WO2024139107A1 - 毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用 - Google Patents

毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2024139107A1
WO2024139107A1 PCT/CN2023/102886 CN2023102886W WO2024139107A1 WO 2024139107 A1 WO2024139107 A1 WO 2024139107A1 CN 2023102886 W CN2023102886 W CN 2023102886W WO 2024139107 A1 WO2024139107 A1 WO 2024139107A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tumor
lachnospiraceae
cancer
cfu
microbial strain
Prior art date
Application number
PCT/CN2023/102886
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
赵国振
肖晨
黄少莉
邝茜雯
刘真真
孔萍
泰利宏
张陈陈
梁雅俊
朱瑞娟
贤一博
张东亚
蒋先芝
Original Assignee
慕恩（广州）生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 慕恩（广州）生物科技有限公司 filed Critical 慕恩（广州）生物科技有限公司
Publication of WO2024139107A1 publication Critical patent/WO2024139107A1/zh

Links

Definitions

  • Clostridium is associated with low tumor burden, proving that a mixture of commensal Clostridium strains can produce a powerful anti-tumor effect through CD8 + T cells, and by using a variety of solid tumor models, proving the feasibility of specific intestinal bacteria as a monotherapy for cancer treatment.
  • the Clostridium mixture CC4 can exert anti-cancer effects by activating CD8 + T cells while downregulating immunosuppressive factors.
  • CC4's ability to increase CD8+ T cell infiltration puts the tumor in a highly immunogenic state, which is beneficial to improve the response rate of CRC patients to aPD-1 treatment.
  • Short-chain fatty acids (SCFAs) valerate and butyrate enhance the antitumor activity of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and chimeric antigen receptor (CAR) T cells through metabolic and epigenetic reprogramming.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • CAR chimeric antigen receptor
  • This SCFA is a rare bacterial metabolite produced by low-abundance commensals such as Megasphaera massiliensis, which can be classified as a valerate-producing bacterial species.
  • dominant commensal bacteria are unable to produce valerate.
  • Studies have shown that in vitro treatment of CTL and CAR T cells with valerate and butyrate increases the function of mTOR as a central cellular metabolic sensor and inhibits class I histone deacetylase activity.
  • the present invention provides the use of a Lachnospiraceae microbial strain in the preparation of a drug for preventing and/or treating tumors, wherein the Lachnospiraceae microbial strain belongs to a new genus and new species (Lachnospiraceae sp.) of the Lachnospiraceae family, and the nucleotide sequence of 16S rDNA of the Lachnospiraceae microbial strain is shown in SEQ ID No. 1; the tumor includes at least one of liver cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, kidney cancer and fibrosarcoma.
  • the tumor includes at least one of liver cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, kidney cancer and fibrosarcoma.
  • the strain of the present invention has anti-tumor activity and can significantly inhibit the growth rate of tumors.
  • the present invention provides a microbial agent, comprising the aforementioned Lachnospiraceae microbial strain of the present invention or a metabolite of the Lachnospiraceae microbial strain.
  • the present invention provides a drug for preventing and/or treating tumors, comprising the aforementioned Lachnospiraceae microbial strain or a metabolite of the Lachnospiraceae microbial strain.
  • the drug further comprises a pharmaceutically acceptable carrier; preferably, the carrier is selected from one or more of a diluent, a dispersant, an excipient, a stabilizer, a lubricant, and a disintegrant; the excipient includes mannitol, lactose, starch, microcrystalline cellulose, etc.
  • the disintegrant includes polyvinyl pyrrolidone, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc.
  • the lubricant includes talc, magnesium stearate, etc.
  • the chemotherapy drug includes one or more of paclitaxel, camptothecin, 5-fluorouracil, cisplatin, doxorubicin, mitomycin, or epirubicin;
  • the immunotherapy drug includes PD-1 antibody, CTLA-4 antibody, PD-L1 antibody, PD-L1 inhibitor;
  • the present invention provides a drug for preventing or treating tumors, the drug comprising a microorganism of the Lachnospiraceae family and a pharmaceutically acceptable excipient or adjuvant or liquid preparation; the 16s rRNA sequence of the microorganism of the Lachnospiraceae family is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the applicant has obtained through experiments that the above-mentioned drug has preventive and therapeutic effects on lung tumors, liver tumors, pancreatic cancer tumors (cell lines are KPC and Panc02), gliomas (cell lines are GL261), and fibrosarcoma (cell line is WEHI164).
  • pancreatic cancer cell line PanO2 was inoculated into the subcutaneous tissue of mice to grow into tumors, intervention with Lachnospiraceae microorganisms had a significant effect in inhibiting the growth of pancreatic tumors.
  • glioma cell line GL261 After the glioma cell line GL261 was inoculated into the subsplenic area of mice and a tumor was grown, intervention with Lachnospiraceae microorganisms had a significant inhibitory effect on the growth of glioma.
  • fibrosarcoma cell line WEHI164 was inoculated into the subcutaneous tissue of mice to grow tumors, intervention with microorganisms of the Lachnospiraceae family had a significant effect in inhibiting the growth of fibrosarcoma.
  • the drug for preventing or treating tumors can also be a composition, which includes a microorganism of the Lachnospiraceae family and a combined drug; or includes a microorganism of the Lachnospiraceae family and an immunosuppressant; the composition obtained by combining the above-mentioned microorganism of the Lachnospiraceae family with a combined drug/immunosuppressant also has preventive and therapeutic effects on lung tumors, liver tumors, pancreatic cancer tumors (cell line is PanO2), glioma (cell line is GL261), and fibrosarcoma (cell line is WEHI164).
  • PanO2 pancreatic cancer tumors
  • glioma cell line is GL261
  • WEHI164 fibrosarcoma
  • the combined drug includes at least one of a radiotherapy drug, a targeted drug, a chemotherapy drug, a photosensitizer, a photothermal agent, an immunotherapy drug, and an enhanced cell therapy drug, wherein:
  • the chemotherapy drug includes at least one of paclitaxel, camptothecin, 5-fluorouracil, cisplatin, doxorubicin, mitomycin or epirubicin;
  • the photosensitizer includes at least one of boron dipyrrole, dihydrochlorin or Bengal red;
  • the photothermal agent includes at least one of indocyanine green, new indocyanine green or gold nanoparticle rods;
  • the immunosuppressant comprises at least one of PD-1 antibody, CTLA-4 antibody, PD-L1 antibody or PD-L1 inhibitor; the PD-L1 inhibitor is selected from durvalumab, atezolizumab or avelumab; the PD-1 antibody or PD-L1 antibody is selected from pembrolizumab or nivolumab; the CTLA-4 antibody is selected from ipilimumab.
  • MNH46686 and PD-1 antibody significantly reduced tumor volume and weight, and significantly improved the response rate of tumor treatment in mice subcutaneously inoculated with PanO2 and KPC pancreatic cancer tumor cell lines to form an ectopic homologous tumor model;
  • MNH46686 and PD-1 antibody significantly reduced tumor volume and weight and significantly improved the response rate of tumor treatment in mice subcutaneously inoculated with GL261 glioma cell line to form an ectopic homologous tumor model;
  • MNH46686 and PD-1 antibody significantly reduced tumor volume and weight and significantly improved the response rate of tumor treatment in mice subcutaneously inoculated with WEHI164 fibrosarcoma cell line to form an ectopic homologous tumor model.
  • MNH46686 combined with PD-1 antibody significantly reduced tumor volume and weight and significantly improved the response rate of tumor treatment in mice subcutaneously inoculated with liver cancer cell lines (H22, Hepal-1) to form an ectopic homologous tumor model;
  • MNH46686 combined with PD-1 antibody significantly reduced tumor volume and weight and significantly improved the response rate of tumor treatment in mice subcutaneously inoculated with lung cancer cell line (LLC1) to form an ectopic syngeneic tumor model;
  • the present invention also provides a method for preventing and/or treating tumors, the method comprising using an effective amount of the Lachnospiraceae microbial strain or metabolite of the present invention to treat patients in need; or using a bacterial agent or drug containing the strain or metabolite of the present invention as an effective ingredient to treat patients in need.
  • the strain is Lachnospiraceae microbial strain MNH 46686, which is preserved in Guangdong Microbial Culture Collection Center, with the preservation name of Lachnospiraceae sp. MNH 46686 and the strain preservation number of GDMCC No: 62002.
  • Embodiment 1 Use of a Lachnospiraceae microbial strain in the preparation of a drug for preventing and/or treating tumors, characterized in that the Lachnospiraceae microbial strain belongs to a new genus and species (Lachnospiraceae sp.) of the Lachnospiraceae family, and the nucleotide sequence of 16S rDNA of the Lachnospiraceae microbial strain is as shown in SEQ ID No. 1; the tumor includes at least one of liver cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, kidney cancer and fibrosarcoma.
  • the tumor includes at least one of liver cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, bile duct cancer, kidney cancer and fibrosarcoma.
  • increase or “elevate” or “enhance” refers to a change such that the difference is at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2-fold, 4-fold, 10 ...
  • subject refers to any mammal.
  • a subject or patient described as “in need” refers to a person who needs to treat (or prevent) a disease.
  • Mammals i.e., mammals
  • mammals include humans, laboratory animals (e.g., primates, rats, mice), livestock (e.g., cattle, sheep, goats, pigs), and household pets (e.g., dogs, cats, rodents).
  • the object can be a human.
  • the subject can be a non-human mammal, including but not limited to dogs, cats, cattle, horses, pigs, donkeys, goats, camels, mice, rats, guinea pigs, sheep, camels, monkeys, gorillas, or chimpanzees.
  • the subject or patient may be healthy, or may suffer from a metabolic disease at any stage of development.
  • Suitable lubricants include sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate or sodium chloride, etc.
  • Preservatives, stabilizers, dyes and even flavoring agents may be provided in the composition.
  • preservatives include sodium benzoate, sorbic acid or parabens.
  • Antioxidants and suspending agents may also be used. Antioxidants and suspending agents may also be used.
  • the Lachnospiraceae microbial strain of the present invention has a complete butyrate production pathway and can synthesize a large amount of acetic acid, isobutyric acid, butyric acid and isovaleric acid during the growth process;
  • FIG4 is a Gram-stained microscopic photograph of strain MNH 46686 of the present invention.
  • FIG6 shows the tolerance results of strain MNH 46686 of the present invention to different pH values
  • Figure 14 is a comparison of tumor tissue sizes after dissection in an animal experiment for preventing liver cancer
  • Figures 15(A) to 15(D) are the verification of the therapeutic effect of MNH 46686 on lung cancer
  • Figure 26 is a graph of mouse tumor volume. The data in the graph are displayed as mean ⁇ standard deviation (Mean ⁇ SD). The statistical analysis was performed using a two-factor Two-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons was used for analysis. Significant differences are indicated by *, *p ⁇ 0.05;
  • Figure 29 is a comparison of tumor growth inhibition rates in mice at the experimental endpoint.
  • the data in the figure are displayed using mean ⁇ standard deviation (Mean ⁇ SD).
  • Statistical analysis was performed using the One-Way ANOVA method combined with Dunnett’s multiple comparisons test analysis method. Significant differences are indicated by *, *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01;
  • the donor takes 2 to 5 g of fresh feces and puts it into a sample collection and preservation tube. After shaking and homogenization, the processed feces sample is placed in an ice box and sent to the laboratory for strain isolation within 24 hours.
  • the purified strain is placed at 37°C for anaerobically culture.
  • the pure culture strain was prepared into 20% glycerol/water-bacteria solution and stored at -86°C.
  • strain MNH 46686 The Gram-stained microscopic morphology of strain MNH 46686 is shown in Figure 4, and the spore-stained microscopic morphology of strain MNH 46686 is shown in Figure 5 ( Figures 4 and 5 have been grayscaled, and the original staining pictures show red).
  • the strain can produce spores and is Gram-negative.
  • test was performed using API 20A reagent strips (BioMérieux) according to the instructions. Culture conditions: 37°C, anaerobic. Experimental The results are shown in Table 1 and Figure 9.
  • strain MNH 46686 The antibiotic sensitivity of strain MNH 46686 was tested using the disk diffusion method.
  • MNH 46686 The results of antibiotic sensitivity test of MNH 46686 are shown in Table 2.
  • Strain MNH 46686 was resistant to erythromycin, ciprofloxacin, co-trimoxazole, ampicillin, ceftriaxone and lincomycin, and was sensitive to antibiotics such as gentamicin, chloramphenicol, tetracycline and penicillin.
  • a multiple sequence alignment was performed between MNH 46686 and the model strains with high 16S rRNA gene sequence similarity in the NCBI database, and then a phylogenetic tree was constructed using the software MEGA 5 (the phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood method).
  • the phylogenetic tree nodes in the figure only show values with Bootstrap values greater than 50%, and the superscript "T" indicates the model strain.
  • the raw sequencing data of the genome were filtered using fastp (version: 0.20.0) with filtering parameters: "--poly_g_min_len 10--poly_x_min_len 10-q 15-u 40-n 5-l 50".
  • the filtered raw data were assembled using SPAdes (version: v3.14.0) with assembly parameters "--isolate--cov-cutoff 10".
  • the total gene length of the genome assembly was 3.34Mbp, the N50 length was 174.9kbp, and the GC content was 51.93%.
  • antibiotic resistance genes in the genome were analyzed using the RGI pipeline (version: 4.2.2), where the antibiotic resistance gene database was CARD (version: 3.0.0, https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi). Detailed comparison information is shown in Table 3.
  • the butyrate production capacity of this strain was evaluated.
  • the genes related to the butyrate production pathway in the article (Vital M, Howe C, Tiedje M. Revealing the Bacterial Butyrate Synthesis Pathways by Analyzing (Meta) genomic Data [J]. Mbio, 2014, 5 (2): 1-11) were used as a reference database.
  • the genome sequence of this strain was compared with the reference database using NCBI blastp (version: 2.7.1+). The detailed comparison results are shown in Table 7.
  • the integrity of the butyrate production pathway was then calculated, and it was found that the integrity of the butyrate production pathway of this strain was 100%.
  • the strain MNH 46686 was inoculated into TSB liquid culture medium and cultured anaerobically at 37°C for 48 hours. The bacteria were collected by centrifugation and stored at -86°C until use.
  • Acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid, isovaleric acid and hexanoic acid standards were weighed and prepared with ethyl acetate into eight mixed standard concentration gradients of 0.1 ⁇ g/mL, 0.5 ⁇ g/mL, 1 ⁇ g/mL, 5 ⁇ g/mL, 10 ⁇ g/mL, 20 ⁇ g/mL, 50 ⁇ g/mL and 100 ⁇ g/mL.
  • the sample was thawed on ice, 80 mg of the sample was taken into a 2 mL glass centrifuge tube, and 900 ⁇ L of 0.5% phosphoric acid was added to resuspend, and the mixture was shaken for 2 min, and centrifuged at 14000 g for 10 min. 800 ⁇ L of the supernatant was taken, and an equal amount of ethyl acetate was added for extraction, and the mixture was shaken for 2 min, and centrifuged at 14000 g for 10 min. 600 ⁇ L of the upper organic phase was taken, and 4-methylpentanoic acid with a final concentration of 500 ⁇ M was added as an internal standard. The mixture was mixed and added to the injection bottle for GC-MS detection. The injection volume was 1 ⁇ L, the split ratio was 10:1, and split injection was performed.
  • MSD ChemStation software was used to extract the chromatographic peak area and retention time.
  • the calibration curve was drawn to calculate the content of short-chain fatty acids in the sample.
  • strain MNH 46686 can synthesize a large amount of acetic acid, isobutyric acid, butyric acid and isovaleric acid during its growth.
  • the experimental method refers to Experimental Example 1 in the prior art CN112618576B.
  • MOI viable bacteria: cell number
  • an M1 macrophage control group was set up (M0 macrophages were induced with 20ng/ml IFN ⁇ +10pg/ml LPS for 24hr).
  • mixed antibiotics Amicillin, Streptomycin, Colistin
  • the experimental method refers to Experimental Example 2 in the prior art CN112618576B.
  • strain MNH46686 was inoculated into MM01 liquid culture medium, cultured anaerobically at 37°C for 48 hours, and the bacteria were removed by centrifugation. The culture supernatant was filtered with a 0.22 ⁇ m filter, aliquoted, and the collected material was stored at -86°C for later use.
  • THP-1-IFN ⁇ -promoter reporter cells were inoculated in 96-well plates, with 1 ⁇ 10 5 cells per well. Cells were treated according to the set groups. After 24 hours of continuous culture, the cells were centrifuged at 300g for 5 minutes, the culture supernatant was removed, 50 ⁇ L 1 ⁇ luciferase detection reagent was added, the reaction was carried out for 1 minute, and the luminescence chemiluminescence value was detected by an enzyme reader. The relative fluorescence value (Relative Luminescence) was normalized to the untreated group, and the effect of MNH46686 on IFN ⁇ transcriptional activity was evaluated by comparing the relative fluorescence readings with the High group.
  • MNH46686 “Microbiota triggers STING-type I IFN-dependent monocyte reprogramming of the tumor microenvironment” Cell 184, 5338–5356) had a good response to positive drugs (Figure 13A). The samples were further evaluated using this system and it was found that MNH46686 could significantly promote IFN ⁇ transcriptional activity ( Figure 13B). These results indicate that MNH46686 has potential roles in immunoregulation, antiviral and anti-tumor.
  • strain MNH 46686 can be used for tumor prevention and treatment
  • a mouse homologous tumor model was used to inhibit liver cancer growth. This study has been approved by the Muen Biotechnology Laboratory Animal Care and Use Committee.
  • mice were C57BL/6J mice, 5 weeks old, a total of 20 mice, purchased from Guangdong Yaokang Biotechnology Co., Ltd.
  • mice were raised normally and randomly divided into two groups (control group and experimental group) according to their body weight after the quarantine period. Each group had 10 mice and they were raised in separate cages.
  • the mouse liver cancer model was established by intradermal injection of H22 mouse liver cancer cells. The cell inoculation volume was 2 ⁇ 10 6 /mL, 0.1mL/mouse.
  • Figure 14 is a comparison of tumor tissue sizes after dissection of experimental mice, with the left picture being the experimental group and the right picture being the control group.
  • mice were C57BL/6J mice, 5 weeks old, a total of 120 mice, purchased from Guangdong Yaokang Biotechnology Co., Ltd.
  • This example explores the immunoanalysis of mice activated by MNH46686.
  • T-Live-Tumor/NK-Live-Tumor and T-Tumor/NK-Tumor were added to stain T cells/NK cells on the surface of tumor cells.
  • the stained cells were resuspended in PBS and tested on the machine.
  • mice spleen single cell suspension prepared above was taken, and red blood cell lysis solution, PBS, etc. were added in sequence for cell treatment.
  • the treated cell suspension was filtered through a 300-mesh filter and then tested on a machine.
  • T-Alexa Fluor647 anti-mouse FOXP3-SP/NK-Alexa Fluor647anti-mouse FOXP3-SP, T-Live-SP/NK-Live-SP, and T-SP/NK-SP to stain T cells/NK cells on the surface of spleen cells. Resuspend the stained cells with PBS and detect them on the machine.
  • a single cell suspension of mouse spleen was obtained, and dyes Treg-Fcblock-SP, Treg-Live-SP, and Treg-Surface-SP were added in sequence for staining.
  • the stained cells were resuspended in PBS. Subsequently, fixative, membrane permeabilization solution, and Treg-SP nuclear staining were used in sequence according to the instructions of the detection kit. The stained cells were resuspended in PBS and tested on the machine.
  • M2 macrophages The proportion of M2 macrophages, immunosuppressive Treg cells, killer cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, and CD4+TNF ⁇ + cells in tumor tissues (see A to F in Figure 16).
  • the proportion of killer cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, and CD4+TNF ⁇ + cells in mouse tumor tissues showed an upward trend, while M2 macrophages and immunosuppressive Treg cells showed a downward trend; analysis of the correlation between the above cells in tumor tissues and the tumor endpoint volume (see A to F in Figure 17) showed that the tumor endpoint volume was significantly positively correlated with the proportion of immunosuppressive Treg cells and M2 macrophages in tumor tissues, and was significantly positively correlated with the tumor killer cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, and CD4+TNF ⁇ + cells in tumor tissues.
  • tumor weight is significantly positively correlated with the proportion of immunosuppressive Treg cells in tumor tissues, and significantly negatively correlated with the proportion of tumor killer cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells in tumor tissues; thus, MNH46686 can inhibit the proportion of M2 macrophages and immunosuppressive Treg cells in mouse tumors, increase the proportion of tumor killer cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells to activate mouse tumor local immunity and exert anti-tumor effects.
  • the strain MNH46686 can exert anti-tumor activity by stimulating the activation of the mouse immune system.
  • Test strains After the MNH46686 strain glycerol cryopreservation tube was thawed at 37°C, it was inoculated on an anaerobic blood plate in an anaerobic workstation for activation. The activated strain was inoculated into MM01 liquid culture medium and cultured anaerobically to obtain a sufficient number of viable bacteria. The cultured bacterial solution was concentrated by centrifugation and resuspended with a solvent to obtain a purity and viable bacterial count (9.23 ⁇ 10 8 CFU/mL) that met the requirements of animal experiments. of the test substance.
  • Tumor cells LLC1 mouse lung cancer cells, catalog number CL-0140.
  • mice were C57BL/6J mice, aged 5-6 weeks, a total of 108 mice, purchased from Guangdong Yaokang Biotechnology Co., Ltd.
  • Animal experiment The animals were fed normally. After the quarantine period, LLC1 lung cancer cells were subcutaneously inoculated to form an ectopic homologous tumor model. The cell inoculation volume was 2 ⁇ 10 6 /mL, 0.1mL/animal. When the average tumor volume reached 60-100mm 3 , the animals were randomly divided into 8 groups according to the tumor volume, including group A (Negative Control), group B (Positive Control, PD-1), group E (MNH46686 & PD-1), and groups C, D, and FH were other test substances. The drugs were administered on the day of grouping.
  • Group A was given vehicle and saline
  • group B was given vehicle and PD-1 antibody
  • group E was given MNH46686 and PD-1 antibody
  • vehicle and MNH46686 were administered by intragastric gavage, with a gavage volume of 0.2mL/animal/time, and the frequency of administration was 1 day/time, for a total of 20 times
  • PD-1 antibody and saline were administered by intraperitoneal injection, with a dose of 10mg/kg, and the frequency of administration was once every 3 days, for a total of 6 times.
  • tumor diameter was measured once a day; after grouping, the tumor diameter was measured once every 3 days; and the tumor growth was recorded.
  • the experimental endpoint was the 23rd day of administration.
  • General clinical observation, body weight monitoring, and tumor volume (mm 3 ) were performed during the experiment. After reaching the experimental endpoint, all surviving mice were dissected and sampled, and the tumor weight and tumor volume were measured. Finally, statistical analysis and comparison were performed on the changes in tumor volume curve (Tumor volume), endpoint tumor volume (Tumor volume at endpoint), endpoint tumor weight (Tumor weight at endpoint) and endpoint tumor growth inhibition rate (Tumor Growth Inhibition at endpoint, TGI).
  • the statistical analysis results of the tumor volume curve of Group E were significantly smaller than those of Group A (Negative Control) and Group B (Positive Control) (as shown in Figure 19).
  • the average tumor volume of mice in the negative control group was 1279.80 mm 3 , and the average weight of tumor tissue was about 1.28 g;
  • the average tumor volume of mice in the positive control group (Positive Control) was 710.29 mm 3 , and the average weight of tumor tissue was about 0.92 g;
  • the average tumor volume of mice in the MNH46686&PD-1 antibody treatment group was 346.99 mm 3 , and the average weight of tumor tissue was about 0.47 g.
  • HDAC Inhibitor Drug Screening Kit (Fluorometric) purchased from Abcam to detect the inhibitory effect of HDAC activity in vitro.
  • strain MNH46686 was inoculated into liquid culture medium, cultured anaerobically at 37°C for 48 hours, and the bacteria were removed by centrifugation. The culture supernatant was filtered with a 0.22 ⁇ m filter, aliquoted, and the collected material was frozen and stored at -80°C for later use.
  • Preparation of HDACs detection reaction reagents Prepare an appropriate amount of detection reaction system according to the kit instructions. Each reaction requires 50 ⁇ L of reaction reagent.
  • HDAC The function of HDAC in cancer is related to the abnormal expression or function of genes that promote cell proliferation and tumorigenic phenotype.
  • HDAC mainly regulates the onset of cancer and is described as an oncogene.
  • the activity reduction or inhibition of HDAC expression has been shown to have a variety of anti-cancer effects, such as cell cycle arrest and inhibition of proliferation, apoptosis, differentiation and aging, and destruction of angiogenesis. Therefore, the strain MNH46686 of the present invention has the ability to inhibit HDAC activity, suggesting that the medicine or composition of the present invention can be used to prevent or treat tumors or cancers mediated by HDAC activity. Since the genes regulated by HDAC play an important role in angiogenesis, the medicine or composition of the present invention can be used for the prevention and metastasis of tumors.
  • Diabetes is a group of diseases in which low levels of insulin and/or peripheral insulin resistance lead to hyperglycemia.
  • Inhibition of HDAC has been proposed to treat diabetes through a variety of mechanisms, including inhibition of Pdxl (Park et al., 2008, J Clin Invest, 118, 2316-24), enhancing the expression of the transcription factor Ngn3 to increase the endocrine pool.
  • Progenitor cells Haumaitre et al., 2008, Mol Cell Biol, 28, 6373-83
  • enhancing insulin expression Molsey et al., 2003, J Biol Chem, 278, 19660-6), etc.
  • compositions of the present invention have HDAC inhibitory activity, and thus they can be used to treat inflammatory bowel diseases mediated by HDAC activity.
  • Example 15 MNH46686 combined with PD-1 to activate mouse immune analysis
  • the proportions of immune cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, and CD4+TNF ⁇ + cells with tumor-killing effects in tumor tissues were up-regulated in the tumor tissues of mice in the MNH46686+PD-1 group compared with those in the positive control group (PD-1 group).
  • the proportions of cytotoxic cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, and CD4+TNF ⁇ + cells in the tumor tissues of mice in the MNH46686+PD-1 group were analyzed.
  • MNH46686 can activate the local immunity of mouse tumors by increasing the proportion of tumor-killing cells CD4+IFN ⁇ + cells, CD8+IFN ⁇ + cells, CD4+TNF ⁇ + cells, and CD4+TNF ⁇ + cells, thereby enhancing the anti-tumor effect of PD-1 antibodies.
  • the average tumor volumes of groups A to C were 1067.54 mm 3 , 838.01 mm 3 and 561.50 mm 3 , respectively, and the average tumor weights were 1.39 g, 1.18 g and 0.72 g, respectively; at the end of the test, the tumor volumes and tumor weights of groups B to C were compared with those of group A as shown in Figures 27 and 28.
  • the TGIs of groups B to C were 23.00% and 50.30%, respectively; at the end of the test, the TGIs of groups B to C were compared with those of group A as shown in Figure 30.
  • the response rate of group A was 22.22%, the response rate of group B was 33.33%, and the response rate of group C was 66.67% (as shown in Figure 30).

Abstract

提供了一种毛螺菌科微生物菌株、预防和/或治疗肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、感染性疾病、中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种疾病的药物及应用。该毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，可以抑制肿瘤的生长速度，可用于肿瘤的预防和/或治疗。所述肿瘤包括以下至少一种：肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌和纤维肉瘤。

Description

毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用 技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域，尤其是涉及毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用。
背景技术
人体肠道内有大量的共生微生物，其携带的基因信息总量是人自身基因组信息的50～100倍，即“肠道微生物组(gutmicorbiome)”，也被称为人类的“第二基因组”。肠道微生物组是人体最大、最直接的外环境，对维持人体健康发挥着不可或缺的作用。目前，已经有关于肠道微生物组在营养障碍、代谢异常及复杂疾病(比如肥胖、糖尿病、炎性肠病及肿瘤等)方面的研究报道。
近年来，随着分子生物学、基因组学、生物信息分析技术、高通量测序技术及微生物培养技术的高速发展，肠道菌群对肠道和肠道外疾病的影响及作用越来越明确。肠道菌群更像是具备代谢、免疫和内分泌功能的器官，可以影响人体消化系统、循环系统和神经系统，与人类各种慢性疾病(糖尿病、高血压、心血管疾病和脑部疾病等)及肿瘤的发生密切相关。研究肠道菌群与人体健康和疾病的相互关系，不仅是重要的科学研究，更具有临床诊断、治疗、乃至转化的重要意义和价值。
肠道菌群失调会增加结肠直肠癌的发病率，同时一些肠道微生物的代谢产物能够直接减缓致癌作用或者抑制肿瘤发生。除肠道有关的结肠癌和直肠癌之外，肠道菌群同样还能影响到乳腺癌、肝癌等。越来越多的证据表明肠道微生物能够影响肿瘤形成、肿瘤发育以及肿瘤治疗。如何调控肠道菌群引起的免疫和炎症反应，使得既不会诱发肿瘤又可以增强抗肿瘤药物疗效，目前还在继续探讨研究中，如果能够解决这些问题，对将来肿瘤治疗领域创新和变革有重大意义。
Michael Scharl等在《Cell Host Microbe》报道，梭菌与低肿瘤负荷相关，证明共生梭菌菌株的混合物能够通过CD8+T细胞产生强大的抗肿瘤作用，并通过使用多种实体瘤模型，证明特异性肠菌作为单药治疗应用于癌症治疗的可行性。梭菌混合物CC4能通过激活CD8+T细胞同时下调免疫抑制因子发挥抗癌效应，此外，CC4增加CD8+T细胞浸润的能力使得肿瘤处于高免疫原性状态，有利于提高CRC患者对aPD-1治疗的应答率。这些发现开启了肠道菌群补充作为一种独立治疗方式的新篇章。
短链脂肪酸(SCFA)中的戊酸和丁酸能通过代谢和表观遗传重编程增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和嵌合抗原受体(CAR)T细胞的抗肿瘤活性。这种SCFA是一种罕见的细菌代谢物，由低丰度的共生体如Megasphaera massiliensis产生，可将其归类为产生戊酸盐的细菌物种。有趣的是，优势共生细菌不能产生戊酸。研究表明，用戊酸和丁酸对CTL和CAR T细胞进行体外处理可增加mTOR作为中央细胞代谢传感器的功能，并抑制I类组蛋白脱乙酰酶活性。这种重编程导致CD25、IFN-γ和TNF-α等效应分子的产生增加，并显著增强了同源小鼠黑色素瘤和胰腺癌模型中抗原特异性CTL和靶向ROR1的CAR T细胞的抗肿瘤活性。这些实验数据揭示了可用于增强细胞抗肿瘤免疫的微生物分子，同时实验结果支持将戊酸和丁酸确定为两种在细胞癌症免疫治疗中具有治疗效用的SCFA。
因此，进一步发现、挖掘和研究具有肿瘤预防或治疗潜力的微生物菌株具有重要的应用价值和市场前景。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用。本发明发现新属级别的肠道厌氧微生物菌株Lachnospiraceae sp.可以抑制肿瘤的生长速度，可用于肿瘤的预防和/或治疗。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了毛螺菌科微生物菌株在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述肿瘤包括肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌和纤维肉瘤中的至少一种。
在一个实施方案中，毛螺菌科微生物菌株在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用中，所述毛螺菌微生物菌株包括毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株保藏编号为GDMCC No：62002。本发明涵盖毛螺菌科微生物菌株的菌体细胞及其提取物、代谢产物(例如发酵液)在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用以及在制备抑制肿瘤生长速度(抑制肿瘤的尺寸和大小)的药物方面的作用。
在一个实施方案中，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的菌株为具有抗肿瘤活性，能够显著抑制肿瘤的生长速度。
本发明所述毛螺菌科微生物菌株具有以下生物学特征：
(1)菌体特征：菌株能产芽孢，无鞭毛，不运动，杆状，长度约2～5μm×20～50μm；菌株革兰氏阴性；
(2)菌落特征：接种于厌氧血平板培养基，37℃厌氧培养48h后，在厌氧血平板培养基上形成可见菌落；菌落圆形，边缘规则且光滑，直径约0.5mm，淡黄色，不透明，菌落周边无分泌物形成；
(3)生长特性与生理生化特性：温度生长范围30～42℃，最适生长是37℃；在pH 7.0～9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0；在NaCl含量超过2％培养基上不生长；菌株MNH 46686能在胆盐浓度为0％～0.3％范围内存活生长，在胆盐浓度大于等于0.4％时不能生长；
(4)其他特征：对红霉素、环丙沙星、复方新诺明、氨苄西林、头孢曲松和林可霉素具有耐药性；对庆大霉素、氯霉素、四环素和青霉素等抗生素敏感；在生长过程中可以大量合成短链脂肪酸：乙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸。
在另一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含本发明前述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的代谢产物。
在另一个方面，本发明提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药物，包含前述毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的代谢产物。
在一个实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的载体；优选地，所述载体选自稀释剂、分散剂、赋形剂、稳定剂、润滑剂、崩解剂中的一种或几种；所述赋形剂包括甘露醇、乳糖、淀粉、微晶纤维素等。所述崩解剂包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸镁等。
优选地，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂和纳米制剂中的任一种。例如所述药物的剂型为注射剂、片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂等。
在一个实施方案中，所述组合物还包括联用药物；所述联用药物包括化疗药物、光敏剂、光热剂、免疫治疗药物中的至少一种。
在一个实施方案中，所述化疗药物包括紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星、丝裂霉素或表柔比星中的一种或多种；
所述光敏剂包括硼二吡咯、二氢卟吩或孟加拉红的一种或多种；
所述光热剂为吲哚菁绿、新吲哚菁绿或金纳米粒棒的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明的药物可以与其他抗肿瘤药物联用，例如但不限于奥沙利铂、米托蒽醌、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、长春瑞宾或甲氨蝶呤等。
在一个实施方案中，本发明的药物可以与免疫佐剂，例如CpG、IL-2、氢氧化铝等一起使用。
在一个实施方案中，所述免疫治疗药物包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、PD-L1抑制剂；
优选地，所述PD-L1抑制剂选自度伐单抗、阿替珠单抗或阿维单抗；所述PD-1抗体或PD-L1抗体选自帕博利珠单抗或纳武利尤单抗；所述CTLA-4抗体选自伊匹木单抗。
此外，本发明提供的一种预防或治疗肿瘤的药物，所述药物包括毛螺菌科微生物菌和药学上可接受的赋形剂或辅料或液体制剂；所述毛螺菌科微生物菌的16s rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。申请人通过实验得到，上述药物对肺部肿瘤、肝部肿瘤、胰腺癌肿瘤(细胞系为KPC、Panc02)，胶质瘤(细胞系为GL261)，纤维肉瘤(细胞系为WEHI164)均具有预防和治疗的作用。
具体的，将细胞系为PanO2的胰腺癌肿瘤细胞系接种到小鼠皮下长成肿瘤之后，通过毛螺菌科微生物菌干预，具有明显的抑制胰腺肿瘤生长的效果；
将细胞系为GL261的胶质瘤细胞系接种到小鼠脾下长成肿瘤之后，通过毛螺菌科微生物菌干预，具有明显的抑制胶质瘤生长的效果；
将细胞系为WEHI164的纤维肉瘤细胞系接种到小鼠皮下长成肿瘤之后，通过毛螺菌科微生物菌干预，具有明显的抑制纤维肉瘤生长的效果。
同时，需要说明的是，所述预防或治疗肿瘤的药物还可以为组合物，所述组合物包括毛螺菌科微生物菌和联用药物；或包括毛螺菌科微生物菌和免疫抑制剂；上述毛螺菌科微生物菌与联用药物/免疫抑制剂组合得到的组合物对肺部肿瘤、肝部肿瘤、胰腺癌肿瘤(细胞系为PanO2)，胶质瘤(细胞系为GL261)，纤维肉瘤(细胞系为WEHI164)也均具有预防和治疗的作用。
所述联用药物包括放疗药物、靶向药物、化疗药物、光敏剂、光热剂、免疫治疗药物、增强细胞疗法药物中的至少一种，其中：
所述化疗药物包括紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星、丝裂霉素或表柔比星中的至少一种；所述光敏剂包括硼二吡咯、二氢卟吩或孟加拉红中的至少一种；所述光热剂包括吲哚菁绿、新吲哚菁绿或金纳米粒棒中的至少一种；
所述免疫抑制剂包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体或PD-L1抑制剂中的至少一种；所述PD-L1抑制剂选自度伐单抗、阿替珠单抗或阿维单抗；所述PD-1抗体或PD-L1抗体选自帕博利珠单抗或纳武利尤单抗；所述CTLA-4抗体选自伊匹木单抗。
具体的，MNH46686与PD-1抗体联用，对于皮下接种PanO2、KPC的胰腺癌肿瘤细胞系形成异位同源肿瘤模型的小鼠，具有显著降低肿瘤体积和重量，并明显提高治疗肿瘤的应答率的效果；
MNH46686与PD-1抗体联用，对于皮下接种GL261的胶质瘤细胞系形成异位同源肿瘤模型的小鼠，具有显著降低肿瘤体积和重量，并明显提高治疗肿瘤的应答率的效果；
MNH46686与PD-1抗体联用，对于皮下接种WEHI164的纤维肉瘤细胞系形成异位同源肿瘤模型的小鼠，具有显著降低肿瘤体积和重量，并明显提高治疗肿瘤的应答率的效果。
MNH46686与PD-1抗体联用，对于皮下接种肝癌细胞系(H22、Hepal-1)形成异位同源肿瘤模型的小鼠，具有显著降低肿瘤体积和重量，并明显提高治疗肿瘤的应答率的效果；
MNH46686与PD-1抗体联用，对于皮下接种肺癌细胞系(LLC1)形成异位同源肿瘤模型的小鼠，具有显著降低肿瘤体积和重量，并明显提高治疗肿瘤的应答率的效果；
与PD-1联用的流式细胞实验分析表明，本发明的菌株与PD-1抗体联用明显提高治疗肿瘤的应答率，本发明的菌株与PD-1联用能够激活小鼠免疫系统；上调CD45+CD3+、CD45+CD4+、CD45+CD8+等免疫T细胞，上调外周血NK细胞比例等。
如本文所用，“增强”细胞疗法(例如CAR-T)的功效是指本发明的组合物从细胞疗法(例如，在CAR-T的情况下，T细胞介导的免疫反应，特别是针对肿瘤抗原)作为其施用的结果，当与不施用相比时。例如，与用细胞疗法而不是本发明的组合物治疗的对照对象相比，用本发明的组合物和细胞疗法治疗的对象可表现出来自细胞疗法的更大的此类治疗效果。
本发明提供的微生物菌株、微生物菌剂、药物、组合物中毛螺菌科微生物菌和/或毛螺菌科微生物菌的代谢产物和/或毛螺菌科微生物菌的上清液能抑制抑制肿瘤生长，优选地，抑制肿瘤生长包括抑制肿瘤体积增长，抑制肿瘤重量增加、提高小鼠外周血中的NK比例激活小鼠系统性免疫、增强免疫治疗剂、CAR-T治疗剂的功效、提高肿瘤应答率作用中的至少一种。
单位剂量的所述的口服组合物中单位剂量的所述的口服组合物中微生物菌株的含量包括2×107～9×1010CFU/mL或1×106～2×1010CFU/mg的毛螺菌科微生物菌株菌；单位剂量优选为4×107CFU/mL、5×107CFU/mL、6×107CFU/mL、7×107CFU/mL、8×107CFU/mL、1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、8×108CFU/mL、9×108CFU/mL、1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、3×109CFU/mL、4×109CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109CFU/mL、7×109CFU/mL、8×109CFU/mL、9×109CFU/mL、2×1010或1.2×106CFU/mg、4×106CFU/mg、5×107CFU/mg、6×107CFU/mg、7×107CFU/mg、8×107CFU/mg、9×107CFU/mg、1×108CFU/mg、2×108CFU/mg、3×108CFU/mg、4×108CFU/mg、5×108CFU/mg、6×108CFU/mg、7×108CFU/mg、8×108CFU/mg、9×108CFU/mg的至少一种。
本发明提供的微生物菌株、微生物菌剂、药物、组合物中毛螺菌科微生物菌和/或毛螺菌科微生物菌的代谢产物和/或毛螺菌科微生物菌的上清液能加强毒杀性T细胞的抗肿瘤活性、增强受试者的免疫反应、抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的扩散、抑制肿瘤的免疫逃逸、调节受试者肠内一种或多种共生微生物的所述水平、上调促炎性细胞因子、趋化因子、降低肠屏障通透性和/或上调保护性免疫原性细胞因子、调节趋化因子、增加肿瘤中T细胞的浸润作用中的至少一种。
本发明提供一种在制备治疗和/或预防HDAC活性介导的疾病的药物中的应用，其特征在于，毛螺菌科微生物菌和/或毛螺菌科微生物菌的代谢产物和/或毛螺菌科微生物菌的上清液抑制HDAC活 性实现治疗或预防HDAC活性介导的疾病；所述HDAC活性介导的疾病包括肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病，感染性疾病，中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种；
优选地，所述肿瘤包括肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌和纤维肉瘤中的至少一种；
优选地，通过调节短链脂肪酸/短链脂肪酸盐来抑制HDAC活性；所述短链脂肪酸包括乙酸、丁酸、戊酸中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸；优选的，所述短链脂肪酸盐包括乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸盐；优选的，所述组蛋白乙酰酶为I类、II类、III类和/或IV类组蛋白乙酰酶。
本发明提供的微生物菌株或微生物菌株的代谢产物或微生物菌株的上清液通过抑制组蛋白乙酰酶(HDAC)活性来实现预防和/或治疗肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病，感染性疾病，中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种；优选地，通过调节短链脂肪酸/短链脂肪酸盐来抑制HDAC活性；所述短链脂肪酸包括乙酸、丁酸、戊酸中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸；优选的，所述短链脂肪酸盐包括乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸盐；优选的，所述组蛋白乙酰酶为I类、II类、III类和/或IV类组蛋白乙酰酶。
在一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括使用有效量的本发明的所述毛螺菌科微生物菌株或代谢物对有需要的患者进行治疗；或者使用含有本发明菌株或代谢物作为有效成分的菌剂或药物对有需要的患者进行治疗。优选地，所述菌株为毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株保藏编号为GDMCC No：62002。
本发明的实施方案包括以下：
实施方案1、毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的16S rDNA或者与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.65％、98.7％、99％同一性，例如97％或98.7％或99％同一性的16S rDNA；
所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中的至少一种；或者所述肿瘤为病毒感染引起的肿瘤或细菌感染引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染(HPV)、乙型或丙型肝炎感染(HBV,HCV)、人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、EB病毒感染引起的肿瘤，以及幽门螺杆菌(HP)感染、具核梭杆菌(F.nucleatum)感染引起的肿瘤。
实施方案2、根据实施方案1所述的应用，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株包括毛螺菌科微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002；
或者，所述毛螺菌微生物菌株与毛螺菌微生物菌株MNH 46686的平均核苷酸同一性ANI值为至少95％，优选地，所述平均核苷酸同一性ANI值为95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。
实施方案3、一种组合物，其包含肠溶衣中的毛螺菌科微生物菌株和可药用载体，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的16S rDNA或者与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.65％、98.7％、99％同一性，例如97％或98.7％或99％同一性的16S rDNA；优选地，所述组合物为口服组合物；优选地，所述组合物还包含可药用载体；优选地，所述毛螺菌科微生物菌株和可药用载体存在于肠溶衣中。
实施方案4、根据实施方案3所述的组合物，其特征在于，所述毛螺菌微生物菌株包括毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002；
或者，所述毛螺菌微生物菌株与毛螺菌微生物菌株MNH 46686的平均核苷酸同一性ANI值为至少95％，优选地，所述平均核苷酸同一性ANI值为95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。
实施方案5、如实施方案3-4任一项所述的组合物，其特征在于，其包含毛螺菌科微生物菌株活细胞或活细菌或减毒的细菌或经辐照的细菌或灭活的细菌或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或所述毛螺菌科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液。
实施方案6、如实施方案5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括联用药物；所述联用药物选自化疗药物、光敏剂、光热剂、免疫治疗药物、增强细胞疗法药物中的至少一种；
优选地，所述化疗药物包括紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星、丝裂霉素或表柔比星中的一种或多种；
优选地，所述光敏剂包括硼二吡咯、二氢卟吩或孟加拉红的一种或多种；
优选地，所述光热剂为吲哚菁绿、新吲哚菁绿或金纳米粒棒的一种或多种；
优选地；所述免疫治疗药物包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、PD-L1抑制剂；更优选地，所述PD-L1抑制剂选自度伐单抗、阿替珠单抗或阿维单抗；所述PD-1抗体或PD-L1抗体选自帕博利珠单抗或纳武利尤单抗；所述CTLA-4抗体选自伊匹木单抗；更优选地，所述PD-1抑制剂的有效剂量为1～11mg/kg；优选地，PD-1的有效剂量包括：1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg或9mg/kg或10mg/kg；
优选地；所述增强细胞疗法包括CAR-T；
优选地，单位剂量的所述的组合物中微生物菌株的含量包括2×107～9×1010CFU/mL或1×106～2×1010CFU/mg的毛螺菌科微生物菌株菌；单位剂量优选为4×107CFU/mL、5×107CFU/mL、6×107CFU/mL、7×107CFU/mL、8×107CFU/mL、1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、8×108CFU/mL、9×108CFU/mL、1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、3×109CFU/mL、4×109CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109CFU/mL、7×109CFU/mL、8×109CFU/mL、9×109CFU/mL、2×1010或1.2×106CFU/mg、4×106CFU/mg、5×107CFU/mg、6×107CFU/mg、7×107CFU/mg、8×107CFU/mg、9×107CFU/mg、1×108CFU/mg、2×108CFU/mg、3×108CFU/mg、4×108CFU/mg、5×108CFU/mg、6×108CFU/mg、7×108CFU/mg、8×108CFU/mg、9×108CFU/mg的至少一种。
实施方案7.如实施方案5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体；优选地，所述载体选自稀释剂、分散剂、赋形剂、稳定剂、润滑剂、崩解剂中的一种或几种；
优选地，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂和纳米制剂中的任一种。
实施方案8、如实施方案5所述的组合物，其中所述细菌中至少50％以上是活菌，例如90％以上是活菌。
实施方案9、如实施方案5所述的组合物，其中所述组合物呈以下形式：粉剂、微囊化粉剂、胶囊、片剂、锭剂、颗粒剂、乳剂、悬剂、栓剂、饮料、食品、药品或营养品、食品添加剂、膳食补充剂或乳制品。
实施方案10、实施方案3-9任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、感染性疾病、中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种疾病的药物中的应用。
实施方案11、实施方案3-9任一项所述的组合物在制备用于抗肿瘤或者抑制肿瘤生长的药物中的应用，
优选地，抑制肿瘤生长包括以下至少一种：(a)抑制肿瘤体积增长；(b)抑制肿瘤重量增加；(c)抑制肿瘤细胞增长；(d)提高肿瘤治疗应答率；(e)提高免疫抑制药物治疗功效，例如提高PD-1药物治疗功效；(f)抑制肿瘤细胞转移；(g)降低PD-1耐药性；(h)提高外周血中的NK比例激活受试者系统性免疫；(i)通过SCFA中的乙酸、丙酸、丁酸或戊酸中的至少一种抑制HDAC活性；(j)通过SCFA中的乙酸、丙酸、丁酸或戊酸中的至少一种抑制肿瘤；(k)通过调节受试者免疫系统发挥免疫调节作用来抑制肿瘤；
所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中中的至少一种；或者所述肿瘤为病毒引起的肿瘤或细菌引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染(HPV)、乙型或丙型肝炎感染(HBV,HCV)、人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、幽门螺杆菌感染(HP)、EB病毒感染引起的肿瘤，以及幽门螺杆菌(HP)感染、具核梭杆菌(F.nucleatum)感染引起的肿瘤。
实施方案12、实施方案3-9任一项所述的组合物在制备用于治疗和/或预防HDAC活性介导的疾病的药物中的应用，优选地，所述HDAC活性介导的疾病包括肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病，感染性疾病，中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种；优选地，所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中中的至少一种；或者所述肿瘤为病毒感染引起的肿瘤或细菌感染引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染(HPV)、乙型或丙型肝炎感染(HBV,HCV)、人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、EB病毒感染引起的肿瘤，以及幽门螺杆菌(HP)感染、具核梭杆菌(F.nucleatum)感染引起的肿瘤。
实施方案13、毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施方案14、根据实施方案13所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液，其特征在于，所述毛螺菌微生物菌株包括毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002。
实施方案15、一种治疗或预防肿瘤或糖尿病的方法，包括给予有需求的受试者有效量的实施方案13或14中所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液或者实施方案3-9任一项所述的组合物的步骤；
优选地，所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中的一种或多种；或者所述肿瘤为病毒引起的肿瘤或细菌引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染、人类免疫缺陷病毒感染、幽门螺杆菌感染、EB病毒感染或具核梭杆菌感染引起的肿瘤；
优选地，所述菌株是通过抑制肿瘤生长来预防和/或治疗肿瘤，抑制肿瘤生长包括以下至少一种：(a)抑制肿瘤体积增长；(b)抑制肿瘤重量增加；(c)抑制肿瘤细胞增长；(d)提高肿瘤治疗应答率；(e)提高免疫抑制药物治疗功效，例如提高PD-1药物治疗功效；(f)抑制肿瘤细胞转移；(g)降低PD-1耐药性；(h)提高外周血中的NK比例激活受试者系统性免疫；(i)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种抑制HDAC活性；(j)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种短链脂肪酸或短链脂肪酸盐抑制肿瘤；(k)通过调节受试者免疫系统发挥免疫调节作用来抑制肿瘤。
实施方案16、实施方案13或14中所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液或者实施方案3-9任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤或糖尿病；
优选地，所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中的一种或多种；或者所述肿瘤为病毒引起的肿瘤或细菌引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染、人类免疫缺陷病毒感染、幽门螺杆菌感染、EB病毒感染或具核梭杆菌感染引起的肿瘤；
优选地，所述菌株是通过抑制肿瘤生长来预防和/或治疗肿瘤，抑制肿瘤生长包括以下至少一种：(a)抑制肿瘤体积增长；(b)抑制肿瘤重量增加；(c)抑制肿瘤细胞增长；(d)提高肿瘤治疗应答率；(e)提高免疫抑制药物治疗功效，例如提高PD-1药物治疗功效；(f)抑制肿瘤细胞转移；(g)降低PD-1耐药性；(h)提高外周血中的NK比例激活受试者系统性免疫；(i)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种抑制HDAC活性；(j)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种短链脂肪酸或短链脂肪酸盐抑制肿瘤；(k)通过调节受试者免疫系统发挥免疫调节作用来抑制肿瘤。
本发明的实施方案还包括以下：
实施方案1、毛螺菌科微生物菌株在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述肿瘤包括肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌和纤维肉瘤中的至少一种。
实施方案2、根据实施方案1所述的应用，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株包括毛螺菌科微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002。
实施方案3、毛螺菌科微生物菌株，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施方案4、根据实施方案3所述的毛螺菌科微生物菌株，其特征在于，所述毛螺菌微生物菌株包括毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002。
实施方案5、一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含实施方案3或实施方案4所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的上清液。
实施方案6、一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于，包含实施方案3或实施方案4所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的上清液；
优选地，所述药物的单位剂量包括9×108～2×109CFU/mL或1×106～2×109CFU/mg的毛螺菌微生物菌株；所述单位剂量优选为9×108CFU/mL或1×109CFU/mg、9.2×109CFU/mL或1.2×109CFU/mg、9.3×109CFU/mL或1.4×109CFU/mg、9.4×109CFU/mL或1.1×109CFU/mg、1.2×109CFU/mL或1.8×109CFU/mg和1.4×109CFU/mL或1.6×109CFU/mg、1.7×109CFU/mL或1.2×1010CFU/mg、1.8×109CFU/mL或1.4×109CFU/mg、1.6×109CFU/mL或1.6×1010CFU/mg、1.8×1010CFU/mL或1.8×1010CFU/mg和2×1010CFU/mL或2×1010CFU/mg中的至少一种。
实施方案7.根据实施方案6所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体；优选地，所述载体选自稀释剂、分散剂、赋形剂、稳定剂、润滑剂、崩解剂中的一种或几种；
优选地，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂和纳米制剂中的任一种。
实施方案8、一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括实施方案3-4任意一项所述的毛螺菌科微生物菌株和/或实施方案5所述的微生物菌剂和/或实施方案6-7任意一项所述的药物；所述药物组合物还包括联用药物；所述联用药物包括化疗药物、光敏剂、光热剂、免疫治疗药物、增强细胞疗法药物中的至少一种；
优选地，所述化疗药物包括紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星、丝裂霉素或表柔比星中的一种或多种；
优选地，所述光敏剂包括硼二吡咯、二氢卟吩或孟加拉红的一种或多种；
优选地，所述光热剂为吲哚菁绿、新吲哚菁绿或金纳米粒棒的一种或多种；
优选地；所述免疫治疗药物包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、PD-L1抑制剂；更优选地，所述PD-L1抑制剂选自度伐单抗、阿替珠单抗或阿维单抗；所述PD-1抗体或PD-L1抗体选自帕博利珠单抗或纳武利尤单抗；所述CTLA-4抗体选自伊匹木单抗；
优选地；所述增强细胞疗法包括CAR-T；
优选地，所述药物的单位剂量包括9×108～2×109CFU/mL或1×106～2×109CFU/mg的毛螺菌科微生物菌株菌；单位剂量优选为9×108CFU/mL或1×109CFU/mg、9.2×109CFU/mL或1.2×109CFU/mg、9.3×109CFU/mL或1.4×109CFU/mg、9.4×109CFU/mL或1.1×109CFU/mg、1.2×109CFU/mL或1.8×109CFU/mg和1.4×109CFU/mL或1.6×109CFU/mg、1.7×109CFU/mL或1.2×1010CFU/mg、1.8×109CFU/mL或1.4×109CFU/mg、1.6×109CFU/mL或1.6×1010CFU/mg、1.8×1010CFU/mL或1.8×1010CFU/mg和2×1010CFU/mL或2×1010CFU/mg中的至少一种。
实施方案9、如实施方案3-4任一项所述的微生物菌株、实施方案5所述的微生物菌剂、实施方案6-7任意一项的所述的药物、实施方案8所述的药物组合物，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株产丁酸通路的完整性为100％和/或所述菌株高产丁酸和/或乙酸菌株；优选地，所述微生物菌株 或微生物菌株的代谢产物或微生物菌株的上清液通过抑制HDAC活性来实现预防和/或治疗肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病，感染性疾病，中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种；优选地，通过调节短链脂肪酸/短链脂肪酸盐来抑制HDAC活性；所述短链脂肪酸包括乙酸、丁酸、戊酸中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸；优选的，所述短链脂肪酸盐包括乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸盐；优选的，所述组蛋白乙酰酶为I类、II类、III类和/或IV类组蛋白乙酰酶。
实施方案10、如实施方案3-4、9任一项所述的微生物菌株、实施方案5～9任意一项所述的微生物菌剂、实施方案6-7、9任意一项所述的药物、实施方案8～9任意一项所述的药物组合物，其特征在于，毛螺菌科微生物菌和/或毛螺菌科微生物菌的代谢产物和/或毛螺菌科微生物菌的上清液能抑制肿瘤生长；优选地，抑制肿瘤生长包括抑制肿瘤体积增长，抑制肿瘤重量增加、提高外周血中的NK比例激活小鼠系统性免疫、增强免疫治疗剂、CAR-T治疗剂的功效、提高肿瘤应答率作用中的至少一种。
实施方案11、如实施方案3-4、9～10任一项所述的微生物菌株、实施方案5～10任意一项所述的微生物菌剂、实施方案6-7、9～10任意一项的所述的药物、实施方案8～10任意一项所述的药物组合物，其特征在于，毛螺菌科微生物菌和/或毛螺菌科微生物菌的代谢产物和/或毛螺菌科微生物菌的上清液能加强毒杀性T细胞的抗肿瘤活性、增强受试者的免疫反应、抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的扩散、抑制肿瘤的免疫逃逸、调节受试者肠内一种或多种共生微生物的水平、上调促炎性细胞因子、趋化因子、降低肠屏障通透性和/或上调保护性免疫原性细胞因子、调节趋化因子、增加肿瘤中T细胞的浸润作用中的至少一种。
实施方案12、如实施方案3-4、9～11任一项所述的微生物菌株、实施方案5～11任意一项所述的微生物菌剂、实施方案6-7、9～11任意一项所述的药物、实施方案8～11任意一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防HDAC活性介导的疾病的药物中的应用，其特征在于，毛螺菌科微生物菌和/或毛螺菌科微生物菌的代谢产物和/或毛螺菌科微生物菌的上清液抑制HDAC活性实现治疗或预防HDAC活性介导的疾病；所述HDAC活性介导的疾病包括肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病，感染性疾病，中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种；优选地，所述肿瘤包括肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌和纤维肉瘤中的至少一种；
优选地，通过调节短链脂肪酸/短链脂肪酸盐来抑制HDAC活性；所述短链脂肪酸包括乙酸、丁酸、戊酸中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸；优选的，所述短链脂肪酸盐包括乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐中的一种或多种；更优选的，所述短链脂肪酸为丁酸盐；优选的，所述组蛋白乙酰酶为I类、II类、III类和/或IV类组蛋白乙酰酶。
本文中菌株MNH 46686，在下文中出现的MNC-686等同于MNH 46686；
菌种分类学相关内容
16s rRNA在分类学的应用内容：
判断标准：当两菌株16S rRNA基因序列之间相似性低于97％～98.65％时，可判断它们归属于不同的种。
“一致性”或“一致性”计算方法：
两个核酸分子的核酸序列之间的“一致性”可以使用已知的计算机算法，例如“FASTA”程序，使用例如Pearson等人中的默认参数，确定为一致性百分比。(其他程序包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA)。例如，NCBI数据库的BLAST功能、其他商业或公开可用的程序包括DNAStar“MegAlign”程序。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用益生元。在一些实施方案中，益生元是低聚果糖、低聚半乳糖、反式低聚半乳糖、低聚木糖、壳低聚糖、低聚大豆、低聚龙胆糖、低聚异麦芽糖、低聚甘露糖、低聚麦芽糖、低聚甘露糖、乳果糖、乳糖蔗糖、帕拉金糖、糖基蔗糖、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、塔加糖、直链淀粉、支链淀粉、果胶、木聚糖或环糊精。
“给药”或“施用”泛指将组合物(例如，组合物)给予受试者的途径。给药途径的实例包括口服给药、直肠给药、局部给药、吸入(鼻)或注射。注射给药包括静脉内(IV)、肌肉内(IM)、瘤内(IT)和皮下(SC)给药。本文所述的组合物或药物组合物可以通过任何有效途径以任何形式施用，包括但不限于瘤内、口服、肠胃外、肠内、静脉内、腹膜内、局部、透皮(例如，使用任何标准贴剂)、皮内、眼内、(鼻内、局部、非口腔，例如气雾剂、吸入、皮下、肌内、口腔、舌下、(经)直肠、阴道、动脉内和鞘内，-本文所述的组合物经口、直肠、瘤内、局部、膀胱内、通过注射到引流淋巴 结中或引流淋巴结附近、静脉内、通过吸入或气雾剂、或皮下施用。在另一个优选的实施方案中，本文所述的组合物经口、瘤内或静脉内施用。-本文所述的组合物经口、直肠、瘤内、局部、膀胱内、通过注射到引流淋巴结中或引流淋巴结附近、静脉内、通过吸入或气雾剂、或皮下施用。在另一个优选的实施方案中，本文所述的组合物经口、瘤内或静脉内施用。
两个核酸分子的核酸序列之间的“同一性”可以使用已知的计算机算法，例如“FASTA”程序，使用例如Pearson等人中的默认参数，确定为同一性百分比。(其他程序包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA)。例如，NCBI数据库的BLAST功能、其他商业或公开可用的程序包括DNAStar“MegAlign”程序。
本发明中的术语平均核苷酸同一性ANI(Average Nucleotide Identity)是在核苷酸水平比较两个基因组亲缘关系的指标。ANI被定义为两个微生物基因组同源片段之间平均的碱基相似度。
术语“增加”或“提升”或“提高”是指改变，使得根据情况，差异为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、4倍、10倍、100倍、10^3倍、10^4倍、10^5倍、10^6倍和/或10^7倍治疗后与相比预处理状态。可能增加的特性包括免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物的数量；细胞因子的水平；或其他物理参数(例如肿瘤大小)。
术语“减少”或“降低”或“下降”是指改变，使得根据情况，差异为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80与治疗前状态相比，治疗后％、90％、1/100、1/1000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或检测不到。可能减少的特性包括免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物的数量；细胞因子的水平；或其他物理参数(例如耳朵厚度(例如，在DTH动物模型中)或肿瘤大小)。
如本文所用，“代谢产物”是指在任何细胞或微生物代谢反应中用作底物或作为产物化合物、组合物、分子、来自任何细胞或微生物代谢反应的离子、辅因子、催化剂或营养物质。
“菌株”是指具有遗传特征的细菌物种的成员，使得它可以与相同细菌物种的密切相关的成员区分开来。遗传特征可以是至少一个基因的全部或部分不存在、至少一个调节区(例如，启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)的全部或部分不存在、不存在(至少一种天然质粒的“治愈”)、至少一种重组基因的存在、至少一种突变基因的存在、至少一种外源基因(来自另一物种的基因)的存在、至少一个突变的调节区(例如，启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)，至少一种非天然质粒的存在，至少一种抗生素抗性盒的存在，或其组合。不同菌株之间的遗传特征可以通过PCR扩增来鉴定，任选地随后对感兴趣的基因组区域或整个基因组进行DNA测序。在一种菌株(与同一物种的另一种菌株相比)获得或失去抗生素抗性或获得或失去生物合成能力(例如营养缺陷型菌株)的情况下，可以通过选择或使用抗生素的反选择来区分菌株或营养/代谢物。
本发明含义内的“培养物”是指使用液体培养基在厌氧培养条件下得到的培养物；优选地，所述液体培养基为MM01液体培养基；优选地，培养温度为37℃，优选地，培养时间为24-72小时，优选36-60小时，更优选为48小时。
MM01液体培养基的组分如下：
本文涉及的液体MM01培养基，其组分为：蛋白胨5g/L，胰化酪蛋白5g/L，酵母粉10g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖5g/L，K2HPO4 2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L,血红素5mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，维生素K1 1uL/L,无机盐溶液8ml/L,无机盐溶液每1L包括(氯化钙0.25g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，碳酸氢钠10g，氯化钠2g)。
本文涉及的固体MM01培养基，其组分为：蛋白胨5g/L，胰化酪蛋白5g/L，酵母粉10g/L，牛肉膏5g/L，葡萄糖5g/L，K2HPO4 2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L,血红素5mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，维生素K1 1uL/L,无机盐溶液8ml/L,无机盐溶液每1L包括(氯化钙0.25g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，碳酸氢钠10g，氯化钠2g),琼脂15g/L。
本发明含义内的“发酵培养液”是指本发明的使用液体培养基在厌氧培养条件下培养细菌而得到的细菌菌株的培养液的过滤液；“上清”或“上清液”是指根据本发明的细菌菌株的培养液的上清部分，其包含所述菌株的化合物和/或细胞碎片，和/或由所述菌株分泌的代谢物和/或分子。
术语“受试者”或“患者”是指任何哺乳动物。描述为“有需要”的受试者或患者是指需要治疗(或预防)疾病的人。哺乳动物(即哺乳动物)包括人类、实验室动物(例如灵长类动物、大鼠、小鼠)、家畜(例如牛、绵羊、山羊、猪)和家庭宠物(例如狗、猫、啮齿动物)。对象可以是人。受试者可以是非人类哺乳动物，包括但不限于狗、猫、牛、马、猪、驴、山羊、骆驼、小鼠、大鼠、豚鼠、羊、骆驼、猴子、大猩猩或黑猩猩。受试者或患者可能是健康的，或可能在任何发育阶段患有代谢疾病。
如本文所用，术语“治疗”受试者的疾病或“治疗”患有或怀疑患有疾病的受试者是指向受试者施用药物治疗，例如施用一种或多种药剂，从而减少或防止疾病的至少一种症状恶化。因此，在一个实施方案中，“治疗”尤其是指延迟进展、加速缓解、诱导缓解、增加缓解、加速恢复、增加替代疗法的功效或降低对替代疗法的抗性，或它们的组合。
如本文所用，术语“预防”是本领域公认的，并且当与诸如局部复发等病症相关使用时，在本领域中是众所周知的，并且包括施用降低相对于未接受该组合物的受试者，受试者的医学病症症状的发生或延迟该症状的发作。因此，癌症的预防包括，例如，相对于未治疗的对照群体，减少接受预防性治疗的患者群体中可检测肿瘤的数量，和/或相对于未治疗的对照群体延迟治疗群体中可检测肿瘤的出现，例如，统计和/或临床上显着的量。本发明的组合物可以作为食品，例如营养增补剂施用。一般地，本发明的组合物用于治疗人类，不过其可以用于治疗动物，包括单胃哺乳动物，例如家禽、猪、猫、犬、马或兔。本发明的组合物可用于增强动物的生长和性能。如果施用于动物，那么可以使用经口管饲法。
本发明提供的组合物或药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知。合适的载体的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇或山梨糖醇等。合适的稀释剂的例子包括乙醇、甘油和水。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的给药途径和标准药物实践来选择。组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、涂层剂或增溶剂等。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖以及天然或合成树胶。其中天然糖例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖或玉米甜味剂。天然或合成树胶例如阿拉伯树胶、黄芪胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的润滑剂的例子包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠或氯化钠等。组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸或对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
在某些实施方案中，本发明提供的上述组合物中所述细菌菌株是冻干的。在某些实施方案中，本发明提供上述组合物中所述细菌菌株是喷雾干燥的。在某些实施方案中，本发明提供上述组合物中细菌菌株被冻干或喷雾干燥并且其中它是活的。在某些实施方案中，本发明提供上述组合物中所述细菌菌株被冻干或喷雾干燥并且其中它能够部分或完全定植于肠。在某些实施例中，在一些情况下，冻干的细菌菌株在给药前被重构。在一些情况下，重构是通过使用本文所述的稀释剂进行的。
在一些实施方案中，本发明提供的组合物是口服给药的。口服给药可能涉及吞咽，从而化合物进入胃肠道，和/或通过口腔、舌或舌下给药，化合物通过口腔直接从口腔进入血流。适于口服给药的药物剂型包括固体栓剂、固体微粒、半固体和液体(包括多相或分散系统)如片剂；含有多颗粒或纳米颗粒、液体(例如水溶液)、乳液或粉末的软或硬胶囊；锭剂(包括液体填充剂)；咀嚼；凝胶；快速分散剂型；胚珠；喷雾剂；和颊/粘膜粘附贴片。
在一些实施方案中，药物制剂是肠溶制剂，即适于通过口服给药将本发明的组合物递送至肠的耐胃液制剂(例如，耐受胃pH)。当细菌或组合物的另一种成分对酸敏感，例如在胃条件下易于降解时，肠溶制剂可能特别有用。
在一些实施方案中，肠溶制剂包含肠溶包衣。在一些实施方案中，制剂是肠溶包衣的剂型。例如，制剂可以是肠溶片或肠溶胶囊等。肠溶包衣可以是常规的肠溶包衣，例如用于口服递送的片剂、胶囊等的常规包衣。该制剂可包含薄膜包衣，例如肠溶聚合物的薄膜层，例如酸不溶性聚合物。在一些实施方案中，肠溶制剂本质上是肠溶的，例如胃肠溶性的而不需要肠溶包衣。在一些实施例中，该制剂是一种固有的肠溶胶囊(例如，来自Capsugel)。
在一些实施例中，该制剂是软胶囊。软胶囊是由于胶囊壳中存在的软化剂例如甘油、山梨糖醇、麦芽糖醇和聚乙二醇的添加而具有一定弹性和柔软性的胶囊。软胶囊可以例如在明胶或淀粉的基础上生产。基于明胶的软胶囊可从各种供应商商购获得。根据给药方法，例如口服或直肠给药，软胶囊可以具有各种形状，它们可以是例如圆形、椭圆形、椭圆形或鱼雷形。软胶囊可以通过常规工艺生产，例如通过Scherer工艺、Accogel工艺或液滴或吹塑工艺。
在某些实施方案中，本发明的组合物通过管，例如鼻饲管、口胃管、胃管、空肠造口管(J型管)、经皮内窥镜胃造口术(percutaneous endoscopic gastrostomy，PEG)或端口，例如通向胃、空肠和其它适合进入端口的胸壁端口施用于胃肠道。
在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随有患者肠微生物丛的评估。如果未实现本发明的菌株传递和/或部分或全部定殖未实现，从而未观测到功效，那么可以重复治疗，如果传递和/或部分或全部定殖成功且观测到功效，那么可以停止治疗。
生物保藏信息：
本发明的菌株MNH 46686，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，保藏编号为GDMCC No:62002；保藏时间2021年11月4日；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，提议的分类名称为Lachnospiraceae sp.。经保藏中心鉴定，所保藏菌株存活。
有益效果：
本发明提供的毛螺菌科微生物菌株在已有的报道中并不存在，属于新属级新物种；
本发明的毛螺菌科微生物菌株具有完整的产丁酸通路，在生长过程中可以大量合成乙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸；
本发明的毛螺菌科微生物菌株可以抑制肿瘤(如肝癌)的生长，与对照组相比，可以显著降低肿瘤的尺寸和重量；
本发明的菌株及其代谢产物可用于制备缓解、预防或治疗癌症(或肿瘤)的组合物，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明菌株MNH 46686在厌氧血平板培养24h的菌落形态照片；
图2为本发明菌株MNH 46686的显微形态照片；
图3为本发明菌株MNH 46686的显微形态照片；
图4为本发明菌株MNH 46686的革兰氏染色显微形态照片；
图5为本发明菌株MNH 46686的芽孢革兰氏染色显微形态照片；
图6为本发明菌株MNH 46686对不同pH的耐受性结果；
图7为本发明菌株MNH 46686对不同浓度NaCl的耐受性结果；
图8为本发明菌株MNH 46686对不同胆盐的耐受性结果；
图9为本发明菌株MNH 46686经API 20A进行生化鉴定的结果；
图10为将本发明菌株与Lachnospiraceae菌科相关菌株比较构建的系统发育树；
图11为菌株MNH 46686对巨噬细胞免疫活性调节；
图12为菌株MNH 46686对Primary PBMC免疫活性调节；
图13A显示本研究所构建的IFNβ基因报告系统对阳性药物MSA-2具有良好的反应，图13B显示MNH46686可显著促进IFNβ转录活性；
图14为预防肝癌的动物实验解剖后肿瘤组织大小对比图；
图15(A)～15(D)为MNH 46686对肺癌的治疗效果验证；
图16为小鼠组织中免疫细胞的比例；
图17为小鼠组织中免疫细胞与肿瘤终点体积的相关性分析；
图18为小鼠组织中免疫细胞与肿瘤重量的相关性分析；
图19为MNH46686与PD-1联用实验中的小鼠肿瘤体积图；
图20为MNH46686与PD-1联用实验中实验终点小鼠肿瘤体积比较图；
图21为MNH46686与PD-1联用实验中实验终点小鼠肿瘤重量比较图；
图22为MNH46686与PD-1联用实验中实验终点小鼠应答率图；
图23为菌株MNH46686对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制；
图24A-D为小鼠组织中免疫细胞的比例，其中，数据均用CyExpert进行分析，Graphpad Prism V9统计处理；统计分析采用T检验(Student‘s t test)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图25A-D为小鼠组织中免疫细胞与肿瘤重量的相关性分析，其中数据均用CyExpert进行分析，Graphpad Prism V9统计处理。统计分析采用Correlation Analysis，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图26为小鼠肿瘤体积图，图中数据采用平均值±标准差(Mean±SD)显示，统计分析采用双因 素方差(2way ANOVA)搭配Dunnett's多重比较进行分析，差异显著性用*表示，*p＜0.05；
图27为实验终点小鼠肿瘤体积比较图，图中数据采用平均值±标准差(Mean±SD)显示，统计分析采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法与搭配Dunnett’s多重比较分析(Dunnett’smultiple comparisons test)分析方法，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01，无显著性，不标示；
图28为实验终点小鼠肿瘤重量比较图，图中数据采用平均值±标准差(Mean±SD)显示，统计分析采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法与搭配Dunnett’s多重比较分析(Dunnett’smultiple comparisons test)分析方法，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01，无显著性，不标示；
图29为实验终点小鼠肿瘤生长抑瘤率比较图，图中数据采用平均值±标准差(Mean±SD)显示，统计分析采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法与搭配Dunnett’s多重比较分析(Dunnett’s multiple comparisons test)分析方法，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01；
图30为实验终点小鼠应答率图，其中数据采用单个小鼠肿瘤体积(mm3)显示。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.1菌株MNH 46686的分离
本发明筛选到的肠道菌株Lachnospiraceae sp.MNH 46686分离自广东省广州市的一位健康女性自愿者的粪便样本。
具体地，菌株的分离方法如下：
捐赠者自取新鲜粪便2～5g，放入样本收集保存管中，震荡匀质后将处理好的粪便样本置于冰盒中，并于24小时内送达实验室进行菌株分离。
在生物安全柜中分装生理盐水，9mL/管；准备菌株分离培养基厌氧血琼脂平板(环凯微生物科技有限公司)，并提前24h将其转入厌氧工作站内，标记样品信息、培养基类型、分离日期等。
取新鲜粪便样本置于厌氧操作站中(Don Whitley Scientific H35)使用漩涡振荡器震荡1min，混匀，吸取1mL样本到9mL生理盐水中，混匀为10-1稀释液，然后梯度稀释至10-6稀释液，备用。
取10-6稀释液滴于分离培养基(厌氧血琼脂平板、哥伦比亚血琼脂平板和巧克力琼脂平板)中，滴加量为100μL/皿，涂布均匀，待平板表面干燥后，平板倒置，37℃培养3～5天。
1.2菌株的纯化
观察分离培养基菌株生长状况并用灭菌牙签挑取单菌落，进行菌株纯化，纯化菌株置于37℃，厌氧培养。
将纯培养菌株制备成20％甘油/水-菌液，-86℃低温保存。
实施例2.菌株MNH 46686的形态特征和生理生化特征
2.1菌株MNH 46686的形态特征
将菌株MNH 46686接种于厌氧血平板培养基，37℃厌氧培养48h后，在厌氧血平板培养基上形成可见菌落，菌落圆形，边缘规则且光滑，直径约0.5mm，淡黄色，不透明，菌落周边无分泌物形成；菌株为革兰氏阴性；显微形态观察发现无鞭毛，不运动，杆状，长度约2～5μm×20～50μm。菌株MNH 46686在厌氧血平板培养48h的菌落形态照片见图1。菌株MNH 46686的显微形态照片见图2(整体)和图3(局部)。
菌株MNH 46686的革兰氏染色显微形态照片见图4，菌株MNH 46686芽孢染色显微形态照片见图5(图4与图5进行了灰度化处理，原始染色图片显示呈红色)，菌株能产芽孢，革兰氏染色阴性。
2.2菌株MNH 46686的生理生化特征
菌株MNH 46686，温度生长范围30～42℃，最适生长是37℃。在pH 7.0到9.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0(菌株对不同pH的耐受性结果见图6)；在NaCl含量超过2％培养基上不生长(菌株对不同浓度NaCl的耐受性结果见图7)；菌株MNH 46686能在胆盐浓度为0％～0.3％范围内存活生长，在胆盐浓度大于等于0.4％时不能生长(菌株对不同浓度胆盐的耐受性结果见图8)。
2.3菌株MNH 46686经API 20A进行生化鉴定的结果
根据说明书，使用API 20A试剂条(BioMérieux)进行测试。培养条件：37℃，厌氧。实验 结果见表1和图9。
表1.菌株MNH 46686API 20A测试结果
2.4使用纸片扩散法进行菌株MNH 46686抗生素敏感性测试。
MNH 46686的抗生素敏感性测试结果见表2。菌株MNH 46686对红霉素、环丙沙星、复方新诺明、氨苄西林、头孢曲松和林可霉素具有耐药性；对庆大霉素、氯霉素、四环素和青霉素等抗生素敏感。
表2.菌株MNH 46686抗生素敏感性测试结果
实施例3.菌株MNH 46686鉴定
3.1 16S rRNA基因扩增
取菌株MNH 46686新鲜培养物，进行菌株基因组DNA的提取。采用提取的菌株基因组DNA作为模板进行16S rRNA基因扩增。
本发明16S rRNA基因PCR使用的引物对为：
27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.2)
1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.3)。
PCR反应程序如下：
预变性：94℃，4min；变性：94℃，50sec；退火：52℃，40sec；延伸：72℃，70sec；终延伸：72℃，10min。(注：循环36次)。
3.2 16S rRNA基因测序
PCR扩增完成后，将PCR产物进行纯化，交由金唯智公司进行16S rRNA基因测序，得到16S rRNA基因序列(1383bp)。
菌株MNH 46686 16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示：

3.3菌株鉴定结果
将测序返回的菌株16S rRNA基因序列提交到NCBI Basic Local Alignment Search Tool，进行菌株16S rRNA基因分析，确认菌株分类信息。
将测得的序列与GenBank中的数据通过BLAST进行分析，比对结果显示与MNH 46686相似性最高的菌株是Lachnoclostridium pacaense(93.77％)和Enterocloster citroniae(93.77％)，菌株MNH46686与其它菌株16S rRNA基因序列相似性均低于93.7％；较低(<95％)的16S rRNA基因序列相似性表明菌株MNH 46686可能是Lachnospiraceae菌科的一个新属级新物种。
将MNH 46686与从GenBank等数据库中调取的Lachnospiraceae菌科相关菌株的16S rRNA基因序列进行比较，构建系统进化树。
将MNH 46686和NCBI数据库中16S rRNA基因序列相似性较高模式菌株的序列进行多序列比对，然后利用软件MEGA 5构建系统发育树(采用最大似然法构建系统发育树)，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。
从系统进化树(图10)可以看出菌株MNH 46686与Lachnospiraceae菌科其他菌属菌株未聚在一起，而是形成一个单独的分枝(Bootstrap支持值为90)，系统进化树分析支持将菌株MNH 46686划定为Lachnospiraceae菌科的一个新属级新物种。
实施例4.菌株MNH 46686的基因组分析
MNH46686原始菌株的基因组通过超声波法进行序列片段化，片段化长度范围～350bp，然后利用标准DNA建库试剂盒(NEB UltraTM)构建Illumina测序文库。将构建好的测序文库利用NovaSeq(Illumina)进行双端150bp测序。测序得到1.34Gbp数据，其中Q20占比为：97.325％。
基因组原始测序数据使用fastp(版本：0.20.0)进行数据过滤，过滤参数：“--poly_g_min_len 10--poly_x_min_len 10-q 15-u 40-n 5-l 50”。过滤后的原始数据使用SPAdes(版本：v3.14.0)进行基因组组装，组装参数“--isolate--cov-cutoff 10”。基因组组装得到基因总长度3.34Mbp，N50长度为174.9kbp，GC含量为51.93％。
基因组基因使用原核分析软件基因组注释流程prokka(版本：1.14.5)进行基因组基因预测分析，参数“--gcode 11--evalue 1e-09”。总共预测得到3052条CDS序列，其中平均CDS序列长度为977bp。
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用RGI流程分析(版本：4.2.2)，其中抗生素耐药基因数据库为CARD(版本：3.0.0，https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)。详细对比信息参照表3所示。
表3.耐药基因信息列表
对基因组中潜在的毒力因子及相关基因的分析采用的是NCBI blastp(版本为：2.7.1+)比对毒力因子数据库VFDB(virulence factor database，http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi，更新日期为2019年9月19日)。详细比对结果见表4。
表4.MNH-46686潜在毒性基因列表
对基因组中潜在的次级代谢基因簇的分析采用的是antiSMASH5(版本为：5.1.1)。详细比对结果见表5。
表5.MNH-46686潜在次级代谢基因簇列表
对基因组中潜在的初级代谢基因簇的分析采用的是gutSMASH5(版本为：1.0.0)。详细比对结果见表6。
表6.MNH-46686潜在初级代谢基因簇列表
对此菌株产丁酸能力进行评估，采用文章(Vital M,Howe C,Tiedje M.Revealing the Bacterial Butyrate Synthesis Pathways by Analyzing(Meta)genomic Data[J].Mbio,2014,5(2):1-11)中的产丁酸通路有关基因作为参考数据库，用NCBI blastp(版本为：2.7.1+)将此菌株的基因组序列和参考数据库进行比对，详细比对结果见表7，进而计算产丁酸通路的完整性，通过计算发现此菌株产丁酸通路的完整性为100％。
表7.MNH-46686潜在产丁酸基因列表

实施例5.菌株MNH 46686的脂肪酸组分分析
将菌株MNH 46686接种在TSA平板上，37℃厌氧培养48小时后，收集菌体，进行菌体脂肪酸提取和甲基化处理；使用美国MIDI公司的(Microbial ID,Inc.,Newark,Del)(Kroppenstedt,1985；Meier et al.,1993)全自动细菌鉴定系统进行菌株MNH 46686脂肪酸组分分析。
实验菌株MNH 46686脂肪酸组成见下表。
从结果看，MNH 46686主要脂肪酸(>10％)是十六碳饱和脂肪酸(C16:0 34.61％)、18:1CIS 9FAME(18.30％)、18:1c11/t9/t6FAME(12.74％)和十八碳饱和脂肪酸(C18:0 10.92％)；其余类型脂肪酸及含量详见下表8。
表8.菌株MNH 46686脂肪酸组分表
实施例6.菌株MNH 46686的短链脂肪酸(SCFA)测定
6.1菌体制备
将菌株MNH 46686接种在TSB液体培养基中，37℃厌氧培养48小时，离心收集菌体，收集物置于-86℃低温保存，待用。
6.2标准品配制
称量乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸标准品，用乙酸乙酯配制成0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL八个混合标准浓度梯度。
取600μL标准品，加入25μL终浓度为500μM的4-甲基戊酸作为内标，混匀加入进样瓶，进入GC-MS检测，进样量1μL，分流比10:1，分流进样。
6.3代谢物提取
将样品冰上解冻，取80mg样品于2mL玻璃离心管中，加入900μL0.5％的磷酸重悬，震荡混匀2min，14000g离心10min，取上清液800μL，加入等量的乙酸乙酯提取，震荡混匀2min，14000g离心10min，取600μL上层有机相，加入终浓度为500μM的4-甲基戊酸作为内标，混匀加入进样瓶，进入GC-MS检测，进样量1μL，分流比10:1，分流进样。
6.4样本检测分析
采用Agilent DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm ID×0.25μm)气相色谱系统对样本进行分离。程序升温：初始温度90℃，以10℃/min升温至120℃，再以5℃/min升温至150℃，最后以25℃/min升温至250℃，并维持2min。载气为氦气载气流速1.0mL/min。
采用Agilent 7890A/5975C气质联用仪进行质谱分析。进样口温度250℃，离子源温度230℃，传输线温度250℃，四极杆温度150℃。电子轰击电离(EI)源，全扫及SIM扫描方式，电子能量70eV。
采用MSD ChemStation软件提取色谱峰面积及保留时间。绘制标曲曲线，计算样品中短链脂肪酸的含量。
表9.菌株MNH 46686短链脂肪酸(SCFA)产量结果
由检测结果可见，菌株MNH 46686在生长过程中可以大量合成乙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸。
实施例7.菌株MNH 46686对巨噬细胞免疫活性调节
实验方法参照现有技术CN112618576B中的实验例1。
使用终浓度为5ng/mL的PMA处理THP-1细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)48hr使其分化为M0巨噬细胞。
按照MOI(活菌数：细胞数)＝8～10：1的比例加入菌株MNH46686。同时设置M1巨噬细胞对照组(M0巨噬细胞经20ng/ml IFNγ+10pg/ml LPS诱导24hr)。培养1hr后，加入混合抗生素(Ampicillin，Streptomycin，Colistin)杀死细菌，继续培养23h后，收集上清。
使用BDTM Cytometric Bead Array(CBA)Human Soluble Protein Master Buffer Kit试剂盒，按照说明书使得上清样本与抗体蛋白作用后，使用流式细胞仪检测其上清中IL-10、MIG、IL-6、MCP-1、RANTES、IL-1β、IL-8和TNFα等细胞因子的浓度(结果见图11)。
结果显示，M0巨噬细胞和MNH46686共培养后，巨噬细胞明显表现出向M1型巨噬细胞分化的特征。其中，促炎因子IL-6、IL-1β、IL-8和IL-12/IL-13P40的含量都有显著的增加，TNFα呈上调趋势；趋化因子MIG、MCP-1、RANTES的含量显著增加，IP-10呈上调趋势；抑炎因子IL-10呈下调趋势。
实施例8.菌株MNH 46686对对Primary PBMC免疫活性调节
实验方法参照现有技术CN112618576B中的实验例2。
将菌株MNH46686与Primary PBMC细胞以MOI＝1～5的比例共培养4小时，加入联合抗生素(氨苄西林、链霉素、粘菌素)抑制菌株过度增殖，24小时后收集上清，使用BDTM Cytometric Bead Array(CBA)Human Soluble Protein Master Buffer Kit试剂盒检测上清中的细胞因子IFNγ、TNFα、IL-1β、IP-10(CXCL-10)、RANTES(CCL5)、MIG(CXCL-9)、IL-6、MCP-1(CCL2)、IL-10、IL-12/IL-23P40、IL-8等的浓度(结果见图12)。
结果显示MNH46686能够诱导炎症因子TNFα、IL-12/IL-23P40、IL-6、IL-1β、IFNγ、IL-8、IP-10(CXCL-10)、MIG、RANTES(CCL5)的表达显著增加；炎症因子MCP-1因子表达有增加趋势，但未达到显著性变化；抗炎因子IL-10几乎不表达。
实施例9.菌株MNH46686对IFNβ表达的影响
1.1实验方法
干扰素(IFN)受体蛋白是宿主细胞分泌的一类细胞因子，可调节免疫应答。病毒、细菌内毒素、人工合成的双链RNA等刺激下产生干扰素。人体内的巨噬细胞、淋巴细胞、体细胞等都可以产生干扰素。其中，IFNβ属于I型干扰素，可以促进NK细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞的活性，本发明实施例12中的实验结果(图16-18)表明MNH46686在抗肿瘤过程中，NK细胞上升；进一步地，本发明的菌株MNH46686进一步通过实验验证其能够促进IFNβ的表达，从而发挥抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用。为验证MNH46686是否能促进IFNβ的表达，本研究利用已构建好的携带IFNβ基因启动子报告基因(即IFNβ-promoter reporter)的THP-1细胞(慕恩公司自建细胞系)评价MNH46686对IFNβ转录活性的影响。
MNH46686培养上清制备:将菌株MNH46686接种在MM01液体培养基中，37℃厌氧培养48小时，离心去除菌体，培养上清用0.22μm滤器进行过滤，分装，收集物置于-86℃低温保存，待用。
阳性药物组：MSA-2(Sting激动剂)(来源于TargetMol Cat No.T8798(Target Molecule Corp.))可促进IFNβ的表达，设置20μM、40μM和80μM三个梯度。
Untreated组：DMEM完全培养基(10％FBS)
High组：含10％体积的MM01细菌培养
MNH46686组：含10％体积的MNH46686细菌培养上清
将THP-1-IFNβ-promoter reporter细胞接种于96孔板，每孔1×105个细胞。按照所设置的组别处理细胞。继续培养24h后，细胞离心300g，5min，去除培养上清，加入50μL 1×luciferase检测试剂，反应1min，酶标仪检测Luminescence化学发光值。相对荧光值(Relative Luminescence)以untreated组进行归一化处理，通过与High组的相对荧光读值进行比较，评价MNH46686对IFNβ转录活性的影响。
结果显示，本发明所构建的IFNβ基因报告系统(本发明提及的基因报告系统含义为：报告基因插入到载体，载体感染细胞，筛选拿到表达报告基因的细胞系)(参见文献1：Huashan Du,Tianmin Xu,Manhua Cui“cGAS-STING signaling in cancer immunity and immunotherapy”Biomedicine&Pharmacotherapy 133(2021)110972；文献2：Jiang et al.“cGAS-STING,an important pathway in cancer immunotherapy”Journal of Hematology&Oncology(2020)13:81；文献3：Khiem C.Lam et al.“Microbiota triggers STING-type I IFN-dependent monocyte reprogramming of the tumor microenvironment”Cell 184,5338–5356)对阳性药物具有良好的反应(图13A)，进一步利用此系统对样品进行评价，发现MNH46686可显著促进IFNβ转录活性(图13B)。这些结果表明，MNH46686对免疫调节、抗病毒、抗肿瘤中具潜在作用。
实施例10.菌株MNH 46686用于预防肝癌的动物实验
为了验证菌株MNH 46686是否可以用于肿瘤的预防和治疗，利用小鼠同源肿瘤模型进行抑制肝癌生长实验。该研究已通过慕恩生物实验动物管理和使用委员会伦理审查。
供试菌株：将MNH 46686菌种甘油冻存管在37℃下融化后，于厌氧工作站中接种于厌氧血平板上进行活化，将活化后的菌株接种于MM01液体培养基中，厌氧培养，获得足够数量的培养物，将培养好的菌液离心浓缩后用溶媒将菌体重悬，得到纯度和活菌数(2.04×1010CFU/mL)满足动物实验要求的受试物。
肿瘤细胞：H22小鼠肝癌细胞，CBP69230。
实验动物：实验用鼠为C57BL/6J小鼠，鼠龄5周，总共20只，购自广东药康生物科技有限公司。
动物实验：正常饲养，检疫期结束后，根据体重进行随机分为2组(对照组和实验组)，每组10只，分笼饲养。分组后以皮内注射H22小鼠肝癌细胞方式构建小鼠肝癌模型，细胞接种量为2×106/mL，0.1mL/只。
接种完成当天(DAY 0)开始进行灌胃给药，对照组给予培养基，实验组给予MNH 46686菌，灌胃体积为0.2mL/只/次，给药频率为1天/次。检疫期每天、给药期每天给药后进行一般观察1次，在接收动物、检疫期结束、给药期每周3次需称量动物体重；肿瘤细胞接种7天(DAY 7)开始，每周进行3次肿瘤测量，并记录肿瘤生长情况。本实验终点为：灌胃给药完成19次。实验终点时，将全部小鼠用颈椎脱臼法执行安乐死。
实验结果见下表10。
表10.实验终点小鼠总体情况统计
图14为实验小鼠解剖后肿瘤组织大小对比图，图中左图为实验组，右图为对照组。
对小鼠解剖后肿瘤组织的重量进行统计，结果如下表11。
表11.小鼠解剖后肿瘤组织重量
结果显示，对照组肿瘤快速生长，在D19肿瘤组织达到均重约2.53g，实验组在第19天肿瘤组织均重约1.69g，生长速度明显慢于对照组。该实验证明MNH 46686可以明显降低肝癌的生长速度。表明本发明菌株可以抑制肿瘤生长，进而可用于肿瘤的预防和治疗。
实施例11.MNH 46686对肺癌的治疗效果验证实验
实验方法
验证菌株MNH46686是否具有治疗肿瘤的效果，利用小鼠同源肿瘤模型进行抑制肺癌生长实验。本实验方案已通过慕恩生物实验动物管理和使用委员会伦理审查。
供试菌株：将MNH46686菌种甘油冻存管在37℃下融化后，于厌氧工作站中接种于厌氧血平板上进行活化，将活化后的菌株接种于MM01液体培养基中，厌氧培养，获得足够数量的培养物，将培养好的菌液离心浓缩后用溶媒将菌体重悬，得到纯度和活菌数(1.0～2.0×109CFU/mL)满足动物实验要求的受试物。
肿瘤细胞：LLC1小鼠肺癌细胞，CL-0140。
(一)菌株MNH46686对肿瘤的治疗效果验证实
实验动物：实验用鼠为C57BL/6J小鼠，鼠龄5周，总共120只，购自广东药康生物科技有限公司。
动物实验：正常饲养，检疫期结束后，进行皮下接种LLC1肺癌细胞形成异位同源肿瘤模型，细胞接种量为2×106/mL，0.1mL/只。当肿瘤平均体积达到80-100mm3时，根据肿瘤体积分层随机分为2组，A组(Control)、F组(MNH46686)，B-E组为其他受试物，分组当天(D1)开始进行灌胃给药，对照组给予溶媒，F组给予MNH46686菌，灌胃体积为0.2mL/只/次，给药频率为1天/次。检疫期每天、给药期每天给药后进行一般观察1次，接收动物和检疫期结束称量动物体重，肿瘤接种后每周称量2次动物体重。肿瘤细胞接种当天为D1。D5至分组前，每天测量1次肿瘤直径；分组后每2天测量1次肿瘤直径；当肿瘤平均体积≥1000mm3开始每天测量1次肿瘤直径，并记录肿瘤生长情况，本实验终点为给药第20天。试验过程进行一般临床观察、体重监测、肿瘤体积(mm3)测量，到达试验终点后对全部存活小鼠进行解剖取材，测量量测肿瘤重量与计算肿瘤体积，最后进行肿瘤体积曲线变化(Tumor volume)、终点肿瘤体积(Tumor volume at endpoint)、终点肿瘤质量(Tumor weight at endpoint)与终点肿瘤抑瘤率(Tumor inhibition rate at endpoint，TGI)等统计分析与比较，抑瘤率：(对照组平均体积一实验组体积)/对照组平均体积×100％，所有数据采用mean±SD形式表示，用GraphPad Prism 8.0.2软件绘图和统计分析。对于两两比较，采用t检验(Student’s t test)分析方法，对于双因素考察则透过双因素方差(2way ANOVA)搭配Sidak多重比较进行分析，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
实验终点(D21)时，对存活小鼠进行解剖，称重肿瘤组织，结果汇总如下表。
表12实验终点小鼠总体情况统计
结果显示，试验期间，F组(MNH46686)的肿瘤体积曲线统计分析结果显著小于A组(Control)(如图15(A))。试验终点时，对照组小鼠平均肿瘤体积是1136.39mm3，肿瘤组织均重约1.33g；MNH46686处理组小鼠平均肿瘤体积是751.78mm3，肿瘤组织均重约0.74g，MNH46686处理组小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显小于对照组(表12、图15(B)和15(C))。试验终点，F组(MNO-863)的肿瘤生长抑制率(TGI)为36.3％(如图15(D))，明显提高了肿瘤生长抑制率。
实施例12.MNH 46686的细胞流式检测结果
本实施例探究MNH46686激活小鼠免疫分析。
实验原理：
取荷瘤小鼠的组织制备成单细胞悬液后，标记带有荧光分子标记的特定分子，可在流式细胞仪中检测到表达特定分子的细胞比例。免疫细胞的比例分布，一定程度上体现小鼠免疫状态。
实验方法：
一、肿瘤组织
1.肿瘤单细胞悬液制备及细胞计
取0.3g肿瘤组织，用PBS冲洗表面后剪成小块并粉碎，将粉碎的肿瘤组织置于5mL胶原酶IV消化液体系中(1mg/ml胶原酶IV，0.1mg/ml DNA酶，10％FBS)37℃消化处理30min；消化处理的组织液经70um滤膜过滤，制成小鼠肿瘤单细胞悬液，上机检测，计算总细胞数。
2.肿瘤细胞表面T细胞/NK细胞染色
取小鼠肿瘤单细胞悬液，分别加入染料(相应的抗体组合)T-Live-Tumor/NK-Live-Tumor、T-Tumor/NK-Tumor进行肿瘤细胞表面T细胞/NK细胞染色，染色后的细胞使用PBS重悬，上机检测。
3.肿瘤细胞胞内转录因子Foxp3染色
取小鼠肿瘤单细胞悬液，依次加入染料(相应的抗体组合)Treg-Live-Tumor、Treg-Surface-Tumor进行染色，染色后的细胞使用PBS重悬；随后，按照检测试剂盒说明书依次使用固定液、破膜液处理，使用Treg-Foxp3-Tumor核内染色进行染色；染色后的细胞使用PBS重悬，上机检测。
二、外周血
取外周血，进行红细胞裂解步骤：加入红细胞裂解液进行裂解5min，加入PBS终止裂解，500g离心去上清；再重复一次红细胞裂解后，PBS重悬即得外周血单细胞悬液。取小鼠外周血单细胞悬液，分别加入染料T-Live-Blood/NK-Live-Blood、T-Blood/NK-Blood进行外周血细胞表面T细胞/NK细胞染色，染色后的细胞使用PBS重悬，上机检测。
三、脾脏组织
1.脾脏单细胞悬液制备及细胞计数
取0.1g脾脏组织，用PBS冲洗表面后进行组织粉碎，将粉碎的脾脏组织悬于PBS中，经70um滤膜过滤，制成小鼠脾脏单细胞悬液，上机检测。
取少量上述制备的小鼠脾脏单细胞悬液，依次加入红细胞裂解液、Spleen-Counting、预冷PBS等，完成上机检测，准确计数小鼠脾脏单细胞数值。
取剩余上述制备的小鼠脾脏单细胞悬液，依次加入红细胞裂解液、PBS等进行细胞处理，处理后的细胞悬液过300目滤膜后，上机检测。
2.脾脏细胞表面T细胞/NK细胞染色
取小鼠脾脏单细胞悬液，分别加入染料T-Alexa Fluor647 anti-mouse FOXP3-SP/NK-Alexa Fluor647anti-mouse FOXP3-SP、T-Live-SP/NK-Live-SP、T-SP/NK-SP进行脾脏细胞表面T细胞/NK细胞染色，染色后的细胞使用PBS重悬，上机检测。
3.脾脏细胞胞内转录因子Foxp3染色
取小鼠脾脏单细胞悬液，依次加入染料Treg-Fcblock-SP、Treg-Live-SP、Treg-Surface-SP进行染色，染色后的细胞使用PBS重悬；随后，按照检测试剂盒说明书依次使用固定液、破膜液、Treg-SP核内染色进行染色；染色后的细胞使用PBS重悬，上机检测。
实验结果：
结合图16-图17，外周血中各免疫细胞比例结果显示，与对照组相比，小鼠外周血中的NK比例显著上调，CD45+CD3+、CD45+CD4+、CD45+CD8+等免疫T细胞均呈上调趋势(参见图16中G～J)；分析外周血中各免疫细胞与肿瘤终点体积的相关性(参见图17)，可知肿瘤终点体积与外周血中NK细胞比例显著负相关，与其他免疫细胞比例相关性不显著。由此可知，MNH46686可通过提高小鼠外周血中的NK比例激活小鼠系统性免疫，发挥抗肿瘤作用。
肿瘤组织中M2巨噬细胞比例、免疫抑制Treg细胞、杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞(参见图16中A～F)，与对照组相比，小鼠肿瘤组织中杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞比例呈上调趋势，M2巨噬细胞、免疫抑制Treg细胞呈下调趋势；分析肿瘤组织中以上细胞与肿瘤终点体积的相关性(参见图17中A～F)，可知肿瘤终点体积与肿瘤组织中免疫抑制Treg细胞、M2巨噬细胞比例显著正相关，与肿瘤组织中肿瘤杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞的比例显著负相关；分析肿瘤组织中免疫抑制Treg细胞、杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞与肿瘤重量的相关性(参见图18)，可知肿瘤重量与肿瘤组织中免疫抑制Treg细胞比例显著正相关，与肿瘤组织中肿瘤杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞的比例显著负相关；由此可知，MNH46686可通过抑制小鼠肿瘤中M2巨噬细胞比例、免疫抑制Treg细胞，提高肿瘤杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞激活小鼠肿瘤局部免疫，发挥抗肿瘤作用。菌株MNH46686可通过刺激小鼠免疫系统活化发挥抗肿瘤活性作用。
实施例13.MNH 46686与PD-1抗体联用对肺癌肿瘤的治疗效果验证实验：
1.实验方法
验证菌株MNH46686与PD-1抗体联用对治疗肿瘤的效果，利用小鼠同源肿瘤模型进行抑制肺癌生长实验。本实验方案已通过慕恩生物实验动物管理和使用委员会的审查。
供试菌株：将MNH46686菌种甘油冻存管在37℃下融化后，于厌氧工作站中接种于厌氧血平板上进行活化，将活化后的菌株接种于MM01液体培养基中，厌氧培养，获得足够数量的活菌，将培养好的菌液离心浓缩后用溶媒将菌体重悬，得到纯度和活菌数(9.23×108CFU/mL)满足动物实验要求 的受试物。
肿瘤细胞：LLC1小鼠肺癌细胞，货号CL-0140。
实验动物：实验用鼠为C57BL/6J小鼠，鼠龄5-6周，总共108只，购自广东药康生物科技有限公司。
动物实验：正常饲养，检疫期结束后，进行皮下接种LLC1肺癌细胞形成异位同源肿瘤模型，细胞接种量为2×106/mL，0.1mL/只。当肿瘤平均体积达到60-100mm3时，根据肿瘤体积分层随机分为8组，A组(Negative Control)、B组(Positive Control，PD-1)、E组(MNH46686&PD-1)，C、D、F-H组为其他受试物,分组当天开始给药，A组给予溶媒和生理盐水，B组给予溶媒和PD-1抗体；E组给予MNH46686和PD-1抗体；溶媒和MNH46686灌胃给药，灌胃体积为0.2mL/只/次，给药频率为1天/次，共给药20次；PD-1抗体及生理盐水为腹腔注射给药,给药剂量为10mg/kg，给药频率为每3天1次，共给药6次。接收动物和检疫期结束称量动物体重；肿瘤接种后每周称量2次动物体重，其中需进行腹腔注射给药的当天称量动物体重；肿瘤细胞接种当天为D1。D5至分组前，每天测量1次肿瘤直径；分组后，每3天测量1次肿瘤直径；并记录肿瘤生长情况，试验终点为给药第23天，实验过程进行一般临床观察、体重监测、肿瘤体积(mm3)测量，到达实验终点后对全部存活小鼠进行解剖取材，测量肿瘤重量与计算肿瘤体积，最后进行肿瘤体积曲线变化(Tumor volume)、终点肿瘤体积(Tumor volume at endpoint)、终点肿瘤质量(Tumor weight at endpoint)与终点肿瘤生长抑瘤率(Tumor Growth Inhibition at endpoint，TGI)等统计分析与比较，肿瘤生长抑制率(TGI)＝1-(个体肿瘤体积-分组时个体肿瘤体积)/(A组肿瘤平均体积-分组时A组肿瘤平均体积)×100％，所有数据采用mean±SD形式表示，用GraphPad Prism 8.0.2软件绘图和统计分析。对于三个以上的组相互比较，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法与搭配Tukey’s多重比较分析(Tukey’smultiple comparisons test)进行分析。，对于双因素考察则透过双因素方差(2way ANOVA)搭配Sidak多重比较进行分析，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
2.菌株MNH46686与PD-1抗体联用对肺癌肿瘤治疗的实验结果
实验终点(D24)时，对存活小鼠进行解剖，称重肿瘤组织，结果汇总如表13。
表13实验终点小鼠总体情况统计
结果显示，实验期间，E组(MNH46686&PD-1)的肿瘤体积曲线统计分析结果显著小于A组(Negative Control)、B组(Positive Control)(如图19)。实验终点时，阴性对照组小鼠平均肿瘤体积是1279.80mm3，肿瘤组织均重约达1.28g；阳性对照组(Positive Control)小鼠平均肿瘤体积是710.29mm3，肿瘤组织均重约达0.92g；MNH46686&PD-1抗体处理组小鼠平均肿瘤体积是346.99mm3，肿瘤组织均重约达0.47g。相较于阴性对照组，MNH46686&PD-1抗体处理组小鼠的终点肿瘤体积和肿瘤重量显著下调，相较于阳性对照组，MNH46686&PD-1抗体处理组小鼠的终点肿瘤体积和肿瘤重量均呈下调趋势(图20、图21)。实验终点，B组(Positive Control)的肿瘤生长抑制率(TGI)为47.3％，E组(MNH46686&PD-1)的肿瘤生长抑制率(TGI)为77.2％，明显高于阳性对照组(图22)。实验终点,A组(Negative Control)的应答率为20.0％，B组(Positive Control)的应答率为60.0％，E组(MNH46686&PD-1)的应答率为87.5％，MNH46686与PD-1抗体联用明显提高治疗肿瘤的应答率(图22)。图中数据采用平均值±标准差(Mean±SD)显示，统计分析采用双因素方差(2way ANOVA)搭配Sidak多重比较进行分析，差异显著性用*表示，*p＜0.05。
实施例14.菌株MNH46686对组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDAC)活性的抑制 作用
为验证MNH46686是否对组蛋白去乙酰化酶活性具抑制作用，本研究使用购买的Abcam公司的HDAC Inhibitor Drug Screening Kit(Fluorometric)试剂盒进行体外的HDAC活性抑制作用的检测。
MNH46686培养上清制备：将菌株MNH46686接种在液体培养基中，37℃厌氧培养48小时，离心去除菌体，培养上清用0.22μm滤器进行过滤，分装，收集物置于-80℃冷冻保存，待用。
检测样品准备：1)Control组，MM01培养基用PBS进行10倍稀释得到含10％的MM01；2)阳性对照组：TSA，HDAC的抑制剂，用PBS稀释成终浓度为40μM；3)MNH46686组，MNH46686培养上清用PBS进行10倍稀释得到含10％细菌上清的实验样品。
HDACs检测反应试剂配制：根据试剂盒说明书配制适量的检测反应体系，每个反应需50μL反应试剂。
HDACs活性检测：在96孔白板中加入50μL检测样品，然后分别加入50μL反应试剂，充分混匀，37℃孵育30min，加入10μL Lysine Developer到反应孔中并充分混匀，终止反应。板子置于37℃孵育30min。最后利用酶标仪检测样品的荧光强度。酶标仪设置，Ex.＝350-380nm，Em.＝440-460nm。样品的HDACs抑制活性分析，将Control的荧光强度值设定为100％，阳性对照组和MNH46686的荧光强度分别除以Control再乘以100％，可得到相对的HDACs活性。
结果显示(见图23)，与Control组的HDACs活性相比较，MNH46686的上清对HDAC活性具显著的抑制作用，与HDACs抑制剂对照组TSA的作用相似。这些结果提示，MNH46686能够抑制HDAC活性，MNH46686能通过抑制HDAC活性，用于预防或治疗HDAC活性介导的疾病。
HDAC在癌症中的功能与促进细胞增殖和致瘤表型的基因的异常表达或功能有关。在某些癌症中，HDAC主要调节癌症的发作，并被描述为癌基因。HDAC表达的活性降低或抑制已显示具有多种抗癌作用，例如细胞周期停滞和抑制增殖，凋亡，分化和衰老以及破坏血管生成。因此，本发明的菌株MNH46686具有抑制HDAC活性，提示本发明的药物或组合物可以用于预防或治疗HDAC活性介导的肿瘤或癌症。由于HDAC调控的基因在血管生成中具有重要作用，因此本发明的药物或组合物可以用于肿瘤的预防转移。
糖尿病是其中低水平的胰岛素和/或外周胰岛素抵抗导致高血糖症的一组疾病。已提出抑制HDAC通过多种机制来治疗糖尿病，包括Pdxl的抑制(Park等，2008，J Clin Invest，118，2316-24)，增强转录因子Ngn3的表达以增加内分泌库。祖细胞(Haumaitre等，2008，Mol Cell Biol，28，6373-83)和增强胰岛素表达(Molsey等，2003，J Biol Chem，278，19660-6)等。HDAC抑制也是用于晚期糖尿病并发症如糖尿病性肾病和视网膜缺血的有希望的治疗方法(Christensen等，2011，Mol Med，17(5-6)，370-390)。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防HDAC活性介导的糖尿病。
本发明的组合物用于治疗或预防糖尿病。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防I型糖尿病。在优选的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防II型糖尿病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防糖尿病，其中所述治疗或预防通过减少或预防HDAC活化来实现。
本发明的菌株MNH46686能够抑制HDAC活性，激活T细胞，实现抗肿瘤的用途。
本发明的组合物具有HDAC抑制活性，因此它们可用于治疗HDAC活性介导的炎性肠病。
实施例15 MNH46686与PD-1联用激活小鼠免疫分析
取荷瘤小鼠的组织制备成单细胞悬液后，标记带有荧光分子标记的特定分子，可在流式细胞仪中检测到表达特定分子的细胞比例。免疫细胞的比例分布，一定程度上体现小鼠免疫状态。
实验方法：
取肿瘤组织，用PBS冲洗表面后剪成小块并粉碎，将粉碎的肿瘤组织置于5mL胶原酶IV消化液体系中(1mg/ml胶原酶IV，0.1mg/ml DNA酶，10％FBS)37℃消化处理30min；消化处理的组织液经70um滤膜过滤，制成小鼠肿瘤单细胞悬液，上机检测，计数组织中的总细胞数量。取小鼠肿瘤单细胞悬液，加入刺激剂刺激4h，清洗重悬细胞后，依次加入染料(相应的抗体组合)Live-Tumor、IFN/TNF-Surface-Tumor进行染色，染色后的细胞使用PBS重悬；随后，按照检测试剂盒说明书依次使用固定液、破膜液处理，使用IFN/TNF-Tumor核内染色进行染色；染色后的细胞使用PBS重悬，上机检测。
流式分析数据均用CyExpert处理，Graphpad Prism V9统计处理。统计分析采用one-way ANOVA with Dunnet’s multiple comparison,ns not significant*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
实验结果：
肿瘤组织中具有肿瘤杀伤性作用的免疫细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞(参见图24A～24D)，与阳性对照组(PD-1组)相比，MNH46686+PD-1组小鼠肿瘤组织中杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞比例呈上调趋势；分析阳性对照组(PD-1组)与MNH46686+PD-1组的肿瘤组织中以上细胞与肿瘤终点重量的相关性(参见图25A～25D)，可知肿瘤重量与肿瘤组织中肿瘤杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞的比例显著负相关；由此可知，MNH46686可通过提高肿瘤杀伤性细胞CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞、CD4+TNFα+细胞、CD4+TNFα+细胞激活小鼠肿瘤局部免疫，增强PD-1抗体的抗肿瘤作用。
实施例16菌株MNH46686在肺癌肿瘤中剂量的药效探索实验
1.2.1实验方法
探索菌株MNH46686的剂量对治疗肿瘤的效果，利用小鼠同源肿瘤模型进行抑制肺癌生长实验。本实验方案已通过慕恩生物实验动物管理和使用委员会的审查。
供试菌株：将MNH46686菌种甘油冻存管在37℃下融化后，于厌氧工作站中接种于厌氧血平板上进行活化，将活化后的菌株接种于MM01液体培养基中，厌氧培养，获得足够数量的活菌，将培养好的菌液离心浓缩后用溶媒将菌体重悬，得到纯度和活菌数(4.1×1010CFU/mL)满足动物实验要求的受试物。
肿瘤细胞：LLC1小鼠肺癌细胞，货号CL-0140。
实验动物：实验用鼠为C57BL/6J小鼠，鼠龄5-6周，总共60只，购自广东药康生物科技有限公司。
动物实验：正常饲养，检疫期结束后，进行皮下接种LLC1肺癌细胞形成异位同源肿瘤模型，细胞接种量为2×106/mL，0.1mL/只。当肿瘤平均体积达到60-100mm3时，根据肿瘤体积分层随机分为3组，A组(Negative Control)、B组(High-MNH46686)、C组(Low-MNH46686),分组当天开始给药，阴性对照A组(Negative Control)给予阴性对照品PBS-Cys(甘)、B组(high-MNH46686)给予MNH46686的10-1稀释液(8.2×108CFU/只)、C组(Low-MNH46686)给予MNH46686的10-2稀释液(8.2×107CFU/只),灌胃给药，灌胃体积为0.2mL/只/次，给药频率为1天/次，共给药21次。试验期间每天进行1次一般临床观察。接收动物和检疫期结束称量动物体重；肿瘤接种后每周称量2次动物体重。D5至分组前，每天测量1次肿瘤直径；分组后每2天测量1次肿瘤直径。当任一组肿瘤平均体积达到或超过1000mm3，且B组至C组中，任一组肿瘤平均体积显著小于A组或者该组平均肿瘤生长抑制率(TGI)达到或超过30％，则可选择终止试验；或者任何一组小鼠肿瘤平均体积达到或超过2000mm3，则终止试验，到达试验终点后对全部存活小鼠进行解剖取材或安乐死，测量肿瘤重量与计算肿瘤体积，最后进行肿瘤体积曲线变化(Tumor volume)、终点肿瘤体积(Tumor volume at endpoint)、终点肿瘤质量(Tumor weight at endpoint)与终点肿瘤生长抑瘤率(Tumor Growth Inhibition at endpoint，TGI)等统计分析与比较，肿瘤生长抑制率(TGI)＝1-(个体肿瘤体积-分组时个体肿瘤体积)/(A组肿瘤平均体积-分组时A组肿瘤平均体积)×100％，所有数据采用mean±SD形式表示，用GraphPad Prism 8.0.2软件绘图和统计分析。对于三个以上的组相互比较，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法与搭配Dunnett’s多重比较分析(Dunnett’smultiple comparisons test)进行分析。，对于双因素考察则透过双因素方差(2way ANOVA)搭配Sidak多重比较进行分析，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
1.2.2菌株MNH46686在肺癌肿瘤中剂量的药效探索实验结果
实验终点(D27)时，对存活小鼠进行解剖，称重肿瘤组织，结果汇总如表14。
表14实验终点小鼠总体情况统计

试验期间，除肿瘤造成的红斑、结痂、肿瘤空洞或体温偏低等状态外，全部小鼠未见其他异常。在试验终点，C组(Low-MNH46686)的肿瘤体积曲线统计分析结果显著小于A组(Negative Control)，其余各组与A组相比均无显著差异(如图26)。在试验终点(D27)，A组至C组的肿瘤平均体积分别为1067.54mm3、838.01mm3及561.50mm3，平均肿瘤重量分别为1.39g、1.18g及0.72g；在试验终点，B组至C组的肿瘤体积、肿瘤重量与A组相比如图27、图28所示。在试验终点，B组至C组的TGI分别为23.00％及50.30％；在试验终点，B组至C组的TGI与A组相比如图30所示。A组应答率为22.22％，B组应答率为33.33％，C组应答率为66.67％(如图30)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (16)

  1. 毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的16S rDNA或者与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.65％、98.7％、99％同一性，例如97％或98.7％或99％同一性的16S rDNA；
    所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中的至少一种；或者所述肿瘤为病毒感染引起的肿瘤或细菌感染引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染(HPV)、乙型或丙型肝炎感染(HBV,HCV)、人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、EB病毒感染引起的肿瘤，以及幽门螺杆菌(HP)感染、具核梭杆菌(F.nucleatum)感染引起的肿瘤。
  2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株包括毛螺菌科微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002；
    或者，所述毛螺菌微生物菌株与毛螺菌微生物菌株MNH 46686的平均核苷酸同一性ANI值为至少95％，优选地，所述平均核苷酸同一性ANI值为95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。
  3. 一种组合物，其包含毛螺菌科微生物菌株，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的16S rDNA或者与其具有至少90％同一性，例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.65％、98.7％、99％同一性，例如97％或98.7％或99％同一性的16S rDNA；优选地，所述组合物为口服组合物；
    优选地，所述组合物还包含可药用载体；
    优选地，所述毛螺菌科微生物菌株和可药用载体存在于肠溶衣中。
  4. 根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述毛螺菌微生物菌株包括毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002；
    或者，所述毛螺菌微生物菌株与毛螺菌微生物菌株MNH 46686的平均核苷酸同一性ANI值为至少95％，优选地，所述平均核苷酸同一性ANI值为95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。
  5. 如权利要求3-4任一项所述的组合物，其特征在于，其包含毛螺菌科微生物菌株活细胞或活细菌或减毒的细菌或经辐照的细菌或灭活的细菌或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或所述毛螺菌科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液。
  6. 如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括联用药物；所述联用药物选自化疗药物、光敏剂、光热剂、免疫治疗药物、增强细胞疗法药物中的至少一种；
    优选地，所述化疗药物包括紫杉醇、喜树碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星、丝裂霉素或表柔比星中的一种或多种；
    优选地，所述光敏剂包括硼二吡咯、二氢卟吩或孟加拉红的一种或多种；
    优选地，所述光热剂为吲哚菁绿、新吲哚菁绿或金纳米粒棒的一种或多种；
    优选地；所述免疫治疗药物包括PD-1抗体、CTLA-4抗体、PD-L1抗体、PD-L1抑制剂；更优选地，所述PD-L1抑制剂选自度伐单抗、阿替珠单抗或阿维单抗；所述PD-1抗体或PD-L1抗体选自帕博利珠单抗或纳武利尤单抗；所述CTLA-4抗体选自伊匹木单抗；更优选地，所述PD-1抑制剂的有效剂量为1～11mg/kg；优选地，PD-1的有效剂量包括：1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg或9mg/kg或10mg/kg；
    优选地；所述增强细胞疗法包括CAR-T；
    优选地，单位剂量的所述的组合物中微生物菌株的含量包括2×107～9×1010CFU/mL或1×106～2×1010CFU/mg的毛螺菌科微生物菌株菌；单位剂量优选为4×107CFU/mL、5×107CFU/mL、 6×107CFU/mL、7×107CFU/mL、8×107CFU/mL、1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、8×108CFU/mL、9×108CFU/mL、1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、3×109CFU/mL、4×109CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109CFU/mL、7×109CFU/mL、8×109CFU/mL、9×109CFU/mL、2×1010或1.2×106CFU/mg、4×106CFU/mg、5×107CFU/mg、6×107CFU/mg、7×107CFU/mg、8×107CFU/mg、9×107CFU/mg、1×108CFU/mg、2×108CFU/mg、3×108CFU/mg、4×108CFU/mg、5×108CFU/mg、6×108CFU/mg、7×108CFU/mg、8×108CFU/mg、9×108CFU/mg的至少一种。
  7. 如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体；优选地，所述载体选自稀释剂、分散剂、赋形剂、稳定剂、润滑剂、崩解剂中的一种或几种；
    优选地，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂和纳米制剂中的任一种。
  8. 如权利要求5所述的组合物，其中所述细菌中至少50％以上是活菌，例如90％以上是活菌。
  9. 如权利要求5所述的组合物，其中所述组合物呈以下形式：粉剂、微囊化粉剂、胶囊、片剂、锭剂、颗粒剂、乳剂、悬剂、栓剂、饮料、食品、药品或营养品、食品添加剂、膳食补充剂或乳制品。
  10. 权利要求3-9任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、感染性疾病、中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种疾病的药物中的应用。
  11. 权利要求3-9任一项所述的组合物在制备用于抗肿瘤或者抑制肿瘤生长的药物中的应用，
    优选地，抑制肿瘤生长包括以下至少一种：(a)抑制肿瘤体积增长；(b)抑制肿瘤重量增加；(c)抑制肿瘤细胞增长；(d)提高肿瘤治疗应答率；(e)提高免疫抑制药物治疗功效，例如提高PD-1药物治疗功效；(f)抑制肿瘤细胞转移；(g)降低PD-1耐药性；(h)提高外周血中的NK比例激活受试者系统性免疫；(i)通过SCFA中的乙酸、丙酸、丁酸或戊酸中的至少一种抑制HDAC活性；(j)通过SCFA中的乙酸、丙酸、丁酸或戊酸中的至少一种抑制肿瘤；(k)通过调节受试者免疫系统发挥免疫调节作用来抑制肿瘤；
    所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中中的至少一种；或者所述肿瘤为病毒引起的肿瘤或细菌引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染(HPV)、乙型或丙型肝炎感染(HBV,HCV)、人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、幽门螺杆菌感染(HP)、EB病毒感染引起的肿瘤，以及幽门螺杆菌(HP)感染、具核梭杆菌(F.nucleatum)感染引起的肿瘤。
  12. 权利要求3-9任一项所述的组合物在制备用于治疗和/或预防HDAC活性介导的疾病的药物中的应用，优选地，所述HDAC活性介导的疾病包括肿瘤、代谢性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病，感染性疾病，中枢神经性疾病、炎性肠病中的至少一种；优选地，所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中中的至少一种；或者所述肿瘤为病毒感染引起的肿瘤或细菌感染引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染(HPV)、乙型或丙型肝炎感染(HBV,HCV)、人类免疫缺陷病毒感染(HIV)、EB病毒感染引起的肿瘤，以及幽门螺杆菌(HP)感染、具核梭杆菌(F.nucleatum)感染引起的肿瘤。
  13. 毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液，其特征在于，所述毛螺菌科微生物菌株属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)的新属级新物种(Lachnospiraceae sp.)，所述毛螺菌科微生物菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
  14. 根据权利要求13所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液，其特征在于，所述毛螺菌微生物菌株包括毛螺菌微生物菌株MNH 46686，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Lachnospiraceae sp.MNH 46686，菌株的保藏编号为GDMCC No：62002。
  15. 一种治疗或预防肿瘤或糖尿病的方法，包括给予有需求的受试者有效量的权利要求13或14中所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产 物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液或者权利要求3-9任一项所述的组合物的步骤；
    优选地，所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中的一种或多种；或者所述肿瘤为病毒引起的肿瘤或细菌引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染、人类免疫缺陷病毒感染、幽门螺杆菌感染、EB病毒感染或具核梭杆菌感染引起的肿瘤；
    优选地，所述菌株是通过抑制肿瘤生长来预防和/或治疗肿瘤，抑制肿瘤生长包括以下至少一种：(a)抑制肿瘤体积增长；(b)抑制肿瘤重量增加；(c)抑制肿瘤细胞增长；(d)提高肿瘤治疗应答率；(e)提高免疫抑制药物治疗功效，例如提高PD-1药物治疗功效；(f)抑制肿瘤细胞转移；(g)降低PD-1耐药性；(h)提高外周血中的NK比例激活受试者系统性免疫；(i)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种抑制HDAC活性；(j)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种短链脂肪酸或短链脂肪酸盐抑制肿瘤；(k)通过调节受试者免疫系统发挥免疫调节作用来抑制肿瘤。
  16. 权利要求13或14中所述的毛螺菌科微生物菌株或所述毛螺菌科微生物菌株的培养物或毛螺科微生物菌株的代谢产物或毛螺菌微生物菌株的发酵培养液或发酵培养液的上清液或者权利要求3-9任一项所述的组合物，其用于预防和/或治疗肿瘤或糖尿病；
    优选地，所述肿瘤包括实体瘤、软组织肿瘤、造血肿瘤、腺体瘤或转移性肿瘤；优选地，所述肿瘤选自肝癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、胶质瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌、软骨肉瘤和纤维肉瘤中的一种或多种；或者所述肿瘤为病毒引起的肿瘤或细菌引起的肿瘤，例如人类乳头状瘤病毒感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染、人类免疫缺陷病毒感染、幽门螺杆菌感染、EB病毒感染或具核梭杆菌感染引起的肿瘤；
    优选地，所述菌株是通过抑制肿瘤生长来预防和/或治疗肿瘤，抑制肿瘤生长包括以下至少一种：(a)抑制肿瘤体积增长；(b)抑制肿瘤重量增加；(c)抑制肿瘤细胞增长；(d)提高肿瘤治疗应答率；(e)提高免疫抑制药物治疗功效，例如提高PD-1药物治疗功效；(f)抑制肿瘤细胞转移；(g)降低PD-1耐药性；(h)提高外周血中的NK比例激活受试者系统性免疫；(i)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种抑制HDAC活性；(j)通过SCFA中的乙酸或乙酸盐、丙酸或丙酸盐、丁酸或丁酸盐、戊酸或戊酸盐中的至少一种短链脂肪酸或短链脂肪酸盐抑制肿瘤；(k)通过调节受试者免疫系统发挥免疫调节作用来抑制肿瘤。
PCT/CN2023/102886 2022-12-29 2023-06-27 毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用 WO2024139107A1 (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211718259.0 2022-12-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024139107A1 true WO2024139107A1 (zh) 2024-07-04

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dzutsev et al. Microbes and cancer
WO2023126028A2 (zh) 毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用
WO2019178542A1 (en) Compositions for modulating gut microflora populations, enhancing drug potency and treating cancer, and methods for making and using same
TW201828963A (zh) 誘導cd8+ t細胞的組成物及方法
US20230158088A1 (en) Compositions for modulating gut microflora populations, enhancing drug potency and treating viral infections, and methods for making and using same
Saeed et al. Microbe-based therapies for colorectal cancer: Advantages and limitations
US20150104423A1 (en) Use of blood group status iii
EP2598155A2 (en) Use of blood group status iii
WO2017160944A2 (en) Compositions and methods for treating and preventing graft versus host disease
WO2022156119A1 (zh) 一种乳酸肠球菌、预防或治疗肿瘤的药物及应用
WO2023134203A1 (zh) 脆弱拟杆菌及其两性离子荚膜多糖在制备用于治疗呼吸系统肿瘤药物中的应用
WO2021143621A1 (zh) Anaerostipes sp B2131菌及其在炎症性肠病中的应用
WO2012103785A1 (zh) 唾液乳杆菌及其代谢物的制备方法和组合物以及应用
US20220378855A1 (en) Compositions for modulating gut microflora populations, enhancing drug potency and treating cancer, and methods for making and using same
WO2024139107A1 (zh) 毛螺菌科微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用
WO2021169627A1 (zh) Blautia sp B2132菌在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用
JP2024518084A (ja) 疾患を治療するための組成物及び方法
CN117083069A (zh) 用于治疗covid-19的益生菌组合物
WO2023208225A1 (zh) 药物组合物、巨球型菌及其应用
JP2023548834A (ja) スピルリナ構成要素を含む組成物
WO2024140860A1 (zh) 克里斯滕森菌或包含其的组合物在预防或治疗肿瘤中的用途以及包含其的药物
Hadad et al. In vivo evidence: Repression of mucosal immune responses in mice with colon cancer following sustained administration of Streptococcus thermophiles
WO2024141107A1 (zh) 柯林斯菌新菌种及其药物组合物
TWI817977B (zh) 活化腫瘤浸潤淋巴細胞之方法
Yan et al. Ligilactobacillus salivarius CCFM 1266 modulates gut microbiota and GPR109a-mediated immune suppression to attenuate immune checkpoint blockade-induced colitis