WO2024144315A1 - 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서 및 이를 이용한 프로테아제 검출용 키트 - Google Patents

표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서 및 이를 이용한 프로테아제 검출용 키트 Download PDF

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WO2024144315A1
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protease
hcg
target protease
target
detecting
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유태현
박현지
김유선
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아주대학교산학협력단
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the purpose of the present invention is to provide a protease sensor for conveniently detecting protease through a point-of-care test.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for on-site detection of protease including the protease sensor and a strip on which the hCG antibody is immobilized.
  • the present invention also provides a kit for detecting a target protease comprising:
  • Figure 1 shows a method for analyzing protease activity using a pregnancy diagnostic strip according to the present invention
  • Figure 1A schematically shows the protease analysis method according to the present invention.
  • Figure 1B shows the results of protease activity analysis using a pregnancy test strip.
  • Figure 1C shows the results of protease activity analysis using a pregnancy test strip using Image J software.
  • Figure 1E shows the steps for generating site-specifically modified hCG-biotin conjugate.
  • Figure 3 shows the results of applying purified hCG-SpyTag protein to an hCG test strip.
  • Figure 4 shows the results of SDS-PAGE analysis confirming whether SpyCatcher is resistant to the proteases (MMP-2, caspase-3, and thrombin) used in the present invention.
  • Figure 5B schematically shows the results expected to have an MMP-2 cleavage site in the N-terminal region of the SpyCatcher sequence.
  • Figure 5C shows the results confirmed by SDS-PAGE after reacting dN-SpyCatcher with MMP-2.
  • Figure 6 shows the results of applying the MMP-2 sensor manufactured in Example 2 to an hCG strip.
  • Figure 7D shows the results of quantifying the concentration of thrombin in a solution by applying a thrombin sensor.
  • Figure 8A shows MMP-2 activity analysis using a smartphone-based detector, in a, an analysis device using a smartphone flash as a light source and a smartphone camera as a light receiver, and equipped with a gadget for hCG strip analysis. It is shown.
  • Figure 8B shows the results of an hCG strip loaded with samples reacted with various concentrations of MMP-2 by the MMP-2 sensor and the resulting MMP-2 concentration analysis results.
  • Figure 8C shows the results of confirming the concentration of MMP-2 in urine using the POCT system according to the present invention.
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • hCG is engineered to have site-specific binding biotin and a peptide sequence that can be cleaved by a target protease between hCG and biotin, and the hCG protein is immobilized on beads coated with streptavidin to produce a protease sensor. did. The beads immobilized with hCG in the protease sensor are too large to pass through the membrane of the hCG test strip, resulting in the generation of only one band in the control line.
  • protease sensor When the peptide linker is hydrolyzed by the targeting protease, hCG is released from the beads and signal appears in both the control and test lines.
  • three protease sensors for matrix metalloproteinase-2, caspase-3, and thrombin were constructed by replacing protease-cleavable peptide linkers.
  • detection of each specific protease in the picomolar range is possible with a 30-minute reaction of hCG immobilized beads and samples.
  • the protease sensor according to the present invention features modular design and simple analysis procedures, making it easy to develop POCT for various protease disease markers.
  • the present invention detects a target protease in which hCG protein and biotin are linked by a linker having a peptide sequence that can be cleaved by a target protease, and the hCG protein is immobilized on a bead coated with streptavidin.
  • a linker having a peptide sequence that can be cleaved by a target protease, and the hCG protein is immobilized on a bead coated with streptavidin.
  • the hCG protein and biotin are bound by a peptide sequence that can be cleaved by a targeting protease using the SpyCatcher/SpyTag system, Thiol-maleimide reaction, protein modification system using unnatural amino acids, Sortase reaction, and Transglutaminase reaction. , Formylglycine generation enzyme reaction, etc. can be performed through a method selected from the group consisting of.
  • protease sensor refers to a ‘complex’ of protein and streptavidin that can be used to detect protease.
  • the "protease sensor” of the present invention has a form in which hCG protein and biotin are linked by a linker having a peptide sequence that can be cleaved by a target protease, and the hCG protein is immobilized on beads coated with streptavidin.
  • FIG. 1A A protease sensor was fabricated by immobilizing hCG protein on a bead and engineering the hCG protein to be released from the bead by the enzymatic action of the targeting protease. After incubating the hCG-immobilized beads with a sample containing the target protease, the reaction mixture was prepared. was directly applied to a commercially available pregnancy diagnosis strip. In an embodiment of the present invention, it was confirmed that three proteases, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), caspase-3, and thrombin, could be analyzed in the picomolar range.
  • MMP-2 matrix metalloproteinase-2
  • caspase-3 caspase-3
  • thrombin thrombin
  • the linker sequence may include the peptide sequence of GPLGVR (SEQ ID NO: 1).
  • the linker sequence may include the peptide sequence of LVPRGS (SEQ ID NO: 3).
  • MMP-2 cleavage site sequence (SEQ ID NO: 1): GPLGVR
  • Thrombin cleavage site sequence (SEQ ID NO: 3): LVPRGS
  • the protease activity analysis method proposed in the present invention is schematically shown in Figure 1A.
  • hCG is linked to biotin modified at a specific site, and the linker between hCG and biotin contains a peptide sequence that can be cleaved by a targeting protease.
  • the resulting hCG-biotin conjugate is immobilized on streptavidin-coated beads through an irreversible bond between biotin and streptavidin, and the hCG immobilized beads are used as protease sensors. Because the beads are large, they cannot pass through the membrane of the hCG detection strip and application of the beads produces only one control band at the identification line of the strip. However, when the peptide bond between the bead and hCG is hydrolyzed by protease, hCG is released from the bead and passes through the membrane, causing both control and test lines to appear.
  • the present invention relates to a method for quantifying a target protease comprising the following steps:
  • the reaction solution may contain a stabilizer for protease enzymes such as neotrehalose, isotrehalose, raffinose, and melegitose, a buffer solution, etc.
  • a stabilizer for protease enzymes such as neotrehalose, isotrehalose, raffinose, and melegitose, a buffer solution, etc.
  • the kit may further include an enzyme reaction solution, and the enzyme reaction solution may include a stabilizer for protease enzymes such as neotrehalose, isotrehalose, raffinose, and melegitose, a buffer solution, etc. .
  • a stabilizer for protease enzymes such as neotrehalose, isotrehalose, raffinose, and melegitose, a buffer solution, etc.
  • the present invention also provides a method for detecting a target protease using a smartphone comprising the following steps:
  • the pSPEL150 plasmid expresses an orthogonal pair of aminoacyl-tRNA synthetase and tRNA from Methanococcus jannaschii
  • the pSPEL168 plasmid expresses prolyl-tRNA synthetase to prevent erroneous incorporation of AzF into the Pro site.
  • hCG is a heterodimeric protein composed of alpha and beta subunits.
  • the SpyTag sequence was fused to the C-terminus of the beta subunit with a His6 tag, designated hCG-SpyTag ( Figure 2B and Table 1).
  • hCG-SpyTag His6 tag

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Abstract

본 발명은 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서 및 hCG 항체가 고정되어 있는 임신진단용 스트립을 이용한 표적 프로테아제의 검출 및 정량 방법과 상기 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서를 포함하는 표적 프로테아제 검출용 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 기존에 상용화 되어 있는 임신진단 스트립을 이용하여, 질병 진단의 바이오마커로 사용되는 표적 프로테아제를 높은 민감도로 간편하게 검출 및 정량할 수 있다.

Description

표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서 및 이를 이용한 프로테아제 검출용 키트
본 발명은 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서 및 hCG 항체가 고정되어 있는 임신진단용 스트립을 이용한 표적 프로테아제의 검출 및 정량 방법과 상기 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서를 포함하는 표적 프로테아제 검출용 키트에 관한 것이다.
펩타이드 결합의 가수분해를 촉매하는 프로테아제는 면역 반응, 혈액 응고, 발달, 세포사멸 및 상처 치유를 포함한 다양한 세포 과정에 관여한다. 따라서, 프로테아제의 조절장애는 암, 신경퇴행성 장애, 만성 상처 및 응고 장애를 포함한 여러 질병과 관련이 있다. 또한, 바이러스의 프로테아제는 바이러스 감염 경로에서 중요한 역할을 하기 때문에 중요한 연구 주제이다. 따라서, 질병 및 약물 개발의 진단 및 예후를 위한 프로테아제 활성을 측정하는 방법이 개발되었다(Dudani et al.Annual Review of Cancer Biology 2:353, 2018; Oliveira-Silva et al. Trends Biochem Sci 45:604, 2020). 특히, 프로테아제 활성에 대한 현장 진료 검사(POCT)는 질병의 조기 진단 및 모니터링을 위한 새로운 기회로 최근 주목받고 있다(Oliveira-Silva et al. Trends Biochem Sci 45:604, 2020). 그러나 현재 사용되는 대부분의 방법은 형광, 발광 또는 전기화학에 의존하고 복잡한 기기가 필요하며 종종 의료 진단 실험실에서만 진단이 가능한 단점이 있다. 나노 입자 또는 조작된 단백질을 사용하는 흡광도에 기반한 대체 방법이 보고되었지만 숙련된 스킬이 요구되고, 생물학적 샘플 구성 요소의 간섭을 포함하여 이를 현장진단검사(POCT)로 개발하는 데 한계가 있다.
제한된 자원환경에서 POCT를 개발하는 것은 어려운 일이며 현재 상업적으로 이용 가능한 제품은 거의 없는 실정이다. 따라서, 현장 진단을 위한 분석법인 de novo를 설계하는 대신 기존제품과 결합한 방법이 주목받고 있다. 예를 들어, 표적 바이오마커의 존재를 인버타아제의 방출 또는 합성으로 해석하는 전략이 제안되었다(Jang et al. 2019; Xiang and Lu 2011; Zhang et al. 2019). 인버타아제 효소는 자당을 포도당으로 전환시켜 개인 혈당 측정기(PGM)를 사용하여 분석할 수 있다. 단백질, 핵산, 대사 산물 및 금속 이온을 포함한 비포도당 표적에 대한 다양한 방법이 보고되었다(Jang et al. 2019; Qiu et al. 2018; Xiang and Lu 2012; Zhang et al. 2019). 그러나 이러한 방법을 사용할 때 혈액이나 소변 샘플에 포도당이 있으면 문제가 될 수 있다.
한편, 인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG)을 감지하는 임신진단 스트립은 상업용 POCT 제품으로, 임신진단 스트립에 기반한 방법은 임산부의 샘플을 제외하고 간섭으로 인해 발생하는 문제가 적을 수 있다. 등온 증폭 방법은 핵산을 검출하기 위해 상용 임신진단 스트립과 결합되었으며(Du et al. Angewandte Chemie International Edition 56:992, 2017), 이러한 방법 중 하나는 나중에 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2에 대한 테스트를 개발하는 데 적용되었다(Yang et al., Analytical chemistry 93:11956, 2021). hCG 검출 스트립을 사용하여 다른 핵산 검출 방법도 개발되었다(Qi et al., Angewandte Chemie International Edition 60:24823, 2021; Zhong et al., Sensors and Actuators B: Chemical 337: 129778,2021). 그러나 PGM과 비교하여 상업적인 임신진단 스트립은 다른 바이오마커를 검출하는 방법을 개발하는 데 거의 활용되지 않았다.
따라서, 본 발명에서는 프로테아제를 현장진단 검사로 간편하게 검출하기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, hCG 단백질과 비오틴이 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열에 의해 결합되고, hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서와 hCG를 검출할 수 있는 상용 임신진단 스트립을 사용하는 경우, 프로테아제를 간편하게 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 프로테아제를 현장진단 검사로 간편하게 검출하기 위한 프로테아제 센서를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 프로테아제를 현장진단 검사로 간편하게 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로테아제 센서와 프로테아제 반응용액을 포함하는 프로테아제 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로테아제 센서와 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립을 포함하는 프로테아제의 현장검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 스마트폰을 이용하여 현장에서 표적 프로테아제를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 표적 프로테아제의 검출방법을 제공한다:
(a) 상기 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
(c) 유리 hCG와 hCG 항체의 결합을 확인하여 표적 프로테아제를 검출하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 표적 프로테아제의 정량방법을 제공한다:
(a) 상기의 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
(c) 유리 hCG와 hCG 항체의 결합을 확인하여 표적 프로테아제를 정량하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 프로테아제 센서와 프로테아제 반응용액을 포함하는 프로테아제 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음을 포함하는 표적 프로테아제 검출용 키트를 제공한다:
(a) 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서; 및
(b) hCG 항체가 고정되어 있는 스트립.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 스마트폰을 이용하여 표적 프로테아제를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 표적 프로테아제 검출용 키트에 포함된 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
(c) 상기 스트립을 스트립 장착용 가제트가 설치된 스마트폰에 적용하여, 스마트폰의 플래시를 광원으로 사용하고 스마트폰 카메라를 광수신기로 사용하여, 표적 프로테아제를 정량하는 단계.
도 1은 본 발명에 따른 임신진단 스트립을 사용한 프로테아제 활성 분석 방법을 나타낸 것으로, 도 1A는 본 발명에 따른 프로테아제 분석 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1B는 임신진단 스트립을 사용한 프로테아제 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1C는 임신진단 스트립을 사용한 프로테아제 활성 분석 결과를 Image J 소프트웨어를 사용하여 나타낸 것이다.
도 1D는 본 발명에 따른 프로테아제 활성을 측정하기 위해 제안된 방법을 적용하기 위한 분석 절차를 나타낸 것이다.
도 1E는 부위 특이적으로 변형된 hCG-비오틴 접합체를 생성 단계를 나타낸 것이다.
도 1F는 dN-SpyCatcher의 비오틴화 및 dN-SpyCatcher-Biotin과 hCG-SpyTag 간의 접합에 대한 결과를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다. dN-SpyCatcher는 N-말단이 잘린 SpyCatcher를 의미한다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용한 SpyCatcher 시스템을 나타낸 것으로, a는 SpyCatcher 단백질의 구조를 나타낸 것이고, b는 이다. 의 구조를 나타낸 것이다. b는 hCG와 SpyTag 단백질의 결합을 나타낸 것이다.
도 3은 정제된 hCG-SpyTag 단백질을 hCG 테스트 스트립에 적용한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 SpyCatcher가 본 발명에서 사용된 프로테아제(MMP-2, caspase-3 및 트롬빈)에 내성이 있는지 여부를 확인한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 SpyCatcher를 MMP-2와 함께 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5B는 SpyCatcher 시퀀스의 N-말단 영역에서 MMP-2 절단 부위를 가지는 것으로 예상되는 결과를 도식화한 것이다.
도 5C는 dN-SpyCatcher와 MMP-2를 반응 시킨 후 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 2에서 제작한 MMP-2 센서를 hCG 스트립에 적용한 결과를 나타낸 것이다.
도 7A는 hCG 단백질을 Streptactin Sepharose에 고정시키고, dN-SpyCatcher, dN-SpyCatcher-Biotin, dN-SpyCatcher-MMP-2 및 dN-SpyCatcher-MMP-2-Biotin을 hCG-SpyTag와 접합시켜, 생성된 분자를 Streptactin Sepharose와 혼합한 후, 상기 4가지 비드를 MMP-2와 반응시킨 후, hCG 스트립에 로딩한 결과를 나타낸 것이다.
도 7B는 MMP-2 센서를 적용하여 용액의 MMP-2의 농도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7C는 카스파제-3 센서를 적용하여 용액의 카스파제-3의 농도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7D는 트롬빈 센서를 적용하여 용액의 트롬빈의 농도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7E는 MMP-2 센서, 카스파제-3 센서 및 트롬빈 센서를 이용하여, 3가지 센서의 교차반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8A는 스마트폰 기반 검출기를 이용한 MMP-2 활성 분석을 나타낸 것으로, a는 스마트폰 플래시를 광원으로 사용하고 스마트폰 카메라를 광수신기로 사용하고, hCG 스트립 분석을 위한 가제트가 장착된 분석장치를 나타낸 것이다.
도 8B는 MMP-2 센서가 다양한 농도의 MMP-2와 함께 반응시킨 샘플이 로드된 hCG 스트립 결과 및 이에 따른 MMP-2 농도 분석결과를 나타낸 것이다.
도 8C는 본 발명에 따른 POCT 시스템을 사용하여, 소변의 MMP-2 농도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG)을 감지하는 상업용 임신진단 스트립을 사용하여 프로테아제 활성을 분석하는 간단하고 민감한 방법을 개발하였다. 본 발명에서는 hCG를 부위 특이적 결합 비오틴과 hCG와 비오틴 사이에 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 갖도록 조작하고, 상기 hCG 단백질을 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정하여, 프로테아제 센서를 제작하였다. 상기 프로테아제 센서에서 hCG로 고정된 비드는 hCG 테스트 스트립의 막을 통과하기에 너무 커서 대조군 라인에서 하나의 밴드만 생성하게 된다. 펩타이드 링커가 표적 프로테아제에 의해 가수분해되면, 비드로부터 hCG가 방출되고, 대조군 라인 및 시험 라인 모두에서 신호가 나타나게 된다. 본 발명에서는, 실례로, 매트릭스 메탈로프로티나제-2, 카스파제-3 및 트롬빈에 대한 3개의 프로테아제 센서를 프로테아제 절단 가능한 펩티드 링커를 대체하여 구축하였다. 본 발명의 프로테아제 센서와 상업용 임신 스트립의 조합에 의하면, hCG 고정된 비드 및 샘플의 30분 반응으로 피코몰(picomolar) 범위의 각 특정 프로테아제 검출이 가능하다. 본 발명에 의한 프로테아제 센서는 모듈식 설계와 간단한 분석 절차를 특징으로 하여, 다양한 프로테아제 질병 마커에 대한 POCT 개발에 용이하다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 hCG 단백질과 비오틴이 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열에 의해 결합되는 것은 SpyCatcher/SpyTag 시스템, Thiol-maleimide 반응, 비천연아미노산을 이용한 단백질 변형 시스템, Sortase 반응, Transglutaminase 반응, Formylglycine generation enzyme 반응 등으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에서 "프로테아제 센서"는 프로테아제 검출에 사용할 수 있는 단백질과 스트렙타비딘의 '복합체'를 의미한다.
본 발명의 "프로테아제 센서"는 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 형태를 가진다.
본 발명에서는 프로테아제 활성을 분석하는 간단한 방법을 개발하였다(도 1A). hCG 단백질을 비드에 고정하고, 표적하는 프로테아제의 효소작용에 의해 hCG 단백질이 비드에서 방출되도록 조작한 프로테아제 센서를 제작하고, hCG-고정 비드를 표적 프로테아제를 함유하는 샘플과 함께 인큐베이션한 후, 반응 혼합물을 시판되는 임신진단 스트립에 직접 적용하였다. 본 발명의 양태에서는 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), 카스파제-3 및 트롬빈의 3 가지 프로테아제를 피코몰 범위에서 분석가능한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 MMP-2인 경우, 상기 링커의 서열은 GPLGVR(서열번호 1)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 카스파제-3인 경우, 상기 링커의 서열은 DEVE(서열번호 2)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 트롬빈인 경우, 상기 링커의 서열은 LVPRGS(서열번호 3)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
MMP-2 절단 부위 서열(서열번호 1): GPLGVR
카스파제-3 절단 부위 서열(서열번호 2): DEVE
트롬빈 절단 부위 서열(서열번호 3): LVPRGS
본 발명에서 제안된 프로테아제 활성 분석 방법을 도 1A에 개략적으로 나타내었다. hCG는 특정 부위에서 변형된 비오틴과 연결되며, hCG와 비오틴 사이의 링커는 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 포함한다. 생성된 hCG-비오틴 접합체는 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 비가역적 결합을 통해 스트렙타비딘이 코팅된 비드에 고정되며, hCG 고정화 비드는 프로테아제 센서로 사용된다. 상기 비드는 크기가 크기 때문에, hCG 검출 스트립의 막을 통과할 수 없으며 비드를 적용하면 스트립의 확인 라인에서 대조군 밴드 하나만 생성된다. 그러나 비드와 hCG의 펩타이드 결합이 프로테아제에 의해 가수분해되면 hCG가 비드에서 방출되어 막을 통과하여 대조군과 테스트 라인이 모두 나타나게 된다.
본 발명의 방법을 사용하여 얻은 결과의 예를 도 1B 및 도 1C에 나타내었다. 본 발명의 일 양태에서, 프로테아제 분석방법의 절차는 3단계로 구성된다(도 1D):
i) 프로테아제 센서, 즉, hCG 고정 비드를 샘플과 함께 반응시킨다;
ii) 반응 혼합물을 상업용 임신진단 스트립의 샘플 패드에 직접 적용한다; 및
iii) 스트립 이미지를 휴대용 장치로 촬영한 다음 분석한다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 표적 프로테아제의 검출방법에 관한 것이다:
(a) 상기 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
(c) 유리 hCG와 hCG 항체의 결합을 확인하여 표적 프로테아제를 검출하는 단계.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 표적 프로테아제의 정량방법에 관한 것이다:
(a) 상기의 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
(c) 유리 hCG와 hCG 항체의 결합을 확인하여 표적 프로테아제를 정량하는 단계.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 프로테아제 센서와 프로테아제 반응용액을 포함하는 프로테아제 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 반응용액은 네오트레할로스, 이소트레할로스, 라피노스, 멜레지토스 등의 프로테아제 효소의 안정화제, 완충용액 등을 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 표적 프로테아제 검출용 키트에 관한 것이다:
(a) 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서; 및
(b) hCG 항체가 고정되어 있는 스트립.
본 발명에 있어서, 상기 hCG 단백질과 비오틴이 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열에 의해 결합되는 것은 SpyCatcher/SpyTag 시스템, Thiol-maleimide 반응, 비천연아미노산을 이용한 단백질 변형 시스템, Sortase 반응, Transglutaminase 반응 및 Formylglycine generation enzyme 반응으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 MMP-2인 경우, 상기 링커의 서열은 GPLGVR(서열번호 1)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표적 프로테아제가 카스파제-3인 경우, 상기 링커의 서열은 DEVE(서열번호 2)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 표적 프로테아제가 트롬빈인 경우, 상기 링커의 서열은 LVPRGS(서열번호 3)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립는 임신 진단용 스트립인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 키트는 효소 반응용액을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 효소 반응 용액은 네오트레할로스, 이소트레할로스, 라피노스, 멜레지토스 등의 프로테아제 효소의 안정화제, 완충용액 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 스마트폰을 이용하여 표적 프로테아제를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 표적 프로테아제 검출용 키트에 포함된 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
(c) 상기 스트립을 스트립 장착용 가제트가 설치된 스마트폰에 적용하여, 스마트폰의 플래시를 광원으로 사용하고 스마트폰 카메라를 광수신기로 사용하여, 표적 프로테아제를 정량하는 단계.
본 발명에서 상기 스트립 장착용 가제트는 도 8A에 나타난 바와 같이, 스트립 장착용 홀더(holder)와 스마트폰 카메라에 장착되어 상기 홀더에 장착된 스트립을 촬영할 수 있도록 하는 trigonal prism이 구비된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 프로테아제 활성 분석을 위해 상업용 임신진단 스트립을 사용하는 방법을 개발하였으며, 임신진단 스트립에 의해 그 존재가 검출되는 hCG는 1) 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정화를 위해 특정 부위에서 비오틴이 hCG에 접합되었고, 2) 비오틴과 hCG 사이의 연결이 표적 프로테아제에 의해 절단되게 된다. hCG로 고정된 비드는 크기가 크기 때문에 임신진단 스트립을 통과할 수 없었지만 표적 프로테아제에 의해 비드에서 방출된 hCG는 대조군과 테스트 라인 모두에서 신호를 생성할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 SpyTag와 SpyCatcher 사이의 이소펩티드 결합 형성 반응을 사용하여 hCG에 비오틴과 프로테아제 절단 서열을 도입하였다. hCG의 베타-서브유닛은 C-말단에 SpyTag 서열을 가지도록 설계하였다. SpyCatcher는 비오틴 및 프로테아제 절단 서열과의 접합을 위해 AzF를 포함하도록 설계하였다. 이 디자인은 다양한 프로테아제 센서에 대해 포유류 세포에서 발현되는 조작된 hCG을 사용할 수 있게한다. AzF 및 프로테아제 절단 부위가 있는 SpyCatcher는 Escherichia coli와 같은 미생물에서 고수율로 발현시켰다.
본 발명의 다른 양태에서는, 본 발명의 방법을 적용하여 다양한 질병과 관련이 있다고 보고된 MMP-2, caspase-3 및 트롬빈에 대한 프로테아제 센서를 개발하였다. 표적 프로테아제는 프로테아제 센서 및 샘플의 30분 인큐베이션 후 피코몰 범위에서 검출될 수 있었다. hCG 스트립 신호는 비전문가에게 편리한 도구를 제공할 수 있는 가젯이 장착된 스마트폰을 사용하여 판독할 수 있다.
본 발명에 따른 프로테아제 센서의 디자인은 모듈식이며 SpyCatcher에서 프로테아제 절단 시퀀스를 대체하여 최소한의 수정으로 다른 프로테아제에 적용할 수 있다. 짧은 반응시간과 임신 진단 스트립을 사용한 분석으로 구성된 분석 절차는 간단하고 빠르다. 따라서, 본 발명에 따른 프로테아제 검출 방법은 다양한 프로테아제에 대한 POCT 개발에 적용될 수 있을 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 해당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 부위 특이적으로 변형된 hCG-비오틴 접합체(프로테아제 센서)의 제작
hCG-비오틴 접합체를 구성하는 방법은 도 1E에 나타내었다. SpyCatcher/SpyTag 시스템은 Streptococcus pyogenes의 피브로넥틴(fibronectin) 결합 단백질 FbaB의 두 단백질 단편 사이의 isopeptide 결합 형성을 위한 효율적인 반응을 기반으로 비오틴으로 변형된 SpyCatcher 단백질과 SpyTag와 융합된 hCG를 연결하는 데 사용하였다. SpyCatcher/SpyTag 시스템을 사용하면 포유류 세포에서 발현되는 한 가지 유형의 hCG 단백질을 사용하여 다양한 프로테아제 센서를 개발할 수 있다.
SpyCatcher 단백질은 프로테아제 절단 부위를 포함하며 미생물에서 발현된다. SpyCatcher의 부위별 변형은 azide와 cyclooctyne 사이의 변형 촉진 클릭 반응을 통해 달성되었다. AzF(4-Azido-L-phenylalanine)은 앰버 코돈에 비정규 아미노산을 통합하도록 설계된 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소의 직교 쌍을 사용하여 SpyCatcher에 도입하였다. SpyCatcher 단백질은 N-말단 His6 태그 뒤에 앰버 코돈과 AzF와 SpyCatcher 서열 사이에 프로테아제 절단 부위를 갖도록 설계하였다(도 2a 및 표 1).
1-1: SpyCatcher dN-SpyCatcher의 제작
SpyCatcher dN-SpyCatcher를 구축하기 위해 프라이머를 사용하여 SpyCatcher의 N-말단 잔기의 8개 아미노산을 삭제하고, PCR 산물을 pSPEL517 플라스미드(Park & Yoo, ACS sensors, 3, 1772-1779)에 삽입하여 pSPEL906을 제작하였다. 프로테아제 절단 부위를 갖는 dN-SpyCatcher의 발현을 위해 pSPEL906 플라스미드에서 TAG 코돈과 dN-SpyCatcher 사이에 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 삽입하였다. 구성된 플라스미드에 대한 정보는 표 1에 나타내었다. 구축된 플라스미드를 pSPEL150 플라스미드 및 pSPEL168 플라스미드를 갖는 E. coli BL21(DE3) 세포로 형질전환시켜 단백질의 TAG 코돈에 4-azido-L-페닐알라닌(AzF; Bachem, Switzerland)을 연결하였다; pSPEL150 플라스미드는 Methanococcus jannaschii에서 유래한 아미노아실-tRNA 합성효소와 tRNA의 직교 쌍을 발현하고, pSPEL168 플라스미드는 AzF가 Pro 부위로 잘못 결합되는 것을 방지하기 위해 prolyl-tRNA 합성효소를 발현한다. 세포는 2xYT에서 37℃에서 배양하였으며, OD600이 0.5에 도달했을 때 0.2% L-arabinose와 50nM anhydrous tetracycline을 첨가하여 orthogonal pair와 prolyl-tRNA synthetase를 발현시켰다. 그 후, OD600 1.0에서 0.4mM IPTG와 1mM AzF를 첨가하여 SpyCatcher의 발현을 유도하였다. 세포를 30℃에서 하룻밤 추가 배양하였다. SpyCatcher의 N-말단에 도입된 His6-tag를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 수지(Clontech, Japan)로 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 20%(v/v) 글리세롤과 함께 인산염 완충 식염수 용액(PBS; 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4)에 -20°C에서 저장하였다.
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1-2:hCG-SpyTag의 제작
hCG-SpyTag 발현 벡터의 구성을 위해, SpyTag가 있는 hCG 알파 서브유닛 및 hCG 베타 서브유닛을 인코딩하는 합성 유전자를 NotI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 pcDNA3.1(+)에 클로닝하였다(표 1 참조). hCG-SpyTag는 FreeStyle 293 발현 배지(Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA)에서 37℃, 8% CO2에서 유지된 HEK293F 세포주를 사용하여 생성시켰다. 단백질 발현을 위해 hCG 알파 서브유닛과 hCG 베타 서브유닛-SpyTag에 대한 발현 플라스미드 2.5 μg/mL를 3.75 μg/mL의 폴리에틸렌이민(Polysciences, USA)을 사용하여 2 x 106 cells/mL로 형질감염시켰다. 6일 동안 세포를 인큐베이션한 후, 상청액을 수집한 다음 10x Ni-NTA 결합 완충액(0.1M Tris, 1.5M NaCl, 0.5M K2HPO4, 50mM 이미다졸, pH 8.5)과 혼합하였다. 각 서브유닛의 C-말단에 His6 태그를 포함하는 hCG-SpyTag를 Ni-NTA 수지로 정제하고, 정제된 단백질을 20%(v/v) 글리세롤이 포함된 PBS에 -20℃에서 보관하였다.
hCG는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 이종이량체 단백질이다. SpyTag 서열은 hCG-SpyTag로 명명된 His6 태그로 베타 서브유닛의 C-말단에 융합되었다(도 2b 및 표 1). 정제된 hCG-SpyTag 단백질을 hCG 테스트 스트립에 적용했을 때, 신호가 대조군과 테스트 라인 모두에 나타났으며(도 3), 이는 베타 서브유닛의 C-말단 변형이 키트의 항-hCG 항체에 대한 결합을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.
1-3: hCG 기반 프로테아제 센서의 준비
Azido 그룹이 있는 SpyCatcher를 디벤조시클로옥틴-(에틸렌 글리콜)3-비오틴(DBCO-EG3-비오틴)과 함께 반응시켜 SpyCatcher-Biotin을 생성하였다.
1-1에서 제작한 SpyCatcher-AzF를 4℃에서 하룻밤 PBS에서 50배 몰의 디벤조시클로옥틴-(에틸렌 글리콜)4-비오틴(DBCO-EG4-비오틴)과 반응시켰다. 원심필터(Merck, USA)를 사용하여 PBS로 완충액 교환을 통해 반응 혼합물에서 미반응 링커를 제거하고, 정제된 SpyCatcher-Biotin 접합체를 20%(v/v) 글리세롤을 포함하는 PBS에 -20℃에서 보관하였다.
SpyCatcher-Biotin 단백질을 4℃에서 2시간 동안 1-2에서 제작한 hCG-SpyTag와 혼합한 후, 반응 용액을 Streptactin Sepharose　(IBA Lifesciences, Germany)와 실온에서 0.1%(w/v) BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 PBS에서 반응시켰다. 1시간 후, 용액을 중력류 컬럼(gravity flow column)(Thermo Scientific, USA)에 붓고 0.05%(v/v) Tween20을 포함하는 PBS로 세척하여 결합되지 않은 hCG를 제거하였다. hCG-고정된 비드는 4°C에서 PBS에 50% 현탁액으로 저장하였다.
1-4: SpyCatcher의 프로테아제 내성 확인
SpyCatcher-Biotin과 hCG-SpyTag를 결합하기 전에, hCG-SpyTag 단백질과 표적 프로테아제 절단 서열이 없는 SpyCatcher가 본 발명에서 사용된 프로테아제(MMP-2, caspase-3 및 트롬빈)에 내성이 있는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, hCG-SpyTag 단백질에서는 절단된 생성물이 관찰되지 않았지만, SpyCatcher를 MMP-2와 함께 반응시키면 SDS-PAGE 분석에서 더 작은 밴드가 생성되었다(도 5A). SpyCatcher 시퀀스는 N-말단 영역에서 MMP-2 절단 부위를 가지는 것으로 예상되었다(도 5B, (https:/procleave.erc.monash.edu/)).
SpyCatcher의 N-말단 영역은 SpyTag와의 접합에 중요하지 않다고 이전에 보고되었으며, 결과적으로 dN-SpyCatcher라는 N-말단 8개 아미노산이 없는 새로운 SpyCatcher를 구성하였다. (도 5B). dN-SpyCatcher는 MMP-2에 의해 절단되지 않았으며 원래 SpyCatcher 단백질을 사용하여 hCG-SpyTag에 접합하는 데 필적할만한 효율을 나타냈다(도 5C). 따라서, 본 발명의 실시예에서는 hCG-비오틴 접합체를 생성하기 위해 dN-SpyCatcher 구성을 사용하였다.
1-5: hCG 기반 프로테아제 센서 및 상업용 임신진단 스트립을 사용한 프로테아제 활성 분석
각 프로테아제에 대한 분석 완충액에 재현탁된 프로테아제 센서, hCG 고정화 비드 100μL를 샘플 100μL와 혼합하였다. Pro-MMP-2(R&D systems, USA)는 MMP-2 활성화 완충액(100mM Tris, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05%(w/v) Brij-35, 1mM의 p-아미노페닐수은 아세테이트(APMA), pH 8.0) 37℃에서 1시간 동안. 활성화된 MMP-2를 MMP-2 분석 완충액(100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.05%(v/v) Brij-35, pH 7.5)에 희석하여Tekk.
카스파제-3을 카스파제-3 분석 완충액(25mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 0.1% CHAPS, 10mM 디티오트레이톨(DTT), pH 7.5)에 희석하고, 트롬빈을 트롬빈에 희석하였다. 분석 완충액(50mM Tris, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.25%(w/v) BSA, pH 7.5). 반응 혼합물을 상온에서 회전시키면서 30분간 배양한 후, 혼합물 100 μL를 임신진단 스트립(PREGMATE, USA)의 샘플 패드에 직접 로딩하였다. 3분 후 스마트폰(갤럭시노트10)으로 스트립 이미지를 촬영하였다. 소변 간섭을 평가하기 위해 MMP-2를 60%(v/v) 인간 소변을 포함하는 MMP-2 분석 완충액에 첨가하였다(Innovate Research, USA). 사람 소변을 이용한 연구는 아주대학교 기관심의위원회(IRB, 202103-HM-EX-001)의 승인을 받았다.
실시예 2: 본 발명에 따른 MMP-2 활성 분석
본 발명에 따른 프로테아제 센서를 이용하여 MMP-2 활성 분석을 수행하였다. MMP-2는 만성 상처, 암, 알츠하이머병의 중요한 바이오마커이다. MMP-2 절단 서열(GPL/GVR; "/"은 MMP-2에 의해 가수분해된 펩티드 결합을 나타냄)을 AzF 통합을 위한 앰버 코돈과 dN-SpyCatcher 서열 사이에 삽입하였다(도 2a 및 표 1). MMP-2와 함께 dN-SpyCatcher-MMP-2를 반응시킨 후, SDS-PAGE를 통하여 확인하면, MMP-2의 효소활성에 의하여, MMP-2 절단부위가 없는 dN-SpyCatcher의 밴드와 다른 더 작은 밴드가 생성되었으며(도 5A), 이는 프로테아제 절단 서열이 MMP-2에 의해 처리되었음을 나타낸다. dN-SpyCatcher-MMP-2의 azide 그룹을 DBCO-EG4-Biotin과 반응시킨 후, biotin conjugate는 자발적인 isopeptide 결합 형성 반응을 통해 hCG-SpyTag에 연결된다(도 1E 및 도 1F).
생성된 hCG-비오틴 단백질은 변형된 스트렙타비딘(Strep-Tactin)을 가지는 Streptactin Sepharose　(IBA Lifesciences, Germany) 고정시켰다. dN-SpyCatcher-MMP-2-Biotin과 hCG-SpyTag의 반응혼합물을 별도의 정제과정 없이 Streptactin Sepharose　에 직접 적용하고, 0.05% Tween　20이 포함된 PBS로 세척하여 결합되지 않은 hCG를 제거하였으며, 수득한 비드를 MMP-2 센서로 명명하였다. 상기 MMP-2 센서를 60nM MMP-2 효소와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 혼합물을 hCG 스트립에 적용하였다. 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 시그널은 대조군 라인과 테스트 라인 모두에 나타났다(hCG 25μM). 예기치 않게 hCG 고정 비드 자체도 MMP-2와 함께 배양하지 않고 희미한 시그널이 생성되었다(도 6의 hCG 25μM). 스트립 패드의 알 수 없는 구성 요소는 비드에서 비특이적으로 결합된 hCG의 해리를 향상시킬 수 있다. 비특이적 결합을 감소시키기 위해, 비드에 고정화를 위한 hCG의 농도를 12.5μM으로 감소시켰다. MMP-2가 있을 때 밴드 강도는 두 hCG 농도에서 비슷했지만 MMP-2가 없는 배경 신호는 12.5μM hCG에서 감소하였다(도 6 참조).
4개의 hCG 단백질을 Streptactin Sepharose에 고정시켰다. dN-SpyCatcher, dN-SpyCatcher-Biotin, dN-SpyCatcher-MMP-2 및 dN-SpyCatcher-MMP-2-Biotin(표 1)을 hCG-SpyTag와 접합시켜, 생성된 분자를 Streptactin Sepharose와 혼합하였다. 4가지 유형의 비드를 0 또는 60nM MMP-2와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 샘플을 hCG 스트립에 로딩하였다.
그 결과, 도 7A에 나타난 결과, 프로테아제 절단 부위가 있는 샘플만이 대조군과 테스트 라인의 2개의 라인을 나타내었으며, 제안된 MMP-2 센서에 대한 비오틴과 프로테아제 절단 부위의 필요성을 확인할 수 있다. 이후, 센서를 적용하여 용액의 MMP-2 농도를 정량하였다. MMP-2의 농도가 16nM으로 증가함에 따라 대조선에 대한 시험선의 강도의 비율로 정의되는 상대 강도가 증가하였다(도 7B). 상대 강도와 MMP-2 농도 사이의 선형 관계는 검출 한계(LOD)로 43.2pM을 사용하여 0~1.0nM 범위에서 확인되었다.
실시예 3: 본 발명에 따른 카스파제-3 및 트롬빈의 검출
다른 표적 프로테아제에 대한 프로테아제 센서는 AzF에 대한 앰버 코돈과 dN-SpyCatcher 서열(도 2a) 사이에 각각의 프로테아제 절단 서열을 도입하여 간단하게 설계할 수 있으며, 이는 dN-SpyCatcher 및 hCG-SpyTag가 효소에 의한 단백질 분해에 내성을 갖는 조건을 충족한다.
본 발명의 프로테아제 분석 방법의 일반성을 입증하기 위해 카스파제-3 및 트롬빈을 추가 표적 프로테아제로 선택하였다.
dN-SpyCatcher 및 hCG-SpyTag는 이 두 프로테아제에 의해 절단되지 않았다(도 5A). Caspase-3는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측삭 경화증을 비롯한 여러 신경 퇴행성 장애와 관련이 있는 프로테아제이다.
성숙한 카스파제-3(caspase-3)의 발현을 위한 pHC332(Pop et al., Biochemistry, 40, 14224-14235)를 E. coli BL21(DE3) 세포로 형질전환시킨 후, 배양하였다. 배양액의 OD600가 0.5에 도달하였을 때 0.2mM IPTG를 첨가하여 단백질을 발현시켰다. 그 후, 세포를 30℃에서 6시간 동안 배양하였다. 단백질을 Ni-NTA로 정제하고 정제된 단백질을 PBS에 -80℃에서 보관하였다.
트롬빈은 출혈 장애가 있는 환자를 모니터링하기 위한 중요한 바이오마커이며, 중추신경계 질환과의 관계가 최근에 보고되었다(Ebrahimi et al., Journal of cellular physiology 232:482-485,2017; Shlobin et al., Biomolecules 11; 2021). dN-SpyCatcher-MMP-2의 프로테아제 절단 서열은 카스파제-3 또는 트롬빈으로 대체되었고, 생성된 단백질은 각각 dN-SpyCatcher-caspase-3 및 dN-SpyCatcher-thrombin으로 명명되었다(표 1).
MMP-2 센서와 동일한 절차에 따라 두 단백질을 DBCO-EG3-Biotin과 결합한 다음 hCG-SpyTag와 결합시켰다. hCG-비오틴 접합체는 Streptactin Sepharose　에 고정시켰다. hCG 고정된 비드를 사용한 분석 결과, 카스파제-3의 경우, 0-2.0nM 범위에서 LOD가 7.2pM인 농도 의존적 곡선 및 선형 관계가 나타났으며(도 7 c), 트롬빈의 경우 LOD가 43.9pM인 0-1.0nM 범위에서 농도 의존적 곡선 및 선형 관계가 나타났다(도 7D).
또한, MMP-2, 카스파제-3 및 트롬빈 활성을 분석하기 위해 개발된, 세 가지 센서의 교차 반응성을 확인하였다. 배경을 초과하는 신호는 hCG 고정된 비드가 해당 표적 프로테아제와 함께 반응된 경우에만 테스트 라인이 나타났다(도 7E). 따라서, dN-SpyCatcher 단백질의 최소한의 수정을 통해 특정 프로테아제 분석 방법의 개발을 가능하게 하는 프로테아제 센서 설계의 모듈성을 입증하였다.
실시예 4: 스마트폰 기반 검출기를 이용한 MMP-2 활성 분석
스트립을 기반으로 하는 분석 방법은 숙련된 인력이 아닌 사용자에게 빠르고 비용 효율적이며 사용하기 쉬우며, 또한, 스마트폰과 같은 휴대용 장치를 사용하면, 스트립 이미지를 획득하고 분석물을 민감하고 정량적으로 검출할 수 있다.
스마트 IT 기기는 최근 현장 진단을 위한 기기 개발 플랫폼으로 상당한 주목을 받고 있다. 본 발명자들은 스마트폰 플래시를 광원으로 사용하고 스마트폰 카메라를 광수신기로 사용하는 간단한 장치를 보고한 바 있다(도 8A)(Kim et al. Biosensors and Bioelectronics, 196, 113722, 2022; Kim et al., Biosensors and Bioelectronics, 150, 111932, 2020).
본 발명의 프로테아제 검출 방법은 표준화된 분석 방법을 개발하는 데 중요할 수 있는 이미지를 얻기 위한 일관된 조건을 제공할 수 있다. MMP-2 센서가 다양한 농도의 MMP-2와 함께 인큐베이션된 샘플이 로드된 hCG 스트립을 분석하기 위해 가제트가 장착된 스마트폰을 사용하였다(도 8B). 상대 강도는 MMP-2 농도가 16nM으로 증가함에 따라 증가하였다. 상대 강도와 MMP-2 농도 사이의 선형 관계는 38.4pM의 LOD로 0~2.0nM 범위에서 관찰되었다. 소변의 MMP-2 농도는 건강한 사람보다 일부 암 환자에서 더 높은 것으로 보고된 바 있다(Coticchia et al. 2011; Ricci et al. 2015). 본 실시예에서는 POCT 시스템을 사용하여 MMP-2가 첨가된 인간 소변 샘플의 MMP-2 농도를 결정하였다(도 8C). MMP-2의 회수율은 96%를 초과하여 개발된 분석법에서 소변 성분의 간섭이 최소화되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 기존에 상용화 되어 있는 임신진단 스트립을 이용하여, 질병 진단의 바이오마커로 사용되는 표적 프로테아제를 높은 민감도로 간편하게 검출 및 정량할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 hCG 단백질과 비오틴이 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열에 의해 결합되는 것은 SpyCatcher/SpyTag 시스템, Thiol-maleimide 반응, 비천연아미노산을 이용한 단백질 변형 시스템, Sortase 반응, Transglutaminase 반응 및 Formylglycine generation enzyme 반응으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 MMP-2인 경우, 상기 링커의 서열은 GPLGVR(서열번호 1)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 센서.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 카스파제-3인 경우, 상기 링커의 서열은 DEVE(서열번호 2)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 센서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 트롬빈인 경우, 상기 링커의 서열은 LVPRGS(서열번호 3)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 센서.
  6. 다음 단계를 포함하는 표적 프로테아제의 검출방법.
    (a) 제1항의 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
    (c) 유리 hCG와 hCG 항체의 결합을 확인하여 표적 프로테아제를 검출하는 단계.
  7. 다음 단계를 포함하는 표적 프로테아제의 정량방법.
    (a) 제1항의 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
    (c) 유리 hCG와 hCG 항체의 결합을 확인하여 표적 프로테아제를 정량하는 단계.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한의 프로테아제 센서와 프로테아제 반응용액을 포함하는 프로테아제 검출용 조성물.
  9. 다음을 포함하는 표적 프로테아제 검출용 키트:
    (a) 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열을 가지는 링커에 의해 hCG 단백질과 비오틴이 결합되고, 상기 hCG 단백질은 스트렙타비딘으로 코팅된 비드에 고정되어 있는 표적 프로테아제 검출용 프로테아제 센서; 및
    (b) hCG 항체가 고정되어 있는 스트립.
  10. 제9항에 있어서, 상기 hCG 단백질과 비오틴이 표적 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 서열에 의해 결합되는 것은 SpyCatcher/SpyTag 시스템, Thiol-maleimide 반응, 비천연아미노산을 이용한 단백질 변형 시스템, Sortase 반응, Transglutaminase 반응 및 Formylglycine generation enzyme 반응으로 구성된 군에서 선택되는 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 프로테아제 검출용 키트.
  11. 제9항에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 MMP-2인 경우, 상기 링커의 서열은 GPLGVR(서열번호 1)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 프로테아제 검출용 키트
  12. 제9항에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 카스파제-3인 경우, 상기 링커의 서열은 DEVE(서열번호 2)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 프로테아제 검출용 키트
  13. 제9항에 있어서, 상기 표적 프로테아제가 트롬빈인 경우, 상기 링커의 서열은 LVPRGS(서열번호 3)의 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 프로테아제 검출용 키트.
  14. 제9항에 있어서, 상기 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립는 임신 진단용 스트립인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 다음 단계를 포함하는 스마트폰을 이용하여 표적 프로테아제를 검출하는 방법:
    (a) 제9항의 표적 프로테아제 검출용 키트에 포함된 프로테아제 센서에 표적 프로테아제를 함유하는 샘플을 처리하여 유리 hCG를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 유리 hCG를 포함하는 샘플을 hCG 항체가 고정되어 있는 스트립에 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 스트립을 스트립 장착용 가제트가 설치된 스마트폰에 적용하여, 스마트폰의 플래시를 광원으로 사용하고 스마트폰 카메라를 광수신기로 사용하여, 표적 프로테아제를 정량하는 단계.
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