示す図である。 図３４は、試験例１０で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図３５は、試験例１０で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図３６は、試験例１０の結果を示す図である。 図３７は、試験例１０の結果を示す図である。 図３８は、試験例１０の結果を示す図である。 図３９は、試験例１０の結果を示す図である。 図４０は、試験例１１で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図４１は、試験例１１の結果を示す図である。 図４２は、試験例１１の結果を示す図である。 図４３は、試験例１２で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図４４は、試験例１２の結果を示す図である。 図４５は、試験例１２の結果を示す図である。 図４６は、試験例１３の結果を示す図である。 図４７は、試験例１３の結果を示す図である。 図４８は、試験例１３の結果を示す図である。 図４９は、試験例１３の結果を示す図である。 図５０は、試験例１３の結果を示す図である。 図５１は、試験例１３の結果を示す図である。 図５２は、試験例１３の結果を示す図である。 図５３は、試験例１３の結果を示す図である。 図５４は、試験例１３の結果を示す図である。 図５５は、試験例１３の結果を示す図である。 図５６は、試験例１４で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図５７は、試験例１４の結果を示す図である。 図５８は、試験例１４の結果を示す図である。 図５９は、試験例１５で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図６０は、試験例１５の結果を示す図である。 図６１は、試験例１５の結果を示す図である。 図６２は、試験例１６で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図６３は、試験例１６の結果を示す図である。 図６４は、試験例１６の結果を示す図である。 図６５は、試験例１７で用いたアデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。 図６６は、試験例１７の結果を示す図である。 図６７は、試験例１７の結果を示す図である。 図６８は、試験例１８におけるマウスの状態を示す図である。 図６９は、試験例１８において、腫瘍の大きさを経時的に測定した結果を示す図である。 図７０は、試験例１９で用いたノックインベクターの模式図である。 図７１は、試験例１９で用いたノックインベクターの模式図である。 図７２は、マウスのフェニルアラニン水酸化酵素をコードする遺伝子を説明するための模式図である。 図７３は、試験例２０の結果を示す図である。 図７４は、試験例２１の実験の概略を説明するための図である。 図７５は、試験例２１におけるドナーＤＮＡを説明するための図である。 図７６は、試験例２１におけるＰＣＲの結果を示す図である。 図７７は、試験例２２の結果を示す図である。 図７８は、試験例２２の結果を示す図である。 図７９は、試験例２２の結果を示す図である。 図８０は、試験例２２の結果を示す図である。 図８１は、試験例２２の結果を示す図である。 図８２は、試験例２３の実験の概略を説明するための図である。 図８３は、試験例２３における６週目の血中フェニルアラニン濃度を測定した結果を示す図である。 図８４は、試験例２３における１３週目の血中フェニルアラニン濃度を測定した結果を示す図である。 図８５は、試験例２３におけるノックイン効率検討を行なった結果を示す図である。 図８６は、試験例２３におけるノックイン効率検討を行なった結果を示す図である。 図８７は、試験例２３におけるＴ７Ｅ１アッセイでミスマッチを検出した結果を示す図である。 図８８は、点変異修復とｃＤＮＡノックインとを説明するための模式図である。 図８９は、試験例２４で用いたベクターを説明するための模式図である。 図９０は、試験例２５の結果を示す図である。 図９１は、試験例２５の結果を示す図である。 図９２は、試験例２６の結果を示す図である。 図９３は、試験例２７におけるセーフハーバー領域、ドナーＤＮＡを説明するための模式図である。 図９４は、試験例２７におけるＰＣＲの結果を示す図である。 図９５は、試験例２７におけるＰＣＲ　ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断した結果を示す図である。
（ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物）
　本発明のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物は、ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれらをコードする核酸分子と、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
　前記ＨＰＶ陽性がんとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、子宮頸がん、中咽頭がんなどが挙げられる。
　前記ＨＰＶ陽性前がん病変としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、子宮頸部異形成などが挙げられる。
　前記ＨＰＶの型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８などが挙げられる。
＜ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子＞
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子は、下記（１）～（３３）から選択されるＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア又はペアの組合せを含む。前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子は、下記（１）～（３３）から選択されるＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子の組合せのみからなるものであってもよいし、更に他のＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子を含んでもよい。
　下記（１）から（１３）、（２４）から（３３）は、ＨＰＶ１６に対して好適に用いることができる。
（１）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（３）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（４）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（５）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（６）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（７）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（８）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（９）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１０）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１１）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１２）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１３）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２４）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア
（２５）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア
（２６）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア
（２７）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２８）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２９）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（３０）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（３１）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（３２）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（３３）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
　下記（１４）から（２３）は、ＨＰＶ１８に対して好適に用いることができる。
（１４）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１５）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１６）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１７）　配列番号２３で表される配列若しくは配列番号２３で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２４で表される配列若しくは配列番号２４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１８）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（１９）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２０）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２１）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２２）　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
（２３）　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子を用いることにより、ダブルニッキング法を用いた切断を行い、ＨＰＶゲノムのＥ６及びＥ７領域を安全かつ完全に破壊することができ、ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変を治療することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子は、ＲＮＡの態様であってもよいし、ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子の態様であってもよいが、ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子、特にＤＮＡの態様が好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子＞
　前記Ｃａｓニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子としては、特に制限はなく、公知のＣａｓニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子を用いることができる。
　前記Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子は、タンパク質の態様であってもよいし、Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子の態様であってもよいが、Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子の態様が好ましい。
　前記Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子及び前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子は、核酸ベクターに搭載されていることが好ましい。前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子及び前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子は、同一の核酸ベクターに搭載されていてもよいし、異なる核酸ベクターに搭載されていてもよいが、同一の核酸ベクターに搭載されていることが好ましい。
　前記核酸ベクターとは、外来遺伝子等を標的細胞内に送達するために用いられる、核酸からなる分子を意味する。前記核酸ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ＤＮＡウイルスベクターやＲＮＡウイルスベクター等のウイルスベクターなどが挙げられる。また、非ウイルスベクター系では、脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＬＮＰ）、エレクトロポレーションなどを用いる方法も挙げられる。前記ウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、組換えバキュロウイルスベクター、組換えセンダイウイルスベクター、組換えワクシニアウイルスベクター、組換えヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。これらの中でも、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターが好ましい。
　前記組換えアデノウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する本発明の組換えアデノウイルスベクターが好ましい。
　前記組換えアデノウイルスベクター上での前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子の配置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１カ所の部位にすべて配置してもよいし、２カ所以上の部位に分割して配置してもよい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を合計４個以上用いる場合には、前記組換えアデノウイルスベクター上で２カ所以上の部位に分割して配置することが好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して配置する場合には、後述する本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターにおけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと同様に配置することが好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子は、後述する本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターにおけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと同様に、プロモーターなどその発現を調節する発現調節領域等と共に用いることができる。
　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子は、後述する本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターにおけるＣａｓタンパク質発現ユニットと同様に、プロモーター、ポリＡ等と共に用いることができる。
　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子は、後述する本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターにおけるＣａｓタンパク質発現ユニットと同様に配置することが好ましい。
　前記核酸ベクターの製造方法としては、特に制限はなく、当業者が通常行う方法によって製造することができる。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容される担体などが挙げられる。
　薬学的に許容される担体とは、作用物質（Ｃａｓニッカーゼ、ＣａｓガイドＲＮＡなど）の細胞、生物体、又は対象への投与を助ける物質を意味する。
　前記薬学的に許容される担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸リンゲル液、規定のスクロース、規定のグルコース、結合剤、増量剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、甘味剤、香料、着色剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記その他の成分のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、局所的接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内、又は皮下の投与などが挙げられる。投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非経口、経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、又は経皮）を含む任意の経路とすることができる。前記非経口投与としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内などが挙げられる。送達の他の様式には、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられるが、それらに限定されない。
　本発明において、「有効量」又は「十分な量」は、有益な、又は所望の結果をもたらすのに十分である作用物質（例えば、Ｃａｓニッカーゼ等のＣａｓタンパク質、ＣａｓガイドＲＮＡなど）の量を指す。治療的有効量は、処置されている対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などの１つ又は複数に依存して変わり得、それは、当業者により容易に決定することができる。特定の量は、選択された特定の作用物質、標的細胞型、対象における標的細胞の位置、従われるべき投与計画、それが他の作用物質と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、及びそれが運ばれる物理的送達系の１つ又は複数に依存して変わり得る。
　本発明は、本発明のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物を対象へ投与することを特徴とするゲノム編集による治療方法（遺伝子治療方法）、又は後述する本発明の組換えアデノウイルスベクター、本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターを用いるゲノム編集による治療方法（遺伝子治療方法）にも関する。
（組換えアデノウイルスベクター）
　本発明において、「組換えアデノウイルスベクター」（「アデノウイルスベクター」と称することもある。）とは、アデノウイルス固有の塩基配列とは異なる塩基配列をそのゲノム中に含有するアデノウイルスのことをいう。
　前記組換えアデノウイルスベクターの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒト由来のアデノウイルスであることが好ましい。ヒト由来のアデノウイルスにおいては、Ｃ型に分類される２型又は５型がより好ましい。
　本発明の組換えアデノウイルスベクターは、Ｌ４／Ｅ３領域において、１２．４Ｋ遺伝子配列を欠失し、かつＬ４ポリＡ領域配列を有する新規の組換えアデノウイルスベクターである。前記組換えアデノウイルスベクターは、バックボーンを改変し、より長い核酸領域をペイロードして運搬することが可能である。
　前記組換えアデノウイルスベクターは、Ｌ４／Ｅ３領域において、アデノウイルス５型の位置付けで、第２７，８６４番塩基～第２８，１３７番塩基、及び第２８，２００番塩基以降が欠失しているものであることが好ましい。
　前記組換えアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域において、アデノウイルス５型の位置付けで、ゲノム左端から第３５８番塩基までの領域をすべて含むものであることが好ましい。
　前記組換えアデノウイルスベクターの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができる。例えば、既存のアデノウイルスベクターをベースとして、目的とする配列の欠失や挿入等を当業者が通常用いる標準的な遺伝子組み換え技術を用いて導入することにより製造することができる。
　前記既存のアデノウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｍｉｙａｋｅ　Ｓ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ（ＰＮＡＳ，　９３：１３２０－１３２４，　１９９６）に記載されているアデノウイルスベクターが好ましい。前記Ｍｉｙａｋｅ　Ｓ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌに記載のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域に第４５５番塩基～第３，３２８番塩基の欠失と、Ｅ３領域に第２８，５９３番塩基～第３０，４７０番塩基の欠失とを有しており、また、Ｅ４領域に外来ＤＮＡを挿入する部位（クローン化部位）を有している。
　前記組換えアデノウイルスベクターは、例えばＡｄ５アデノウイルスベクターと通常組み合わせて使用される２９３細胞などを用いて増幅させることができる。
　前記組換えアデノウイルスベクターは、ヒトの治療用遺伝子、ＧＦＰ遺伝子等のいわゆるレポーター遺伝子、リコンビナーゼ等のタンパク質をコードする遺伝子、プロモーターやポリＡ配列などの調節遺伝子、また何ら機能を有さない塩基配列などを搭載することができる。
　前記組換えアデノウイルスベクターに搭載する遺伝子等の挿入位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｅ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域などが挙げられる。前記遺伝子等の挿入は、１カ所に挿入してもよいし、２カ所以上に挿入してもよい。
　前記組換えアデノウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集等に好適に用いることができる。
　本発明において、「ゲノム編集」は、１つ又は複数のヌクレアーゼ及び／又はニッカーゼを用いて、ＤＮＡが、標的ＤＮＡ、例えば、細胞のゲノムから挿入、置換、又は除去される一連の遺伝子操作を意味する。ヌクレアーゼは、ゲノムにおいて所望の位置に、特異的な二本鎖切断を生じさせ、細胞の内因性機構を利用して、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、引き起こされた切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノムにおいて所望の位置に特異的な一本鎖切断を生じさせる。ある態様において、２つのニッカーゼは、標的ＤＮＡの向かい合わせのストランドに２個の一本鎖切断を生じさせるために用いることができ、それにより、平滑又は突出末端を生み出す。標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するために任意の適切なヌクレアーゼを導入することができ、それらには、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンド－又はエキソ－ヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの断片、及びそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
　本発明において、「ゲノム切断」又は「ゲノムの切断」とは、上述のゲノム編集に伴って、ゲノムを構成する２本鎖核酸の両方の鎖が切断されることを意味する。当該２本鎖核酸の切断は、センス鎖とアンチセンス鎖の互いに対応する塩基対での切断により、平滑末端を生じるものでもよいし、センス鎖とアンチセンス鎖が近接する異なる位置で切断されることにより、突出末端を生じるものであってもよい。
　本発明において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、原核生物が有する免疫機構であるＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔ）核酸とＣａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）を利用したシステムを意味する。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」はクラス１とクラス２に分類され、クラス２の「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」はさらにＩＩ型、Ｖ型、ＶＩ型に分類される（Ｙａｍａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，２０１７，Ｖｏｌ．６７，ｐｐ．６３３－６４５）。
　ＩＩ型「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」に分類される、Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９を利用するシステムは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質と、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びこれと部分的に相補的であり、Ｃａｓ９タンパク質への結合の足場となるトランス作動性ＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を利用する。上記ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、融合した単一のＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ）として供給されてもよいし、別々のＲＮＡ分子（「非単一ガイドＲＮＡ」と称することがある）として供給されてもよい。一つの態様において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」は標的細胞に対して、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡを発現するＤＮＡ断片として供給される。また、一つの態様において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片及び単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ断片として供給される。一つの態様において、これらのＤＮＡ断片は、ウイルスベクターを用いて標的細胞に供給される。これらのＤＮＡ断片は、単一のウイルスベクターあるいは、別々のウイルスベクターにより標的細胞に供給され得る。なお、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができ、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ社製のプラスミド（ｐＸ２６０）などを適宜選択することができる。
　前記組換えアデノウイルスベクターは、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニット、Ｃａｓタンパク質発現ユニット、及びドナーＤＮＡ発現ユニットからなる群から選択される１種以上を有する組換えアデノウイルスベクターに好適に用いることができる。
（ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクター）
　本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、少なくともベクターゲノム上で合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有し、必要に応じて更にその他の構成を有する。
　ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上に分割して組み込むことにより、８個以上のユニットを含む場合でも、その欠失を防ぐことができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、動物細胞内で当該ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを安定的に保持することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集等に好適に用いることができる。
＜ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット＞
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット（以下、以下、「ガイドＲＮＡ発現ユニット」と称することがある。）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用されるＣａｓガイドＲＮＡ（「ガイドＲＮＡ」と称することもある。）を発現するためのＤＮＡ構成単位を意味する。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットは、ＣａｓガイドＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列を含むものである。
　前記「ＣａｓガイドＲＮＡ」の態様としては、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを融合した単一ガイドＲＮＡを用いる「単一ＣａｓガイドＲＮＡ」の態様、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々とした非単一ガイドＲＮＡを用いる「非単一ＣａｓガイドＲＮＡ」の態様が挙げられる。
　前記「ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」の態様としては、単一ＣａｓガイドＲＮＡを発現するための「単一ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」の態様、ｃｒＲＮＡを発現するための「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」の態様、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するための「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」の態様とすることができる。
　前記「ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」は、「単一ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」のみからなるものであってもよいし、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」と「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」とからなるものであってもよいし、「単一ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」と「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」と「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」とを含むものであってもよい。
　本明細書において、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数は、「単一ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」、「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」のそれぞれについて１つと数える。即ち、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」と「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」とを１つずつ用いる場合の前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数は２個となる。
　前記非単一ＣａｓガイドＲＮＡの態様では、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」の個数は、両者が同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　両者の個数が異なる場合の例としては、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を６個とする態様；前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個とする態様；前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を６個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個とする態様；前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を８個とする態様などが挙げられる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での配置としては、合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して配置する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での合計個数としては、４個以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個以上などが挙げられる。これらの中でも、合計６個以上が好ましく、合計８個以上がより好ましく、合計１０個以上がさらに好ましく、合計１２個以上が特に好ましい。
　ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを配置するベクター上の部位は、２カ所以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されていることが好ましい。
　本明細書において、アデノウイルスの必須領域とは、初期遺伝子群のＥ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ２Ａ領域、Ｅ２Ｂ領域、Ｅ４領域、後期遺伝子群のＬ１領域からＬ４領域までの各領域のことをいう。
　また、「アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ」とは、分割して搭載された前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの間に、上記したアデノウイルスの必須領域の少なくとも一部が存在していればよく、上記したアデノウイルスの必須領域のすべてが存在していてもよい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットは、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域（以下、「Ｅ１部位」と称することがある。）、Ｅ３領域（以下、「Ｅ３部位」と称することがある。）、及びＥ４領域（以下、「Ｅ４部位」と称することがある。）からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されていることが好ましい。
　前記アデノウイルスベクターでは、アデノウイルスのＥ１領域は欠失していることが好ましい。この場合、Ｅ１領域のＤＮＡを有する２９３細胞で機能補完される。前記アデノウイルスベクターにおいて欠失しているＥ１領域のことを、「Ｅ１欠失領域」又は「Ｅ１欠失組込み部位」と称することがある。本明細書において、Ｅ１領域には、欠失しているＥ１領域のことも含まれる。なお、本明細書において、ある領域が欠失しているとは、その領域のすべてが欠失している場合、その領域の一部が欠失している場合のいずれもが含まれる。
　アデノウイルスにおけるＥ３遺伝子群はウイルス複製に必須ではない。そのため、前記アデノウイルスベクターでは、Ｅ３領域は欠失していることが好ましい。前記アデノウイルスベクターにおいて欠失しているＥ３領域のことを、「Ｅ３欠失領域」又は「Ｅ３欠失組込み部位」と称することがある。本明細書において、Ｅ３領域には、欠失しているＥ３領域のことも含まれる。
　前記アデノウイルスベクターにおけるＥ４領域は、アデノウイルスのＥ４遺伝子群を有する領域である。前記Ｅ４領域は、遺伝子が欠失していてもよいし、欠失していなくてもよい。前記Ｅ４領域は、必ずしも欠失を伴わずに外来ＤＮＡの組み込みが可能な部位を含む領域である（以下、「Ｅ４組込み部位」と称することがある。）。本明細書において、Ｅ４領域には、欠失しているＥ４領域のことも含まれる。
　１つの配置部位におけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は１１個以上などが挙げられる。これらの中でも、２個以上が好ましく、４個以上がより好ましく、６個以上が特に好ましい。
　１つの配置部位におけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数の上限（ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６個が好ましく、８個がより好ましい。
　１つの部位におけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数の下限（ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの最小の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２個が好ましい。
　なお、本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値及び上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所に分割して配置する場合の例（第１の配置部位における個数：第２の配置部位における個数）としては、１個：３個以上、２個：２個以上などが挙げられ、より具体的には、２個：２個、２個：４個、２個：６個、２個：８個、３個：３個、３個：６個、４個：４個、４個：６個、４個：８個、６個：６個、６個：８個、８個：８個などが挙げられる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを３カ所に分割して配置する場合の例（第１の配置部位における個数：第２の配置部位における個数：第３の配置部位における個数）としては、１個：１個：２個以上が挙げられ、より具体的には、２個：２個：２個、２個：２個：４個、２個：２個：６個、２個：２個：８個、３個：３個：３個、３個：３個：６個４個：４個：４個、４個：４個：６個、４個：４個：８個、６個：６個：６個、８個：８個：８個などが挙げられる。
　ベクターゲノム上で合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有することで、相同組換え欠失が生じることを抑制することができる。例えば、８個のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを搭載する場合、４個ずつの２つのユニットに分割することで、それぞれのユニットの間の距離を十分に広く取ることができる。これにより、独立した２つのユニットとなり、相同組換え欠失が生じることを抑制することができると考えられる。
　また、例えば、４個のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットをＥ１領域とＥ４領域にそれぞれ組み込んだ場合は、非常に距離が離れているにもかかわらず相同組み換えが起きたとしても、この間にあるウイルスゲノムの大半を占める配列はウイルス増殖に必要であるため、これを失ったウイルスゲノム分子は自立増殖できないと考えられる。すなわち相同組み換えが抑制されたのではなく、相同組み換え分子が増殖できないために、相同組換え欠失が生じることが抑制されたように見えるという可能性も考えられる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットは、当該ＣａｓガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ以外に、プロモーターなどその発現を調節する発現調節領域等を含むことができる。前記プロモーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、アデノウイルスＶＡプロモーターなどが挙げられる。前記プロモーターの中でも、後述する短縮Ｕ６プロモーター（配列番号８８）が好ましい。
　通常、ベクターに複数のガイドＲＮＡ発現ユニットを含ませる場合、これらは同じ転写方向になるように隣接してタンデムに配置される。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡの標的としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットは、１種類の遺伝子を標的とするものであってもよいし、２種類以上の遺伝子を標的とするものであってもよい。
　多くの癌において、細胞の癌化には２つ以上の異なる遺伝子変異が関与していることが明らかとなっており、ゲノム編集治療において２つ以上の遺伝子を同時に編集できる能力は、癌治療において極めて有益な結果をもたらすことが理解される。また、単一の遺伝子の複数の領域を欠失させることにより、より確実な遺伝子破壊を行うことも可能となる。
　また、ウイルスは変異しやすいため、患者に感染しているウイルスのゲノムの塩基配列は患者によって異なる。患者に持続感染しているウイルスの場合は、一人の患者が持つウイルス集団のゲノムの塩基配列は同一ではなく、さまざまな変異を持つ集団であることが知られている。その結果、薬剤耐性を持つウイルスが選択的に増殖し、薬剤が効果を失う原因となっている。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）がその一例であるが、この現象は、ＨＢＶのみならず、他のウイルスあるいは細菌やマラリアなど、様々な病原体において観察され、特定の病原体に限定されない。
　従ってウイルスゲノムを標的とするベクターが多重にガイドＲＮＡを発現する（多数の異なるガイドＲＮＡを発現する）ことは、単に多数のウイルス必須部位を同時に破壊することにより治療効果を高めるだけでなく、（１）１つのベクター薬剤が変異ウイルスを持つ広範囲の患者のウイルスに効果をもつ広域薬剤となりうる、（２）一人の患者に持続感染している多様なウイルスのそれぞれを破壊するため残存ウイルスを減少させる、（３）ウイルスゲノム上の多数の部位を同時破壊することにより、ウイルスに変異により耐性を獲得する継代数を与えないため耐性ウイルスの出現を許さない、という効果を奏すると理解される。
　また、がんについても同様の効果が考えられる。すなわち、単にがん細胞の増殖を有利にする多数の細胞遺伝子を同時に破壊することにより治療効果を高めるだけでなく、（１）１つのベクター薬剤が異なるゲノム変異によりがん細胞化している異なる患者にも効果を持つことにより、広範囲の患者のがんに効果をもつ広域薬剤となりうる、（２）一人の患者のがんにおいても、異なるゲノム部位が変異し転移能を獲得したがん細胞や、逆に増殖が遅くなり薬剤抵抗性が増すがん細胞など、多様ながん細胞のそれぞれを破壊することができる可能性がある、（３）がん細胞のゲノム上の多数の変異部位を同時切断破壊することにより、がん細胞に変異により耐性を獲得する継代数を与えないため耐性がん細胞の出現を許さない、という効果を奏すると理解される。
　また、前記ベクターは、遺伝性疾患の治療にも有用である。そのため、本発明は、本発明のベクターを含む医薬組成物にも関する。
　前記遺伝性疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、カルバミルリン酸合成酵素（ＣＰＳ）欠損症、メチルマロン酸血症、α１－アンチトリプシン欠損症などが挙げられる。
　なお、後述するショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクター、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有する組換えアデノウイルスベクターも同様の用途に好適に用いることができる。
＜その他の構成＞
　前記その他の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｃａｓタンパク質発現ユニット、ドナーＤＮＡユニットなどが挙げられる。
＜＜Ｃａｓタンパク質発現ユニット＞＞
　前記Ｃａｓタンパク質発現ユニットは、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも含み、必要に応じて、プロモーター、ポリＡなどのその他の構成を有する。
　前記Ｃａｓタンパク質は、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」を構成する、エフェクター分子として機能するタンパク質を及びその誘導体を意味する。例えば、「Ｃａｓタンパク質」は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質及びＤＮＡ切断活性を有するその変異体を意味する。一つの態様において、「Ｃａｓタンパク質」はＤＮＡ２重鎖切断活性を有するＣａｓヌクレアーゼである。一つの態様において、「Ｃａｓタンパク質」はＤＮＡ２重鎖の片方の鎖のみを切断する活性を有するＣａｓニッカーゼである。一つの態様において、ＣａｓニッカーゼはＲｕｖＣドメインに変異を有するＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼ（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，Ｖｏｌ．３３７，ｎｏ６０９６，ｐｐ．８１６－８２１）であってもよい。
　これらの中でも、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼが好ましく、Ｃａｓ９ニッカーゼがより好ましい。
　前記プロモーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＢプロモーター（ＣＢ　ｐｒｏ）、ＰＧＫプロモーター（ＰＧＫ　ｐｒｏ）、ヒトＥＦ１αプロモーター（「ＥＦプロモーター」と称することがある。）などが挙げられる。これらの中でも、短縮されたＥＦプロモーター（配列番号８７）（以下、「ＥＦｄプロモーター」と称することがある。）が好ましい。
　前記ポリＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウシ成長ホルモン由来のポリＡなどが挙げられる。
　Ｃａｓタンパク質発現ユニットを配置する部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｅ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域などが挙げられる。これらの中でも、Ｅ４領域が好ましい。
　前記Ｃａｓタンパク質発現ユニットを配置する部位は、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを配置する部位（領域）と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
＜＜ドナーＤＮＡユニット＞＞
　前記ドナーＤＮＡユニットは、ノックインされるドナーＤＮＡ配列を少なくとも含み、必要に応じて、後述する左アーム配列、右アーム配列などのその他の構成を有する。
　前記ドナーＤＮＡ配列は、遺伝子をコードする配列であってもよいし、遺伝子をコードしない配列であってもよい。
　遺伝病治療などにおいて、異常遺伝子配列を正常遺伝子配列と置き換えるノックインが必要となるが、ノックインに用いるＤＮＡ断片は、異常配列の両側（上流及び下流）に、相同組換えに利用される正常塩基配列を有している。一般的にこれらの配列は左アーム配列（上流）及び右アーム配列（下流）と呼ばれている。
　ドナーＤＮＡユニットを配置する部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｅ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域などが挙げられる。
　前記Ｃａｓタンパク質発現ユニットを配置する部位は、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記Ｃａｓタンパク質発現ユニットを配置する部位（領域）と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、前記Ｃａｓタンパク質発現ユニット及び前記ドナーＤＮＡユニットの少なくともいずれかを更に搭載することにより、「一体型Ｃａｓアデノウイルスベクター」（「オールインワン型Ｃａｓアデノウイルスベクター」と称することもある。）とすることができる。
　「一体型Ｃａｓアデノウイルスベクター」が含有する、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、Ｃａｓタンパク質発現ユニットと、ドナーＤＮＡユニットの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　例えば、１コピーのＣａｓタンパク質発現ユニットと共に、上記した４個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含むことができる。一態様として、４個以上の単一ガイドＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質発現ユニットを含む態様、２個以上のｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニットと、６個以上のｃｒＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質発現ユニットを含む態様、４個以上のｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニットと、４個以上のｃｒＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質発現ユニットを含む態様、６個以上のｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニットと、２個以上のｃｒＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質発現ユニットを含む態様などが挙げられる。
　また、前記ドナーＤＮＡユニットを含む一体型Ｃａｓアデノウイルスベクターによれば、極めて高い効率で、当該ドナーＤＮＡ配列をゲノム上の特定の位置へ導入することができる。典型的には、当該一体型Ｃａｓノックイン核酸ベクターはダブルニッキングを生じるための１組（２個）のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット、１つのドナーＤＮＡ配列及び１つのＣａｓタンパク質をコードする遺伝子から構成されるが、当該構成に限定されない。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むコスミドベクターに、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、必要に応じて前記その他の構成とを挿入した後、２９３細胞へトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスベクターを得る方法（完全長ＤＮＡ導入法：Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，Ｖｏｌ．５０，ｐｐ．４６３－４５４）により製造することができる。２９３細胞を用いた完全長ＤＮＡ導入法を用いる場合、２９３細胞による培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、又は２４日間以上継続されることが好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターとして使用し得るアデノウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記した本発明の組換えアデノウイルスベクターを好適に用いることができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターが、前記Ｃａｓタンパク質発現ユニットを有する場合、宿主細胞においてもＣａｓタンパク質のゲノム編集活性を生じ得るため、当該活性の生じにくい培養条件にて培養することが好ましい。また、当該Ｃａｓタンパク質の発現を抑制し得るような条件で培養することも望ましい。一態様において、当該培養細胞にＣａｓタンパク質の発現を抑制するｓｉＲＮＡを発現するベクターを導入することで、Ｃａｓタンパク質の発現を抑制することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットがダブルニッキングを誘導するように構成されたものであることが好ましい。
　本発明において、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが「ダブルニッキングを誘導するように構成される」とは、少なくとも２個のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが、ゲノム上の近接する位置のセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれ一本鎖切断、すなわち「ニック」を誘導するように選択されており、それによりゲノムＤＮＡの２本鎖が当該２つのニックの付近で切断されることを意味する。
　本発明において、ＤＮＡ上の２つの位置が「近接する位置」にあるとは、当該２つの位置の間に、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０塩基対が存在することを意味するが、これらに限定されない。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、少なくとも４つのダブルニッキングを誘導することで少なくとも４カ所のゲノム切断を起こすように構成されたものであることが好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、ゲノム上からノックダウンする配列の上流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導し、更に、該ノックダウンする配列の下流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導することで、該ノックダウンする配列をノックダウンするように設計されたものであることが好ましい。これにより、目的の配列を極めて安全かつ確実にノックダウンすることが可能となる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、有効量を培養細胞に適用することでゲノム編集実験に用いることができる他、有効量をヒト以外の動物に投与することによるゲノム編集実験又は疾患治療、有効量をヒトに投与することによるゲノム編集疾患治療に適用することなどができる。
（ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクター）
　本発明のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、少なくともベクターゲノム上で合計６個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有し、必要に応じて更にその他の構成を有する。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターは、動物細胞内で当該ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを安定的に保持することができる。
＜ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニット＞
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットは、ショートヘアピンＲＮＡを発現するためのＤＮＡ構成単位を意味する。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットは、ショートヘアピンＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列を含むものである。
　前記ショートヘアピンＲＮＡとは、５５～６５塩基長のＲＮＡである。前記ショートヘアピンＲＮＡの構造は、２１塩基の標的配列のセンス鎖と、９塩基のループ配列と、アンチセンス鎖と、終止ポリＵとを有する構造である。前記ショートヘアピンＲＮＡは、転写された後、ヘアピン構造を形成し、プロセシングを受けてｓｉＲＮＡとなるものである。
　前記ループ配列及び終止ポリＵの配列及び長さとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での配置としては、合計６個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して配置する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での合計個数としては、６個以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個以上などが挙げられる。これらの中でも、合計８個以上が好ましく、合計１０個以上がより好ましく、合計１２個以上がさらに好ましい。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを配置するベクター上の部位は、２カ所以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されていることが好ましい。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットは、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されていることが好ましい。
　１つの配置部位におけるショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの個数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は１１個以上などが挙げられる。これらの中でも、２個以上が好ましく、４個以上がより好ましく、６個以上が特に好ましい。
　１つの配置部位におけるショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの個数の上限（ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４個が好ましい。
　１つの部位におけるショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの個数の下限（ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの最小の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２個が好ましい。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所又は３カ所に分割して配置する場合の例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記したＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと同様にして配置することができる。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットは、上記したＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと同様に、前記ショートヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡ以外に、プロモーターなどその発現を調節する発現調節領域等を含むことができる。
　通常、ベクターに複数のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを含ませる場合、これらは同じ転写方向になるように隣接してタンデムに配置される。
　前記ショートヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡの配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜その他の構成＞
　前記その他の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ドナーＤＮＡユニットなどが挙げられる。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターとして使用し得るアデノウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記した本発明の組換えアデノウイルスベクターを好適に用いることができる。
（ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有する組換えアデノウイルスベクター）
　本発明のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有する組換えアデノウイルスベクターは、少なくともベクターゲノム上で、２個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、２個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有し、必要に応じて更にその他の構成を有する。
＜ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット＞
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットは、上記したＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターの項目に記載のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと同様である。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットにおけるＣａｓガイドＲＮＡの標的としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、セーフハーバー領域が好ましい。
　前記セーフハーバー領域とは、挿入された遺伝子が発現抑制を受けにくく、かつ欠損させても細胞に有害な影響を与えないことが知られている遺伝子領域のことをいう。
　前記セーフハーバー領域を標的とするＣａｓガイドＲＮＡの配列としては、特に制限はなく、前記セーフハーバー領域の中から目的に応じて適宜選択することができる。
＜ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニット＞
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットは、上記したショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターの項目に記載のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットと同様である。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットにおけるショートヘアピンＲＮＡの標的としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｃｙｐｏｒ　ｍＲＮＡが好ましい。
　Ｃｙｐｏｒとは、ＮＡＤＰＨからＰ４５０へ電子を伝達する酵素であるチトクロームＰ４５０レダクターゼである。
　前記Ｃｙｐｏｒ　ｍＲＮＡを標的とするショートヘアピンＲＮＡの配列としては、特に制限はなく、前記Ｃｙｐｏｒ　ｍＲＮＡの中から目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での合計個数としては、２個以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個以上などが挙げられる。これらの中でも、合計２個以上が好ましく、合計４個以上がより好ましく、合計６個以上がさらに好ましく、合計８個以上が特に好ましい。
　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での合計個数としては、２個以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個以上などが挙げられる。これらの中でも、合計２個以上が好ましく、合計４個以上がより好ましく、合計６個以上がさらに好ましく、合計８個以上が特に好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットのベクターゲノム上での配置としては、２個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、２個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１カ所の部位にまとめて配置してもよいし、２カ所以上の部位に分割して配置してもよい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを配置するベクター上の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される１カ所以上の部位に配置することが好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して配置する場合のベクター上の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されていることが好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して配置する場合、前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットは、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されていることが好ましい。
　１つの配置部位におけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及びショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの合計個数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又は１１個以上などが挙げられる。これらの中でも、合計２個以上が好ましく、合計４個以上がより好ましく、合計６個以上がさらに好ましく、合計８個以上が特に好ましい。
　１つの配置部位におけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数の上限（ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６個が好ましく、８個がより好ましい。
　１つの部位におけるＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの個数の下限（ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの最小の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２個が好ましい。
　１つの配置部位におけるショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの個数の上限（ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４個が好ましい。
　１つの部位におけるショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの個数の下限（ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの最小の連続数）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２個が好ましい。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット及び前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所又は３カ所に分割して配置する場合の例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記したＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと同様にして配置することができる。
＜その他の構成＞
　前記その他の構成としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記したＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクター、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する組換えアデノウイルスベクターの項目に記載したその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有する組換えアデノウイルスベクターとして使用し得るアデノウイルスベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記した本発明の組換えアデノウイルスベクターを好適に用いることができる。
　以下、本発明の試験例等を説明するが、本発明は、これらの試験例等に何ら限定されるものではない。
（試験例１：ＨＰＶ１６標的ガイドＲＮＡの選定）
　本試験例の概要は、以下の通りである。
［１］　Ｅ６Ｅ７遺伝子を含むＬＣＲからＥ１領域の内、ダブルニッキング可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）候補１０５個について検討した。図１にＨＰＶ１６の遺伝子の構造を示す。
［２］　当初有望と考えた３９個については試験管内における切断効率を調べた。
［３］　当初有望と考えた２４個についてＳｉＨａ細胞内にレトロウイルスで発現させ、Ｃａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルス（ＣＢ－ＮＣ９）を感染させることで細胞増殖抑制効果を検討した。
［４］　上記［２］及び［３］、並びにＳＮＰの有無を参考に２０組の有望なダブルニッキングｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。
［５］　上記４で作製したレンチウイルスをＨＰＶ１６陽性子宮頸がん細胞株ＳｉＨａに単独感染あるいは重感染させることで、１～５組（２～１０個）のｇＲＮＡを発現するＳｉＨａ細胞を樹立した。
［６］　上記５で作製した細胞にアデノウイルス（ＣＢ－ＮＣ９）を感染させることで細胞増殖抑制効果を検討した。
［７］　上記６の結果の再現性をＨＰＶ１６陽性中咽頭がん細胞株ＳＣＣ９０で確認すると共に、Ｎ５～Ｎ７（後述参照）についてはＳｉＨａ細胞内のＨＰＶ１６ゲノムにＳＮＰがあるためＳＣＣ９０でその優劣を評価した。方法は上記５と同じ方法を用いた。
［１］
　Ｅ６Ｅ７遺伝子を含むＬＣＲからＥ１領域の内、ダブルニッキング可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）候補１０５個をリストアップした。これらについて、ＮＣＢＩに登録されているＨＰＶ１６のバリアントの系統（Ａ－Ｄ）のサブ系統（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）の配列と、ＳｉＨａなどＨＰＶ１６陽性がん細胞中のＨＰＶ１６の配列を並べてＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の有無を調べた。
＜ダブルニッキング切断＞
　野生型Ｃａｓ９では、１個のＣａｓ９がオンターゲット部位（目的の標的部位）、オフターゲット部位を切断する（図２の左上、右上）。
　Ｃａｓ９ニッカーゼによる切断では、オンターゲット部位（標的部位）においては２つのニッカーゼが近接した表鎖と裏鎖にニックをいれて切断する（図２の左下）。一方オフターゲット部位では、１つのＣａｓニッカーゼがニックを入れるだけなので、ニックは直ちに修復され切断は起こらない（図２の右下）。そのため、ダブルニッキング切断は安全といえる。
［２］及び［３］
　上記でリストアップした１０５個のｇＲＮＡ候補のうち、下記のうちの３９個のｇＲＮＡ候補について、試験管内における切断効率を調べた。具体的には、ｇＲＮＡ配列を有するｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを合成し、これらと基質ＨＰＶ１６のＤＮＡを混ぜ、Ｃａｓ９蛋白を加え切断効率を調べた。結果を図３～図５に示す。各図中、ｇＲＮＡ候補の名称は「１６＿」を省略して記載した。
　なお、下記の切断効率の結果は、２回の試験の結果（１回目、２回目）について、○（切断効率：優）、△（切断効率：良）、×（切断効率：可）をそれぞれ記載した。
　上記でリストアップした１０５個のｇＲＮＡ候補のうち、下記のうちの２４個のｇＲＮＡ候補について、シングルｇＲＮＡ発現レトロウイルス導入と野生型Ｃａｓ９によるＳｉＨａ細胞の増殖抑制活性を調べた。下記の増殖抑制活性の結果は、モック（ｍｏｃｋ）を１００％としたときのＳｉＨａ細胞の増殖を示す。
＜結果＞
＜＜ｇＲＮＡ候補＞＞
（１）　１６＿ＡＳ５７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴ（配列番号３０）
　　　　　切断効率の結果　：　△、×
　　　　　増殖抑制活性　：　７５％
　　　　　ＳＮＰ　：　－（なし、以下同様）
（２）　１６＿ＡＳ６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣ（配列番号３１）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　増殖抑制活性　：　６８％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（３）　１６＿Ｓ１０７ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣ（配列番号５４）
　　　　　増殖抑制活性　：　８６％
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｃ／ＵＭ－ＳＣＣ－４７
（４）　１６＿Ｓ１０７ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣ（配列番号３２）
　　　　　切断効率の結果　：　△、×
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｃ／ＵＭ－ＳＣＣ－４７
（５）　１６＿Ｓ１１６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号３３）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｃ／ＵＭ－ＳＣＣ－４７
（６）　１６＿ＡＳ４３４ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧ（配列番号３４）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｄ３，　ＳｉＨａ
（７）　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号２）
　　　　　切断効率の結果　：　○、×
　　　　　増殖抑制活性　：　６０％
　　　　　ＳＮＰ　：　ＳｉＨａ
（８）　１６＿Ｓ４８４ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡ（配列番号３５）
　　　　　切断効率の結果　：　△、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（９）　１６＿Ｓ４８５Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡ（配列番号３６）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　増殖抑制活性　：　７６％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１０）　１６＿Ｓ４８６Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧ（配列番号３７）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　増殖抑制活性　：　２０％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１１）　１６＿Ｓ４９０Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号１）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　増殖抑制活性　：　１６％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１２）　１６＿Ｓ４９３ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧ（配列番号５５）
　　　　　増殖抑制活性　：　１６％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１３）　１６＿Ｓ４９３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧ（配列番号３８）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１４）　１６＿Ｓ４９８ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣ（配列番号３９）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１５）　１６＿Ｓ４９８ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣ（配列番号５６）
　　　　　増殖抑制活性　：　１２％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１６）　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　増殖抑制活性　：　１３％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１７）　１６＿Ｓ５６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号７）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　増殖抑制活性　：　１０％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１８）　１６＿Ｓ５６３ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号５７）
　　　　　増殖抑制活性　：　１２％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１９）　１６＿ＡＳ６１６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＡＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＣ（配列番号５８）
　　　　　増殖抑制活性　：　２５％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２０）　１６＿ＡＳ６８８Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣ（配列番号４０）
　　　　　切断効率の結果　：　△、○
　　　　　増殖抑制活性　：　７５％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２１）　１６＿Ｓ６９７ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣ（配列番号５９）
　　　　　増殖抑制活性　：　６４％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２２）　１６＿ＡＳ７０６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号１１）
　　　　　増殖抑制活性　：　７５％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２３）　１６＿ＡＳ７０６ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号６０）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　増殖抑制活性　：　２６％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２４）　１６＿ＡＳ７１７ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡ（配列番号４）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２５）　１６＿ＡＳ７１７ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡ（配列番号６１）
　　　　　増殖抑制活性　：　２６％
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｄ２，Ｄ３（ただし５’－末端側）
（２６）　１６＿Ｓ７５３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号３）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　増殖抑制活性　：　１５％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２７）　１６＿ＡＳ８１０ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＴＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣ（配列番号６２）
　　　　　増殖抑制活性　：　６８％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２８）　１６＿ＡＳ８４０ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ（配列番号１０）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ４／ＱＧ－Ｕ／ＳＣＣ９０／ＳＫＧＩＩＩｂ
（２９）　１６＿ＡＳ８４１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴ（配列番号４１）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ４／ＱＧ－Ｕ／ＳＣＣ９０／ＳＫＧＩＩＩｂ
（３０）　１６＿ＡＳ８４２ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡ（配列番号４２）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ４／ＱＧ－Ｕ／ＳＣＣ９０／ＳＫＧＩＩＩｂ
（３１）　１６＿ＡＳ８５９Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＴＡ（配列番号１３）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　増殖抑制活性　：　５３％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（３２）　１６＿ＡＳ８６９Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡ（配列番号４３）
　　　　　切断効率の結果　：　×、×
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（３３）　１６＿ＡＳ８８０ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣ（配列番号６３）
　　　　　増殖抑制活性　：　２４％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（３４）　１６＿Ｓ８８４Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡ（配列番号９）
　　　　　切断効率の結果　：　×、×
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ４
（３５）　１６＿Ｓ８９３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡ（配列番号１２）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　増殖抑制活性　：　４８％
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（３６）　１６＿Ｓ９０８Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＡＧＡＧＧＧＴＡＣＧＧＧＡＴＧＴＡＡ（配列番号４４）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ４
（３７）　１６＿ＡＳ１１９２ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴ（配列番号４５）
　　　　　切断効率の結果　：　×、×
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｂ１，Ｃ，Ｄ，ＳｉＨａ
（３８）　１６＿Ｓ１２３０ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＡＡＡＧＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡ（配列番号４６）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｄ１
（３９）　１６＿ＡＳ１４３８ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧ（配列番号１５）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（４０）　１６＿Ｓ１４７１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＡＴＧＣＡＡ（配列番号１４）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｃ
（４１）　１６＿ＡＳ１５４３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＡ（配列番号６）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（４２）　１６＿Ｓ１５８３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴ（配列番号５）
　　　　　切断効率の結果　：　○、×
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（４３）　１６＿ＡＳ１４３４ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＧＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧＣＣＴＧ（配列番号４７）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ１，Ｂ２，Ｃ，ＣａＳｋｉ
（４４）　１６＿ＡＳ１７４１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＴＣＧＧＴＴＧＡＡＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴ（配列番号４８）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｂ２，Ｃ
（４５）　１６＿Ｓ７４７０ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＧＡＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＴ（配列番号４９）
　　　　　切断効率の結果　：　○、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｃ
（４６）　１６＿ＡＳ７６６８Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＣＣＴＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＴＧＴＡＡ（配列番号５０）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　ＳＮＰ　：　Ｂ，Ｄ
（４７）　１６＿Ｓ７７３９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＡＡＣＴＡＡＣＣＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴ（配列番号５１）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ３，Ａ４，Ｄ（Ｄ３は２カ所）
（４８）　１６＿ＡＳ７７７４Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＣＴＡＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＴＡＧＴＴ（配列番号５２）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　Ａ４，Ｂ，Ｃ，Ｄ
（４９）　１６＿Ｓ７８０４Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＧＴＴＣＡＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＴＡ（配列番号５３）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
［４］
　上記［２］及び［３］、並びにＳＮＰの有無を参考に１６組の有望なダブルニッキングｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（２つのｇＲＮＡ発現ユニットと１つの薬剤耐性遺伝子発現ユニットをもつレンチウイルスベクター）を下記のようにして作製した。
　２つのｇＲＮＡ発現ユニットと１つの薬剤耐性遺伝子発現ユニットをレンチウイルスベクターに配置するため、３つのエントリーベクターを作製した。
１）　レンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ－ＲｆＡベクター）（ａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２デスティネーションベクター）
２）　センス鎖ｇＲＮＡ発現カセットプラスミド（ａｔｔＬ４－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ａｔｔＬ１エントリーベクター）
３）　アンチセンス鎖ｇＲＮＡ発現カセットプラスミド（ａｔｔＲ４ｒ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ａｔｔＲ３ｒエントリーベクター）
４）　薬剤耐性遺伝子発現カセットプラスミド（ａｔｔＬ３－ＰＧＫ－薬剤耐性遺伝子－ａｔｔＬ２エントリーベクター）
１）　レンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ－ＲｆＡベクター）（ａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２デスティネーションベクター）の作製
　本実験に用いたレンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ－ＲｆＡベクター）は、ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣの三好浩之が開発したＣＳＩＩ－ＥＦ－ＲｆＡ（ＲＤＢ０４３８７；　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｎａｃｏｎｄａ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈ／ＲＤＢ＿ｃｌｏｎｅ／ＲＤＢ０４／ＲＤＢ０４３８７．ｈｔｍｌ）のＥＦプロモーターをＡｇｅＩ（ｎｔ２６６８と３７６０）で切断することにより除き、セルフライゲーションにより、ＣＳＩＩ－ＲｆＡベクターを作製した。
　ＣＳＩＩ－ＲｆＡベクターは、外来遺伝子挿入部位にＲｆＡ配列をもちＧａｔｅｗａｙシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＬＲ組み換え反応によりインサートを挿入できる。
２）　センス鎖ｇＲＮＡ発現カセットプラスミド（ａｔｔＬ４－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ａｔｔＬ１エントリーベクター）の作製
＜Ｕ６－ｇＲＮＡエントリーベクター＞
　ｇＲＮＡ発現カセットは、ｇＲＮＡ－ＧＦＰ－Ｔ２（Ａｄｄｇｅｎｅ　＃４１８２０；　Ｍａｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１３　３３９：　８２３－８２６）を改変して作製した。
　Ｕ６プロモーターの３’端１０塩基とｇＲＮＡ配列までの６塩基の計１６塩基（５’－ｔｇｇａａａｇｇａｃｇａａａｃａ－３’（配列番号６４））を突然変異により５’－ａｔｇａｇａｃｃａｃｔｃｔｔｔｃ－３’（配列番号６５）に置換した後、Ｕ６プロモーターからｇＲＮＡスカホールド配列をａｔｔＢ４配列とａｔｔＢ１配列を含むプライマーを用いＰＣＲにより増幅し、ＢＰ組み換え反応（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりｐＤＯＮＲ２２１　Ｐ１－Ｐ４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入し、Ｌ１－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＧＦＰ－Ｔ２－Ｌ４発現カセットプラスミドを作製した。Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＧＦＰ－Ｔ２の配列は、下記のとおりである。
ｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇＡＴｇａＧａＣＣａｃＴＣＴＴＴＣｃｃｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃｔｔｔｔｔｔｔ（配列番号６６）
　配列番号６６中、１～２４１番目の塩基は置換後（下線で示す）の「Ｕ６プロモーター」であり、２５０～２６９番目の塩基は「標的配列（ＧＦＰ－Ｔ２）」であり、２７０～３４５番目の塩基は「ｇＲＮＡスカホールド配列」であり、３４６～３５２番目の塩基は「ｔｔｔｔｔ転写終結シグナル」である。
　Ｌ１－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＧＦＰ－Ｔ２－Ｌ４発現カセットプラスミドを目的のｇＲＮＡ配列をもつプライマーセットによるＰＣＲとｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応（ＴＡＫＡＲＡ　Ｂｉｏ）による突然変異により目的のｇＲＮＡ配列を有するＬ４－Ｕ６－ｇＲＮＡ－Ｌ１カセットを有するエントリーベクタープラスミドを作製した。
　ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応は、ＰＣＲで得られた線状ＤＮＡ（５０～１００ｎｇ／８μＬ）に５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｅｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ　Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ，　ｃａｔ＃６３９６４８）を２μＬ加え、５０℃で１５分インキュベートする。これにより、線状ＤＮＡの両端にある共通重複配列部分で整復され環状ＤＮＡが生成される。
＜Ｌ４－Ｕ６－ｇＲＮＡ－Ｌ１エントリーベクター＞
　標的配列とプライマー結合配列からなる１組のプライマーセットによりａｔｔＬ４－ａｔｔＬ１カセットを含むプラスミドを増幅し、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応（ＴＡＫＡＲＡ　Ｂｉｏ）により新たな標的配列部分でオーバーラップする配列で環状化し、新たな標的配列を含むａｔｔＬ４－ａｔｔＬ１カセットプラスミドを得た。
　一例として、Ｌ１－Ｕ６－Ｓ８９３Ｇ－Ｌ４カセットプラスミドにおけるａｔｔＬ４－ａｔｔＬ１カセットの配列を下記に示す。
ＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＧＣＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＧＧＴＧａａｔｔｃＧＡＧＧｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇａｔｇａｇａｃｃａｃｔｃｔｔｔｃｃｃＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａＡＧｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴａａｇｃｔｔＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧ（配列番号６７）
　配列番号６７中、１～９６番目の塩基は「ａｔｔＬ４」であり、１０６～３３６番目は「Ｕ６プロモーター」であり、３３７～３５４番目の塩基は「リバース（Ｒ）プライマー結合配列」であり、３５５～３７４番目の塩基は「ｇＲＮＡ標的配列」であり、３７５～３９５番目の塩基は「フォワード（Ｆ）プライマー結合配列」であり、３９６～４５０番目の塩基は「ｇＲＮＡスカフォールド配列」であり、４５１～４５６番目の塩基は「転写終結シグナル」であり、４６３～５６２番目の塩基は「ａｔｔＬ１」である。
　カセットの配列はＭ１３Ｆプライマー（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ－３’（配列番号６８））ならびにＭ１３Ｒプライマー（５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’（配列番号６９））を用いたサンガーシークエンスにより正しいことを確認した。
３）　アンチセンス鎖ｇＲＮＡ発現カセットプラスミド（ａｔｔＲ４ｒ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ａｔｔＲ３ｒエントリーベクター）の作製
　標的配列とプライマー結合配列からなる１組のプライマーセットによりａｔｔＲ４ｒ－ａｔｔＲ３ｒカセットを含むプラスミドを増幅し、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応（ＴＡＫＡＲＡ　Ｂｉｏ）により新たな標的配列部分でオーバーラップする配列で環状化し、新たな標的配列を含むａｔｔＲ４ｒ－ａｔｔＲ３ｒカセットプラスミドを得た。ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応は、ＰＣＲで得られた線状ＤＮＡ（５０～１００ｎｇ／８μＬ）に５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｅｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ　Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ，　ｃａｔ＃６３９６４８）を２μＬ加え、５０℃で１５分インキュベートする。これにより、線状ＤＮＡの両端にある共通重複配列部分で整復され環状ＤＮＡが生成される。
　一例として、Ｒ４ｒ－Ｕ６－ＡＳ８５９Ｇ－Ｒ３ｒカセットプラスミドにおけるａｔｔＲ３ｒ－ａｔｔＲ４ｒカセットの配列を下記に示す。
ＣＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＴｇａａｔｔｃＧＡＧＧｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔａｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇａｔｇａｇａｃｃａｃｔｃｔｔｔｃｃｃＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＴＡｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａＡＧｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴａａｇｃｔｔＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＴＡＡＴＡＣＴＧＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＴＡＴＧ（配列番号７０）
　配列番号７０中、１～１２４番目の塩基は「ａｔｔＲ３ｒ」であり、１３２～３６２番目は「Ｕ６プロモーター」であり、３６３～３８０番目の塩基は「リバース（Ｒ）プライマー結合配列」であり、３８１～４００番目の塩基は「ｇＲＮＡ標的配列」であり、３８２～４２１番目の塩基は「フォワード（Ｆ）プライマー結合配列」であり、４２２～４７６番目の塩基は「ｇＲＮＡスカフォールド配列」であり、４７７～４８２番目の塩基は「転写終結シグナル」であり、４８８～６１２番目の塩基は「ａｔｔＲ４ｒ」である。
　カセットの配列はＭ１３Ｆプライマー（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ－３’（配列番号６８））ならびにＭ１３Ｒプライマー（５’－ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ－３’（配列番号６９））を用いたサンガーシークエンスにより正しいことを確認した。
４）　薬剤耐性遺伝子発現カセットプラスミド（ａｔｔＬ３－ＰＧＫ－薬剤耐性遺伝子－ａｔｔＬ２エントリーベクター）の作製
　薬剤耐性遺伝子発現カセットをもつレトロウイルスベクター（ｐＣＭＳＣＶｎｅｏ、ｐＣＭＳＣＶｐｕｒｏ、ｐＣＬＭＳＣＶｈｙｇ’、ｐＥＦ６－ＭＹＣ－Ｈｉｓ－Ａ、ｐＣＭＳＣＶ－ＥＭ７ｚｅｏ）より、ＰＧＫプロモーターから薬剤耐性遺伝子配列までを、ａｔｔＢ３配列を含むプライマーとａｔｔＢ２配列を含むプライマーを用いＰＣＲで増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１　Ｐ３－Ｐ２とゲートウェイ法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＢＰ組み換え反応を行い、薬剤耐性遺伝子発現カセットを含むａｔｔＬ３－ａｔｔＬ２カセットプラスミドを作製した。
　ａｔｔＬ３－ａｔｔＬ２カセットの配列は、下記のとおりである。なお、下記配列では、薬剤耐性遺伝子の例として、ハイグロマイシン耐性遺伝子を記載している。
ＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＧＣＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＴＴＧａｇａｔｃｔａａｔｔｃｔａｃｃｇｇｇｔａｇＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧｇＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧｇＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣｃＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＴｃＣＣＣＣＣｃＧＣｃｃｃｇｃＡＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧｃＴＣＣＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧｇＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣｇＧＡＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＴＴＧＣＡＴＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＴＣＡＣＧＴＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＡＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＡＣＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＣＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＧＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＣＣＣＧＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＧＴＧＣＡＣＧＣＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＣＡＧＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＴＡＣＴＴＣＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＴＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＣＧＡＣＧＣＡＡＴＣＧＴＣＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＣＴＧＴＣＧＧＧＣＧＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＴＣＧＣＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡｔａａＴＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧ（配列番号７１）
　配列番号７１中、１～１１１番目の塩基は「ａｔｔＬ３」であり、１１２～６１１番目は「ＰＧＫプロモーター」であり、６２９～１，６５４番目の塩基は「ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）」であり、１，６５５～１，７５５番目の塩基は「ａｔｔＬ２配列」である。
ダブルニッキングｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの作製
　ダブルニッキングｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの作製法として、「Ｈ１」（センス鎖：１６＿Ｓ８９３Ｇ、アンチセンス鎖：１６＿ＡＳ８５９Ｇ、後述参照）を例として、説明する。
　ＨＰＶのセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセットとして「Ｌ１－Ｕ６－１６＿Ｓ８９３Ｇ－Ｌ４」、ＨＰＶのアンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセットとして「Ｒ４ｒ－Ｕ６－１６＿ＡＳ８５９Ｇ－Ｒ３ｒ」、及び薬剤耐性遺伝子発現カセットとして「Ｌ３－ＰＧＫ－Ｈｙｇ－Ｌ２」の３つをマルチサイトゲートウェイＬＲ反応（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によりプロモーターレスレンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ－ＲｆＡ）に組み換え導入し、２つのｇＲＮＡと薬剤耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクター（Ｈ１：１６Ｓ８９３Ｇ－ＡＳ８５９Ｇ）を作製した。
　ＬＲ反応ではデスティネーションベクターと３種類のエントリーベクター（上記１）～４））を各５０～１５０ｎｇ混合し８μＬとし、ＬＲクロナーゼＴＭＩＩ　酵素ミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃１１７９１）を２μＬ加え、２５℃で１時間インキュベーションする。次いで１μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ溶液を加え３７℃で１０分間インキュベーションする。
　これにより、（ａｔｔＬ－遺伝子－ａｔｔＬ）とａｔｔＲサイトを持つデスティネーションベクターとの間のｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え反応を触媒し、ａｔｔＢサイトを持つ発現クローンを生成する。
　具体的には下記の反応により目的の発現ベクターが生成される。
　ａｔｔＲ１－ｃｃｄＢ－ａｔｔＲ２　×　ａｔｔＬ４－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ａｔｔＬ１　×　ａｔｔＲ４ｒ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ａｔｔＲ３ｒ　×　ａｔｔＬ３－ＰＧＫ－薬剤耐性遺伝子－ａｔｔＬ２　→　ａｔｔＢ１－ｇＲＮＡ－Ｕ６－ａｔｔＢ４－ｇＲＮＡ－Ｕ６－ａｔｔＢ３－ＰＧＫ－薬剤耐性遺伝子－ａｔｔＢ２（発現ベクター）
　組み換えを起こすａｔｔＲとａｔｔＬの組合せは、ａｔｔＲ１とａｔｔＬ１、ａｔｔＬ４とａｔｔＲ４ｒ、ａｔｔＲ３ｒとａｔｔＬ３、ａｔｔＬ２とａｔｔＲ２となる。
　なお、薬剤耐性遺伝子の転写方向とｇＲＮＡの転写方向は逆向きになるよう配置されている。
　以下に、作製したＨＰＶ１６を標的とする２つのｇＲＮＡ発現ユニットと、１つの薬剤耐性遺伝子発現ユニットをもつレンチウイルスベクターを示す。
　ＮＣＢＩに登録されているＨＰＶ１６のバリアントの系統（Ａ－Ｄ）のサブ系統（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）の配列とＳｉＨａなどＨＰＶ１６陽性がん細胞中のＨＰＶ１６の配列を並べて２つ以上のサブ系統で５’側１８塩基のコア配列内にＳＮＰを含むものを除外した。
　標的配列名の命名法は、以下のとおりである。
　「１６＿」　：　ＨＰＶ１６を標的とすることを示す。
　「Ｓ」　：　センス鎖を標的配列とすることを示す。
　「ＡＳ」　：　アンチセンス鎖を標的配列とすることを示す。
　「数字」　：　推定切断端（５’－オーバーハング端）のＨＰＶ１６プロトタイプ配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｋ０２７１８．１）の位置を示す。
　「Ｇ」　：　２０塩基を標的配列とし、５’端のＧが標的配列と一致する。
　「Ｇ＋」　：　２１塩基を標的配列とし、５’端のＧが標的配列と一致する。
　「ｇ」　：　２０塩基を標的配列とし、５’端のｇは標的配列と一致しない。
　「ｇ＋」　：　２１塩基を標的配列とし、５’端のｇは標的配列と一致しない。
　「ｇＡ＋」　：　は２２塩基を標的配列とし、５’端のｇは標的配列と一致しない。
　下記標的配列中の５’端に小文字の「ｇ」の記載がある場合、この「ｇ」はＵ６プロモーターからの転写開始のために付加したものである。
＜薬剤耐性遺伝子がＧ４１８耐性遺伝子のベクター＞
（１）　Ｎ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１０７ｇＡ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣ（配列番号７３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴ（配列番号３０）
（２）　Ｎ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１０７ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣ（配列番号３２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴ（配列番号３０）
（３）　Ｎ３
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１１６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣ（配列番号３３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴ（配列番号３０）
（４）　Ｎ４
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１０７ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣ（配列番号３２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣ（配列番号３１）
（５）　Ｎ５
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ４９０Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴ（配列番号１）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号２）
（６）　Ｎ６
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ４８５Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡ（配列番号３６）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号２）
（７）　Ｎ７
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ４８６Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧ（配列番号７２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号２）
（８）　Ｎ８
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ５６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号７）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
＜薬剤耐性遺伝子がＢｓｄＳ耐性遺伝子のベクター＞
（９）　Ｂ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ５６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号７）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
（１０）　Ｂ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ５６３ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号５７）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
＜薬剤耐性遺伝子がピューロマイシン耐性遺伝子のベクター＞
（１１）　Ｐ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ７５３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ７０６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号１１）
（１２）　Ｐ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ７５３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ７０６ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号６０）
（１３）　Ｐ３
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ７５３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ７１７ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡ（配列番号４）
＜薬剤耐性遺伝子がハイグロマイシンＢ耐性遺伝子のベクター＞
（１４）　Ｈ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ８９３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡ（配列番号１２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ８５９Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＴＡ（配列番号１３）
（１５）　Ｈ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ８８４Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡ（配列番号９）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ８４０ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ（配列番号１０）
（１６）　Ｈ３
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１４７１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＡＴＧＣＡＡ（配列番号１４）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ１４３８ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧ（配列番号１５）
（１７）　Ｈ４
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１５８３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴ（配列番号５）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ１５４３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＡ（配列番号６）
＜薬剤耐性遺伝子がゼオシン耐性遺伝子のベクター＞
（１８）　Ｚ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１４７１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＡＴＧＣＡＡ（配列番号１４）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ１４３８ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧ（配列番号１５）
（１９）　Ｚ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１５８３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴ（配列番号５）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ１５４３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡＡＡ（配列番号６）
（２０）　Ｚ３
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ５６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号７）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
［５］及び「６」
＜ＨＰＶ１６（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討＞
　上記で作製したレンチウイルスをＨＰＶ１６陽性子宮頸がん細胞株ＳｉＨａに感染後、Ｇ４１８（ｎｅｏ）耐性ベクターは１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で、ＢｓｄＳ耐性ベクターは１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンＳで、Ｐｕｒｏ耐性ベクターは１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで、ＨｙｇＢ耐性ベクターは４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢで、Ｚｅｏ耐性ベクターは１ｍｇ／ｍＬのゼオシンでそれぞれ被感染細胞を選択した。
　樹立した細胞に、同様に薬剤耐性の異なるレンチウイルスを感染後薬剤選択し、ＨＰＶ１６に対するダブルニッキングｇＲＮＡペアを１組２個から４組８個（一部５組１０個）発現するＳｉＨａ細胞を樹立した。
　各細胞を９６ウェルプレートに１，０００個／ウェルとなるように１２ウェルに播種し、翌日Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）を発現するアデノウイルスベクターをＭＯＩ＝０からＭＯＩ＝１，０００の４段階でトリプリケートとなるよう感染し、ＭＯＩ＝０でモック感染したウェルがコンフルエントになった１０日から１４日後にメタノール固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法（Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　１９９０　Ｊｕｌ　４；８２（１３）：１１０７－１２）で相対残存細胞数を定量した。各条件の３ウェルずつの残存細胞数の平均と標準誤差を算出し、モックのウェルを１００とした相対残存細胞数（「％ｇｒｏｗｔｈ」）をグラフ化した。結果を図６～１４に示す。各図中、横軸は、使用したｇＲＮＡペア又はペアの組合せを示す。例えば、「Ｎ１」は上記したＮ１の１ペアのｇＲＮＡを用いた場合、「Ｂ１Ｚ２」は上記したＢ１のペアのｇＲＮＡと、Ｚ２のペアのｇＲＮＡとの組合せ（２ペアの組合せ）を用いた場合、「Ｈ１Ｂ１Ｐ１」は上記したＨ１のペアのｇＲＮＡと、Ｂ１のペアのｇＲＮＡと、Ｐ１のペアのｇＲＮＡとの組合せ（３ペアの組合せ）を用いた場合、「Ｈ１Ｂ１Ｐ３Ｚ１」は上記したＨ１のペアのｇＲＮＡと、Ｂ１のペアのｇＲＮＡと、Ｐ３のペアのｇＲＮＡと、Ｚ１のペアのｇＲＮＡとの組合せ（４ペアの組合せ）を用いた場合を表す。
　ｇＲＮＡを０～４組（８個）導入したＳｉＨａ細胞を９６ウェルプレートに１，０００個／ウェルとなるように各１２ウェルに播種した。翌日Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）を発現するアデノウイルスベクターをＭＯＩ＝０、２５０、５００、１，０００の４段階でトリプリケートとなるよう感染し、ＭＯＩ＝０でモック感染したウェルがコンフルエントになった１０日から１４日後にメタノール固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法で相対残存細胞数を定量した。図１５に、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄで染色した９６ウェルプレートを示す。
［７］
　上記［６］の結果の再現性をＨＰＶ１６陽性中咽頭がん細胞株ＳＣＣ９０で確認すると共に、Ｎ５～Ｎ７についてはＳｉＨａ細胞内のＨＰＶ１６ゲノムにＳＮＰがあるためＳＣＣ９０でその優劣を評価した。方法は上記［５］と同じ方法を用いた。
　図６～１０の結果から、ｇＲＮＡペアとしては、Ｎ３、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｂ１、Ｐ１、Ｐ３、Ｈ１、Ｚ１、Ｚ２が好ましいことが確認された。
　また、ｇＲＮＡペアの組合せとしては、Ｎ５とＰ３との組合せ、Ｎ５とＺ２との組合せ、Ｂ１とＨ２との組合せ、Ｂ１とＺ２との組合せ、Ｐ１とＨ１との組合せ、Ｐ１とＺ２との組合せ、Ｎ５とＰ３とＨ１との組合せ、Ｎ５とＰ３とＺ１との組合せ、Ｂ１とＰ１とＨ１との組合せ、Ｂ１とＰ３とＨ１との組合せ、Ｂ１とＨ２とＺ１との組合せ、Ｐ３とＨ１とＺ１との組合せ、Ｐ３とＨ２とＺ１との組合せが好ましいことが確認された。
　これらの中でも、Ｈ１又はＨ２と、Ｂ１と、Ｐ１又はＰ３との組合せが好ましく、Ｈ２は日本人に多いサブ系統Ａ４にＳＮＰがあること、Ｐ３はサブ系統Ｄ２、Ｄ３の５’端にＳＮＰがあることから、Ｈ１と、Ｂ１と、Ｐ１との組合せがより好ましい。
　更に、上記３組の組合せに、４組目として、Ｚ１もしくはＺ２、又はＮ３もしくはＮ５を用いることも好ましく、これらの中でも、ＳＮＰのないＺ２がより好ましい。
　また、図１１の結果から、ｇＲＮＡペアとしては、Ｂ１、Ｂ２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ１が好ましいことが確認された。この中でサブ系統にＳＮＰのないＢ１、Ｂ２、Ｐ１、Ｐ２、Ｈ１がより好ましい。
　また、ｇＲＮＡペアの２組の組合せとしては、図１２～１４の結果から、Ｂ１とＺ１との組合せ、Ｈ１とＰ３との組合せ、Ｈ１とＰ１との組合せ、Ｈ２とＢ１との組合せ、Ｈ２とＰ１との組合せ、Ｎ５とＰ３との組合せ、Ｂ１とＺ１との組合せ、Ｐ１とＺ２との組合せ、Ｐ１とＺ１との組合せ、Ｈ１とＢ１との組合せ、Ｈ１とＮ１との組合せ、Ｈ１とＢ２との組合せ、Ｈ１とＰ２との組合せ、Ｈ１とＰ３との組合せ、Ｎ１とＰ３との組合せ、Ｂ１とＰ１との組合せ、Ｂ１とＨ３との組合せ、Ｎ５とＰ３との組合せ、Ｎ３とＰ３との組合せ、Ｎ３とＨ３との組合せ、Ｎ３とＨ４との組合せ、Ｂ１とＨ４（Ｈ４はＺ２と同じｇＲＮＡペアをもつ）との組合せが好ましいことが確認された。
　この中でも、Ｈ２は日本人に多いサブ系統Ａ４にＳＮＰがあること、Ｎ５には日本人に多いサブ系統Ａ５にＳＮＰがあること、Ｐ３にはサブ系統Ｄ２、Ｄ３の５’端にＳＮＰがあること、Ｎ１、Ｎ３、Ｚ１、Ｈ３にはサブ系統ＣにＳＮＰがあることから、Ｈ１とＰ１との組合せ、Ｈ１とＰ２との組合せ、Ｈ１とＢ１との組合せ、Ｈ１とＢ２との組合せ、Ｂ１とＰ１との組合せ、Ｂ１とＺ２との組合せ、Ｐ１とＺ２との組合せがより好ましい。
　ｇＲＮＡペアの３組の組合せとしては、Ｈ１とＰ１とＢ１との組合せ、Ｈ１とＰ１とＢ２との組合せ、Ｈ１とＰ２とＢ１との組合せ、Ｈ１とＰ２とＢ２との組合せが好ましい。
　ｇＲＮＡペアの４組の組合せとしては、前記ｇＲＮＡペアの３組の組合せにＺ２を加えた、Ｈ１とＰ１とＢ１とＺ２との組合せ、Ｈ１とＰ１とＢ２とＺ２との組合せ、Ｈ１とＰ２とＢ１とＺ２との組合せ、Ｈ１とＰ２とＢ２とＺ２との組合せが好ましい。
（試験例２：ＨＰＶ１８標的ガイドＲＮＡの選定）
　本試験例の概要は、以下の通りである。
［１］　Ｅ６Ｅ７遺伝子を含むＬＣＲからＥ１領域の内、ダブルニッキング可能なｇＲＮＡ候補８３個について検討した。図１６にＨＰＶ１８の遺伝子の構造を示す。
［２］　当初有望と考えた１９個については試験管内における切断効率を調べた。
［３］　上記［２］と、ＳＮＰの有無を参考に１４組の有望なダブルニッキングｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターを作製した。
［４］　上記［３］で作製したレンチウイルスをＨＰＶ１８陽性子宮頸がん細胞株ＨｅＬａに単独感染あるいは重感染させることで、１～４組（２～８個）のｇＲＮＡを発現するＨｅＬａ細胞を樹立した。
［５］　上記［４］で作製した細胞にアデノウイルス（ＣＢ－ＮＣ９）を感染させることで細胞増殖抑制効果を検討した。
［１］
　Ｅ６Ｅ７遺伝子を含むＬＣＲからＥ１領域の内、ダブルニッキング可能なｇＲＮＡ候補８３個をリストアップした。これらについて、ＮＣＢＩに登録されているＨＰＶ１８のバリアントの系統（Ａ－Ｄ）の配列と、ＨＰＶ１８陽性がん細胞ＨｅＬａ中のＨＰＶ１８の配列を並べてＳＮＰの有無を調べた。
［２］
　上記でリストアップした８３個のｇＲＮＡ候補のうち、下記の１９個のｇＲＮＡ候補について、試験管内における切断効率を調べた。具体的には、上記したｇＲＮＡ配列を有するｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを合成し、これらと基質ＨＰＶ１８のＤＮＡを混ぜ、Ｃａｓ９蛋白を加え切断効率を調べた。なお、切断効率が良すぎると違いが分かりにくいので、切断効率を意図的に下げた。
　基質となる切断用ＤＮＡは、ＨＰＶ１８ゲノムを以下のプライマーで増幅した２．３ｋｂの断片を用いた。
［プライマー］
　ＨＰＶ１８－Ｅ６ｕ７０Ｌ１ｄ１７－Ｆ－３４ｈｎｔ　：
　ｇｇｔｔｇｃｇｃｃｃｔａｇｔｇａｇｔａａｃａａｃｔｇｔａｔｔｔｇｔｇ（配列番号７４）
　ＨＰＶ１８－Ｅ７ｄ８４ＸｂａＩ０－Ｒ－３２ｈｎｔ　：
　ｃｃｃｃａｔｔｔａｃａｇｔｃｔａｇａｃａｔｔｇａａｔａｔｇｇｇｃ（配列番号７５）
　結果を図１７～２０に示す。各図中、ｇＲＮＡ候補の名称は「１８＿」における「＿」を省略して記載した。
　なお、下記の切断効率の結果は、２回の試験の結果（１回目、２回目）について、○（切断効率：優）、△（切断効率：良）、×（切断効率：可）をそれぞれ記載した。
＜結果＞
［ｇＲＮＡ候補］
（１）　１８＿ＡＳ４９Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＴＴ（配列番号１７）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（２）　１８＿ＡＳ６５ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＴ（配列番号２０）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（３）　１８＿Ｓ１２５Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡ（配列番号１６）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（４）　１８＿ＡＳ１５３Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＣＡＣＡＧＡＴＣ（配列番号２９）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（５）　１８＿Ｓ２１６Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＡＴ（配列番号２８）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（６）　１８＿ＡＳ２９１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号２２）
　　　　　切断効率の結果　：　△、△
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（７）　１８＿Ｓ３５８ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡ（配列番号２１）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（８）　１８＿Ｓ３５８ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡ（配列番号７６）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（９）　１８＿ＡＳ６４４Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号７７）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１０）　１８＿ＡＳ６４５Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴ（配列番号２７）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１１）　１８＿ＡＳ６４６Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴ（配列番号１９）
　　　　　切断効率の結果　：　△、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１２）　１８＿Ｓ６８９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１８）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１３）　１８＿Ｓ７１１Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡ（配列番号７８）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１４）　１８＿ＡＳ８４１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡ（配列番号２６）
　　　　　切断効率の結果　：　×、△
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１５）　１８＿ＡＳ８７３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡ（配列番号２４）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１６）　１８＿ＡＳ８７４ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣ（配列番号７９）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１７）　１８＿ＡＳ８７９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡ（配列番号８０）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１８）　１８＿Ｓ８８３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＧＴＧＴＣＣＧ（配列番号２５）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
（１９）　１８＿Ｓ９１１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）
　　　　　切断効率の結果　：　○、○
　　　　　ＳＮＰ　：　－
　図１７～１８の結果から、Ｅ６の５’側については、アンチセンス側の２つと対になるセンス側１８＿Ｓ１２５Ｇ＋の切断効率が低かった。Ｅ６の前半については、１８＿ＡＳ２９１ｇ＋以外はどれもまずまずの切断効率であった。１８＿Ｓ３５８ｇと１８＿Ｓ３５８ｇ＋の間に違いはなかった。この切断効率で選ぶとすると、１８＿ＡＳ１５３Ｇ＋と１８＿Ｓ２１６Ｇ＋が良いことがわかった。
　図１９～２０の結果から、Ｅ７の５’側については、アンチセンス側の１８＿ＡＳ６４６Ｇが、１回目で切断効率が低く、２回目でも少し効率が低かった。Ｅ７の３’側については、１８＿ＡＳ８４１ｇ以外はどれもまずまずの切断効率であった。この中から選ぶとすると、アンチセンス側はブレのない１８＿ＡＳ８７３ｇ、センス側は１８＿Ｓ８８３ｇ＋が良いことがわかった。
［３］
　上記［２］と、ＳＮＰの有無を参考に１４組の有望なダブルニッキングｇＲＮＡを発現するレンチウイルスベクター（２つのｇＲＮＡ発現ユニットと１つの薬剤耐性遺伝子発現ユニットをもつレンチウイルスベクター）を試験例１と同様にして、作製した。
　作製したＨＰＶ１８を標的とする２つのｇＲＮＡ発現ユニットと、１つの薬剤耐性遺伝子発現ユニットをもつレンチウイルスベクターを下記に示す。
　原則として、標的配列を２０塩基とした際、５’端の配列がＧであれば２０塩基とし、Ｇでない場合には５’端にｇを付加し２１塩基とした。例外的に１８＿Ｓ３５８ｇは標的配列を２０塩基とした際、５’端の配列Ｃをｇに置換し２０塩基のままとした。
　標的配列名の命名法は、以下のとおりである。
　「１８＿」　：　ＨＰＶ１８を標的とすることを示す。
　「Ｓ」　：　センス鎖を標的配列とすることを示す。
　「ＡＳ」　：　アンチセンス鎖を標的配列とすることを示す。
　「数字」　：　推定切断端（５’－オーバーハング端）のＨＰＶ１８プロトタイプ配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｘ０５０１５．１）の位置を示す。
　「Ｇ」　：　２０塩基を標的配列とし、５’端のＧが標的配列と一致する。
　「Ｇ＋」　：　２１塩基を標的配列とし、５’端のＧが標的配列と一致する。
　「ｇ」　：　２０塩基を標的配列とし、５’端のｇは標的配列と一致しない。
　「ｇ＋」　：　２１塩基を標的配列とし、５’端のｇは標的配列と一致しない。
　下記標的配列中の５’端に小文字の「ｇ」の記載がある場合、この「ｇ」はＵ６プロモーターからの転写開始のために付加したものである。
＜薬剤耐性遺伝子がＧ４１８耐性遺伝子のもの＞
（１）　Ｎ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ１２５Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡ（配列番号１６）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ４９Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＣＣＧＡＣＣＧＴＴＴＴ（配列番号１７）
（２）　Ｎ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ１２５Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＣＧＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡ（配列番号１６）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６５ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＣＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＴ（配列番号２０）
＜薬剤耐性遺伝子がハイグロマイシンＢ耐性遺伝子のベクター＞
（３）　Ｈ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ２１６Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＡＴ（配列番号２８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ１５３Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＣＡＣＡＧＡＴＣ（配列番号２９）
（４）　Ｈ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ３５８ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡ（配列番号２１）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ２９１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号２２）
＜薬剤耐性遺伝子がゼオシン耐性遺伝子のベクター＞
（５）　Ｚ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ３５８ｇ
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡ（配列番号２１）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ２９１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号２２）
＜薬剤耐性遺伝子がピューロマイシン耐性遺伝子のベクター＞
（６）　Ｐ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ６８９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６４４Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号７７）
（７）　Ｐ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ６８９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６４５Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴ（配列番号２７）
（８）　Ｐ３
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ６８９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６４６Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴ（配列番号１９）
（９）　Ｐ４
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ７１１Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡ（配列番号７８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６４４Ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号７７）
（１０）　Ｐ５
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ７１１Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡ（配列番号７８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６４５Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴＴ（配列番号２７）
（１１）　Ｐ６
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ７１１Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡ（配列番号７８）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ６４６Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＴ（配列番号１９）
＜薬剤耐性遺伝子がＢｓｄＳ耐性遺伝子のベクター＞
（１２）　Ｂ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ８８３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＧＴＧＴＣＣＧ（配列番号２５）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ８４１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＧＡ（配列番号２６）
（１３）　Ｂ２
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ９１１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ８７３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡ（配列番号２４）
（１４）　Ｂ３
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ９１１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ８７４ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣ（配列番号７９）
（１５）　Ｂ４
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿Ｓ９１１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＡ（配列番号２３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１８＿ＡＳ８７９ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡ（配列番号８０）
［４］及び［５］
＜ＨＰＶ１８（＋）子宮頸がん細胞を用いたダブルニッキングｇＲＮＡの検討＞
　上記で作製したレンチウイルスをＨＰＶ１８陽性子宮頸がん細胞株ＨｅＬａに感染後、Ｇ４１８（ｎｅｏ）耐性ベクターは８００μｇ／ｍＬのＧ４１８で、ＢｓｄＳ耐性ベクターは１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンＳで、Ｐｕｒｏ耐性ベクターは１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで、ＨｙｇＢ耐性ベクターは２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢで、Ｚｅｏ耐性ベクターは１ｍｇ／ｍＬのゼオシンでそれぞれ被感染細胞を選択した。
　樹立した細胞に、同様に薬剤耐性の異なるレンチウイルスを感染後薬剤選択し、ＨＰＶ１８に対するダブルニッキングｇＲＮＡペアを１組２個から４組８個発現するＨｅＬａ細胞を樹立した。
　各細胞を９６ウェルプレートに１，０００個／ウェルとなるように１２ウェルに播種し、翌日Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）を発現するアデノウイルスベクターをＭＯＩ＝０からＭＯＩ＝１，０００の４段階でトリプリケートとなるよう感染し、ＭＯＩ＝０でモック感染したウェルがコンフルエントになった１０日から１４日後にメタノール固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法で相対残存細胞数を定量した。各条件の３ウェルずつの残存細胞数の平均と標準誤差を算出し、モックのウェルを１００とした相対残存細胞数をグラフ化した。結果を図２１～２４に示す。
　以上の結果から、ｇＲＮＡペアとしては、単独ではＨ１が最も効果が高く、次いで、Ｐ３、Ｎ１（Ｎ２）、Ｐ２、Ｂ１、Ｈ２（Ｚ１）の効果が高かった。
　Ｎ１、Ｎ２は単独で同程度に効果があり、Ｂ１やＰ３との組合せも良好な結果であった。
　Ｐ１～Ｐ６の中では、Ｐ１～Ｐ３がＰ４～Ｐ６よりも優れていた。Ｐ１～Ｐ３の中では、Ｐ１はやや効率が低かった。Ｐ２、Ｐ３の切断部位は同じで効果もほぼ同じであった。
　Ｂ１～Ｂ４の中では、Ｂ１、Ｂ２が好ましく、Ｂ１がより好ましい結果となった。
　Ｈ２（Ｚ１）は単独での効果はやや低いものの、Ｈ１との組合せでは強い相乗効果を示した。
　ｇＲＮＡペアの２組の組合せでは、Ｎ１とＰ３との組合せ、Ｎ２とＰ３との組合せ、Ｎ２とＨ２との組合せ、Ｂ２とＨ２との組合せの効果が高かった。また、ｇＲＮＡペアの３組の組合せでは、Ｎ１とＢ１とＰ２との組合せ、Ｎ１とＨ１とＺ１との組合せ、Ｎ２とＢ１とＰ２との組合せ、Ｎ２とＢ１とＰ３との組合せ、Ｂ１とＰ２とＨ２との組合せ、Ｂ１とＰ３とＨ２との組合せの効果が高かった。
　ｇＲＮＡペアの４組の組合せとしては、（ｉ）Ｈ１と、（ｉｉ）Ｐ２又はＰ３、Ｎ１又はＮ２、Ｂ１、及びＺ１からなる群から選択される３種との組合せが好ましい。
（試験例３）
［実験に用いた８重ガイドＲＮＡ発現ユニット搭載アデノウイルスベクターの構造］
　本実験に用いたアデノウイルスベクター（Ａｄｅｘベクター）は、Ｍｉｙａｋｅ　Ｓ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ（ＰＮＡＳ，　９３：１３２０－１３２４，　１９９６）に記載されているものを用いた。具体的には、Ｅ１領域に塩基位置４５５～３，３２８の欠失（欠失長２，８７４塩基）及びＥ３領域に塩基位置２８，５９３－３０，４７０の欠失（欠失長１，８７８塩基）の欠失を持つ。このアデノウイルスベクターを基にして、後述の＜Ｌ４ポリＡ配列を回復したＬ４／Ｅ３欠失の延長＞の項目に記載したように、Ｌ４／Ｅ３領域の欠失範囲を拡大し、ベクター容量を増加させた。
　なお、世界でよく用いられているベクター（Ｂｅｔｔ　ＡＪ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＮＡＳ，　９１：８８０２－８８０６，　１９９４）の欠失は、Ｅ１領域で塩基位置３４２～３，５２８（欠失長３，１８７塩基）及びＥ３領域に塩基位置２８，１３３～３０，８１８（欠失長２，６８６塩基）である。アデノウイルスゲノムが粒子にパッケージングされるときに使われる領域は塩基位置１９４～３５８であり、Ｂｅｔｔ　ＡＪ　ｅｔ　ａｌ．では、本発明で用いている配列より１４８塩基短い。この相違により、機能配列はＡ１からＥ７まで７個あるが（Ｇｒａｂｌｅ　Ｍ　ａｎｄ　Ｈｅａｒｉｎｇ　Ｐ，　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，　６６：７２３－７３１，１９９２）、Ｂｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．のベクターはこのうちＡ５、Ａ６、Ａ７配列を欠失している。これに対し、本発明で用いられているＭｉｙａｋｅ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．のベクターは７個の機能配列を全て保持しているという構造上の違いがある。
　図２５～２７は、実験に用いた８重ガイドＲＮＡ発現ユニット搭載アデノウイルスベクターの構造を説明した模式図である。
　本実験に用いたアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの全長を含むコスミドベクターに目的遺伝子を挿入後、２９３細胞へトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスベクターを得る方法（完全長ＤＮＡ導入法：Ｆｕｋｕｄａ　Ｈ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　５０：６４３－６５４，２００６）により作製された。まずベクターゲノム全長をもつコスミドを９６穴プレートの２９３細胞へトランスフェクションを行い、２週間後にウイルスクローンを分離した。これを２９３細胞に感染させウイルスを継代・増幅することにより２次から５次までの継代ウイルスストック、及び精製ウイルスストックを調製した。この５次ウイルス及び精製ウイルスをＳｉＨａ細胞等に感染することにより、染色体上にあるＨＰＶ　ＤＮＡが含むＥ６、Ｅ７遺伝子を破壊する実験を行った。
　図２５は、ＣＢプロモーター（ＣＢ　ｐｒｏ）からＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクターの構造を示す。このベクターでは、ウイルスゲノムの左端近くのＥ１クローン化部位に、Ｃａｓ９ニッカーゼをＣＢプロモーターから発現するＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニット、Ｅ４部位に、８重ガイドＲＮＡを短縮Ｕ６プロモーターから発現する８重ガイドＲＮＡ発現ユニット（８ｇＲＮＡ）を持つ。
　図２６は、ＰＧＫプロモーター（ＰＧＫ　ｐｒｏ）からＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクターの構造を示す。このベクターでは、Ｅ４部位の末端に、Ｃａｓ９ニッカーゼをＰＧＫプロモーターから発現するＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニット、Ｅ４部位のＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットよりも内側に、８重ガイドＲＮＡを短縮Ｕ６プロモーターから発現する８重ガイドＲＮＡ発現ユニット（８ｇＲＮＡ）を持つ。
　図２７は、ＥＦプロモーター（ＥＦｄ　ｐｒｏ）からＣａｓ９ニッカーゼを発現するベクターの構造を示す。このベクターでは、Ｅ１クローン化部位に、Ｃａｓ９ニッカーゼをＥＦプロモーターから発現するＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニット、Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ユニットよりも内側に、４重ガイドＲＮＡを短縮Ｕ６プロモーターから発現する４重ガイドＲＮＡ発現ユニット（４ｇＲＮＡ）、Ｅ４部位に、Ｅ１部位に搭載した４重ガイドＲＮＡとは異なる４重ガイドＲＮＡを短縮Ｕ６プロモーターから発現する４重ガイドＲＮＡ発現ユニット（４ｇＲＮＡ）を持つ。すなわち８重ガイドＲＮＡ発現ユニットはＥ１部位とＥ４部位に２分割された形で組み込まれている。
　全てのベクターにおいてＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットは外向きに、また全てのガイドＲＮＡ発現ユニットは左向きに組み込まれた構造を持つ。
　プロモーター、多重ガイドユニットの挿入位置はＥ１領域が一般的である。Ｅ３領域で用いると周辺のアデノウイルス遺伝子の影響を受けるので好ましくないため本発明では用いていない（Ｓｕｚｕｋｉ　Ｍ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，　１－９，　２０１５）。
　Ｅ４領域はＥ１領域と同様にベクターゲノムの末端にあり、Ｅ４側しかアデノウイルス遺伝子の影響を受けない利点がある（つまりＥ３部位では両側あるいは内部の影響を受ける）。Ｅ４挿入部位は本発明者の一人である齋藤により開発され（上述した、Ｍｉｙａｋｅ　Ｓ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ　．，　ＰＮＡＳ，　９３：１３２０－１３２４，　１９９６）、世界で他には使われていない独自のものである。
　また３つのプロモーターの転写方向は少なくともＥ１領域については外向きが免疫反応をほとんど惹起しないため（Ｎａｋａｉ　Ｍ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，　１８：９２５－９３６，　２００７）、ＣＢ、ＰＧＫ、ＥＦｄプロモーターをすべて外向きで用いた。また多重ガイドＲＮＡの挿入位置と方向は、同じＵ６プロモーターで２重ユニットで転写されたｓｈＲＮＡがＥ４部位、内向きの効率がよいことを報告しているため（Ｐｅｉ　Ｚ，　Ｓａｉｔｏ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉ　Ｒｅｐ，　３：３５７５，　２０１３）、同じ部位と方向で用いた。
　図２６のＰＧＫプロモーターを発現するベクターではＥ１部位には外来ＤＮＡが組み込まれておらず、Ｅ４部位には８重ガイドＲＮＡ発現ユニット及びＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットという大きな外来ＤＮＡが組み込まれている。この構造はＲＣＡ（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）の生成を低減させることを目的としている（Ｓｕｚｕｋｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ，　１５８：１５４－１６０，　２０１１）。ＲＣＡは野生型ウイルスであり、２９３細胞の染色体上に存在しベクターでは欠失しているＥ１遺伝子とベクター上で残存する配列との相同組み換えにより生成する。しかし図２６のベクターでは、ＲＣＡがＥ１遺伝子を獲得するとＥ１遺伝子のサイズだけウイルスゲノムが伸長することを利用してＲＣＡの生成を低減させている。具体的にはベクターゲノムをアデノウイルスゲノムのパッケージング可能サイズの上限近くとすることにより、生成したＲＣＡゲノムがこのサイズを超えてしまうように設計されている。
＜Ｌ４ポリＡ配列を回復したＬ４／Ｅ３欠失の延長＞
　図２８は、アデノウイルスのＬ４／Ｅ３領域に関連する配列として、アデノウイルス５型の位置付けで第２７８０１番塩基～第２８２００番塩基の配列（配列番号８１）と、１２．４Ｋ遺伝子のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８２）を記載した。
ＧＡＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＣＧＣＧＧＴＡＡＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＣＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＡＴＣＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＧＣＴＴＡＣＣＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＧＣＣＣＧＴＡＧＣＣＴＧＡＴＴＣＧＧＧＡＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡＧＣＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＴＧＴＣＣＴＡＡＣＣＴＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＡＴ（配列番号８１）
ＭＬＳＧＥＡＥＱＬＲＬＫＨＬＶＨＣＲＲＨＫＣＦＡＲＤＳＧＥＦＣＹＦＥＬＰＥＤＨＩＥＧＰＡＨＧＶＲＬＴＡＱＧＥＬＡＲＳＬＩＲＥＦＴＱＲＰＬＬＶＥＲＤＲＧＰＣＶＬＴＶＩＣＮＣＰＮＬＧＬＨＱＤＬＣＣＨＬＣＡＥＹＮＫＹＲＮ（配列番号８２）
　アデノウイルス粒子へのパッケージングできる長さの上限は約３７．７ｋｂ（約１０５％）と報告されている（Ｂｅｔｔ　ＡＪ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，　６７：５９１１－５９２１，　１９９３）。もし本来の完全長ＤＮＡ導入法で用いられるバックボーンをそのまま使ってＣＢプロモーター及びＨＰＶ遺伝子を標的とした８個のガイドユニットを持つベクター（図２５）を作製しようとしても、パッケージングサイズを大幅に超過するため作製できない。また、もしＢｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．のベクターのＬ４／Ｅ３欠失を持ち（図２８の最下段、Ａｘ３ｄＢ）、かつＥ１欠失は完全なパッケージング領域を保持したベクターを作製しようとしても、ベクターサイズは３８．１ｋｂとなり、依然として上限を越えているためベクターを得ることはできない。
　そこで発明者はＬ４／Ｅ３欠失をＢｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．のベクターよりも拡張した新規ベクターの開発を試みてこれに成功した（図２８）。Ｂｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．のＬ４／Ｅ３欠失では、欠失の５’端はＬ４ポリＡ配列の上流にありこれを欠失し（図２８最下段、３ｄＢ及びＬ４ポリＡ配列）、一方で機能未知の１２．４Ｋ遺伝子を開始コドンから終始コドン直前（図２８最下段）までのほぼ全長を温存している。発明者はベクターのＬ４必須遺伝子群のポリＡ配列に何らかの機能があると考え、この周辺部分を含む６２塩基の配列を飛び地として回復し、代わりに機能未知の１２．４Ｋ遺伝子（アミノ酸を示す）のほぼ全長にあたる２７３塩基を、ポリＡ回復配列まで欠失させた（３ｄＰ；中間欠失の５’端と回復ポリＡ配列の３’端に位置する）。その結果Ｌ４／Ｅ３欠失は、Ｂｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．のＬ４／Ｅ３欠失と比べて、差し引き２１１塩基延長された。この欠失に用いたリバースプライマー配列（配列番号８３）を以下に示す。下線はプライマーの５’端として付加したＢｇｌＩＩ配列である。
ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＡＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＡＧＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧ（配列番号８３）
　この欠失の拡張とＬ４ポリＡ回復の影響を調べるため、３ｄＰ欠失を持ちＣＢプロモーターからＣａｓ９ニッカーゼを発現するベクター（Ａｘ３ｄＰ－ＣＢＮＣ９）、及び同じ構造で３ｄＢ欠失をもつベクター（Ａｘ３ｄＢ－ＣＢＮＣ９）を作製した。Ａｘ３ｄＰ－ＣＢＮＣ９、Ａｘ３ｄＢ－ＣＢＮＣ９の力価はそれぞれ５．０２×１０９、６．４０×１０９（単位ＴＣＩＤ５０，　ｎ＝３）でほぼ同じであった。すなわちＡｘ３ｄＰ－ＣＢＮＣ９はＡｘ３ｄＢ－ＣＢＮＣ９よりも２２１塩基広い欠失を持ちながら力価はほぼ同じに保たれた。
　ＣＢプロモーターからＣａｓ９ニッカーゼを発現し８個のガイドユニットを持つＡｘ３ｄＰ－ＨＰＶ８ｇ－ＣＢＮＣ９（図２５）は、このカセットベクターＡｘ３ｄＰ－ＣＢＮＣ９に８個のガイドユニットを組み込むことで作製された。このベクターのサイズは３７．９ｋｂとなり、上限とされる約３７．７ｋｂを上回った。従ってこの結果は、報告された上限が３７．７ｋｂであるという記載が常に正しいとは限らない可能性を示している。ＰＧＫプロモーター及びＥＦｄプロモーターをもつベクター（図２６、図２７）はＡｘ３ｄＰ－ＣＢＮＣ９を基本としてＣａｓ９ニッカーゼを発現するユニットのプロモーターの種類及びその位置を変えることで作製された。
　上記したＣａｓ９ニッカーゼをＣＢプロモーターから発現するＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットの配列（配列番号８４）は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４２３３５／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／でｐＸ３３５にある。配列番号８４中、１番目～８０５番目はＣＢプロモーター、８０６番目～５，０２６番目はＣａｓニッカーゼ、５，０２７番目～５，２４９番目はポリＡ（ウシ成長ホルモン由来）である。
　上記したＣａｓ９ニッカーゼをＰＧＫプロモーターから発現するＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットでは、配列番号８４におけるＣＢプロモーターを下記配列のＰＧＫプロモーター（配列番号８５）とし、ポリＡを下記配列のポリＡ（トリβ-グロビン由来）（配列番号８６）とした以外は、同様の構成とした。
ＡＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＡＧＣＴＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＣＴＧＣＣＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ（配列番号８５）
ＣＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡ（配列番号８６）
　上記したＣａｓ９ニッカーゼをヒトＥＦ１αプロモーター（「ＥＦプロモーター」と称することがある。）から発現するＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットでは、配列番号８４におけるＣＢプロモーターを下記配列の短縮されたＥＦプロモーター（配列番号８７）（ＥＦｄプロモーター）とした以外は、同様の構成とした。
ＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡ（配列番号８７）
　上記した多重ガイドＲＮＡ発現ユニットに用いた短縮Ｕ６プロモーターの配列（配列番号８８）は、下記の通りである。
ＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＴＧＴＡＣＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号８８）
（試験例４）
［ＨＰＶ１６陽性がん細胞に対する一体型アデノウイルスベクターの効果］
　上記試験例２の結果から、４組８個のｇＲＮＡとして好ましい態様の下記のｇＲＮＡ発現カセット（Ｓｅｔ２）を搭載した一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）を調製した。なお、アデノウイルスベクターには、図２６に記載のものを用いた。
（１）　Ｎ７
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ４８６Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧ（配列番号７２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣ（配列番号２）
（２）　Ｂ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ５６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号７）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
（３）　Ｐ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ７５３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ７０６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号１１）
（４）　Ｈ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ８９３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡ（配列番号１２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ８５９Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＴＡ（配列番号１３）
　上記した一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）を以下の細胞株に感染させ増殖抑制効果を調べた。
　・　ＨＰＶ１６陽性子宮頸がん細胞株
　　　５株　：　ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ、ＳＫＢＩＩＩｂ、ＱＧ－Ｈ、ＱＧ－Ｕ
　・　ＨＰＶ１６陽性中咽頭がん細胞株
　　　４株　：　ＳＣＣ９０、ＶＵ１４７Ｔ、ＵＭ－ＳＣＣ－４７、ＵＭ－ＳＣＣ－１０４
　・　子宮頸部由来正常上皮細胞
　　　２株　：　ＨＣＫ１Ｔ、ＨＦＦ２Ｔ
　増殖抑制効果は、下記のようにして試験した。
　各細胞を９６ウェルプレートに１，０００個／ウェルとなるように１２ウェルに播種し、翌日一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）をＭＯＩ＝０からＭＯＩ＝１，５００の７段階でトリプリケートとなるよう感染し、ＭＯＩ＝０でモック感染したウェルがコンフルエントになった１０日から１４日後にメタノール固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法で相対残存細胞数を定量した。各条件の３ウェルずつの残存細胞数の平均と標準誤差を算出し、モックのウェルを１００とした相対残存細胞数をグラフ化した。代表例として、ＨＰＶ１６陽性がん細胞株ＳｉＨａ、ＳＣＣ９０と、正常子宮頸部上皮細胞株ＨＣＫ１Ｔの結果を図２９に示す。
　試験の結果、Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９により、すべてのＨＰＶ１６陽性細胞株の増殖が顕著に抑制された。また、Ｅ６Ｅ７発現やＨＰＶゲノムコピー数の低下も認められた。そして、正常上皮細胞に対する細胞毒性はほとんどないことも確認された。
（試験例５）
［ＣＢ－ＮＣ９アデノウイルスベクターと、Ｓｅｔ２（Ｎ７Ｈ１Ｂ１Ｐ１）アデノウイルスベクターとを共感染した場合のＨＰＶ１６ゲノムの欠失］
　ＣＢ－ＮＣ９（又はＣＢ－Ｃａｓ９）を搭載したアデノウイルスベクターと、ガイドＲＮＡとしてＳｅｔ２（Ｎ７Ｈ１Ｂ１Ｐ１、試験例４参照）を搭載したアデノウイルスベクターとをＳｉＨａ細胞にＭＯＩ＝５００で感染させ、３日後にゲノムＤＮＡを回収した。標的配列より広い領域を以下のプライマーを用いＰＣＲで増幅し、ナノポアシーケンサーで解析した。アガロースゲル電気泳動の結果（図３０）と一致して、大部分の配列は大きな欠損を有しておりＥ６Ｅ７の遺伝子発現ができない状態になっていることが確認された。
＜プライマー＞
　・　４８１６＿ＨＰＶ１６－１４１Ｆ
　　　ｃａｇｇａｇｃｇａｃｃｃａｇａａａｇｔｔａｃｃ（配列番号８９）
　・　４８１４＿ＨＰＶ１６－１１３５Ｒ
　　　ｔｃａｃｔａａｇｔｇｇａｃｔａｃｃｃａａ（配列番号９０）
（試験例６）
［Ｓｅｔ　２－ＰＧＫ－ＮＣ９とＳｅｔ　２－ＥＦｄ－ＮＣ９の性能比較］
　試験例４と同様にして、４組８個のｇＲＮＡ（Ｓｅｔ２）を搭載した一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）を調製した。
　また、アデノウイルスベクターとして図２７に記載のものを用い、４組８個のｇＲＮＡ（Ｓｅｔ２）を搭載した一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＥＦｄ－ＮＣ９）を調製した。なお、ｇＲＮＡは、Ｅ１と、Ｅ４に分けてそれぞれ４個配置した。
　１，０００個／ウェルで９６ウェルに播種したＳｉＨａ細胞に、Ｓｅｔ　２－ＰＧＫ－ＮＣ９又はＳｅｔ　２－ＥＦｄ－ＮＣ９アデノウイルスベクターをＭＯＩ＝０、２、４、８、１６、３２、６３、１２８、２５６、５１２、１，０２４、又は２，０４８で感染し、１１日後に固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法で相対残存細胞数を定量し、グラフ化した（図３１）。値はトリプリケートの平均と標準誤差を示す。
　また、グラフから求めたＩＣ５０とＩＣ９０の値は、下記のとおりであり、約４～６．５倍ほどＳｅｔ　２－ＥＦｄ－ＮＣ９の活性が高いことが確認された。
　・　Ｓｅｔ　２－ＥＦｄ－ＮＣ９
　　　ＩＣ５０　・・・　４０
　　　ＩＣ９０　・・・　２５６
　・　Ｓｅｔ　２－ＰＧＫ－ＮＣ９
　　　ＩＣ５０　・・・　２５６
　　　ＩＣ９０　・・・　１，０２４
（試験例７）
［ＨＰＶ１６陽性がん細胞に対する一体型ベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）の効果］
　試験例４と同様にして、４組８個のｇＲＮＡ（Ｓｅｔ２）を搭載した一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）を調製した。この一体型アデノウイルスベクターを以下の細胞株に感染させ増殖抑制効果を調べた。
　・　ＨＰＶ１６陽性子宮頸がん細胞株
　　　ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩｂ
　・　ＨＰＶ１６陽性中咽頭がん細胞株
　　　ＵＭ－ＳＣＣ－１０４、ＶＵ１４７Ｔ
　・　子宮頸部由来正常上皮細胞
　　　ＨＣＫ１
　増殖抑制効果は、下記のようにして試験した。
　各細胞を９６ウェルプレートに１，０００個／ウェルとなるように１２ウェルに播種し、翌日一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ２－ＰＧＫ－ＮＣ９）をＭＯＩ＝０からＭＯＩ＝１，５００の７段階でトリプリケートとなるよう感染し、ＭＯＩ＝０でモック感染したウェルがコンフルエントになった１０日から１４日後にメタノール固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法で相対残存細胞数を定量した。各条件の３ウェルずつの残存細胞数の平均と標準誤差を算出し、モックのウェルを１００とした相対残存細胞数をグラフ化した。結果を図３２に示す。
（試験例８）
［ＨＰＶ１６陽性がん細胞に対する一体型ベクター（Ｓｅｔ　Ａ－ＥＦｄ－ＮＣ９）の効果］
　４組８個のｇＲＮＡ（Ｐ１Ｂ１Ｈ１Ｚ１、下記参照、なお、ｇＲＮＡは、Ｅ１と、Ｅ４に分けてそれぞれ４個配置した。）を搭載した以外は、試験例６と同様にして、一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ　Ａ－ＥＦｄ－ＮＣ９）を調製した。この一体型アデノウイルスベクターを以下の細胞株に感染させ増殖抑制効果を調べた。
（１）　Ｐ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ７５３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号３）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ７０６ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号１１）
（２）　Ｂ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ５６３ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号７）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ５０７Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号８）
（３）　Ｈ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ８９３Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡ（配列番号１２）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ８５９Ｇ
　　　　　標的配列　：　ＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＴＡ（配列番号１３）
（４）　Ｚ１
　　　・　センス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿Ｓ１４７１ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＡＴＧＣＡＡ（配列番号１４）
　　　・　アンチセンス鎖を標的配列とするｇＲＮＡ発現カセット
　　　　　１６＿ＡＳ１４３８ｇ＋
　　　　　標的配列　：　ｇＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧ（配列番号１５）
＜細胞株＞
　・　ＨＰＶ１６陽性子宮頸がん細胞株
　　　ＳｉＨａ、ＳＫＧＩＩＩｂ
　・　ＨＰＶ１６陽性中咽頭がん細胞株
　　　ＵＭ－ＳＣＣ－１０４、ＶＵ１４７Ｔ
　・　子宮頸部由来正常上皮細胞
　　　ＨＣＫ１
　増殖抑制効果は、下記のようにして試験した。
　各細胞を９６ウェルプレートに１，０００個／ウェルとなるように１２ウェルに播種し、翌日一体型アデノウイルスベクター（Ｓｅｔ　Ａ－ＥＦｄ－ＮＣ９）をＭＯＩ＝０からＭＯＩ＝１，５００の７段階でトリプリケートとなるよう感染し、ＭＯＩ＝０でモック感染したウェルがコンフルエントになった１０日から１４日後にメタノール固定し、Ａｃｉｄ　Ｒｅｄ法で相対残存細胞数を定量した。各条件の３ウェルずつの残存細胞数の平均と標準誤差を算出し、モックのウェルを１００とした相対残存細胞数をグラフ化した。結果を図３３に示す。
（試験例９）
［オフターゲット候補配列の選択と検出］
　８個のガイドＲＮＡについてオフターゲット切断の可能性が高いと思われる１２個のオフターゲット配列＃１～＃１２を選んだ。ＰＡＭ側の１２塩基（シード配列）が完全一致し、残りの８塩基のうちミスマッチが４塩基以下のものをＣＲＩＳＰＲＤｉｒｅｃｔにより選択した。そのうちＹ染色体配列の配列とＣＴリッチな１カ所を除き、１０カ所のオフターゲット効果をアンプリコンシーケンシングにより検出を試みた。
＜ＰＣＲに用いた配列＞
　・　＃１（ガイドＲＮＡ　：　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋）
　　　＄１Ｆ
　　　ＴＣＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣ（配列番号９１）
　　　＄１Ｒ
　　　ＴＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＡＡＡＡＧ（配列番号９２）
　・　＃２（ガイドＲＮＡ　：　１６＿ＡＳ４４３ｇ＋）
　　　＄２Ｆ
　　　ＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣ（配列番号９３）
　　　＄２Ｒ
　　　ＴＴＧＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＴＧＧ（配列番号９４）
　・　＃３（ガイドＲＮＡ　：　１６＿Ｓ４８６Ｇ＋）
　　　＄３Ｆ
　　　ＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣ（配列番号９５）
　　　＄３Ｒ
　　　ＧＣＧＡＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣ（配列番号９６）
　・　＃４（ガイドＲＮＡ　：　１６＿Ｓ４８６Ｇ＋）
　　　＄４Ｆ
　　　ＧＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＴＡＣ（配列番号９７）
　　　＄４Ｒ
　　　ＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣ（配列番号９８）
　・　＃５（ガイドＲＮＡ　：　１６＿ＡＳ５６３ｇ＋（ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧ（配列番号９９）））
　　　＄５Ｆ
　　　ＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＧ（配列番号１００）
　　　＄５Ｒ
　　　ＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡＧＣ（配列番号１０１）
　・　＃６（ガイドＲＮＡ　：　１６＿ＡＳ７０６ｇ＋）
　　　＄６Ｆ
　　　ＴＧＡＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴＡＡＧＡＧＴＧＣＴＴＡＣ（配列番号１０２）
　　　＄６Ｒ
　　　ＧＴＴＡＧＡＣＧＴＧＡＣＴＡＡＴＧＴＡＡＡＡＴＧＧ（配列番号１０３）
　・　＃７（ガイドＲＮＡ　：　１６＿ＡＳ７０６ｇ＋）
　　　＄７Ｆ
　　　ＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＴＣＴＧＣＡＡＣ（配列番号１０４）
　　　＄７Ｒ
　　　ＡＣＧＧＡＣＡＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧ（配列番号１０５）
　・　＃８（ガイドＲＮＡ　：　１６＿ＡＳ８５９Ｇ）
　　　＄８Ｆ
　　　ＧＧＧＡＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＴＡＡＡＡＴ（配列番号１０６）
　　　＄８Ｒ
　　　ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＴＧＧ（配列番号１０７）
　・　＃９（ガイドＲＮＡ　：　１６＿Ｓ８９３Ｇ）
　　　＄９Ｆ
　　　ＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＣＡＡＧＴＴＴＡＣ（配列番号１０８）
　　　＄９Ｒ
　　　ＴＡＡＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣ（配列番号１０９）
　・　＃１０（ガイドＲＮＡ　：　１６＿Ｓ８９３Ｇ）
　　　＄１０Ｆ
　　　ＧＣＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号１１０）
　　　＄１０Ｒ
　　　ＣＣＴＣＴＣＴＡＡＧＴＴＣＣＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＣ（配列番号１１１）
　その結果、Ｃａｓ９使用時には＄３で４２％、＄９で０．００５％のオフターゲット変異が検出された。一方、Ｃａｓ９ニッカーゼ使用時には＄３におけるオフターゲット変異はＣａｓ９使用時の１／１，０００以下であり、＄９ではオフターゲット変異は検出されなかった。なお、＄１、＄２、＄４～６、＄７、＄８、＄１０では、Ｃａｓ９及びＣａｓ９ニッカーゼのどちらもオフターゲット変異は検出されなかった。
（試験例１０：アデノウイルスベクターゲノム上の８個連続及び１２個連続のガイドＲＮＡ発現ユニットの安定性）
　８個連続及び１２個連続のガイドＲＮＡ発現ユニットをＥ４部位に組み組んだベクター（図３４～３５（Ａｘｇ８ＨＢＶ－ＤＲ２、Ａｘｇ１２ＨＢＶ－ＤＲ２－ＤＲ１）；Ｋａｔｏ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｓｃｉ，　２２：１０５７０，　２０２１）各６クローンの初代継代ストックを２９３細胞に感染し、細胞全ゲノムＤＮＡをＢｓｐＥＩで切断し電気泳動を行った。アデノウイルスゲノムは細胞あたり数千万コピーに増幅するため、ウイルスＤＮＡを分離することなくウイルスゲノム由来のバンドを見ることができる。結果を図３６～３７に示す。８個連続ユニットの場合（図３６）はクローン１、４及び６でユニットが欠失あるいは増幅により生じたバンド（星印）が明らかに認められた。一方、クローン２、３及び５では、ユニットが欠失あるいは増幅により生じたバンドは認められず、８連続ユニットに対応するバンド（四角で示す）はこの段階ではほぼ安定と考えられた。１２個連続ユニットの場合（図３７）は６クローン中４クローンで欠失あるいは増幅による濃いバンドが見られた。クローン２及び６では欠失等による明らかなバンドは認められなかった。
　なお、ガイドＲＮＡ発現ユニットの構成は、下記のとおりとした。
　Ｕ６プロモーター－標的塩基－ガイドＲＮＡ土台
　Ｕ６プロモーターの配列は、下記のとおりとした。
　ＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣ（配列番号１１２）
　ガイドＲＮＡ土台の配列は、下記のとおりとした。
　ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号１１３）
　標的塩基の配列は、下記のとおりとした。
　・　８個連続のガイドＲＮＡ発現ユニット
　　　（１）ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣ（配列番号１１４）
　　　（２）ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡ（配列番号１１５）
　　　（３）ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧ（配列番号１１６）
　　　（４）ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣＡＣＧＧ（配列番号１１７）
　　　（５）ＧＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴ（配列番号１１８）
　　　（６）ＧＡＣＣＴＴＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＴ（配列番号１１９）
　　　（７）ＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＡＣＣＴＴ（配列番号１２０）
　　　（８）ＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧ（配列番号１２１）
　・　１２個連続のガイドＲＮＡ発現ユニット
　　　　８個連続のガイドＲＮＡ発現ユニットの後に、下記の標的塩基を含むガイドＲＮＡ発現ユニットを配置した。
　　　（９）ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡ（配列番号１２２）
　　　（１０）ＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴ（配列番号１２３）
　　　（１１）ＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴ（配列番号１２４）
　　　（１２）ＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡ（配列番号１２５）
　そこで８連続ユニット及び１２連続ユニットで比較的安定と思われるクローン５及びクローン６をそれぞれ選択し、ウイルスストックを２９３細胞に感染して第３継代ストック（３ｒｄ）及び第４継代ストック（４ｔｈ）を調製し同じ方法で検討した（図３８～３９）。１２連続ユニットが完全に保たれているベクターのゲノムからは５．５ｋｂのＤＮＡが生じるが、ユニットが欠失しているベクターのゲノムからはこのＤＮＡは生じない。従ってユニットが欠失したベクターが含まれているストックは５．５ｋｂのバンドの濃さが減少する。図３９の１２ｇＲＮＡｓの３ｒｄ及び４ｔｈのレーンでは５．５ｋｂのバンドの濃さはその下の「Ａ」で示すアデノゲノムバックボーン由来のバンドに比べて３分の１以下に減少しており、大多数のベクターでは１２個のユニットは欠失のため保たれていないことが示された。この結果によりこのベクターを実験に用いることは断念した。一方８連続ユニットの場合（図３８の８ｇＲＮＡｓ）は８個の完全ユニットを示すバンドは３．８ｋｂであるが、濃さは保たれているものの定量の結果本来の濃さよりやや薄くなっていた。従って８連続ユニットの場合も少し欠失が起こったことが示された。なお４連続の場合は意図的に選択したクローン以外では欠失が検出されていない（Ｋａｔｏ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｓｃｉ，　２２：１０５７０，　２０２１）。
（試験例１１：ガイドＲＮＡ発現ユニットが１０個連続の場合の安定性）
　ガイドＲＮＡ発現ユニットが１０個連続のベクター（図４０）の場合を同様に検討した。切断する酵素はＳｍａＩを用いた。１０個連続のバンドは４．３ｋｂであり、その下にあるベクターバックボーン由来のバンド（「Ａ」で示す）と濃さを比較することにより欠失が検出できる（図４１）。６クローンのうちクローン３及び４以外では４．３ｋｂのバンドはその下のバンドより上にあるにもかかわらず薄くなっており、欠失が起きていることが示された。比較的安定と思われたクローン４を選択し、第３継代ストック及び第４継代ストックを調製し同様の実験を行ったところ（図４２）バンドの太さがやや減少していた。１０個連続では欠失が起こることが示された。
　なお、ガイドＲＮＡ発現ユニットの構成は、下記のとおりとした。
　Ｕ６プロモーター－標的塩基－ガイドＲＮＡ土台
　Ｕ６プロモーターの配列は、３’端をＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ、配列番号１５６）とした以外は、配列番号１１２と同様とした。
　ガイドＲＮＡ土台の配列は、試験例１０と同様に、配列番号１１３とした。
　標的塩基の配列は、下記のとおりとした。
　　　（１）ＧＧＣＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＧＧ（配列番号１２６）
　　　（２）ＧＴＧＡＴＣＴＧＣＧＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡ（配列番号１２７）
　　　（３）ＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＣＴＧＧＡＡ（配列番号１２８）
　　　（４）ｇＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＴＡ（配列番号１２９）
　　　（５）ＧＴＧＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡ（配列番号１３０）
　　　（６）ＧＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣＴＡＧＣＴＧＣＣ（配列番号１３１）
　　　（７）ＧＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣＡＴＧＡ（配列番号１３２）
　　　（８）ｇＣＡＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＣ（配列番号１３３）
　　　（９）ＧＴＴＣＡＧＡＣＡＣＧＡＴＧＣＣＣＡＡＣ（配列番号１３４）
　　　（１０）ＧＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧ（配列番号１３５）
（試験例１２：ガイドＲＮＡ発現ユニット１０個を２個と８個に分割して組み込んだベクターによる５遺伝子の同時ノックアウト）
　試験例１１における１０個のガイドＲＮＡ発現ユニットのうち２個（配列番号１３４、配列番号１３５）をＥ１部位、８個（配列番号１２６～配列番号１３３）をＥ４部位に組み込んだベクターを作製し（図４３）、１０連続の場合と同様に検討した。８連続ユニットを含む４．３ｋｂのバンドは６クローン全てにおいてその下のバンドと比較してやや濃さが減少していた（図４４）。減少が少ないと思われるクローン２及び５のうち前者を選択し、第３継代ストック及び第４継代ストックを調製し同様の実験を行ったところ（図４５）、バンドの太さがやや減少していた。従って１０個のユニットを２個と８個に分けて組み込んだ場合は、少なくとも８個連続の組み込み部分では少し欠失が起こっていた。この結果は試験例１０の結果と矛盾しない。
（試験例１３：ガイドＲＮＡ発現ユニット１０個を２個と８個に分割したベクターによる５遺伝子の同時ノックアウト）
　試験例１２で用いた１０個のガイドＲＮＡが実際に遺伝子をノックアウトできる活性を持つかどうかを検討した。１０個のガイドＲＮＡは２個ずつが組になり、５遺伝子（ｐ６２、ＮＢＲ１、ＯＰＴＮ、ＴＡＸ１ＢＰ１、ＮＤＰ５２）のダブルニッキング切断を行うように設計されている。試験例１２で用いた２個及び８個に分割したユニットを持つベクターを、ＣＢプロモーターによりＣａｓ９を発現するベクター（ＡｘＣＢＣａｓ９）又はＣａｓ９ニッカーゼを発現するベクター（ＡｘＣＢＮＣ９）（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉ　Ｒｅｐ，　１１：３９６１）と混合し、ＨｅｐＧ２細胞に共感染を行い、３日後に全細胞ＤＮＡを抽出した。感染条件は両ベクターとも感染重複度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，　ＭＯＩ）３０又は６０で行った。次いでそれぞれの標的遺伝子について、切断部位を含む断片をＰＣＲで増幅し、Ｔ７Ｅ１アッセイにより標的遺伝子に起こった挿入／欠失（インデル（ｉｎｄｅｌ））を検出した。図４６～５５中、１ｓｔと２ｎｄは２回の独立した実験の結果であることを示す。
　Ｃａｓ９発現ベクターとの共感染では、Ｃａｓ９により約１００塩基程度に近接した２カ所の同時切断によりその間が欠失する場合と、個々のガイドＲＮＡによりインデルが生成する場合の両方が起こる。Ｔ７Ｅ１アッセイによる効率は３２％～６１％であり、５遺伝子の同時ノックアウトが確認された。
　Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ベクターとの共感染では、４遺伝子で３０％～５５％の効率で同時ノックアウトが確認された。ダブルニッキング切断では両方のガイドＲＮＡが働いた場合のみで欠失が起きるため、この実験で８個のガイドＲＮＡの活性が確認された。１つの遺伝子（ＮＤＰ５２）では、Ｃａｓ９では４０％の効率が検出されたが、Ｃａｓ９ニッカーゼでは切断が検出されなかった。このことから２つのガイドＲＮＡのうち１つだけが活性を示したと考えられた。従ってこのベクターは本条件においてガイドＲＮＡ１０個のうち９個の同時発現を行ったことが示唆された。
（試験例１４：ガイドＲＮＡ発現ユニット１２個を６個２組に分割して組み込んだ場合の安定性）
　１２個のガイドＲＮＡ発現ユニットの６個をＥ１部位、別の６個をＥ４部位に組み込んだベクターを作製し（図５６）、２個と８個の場合と同様に２継代ストックを検討し、欠失が見られないクローンを選択して３継代ストック、第４継代ストック、及び第５継代ストックを調製し、ＢｓｐＥＩ及びＮｇｏＭＩＶで切断した結果を図５７及び５８に示す。ＮｇｏＭＩＶ切断（図５８）において、Ｅ４部位の６個のユニットを含む２．７ｋｂのバンドはその下のベクターバックボーン由来のバンドよりも３レーンともやや濃く、欠失が起きていないことが示された。またＥ１部位については、ＢｓｐＥＩ切断（図５７）においてこの６個のユニットを含む６．８ｋｂのバンドは、もし欠失がなければその下にあるバックボーン由来の４．４ｋｂの１．５５倍の濃さになるはずである。実際の６．８ｋｂのバンドの濃さは１．５５倍に比して十分に濃く、欠失は起きていても少ないと考えられた。しかし、第５継代ストック（レーン５ｔｈ）ではよく見ると６．８ｋｂの濃いバンドの下に階段状の薄いバンドがあり、１ユニットが約４００塩基であることからユニットがいくつか欠失したＤＮＡがわずかに存在することが示唆された。以上の結果からこのベクター上の１２個のユニットの欠失は非常に少なく、第４及び第５継代ストックでも極めて安定に保たれていることが明らかとなった。
　なお、ガイドＲＮＡ発現ユニットの構成は、配置位置及び標的塩基の配列を下記とした以外は、試験例１１と同様の構成とした。
　・　Ｅ４部位
　　　（１）ｇＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＴＴＣＴＣＧＡＡ（配列番号１３６）
　　　（２）ＧＡＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣ（配列番号１３７）
　　　（３）ＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣ（配列番号１３８）
　　　（４）ｇＣＴＡＧＴＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＡＣ（配列番号１３９）
　　　（５）ｇＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＴＡＴＣＡＧ（配列番号１４０）
　　　（６）ＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡ（配列番号１４１）
　・　Ｅ１部位
　　　（１）ｇＴＧＴＡＧＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡＴＣＡＣＣ（配列番号１４２）
　　　（２）ｇＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＴＣＣ（配列番号１４３）
　　　（３）ＧＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＡＡＴＡＡＧＴ（配列番号１４４）
　　　（４）ＧＣＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴ（配列番号１４５）
　　　（５）ｇＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣ（配列番号１４６）
　　　（６）ｇＡＡＡＴＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＣＡＣ（配列番号１４７）
　既に述べたように、１２個のユニットを連続して持つベクターの第４継代ストックの５．５ｋｂのバンド（試験例１０の図３９の１２ｇＲＮＡｓ、４ｔｈ）の濃さは３分の１以下に減少しており、第４継代ストックで既に欠失ベクターの方がはるかに多く、実験に用いることができなかった。この１２個のユニットを連続して持つベクターの結果を考えると、１２個のガイドＲＮＡユニットを６連続ずつ２カ所に分割して組み込むとほとんど欠失しないと言うことは驚くべき結果であり、多重ガイドユニットの欠失問題は少なくともこの実験系において解決されたといえる。
　試験例１２において、多重ガイドユニットを２分割してもその１つが８連続の場合は少し欠失していた。この結果と考え合わせると、ベクターゲノム上では連続ユニットが欠失しないのは少なくとも６個までであるということが示唆された。
（試験例１５：ＥＦ１αプロモーターを用いた一体型ベクターにおける８連続ガイドＲＮＡユニットの安定性）
　ＨＰＶ　ＤＮＡを標的とする一体型ベクターでは８連続ガイドＲＮＡ発現ユニットに加えてＣＢプロモーター又はＰＧＫプロモーターからＣａｓ９ニッカーゼを発現するユニットが組み込まれている。そしてＣａｓ９ニッカーゼをＣＢプロモーターから発現させた場合には少し欠失が起こり、ＰＧＫプロモーターを用いた場合には欠失があまり起こらないという結果であった。本試験例ではＣａｓ９ニッカーゼ発現プロモーターとして上記した短縮されたＥＦプロモーター（配列番号８７）（ＥＦｄプロモーター）からＣａｓ９ニッカーゼを発現するユニット（ＥＦｄＮＣ９）を持つ一体型ベクターを作製して用いた（図５９）。
　なお、ガイドＲＮＡ発現ユニットの構成は、配置位置及び標的塩基の配列を下記とした以外は、試験例１１と同様の構成とした。
　・　Ｅ４部位
　　　（１）ＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣ（配列番号１４８）
　　　（２）ｇＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡ（配列番号１４９）
　　　（３）ＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡ（配列番号１５０）
　　　（４）ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＧＣＴＴ（配列番号１５１）
　・　Ｅ１部位
　　　（１）ＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＴＴＡ（配列番号１５２）
　　　（２）ＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡ（配列番号１５３）
　　　（３）ｇＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＡＴＧＣＡＡ（配列番号１５４）
　　　（４）ｇＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧ（配列番号１５５）
　初代ベクターストックを用いた検討（図６０）では、８重ユニットを含む２．６ｋｂのバンドの濃さをそのすぐ下のゲノムバックボーン由来のバンドの濃さとの比較により、クローン１、５、６では濃さの減少はほぼ見られなかったが、他の３クローンでは減少し欠失が認められた。そこでクローン５を選択し、第３、第４及び第５継代ストックを調製し検討したところ、特に第５継代ストックにおいてバンドの濃さは半分以下に減少していた（図６１、レーン５ｔｈ）。
（試験例１６：ＥＦ１αプロモーターを用いた一体型ベクターにおいて８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを４個２組に分割して組み込んだ場合の安定性）
　８個のガイドＲＮＡユニットのうち４個をニッカーゼ発現ユニットとともにＥ１部位へ、他の４個をＥ４部位に組み込んだベクターを作製し（図６２）、初代ストックを用いた検討を行った（図６３）。試験例１５では８個のユニットは連続して１カ所に組み込まれているため制限酵素切断で１本のバンドに含まれているが、この試験例１６では４個ずつ２カ所に組み込まれているため２つの異なるバンドに含まれている。ＢｓｐＥＩによる切断でＥ４部位の４ユニットを含む１．９ｋｂのバンドはその下のバックボーン由来のバンドの濃さとの比較により６クローン全てにおいてほぼ減少を認めなかった。クローン１を選択して第３、第４及び第５継代ストックを調製し検討したところ減少がほとんど見られなかった（図６４）。Ｅ１についても４ユニットを持つ４．７ｋｂのバンドとバックボーン由来の４．４ｋｂのバンドの濃さの比較から、欠失はほとんどないと考えられた。試験例１５の図６１のレーン５ｔｈにおいてバンドの濃さは半分以下であったことを考えると驚くべき結果である。従って一体型においても、８個のユニットを４個２組に分割して組み込むことにより欠失を大幅に減少させることが可能であった。
（試験例１７：８個のショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ユニットを４個２組に分割して組み込んだ場合の安定性）
　ｓｈＲＮＡは２１塩基のセンスストランド、約９塩基のループ、２１塩基のアンチセンスストランド及び転写終始ポリＵからなる約６０塩基のＲＮＡで、細胞の核内でプロセスされて単独のアンチセンスＲＮＡとなり、ｍＲＮＡやＲＮＡウイルスゲノムと対合することにより発現抑制あるいはＲＮＡウイルスの増殖阻止を行う。アデノウイルスベクターゲノムに組み込まれた発現ユニットは４個まで報告があるが、ガイドＲＮＡと異なり２１基のパリンドロームによる強固な２次構造のため、４個を超える多重ユニットを持つアデノベクターが作製可能であるかどうかは不明であった。
　８個のｓｈＲＮＡ発現ユニットの４個をＥ１部位、別の４個をＥ４部位に組み込んだベクターを作製し（図６５）、多重ガイドＲＮＡの場合と同様に２継代ストックを検討した（図６６）。８ガイドＲＮＡの場合は分割した４ユニットに欠失が見られることはほとんどないが、少なくともこのｓｈＲＮＡについては６クローン中４クローンにおいて、ＢｓｐＥＩ切断によりＥ１部位由来の５．８ｋｂのバンドの上下に４ユニットで欠失あるいは重複による星印で示すバンドが見られた。この結果はｓｈＲＮＡの場合は多重ユニットが不安定な場合があることを示している。
　この６クローンのうち欠失が見られないクローン５を選択して３継代ストック、第４継代ストック、及び第５継代ストックを調製しＳｍａＩで切断した結果を図６７に示す。Ｅ１部位由来の２．４ｋｂ、Ｅ４部位由来の２．１ｋｂのどちらのバンドも近傍のバックボーン由来のバンドと比較して、濃さの減少は見られなかった。従って多重ｓｈＲＮＡユニット２分割法を用いれば第５継代ストックでも多重ユニットは極めて安定に保たれていることが明らかとなった。
（試験例１８：８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを４個２組に分割して組み込んだ一体型ベクターによるｉｎ　ｖｉｖｏ増殖抑制効果の検討）
　ＳＣＣ９０細胞はＨＰＶ　ＤＮＡを染色体上に約３００コピーもつヒト舌がん由来の細胞であり、ＨＰＶのＥ６及びＥ７の遺伝子の発現によりヌードマウスに腫瘍を形成する。
　本試験例では、３匹のヌードマウスにＳＣＣ９０細胞のゼノグラフト（種が異なる細胞のシート）を４カ所に移植した。次いでＨＰＶのＥ６及びＥ７遺伝子を標的とする上記試験例８に記載の一体型アデノウイルスベクター（ＳｅｔＡ－ＥＦｄＮＣ９）を２１日目から１日ごとに３回、２７日目から４回、３３日間から５回の腫瘍内投与を行なった（図６９中の下向き矢印）。１回のベクター投与量はそれぞれ合計６×１０１０ｐｆｕ、８×１０１０ｐｆｕ、１×１０１１ｐｆｕとした。
　なお、用いたガイドＲＮＡの標的塩基配列は配列番号１４８から配列番号１５５である。
　４１日目のマウスを図６８に示す。ベクターの代わりにＰＢＳを投与したコントロールマウス（図６８中、「ＰＢＳ」）と比較して３匹（図６８中、「ＡｄＶ－１」、「ＡｄＶ－２」、「ＡｄＶ－３」）とも明らかに腫瘍のサイズが縮小し、顕著な腫瘍増殖抑制効果を認めた。また腫瘍の大きさを経時的に測定した結果を図６９に示す。図６９中、○は「ＡｄＶ－１」、△は「ＡｄＶ－２」、□は「ＡｄＶ－３」、■は「ＰＢＳ」の結果を表す。３８日目、４１日目においてベクターを投与したマウスの腫瘍サイズは有意に縮小していた。以上から、８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを４個２組に分割して安定に持つベクターの顕著な腫瘍増殖抑制効果が示された。
（試験例１９：８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを６個と２個に分割して持つフェニルケトン尿症モデルマウスの治療実験に用いたベクターの構造）
　フェニルケトン尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ，ＰＫＵ）の白人における発生頻度は９，０００人に１人であり、その患者数は欧米だけで１５万人である。変異酵素はフェニルアラニン水酸化酵素であり、モデルマウスではフェニルアラニンがセリンに変異した「ＴＴＣ」→「ＴＣＣ」の１塩基変異である。また代謝異常疾患の遺伝病では、疾患により異なるが一般的に酵素活性が正常の１／１０でも日常生活に支障がない場合が多いため、ノックイン効率が１０％なら実質治癒、５％なら症状改善が期待される。従って本研究でもノックイン効率５％を目標とした。
　実験には図７０～７１に示す構造の２種類のノックインベクター、すなわち「ｇ（６＋２）ベクター」（図７０）及び「ＤＮ（３＋１）ベクター」（図７１）を作製して用いた（「ＤＮ」はダブルニッキングを行う２個のガイドＲＮＡを示す）。２つのベクターは共通して４ｋｂの大きなドナーＤＮＡを有し、置換すべき正常アミノ酸配列を中央部位に持つ。またどちらも８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを、Ｅ４部位に６個、Ｅ１部位に２個に分割して保持する。なお、これらのベクターには、Ｅ４部位及びＥ１部位に搭載するガイドＲＮＡ発現ユニットの数を変え、Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ユニットを搭載しなかった以外は、図２７に記載のアデノウイルスベクターを同じものを使用した。
　「ｇ（６＋２）ベクター」は、本来のＣａｓ９を発現するベクター「ＡｘＣａｓ９」との共感染により、ダブルニッキングを用いずに１箇所を高効率に切断し、ノックイン置換を行う。Ｅ４部位にはドナーＤＮＡと共に、後述の５種類のガイドＲＮＡ（ガイドａ～ｅ）の中で最も効率が高かったガイドｄを６個全ての発現ユニットで用いた。従って６個の発現ユニット（「６ガイド」）の塩基配列は同じである。
　またドナーＤＮＡの端を切断するとノックイン効率が上がるということが知られている（Ｉｒｉｏｎ　Ｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　ｖｏｌ．　１４１：４８２７－４８３０，　２０１４）。そこで、「ｇ（６＋２）ベクター」及び「ＤＮ（３＋１）ベクター」はＥ１部位にこの切断を行う２個のガイドＲＮＡを発現する２つのユニットを持ち、図７０～７１の縦の矢印で示す位置でドナーＤＮＡの左端を切断する。２つのガイドＲＮＡはオーバーラップしており、その標的塩基配列を以下に示す。
末端切断１　：　ｇＡＡＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＣＡ（配列番号１５７）
末端切断２　：　ｇＣＧＴＣＡＡＴＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣ（配列番号１５８）
　「ＤＮ（３＋１）ベクター」が有する８個のガイドＲＮＡ発現ユニットのうち、２個はＥ１部位にあり、ドナーＤＮＡの左端をダブルニッキングで切断するガイド（末端切断ｂ及び末端切断ｔ）である。６個はＥ４部位にあり、２個１組でダブルニッキング切断を行う３組のペアからなる。この３組は、図７２に示すように変異塩基近傍を標的として複数切断する（変異部位を右端に示す）。このベクターはＣａｓ９ニッカーゼを発現するベクター「ＡｘＮＣ９」と共感染で使用する。ダブルニッキングに用いるペアのガイドＲＮＡの５’端間の長さをオフセットと呼び、３組のダブルニッキングはオフセット長の違いにより、「ダブルニッキング－１」、「ダブルニッキング２」、「ダブルニッキング０」と呼ぶ。またガイドＲＮＡをガイドａ～ｅと呼ぶ（図７２）。
　なお、図７２に記載した正常配列は、マウスのフェニルアラニン水酸化酵素をコードする遺伝子の第４８，４２４～４８，５００番目の塩基配列である（下記配列番号１７８）。
ＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧ（配列番号１７８）
　また、図７２に記載の制限酵素（ＡｖｒＩＩ、ＳｔｕＩ）部位を含む配列は、「ＣＣＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧ」（配列番号１７９）である。
　以上のガイドＲＮＡの標的塩基配列を以下に示す。なお「ガイドｄ」は「ダブルニッキング２」の表鎖であるが、「ｇ（６＋２）ベクター」で単独切断を行う６個のガイドＲＮＡと同一である。
ガイドａ　：　ＧＴＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＣＧＧ（配列番号１５９）
ガイドｂ　：　ＧＡＣＧＡＣＡＧＴＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣ（配列番号１６０）
ガイドｃ　：　ｇＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴ（配列番号１６１）
ガイドｄ　：　ｇＴＣＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧ（配列番号１６２）
ガイドｅ　：　ｇＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣ（配列番号１６３）
末端切断ｂ　：　ｇＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧ（配列番号１６４）
末端切断ｔ　：　ｇＣＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡ（配列番号１６５）
（試験例２０：ＰＫＵマウス治療実験に用いた８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを６個と２個に分割して持つガイドＲＮＡ発現ユニットの安定性）
　「ｇ（６＋２）ベクター」について、第３次、第４次、第５次及びｉｎ　ｖｉｖｏ実験用精製ストック（以下、「ｐｕｒｉｆｙ」と称することがある。）を少量ずつ２９３細胞に感染し、感染細胞ＤＮＡを調製してＣｌａＩとＮｒｕＩで同時切断した結果を図７３に示す。Ｅ１部位由来の１．３ｋｂのバンドはバックボーン由来のバンドと比較して濃さの減少は認められなかったが、Ｅ４部位に組み込まれた６個のユニットを含む５．３ｋｂのバンドは減少が認められた。この減少は「ｇ（６＋２）ベクター」と「ＤＮ（３＋１）ベクター」に特異的であり、他の２０個近くの構築物では見られていない。原因は明らかではないが、「ｇ（６＋２）ベクター」、「ＤＮ（３＋１）ベクター」に特異的であることから、後述のドナーＤＮＡ下流領域ＤＮＡにある異常構造が強固な２次構造を引き起こして６重ガイドユニットのゲノム複製を阻害していることが考えられた。６重ユニットの位置がこのドナーＤＮＡ下流領域の異常構造の位置と極めて近接していることがこの原因を示唆している。
（試験例２１：ＰＫＵ治療用ノックインベクターのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける変異位置の上流及び下流でのノックイン効率の検討）
　実験の概略を図７４に示す。「ＰＫＵマウス変異ＰＡＨ配列」における「ｍ」はＰＫＵ変異を持つ細胞株上の配列であり、図７２に記載の正常マウス塩基配列にＰＫＵ変異（Ｔ→Ｃ）の１塩基を四角内に加えたものとなる。もしノックイン効率をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検討するための細胞株としてマウス由来細胞を用いると、本体の宿主がヒト細胞であるアデノベクターの導入効率が低いだけではなく、将来のｅｘ　ｖｉｖｏ治療モデルとのノックイン効率の比較を行うためにはヒト細胞である必要がある。そこでその細胞株として、モデルマウスの組織からＰＫＵ変異を中央に持ちドナーＤＮＡ断片より上流下流とも少し広い４ｋｂ超の断片をＰＣＲ法により調製し（「ＰＫＵマウス変異ＰＡＨ配列」における黒太線）、その断片を染色体に有するヒトＨｅｐＧ２細胞株（ＰＡＨ／ＨｅｐＧ２細胞株）を作製した。ＰＡＨは遺伝子名である。
　また図７４中段（「ドナーＤＮＡ」）に治療用ベクターが保持するドナーＤＮＡを黒太線で示す。もしドナー断片としてマウスの正常断片又は上記のＰＡＨ／ＨｅｐＧ２に組み込んだＤＮＡで変異１塩基を正常化したものをドナーＤＮＡとして用いると、ＰＫＵモデルマウスの配列と標的１塩基しか違わないため、ノックイン効率を調べるのが容易ではない。また正常断片を用いると、多重ガイドＲＮＡの標的配列がドナーＤＮＡを切断してしまうという問題がある。そこでドナーＤＮＡはＰＫＵ変異塩基が正常塩基であるだけでなく、ドナー配列の中に４塩基の人工変異を持つように設計した（図７４における「ドナーＤＮＡ」及び「修復配列」の中央四角内の「４ｎ」、及び図７２右下（「ドナーにおける変化」のＣ、Ａ、Ａ、Ａの４塩基）。図７５に、その人工変異からＰＫＵ変異（最後の塩基ｃ）までを四角文字で示す。
　図７５中、上段から順に、ＰＫＵマウスのアミノ酸配列（配列番号１８０）、ＰＫＵマウスの塩基配列（配列番号１８１）、ドナーの塩基配列（配列番号１８２）、ドナーのアミノ酸配列（配列番号１８３）を表す。なお、ＡｖｒＩＩ、ＳｔｕＩは、各制限酵素部位を表す。
ＰＫＵマウスのアミノ酸配列　：　ＦＬＧＧＬＡＦＲＶＳ（配列番号１８０）
ＰＫＵマウスの塩基配列　：　ＴＴＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴｃＣ（配列番号１８１）
ドナーの塩基配列　：　ＴＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣ（配列番号１８２）
ドナーのアミノ酸配列　：　ＦＬＧＧＬＡＦＲＶＦ（配列番号１８３）
　この人工変異はアミノ配列を変えずにＡｖｒＩＩと　ＳｔｕＩの切断配列を有することで、ノックインによる修復に成功した細胞ＤＮＡはこの制限酵素部位を持つことになり、その検出を容易にする。またこの４塩基はドナーＤＮＡだけにある特異的配列であるためマウスゲノムとの相補性を持たず、ドナーＤＮＡだけを検出するＰＣＲプライマーの設計を可能とする。さらに、４塩基のうち３塩基（Ｃ、Ａ、Ａ）は治療用ガイドＲＮＡであるガイドｃ、ｄ、ｅの２０塩基の標的配列と重なるため、これらのガイドＲＮＡがドナーＤＮＡを切断することを防いでいる。
　ＰＡＨ／ＨｅｐＧ２細胞株に、「ｇ（６＋２）ベクター」又は「ＤＮ（３＋１）ベクター」と、「Ｃａｓ９発現ベクター」又は「Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ベクター」とをそれぞれＭＯＩ　１０で感染し、３日後に全細胞ＤＮＡを抽出して、ＰＣＲでの検討をドナーの４塩基変異の上流及び下流に分けて行なった。上流及び下流の結果はそれぞれＬアーム領域及びＲアーム領域での相同組換えによるノックイン効率を示唆する。用いたＰＣＲプライマーの塩基配列を以下に示す。上流リバースプライマー及び下流フォワードプライマーは下線で示した４塩基のドナーＤＮＡ特異的人工塩基配列を保持しており、マウスＤＮＡと対合しない。従ってこのＰＣＲは正常化される前のマウスＤＮＡ配列を検出せず、目的の正常化されたドナー配列だけを検出する。
上流プライマー１４０Ｆ　：　ＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＣ（配列番号１６６）
上流プライマー１１５Ｒ　：　ＣＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＧＣＣＴＣＣＴＡＧ（配列番号１６７）
下流プライマー１１３Ｆ　：　ＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡ（配列番号１６８）
下流プライマー１４３Ｒ　：　ＣＣＡＴＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＧ（配列番号１６９）
　ＰＣＲの結果を図７６に示す。「ｇ（６＋２）ベクター」、「ＤＮ（３＋１）ベクター」とも上流領域と下流領域とでノックインによるバンドが検出された（上流領域の＊印はマウスゲノム由来の非特異的なバンドである）。ベクター同士の比較では、「ＤＮ（３＋１）ベクター」によるバンドは上流下流ともに「ｇ（６＋２）ベクター」より薄く（バンドの左右の比較）、この実験においては３カ所のダブルニッキング切断よりもガイドｄの６ガイドＲＮＡによる切断の相加効果の方が、効率が高いことが示唆された。従ってこの後の検討は「ｇ（６＋２）ベクター」のみで行うことにした。
　意外なことに、「ｇ（６＋２）ベクター」でも「ＤＮ（３＋１）ベクター」でも上流領域のノックイン効率と下流領域のノックイン効率に差があり（バンドの上下の比較）、下流の効率は上流の効率の半分以下あるいはさらに低いことが示された。この実験は定量実験ではないが、上流ノックインを行なった分子のかなりの部分が、Ｒアーム領域内で起きたリアレンジのため、下流プライマーの位置まで到達できていないことが示唆された。実際に、Ｒアーム領域では制限酵素切断ができない、次の実験で下流プライマー１４３Ｒが働かない、あるいは別の実験で一本鎖ＤＮＡの存在が示唆されるなど、異常な立体構造が示されており、下流領域のノックイン効率の低下を来している可能性が考えられた。
（試験例２２：変異塩基位置の上流下流領域全体のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるノックイン効率の検討）
　変異位置の上流と下流を合わせた全体のノックイン効率を検討するために、ＰＡＨ／ＨｅｐＧ２細胞に、「ｇ（６＋２）ベクター」と「Ｃａｓ９発現ベクター」をそれぞれＭＯＩ　１０となるように感染し、全細胞ＤＮＡを抽出した。そしてドナー配列の両外側にプライマーを設定したＰＣＲを行い、その全長ＰＣＲ断片（４ｋｂ超）を図７２で示したＳｔｕＩで切断して泳動することによりノックイン効率の定量を行なった。ＳｔｕＩ（ＡＧＧＣＣＴ（配列番号１８４））は図７４下段のプライマー１１５Ｒ及びプライマー１１３Ｒの配列の中に含まれており、全長ＰＣＲ断片をこの位置で切断する。また下流側のプライマー１４３Ｒはこの実験では働かなかったため、その外側にプライマー１９３Ｒを設定し使用した（図７４下段）。その結果を図７７に示す。またプライマー１９３Ｒの塩基配列を以下に示す。
下流プライマー１９３Ｒ　：　ＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＣＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＣ（配列番号１７０）
　ＳｔｕＩはノックインにより導入される。ＳｔｕＩにより全長ＤＮＡが切断されて生ずる２本のバンド（矢印）の濃さは、切断されないバンド（上方の濃いバンド）と比較して、ノックイン効率は約２．９％（ｎ＝３）であった。また非相同性阻害剤あるいは相同組換え促進剤であるバニリン、Ｌ７５５５０７、ＳＣＲ７を用いたところ、わずかに効率が上昇した（図７８～８０）。さらに、「ｇ（６＋２）ベクター」と「Ｃａｓ９発現ベクター」の量比を変えて実験を行った結果、１：３の比率で約３．３％、１：９では約３．６％の効率でノックインが起きていることが示唆された（図８１）。この結果からｉｎ　ｖｉｖｏの実験においてはベクターの比率を１：３としてバニリンを用いることにした。
（試験例２３：ＰＫＵ治療用ノックインベクターのｉｎ　ｖｉｖｏにおけるノックイン効率及び血中フェニルアラニン量の低下）
　ＰＫＵモデルマウスの新生仔に、図８２に示すタイムコースにより「ｇ（６＋２）ベクター」及び「Ｃａｓ９発現ベクター」を出生時に顔面静脈投与、８週目に尾静脈投与を行い、１３週目に肝臓を回収した（ｎ＝４）。ベクターの投与量は出生時に４×１０８ｐｆｕ／マウス、８週目に４×１０８ｐｆｕ／マウスであり、８週目以降は１００ｍｇ／ｋｇのバニリンの持続投与を追加した。
　投与後６週目（初回投与のみ）及び１３週目にシグマ社のキットを用いて血中フェニルアラニン濃度を測定した（図８３、図８４）。６週目では血中フェニルアラニン濃度がコントロールマウスよりわずかに低下し、１３週目では最大で約３０％低下した。この結果から２回投与の有用性が示唆された。しかしｃ５７ＢＬ／６マウスの毛色はＰＫＵではメラニンの低下により灰色であるが、全行程を通じて毛色の変化は見られなかった。
　１３週目の肝臓から全ＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法で変異位置の上流及び下流でのノックイン効率検討を行なった結果を図８５に示す。用いたプライマーはｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験の図７６と同一である。その結果はｉｎ　ｖｉｔｒｏの結果と同様に確かにノックインが起きていること、また下流ＰＣＲにおいて上流ＰＣＲよりも効率が低いことが示唆され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの結果が再現された（図８５中の星印は非相同組換えによるバンドである。さらに上流及び下流領域全体のノックイン効率を、図７７で用いたプライマーによるＰＣＲ及びＳｔｕＩで検討した結果（図８６）、ドナー領域全体を修復するノックインの効率は約１％であった。一方同じプライマーを用いたＴ７Ｅ１アッセイでミスマッチを検出した結果（図８７）、約３０％の効率で挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）が形成されており、ガイドＲＮＡとＣａｓ９による切断効率はかなり高いことが示唆された。従ってノックイン効率が低いのは切断効率以外が原因である可能性が示唆された。
　以上より現在のノックイン効率はｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて３．６％、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて１％であったが、血中フェニルアラニン濃度は約３０％減少した。症状改善の目安が５％とするとまだ１回投与での治療レベルに達していないが、本研究では変異の下流領域に異常な２次構造があると考えられたため、他のケースを検討する必要があると考えられた。
（試験例２４：ＰＫＵ治療用のｃＤＮＡノックインベクターの作製）
　一般的な点変異修復とｃＤＮＡノックインの比較を図８８に示す。点変異修復では１つの変異塩基だけを正常化するが（図８８上段）、１つの疾患でも変異塩基は極めて多種類存在し、点変異塩基の種類の数だけベクターを作製する必要がある。一方ｃＤＮＡノックイン法では変異塩基部位はそのままにして（図８８下段）、大きな治療用遺伝子発現ユニットを持つドナーＤＮＡを、安全とされるセーフハーバー領域（マウスＲｏｓａ２６領域）に組み込むため（図８８中央）、１疾患１ベクターが実現する。またｃＤＮＡを入れ代えるだけで多くの遺伝病の治療ベクターを次々に作製することが可能である。
　本試験例では、ｃＤＮＡノックインベクターとしてＰａｈ遺伝子発現ユニット又はＧＦＰ発現ユニットを搭載する「Ｐａｈ（２＋２）」又は「ＧＦＰ（２＋２）」の２つのベクターを作製して用いた。その構造を図８９に示す。これらのベクターには、搭載する発現ユニットを変え、Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ユニットを搭載しなかった以外は、図２７に記載のアデノウイルスベクターを同じものを使用した。
　これらのベクターの使用はＣａｓ９発現ベクターとの共感染で用いる。ドナーＤＮＡのサイズは、ヒトＰａｈ発現ユニットを用いた場合は６．８ｋｂ、ＧＦＰ遺伝子発現ユニットを用いた場合は６．２ｋｂであり、このサイズはＡＡＶベクターの組み込み可能なサイズ（４．７ｋｂ）をはるかに超えている。このドナーＤＮＡは、１．７ｋｂの右アームＤＮＡと１．９ｋｂの左アームＤＮＡ（図８９左中央）に挟まれたＰａｈ正常遺伝子発現ユニット（２．３ｋｂ）又はＧＦＰ発現ユニット（１．８ｋｂ）（図８９左上段）、及びマウスＣｙｐｏｒ遺伝子を標的とする２個のｓｈＲＮＡ発現ユニット（図８９左中段の２個のダイヤ（◇））からなる。これらは、ベクターのＥ１部位に組み込んだ。両アームの長さの合計は３．６ｋｂと非常に大きく、これまでのベクターでは既に述べた点変異修復実験（合計４ｋｂ）以外に類を見ない。またノックインで組み込まれるユニットの長さはそれぞれ２．３ｋｂと１．８ｋｂであるが、このような長大なＤＮＡを組み込むノックインは非常に難しいことが予想された。なおＣｙｐｏｒ遺伝子（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｐ４５０　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を標的とするｓｈＲＮＡはアセトアミノフェンを介したｉｎ　ｖｉｖｏ選択法に用いられるものを用いた（Ｔｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ　Ａ，　Ｇｒｏｍｐｅ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｃｏｍｍｕｎ，　１３：７３９１，　２０２２）。
　またノックインのためのセーフハーバー領域を標的とする２個のガイドＲＮＡ発現ユニットがベクターのＥ４部位に組み込まれている（図８９右側の２個の四角）。また同じ標的配列（２０塩基）がドナーＤＮＡの右末端に組み込まれており、ドナーＤＮＡがこの位置で切断されることにより（図８９中央のはさみ）、ノックイン効率が上昇する。ガイドＲＮＡの標的塩基配列を以下に示す。
セーフハーバー領域及びドナーＤＮＡ末端を標的とするガイドＲＮＡ　：　
ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＧ（配列番号１７１）。
（試験例２５：Ｅ１部位に組み込まれた２個のｓｈＲＮＡ発現ユニット、及びＥ４部位に組み込まれた２個のガイドＲＮＡ発現ユニットの安定性）
　本ベクターは２個のｓｈＲＮＡ発現ユニットと２個のガイドＲＮＡ発現ユニットの合計４個のＵ６プロモーター発現ユニットを持つが、ベクターゲノム上でこれらのユニットが欠失なく維持されるかを試験例１１の図４１と同様の方法で検討した（図９０（「Ｐａｈ（２＋２）」ベクター）及び図９１（「ＧＦＰ（２＋２）」ベクター））。その結果どちらのベクターでも６クローンすべてにおいてユニットの脱落は検出されず、４個のユニットは安定に維持されていた。
（試験例２６：２重Ｃｙｐｏｒ　ｓｈＲＮＡのノックダウン効率の検討）
　図８９に示すように本ベクターは複数のｓｈＲＮＡ発現ユニットと複数のガイドＲＮＡ発現ユニットの両方を搭載するノックダウン／ノックインベクター（ＫＤ／ＫＩ多重ユニットベクター）である。ｓｈＲＮＡ発現ユニットとガイドＲＮＡ発現ユニットをそれぞれ複数有する構造のベクターはこれまで報告がない。一般論として、遺伝子発現を阻止するには遺伝子ＤＮＡをノックアウトすると同時にｍＲＮＡのノックダウンも行うことができれば、発現阻止を異なる機構で同時に行うことにより相加あるいは相乗効果が期待できる。特にガイドＲＮＡにより遺伝子のノックアウトあるいはノックインを行いながら、Ｃｙｐｏｒ　ｓｈＲＮＡの同時発現によりゲノム編集が行われた細胞を選択的に増殖させるという組み合わせを１つのベクターが行うことができれば、効率の高いゲノム編集が期待できる。ＡＡＶベクターではサイズ制限のためこれを行うことが難しい。またユニットの安定性を保つには多重ユニットはＥ１部位とＥ４部位の２カ所に分割されて組み込まれていることが望ましい。本ベクターは２ユニットずつ組み込まれた構造でこれを満たしている。
　本ベクターで発現する多重ガイドＲＮＡが活性を有することはノックインを生ずることから明らかである。これと同時発現する２個のｓｈＲＮＡが、標的のＣｙｐｏｒ　ｍＲＮＡの発現をノックダウンする活性を検討するため、Ｈｅｐａ１－６細胞に、「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」、「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」、又は発現ユニットを持たない「１ｗ１ベクター」をＣａｓ９発現ベクターと共にそれぞれＭＯＩ　３０で感染し、３日後に全細胞ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡの２μｇを用いてランダムプライマー法でｃＤＮＡを調製し、発現しているＣｙｐｏｒ　ｍＲＮＡを定量した。その結果を図９２に示す。検出されたＣｙｐｏｒ　ｍＲＮＡの量は、コントロールの「１ｗ１ベクター」を感染した場合と比較して、「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」は４％、「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」は３％に減少していた。このとき、同じｃＤＮＡに存在しているマウスＴＦＲＣ遺伝子のｍＲＮＡを定量したところ、「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」はコントロールの９９％、「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」はコントロールの８０％であり大きな差は見られなかった。以上の結果からＣｙｐｏｒ　ｓｈＲＮＡのノックダウン効率は、「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」と「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」でそれぞれ約９６％、約９７％であり、非常に高いことが示唆された。この高い効率の理由の１つは、それそれのｍＲＮＡ標的に対して２個のｓｈＲＮＡを同時発現しているためその相加効果が考えられる。
　本実験で用いたｓｈＲＮＡ、及び検出に用いたプライマーの標的塩基配列を以下に示す。また、ｓｈＲＮＡの配列の下線部分は、ｓｈＲＮＡ標的２１塩基の表鎖及び裏鎖を示す。なお、ｓｈＲＮＡの配列中、表鎖と裏鎖の間の下線を付していない部分は、ループ配列であり、末端の７つのＡは終止ポリＵをコードする配列である。
Ｃｙｐｏｒ　ｓｈＲＮＡ　１　：
ＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＴＧＡＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１７２）
Ｃｙｐｏｒ　ｓｈＲＮＡ　２　：
ＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１７３）
Ｃｙｐｏｒ　ｍＲＮＡ検出プライマー２６８－Ｆ　：
ＧＧＧＡＣＴＣＴＣＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＧＴＧＣ（配列番号１７４）
Ｃｙｐｏｒ　ｍＲＮＡ検出プライマー２６９－Ｒ　：
ＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号１７５）
ＴＦＲＣ　ｍＲＮＡ検出プライマー２７０－Ｆ　：
ＡＴＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣ（配列番号１７６）
ＴＦＲＣ　ｍＲＮＡ検出プライマー２７１－Ｒ　：
ＴＧＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣ（配列番号１７７）
（試験例２７：ｃＤＮＡノックインベクターのノックイン効率）
　図９３はノックイン前のセーフハーバー領域（Ｒｏｓａ２６領域）のマウスゲノム（図９３上段）、ノックインベクター上のドナーＤＮＡ（図９３中段）及びノックイン後のマウスゲノム上のドナーＤＮＡ（図９３下段）の構造を示す図である。
　ｃＤＮＡノックイン法の効率を調べるため、マウス肝臓由来細胞株であるＨｅｐａ１－６に、「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」又は「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」をＣａｓ９発現ベクター「ＡｘＣＢＣａｓ９」と共にそれぞれＭＯＩ　１００で感染し、３日後に全細胞ＤＮＡを抽出し、図９３に示す２７７Ｆプライマー及び２７９Ｒプライマーを用いて３５サイクルのＰＣＲを行なった。これらのプライマーはドナーＤＮＡ配列の外に位置しており、「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」でノックインが行われた場合は６．９ｋｂ、「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」でノックインが行われた場合は６．４ｋｂ、ノックインが行われなかった場合は３．８ｋｂのバンドを生ずる。その結果を図９４に示す。
　「Ｐａｈ（２＋２）ベクター」では、ドナーＤＮＡ全長を含む６．９ｋｂのバンドが明瞭に見られ、ノックインが行われなかった場合の３．８ｋｂのバンドと濃さを比較することにより、ノックイン効率は約７％と推定された（図９４中の「Ｐａｈ（２＋２）＋Ｃａｓ９」）。また、「ＧＦＰ（２＋２）ベクター」でもドナーＤＮＡ全長を含む６．４ｋｂのバンドが見られ、同様の比較によりノックイン効率は約４％と推定された（図９４中の「ＧＦＰ（２＋２）＋Ｃａｓ９」）。この効率はドナーＤＮＡの長さが２．３ｋｂ又は１．８ｋｂと長大であることを考えると驚くべき高さである。
　この６．９ｋｂ及び６．４ｋｂのバンドがほぼドナーＤＮＡからなるかを検討するため、このＰＣＲ　ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断した結果を図９５に示す。ＢａｍＨＩ切断によりこのバンドは完全に消失し、得られたバンドのサイズはドナーＤＮＡと予想されるものと一致した。この結果により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて約７％と約４％の効率でｃＤＮＡノックインに成功していることが確認された。
　既に述べたようにＰａｈ遺伝子を点変異修復するｉｎ　ｖｉｔｒｏノックイン実験では最も高い効率は３％台であるが、アームの長さの合計はＰａｈ遺伝子領域の点変異修復で約４ｋｂ、本実験のマウスセーフハーバー領域のノックインでは約３．６ｋｂであり、むしろ本実験の方がやや短い。この高い効率は、ドナーＤＮＡの末端を切断する方法による効果だけでは説明が難しい。むしろ点変異修復の実験では標的変異部位下流にある異常な２次構造を生じる配列による効率の低下のためという可能性が高いと考えられた。実際に本実験の発現ユニット挿入部位の上流及び下流ＤＮＡのノックイン効率を別々に検討し比較した結果は、予想通り両者で差はほとんど見られなかった。この結果は、本ベクターは点変異修復ノックインにおいても一般的には高い効率が得られる可能性を残している。
　本出願は、２０２３年２月２日に出願した日本国特許出願２０２３－０１４８９９号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願２０２３－０１４８９９号の全内容を本出願に援用する。

Claims (31)

  1. 　ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、Ｃａｓ９ニッカーゼ又はそれをコードする核酸分子とを含み、
    　前記ＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子が、下記（１）～（３３）から選択されるＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア又はペアの組合せを含むことを特徴とするヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物：
    （１）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （３）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （４）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （５）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （６）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （７）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （８）　配列番号１で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２で表される配列若しくは配列番号２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （９）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１０）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１１）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１２）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１３）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号４で表される配列若しくは配列番号４で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１０で表される配列若しくは配列番号１０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１４で表される配列若しくは配列番号１４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１５で表される配列若しくは配列番号１５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１４）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１５）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１６）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１７）　配列番号２３で表される配列若しくは配列番号２３で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２４で表される配列若しくは配列番号２４で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１８）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （１９）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２０）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２１）　配列番号１６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２０で表される配列若しくは配列番号２０で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２２）　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２７で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２３）　配列番号２５で表される配列若しくは配列番号２５で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２６で表される配列若しくは配列番号２６で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１８で表される配列若しくは配列番号１８で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１９で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号２１で表される配列若しくは配列番号２１で表される配列の第２～２０番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号２２で表される配列若しくは配列番号２２で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２４）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア；
    （２５）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア；
    （２６）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペア；
    （２７）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２８）　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （２９）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （３０）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （３１）　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （３２）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ；
    （３３）　配列番号７で表される配列若しくは配列番号７で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号８で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１１で表される配列若しくは配列番号１１で表される配列の第３～２１番目の塩基を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号１２で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号１３で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアと、
    　配列番号５で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子と、配列番号６で表される配列を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ又はそれをコードする核酸分子のペアとの組合せ。
  2. 　前記ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子及び前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子が、核酸ベクターに搭載されている請求項１に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  3. 　前記核酸ベクターが、組換えアデノウイルスベクター又は組換えレンチウイルスベクターである請求項２に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  4. 　前記組換えアデノウイルスベクターが、Ｌ４／Ｅ３領域において、１２．４Ｋ遺伝子配列を欠失し、かつＬ４ポリＡ領域配列を有する組換えアデノウイルスベクターである請求項３に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  5. 　ベクターゲノム上で合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して有する請求項４に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  6. 　ベクターゲノム上で合計６個以上のＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して有する請求項５に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  7. 　ベクターゲノム上で合計８個以上のＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子を２カ所以上の部位に分割して有する請求項５に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  8. 　ＣａｓガイドＲＮＡをコードする核酸分子の最多の連続数が６個である請求項５に記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  9. 　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子が、配列番号８７で表される短縮されたＥＦプロモーターの下流に位置する請求項２から３のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  10. 　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子と、前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子とを同一ベクター上に有する請求項２から３のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  11. 　前記核酸ベクターが組換えアデノウイルスベクターであり、
    　前記Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする核酸分子が、前記アデノウイルスベクターのＥ４領域に搭載されている請求項４から５のいずれかに記載のＨＰＶ陽性がん又はＨＰＶ陽性前がん病変遺伝子治療用医薬組成物。
  12. 　Ｌ４／Ｅ３領域において、１２．４Ｋ遺伝子配列を欠失し、かつＬ４ポリＡ領域配列を有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクター。
  13. 　Ｌ４／Ｅ３領域において、アデノウイルス５型の位置付けで、第２７，８６４番塩基～第２８，１３７番塩基、及び第２８，２００番塩基以降が欠失している請求項１２に記載の組換えアデノウイルスベクター。
  14. 　ベクターゲノム上で合計４個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクター。
  15. 　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されている請求項１４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
  16. 　前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されている請求項１４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
  17. 　ベクターゲノム上で合計６個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する請求項１４から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  18. 　ベクターゲノム上で合計８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する請求項１４から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  19. 　ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数が６個である請求項１４から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  20. 　Ｃａｓタンパク質発現ユニットを有する請求項１４から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  21. 　組換えアデノウイルスベクターが請求項１２から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである請求項１４から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  22. 　ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を標的とするＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する請求項１４から１６のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  23. 　ベクターゲノム上で合計６個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを２カ所以上の部位に分割して有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクター。
  24. 　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットが、アデノウイルスの必須領域の少なくとも一部を挟んだ２カ所以上の部位に分割して搭載されている請求項２３に記載の組換えアデノウイルスベクター。
  25. 　前記ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットが、前記アデノウイルスベクターのＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域からなる群から選択される２カ所以上の部位に分割して搭載されている請求項２３に記載の組換えアデノウイルスベクター。
  26. 　ベクターゲノム上で合計８個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットを有する請求項２３から２５のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  27. 　ショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットの最多の連続数が４個である請求項２３から２５のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  28. 　組換えアデノウイルスベクターが請求項１２から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである請求項２３から２５のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。
  29. 　ベクターゲノム上で、２個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、２個以上のショートヘアピンＲＮＡ発現ユニットとを有することを特徴とする組換えアデノウイルスベクター。
  30. 　ＣａｓガイドＲＮＡの標的がセーフハーバー領域であり、ショートヘアピンＲＮＡの標的がＣｙｐｏｒ　ｍＲＮＡである請求項２９に記載の組換えアデノウイルスベクター。
  31. 　組換えアデノウイルスベクターが請求項１２から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクターである請求項２９から３０のいずれかに記載の組換えアデノウイルスベクター。

     
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