WO2024140596A1 - 调控XDH基因活性的siRNA分子 - Google Patents

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WO2024140596A1
WO2024140596A1 PCT/CN2023/141628 CN2023141628W WO2024140596A1 WO 2024140596 A1 WO2024140596 A1 WO 2024140596A1 CN 2023141628 W CN2023141628 W CN 2023141628W WO 2024140596 A1 WO2024140596 A1 WO 2024140596A1
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WO
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seq
strand comprises
antisense strand
sense strand
sirna
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PCT/CN2023/141628
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English (en)
French (fr)
Inventor
黄金宇
邹昊
Original Assignee
大睿生物医药科技(上海)有限公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • Hyperuricemia is caused by increased uric acid synthesis and/or decreased renal clearance of uric acid in the body under normal dietary conditions. Hyperuricemia is divided into primary hyperuricemia and secondary hyperuricemia. Primary hyperuricemia is usually caused by molecular defects or congenital purine metabolism disorders. Secondary hyperuricemia is hyperuricemia caused by increased blood uric acid production or uric acid excretion disorders due to a variety of acute and chronic diseases such as blood or malignant tumors, chronic poisoning, drugs or high-purine diets. Studies have shown that hyperuricemia can induce a variety of diseases, including gout, hypertension, diabetes, coronary heart disease and kidney disease.
  • Gout is a common and complex type of arthritis. Patients often experience sudden joint pain at night. The onset is acute, and pain, edema, redness, swelling and inflammation occur in the joints. Gout attacks are related to increased uric acid concentration in the body and are a crystal-related arthropathy caused by the deposition of monosodium urate.
  • Xanthine dehydrogenase can convert the purine degradation product xanthine into uric acid. Therefore, xanthine dehydrogenase is one of the key targets for the treatment of gout.
  • RNA interference mechanism Reducing XDH expression through small interfering RNA (siRNA) based on RNA interference mechanism is a new method for treating gout.
  • siRNA small interfering RNA
  • the present invention provides novel small interfering RNA (siRNA), vector, kit and pharmaceutical composition for inhibiting the expression of xanthine dehydrogenase (XDH) in cells, as well as methods for using the siRNA, ligand, kit or pharmaceutical composition in inhibiting or reducing the expression of xanthine dehydrogenase (XDH) gene or treating diseases or conditions that benefit from the reduction of xanthine dehydrogenase (XDH) expression.
  • siRNA small interfering RNA
  • ligand ligand
  • kit or pharmaceutical composition in inhibiting or reducing the expression of xanthine dehydrogenase (XDH) gene or treating diseases or conditions that benefit from the reduction of xanthine dehydrogenase (XDH) expression.
  • the present invention provides a small interfering RNA (siRNA) for inhibiting the expression of xanthine dehydrogenase (XDH) in a cell, the siRNA comprising a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the lengths of the sense strand and the antisense strand are each independently 15-30 nucleotides, and the antisense strand comprises a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 168-332 and 334.
  • the sense strand comprises a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1-165 and 167.
  • the length of the sense strand and the antisense strand are each independently 15-27 nucleotides, preferably 19-25 nucleotides, and more preferably 19-23 nucleotides.
  • the length of the double-stranded region is 15-25 nucleotide pairs, preferably 16-23 nucleotide pairs, and more preferably 18-20 nucleotide pairs.
  • the siRNA comprises a paired sense strand sequence and antisense strand sequence as shown in Table 3.
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NO: 219, 182, 197, 211, 204, 212, 218, 214, 205 and 334, a nucleotide sequence of at least 16 consecutive nucleotides, a nucleotide sequence of at least 17 consecutive nucleotides, a nucleotide sequence of at least 18 consecutive nucleotides, a nucleotide sequence of at least 19 consecutive nucleotides, or a nucleotide sequence of at least 20 consecutive nucleotides.
  • the antisense strand comprises a nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NO: 219, 182, 197, 211, 204, 212, 218, 214, 205 and 334.
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:219, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:52;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 182, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 197, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:211, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:44;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:204, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:37;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:212, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:45;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:218, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:51;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:214, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:47;
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:205, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:38; or
  • the antisense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:334, and the sense strand comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:167.
  • substantially all of the nucleotides of the sense strand and substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides, or all of the nucleotides of the sense strand and all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides.
  • the sense strand and the antisense strand each independently comprise one or more nucleotide modifications selected from the group consisting of 2'-O-methyl modified nucleotides, 2'-fluoro modified nucleotides, 2'-deoxy-modified nucleotides, inosine ribonucleotides, abasic nucleotides, inverted abasic deoxyribonucleotides, phosphorothioate internucleotide linkage modifications, vinylphosphonate modified nucleotides, locked nucleotides, 2'-amino-modified nucleotides, 2'-alkyl-modified nucleotides, morpholino nucleotides, phosphoramidates, nucleotides containing non-natural bases, and terminal nucleotides attached to a cholesterol derivative or a dodecanoic acid didecylamide group, and deoxyribonucleotides.
  • nucleotide modifications selected from
  • the sense strand and the antisense strand each independently comprise one or more nucleotide modifications selected from the group consisting of 2'-O-methyl modified nucleotides, 2'-fluoro modified nucleotides and thiophosphate internucleotide linkage modifications.
  • the sense strand and/or the antisense strand comprise at least 2 2'-fluoro modified nucleotides.
  • the sense strand and/or the antisense strand comprise at least 8 2'-O-methyl modified nucleotides.
  • the 3' end and/or the 5' end of the sense strand and/or the antisense strand comprise 1-5 thiophosphate groups, preferably 2-3 thiophosphate groups.
  • the antisense strand comprises a modified nucleotide sequence as shown in any one of Table 5 of the specification, and/or the sense strand comprises a modified nucleotide sequence as shown in any one of Table 4 of the specification.
  • the siRNA comprises a paired modified sense strand sequence and a modified antisense strand sequence as shown in any one of Table 6 of the specification.
  • the 3' end and/or the 5' end of the sense strand and/or the antisense strand comprises 1-5 phosphorothioate groups, and wherein:
  • the sense strand comprises CmAmUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmAmAmAm (SEQ ID NO:711), and the antisense strand comprises UmUfUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmCfCm (SEQ ID NO:712);
  • the sense strand comprises UmCmUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmUmUm (SEQ ID NO:713), and the antisense strand comprises AmAfCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmCfGm (SEQ ID NO:714);
  • the sense strand comprises UmGmGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmUm (SEQ ID NO:715), and the antisense strand comprises AmAfAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmAfUmGfCmCfAmAfUm (SEQ ID NO:716);
  • the sense strand comprises GmCmAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmAmAmAm (SEQ ID NO:723), and the antisense strand comprises UmUfGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmCfAm (SEQ ID NO:724);
  • the sense strand comprises GmAmUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmAm (SEQ ID NO:727), and the antisense strand comprises UmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCm (SEQ ID NO:728); or
  • the sense strand comprises GmsCmsAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmsAm (SEQ ID NO:737), and the antisense strand comprises UmsUfsGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmsCfsAm (SEQ ID NO:688);
  • the siRNA is further conjugated to a ligand comprising N-acetylgalactosamine, preferably the sense strand of the siRNA is conjugated to the ligand.
  • the 3' end of the sense strand is conjugated to the ligand.
  • the 5' end of the sense strand is conjugated to the ligand.
  • the ligand comprises a conjugate group represented by formula (X'):
  • T is a chemical bond, -CH 2 -, -C(O)-, -M-, -CH 2 -M-, or -C(O)-M-;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the conjugated ligand targets the asialoglycoprotein receptor (ASGPR).
  • ASGPR asialoglycoprotein receptor
  • the conjugated group is selected from Table 1:
  • the ligand contained in the siRNA has the following structure:
  • the positive strand of the siRNA is connected to the positive strand of the siRNA through a phosphate group or a phosphorothioate group. Location.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the siRNA or cell of the present invention, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the method of treating a disease or condition that benefits from reduced xanthine dehydrogenase (XDH) expression in a subject of the present invention comprises administering the siRNA, cell or pharmaceutical composition subcutaneously, topically or intravenously to the subject.
  • the subject is a human patient.
  • Base is the basic unit of synthesis of nucleosides, nucleotides and nucleic acids. It contains nitrogen and is also called “nitrogenous base”.
  • capital letters A, U, T, G and C represent the base composition of nucleotides, which are adenine, uracil, thymine, guanine and cytosine respectively.
  • the present invention provides a small interfering RNA (siRNA) for inhibiting the expression of xanthine dehydrogenase (XDH) in cells, wherein the siRNA comprises a sense chain and an antisense chain forming a double-stranded region, wherein the lengths of the sense chain and the antisense chain are each independently 15-30 nucleotides, and the antisense chain comprises a nucleotide sequence of at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 168-332 and 334.
  • siRNA small interfering RNA
  • substantially all of the nucleotides of the sense strand and substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides. In some embodiments, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% of the nucleotides of the sense strand are modified nucleotides, and/or at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides.
  • L 1 is a chemical bond, -CH 2 -, -CH 2 CH 2 -, -C(O)-, -CH 2 O-, -CH 2 O-CH 2 CH 2 O-, or -NHC(O)-(CH 2 NHC(O)) a -;
  • L is a chemical bond, -CH 2 O- or -NHC(O)-;
  • L' is a chemical bond, -C(O)NH-, -NHC(O)-, or -O(CH 2 CH 2 O) e -;
  • T is a chemical bond, -CH 2 -, -C(O)-, -M-, -CH 2 -M-, or -C(O)-M-;
  • R 1 and R 2 together form -CH 2 CH 2 O- or -CH 2 CH(R)-O-, and R 3 is H;
  • the conjugated group is represented by formula (I'):
  • L 1 is a chemical bond, -CH 2 -, -CH 2 CH 2 -, -C(O)-, -CH 2 O-, -CH 2 O-CH 2 CH 2 O-, or -NHC(O)-(CH 2 NHC(O)) a -;
  • L4 is -( OCH2CH2 ) c- , - ( OCH2CH2 )c- , - ( OCH2CH2CH2 ) c- , - ( OCH2CH2CH2) c- , -( OCH2CH2CH2CH2 )c- , - ( OCH2CH2CH2CH2) c- , or -NHC(O)-( CH2 ) d- ;
  • L' is a chemical bond, -C(O)NH- or -NHC(O)-;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • L 4 is -(OCH 2 CH 2 ) c - or -NHC(O)-(CH 2 ) d -;
  • L is -CH 2 O-
  • L’ is a chemical bond
  • R 1 and R 2 together form -CH 2 CH 2 O- or -CH 2 CH(R)-O-, and R 3 is H;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • R is -OR', -CH 2 OR' or -CH 2 CH 2 OR', wherein R' is H, a hydroxyl protecting group or a solid support, and the hydroxyl protecting group is preferably -C(O)CH 2 CH 2 C(O)OH or 4,4'-dimethoxytrityl;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the conjugated group is as shown in Formula (I'-1), Formula (I'-2) or Formula (I'-3):
  • L2 is -CH2CH2C ( O)-;
  • R' is H, a hydroxyl protecting group or a solid phase carrier, wherein the hydroxyl protecting group is preferably -C(O)CH 2 CH 2 C(O)OH or 4,4'-dimethoxytrityl;
  • L 1 is -CH 2 O-, -CH 2 O-CH 2 CH 2 O-, or -NHC(O)-(CH 2 NHC(O)) a -;
  • L2 is -CH2CH2C ( O)-;
  • L3 is -( NHCH2CH2 ) b- , -( NHCH2CH2CH2 ) b- or -C (O) CH2- ;
  • L' is a chemical bond or -C(O)NH-
  • R 1 and R 2 together form -CH 2 CH 2 O- or -CH 2 CH(R)-O-, and R 3 is H;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the conjugated group is as shown in formula (II'-1) or formula (II'-2):
  • L 1 is -CH 2 O- or -CH 2 O-CH 2 CH 2 O-;
  • L is -CH 2 O- or -NHC(O)-;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • the conjugated group is as shown in formula (II'-2):
  • L is -CH 2 O- or -NHC(O)-;
  • L 1 is a chemical bond, -CH 2 -, -CH 2 CH 2 -, -C(O)-, -CH 2 O-, -CH 2 O-CH 2 CH 2 O-, or -NHC(O)-(CH 2 NHC(O)) a -;
  • L 2 is a chemical bond or -CH 2 CH 2 C(O)-;
  • L is a chemical bond, -CH 2 O- or -NHC(O)-;
  • T is a chemical bond, -CH 2 -, -M-, -CH 2 -M- or -C(O)-M-;
  • R 1 and R 2 together form -CH 2 CH 2 O- or -CH 2 CH(R)-O-, and R 3 is H;
  • R is -OR', -CH 2 OR' or -CH 2 CH 2 OR', wherein R' is H, a hydroxyl protecting group or a solid support, and the hydroxyl protecting group is preferably -C(O)CH 2 CH 2 C(O)OH or 4,4'-dimethoxytrityl;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • T is -M-, -CH 2 -M- or -C(O)-M-, wherein M is
  • L3 is -( NHCH2CH2 ) b- or -( NHCH2CH2CH2 ) b- ;
  • L is a chemical bond or -CH 2 O-;
  • L' is a chemical bond or -O(CH 2 CH 2 O) e -;
  • R 1 and R 2 together form -CH 2 CH 2 O- or -CH 2 CH(R)-O-, and R 3 is H;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • R is -OR', -CH 2 OR' or -CH 2 CH 2 OR', wherein R' is H, a hydroxyl protecting group or a solid support, and the hydroxyl protecting group is preferably -C(O)CH 2 CH 2 C(O)OH or 4,4'-dimethoxytrityl;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • the conjugated group is represented by formula (III'-1), formula (III'-2) or formula (III'-3):
  • L 1 is -CH 2 O- or -NHC(O)-;
  • L2 is -CH2CH2C ( O)-;
  • L is a chemical bond or -CH 2 O-;
  • R' is H, a hydroxyl protecting group or a solid phase carrier, and the hydroxyl protecting group is preferably -C(O)CH 2 CH 2 C(O)OH or 4,4'-dimethoxytrityl;
  • T is as defined in the above embodiments.
  • L 1 is -CH 2 -, -CH 2 O- or -C(O)-;
  • L 2 is a chemical bond
  • L3 is -( NHCH2CH2 ) b- , -( NHCH2CH2CH2 ) b- or -C (O) CH2- ;
  • L 4 is -(OCH 2 CH 2 ) c - or -NHC(O)-(CH 2 ) d -;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • L is a chemical bond or -NHC(O)-
  • R' is H, a hydroxyl protecting group or a solid phase carrier, and the hydroxyl protecting group is preferably -C(O)CH 2 CH 2 C(O)OH or 4,4'-dimethoxytrityl;
  • L 2 is a chemical bond or -CH 2 CH 2 C(O)-;
  • L4 is -( OCH2CH2 ) c- , - ( OCH2CH2 )c- , - ( OCH2CH2CH2 ) c- , - ( OCH2CH2CH2) c- , -( OCH2CH2CH2CH2 )c- , - ( OCH2CH2CH2CH2) c- , or -NHC(O)-( CH2 ) d- ;
  • L is a chemical bond, -CH 2 O- or -NHC(O)-;
  • L' is -O(CH 2 CH 2 O) e -;
  • T is a chemical bond, -CH 2 -, -C(O)-, -M-, -CH 2 -M-, or -C(O)-M-;
  • R 1 and R 2 together form -CH 2 CH 2 O- or -CH 2 CH(R)-O-, and R 3 is H;
  • R 1 and R 3 together form -C 1-2 alkylene-, and R 2 is H;
  • n 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10;
  • the ligand has the following structure:
  • Inhibition of XDH gene expression can be manifested by a decrease in the amount of mRNA expressed by a first cell or group of cells (such cells can be present, for example, in a sample derived from a subject), wherein the XDH gene is transcribed and the cell or cells have been treated (for example, by contacting the cell or cells with an siRNA of the invention, or by administering an siRNA of the invention to a subject in which these cells are now or previously present), such that XDH gene expression is inhibited compared to a second cell or group of cells (one or more control cells) that is substantially identical to the first cell or group of cells but has not been so treated.
  • a second cell or group of cells one or more control cells
  • the inhibition is evaluated by expressing the level of mRNA in the treated cells as a percentage of the level of mRNA in the control cells using the following formula:
  • the inhibition of XDH gene expression for example, XDH protein expression
  • XDH gene silencing can be determined in any cell expressing XDH constitutively or by genome engineering and by any assay known in the art.
  • the liver is the main site of XDH expression, and other important expression sites include intestinal tract and female tissues.
  • the inhibition of the expression of XDH protein can be manifested by a decrease in the level of XDH protein expressed by a cell or cell group (e.g., the level of protein expressed in a sample derived from a subject).
  • the inhibition of protein expression levels in the treated cells or cell groups can be similarly expressed as a percentage of the level of the protein in the control cells or cell groups.
  • Control cells or cell groups that can be used to evaluate the inhibition of XDH gene expression include cells or cell groups that have not been contacted with the siRNA of the present invention.
  • the control cells or cell groups can be derived from individual subjects (e.g., human or animal subjects) before treating the subject with siRNA.
  • the present invention provides a cell containing the siRNA of the present invention, wherein the siRNA of the present invention can be transcribed in the cell.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the siRNA or cell of the present invention, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • pharmaceutically acceptable refers to those compounds, materials, compositions, and/or dosage forms which are, within the scope of sound medical judgment, suitable for contact with the tissues of human subjects and animal subjects without excessive toxicity, irritation, allergic response, or other problem or complication, commensurate with a reasonable benefit/risk ratio.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a drug carrier that helps to administer siRNA or a vector or cell containing its coding sequence to the human body and/or facilitates its absorption or function.
  • diluents excipients such as water, fillers such as starch, sucrose, etc.
  • binders such as cellulose derivatives, alginates, gelatin and polyvinyl pyrrolidone
  • wetting agents such as glycerol
  • disintegrants such as agar, calcium carbonate and sodium bicarbonate
  • absorption promoters such as quaternary ammonium compounds
  • surfactants such as hexadecanol
  • adsorption carriers such as kaolin and bentonite
  • lubricants such as talc, calcium/magnesium stearate, polyethylene glycol, etc.
  • other adjuvants such as flavoring agents, sweeteners, etc. can also be added to the composition.
  • a pharmaceutical composition comprising the siRNA or cells of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable diluent or a sustained-release matrix, in which the siRNA of the present invention is embedded.
  • the present invention provides a kit comprising the siRNA or cells of the present invention.
  • the kit of the present invention may optionally further comprise a device for administering the siRNA or cells of the present invention to a subject or a device for determining a therapeutically effective amount or a preventively effective amount.
  • the present invention provides a method for reducing xanthine dehydrogenase (XDH) or uric acid levels in a subject, the method comprising the step of administering the siRNA, cell, or pharmaceutical composition of the present invention to the subject.
  • XDH xanthine dehydrogenase
  • the present invention provides a method for treating, preventing, inhibiting or alleviating a disease or condition that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase (XDH) in a subject, the method comprising the step of administering to the subject an siRNA, cell, or pharmaceutical composition of the present invention.
  • the present invention also provides a method for treating, preventing, inhibiting or alleviating at least one symptom in a patient suffering from a disease or condition that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase (XDH).
  • the disease or disorder that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase is an XDH-related disease.
  • the XDH-related disease is hyperuricemia, gout, and hypertension, diabetes, coronary heart disease, and kidney disease caused by hyperuricemia.
  • the method of reducing xanthine dehydrogenase (XDH) or uric acid levels in a subject, treating, preventing, suppressing or alleviating a disease or condition that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase (XDH) in a subject, or treating, preventing, suppressing or alleviating at least one symptom in a patient suffering from a disease or condition that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase (XDH) of the present invention comprises administering the siRNA or pharmaceutical composition subcutaneously or intravenously to the subject.
  • the subject is a human patient.
  • the present invention also relates to the siRNA, cell or pharmaceutical composition of the present invention for use in treating a disease or symptom associated with XDH expression in a subject.
  • the present invention also relates to the use of the siRNA, cell, or pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of a drug for treating, preventing, inhibiting or alleviating a disease or condition that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase (XDH) in a subject.
  • the present invention also relates to the use of the siRNA, cell, or pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of a drug for reducing xanthine dehydrogenase (XDH) or uric acid levels in a subject.
  • the present invention also relates to the use of the siRNA, cell, or pharmaceutical composition of the present invention in the preparation of a drug for treating, preventing, inhibiting or alleviating at least one symptom in a patient suffering from a disease or condition that benefits from reduced expression of xanthine dehydrogenase (XDH).
  • the drug of the present invention can be prepared into an emulsion, a microemulsion, microparticles, etc.
  • the RNA sequence provided by the present invention targets the human XHD gene (or target gene, target mRNA sequence, target sequence).
  • the target XHD mRNA sequence is the gene shown in Genbank registration number NM_000379.4.
  • Table 4 shows the modified RNA sequences used in the present invention.
  • the A, U, G and C distribution represents the natural adenine, uracil, guanine and cytosine ribonucleotides.
  • i inosine ribonucleotide
  • d indicates that the adjacent nucleotide on the right is a deoxyribonucleotide.
  • dA, dT, dG, and dC represent adenine deoxyribonucleotide, thymine deoxyribonucleotide, guanine deoxyribonucleotide, and cytosine deoxyribonucleotide, respectively.
  • m indicates that the adjacent nucleotide on its left is a 2'-OCH 3 modified nucleotide.
  • Am, Um, Gm and Cm represent 2'-OCH 3 modified A, U, G and C respectively.
  • f indicates that the adjacent nucleotide on its left side is a 2'-F modified nucleotide.
  • Af, Uf, Gf, and Cf represent 2'-F modified A, U, G, and C, respectively.
  • s indicates that the two adjacent nucleotides and/or delivery vectors are linked by phosphorothioate.
  • L96 represents a GalNAc delivery vector of the following structure well known in the art, wherein The position of the siRNA is linked to the siRNA via a phosphate group or a phosphorothioate group, as described in, for example, PCT Publication Nos. WO2009073809 and WO2009082607.
  • GL12 represents a GalNAc delivery vector of the following structure, wherein Indicates the position where the phosphate or phosphorothioate group is attached to the siRNA
  • Hep3B cell line was purchased from Nanjing Kebai, catalog number CBP60197;
  • PHH cells were purchased from Shanghai Xuanyi, catalog number QYLF-HPMC;
  • HEK293A cell line was purchased from Nanjing Kebai, catalog number CBP60436;
  • Balb/c mice were obtained from Zhejiang Weitonglihua, catalog number Balb/c.
  • siRNA of the present invention is prepared using the solid phase phosphoramidite method well known in the art.
  • the specific method can be found in, for example, PCT Publication Nos. WO2016081444 and WO2019105419, and is briefly described as follows.
  • nucleoside monomers are connected one by one from the 3'-5' direction according to the arrangement order of the positive chain nucleotides.
  • Each connection of a nucleoside monomer includes four steps of deprotection, coupling, capping, oxidation or thiolation.
  • the synthesis conditions of oligonucleotides with a synthesis scale of 5 ⁇ mol are as follows:
  • the nucleoside monomer was provided with a 0.05 mol/L acetonitrile solution.
  • the reaction conditions for each step were the same, i.e., the temperature was 25°C.
  • a 3% trichloroacetic acid-dichloromethane solution was used for deprotection, and the deprotection was repeated 3 times.
  • the activator used in the coupling reaction was a 0.25 mol/L ETT-acetonitrile solution, and the coupling was repeated 2 times.
  • the capping reaction was performed with 10% acetic anhydride-acetonitrile and pyridine/N-methylimidazole/acetonitrile (10:14:76, v/v/v) and the capping was repeated 2 times.
  • the oxidation reaction was performed with 0.05 mol/L iodine/tetrahydrofuran/pyridine/water (70/20/10, v/v/v) and the oxidation was repeated 2 times.
  • the thiolation reaction was performed with 0.2 mol/L PADS in acetonitrile/3-methylpyridine (1/1, v/v) and the thiolation was repeated 2 times.
  • nucleoside monomers are connected one by one from the 3'-5' direction according to the arrangement order of the antisense chain nucleotides.
  • Each connection of a nucleoside monomer includes four steps of deprotection, coupling, capping, oxidation or thiolation.
  • the synthesis conditions of 5 ⁇ mol oligonucleotides of the antisense chain are the same as those of the sense chain.
  • a column filled with strong anion fillers can be used, and a sodium chloride-sodium hydroxide system can be used for elution and purification, and the product can be collected and piped.
  • a gel filler purification column can be used for desalination, and the elution system is pure water.
  • SS strands sense strands
  • AS strands antisense strands
  • Filtering was performed using a sand core funnel, and the filter cake was washed with anhydrous acetonitrile (20mL*5), and the filter cake was taken and filtered under reduced pressure using an oil pump for 6h to obtain 530mg of an off-white solid.
  • nucleoside monomers are connected one by one from the 3'-5' direction according to the arrangement order of the positive chain nucleotides.
  • Each connection of a nucleoside monomer includes four steps of deprotection, coupling, capping, oxidation or thiolation.
  • the synthesis conditions of oligonucleotides with a synthesis scale of 5 ⁇ mol are as follows:
  • the oxidation reaction was performed with 0.05 mol/L iodine/tetrahydrofuran/pyridine/water (70/20/10, v/v/v) and the oxidation was repeated 2 times.
  • the thiolation reaction was performed with 0.2 mol/L PADS in acetonitrile/3-methylpyridine (1/1, v/v) and the thiolation was repeated 2 times.
  • siRNA conjugated with L96 was obtained in a similar manner, and the following siRNAs were finally obtained: DR004361 and DR004362.
  • Ratio Renilla (Renilla luciferase)/Firefly (Firefly luciferase).
  • Remaining inhibition rate (Ratio siRNA / Ratio control )*100%, taking the average value of the results of the two wells: wherein Ratio control is the Ratio value of the control well (without siRNA) (taking the average value of the results of the two wells).
  • PCH Monkey primary hepatocytes
  • Thiawing Medium thawing medium
  • siRNA dilution Take 198 ⁇ L Opti-MEM and add it to 2 ⁇ L 20 ⁇ M siRNA stock solution. Mix by pipetting as the first concentration point and perform corresponding dilution operations according to the actual needs of the experiment (no siRNA is added to the control group).
  • Cell RNA was extracted using a nucleic acid extractor (Auto-pure96, Hangzhou Aosheng) according to the operating procedures of a high-throughput cell RNA extraction kit (Fanzhi Medical, FG0412).
  • the preparation of the denaturation reaction mixture was based on the PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, 6210B). Each well contained 1 ⁇ L of Oligo dT Primer, 1 ⁇ L of dNTP Mixture, and 12.5 ⁇ L of template RNA. The mixture was incubated at 65°C for 5 min in a conventional PCR instrument for denaturation reaction. Cool rapidly on ice for 2 min.
  • the preparation of the reverse transcription reaction solution was based on the PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, 6210B). Each well contained 4 ⁇ L of 5 ⁇ Prime Script II Buffer, 0.5 ⁇ L of RNase inhibitor, and 1 ⁇ L of PrimeScript II RTase.
  • the preparation of the denaturation reaction mixture was based on the PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, 6210B). Each well contained 1 ⁇ L of Oligo dT Primer, 1 ⁇ L of dNTP Mixture, and 12.5 ⁇ L of template RNA.
  • the denaturation reaction was performed by incubating at 65°C for 5 min in a conventional PCR instrument. The mixture was quickly cooled on ice for 2 min.
  • ⁇ Ct [(target gene in Ct experimental group-internal reference in Ct experimental group)-(target gene in Ct control group-internal reference in Ct control group)].
  • Tg mouse liver primary cells (Tg mice are from Jicui Yaokang), count, and plate in 24-well plates Medium, 900 ⁇ L/well, 8 ⁇ 10 4 cells/well.
  • Transfection Add 10 ⁇ L of diluted siRNA to 40 ⁇ L Opti-MEM and mix well. Add 3 ⁇ L RNAiMAX to 47 ⁇ L Opti-MEM and mix well. After incubation for 5 minutes, mix with the diluted siRNA, let stand at room temperature for 10 minutes, add to the corresponding wells, and culture in a 37°C, 5% CO2 incubator for 24 hours (no siRNA was added to the control group).
  • the 2 - ⁇ Ct value was calculated and converted into a percentage to obtain the residual inhibition rate.
  • the starting concentration of siRNA was selected as 40nM, and 9 concentration points (40nM, 1.33nM, 4.44nM, 1.48nM, 0.49nM, 0.16nM, 0.055nM, 0.018nM, 0.006nM) were diluted 3 times to perform 9-point IC50 activity screening of Tg mouse primary hepatocytes.
  • 9 concentration points 40nM, 1.33nM, 4.44nM, 1.48nM, 0.49nM, 0.16nM, 0.055nM, 0.018nM, 0.006nM

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Abstract

本发明提供了用于抑制细胞中黄嘌呤脱氢酶(XDH)的表达的小干扰RNA(siRNA)，以及包含其编码核苷酸的载体和细胞、以及利用该siRNA、载体或细胞治疗受试者中与XDH表达相关的疾病或症状的方法。

Description

调控XDH基因活性的siRNA分子
本申请要求于2022年12月26日提交的中国专利申请号202211677156.4的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及RNA干扰领域。
背景技术
高尿酸血症(HUA)是在正常饮食状态下，体内尿酸合成增加和/或尿酸的肾清除降低所致。高尿酸血症分为原发性高尿酸血症和继发性高尿酸血症。原发性高尿酸血症通常是由于分子缺陷或先天性嘌呤代谢障碍导致。继发性高尿酸血症是由于多种急慢性疾病如血液或恶性肿瘤、慢性中毒、药物或高嘌呤饮食所致的血尿酸产生增高或尿酸排泄障碍所致的高尿酸血症。研究表明，高尿酸血症可以诱发多种疾病，包括痛风、高血压、糖尿病、冠心病和肾脏疾病。
痛风是一种常见且复杂的关节炎类型，患者经常会在夜晚出现突然性的关节疼，发病急，关节部位出现疼痛、水肿、红肿和炎症。痛风发作与体内尿酸浓度升高有关，是由单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病。
黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase，简称XDH)能够将嘌呤降解产物黄嘌呤转化为尿酸。因此，黄嘌呤脱氢酶是治疗痛风的关键靶点之一。
通过抑制XDH的表达，可以减少鸟嘌呤和次黄嘌呤的产生，从而降低体内尿酸浓度，实现缓解、抑制或治疗高尿酸血症及高尿酸血症诱发的疾病或病症例如痛风的目的。
通过小干扰RNA(siRNA)基于RNA干扰机制降低XDH表达，是治疗痛风的新方法。
发明内容
本发明提供了新的用于抑制细胞中黄嘌呤脱氢酶(XDH)的表达的小干扰RNA(siRNA)、载体、试剂盒及其药物组合物，以及所述siRNA、配体、试剂盒或药物组合物在抑制或降低黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因表达或治疗获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的方法。
在第一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中黄嘌呤脱氢酶(XDH)的表达的小干扰RNA(siRNA)，所述siRNA包含形成双链区的正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链的长度各自独立地为15-30个核苷酸，并且所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些具体的实施方案中，所述正义链包含SEQ ID NO:1-165和167中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续的核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链的长度各自独立地为15-27个核苷酸，优选19-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸。
在一些实施方案中，所述双链区的长度为15-25个核苷酸对，优选16-23个核苷酸对，更优选18-20个核苷酸对。
在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链之一或两者包含具有至少1个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端，例如所述正义链和所述反义链之一或两者包 含具有至少1个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端。在一些优选的实施方案中，所述反义链具有至少2个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端，优选地所述反义链包含具有2个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端。
在一些实施方案中，所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列的至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述正义链包含与SEQ ID NO:1-165和167中所示的核苷酸序列任一项的至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述正义链包含SEQ ID NO:1-165和167中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述siRNA包含如表3所示的配对的正义链序列和反义链序列。
在一些实施方案中，所述反义链包含SEQ ID NO:219、182、197、211、204、212、218、214、205和334中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:219、182、197、211、204、212、218、214、205和334中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述正义链包含SEQ ID NO:52、15、30、44、37、45、51、47、38和167中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:52、15、30、44、37、45、51、47、38和167中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，
(a)所述反义链包含SEQ ID NO:219所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列；
(b)所述反义链包含SEQ ID NO:182所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
(c)所述反义链包含SEQ ID NO:197所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；
(d)所述反义链包含SEQ ID NO:211所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列；
(e)所述反义链包含SEQ ID NO:204所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列；
(f)所述反义链包含SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；
(g)所述反义链包含SEQ ID NO:218所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列；
(h)所述反义链包含SEQ ID NO:214所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列；
(i)所述反义链包含SEQ ID NO:205所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；或
(j)所述反义链包含SEQ ID NO:334所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:167所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述正义链的基本上所有的核苷酸和所述反义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，或者所述正义链的所有的核苷酸和所述反义链的所有的核苷酸是修饰的核苷酸。
在一些具体的实施方案中，所述正义链和所述反义链各自独立地包含选自下组的一种或多种核苷酸修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、肌苷核糖核苷酸、脱碱基核苷酸、反向无碱基脱氧核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰、乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸、锁核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸、和脱氧核糖核苷酸。
在一些优选的实施方案中，所述正义链和所述反义链各自独立地包含选自下组的一种或多种核苷酸修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰。在一些优选的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链包含至少2个2'-氟代修饰的核苷酸。在一些优选的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链包含至少8个2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些优选的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链的3’末端和/或5’末端包含1-5个硫代磷酸酯基团，优选2-3个硫代磷酸酯基团。
在一些优选的实施方案中，所述反义链包含说明书表5中任一项所示的经修饰的核苷酸序列，和/或所述正义链包含说明书表4中任一项所示的经修饰的核苷酸序列。在一些优选的实施方案中，所述siRNA包含说明书表6中任一项所示的配对的经修饰的正义链序列和经修饰的反义链序列。
在一些具体的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链的3’末端和/或5’末端包含1-5个硫代磷酸酯基团，且其中：
(a)所述正义链包含CmAmUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmCmAmAmAm(SEQ ID NO:711)，并且所述反义链包含UmUfUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmCfCm(SEQ ID NO:712)；
(b)所述正义链包含UmCmUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmUm(SEQ ID NO:713)，并且所述反义链包含AmAfCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmCfGm(SEQ ID NO:714)；
(c)所述正义链包含UmGmGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmUm(SEQ ID NO:715)，并且所述反义链包含AmAfAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmAfUm(SEQ ID NO:716)；
(d)所述正义链包含UmUmCmAmAmGmAfAfUfAmUmGmCmUmGmUmUmUmUm(SEQ ID NO:717)， 并且所述反义链包含AmAfAmAfCmAfGmCfAmUfAmUfUmCfUmUfGmAfAmCfUm(SEQ ID NO:718)；
(e)所述正义链包含GmAmGmAmUmGmAfAfGfUmUmCmAmAmGmAmAmUmAm(SEQ ID NO:719)，并且所述反义链包含UmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCmAfAm(SEQ ID NO:720)；
(f)所述正义链包含UmCmAmAmGmAmAfUfAfUmGmCmUmGmUmUmUmCmUm(SEQ ID NO:721)，并且所述反义链包含AmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCm(SEQ ID NO:722)；
(g)所述正义链包含GmCmAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmAm(SEQ ID NO:723)，并且所述反义链包含UmUfGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmCfAm(SEQ ID NO:724)；
(h)所述正义链包含GmAmAmUmAmUmGfCfUfGmUmUmUmCmCmUmAmUmAm(SEQ ID NO:725)，并且所述反义链包含UmAfUmAfGmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUm(SEQ ID NO:726)；
(i)所述正义链包含GmAmUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmAm(SEQ ID NO:727)，并且所述反义链包含UmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCm(SEQ ID NO:728)；或
(j)所述正义链包含AmGmAmGmUmAmUfUfAfUmGmGmAmAmCmGmAmGmUm(SEQ ID NO:729)，并且所述反义链包含AmCfUmCfGmUfUmCfCmAfUmAfAmUfAmCfUmCfUmGfAm(SEQ ID NO:730)。
在一些具体的实施方案中，
(a)所述正义链包含CmsAmsUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmCmAmAmsAm(SEQ ID NO:731)，并且所述反义链包含UmsUfsUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmsCfsCm(SEQ ID NO:682)；
(b)所述正义链包含UmsCmsUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmsUm(SEQ ID NO:732)，并且所述反义链包含AmsAfsCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmsCfsGm(SEQ ID NO:683)；
(c)所述正义链包含UmsGmsGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmsUm(SEQ ID NO:733)，并且所述反义链包含AmsAfsAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmsAfsUm(SEQ ID NO:684)；
(d)所述正义链包含UmsUmsCmAmAmGmAfAfUfAmUmGmCmUmGmUmUmUmsUm(SEQ ID NO: 734)，并且所述反义链包含AmsAfsAmAfCmAfGmCfAmUfAmUfUmCfUmUfGmAfAmsCfsUm(SEQ ID NO:685)；
(e)所述正义链包含GmsAmsGmAmUmGmAfAfGfUmUmCmAmAmGmAmAmUmsAm(SEQ ID NO:735)，并且所述反义链包含UmsAfsUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCmsAfsAm(SEQ ID NO:686)；
(f)所述正义链包含UmsCmsAmAmGmAmAfUfAfUmGmCmUmGmUmUmUmCmsUm(SEQ ID NO:736)，并且所述反义链包含AmsGfsAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmsAfsCm(SEQ ID NO:687)；
(g)所述正义链包含GmsCmsAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmsAm(SEQ ID NO:737)，并且所述反义链包含UmsUfsGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmsCfsAm(SEQ ID NO:688)；
(h)所述正义链包含GmsAmsAmUmAmUmGfCfUfGmUmUmUmCmCmUmAmUmsAm(SEQ ID NO:738)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfGmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmsUfsUm(SEQ ID NO:689)；
(i)所述正义链包含GmsAmsUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmsAm(SEQ ID NO:739)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmsUfsCm(SEQ ID NO:690)；或
(j)所述正义链包含AmsGmsAmGmUmAmUfUfAfUmGmGmAmAmCmGmAmsGmsUm(SEQ ID NO:740)，并且所述反义链包含AmsCfsUmCfGmUfUmCfCmAfUmAfAmUfAmCfUmCfUmsGfsAm(SEQ ID NO:691)。
在一些实施方案中，所述siRNA进一步与包含N-乙酰半乳糖胺的配体缀合，优选所述siRNA的正义链与所述配体缀合。在一些优选的实施方案中，所述正义链的3’端与所述配体缀合。在另一些优选的实施方案中，所述正义链的5’端与所述配体缀合。
在一些实施方案中，所述配体包含式(X’)所示的缀合基团：
其中，
表示与siRNA连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，所述缀合配体靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
在一些优选的实施方案中，所述缀合基团选自表1：
表1 缀合基团的结构




在一些具体的实施方案中，表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与所述siRNA的正义链连接的位置。
在一些优选的实施方案中，所述缀合基团选自表2：
表2 缀合基团的结构





。在一些具体的实施方案中，表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与所述siRNA的正义链连接的位置
在一些实施方案中，所述siRNA中包含的所述配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与所述siRNA的正义链连接的位置。
在一些实施方案中，所述siRNA中包含的所述配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与所述siRNA的正义链连接的 位置。
在一些实施方案中，本发明的siRNA中包含的配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置。
在一些实施方案中，本发明的siRNA中包含的配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置。
在一些实施方案中，
(a)所述正义链包含CmsAmsUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmCmAmAmsAms-GL6(SEQ ID NO:503)，并且所述反义链包含UmsUfsUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmsCfsCm(SEQ ID NO:682)；
(b)所述正义链包含UmsCmsUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmsUms-GL6(SEQ ID NO:504)，并且所述反义链包含AmsAfsCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmsCfsGm(SEQ ID NO:683)；
(c)所述正义链包含UmsGmsGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmsUms-GL6(SEQ ID NO:505)，并且所述反义链包含 AmsAfsAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmsAfsUm(SEQ ID NO:684)；
(d)所述正义链包含UmsUmsCmAmAmGmAfAfUfAmUmGmCmUmGmUmUmUmsUms-GL6(SEQ ID NO:506)，并且所述反义链包含AmsAfsAmAfCmAfGmCfAmUfAmUfUmCfUmUfGmAfAmsCfsUm(SEQ ID NO:685)；
(e)所述正义链包含GmsAmsGmAmUmGmAfAfGfUmUmCmAmAmGmAmAmUmsAms-GL6(SEQ ID NO:507)，并且所述反义链包含UmsAfsUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCmsAfsAm(SEQ ID NO:686)；
(f)所述正义链包含UmsCmsAmAmGmAmAfUfAfUmGmCmUmGmUmUmUmCmsUms-GL6(SEQ ID NO:508)，并且所述反义链包含AmsGfsAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmsAfsCm(SEQ ID NO:687)；
(g)所述正义链包含GmsCmsAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmsAms-GL6(SEQ ID NO:509)，并且所述反义链包含UmsUfsGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmsCfsAm(SEQ ID NO:688)；
(h)所述正义链包含GmsAmsAmUmAmUmGfCfUfGmUmUmUmCmCmUmAmUmsAms-GL6(SEQ ID NO:510)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfGmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmsUfsUm(SEQ ID NO:689)；
(i)所述正义链包含GmsAmsUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmsAms-GL6(SEQ ID NO:511)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmsUfsCm(SEQ ID NO:690)；或
(j)所述正义链包含AmsGmsAmGmUmAmUfUfAfUmGmGmAmAmCmGmAmsGmsUm-GL6(SEQ ID NO:512)，并且所述反义链包含AmsCfsUmCfGmUfUmCfCmAfUmAfAmUfAmCfUmCfUmsGfsAm(SEQ ID NO:691)，
其中GL6为
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置。
在第二方面，本发明提供了一种细胞，其含有本发明所述的siRNA。
在第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的siRNA或细胞，以及任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。
在第四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明所述的siRNA、细胞或药物组合物。
在第五方面，本发明提供了一种减少受试者中黄嘌呤脱氢酶(XDH)或尿酸水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物的步骤。本发明还提供了一种治疗受试者中获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物的步骤。本发明还提供了一种预防患有获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的患者中至少一种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，所述获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症是黄嘌呤脱氢酶(XDH)相关疾病。在一些实施方案中，所述黄嘌呤脱氢酶(XDH)相关疾病选自由以下组成的组：高尿酸血症、痛风以及由高血尿酸导致的高血压、糖尿病、冠心病和肾脏疾病。
在一些实施方案中，本发明的治疗受试者中获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的方法、预防患有获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的患者中至少一种症状的方法或减少受试者中黄嘌呤脱氢酶(XDH)或尿酸水平的方法包括向所述受试者皮下施用、局部施用或静脉内施用所述siRNA、细胞或药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人患者。
发明详述
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明，均属于本发明的保护范围。下文更具体详细说明本发明的实施方式。
定义
本文术语“siRNA”是一类双链RNA分子，其可以介导与其互补的靶RNA(例如mRNA，例如，编码蛋白质的基因的转录物)的沉默。siRNA通常是双链的，包括与靶RNA互补的反义链，和与该反义链互补的正义链。为方便起见，这样的mRNA在此也被称为有待被沉默的mRNA。这样的基因也称为靶基因。通常，有待被沉默的RNA是内源基因或病原体基因。另外，除了mRNA以外的RNA(例如tRNA)以及病毒RNA也可以被靶向。
如在此使用的，术语“反义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包含与靶序列完全或基本互补的区域。
如在此使用的，术语“互补区域”是指反义链上与靶mRNA序列完全或基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配位于末端区域中，例如，在5’和/或3’端的5、4、3、2或1个核苷酸内。对错配最敏感的反义链部分被称为“种子区”。例如，在包含19nt的链的siRNA中，第19个位置(从5’向3’)可以耐受一些错配。
如此处所使用，术语“互补”是指第一多核苷酸在某些条件例如严格条件下与第二多核苷酸杂交的能力。例如，严格条件可包括400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA在50℃或70℃下持续12-16小时。
如此处所使用，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
如在此使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分互补”或“基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如，编码XDH的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码XDH的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与XDH mRNA的至少部分互补。
在此的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以相对于siRNA的正义链与反义链之间，或siRNA试剂的反义链与靶序列之间的碱基配对使用。
如在此使用的，术语“正义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包括与作为在此定义的术语反义链的区域基本互补的区域。
“核苷”是由嘌呤碱或嘧啶碱、以及核糖或脱氧核糖两种物质组成的化合物，“核苷酸”则是由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物，“寡核苷酸”是指例如具有少于100、200、300或400个核苷酸长度的核酸分子(RNA或DNA)。
“碱基”是合成核苷、核苷酸和核酸的基本组成单位，其组成元素中含有氮，也称“含氮碱基”。本文中，如无特别说明，大写字母A、U、T、G和C表示核苷酸的碱基组成，分别为腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。
如在此使用的，术语“核苷酸突出端”是指至少一个未配对的核苷酸，其从siRNA的双链体结构(例如，siRNA)突出。例如当siRNA的一条链的3'-末端延伸超过另一条链的5'-末端时或反之亦然，存在核苷酸突出端。siRNA可以包含具有至少一个核苷酸的突出端；替代地，该突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于正义链、反义链或其任何组合上。另外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于siRNA的反义或正义链的5'-末端、3'-末端或两个末端上。
“平端”或“平末端”意指在该双链siRNA的该端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。“平端”siRNA是在其整个长度上为双链的siRNA，即，在分子的任一端处没有核苷酸突出端。本发明的siRNA包括在一端处具有核苷酸突出端(即，具有一个突出端和一个平端的试剂)或在两端处都具有核苷酸突出端的siRNA。
本发明的iRNA的基本上所有的核苷酸是修饰的。例如，正义链的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸，和/或反义链的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸，和/或正义链和反义链两者的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。在本发明其他实施例中，本发明iRNA的所有核苷酸都为修饰的核苷酸。例如，正义链的所有核苷酸都是修饰的核苷酸，和/或反义链的所有核苷酸都是修饰的核苷酸，和/或正义链和反义链两者的全部核苷酸都是修饰的核苷酸。其中“基本上所有核苷酸是修饰的”表示本发明的siRNA是大部分但不是全部修饰的，并且可以包括不多于5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
本文中“修饰的核苷酸”包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、肌苷核糖核苷酸、脱碱基核苷酸、反向无碱基脱氧核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰、乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸、锁核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸、脱氧核糖核苷酸或常规保护基保护等。例如，所述2'-氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2’位的羟基被氟取代形成的核苷酸。所述2'-脱氧-修饰的核苷酸指核糖基的2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
如本文所使用的，“配体”或“配体部分”是指与siRNA缀合的化学部分，其能够改变siRNA的分布、靶向或寿命。在优选的实施方案中，与例如不存在这样一个配体的siRNA相比，这种配体为选择的靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室、组织、器官或身体的区域)提供增强的亲和力。
如在此使用的，术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、以及其他类似术语可互换使用，并且包括任何水平的抑制。
短语“抑制黄嘌呤脱氢酶(XDH)的表达”旨在指抑制任何XDH基因以及XDH基因的变体或突变体的表达。因此，该XDH基因可以是野生型XDH基因、突变XDH基因、或在遗传操作的细胞、细胞群组或生物体的情形下的转基因XDH基因。
“抑制XDH基因的表达”包括XDH基因的任何水平的抑制，例如XDH基因表达的至少部分阻抑。基于与XDH基因表达相关的任何变量的水平或水平变化， 例如XDH mRNA水平、XDH蛋白水平，可以评估XDH基因表达。此水平可以在个体细胞中或在一组细胞中(包括例如来源于受试者的样品)进行评估。
可以通过与对照水平相比的一个或多个与XDH表达相关的变量的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如，仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。
“羟基保护基”是指能够避免羟基遭受化学反应，又可以在特定条件下脱除以恢复羟基的基团。主要包括硅烷型保护基、酰基型保护基或醚型保护基，优选以下：三甲基硅基(TMS)、三乙基硅基(TES)、二甲基异丙基硅基(DMIPS)、二乙基异丙基硅基(DEIPS)、叔丁基二甲基硅基(TBDMS)、叔丁基二苯基硅基(TBDPS)、三异丙基硅基(TIPS)、乙酰基(Ac)、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基(TFA)、苯甲酰基、对甲氧基苯甲酰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、烯丙氧羰基(Alloc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)、苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、烯丙基、三苯基甲基(Tr)、双对甲氧基三苯甲基(DMTr)、甲氧基甲基(MOM)、苯氧基甲基(BOM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、甲硫基甲基(MTM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)。
“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
“C1-6卤代烷基”是指上述“C1-6烷基”，其被一个或多个卤素基团取代。在一些实施方案中，C1-4卤代烷基是特别优选的，更优选C1-2卤代烷基。示例性的所述卤代烷基包括但不限于：-CF3、-CH2F、-CHF2、-CHFCH2F、-CH2CHF2、-CF2CF3、-CCl3、-CH2Cl、-CHCl2、2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基，等等。卤代烷基基团可以在任何可用的连接点上被取代，例如，1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基。
“C1-6亚烷基”是指除去C1-6烷基的另一个氢而形成的二价基团，并且可以是取代或未取代的。在一些实施方案中，C1-4亚烷基、C2-4亚烷基和C1-2亚烷基是优选的。未取代的所述亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)、亚戊基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)、亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)，等等。示例性的取代的所述亚烷基，例如，被一个或多个烷基(甲基)取代的所述亚烷基，包括但不限于：取代的亚甲基(-CH(CH3)-、-C(CH3)2-)、取代的亚乙基(-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)-、-C(CH3)2CH2-、-CH2C(CH3)2-)、取代的亚丙基(-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-C(CH3)2CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2C(CH3)2-)，等等。
I.siRNA
本发明提供了一种用于抑制细胞中黄嘌呤脱氢酶(XDH)的表达的小干扰RNA(siRNA)，所述siRNA包含形成双链区的正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链的长度各自独立地为15-30个核苷酸，并且所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施方案中，正义链和反义链形成的双链区是完全互补的。在另一些实施方案中，正义链和反义链形成的双链区是基本上互补的，其中可以包含1个、2个、3个、4个或5个非互补位点。
在一些具体的实施方案中，所述正义链包含SEQ ID NO:1-165和167中任一 项所示的核苷酸序列的至少15个连续的核苷酸的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链的长度各自独立地为15-27个核苷酸，优选19-25个核苷酸，更优选19-23个核苷酸。
在一些实施方案中，所述双链区的长度为15-25个核苷酸对，优选16-23个核苷酸对，更优选18-20个核苷酸对。
所述正义链和所述反义链之一或两者包含具有至少1个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端，例如所述正义链和所述反义链之一或两者包含具有至少1个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端。在一些优选的实施方案中，所述反义链具有至少2个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端，优选地所述反义链包含具有2个核苷酸的3’突出端和/或5’突出端。在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链的长度相同。在一些实施方案方案中，所述正义链的全长与所述反义链的全长互补形成双链，即具有平末端。在另一些实施方案中，所述正义链和所述反义链长度相同，正义链的一部分与反义链的一部分互补，即正义链和反义链均具有5’突出端。在一些实施方案中，所述正义链和所述反义链的长度不同。在优选的实施方案中，反义链的5’端具有至少1个核苷酸的突出端，更优选2个或3个核苷酸的突出端。
在一些实施方案中，所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列的至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述正义链包含与SEQ ID NO:1-165和167中所示的核苷酸序列任一项的至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:1-165和167中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述siRNA包含如表3所示的配对的正义链序列和反义链序列。
II.核苷酸的修饰
在一些实施方案中，所述正义链的基本上所有的核苷酸和所述反义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述正义链的至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的核苷酸是修饰的核苷酸，和/或所述反义链的至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的核苷酸是修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链的所有的核苷酸和/或所述反义链的所有的核苷酸是修饰的核苷酸。
本发明所述的核苷酸的修饰可以是在核苷酸的磷酸基团、核糖基团和/或碱基基团上的修饰。
在一些具体的实施方案中，所述正义链和所述反义链各自独立地包含选自下组的一种或多种核苷酸修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、肌苷核糖核苷酸、脱碱基核苷酸、反向无碱基脱氧核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰、乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸、锁核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
在一些优选的实施方案中，所述正义链和所述反义链各自独立地包含选自下组的一种或多种核苷酸修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、反向无碱基脱氧核糖核苷酸、和硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰。在一些优选的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链包含至少2个2'-氟代修饰的核苷酸。在一些优选的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链包含至少8个2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些优选的实施方案中，所述正义链和/或所述反义链的3’末端和/或5’末端包含1-5个硫代磷酸酯基团，优选2-3个硫代磷酸酯基团。
在一些优选的实施方案中，所述反义链包含说明书表5中任一项所示的经修饰的核苷酸序列，和/或所述正义链包含说明书表4中任一项所示的经修饰的核苷酸序列。在一些优选的实施方案中，所述siRNA包含说明书表6中任一项所示的配对的经修饰的正义链序列和经修饰的反义链序列。
III.配体
本发明所述的siRNA进一步与包含N-乙酰半乳糖胺的配体缀合。在优选的实施方案中，所述siRNA的正义链与所述配体缀合。在一些优选的实施方案中，所述正义链的3’端与所述配体缀合。在另一些优选的实施方案中，所述正义链的5’端与所述配体缀合。
在一些实施方案中，所述配体包含式(X’)所示的缀合基团：
其中，
表示与siRNA连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，所述缀合基团如式(I’)所示：
其中，
表示与siRNA连接的位置；
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-或-NHC(O)-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些具体的实施方案中，其中，
Q独立地为H或
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
L’为化学键；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，所述缀合基团如式(I’-1)、式(I’-2)或式(I’-3)所示：
其中，
表示与siRNA连接的位置；
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH 或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些具体的实施方案中，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，所述缀合基团如式(II’-1)或式(II’-2)所示：
其中，
表示与siRNA连接的位置；
Q独立地为
其中L1为-CH2O-或-CH2O-CH2CH2O-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些具体的实施方案中，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键或-C(O)NH-；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，其中所述缀合基团如式(II’-2)所示：
其中，
表示与siRNA连接的位置；
Q独立地为
其中L1为-CH2-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
L为-CH2O-或-NHC(O)-；
R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些具体的实施方案中，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为化学键、-C(O)NH-、-NHC(O)-或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些具体的实施方案中，其中，
T为-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-，其中M为
在一些具体的实施方案中，其中，
Q独立地为H或
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
L’为化学键或-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如以上实施方案所定义。
在一些实施方案中，其中所述缀合基团如式(III’-1)、式(III’-2)或式(III’-3)所示：
其中，
Q为
其中L1为-CH2O-或-NHC(O)-；
L2为-CH2CH2C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-或-(NHCH2CH2CH2)b-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-CH2O-；
其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如以上实施方案所定义。
在一些具体的实施方案中，其中，
Q独立地为H、
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L2为化学键；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如以上实施方案所定义。
在一些实施方案中，其中所述缀合基团如式(IV-1)或式(IV-2)所示：
其中，
Q独立地为
其中L1为-CH2-、-CH2O-或-C(O)-；
L3为-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键或-NHC(O)-；
L’为化学键；
其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
其中T如以上实施方案所定义。
在一些具体的实施方案中，其中：
Q独立地为H、
其中L1为化学键、-CH2-、-CH2CH2-、-C(O)-、-CH2O-、-CH2O-CH2CH2O-或-NHC(O)-(CH2NHC(O))a-；
L2为化学键或-CH2CH2C(O)-；
L3为化学键、-(NHCH2CH2)b-、-(NHCH2CH2CH2)b-或-C(O)CH2-；
L4为-(OCH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2)c-、-(OCH2CH2CH2CH2CH2)c-或-NHC(O)-(CH2)d-；
其中a＝0、1、2或3；
b＝1、2、3、4或5；
c＝1、2、3、4或5；
d＝1、2、3、4、5、6、7或8；
L为化学键、-CH2O-或-NHC(O)-；
L’为-O(CH2CH2O)e-；
其中e为1、2、3、4或5；
T为化学键、-CH2-、-C(O)-、-M-、-CH2-M-或-C(O)-M-；
其中M为
R1和R2一起形成-CH2CH2O-或-CH2CH(R)-O-，并且R3为H；
或者R1和R3一起形成-C1-2亚烷基-，并且R2为H；
其中R为-OR’、-CH2OR’或-CH2CH2OR’，其中R’为H、羟基保护基或固相载体，所述羟基保护基优选-C(O)CH2CH2C(O)OH或4,4'-二甲氧基三苯甲基；
m＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
n＝0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些优选的实施方案中，其中所述缀合基团选自表1和表2。
在一些实施方案中，所述配体靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
在一个优选的实施方案中，其中所述配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置。
在一个优选的实施方案中，其中所述配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置。
在一个优选的实施方案中，其中所述配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与所述siRNA的正义链连接的位置。
在一个优选的实施方案中，其中所述配体具有以下结构：
其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与所述siRNA的正义链连接的位置。
IV.XDH基因表达抑制
本发明的siRNA能够将XDH基因表达抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
XDH基因表达的抑制可以通过由第一细胞或细胞群组(这样的细胞可以存在于例如来源于受试者的样品中)表达的mRNA的量的降低来显现，其中XDH基因被转录并且该细胞或这些细胞已经被处理(例如通过使该细胞或这些细胞与本发明的siRNA接触，或通过向现在存在或以前存在这些细胞的受试者给予本发明的siRNA，使得与该第一细胞或细胞群组基本上相同但尚未被如此处理的第二细胞或细胞群组(一种或多种对照细胞)相比，XDH基因表达被抑制。
在优选实施例中，通过使用下式将被处理的细胞中的mRNA的水平表示为对照细胞中的mRNA的水平的百分比来评估该抑制。在一些具体的实施方案中，计算2-△△Ct值以比较实验组和对照组之间的差异，其中△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。
可替代地，可以就与XDH基因表达在功能上有关的参数(如脂质水平、胆固醇水平，例如LDLc水平)的降低而言来评估XDH基因表达例如XDH蛋白表达的抑制。可以组成性地或者通过基因组工程化而表达XDH的任何细胞中并且通过本领域中已知的任何测定来确定XDH基因沉默。肝脏是XDH表达的主要部位，其他重要表达部位包括肠道和女性组织。
XDH蛋白的表达的抑制可以通过由细胞或细胞群组表达的XDH蛋白水平(例如来源于受试者的样品中表达的蛋白质水平)的降低来显现。如以上关于mRNA阻抑的评估所解释，被处理的细胞或细胞群组中的蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为对照细胞或细胞群组中的蛋白质的水平的百分比。
可以用来评估XDH基因表达的抑制的对照细胞或细胞群组包括尚未与本发明的siRNA接触的细胞或细胞群组。例如，该对照细胞或细胞群组可以来源于在用siRNA处理受试者之前的个体受试者(例如人类或动物受试者)。
V.细胞
本发明提供了细胞，其含有本发明所述的siRNA，其中本发明所述的siRNA能够在细胞中转录。
VI.药物组合物
本发明提供了药物组合物，其包含本发明所述的siRNA或细胞，以及任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。
本文使用的“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在正确医学判断范围内，适合于接触人类受试者和动物受试者的组织而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。
在本文中，药学上可接受的载剂是指有助于将siRNA或包含其编码序列的载体或细胞施用至人体和/或有利于其吸收或发挥作用的药物载剂。例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
例如，包含本发明所述的siRNA或细胞的药物组合物可以包含药学上可接受的稀释剂或缓释基质，本发明所述的siRNA被嵌入该缓释基质中。
VII.试剂盒
本发明提供了试剂盒，其包含本发明所述的siRNA或细胞。
本发明还提供了用于使用本发明所述的siRNA和/或执行本发明的方法的试剂盒。这样的试剂盒包括一种或多种本发明所述的siRNA或细胞，还可以进一步包括使用说明书。该使用说明书中可以记录用于通过使细胞与本发明所述的siRNA接触以有效抑制XDH表达的量接触来抑制该细胞中的该XDH表达的说明书。
在本发明所述的siRNA在体外与细胞接触的情况下，任选地，本发明的试剂盒还可以包括用于使细胞与本发明所述的siRNA接触的工具(例如，注射装置)或用于测量XDH的抑制效果的工具(例如，用于测量XDH mRNA或蛋白质的抑制的装置)。这样的用于测量XDH的抑制的装置可以包含用于从受试者获得样品(例如像，血浆样品)的装置。
在将本发明所述的siRNA或已经在体外导入siRNA的细胞施用至体内的情况下，本发明的试剂盒还可以任选地包括用于将本发明所述siRNA或细胞给予至受试者的装置或用于确定治疗有效量或预防有效量的装置。
VIII.治疗方法、制药用途
本发明提供了一种减少受试者中黄嘌呤脱氢酶(XDH)或尿酸水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物的步骤。
本发明提供了一种治疗、预防、抑制或缓解受试者中获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物的步骤。本发明还提供了治疗、预防、抑制或缓解患有获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的患者中至少一种症状的方法。
在一些实施方案中，所述所述获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症是XDH相关疾病。在一些实施方案中，所述XDH相关疾病是高尿酸血症、痛风以及由高血尿酸导致的高血压、糖尿病、冠心病和肾脏疾病。
在一些实施方案中，本发明的减少受试者中黄嘌呤脱氢酶(XDH)或尿酸水平的方法、治疗、预防、抑制或缓解受试者中获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的方法、或治疗、预防、抑制或缓解患有获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的患者中至少一种症状的方法包括向所述受试者皮下施用或静脉内施用所述siRNA或药物组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人患者。
本发明还涉及用于治疗受试者中与XDH表达相关的疾病或症状的本发明所述的siRNA、细胞或药物组合物。
本发明还涉及本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物在制备用于治疗、预防、抑制或缓解受试者中获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的药物中的用途。本发明还涉及本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物在制备用于减少受试者中黄嘌呤脱氢酶(XDH)或尿酸水平的药物中的用途。本发明还涉及本发明所述的siRNA、细胞、或药物组合物在制备用于治疗、预防、抑制或缓解患有获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的患者中至少一种症状的药物中的用途。本发明的药物可以制备成乳剂、微乳剂、微颗粒等。
序列
本发明提供的RNA序列靶向人XHD基因(或靶基因、靶mRNA序列、靶序列)。靶XHD mRNA序列如Genbank注册号NM_000379.4所示的基因。
表3 靶向XDH mRNA的正义链和反义链的核苷酸序列




表4示出了本发明使用的修饰的RNA序列。
本文中，各缩写的意义如下：
A、U、G和C分布表示天然的腺嘌呤核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸和胞嘧啶核糖核苷酸。
i表示肌苷核糖核苷酸。
d表示其右侧相邻的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。例如dA、dT、dG和dC分别表示腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。
m表示其左侧相邻的核苷酸是2’-OCH3修饰的核苷酸。例如，Am、Um、Gm和Cm分别表示2’-OCH3修饰的A、U、G和C。
f表示其左侧相邻的核苷酸是2’-F修饰的核苷酸。例如，Af、Uf、Gf和Cf分别表示2’-F修饰的A、U、G和C。
“s”或“s-”表示其左右相邻的两个核苷酸和/或递送载体通过硫代磷酸酯连接。
VP表示其右侧相邻的核苷酸是乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸，是本领域熟知的，可参见例如PCT公开号WO2011139702、WO2013033230和WO2019105419。
IB表示反向无碱基脱氧核糖核苷酸，根据其在siRNA中所在位置/连接方式的不同可包括以下三种结构(分别用于核酸链的5’端，中间和3’端)：
IB是本领域熟知的，参见例如F.Czauderna,Nucleic Acids Res.,2003,31(11),2705-16以及PCT公开号WO2016011123和WO2019051402。
L96表示本领域熟知的以下结构的GalNAc递送载体，其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置，可参见例如PCT公开号WO2009073809和WO2009082607
NAG37表示本领域熟知的以下结构的GalNAc递送载体，其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置，可参见例如PCT公开号WO2018044350
GL6表示以下结构的GalNAc递送载体，其中表示磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置
GL12表示以下结构的GalNAc递送载体，其中表示磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置
表4 靶向XDH基因的经修饰的siRNA正义链序列




表5 靶向XDH基因的经修饰的siRNA反义链序列




表6 靶向XDH基因的配对的siRNA正义链和反义链



实施例
如无特别说明，实施例中使用的材料来源如下：
Huh7细胞系购自南京科佰，货号CBP60202；
Hep3B细胞系购自南京科佰，货号CBP60197；
PHH细胞购自上海轩一，货号QYLF-HPMC；
HEK293A细胞系购自南京科佰，货号CBP60436；
Balb/c小鼠来自浙江维通利华，货号Balb/c。
实施例1 化合物E7的制备
1.中间体3-4的制备
1.1化合物2的制备
在15℃下向化合物1(300g,2.01mol)的DCM(1.80L)中缓慢加入苄基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(600g,2.40mol)并逐滴加入TEA(203g,2.01mol,280mL)。加入后，将混合物在25℃下搅拌16小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝10:1)显示反应物1(Rf＝0.32)被保留且检测到一个重要新点(Rf＝0.52)。使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应混合物(1.00L x 2)，使用盐水(1.00L)洗涤有机相，用无水Na2SO4干燥并真空浓缩。不经纯化，化合物2(约385g)为黄色油状。
1.2化合物2A的制备
在0-15℃下向化合物4(350g,1.62mol,HCl)和Ac2O(994g,9.74mol,912mL)的吡啶(1.75L)溶液中一次性加入DMAP(19.8g,162mmol)并逐滴加入TEA(164g,1.62mol,226mL)。将混合物在25℃下搅拌16小时。LCMS(产物:RT＝0.687min)显示起始反应物消耗完全。在25℃下向混合物中添加EtOAc(1.40L)并搅拌30分钟，随后过滤混合物并使用EtOAc(300mL)清洗滤饼。在25℃下 用水(1.45L)磨碎滤饼30分钟。过滤混合物并使用水(175mL x 3)清洗滤饼，收集滤饼以获得白色固体状的化合物2A(约580g)。
1.3化合物2B的制备
三次反应平行进行。
在10-15℃下经0.5小时向化合物2A(200g,514mmol)的DCM(800mL)溶液中逐滴加入TMSOTf(137g,616mmol,111mL)。随后将混合物在25℃下搅拌3小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝20:1)显示化合物2A(Rf＝0.54)消耗完全且新点(Rf＝0.24)形成。合并三次反应。将混合物冷却至0-15℃，在0-5℃下缓慢倒入NaHCO3的溶液(300g溶解在3.00L水)中，分离有机相并用DCM(1.00L x 3)萃取水相，合并有机层，用Na2SO4,干燥，过滤并真空浓缩。不经纯化，获得黄色油状的化合物2B(约507g)用于下一步骤。
1.4化合物3的制备
在0-10℃下向在DCM(1.00L)中的化合物2B(250g,759mmol)和化合物2(151g,531mmol)的混合物中逐滴加入TMSOTf(84.4g,380mmol,69.0mL)并将混合物在20℃搅拌12小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝20:1)显示化合物2(Rf＝0.33)消耗完全且形成新点(Rf＝0.03)。将合并的反应物冷却至0-5℃，随后将反应物倒入NaHCO3(水溶液，100g溶于1L水)中并在5-10℃下搅拌10分钟，分离相。使用DCM(500mL x 2)萃取水相，合并的有机相用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩滤液。不经纯化，化合物3(约360g)为黄色油状。
1H NMR:(400MHz,DMSO).
δ＝7.79-7.37(m,1H),7.35-7.26(m,5H),5.21-5.20(m,1H),5.00-4.95(m,3H),4.55-4.53(m,1H),4.03-3.86(m,3H),3.61-3.59(m,1H),3.59-3.57(m,1H),3.48-3.40(m,6H),3.39-3.31(m,2H),3.14-3.13(m,2H),2.09(s,3H),1.99(s,3H),1.88(s,3H),1.76-1.74(m,3H).
1.5中间体3-4(TFA盐)的制备
三次反应平行进行。
在氩气气氛下向在THF(1.80L)中的Pd/C(18.0g,16.3mmol,10％含量)的混合物中加入化合物3(180g,293mmol)和TFA(33.5g,293mmol,21.8mL)。对混悬液排气并使用氢气通气三次。在H2(50Psi)和30℃下将混合物搅拌2小时。LCMS(产物:RT＝0.697min)显示化合物3消耗且检测到产物峰。合并三次反应。通过celite过滤混合物，减压浓缩滤液以除去溶剂。不经纯化，获得黄色固体状的中间体3-4(TFA盐)(393g,660mmol,74.8％产率,99.6％纯度,TFA)。
1H NMR:(400MHz,DMSO-d6)
δ＝7.92(d,J＝9.1Hz,4H),5.27-5.17(m,1H),5.03-4.91(m,1H),4.60-4.50(m,1H),4.09-3.97(m,4H),3.85(s,2H),3.65-3.46(m,10H),3.04-2.92(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.94-1.86(m,3H),1.82-1.71(m,4H).
2.中间体3-5的制备
2.1化合物5的制备
在25℃下向化合物4B(10.0g,35.5mmol,1.00eq)和以上制备的化合物3-4(46.3g,78.2mmol,2.20eq,TFA)的DCM(1.00L)溶液中一次性加入DIEA(30.3g,234mmol,40.8mL,6.60eq)。25℃搅拌半小时。向混合物中加入HBTU(30.3g,234mmol,40.8mL,6.60eq)。25℃搅拌16小时。LCMS(产物:RT＝0.681mins)显示反应完成，真空浓缩混合物。在20℃下向混合物中加入0.50N HCl(200mL x 2)，并用DCM(3x 500mL)萃取，合并有机层并用饱和NaHCO3(3x 800mL)清洗直至pH＝8，用盐水(3x 500mL)清洗，用Na2SO4干燥并真空浓缩纯化。通过柱色谱(SiO2,DCM:MeOH＝50:1-15:1)纯化残留物。在40℃下真空浓缩残留物并通过制备型-MPLC(柱:800g Agela C18；流动相:[水-ACN]；15-45％25min；45％10min)纯化。真空干燥以获得黄色固体状的化合物5(约180g+75.0g+87.0g+40.0g+38.0g)。
417.0g的化合物3-4通过9批次被转换为化合物5。
2.2中间体3-3的制备
在氩气气氛下向Pd/C(3.00g,10％含量)的THF(300mL)中加入化合物5(73.0g,61.7mmol,1.00eq)和TFA(7.04g,61.7mmol,4.57mL,1.00eq)。对悬浮液脱气并使用氢气通气三次。在H2(20Psi)和20℃下搅拌16小时。TLC(二氯甲烷:甲醇＝8:1,Rf＝0.0)显示反应完成。通过celite过滤混合物，加压浓缩滤液以除去溶剂以获得白色固体状的化合物3-3(约33.4g+129g+75.0g)。
1H NMR:(400MHz,DMSO)
δ＝8.53(t,J＝5.2Hz,1H),8.18(d,J＝2.4Hz,3H),8.03(t,J＝5.2Hz,1H),7.84(dd,J＝3.6Hz,2H),5.22(d,J＝3.2Hz,2H),4.96(dd,J＝3.2Hz,2H),4.55(d,J＝8.4Hz,2H),4.02(t,J＝8.8Hz,6H),3.77-3.59(m,5H),3.58-3.45(m,21H),3.40-3.20(m,4H),2.18(t,J＝7.6Hz,2H),2.17(d,J＝8.0Hz,6H),2.10(s,6H),1.99(s,6H),1.90-1.80(m,8H),1.77(s,6H).
3.化合物E7的制备
3.1化合物3的制备
在室温下将化合物1(2.00g,1.87mmol，根据上述中间体3-3的方法制备)溶解到DCM(20.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(0.135mL,0.814mmol)，化合物2(0.550g,0.814mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌16小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示原料消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝5/1)得到白色固体化合物3(约780mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)
δ＝7.28-7.42(m,5H),5.30-5.34(m,4H),5.04-5.14(m,6H),4.63-4.67(m,4H),4.36-4.44(m,2H),4.00-4.20(m,23H),3.91-3.95(m,4H),3.69-3.77(m,9H),3.52-3.67(m,32H),3.34-3.43(m,9H),2.29-2.31(m,4H),2.14(s,12H),2.03(s,12H),1.92-1.96(m,24H).LCMS:m/z＝1221.6(M/2+H)+.
3.2化合物4的制备
在室温下将化合物3(1.10g,0.451mmol)溶解到MeOH(10.0mL)中，向该溶液中加入质量分数为10％的湿Pd/C(0.050g,0.451mmol)，置换3次氢气，反应混合物在氢气氛围下(14.696psi)、25℃下搅拌18小时。液质联用检测到产物的MS响应，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1，磷钼酸显色)显示原料已完全消耗且有新点生成。反应液过滤，滤液在减压下浓缩得到白色固体化合物4(约840mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)
δ＝5.32-5.34(m 4H),5.06-5.10(m,4H),4.63-4.65(m,4H),4.38-4.40(m,2H),3.99-4.20(m,20H),3.90-3.97(m,4H),3.69-3.76(m,6H),3.50-3.68(m,36H),3.35-3.44(m,11H),2.28-2.38(m,4H),2.15(s,12H),2.03(s,12H),1.90-1.94(m,24H).LCMS:m/z＝1154.7(M/2+H)+.
3.3化合物6的制备
在室温下将化合物5(232mg,0.364mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中依次加入HBTU(207mg,0.546mmol)，DIEA(0.181mL,1.09mmol))和化合物4(840mg,0.364mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌1小时。液质联用检测到原料消失，薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝5/1)显示原料消失且有新点生成。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝8/1～5/1)得到白色固体化合物6(约620mg)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)
δ＝7.41-7.43(m,2H),7.23-7.34(m,7H),6.83-6.90(m,4H),5.31-5.35(m,4H),5.01-5.12(m,4H),4.63-4.65(m,4H),4.41-4.45(m,2H),4.31-4.33(m,1H),3.99-4.22(m,22H),3.87-3.97(m,6H),3.58-3.81(m,45H),3.34-3.43(m,10H),2.19-2.40(m,10H),2.14(s,12H),2.02(s,12H),1.92-1.96(mz,24H),1.48-1.63(m,4H),1.28-1.38(m,8H).LCMS:m/z＝1460.0(M/2+H)+.
4.化合物E7的制备
在室温下将化合物6(300mg,0.103mmol)溶解到DCM(10.0mL)中，向溶液中依次加入DIEA(0.102mL,0.618mmol)，化合物7(10.3mg,0.103mmol)和DMAP(12.6mg,0.103mmol)，置换3次氮气。反应混合物在25℃下搅拌2小时。液质联用检测到原料消失。反应液在减压下浓缩，所得的粗产品经制备型高效液相色谱制备(制备型-HPLC,柱：Waters Xbridge BEH C18 100*30mm*10um；流动相:水-ACN；B％:17％-57％,5min)分离得到白色固体化合物E7(53.0mg,收率17.08％,纯度78.94％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)
δ＝7.41-7.45(m,2H),7.17-7.34(m,7H),6.85-6.89(m,4H),5.32-5.36(m,4H),5.03-5.13(m,4H),4.63-4.67(m,4H),4.38-4.47(m,2H),4.32-4.34(m,1H),4.01-4.26(m,22H),3.88-4.00(m,6H),3.77-3.81(m,7H),3.49-3.76(m,45H),3.33-3.47(m,10H),2.56-2.62(m,2H),2.45-2.55(m,3H),2.21-2.38(m,7H),2.14(s,12H),2.05-2.11(m,2H),2.02(s,12H),1.92-1.96(m,24H),1.47-1.68(m,4H),1.28-1.34(m,8H)
MS:m/z＝3022.36(M+H)+.
实施例2 siRNA的制备
使用本领域熟知的固相亚磷酰胺法制备本发明的siRNA。具体方法可参见例如PCT公开号WO2016081444和WO2019105419，并简述如下。
1.未连接配体的siRNA的制备
1.1正义链(SS链)的合成
通过固相亚磷酰胺合成法，利用空白的CPG固相载体做为起始循环，按照正义链核苷酸排布顺序自3‘-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包含了脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫代四步反应，合成规模为5μmol的寡核酸合成条件如下：
核苷单体提供的是0.05mol/L的乙腈溶液，每一步反应的条件相同，即温度为25℃，脱保护使用3％的三氯乙酸-二氯甲烷溶液，脱保护3次；偶联反应使用的活化剂为0.25mol/L的ETT-乙腈溶液，偶联2次；盖帽使用10％醋酐-乙腈和吡啶/N-甲基咪唑/乙腈(10:14:76,v/v/v)，盖帽2次；氧化使用0.05mol/L的碘/四氢呋喃/吡啶/水(70/20/10,v/v/v)，氧化2次；硫代使用0.2mol/L PADS的乙腈/3-甲基吡啶(1/1,v/v)，硫代2次。
1.2反义链(AS链)的合成
通过固相亚磷酰胺合成法，利用空白的CPG固相载体做为起始循环，按照反义链核苷酸排布顺序自3‘-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包含了脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫代四步反应，反义链的5μmol的寡核酸合成条件和正义链的相同。
1.3寡核苷酸的纯化与退火
1.3.1氨解
将合成好的固相载体(正义链或者反义链)加入到5mL的离心管中，加入3％的二乙胺/氨水(v/v)，35℃(或者55℃)恒温水浴下反应16小时(或者8小时)，过滤，固相载体用乙醇/水洗涤三次，每次1mL，滤液离心浓缩后粗品进行纯化。
1.3.2纯化
纯化和脱盐的方法是本领域人员所熟知的。例如，可采用强阴离子填料装柱，氯化钠-氢氧化钠体系进行洗脱纯化，产品收集并管，可采用凝胶填料纯化柱进行脱盐，洗脱体系是纯水。
1.3.3退火
根据表6将成对的正义链(SS链)链与反义链(AS链)以摩尔比(SS链/AS链＝1/1.05)混合，水浴锅加热至70-95℃，保持3-5min，自然冷却至室温，将体系冻干得到产品。
2.正义链与配体连接的siRNA的制备
2.1配体与CPG载体的连接
化合物E7与CPG载体的连接
将化合物E7(53mg，0.018mmol)和HBTU(13.3mg，0.035mmol)混合后加入乙腈(5mL)震荡溶解，随后加入DIEA(9.0mg，0.07mmol)和DMAP(2.1mg，0.018mmol)震荡溶解直至变得清澈。称取空白载体Resin(550mg，CPG孔径)加入到反应液中，控温20℃，摇床反应过夜。取样并监测，进行薄层色谱TLC，结果显示反应完全，其中展开剂为DCM/甲醇＝4/1，用磷钼酸显色。使用砂芯漏斗进行过滤，滤饼用无水乙腈洗涤(20mL*5)，取滤饼，使用油泵减压抽滤6h，得到类白色固体530mg。
将上述缩合后的产品530mg放于50mL的圆底瓶中，依次加入CapC(DMAP/乙腈)，CapB(N-甲基咪唑/吡啶/乙腈)，CapA(醋酐/乙腈)，室温下摇床过夜。过滤，滤饼用乙腈洗涤，20mL*4)，取滤饼，油泵减压抽滤8h后得到类白色固体200mg，用于固相合成。
2.2正义链(SS链)的合成
通过固相亚磷酰胺合成法，利用上述2.1制备的GL6固相载体做为起始循环，按照正义链核苷酸排布顺序自3’-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包含了脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫代四步反应，合成规模为5μmol的寡核酸合成条件如下：
核苷单体提供的是0.05mol/L的乙腈溶液，每一步反应的条件相同，即温度为25℃，脱保护使用3％的三氯乙酸-二氯甲烷溶液，脱保护3次；偶联反应使用的活化剂为0.25mol/L的ETT-乙腈溶液，偶联2次；盖帽使用10％醋酐-乙腈和吡啶/N-甲基咪唑/乙腈(10:14:76,v/v/v)，盖帽2次；氧化使用0.05mol/L的碘/四氢呋喃/吡啶/水(70/20/10,v/v/v)，氧化2次；硫代使用0.2mol/L PADS的乙腈/3-甲基吡啶(1/1,v/v)，硫代2次。
2.3反义链(AS链)的合成
通过固相亚磷酰胺合成法，利用空白的CPG固相载体做为起始循环，按照反义链核苷酸排布顺序自3‘-5’方向逐一连接核苷单体。每连接一个核苷单体都包含了脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫代四步反应，反义链的5μmol的寡核酸合 成条件和正义链的相同。
2.4寡核苷酸的纯化与退火
2.4.1氨解
将合成好的固相载体(正义链或者反义链)加入到5mL的离心管中，加入3％的二乙胺/氨水(v/v)，35℃(或者55℃)恒温水浴下反应16小时(或者8小时)，过滤，固相载体用乙醇/水洗涤三次，每次1mL，滤液离心浓缩后粗品进行纯化。
2.4.2纯化
纯化和脱盐的方法是本领域人员所熟知的。例如，可采用强阴离子填料装柱，氯化钠-氢氧化钠体系进行洗脱纯化，产品收集并管，采用凝胶填料纯化柱进行脱盐，洗脱体系是纯水。
2.4.3退火
根据表6将正义链(SS链)链与反义链(AS链)以摩尔比(SS链/AS链＝1/1.05)混合，水浴锅加热至70-95℃，保持3-5min，自然冷却至室温，将体系冻干得到产品。
以相似的方法获得缀合有L96的siRNA。最终获得以下siRNA：DR004361、DR004362。
实施例3 psi-CHECK2在靶活性筛选
质粒制备
根据人XDH mRNA的全长序列设计质粒，由生工生物工程(上海)股份有限公司制备psiCHECK2 XDH重组质粒。将重组质粒稀释至1000ng/μL备用。
细胞转染
用100μL HEK293A细胞(南京科佰，货号CBP60436)的细胞重悬液铺板到96孔板，细胞量为8×103个细胞/孔。
第二天，首先将孔中的完全培养基吸弃，换成Opti-MEM培养基80μL/孔，饥饿处理约1.5小时。
siRNA配制：siRNA的终浓度为10nM。
质粒混合物：每孔的质粒混合物含有0.01μL质粒和8.99μL Opti-MEM。
Lipo混合：用Opti-MEM稀释Lipo 2000(LipofectamineTM 2000转染试剂，Thermo，11668019)，室温静置5分钟，每孔中的Lipo混合物中含有Lipo 0.2μL和Opti-MEM 9.8μL。
将已配制好的Lipo混合物22μL、化合物2.2μL、质粒混合物19.8μL，分别分装到对应的同一孔中：命名为孔A，吹打混匀后，室温孵育20分钟后进行共转染。最后将孔A混合物20μL/孔加入每孔细胞中。每孔终体积为100μL，其中包含原有80μL Opti-MEM和20μL孔A混合物。37℃5％CO2培养箱培养4h后，每孔补加100μL含20％胎牛血清的DMEM培养基。37℃5％CO2培养箱培养24小时后检测。
结果检测
在实验开始前先将混合好的(Luciferase Assay System，Promega，E2940)进行复融，平衡到室温后每管按1:1加入DMEM，配制成底物I，现配现用。将Stop &Buffer进行复融，等平衡 到室温后与Stop &按照100:1配制成底物II，现配现用。
使用真空泵吸去96孔培养板中原有的培养基。每孔加入150μL底物I，在摇床上室温孵育10分钟。取120μL底物I，转移到96孔酶标板上，在酶标仪(Tecan，Infinite 200)上读取Firefly化学发光值。再向每孔加入60μL底物II，在摇床上室温孵育10分钟，在酶标仪上读取Renilla(海肾荧光素酶)化学发光值。
数据分析处理
荧光活性由酶标仪测定,收集得到的Renilla信号由Firefly信号标准均一化。siRNA的抑制效果由未经过处理的结果比较得出(剩余抑制活性)，其计算过程见下：
均一化Ren/Fir比值：Ratio＝Renilla(海肾荧光素酶)/Firefly(萤火虫荧光素酶)。
剩余抑制率＝(RatiosiRNA/Ratiocontrol)*100％，取两个孔的结果的平均值：其中Ratiocontrol为对照孔(不含siRNA)的Ratio值(取两个孔的结果的平均值)。
作图：利用Graphpad Prism作图。
半数最大抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)：本次实验以Top和Bottom作图，IC50值根据公式Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))求得，其中Y＝50，X＝log(浓度)。
siRNA的psi-CHECK2在靶活性筛选结果如表7所示。
表7 siRNA的psi-CHECK2在靶活性筛选结果


实施例4 猴原代肝细胞(PCH)活性筛选
细胞转染-反向转染
在96孔细胞培养板的每孔中加入100μL包被介质(Coating Medium)，37℃包被30分钟，结束后吸去包被介质。
在37℃复苏猴原代肝细胞(PCH，来源于妙顺(上海)生物科技有限公司)，用冻融介质(Thawing Medium)重悬细胞，离心后计数，将PCH铺板在96孔板中，90μL/孔，2×104个细胞/孔。
siRNA稀释：取198μL Opti-MEM加入2μL20μM的siRNA母液中，吹吸混匀作为第1个浓度点，按照实验实际需求进行相应稀释操作(对照组不加siRNA)。
转染流程：取14.1μL Opti-MEM稀释0.9μL RNAiMAX(Thermo，13778150)，轻轻吹吸混匀，室温静置5分钟。然后将配置好的RNAi-MAX混合液取15μL、稀释好的siRNA 15μL。轻轻吹吸混匀，室温静置10分钟，加入96孔板，10μL/孔。37℃、5％CO2培养箱培养4小时后换培养介质(Culture Medium)，第二天提取RNA。
RNA提取
按照高通量细胞RNA提取试剂盒(凡知医疗，FG0412)的操作方法使用核酸提取仪(杭州奥盛，Auto-pure96)进行细胞RNA提取。
RNA反转录
变性反应混合液的配制参考PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，6210B)。每孔中含有Oligo dT Primer 1μL，dNTP Mixture 1μL，模板RNA 12.5μL。在常规PCR仪中在65℃孵育5min进行变性反应。，将混合液置于 冰上迅速冷却2min。
反转录反应液的配制参考PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，6210B)。每孔中含有5×Prime Script II Buffer 4μL，RNA酶抑制剂0.5μL，PrimeScript II RTase 1μL。
将变性后的反应液14.5μL与反转录反应液5.5μL缓慢混匀，在常规PCR仪中在42℃孵育45分钟进行反转录，95℃孵育5分钟使酶失活，4℃将反转录产物(cDNA)冷却。
反转结束后，向每个孔的cDNA样品中加入不含DNase酶和RNA酶的蒸馏水30μL
荧光定量PCR
参考TaqManTM Fast Advanced Master Mix(ABI，4444965)的操作流程，以20μL体系进行荧光定量PCR反应(ABI，QuantStudio3)。反应程序为：(50℃，2分钟)×1Cycle；(95℃，20秒)×1Cycle；(95℃，1秒；60℃，24秒)×40Cycles。
表8 引物信息
数据统计
计算2-△△Ct值并换算成百分比以得到剩余抑制率；
△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。
siRNA的终浓度为10nM，进行siRNA化合物细胞系活性筛选，实验筛选结果如表9所示。
表9 使用10nM的siRNA进行猴原代肝细胞活性筛选的结果


实施例5 人原代肝细胞(PHH)活性筛选
细胞转染
取鼠尾胶原蛋白溶液(Sigma，C3867)1.4mL加入40.6mL DNase RNase-Free蒸馏水中，混匀。96孔培养板中每孔加入40μL混合液，4℃包被过夜，第二天去除包被液。
第二天，使用前，将包被的细胞板用DPBS润洗后吸去DPBS，将PHH细胞(上海轩一，货号QYLF-HPMC)加入复苏培养基中，在37℃复苏，离心，重悬，并且计数。将PHH细胞铺板到96孔板中，90μL/孔，2×104个细胞/孔；4小时后更换完全培养基，18小时后进行转染操作。
第三天，将198μL Opti-MEM加入2μL 20μM的siRNA母液，吹吸混匀，作 为第1个浓度点，按照实际实验需要进行相应梯度稀释。(对照组不加化合物)
第三天，取14.1μL Opti-MEM稀释0.9μL RNAiMAX(Thermo，13778150)，轻轻吹吸混匀，室温下静置5分钟。然后将配置好的RNAi-MAX混合液取15μL、稀释好的siRNA15μL轻轻吹吸混匀。室温静置10分钟，加入96孔板，10μL/孔。37℃、5％CO2培养箱培养24小时后提取RNA。
RNA提取
按照高通量细胞RNA提取试剂盒(凡知医疗，FG0412)的操作方法使用核酸提取仪(杭州奥盛，Auto-pure96)进行细胞RNA提取。
RNA反转录
变性反应混合液的配制参考PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，6210B)每孔中含有Oligo dT Primer 1μL，dNTP Mixture 1μL，模板RNA12.5μL。在常规PCR仪中在65℃孵育5min进行变性反应。将混合液置于冰上迅速冷却2min。
反转录反应液的配制参考PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，6210B)每孔中含有5×Prime Script II Buffer 4μL，RNA酶抑制剂0.5μL，PrimeScript II RTase 1μL。
将变性后的反应液14.5μL与反转录反应液5.5μL缓慢混匀。在常规PCR仪中42℃孵育45分钟进行反转录，95℃孵育5分钟使酶失活，4℃将反转录产物(cDNA)冷却。
反转结束后，向每个孔的cDNA样品中加入DNase RNase-Free蒸馏水30μL。
荧光定量PCR
参考TaqManTM Fast Advanced Master Mix(ABI，4444965)的操作流程，以20μL体系进行荧光定量PCR反应(ABI，QuantStudio3)。反应程序为：(50℃，2分钟)×1Cycle；(95℃，20秒)×1Cycle；(95℃，1秒；60℃，24秒)×40Cycles。
表10 引物信息
数据统计
计算2-△△Ct值并换算成百分比以得到剩余抑制率。
△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。
选择siRNA起始浓度为10nM，10倍稀释5个浓度点(10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM)进行35个siRNA的PHH活性筛选，实验结果见表11。
表11 PHH 5点IC50活性筛选实验结果
实施例6 Tg小鼠原代肝细胞(PMH)活性筛选实验
自由摄取或转染
分离Tg小鼠肝原代细胞(Tg小鼠来源于集萃药康)，计数，铺板于24孔板 中，900μL/孔，8×104个细胞/孔。
自由摄取：将10μL稀释的siRNA加入90μL Opti-MEM中混匀，加入对应孔中，37℃、5％CO2培养箱中培养24小时(对照组不加siRNA)。
转染：将10μL稀释的siRNA加入40μL Opti-MEM中混匀，3μL RNAiMAX加入47μL Opti-MEM中混匀，孵育5分钟后，与稀释好的siRNA混匀，室温静置10分钟，加入对应孔中，37℃、5％CO2培养箱中培养24小时(对照组不加siRNA)。
荧光定量PCR
使用高通量核酸提取仪-磁珠法提取总RNA，反转录后进行荧光定量PCR检测。
表12 引物信息
数据统计
计算2-△△Ct值并换算成百分比以得到剩余抑制率。
△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组内参)]。
选择siRNA起始浓度为40nM，3倍稀释9个浓度点(40nM、1.33nM、4.44nM、1.48nM、0.49nM、0.16nM、0.055nM、0.018nM、0.006nM)进行Tg小鼠原代肝细胞9点IC50活性筛选，实验结果见表13。
表13 PMH 9点IC50活性筛选实验结果

Claims (26)

  1. 一种用于抑制细胞中黄嘌呤脱氢酶(XDH)的表达的小干扰RNA(siRNA)，所述siRNA包含形成双链区的正义链和反义链，其中所述正义链和所述反义链的长度各自独立地为15-30个核苷酸，并且所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。
  2. 权利要求1的siRNA，其中所述正义链包含SEQ ID NO:1-165和167中任一项所示的核苷酸序列的至少15个连续的核苷酸的核苷酸序列。
  3. 权利要求1或2的siRNA，其中所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列的至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少20个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:168-332和334中任一项所示的核苷酸序列。
  4. 权利要求1-3中任一项的siRNA，其中所述正义链包含与SEQ ID NO:1-165和167中所示的核苷酸序列任一项的至少16个连续核苷酸的核苷酸序列，至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，或至少18个连续核苷酸的核苷酸序列，优选所述反义链包含SEQ ID NO:1-165和167中任一项所示的核苷酸序列。
  5. 权利要求1-4中任一项的siRNA，其中所述siRNA包含如表3所示的配对的正义链序列和反义链序列。
  6. 权利要求5的siRNA，其中：
    (a)所述反义链包含SEQ ID NO:219所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列；
    (b)所述反义链包含SEQ ID NO:182所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
    (c)所述反义链包含SEQ ID NO:197所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；
    (d)所述反义链包含SEQ ID NO:211所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:44所示的核苷酸序列；
    (e)所述反义链包含SEQ ID NO:204所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列；
    (f)所述反义链包含SEQ ID NO:212所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列；
    (g)所述反义链包含SEQ ID NO:218所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列；
    (h)所述反义链包含SEQ ID NO:214所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列；
    (i)所述反义链包含SEQ ID NO:205所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列；或
    (j)所述反义链包含SEQ ID NO:334所示的核苷酸序列，且所述正义链包含SEQ ID NO:167所示的核苷酸序列。
  7. 权利要求1-6中任一项的siRNA，其中所述正义链的基本上所有的核苷酸和所述反义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，或者所述正义链的所有的核苷酸和所述反义链的所有的核苷酸是修饰的核苷酸。
  8. 权利要求7的siRNA，其中所述正义链和所述反义链各自独立地包含选自下组的一种或多种核苷酸修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、肌苷核糖核苷酸、脱碱基核苷酸、反向无碱基脱氧核糖核苷酸、硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰、乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸、锁核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸、和脱氧核糖核苷酸。
  9. 权利要求8的siRNA，其中所述正义链和所述反义链各自独立地包含选自下组的一种或多种核苷酸修饰：2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰。
  10. 权利要求7所述的siRNA，其中所述反义链包含说明书表5中任一项所示的经修饰的核苷酸序列，和/或所述正义链包含说明书表4中任一项所示的经修饰的核苷酸序列。
  11. 权利要求7所述的siRNA，其中所述siRNA包含说明书表6中任一项所示的配对的经修饰的正义链序列和经修饰的反义链序列。
  12. 权利要求7所述的siRNA，其中所述正义链和/或所述反义链的3’末端和/或5’末端包含1-5个硫代磷酸酯基团，且其中：
    (a)所述正义链包含CmAmUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmCmAmAmAm(SEQ ID NO:711)，并且所述反义链包含UmUfUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmCfCm(SEQ ID NO:712)；
    (b)所述正义链包含UmCmUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmUm(SEQ ID NO:713)，并且所述反义链包含AmAfCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmCfGm(SEQ ID NO:714)；
    (c)所述正义链包含UmGmGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmUm(SEQ ID NO:715)，并且所述反义链包含AmAfAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmAfUm(SEQ ID NO:716)；
    (d)所述正义链包含UmUmCmAmAmGmAfAfUfAmUmGmCmUmGmUmUmUmUm(SEQ ID NO:717)，并且所述反义链包含AmAfAmAfCmAfGmCfAmUfAmUfUmCfUmUfGmAfAmCfUm(SEQ ID NO:718)；
    (e)所述正义链包含GmAmGmAmUmGmAfAfGfUmUmCmAmAmGmAmAmUmAm(SEQ ID NO:719)，并且所述反义链包含UmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCmAfAm(SEQ ID NO:720)；
    (f)所述正义链包含UmCmAmAmGmAmAfUfAfUmGmCmUmGmUmUmUmCmUm(SEQ ID NO:721)，并且所述反义链包含AmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCm(SEQ ID NO:722)；
    (g)所述正义链包含GmCmAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmAm(SEQ ID NO:723)，并且所述反义链包含UmUfGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmCfAm(SEQ ID NO:724)；
    (h)所述正义链包含GmAmAmUmAmUmGfCfUfGmUmUmUmCmCmUmAmUmAm(SEQ ID NO:725)，并且所述反义链包含UmAfUmAfGmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUm(SEQ ID NO:726)；
    (i)所述正义链包含GmAmUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmAm(SEQ ID NO:727)，并且所述反义链包含UmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCm(SEQ ID NO:728)；或
    (j)所述正义链包含AmGmAmGmUmAmUfUfAfUmGmGmAmAmCmGmAmGmUm(SEQ ID NO:729)，并且所述反义链包含AmCfUmCfGmUfUmCfCmAfUmAfAmUfAmCfUmCfUmGfAm(SEQ ID NO:730)。
  13. 权利要求6所述的siRNA，其中：
    (a)所述正义链包含CmsAmsUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmCmAmAmsAm(SEQ ID NO:731)，并且所述反义链包含UmsUfsUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmsCfsCm(SEQ ID NO:682)；
    (b)所述正义链包含UmsCmsUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmsUm(SEQ ID NO:732)，并且所述反义链包含AmsAfsCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmsCfsGm(SEQ ID NO:683)；
    (c)所述正义链包含UmsGmsGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmsUm(SEQ ID NO:733)，并且所述反义链包含AmsAfsAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmsAfsUm(SEQ ID NO:684)；
    (d)所述正义链包含UmsUmsCmAmAmGmAfAfUfAmUmGmCmUmGmUmUmUmsUm(SEQ ID NO:734)，并且所述反义链包含 AmsAfsAmAfCmAfGmCfAmUfAmUfUmCfUmUfGmAfAmsCfsUm(SEQ ID NO:685)；
    (e)所述正义链包含GmsAmsGmAmUmGmAfAfGfUmUmCmAmAmGmAmAmUmsAm(SEQ ID NO:735)，并且所述反义链包含UmsAfsUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCmsAfsAm(SEQ ID NO:686)；
    (f)所述正义链包含UmsCmsAmAmGmAmAfUfAfUmGmCmUmGmUmUmUmCmsUm(SEQ ID NO:736)，并且所述反义链包含AmsGfsAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmsAfsCm(SEQ ID NO:687)；
    (g)所述正义链包含GmsCmsAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmsAm(SEQ ID NO:737)，并且所述反义链包含UmsUfsGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmsCfsAm(SEQ ID NO:688)；
    (h)所述正义链包含GmsAmsAmUmAmUmGfCfUfGmUmUmUmCmCmUmAmUmsAm(SEQ ID NO:738)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfGmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmsUfsUm(SEQ ID NO:689)；
    (i)所述正义链包含GmsAmsUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmsAm(SEQ ID NO:739)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmsUfsCm(SEQ ID NO:690)；或
    (j)所述正义链包含AmsGmsAmGmUmAmUfUfAfUmGmGmAmAmCmGmAmsGmsUm(SEQ ID NO:740)，并且所述反义链包含AmsCfsUmCfGmUfUmCfCmAfUmAfAmUfAmCfUmCfUmsGfsAm(SEQ ID NO:691)。
  14. 权利要求1-13中任一项的siRNA，其中所述siRNA进一步与包含N-乙酰半乳糖胺的配体缀合，优选所述siRNA的正义链的3’端与所述配体缀合。
  15. 权利要求14的siRNA，其中所述配体靶向去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
  16. 权利要求14或15的siRNA，其中所述配体具有选自以下结构中的任一个的结构：
    其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA的正义链连接的位置。
  17. 权利要求1-16中任一项的siRNA，其中
    (a)所述正义链包含CmsAmsUmGmAmGmAfGfUfUmUmUmAmUmUmCmAmAmsAms-GL6(SEQ ID NO:503)，并且所述反义链包含 UmsUfsUmGfAmAfUmAfAmAfAmCfUmCfUmCfAmUfGmsCfsCm(SEQ ID NO:682)；
    (b)所述正义链包含UmsCmsUmGmCmAmGfAfAfCmAmAmGmAmUmCmGmUmsUms-GL6(SEQ ID NO:504)，并且所述反义链包含AmsAfsCmGfAmUfCmUfUmGfUmUfCmUfGmCfAmGfAmsCfsGm(SEQ ID NO:683)；
    (c)所述正义链包含UmsGmsGmCmAmUmUfGfAfGmAmUmGmAmAmGmUmUmsUms-GL6(SEQ ID NO:505)，并且所述反义链包含AmsAfsAmCfUmUfCmAfUmCfUmCfAmAfUmGfCmCfAmsAfsUm(SEQ ID NO:684)；
    (d)所述正义链包含UmsUmsCmAmAmGmAfAfUfAmUmGmCmUmGmUmUmUmsUms-GL6(SEQ ID NO:506)，并且所述反义链包含AmsAfsAmAfCmAfGmCfAmUfAmUfUmCfUmUfGmAfAmsCfsUm(SEQ ID NO:685)；
    (e)所述正义链包含GmsAmsGmAmUmGmAfAfGfUmUmCmAmAmGmAmAmUmsAms-GL6(SEQ ID NO:507)，并且所述反义链包含UmsAfsUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmUfCmsAfsAm(SEQ ID NO:686)；
    (f)所述正义链包含UmsCmsAmAmGmAmAfUfAfUmGmCmUmGmUmUmUmCmsUms-GL6(SEQ ID NO:508)，并且所述反义链包含AmsGfsAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmUfUmGfAmsAfsCm(SEQ ID NO:687)；
    (g)所述正义链包含GmsCmsAmUmGmAmGfAfGfUmUmUmUmAmUmUmCmAmsAms-GL6(SEQ ID NO:509)，并且所述反义链包含UmsUfsGmAfAmUfAmAfAmAfCmUfCmUfCmAfUmGfCmsCfsAm(SEQ ID NO:688)；
    (h)所述正义链包含GmsAmsAmUmAmUmGfCfUfGmUmUmUmCmCmUmAmUmsAms-GL6(SEQ ID NO:510)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfGmGfAmAfAmCfAmGfCmAfUmAfUmUfCmsUfsUm(SEQ ID NO:689)；
    (i)所述正义链包含GmsAmsUmGmAmAmGfUfUfCmAmAmGmAmAmUmAmUmsAms-GL6(SEQ ID NO:511)，并且所述反义链包含UmsAfsUmAfUmUfCmUfUmGfAmAfCmUfUmCfAmUfCmsUfsCm(SEQ ID NO:690)；或
    (j)所述正义链包含AmsGmsAmGmUmAmUfUfAfUmGmGmAmAmCmGmAmsGmsUm-GL6(SEQ ID NO:512)，并且所述反义链包含 AmsCfsUmCfGmUfUmCfCmAfUmAfAmUfAmCfUmCfUmsGfsAm(SEQ ID NO:691)，
    其中GL6为
    其中表示通过磷酸酯基团或硫代磷酸酯基团与siRNA连接的位置。
  18. 细胞，其含有如权利要求1-17中任一项所述的siRNA。
  19. 药物组合物，其包含如权利要求1-17中任一项所述的siRNA或如权利要求18所述的细胞，以及任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。
  20. 试剂盒，其包含如权利要求1-17中任一项所述的siRNA或如权利要求18所述的细胞。
  21. 治疗受试者中获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-17中任一项所述的siRNA、如权利要求18所述的细胞、或如权利要求19所述的药物组合物的步骤。
  22. 预防患有获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症的患者中的至少一种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-17中任一项的siRNA、如权利要求18所述的细胞、或如权利要求19的药物组合物的步骤。
  23. 权利要求21或22所述的方法，其中所述获益于黄嘌呤脱氢酶(XDH)表达减少的疾病或病症是XDH相关疾病。
  24. 权利要求23所述的方法，其中所述XDH相关疾病选自由以下组成的组：高尿酸血症、痛风以及由高血尿酸导致的高血压、糖尿病、冠心病和肾脏疾病。
  25. 一种减少受试者中黄嘌呤脱氢酶(XDH)或尿酸水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-17中任一项的siRNA、如权利要求18所述的细胞、或如权利要求19的药物组合物的步骤。
  26. 如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述siRNA、细胞或药物组合物 通过皮下施用、局部施用或静脉内施用。
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