WO2024138276A1 - Polipéptido antimicrobiano micropacina k2, composición que lo comprende y uso para tratar infecciones bacterianas - Google Patents
Polipéptido antimicrobiano micropacina k2, composición que lo comprende y uso para tratar infecciones bacterianasInfo
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Abstract
Un polipéptido que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 1, donde dicho polipéptido tiene actividad antimicrobiana; Una composición antimicrobiana, que comprende dicho polipéptido, y opcionalmente un segundo agente antimicrobiano y un vehículo; Uso de la composición antimicrobiana para inhibir el crecimiento y proliferación de bacterias Gram positivo y Gram negativo.
Description
POLIPÉPTIDO ANTIMICROBIANO MICROPACINA K2, COMPOSICIÓN QUE LO COMPRENDE Y USO PARA TRATAR INFECCIONES BACTERIANAS
La presente invención se encuentra relacionada con el campo de la biología molecular y biotecnología aplicada al uso de péptidos de carácter bacteriano que poseen propiedades bactericidas o bacteriostáticas sobre diferentes microorganismos.
ANTECEDENTES
Durante las últimas décadas, el uso indiscriminado de antibióticos ha provocado que patógenos causantes de infecciones bacterianas en humanos no respondan a este tipo de tratamientos, generando resistencia, lo que representa actualmente, un grave problema de salud pública a nivel mundial. La disponibilidad de nuevas moléculas antimicrobianas para uso terapéutico ha disminuido considerablemente frente al aumento sostenido de la resistencia bacteriana a diferentes antibióticos de uso en clínica, llevando a la selección de bacterias patógenas multirresistentes, como Staphylococcus aureus resistente a meticilina y vancomicina (Mandal et al., 2015; Fussen et al., 2015; Ostojic et al., 2015) e incluso bacterias ambientales (Calisto et al., 2021, Orellana et al., 2022)
La rápida y efectiva resistencia mostrada por este tipo de bacterias ha limitado el uso de muchos de los antibióticos actualmente existentes, convirtiéndose en una creciente preocupación para los organismos de salud pública. Frente a esta compleja situación, diferentes iniciativas se han llevado a cabo por científicos a nivel mundial, lo que ha permitido desarrollar, por la Infectious Diseases Society of America (IDSA), el programa denominado ESKAPE, que considera a las bacterias resistentes Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp. Este acrónimo describe a los patógenos capaces de “escapar” de la acción de los antibióticos, representando nuevos paradigmas en relación con la patogénesis, transmisión y resistencia bacteriana (Rice, 2008). Por lo tanto, los patógenos ESKAPE, son cada vez más relevantes para la búsqueda de terapia antimicrobiana, conduciendo a estrategias innovadoras para el desarrollo de nuevas opciones antimicrobianas (Hijazi et al., 2018; Tommasi et al., 2015; Pendleton et al., 2013; Llaca-Díaz et al., 2012).
Desarrollo de antimicrobianos en la actualidad.
En la actualidad, si bien se han descubierto más de 23 mil antibióticos a partir de diferentes microorganismos (Manivasagan y et al., 2014), desde el año 1980 sólo han ingresado al mercado cinco nuevos antimicrobianos aprobados para su uso y aplicación en pacientes con infecciones causadas por agentes bacterianos de relevancia clínica. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el uso indiscriminado de los agentes terapéuticos existentes actualmente ha llevado a que patógenos bacterianos causantes de infecciones en humanos no respondan a este tipo de tratamiento, generando resistencia. En el mundo, la resistencia a antimicrobianos plantea una amenaza grave y cada vez mayor para la salud pública, siendo un problema creciente, que involucra cada día nuevas especies bacterianas y nuevos mecanismos de resistencia. Este fenómeno observado en los laboratorios de microbiología representa un problema clínico y dificulta el buen manejo de pacientes que padecen distintas patologías infecciosas (Valenzuela y cois., 2003). En este sentido, el actual desarrollo de nuevos antimicrobianos no ha permitido responder al aumento de la resistencia bacteriana a múltiples antibióticos, incluso sobre bacterias que hoy en día se han reportado resistentes a todos los antibióticos disponibles, como es el caso de la denominada “bacteria asesina” Klebsiella pneumoniae, una bacteria pan-resistente reportada en Nevada, Estados Unidos, donde las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos indicaron que el aislado resultó resistente a 26 antibióticos, incluidos los aminoglucósidos, polimixinas, tigeciclina (un derivado de la tetraciclina desarrollado en respuesta a la emergente resistencia antimicrobiana) y colistina. (Chen et al., 2017). De esta forma, se ha generado una importante brecha entre la generación de nuevos compuestos antimicrobianos y el aumento de la resistencia, llevando a una amenaza latente frente al aumento de pacientes en riesgo con infecciones de tipo bacterianas (Boucher et al., 2009).
El desarrollo y descubrimiento de nuevos antimicrobianos se ha complicado en los últimos años, debido a las normativas que regulan la aprobación de nuevos medicamentos por la Food and Drug Administration (FDA), la competencia entre las compañías farmacéuticas y el costo económico y científico que implica (Shlaes et al., 2013; Wright et al., 2014). Sin embargo, pese a lo dificultoso de esta materia, es imperioso seguir con la búsqueda de nuevos antimicrobianos, debido a que la ciencia también tiene una misión social de mejorar la calidad de vida de las personas, logrando finalmente evitar que miles de pacientes mueran por infecciones de tipo bacteriana (Cooper y Shlaes, 2011).
Péptidos antimicrobianos.
El antagonismo bacteriano dado por péptidos antimicrobianos ha tomado importancia debido al efecto de alta toxicidad que presentan frente a un gran espectro de bacterias y a la baja resistencia generada (Maqueda et al., 2008). Diversos microorganismos presentes en la naturaleza producen péptidos antimicrobianos, que en condiciones naturales utilizan como mecanismo de adaptación y competencia contra otros microorganismos, inhibiendo su crecimiento y favoreciendo de esta forma, su establecimiento en el ecosistema bacteriano (Jenssen et al., 2006; Calisto et al., 2021).
Recientes investigaciones se han centrado en el aislamiento y caracterización de bacterias que habitan en ambientes extremos, específicamente en el continente Antartico, debido a que (se describe más adelante) es considerado un gran reservorio de biodiversidad bacteriana (Texeira et al., 2010). Las bacterias que crecen en estos ambientes compiten por mantenerse en un nicho ecológico, liberando moléculas que inhiben o matan a otros microorganismos. En específico, estos péptidos, polipéptidos o proteínas con propiedades antimicrobianas secretadas por bacterias, son denominadas bacteriocinas (Etayash et al., 2016; Riley et al., 2002; Nissen- Meyer, 1997).
Bacteriocinas.
Las bacteriocinas presentan una masa molecular variable y poseen distintos mecanismos de acción, niveles de actividad y propiedades fisicoquímicas (Stoyanova et al., 2012). Estos compuestos son sintetizados tanto por bacterias Gram positivo como por Gram negativo (Jeevaratnam et al., 2005).
En el caso de las bacterias Gram positivo, las bacteriocinas están estructuradas por 20 a 60 aminoácidos que presentan una alta actividad bactericida o bacteriostática contra cepas bacterianas relacionadas y microorganismos patógenos que dañan alimentos (Chen y Hoover, 2003). Poseen puentes disulfuro, tioéter o grupos tiol, son producidas durante la fase exponencial de crecimiento bacteriano (Cotter et al., 2005), presentan gran estabilidad frente a altas temperaturas, debido a formación de enlaces cruzados estables y a regiones hidrofóbicas (Beristain-Bauza et al., 2012; Alquicira, 2006; Chen y Hoover, 2003; Jack et al., 1995). Además, las bacteriocinas son inactivadas por algunas proteasas, característica que les permite, debido a su naturaleza proteica, ser inocuas para el hombre (Beristain-Bauza et al., 2012; Quintero, 2006). Presentan un gran espectro de acción antimicrobiano, mostrando inhibición, a concentraciones menores a 10 ppm, frente a otras bacterias patógenas Gram positivo y Gram
negativo como Clostridium botulinum, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli y algunas especies de Bacillus, aunque se ha demostrado que existe mayor inhibición contra bacterias Gram positivas (Jeevaratnam et al., 2005; Wu et al., 2004).
La síntesis de bacteriocinas está codificada en genes organizados en operones, los cuales pueden estar presentes en transposones, plásmidos o en el cromosoma bacteriano (Altena et al., 2000; Engelke et al., 1992). Su síntesis depende de la estructura genética, compuesta por:
• Un gen estructural, que codifica una pre-bacteriocina, el cual está formado por una secuencia señal amino -terminal que permite la estabilización durante la traducción, evitando que la bacteriocina se active dentro de la bacteria productora. Además, otorga una señal de reconocimiento para el sistema de transporte y mantiene la conformación de la pre-bacteriocina.
• Un gen de inmunidad, que permite la traducción de una proteína que otorga protección a la bacteria frente al efecto antimicrobiano de la propia bacteriocina y que está estrechamente ligado al gen estructural, formando parte de la misma unidad de transcripción. Es importante destacar que cada bacteriocina tiene su propia proteína de inmunidad, la cual se expresa junto con ella. Sin embargo, la homología entre las proteínas de inmunidad es sorprendentemente baja considerando la homología que presentan las bacteriocinas entre sí (Aymerich et al., 1996). Los análisis de hidrofobicidad de algunas proteínas de inmunidad revelaron que éstas poseen posibles segmentos transmembrana, lo cual indicaría que estos factores se localizan en el blanco de acción de la mayoría de las bacteriocinas, llevando a cabo así una protección “in situ” frente a la propia acción antimicrobiana (Fremaux et al., 1998).
• Un gen que codifica para un transportador ABC que excreta la bacteriocina y cataliza su procesamiento (Rebuffat, 2013; Nes et al., 1996; Harvarstein et al., 1994; Klaenhammer, 1993). El gen que codifica para el transportador ABC puede estar formando parte del mismo operón de la bacteriocina o en un operón distinto.
Los elementos consenso encontrados en la región del péptido señal se caracterizan por poseer dos residuos de glicina adyacentes y previos al sitio de procesamiento y dominios de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos separados por distancias conservadas. Los transportadores que reconocen los péptidos señal del tipo doble glicina (GG) contienen tres dominios, que pueden estar codificados en un mismo polipéptido o en polipéptidos separados (Rebuffat, 2013).
En el caso específico de bacteriocinas del tipo microcinas, estas se encuentran en un cluster de genes presentes en un plásmido o en el cromosoma bacteriano, que codifican para el precursor de la microcina, el gen de inmunidad, las proteínas que participan en la secreción (FIGURA *1) y en algunos casos, enzimas que participan en modificaciones postraduccionales (Duquesne et al., 2007; Thomas et al., 2004).
En general, las microcinas de clase I (MccB17, MccC7/C51 y MccJ25) son codificadas por un cluster de genes, donde el gen de autoinmunidad se encuentra lejano al gen estructural de la microcina. Adyacente al gen de la microcina se encuentran dos o tres genes involucrados en la modificación postraduccional y un gen involucrado tanto en la exportación, como en la autoinmunidad (Duquesne et al., 2007).
En el caso de las microcinas de clase II, se caracterizan por presentar al menos dos genes involucrados en la exportación. Estos genes, que son homólogos dentro de esta clase de microcinas, para ser funcionales requieren del producto del gen tolC el cual es aportado por el hospedero. El sistema genético de las microcinas de clase lia está compuesto por cuatro genes, organizados en dos operones, uno para el sistema de microcina e inmunidad y el otro para el sistema de exportación (Duquesne et al., 2007). El sistema genético de las microcinas de clase Ilb se encuentra codificado en el cromosoma bacteriano, presentando una compleja organización transcripcional, con genes involucrados en modificación postraduccional (Duquesne et al., 2007).
Aplicaciones de las bacteriocinas.
Las bacteriocinas presentan diversas aplicaciones tanto a nivel humano como animal, siendo una de las más importantes su potencial uso antibiótico frente a microorganismos y como alternativa frente a las terapias antibióticas usadas que actualmente presentan menos efectividad debido a la resistencia que se ha generado en cepas patógenas (Riley y Wertz, 2002). Difieren de los antibióticos tradicionales ya que actúan sobre un estrecho espectro de bacterias que están relacionadas con la cepa productora (Riley y Wertz, 2002). Por otra parte, las bacteriocinas son de importancia en la industria alimentaria , donde han sido empleadas como biopreserv antes y prebióticos, entre otros usos (Gillor et al., 2008; Ross et al., 2002), pero también en aplicaciones médicas y veterinarias (Tabla 1) ( Pieterse et al., 2010).
Pseudomonas y producción de moléculas antimicrobianas.
Como se ha mencionado anteriormente, diversos estudios han descrito que el género Pseudomonas es uno de los grupos bacterianos más diversos y ecológicamente significativos en el planeta. Miembros de este género han sido aislados de diferentes ambientes, como terrestre, acuático, marino, asociados a plantas, a animales y como se ha descrito más arriba, al continente antártico (Orellana etal., 2017; Matthijs etal., 2014; Spiers, 2000). Esta distribución universal sugiere un amplio rango de adaptabilidad fisiológica y genética, lo que permite una notable capacidad para producir, por ejemplo, moléculas antimicrobianas. Una mayor adquisición y análisis de secuencias del genoma completo de este género bacteriano, entrega información relevante sobre características fenotípicas de los aislados de Pseudomonas. Por su parte, recientes estudios realizados a partir de microorganismos del continente Antártico permitieron secuenciar el genoma de la bacteria Pseudomonas sp., aislado antártico a partir de la planta D. antárctica Desv. (Orellana et al., 2017).
El género Pseudomonas, en particular la especie P. aeruginosa, es reconocido por la producción de proteínas de alta masa molecular, con actividad antimicrobiana sobre otras especies de Pseudomonas, denominadas Pyocinas (Higerd et al., 1987; Sano y Kageyama, 1984). Existen tres tipos de pyocinas descritas hasta hoy:
• Pyocina tipo R corresponden a proteínas no flexibles que forman un complejo multiproteico, similar a la estructura contráctil de un bacteriófago. Ejercen su función mediante la formación de un poro o canal a en la membrana citoplasmática, provocando su despolarización (Michael-Briand and Baysse, 2002).
• Pyocina tipo S similares a las colicinas. Están formadas por una proteína grande y otra menor que se mantienen unidas. La proteína de mayor tamaño presenta la actividad antimicrobiana y la proteína de menor tamaño tiene función de inmunidad frente a la cepa productora (Michael-Briand and Baysse, 2002).
• Pyocina tipo F son proteínas con estructura flexible y con función similar a las pyocinas de tipo R.
Dentro de las moléculas antimicrobianas de tipo bacteriocina, se ha descrito la proteína LlpA, la cual presenta una masa molecular de 30 kDa y secretada por la cepa Pseudomonas sp. BW 1 IM 1. Presenta actividad antimicrobiana sobre cepas de Pseudomonas putida (Parret et al., 2002). Además, la proteína PsVplO con una masa molecular de 2,5 kDa, ha demostrado actividad antimicrobiana sobre bacterias Gram positivo y Gram negativo (Padilla et al., 2002; Hubert et al., 1998).
El documento WO2020187822A1, describe la secuencia del genoma de Pseudomonas sp. CECT8708 (SEQ1), que contiene la secuencia de un marco de lectura abierto (ORF) con una similitud de 91.1% respecto a la Secuencia de la presente invención, describe además los usos de la bacteria en el control de infecciones bacterianas y/o fúngicas en una planta. Sin embargo, no menciona utilizar ORF incluido en su SEQ 1, para combatir específicamente: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica serovar Typhi, ni otras Enterobacterias.
El documento US20200178540A1, describe una secuencia (SEQ 1), con una similitud de 83.3% respecto a la Secuencia de la presente invención. Describe bioplaguicidas que tienen actividad contra especies de Erwinia, particularmente contra el fitopatógeno del fuego bacteriano Erwinia amylovora. También describe su uso como agente de control biológico contra el tizón del fuego(Fuego Bacteriano). Sin embargo, no menciona utilizar su SEQ 1, para combatir específicamente: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica serovar Typhi, ni otra Enterobacteria.
El documento WO2022184525A1, describe una secuencia (SEQ2), con una similitud de 84.3% respecto a la Secuencia de la presente invención. Describe su uso en el campo de Bioremediación, recuperación de metales. Sin embargo, no menciona utilizar su SEQ 2, para combatir específicamente: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica serovar Typhi, ni otra Enterobacteria.
El documento US20190191708A1, describe una secuencia (SEQ8), con una similitud de 89.1% respecto a la Secuencia de la presente invención. Describe cepas bacterianas, eficaces para
controlar, tratar o prevenir la infección de plantas solanáceas con Phytophthora infestans. También se proporcionan formulaciones bioplaguicidas que contienen una o más de las cepas bacterianas o extractos de las mismas, y el uso de las cepas bacterianas, extractos o formulaciones bioplaguicidas en el control, tratamiento y/o prevención de la enfermedad del tizón tardío de la patata. Sin embargo, no menciona utilizar su SEQ 8, para combatir específicamente: Escherichia cali, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica serovar Typhi, ni otra Enterobacteria.
El documento US8945540B2, describe composiciones para mejorar la actividad antibacteriana de la mieloperoxidasa y los métodos de uso de las mismas. Se describe su uso altamente eficaz en la inhibición de organismos tanto Gram positivo como Gram negativo, como, por ejemplo, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus Grupo C, Streptococcus Grupo F, Streptococcus Grupo G, Streptococcus pyogenes, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Acintobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophilia y Pasteurella multocida, Bacillus spp. y Clostridium spp., Aspergillis spp., Fusarium spp.., Trichophyton spp. Sin embargo, solo describe componentes químicos, de acción química, no se describe el uso de proteínas, péptidos, ni enzimas con acción antibiótica.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Problema Técnico
La presente invención busca proporcionar moléculas antimicrobianas que hagan frente a infección por crecimiento de bacterias Gram positivo y Gram negativo, patógenas humanas como: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella entericas serovar Typhi entre otras enterobacterias.
La presente invención describe un polipéptido antimicrobiano, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1:
ALSLSALTTTAHAADDMQKCFGVAEAGKNDCAAGAGTSCAGTSKVKDQANAWKL VPAGTCLKTPSATSPTGFGQEAAFTAKS ; donde dicho polipéptido es secretado y tiene actividad antimicrobiana.
La presente invención también describe una composición antimicrobiana, que comprende dicho polipéptido antimicrobiano de SEQ ID 1; y opcionalmente un segundo agente antimicrobiano y un vehículo.
La presente invención describe que en dicha composición antimicrobiana, el vehículo se selecciona de entre: un solvente orgánico, solvente acuoso, solvente no acuoso, un amortiguador de pH y agua destilada.
La presente invención describe que en dicha composición antimicrobiana, el polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID 1 se encuentra en una concentración de 100-2.000 UA/mL.
La presente invención describe que en dicha composición antimicrobiana, el polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID 1 se encuentra a una concentración de 200 UA/mL.
La presente invención describe que en dicha composición antimicrobiana, el segundo agente antimicrobiano se selecciona del grupo de bacteriocinas, antibióticos betalactámicos y antibióticos del tipo tetraciclinas.
La presente invención también describe el uso de dicha composición antimicrobiana porque sirve para inhibir el crecimiento y proliferación de bacterias Gram positivo y Gram negativo.
La presente invención describe que dicho uso, sirve para inhibir el crecimiento de bacterias seleccionadas del grupo consistente en E. coli, E. coli O157:H7, Vibrio par ahaemoly tic s, Citrobacter freundii, Salmonella enterica , Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Klebsiella oxytoca, Kebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa entre otras bacterias Gram negativo.
La presente invención describe que, en dicho uso, el segundo agente antimicrobiano se selecciona del grupo de bacteriocinas, antibióticos betalactámicos y antibióticos del tipo tetraciclinas. Dicho uso sirve para inhibir el crecimiento de bacterias seleccionadas del grupo consistente en E. coli, E. coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus, Citrobacter freundii, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Klebsiella oxytoca, Kebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morgani, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Satphylococcus saprofiticus, Enterobacter sp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcs pyogenes,
Streptococcus mutans, Enterococcus f aecium, Enterococcus fae calis, Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus cereus, Bacillus subtillis y Cutibacterium acnés entre otras bacterias Gram negativo y Gram positivo.
La presente invención describe el uso de dicha composición, porque sirve para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de afecciones y/o enfermedades provocadas por bacterias Gram positivo y Gram negativo.
La presente invención describe el uso de dicha composición, porque sirve en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de bacterias seleccionadas del grupo consistente en: E. coli, E. coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus, Citrobacter freundii, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Klebsiella oxytoca, Kebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morgani, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Satphylococcus saprofiticus, Enterobacter sp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcs pyogenes, Streptococcus mutans, Enterococcus f aecium, Enterococcus fae calis, Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus cereus, Bacillus subtillis y Cutibacterium acnés entre otras bacterias Gram negativo y Gram positivo.
En la presente invención se realizó el aislamiento y caracterización de bacterias que habitan en ambientes extremos, específicamente en el continente Antartico, debido a que es considerado un gran reservorio de biodiversidad bacteriana. Las bacterias que crecen en estos ambientes compiten por mantenerse en un nicho ecológico, liberando moléculas que inhiben o matan a otros microorganismos.
Específicamente, la SEQ ID 1, corresponde a una secuencia polipéptidica que forma una molécula antimicrobiana con efecto inhibitorio sobre bacterias patógenas humanas. Esta SEQ ID 1 fue obtenida desde la bacteria antártica K2I15 (BA K2115), aislada desde la rizósfera de Deschampsia antárctica. Para ello, la BA K2I15 se caracterizó en base a morfología, tinción de Gram, actividad enzimática, susceptibilidad antimicrobiana y se secuenció el gen rRNA 16S. Se determinó el espectro de acción antimicrobiano de la BA K2I15 sobre bacterias patógenas humanas. Se secuenció su genoma y se identificó los elementos genéticos involucrados en la síntesis y secreción de una molécula antimicrobiana que inhibió el crecimiento de bacterias patógenas. Finalmente, se caracterizó la molécula con actividad antimicrobiana de tipo bacteriocina y su efecto sobre bacterias patógenas humanas. Los resultados bioquímicos y moleculares permitieron identificar a la BA K2I15 como una nueva bacteria perteneciente al
género Pseudomonas que presenta actividad antimicrobiana sobre bacterias patógenas Gram negativo.
De esta forma, la presente invención contribuye al desarrollo biotecnológico de los antimicrobianos, a través de la identificación y caracterización de una molécula proteica de tipo bacteriocina secretada por una bacteria antartica, que sirve como potencial tratamiento alternativo contra patógenos humanos resistentes a antibióticos en enfermedades infecciosas de origen bacteriano.
La presente invención describe la molécula de secuencia SEQ ID 1, obtenida desde la bacteria antartica Pseudomonas sp. K2I15, que fue aislada desde la rizosfera de Deschampsia antárctica. Dicha Molécula inhibe el crecimiento de bacterias patógenas humanas mediante actividad antimicrobiana de tipo bacteriocina.
EJEMPLOS
Ejemplo 1.
Identificación de bacteria antartica con actividad antibacteriana contra bacterias patógenas humanas.
A partir de los 55 aislados de bacterias antarticas, se identificó a la bacteria K2I15 que presentó efecto inhibitorio del crecimiento sobre la bacteria Gram negativo como E. cali, pero no contra la bacteria Gram positivo S. aureus ensayadas.
La bacteria K2I15 se identificó y caracterizó mediante métodos fenotípicos y métodos moleculares, con el fin de establecer las características metabólicas y genéticas que permitieron identificar la bacteria a nivel de género.
Métodos fenotípicos de identificación.
La BA K2I15 se caracterizó en base a color y textura de la colonia, morfología de la bacteria, tinción de Gram (Bartholomew y Mittwer, 1952) y temperatura óptima de crecimiento, determinada a 4°C, 18°C y 37°C. Como se muestra en la Tabla 2, la bacteria K2I15 presentó una colonia de color blanco, con textura mucoide y crecimiento a 4°C y 18°C, pero no a 37°C, características propias de una bacteria psicrófila. La morfología de la célula correspondió a un bacilo corto Gram negativo (Tabla 2).
Ejemplo 2
Identificación mediante pruebas bioquímicas. Para lograr identificar la BA K2I15, se establecieron las principales características metabólicas mediante pruebas bioquímicas convencionales, las que se realizaron considerando temperaturas de incubación de 4°C y 18°C. La bacteria presentó un metabolismo del tipo no fermentativo, movilidad, creció en medio citrato de Simmons y resultó positiva para la prueba de la ureasa en ambas temperaturas de incubación (Tabla 3). Estos resultados son característicos de una bacteria no fermentadora del género Pseudomonas.
Para complementar estos resultados se empleó el sistema API 20NE, el cual determinó el código de identificación 0046755 para la BA K2I15, correspondiente a la bacteria Pseudomonas fluorescens con un 84,1% de identidad. Este resultado permitió sugerir con mayor certeza que la BA K2I15 correspondería a una bacteria perteneciente al género Pseudomonas.
Con el fin de identificar a nivel genético la bacteria K2I15, se amplificó mediante PCR, el gen 16S ADNr a partir de ADN extraído de la bacteria. La secuenciación del gen 16S ADNr, entregó como resultado una secuencia de 1481 pb, la cual se analizó mediante BLAST en base a la comparación con secuencias presentes en la base de datos de GenBank, lo que permitió identificar a la BA K2I15 como Pseudomonas sp., perteneciente a la Familia y- Proteobacteria, con un 98% de identidad (Tabla 4).
Ejemplo 3
Se evaluó el efecto antagónico de la BA K2I15 sobre las bacterias patógenas K. oxytoca, K. pneumoniae, S. Typhi, S. boydii y A. baumannii mediante el método de antagonismo en placa. El ensayo se realizó en los medios de cultivo agar Nutritivo (Nut), agar Nutritivo a un tercio de su formulación (Nut 1/3), agar LB y agar LB a un tercio de su formulación (LB 1/3) y se consideró tres temperaturas distintas de incubación: 4°C, 18°C y 37°C. Los resultados mostraron que las condiciones dónde se obtuvo una mayor zona de inhibición de crecimiento de la cepa indicadora fue en medio de cultivo agar LB a 18 °C. Por lo tanto, se seleccionó esta condición de cultivo de la BA K2I15 para los experimentos posteriores (Tabla 5; Figura 1).
Ejemplo 4
Para establecer cuantitativamente la inhibición del crecimiento, mediante la liberación de una molécula difusible de tipo bacteriocina, se realizó un ensayo de antagonismo en placa usando membrana de diálisis como se mencionó anteriormente. Los resultados mostraron una disminución en al menos la mitad del tamaño de la colonia en comparación con el ensayo sin membrana (Figura 2a, b, c y d), observándose una clara inhibición del crecimiento de la bacteria K2I15 sobre las bacterias patógenas en estudio. Estos resultados indican que la molécula es de un tamaño inferior a 10 kDa, por lo tanto, atravesó la membrana de diálisis y difundió en el medio de cultivo, generando inhibición del crecimiento de las bacteria patógenas. En base a los resultados de inhibición del crecimiento de bacterias patógenas y con el fin de identificar los elementos genéticos que participan en la síntesis y secreción de la bacteriocina secretada por la bacteria K2I15 se secuenció el genoma de la bacteria bajo plataforma Ilumina. Los contigs de corta y baja cobertura se filtraron, resultando un conjunto de 186 contigs, con un promedio de cobertura de 97x (N50= 94.045 pb). El ensamble final para la bacteria K2I15 presentó una longitud total de 6,645,031 pb (6,6 Mb) con un contenido G+C de un 60,4% y 5996 ORFs (Tabla 6).
La anotación de la secuencia del genoma de la bacteria identificada como Pseudomonas sp. cepa K2I15, se realizó por el NCBI Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline (PGAAP), con el número de acceso NIXOOOOOOOOO (Orellana et al., 2017), dando lugar a 5.996 secuencias codificantes (CDS), 59 ARNt, 104 pseudo genes y 7 ARNr.
Para identificar en la secuencia del genoma de la BA K2I15 putativos clusters productores de metabolitos secundarios de tipo bacteriocina, se realizó un análisis bioinformático de los posibles genes asociados, mediante la plataforma bioinformática AntiSmash, la cual permitió, mediante comparación de las secuencias con otros clusters conocidos (Weber y cois., 2015), la identificación de dos clusters en el genoma de la BA K2I15, que contendrían genes candidatos para la síntesis de proteínas de tipo bacteriocina cluster 1 y 8). Estos genes, como en el caso de las microcinas, presentan una organización característica, conformada por un gen que codifica el precursor de la microcina, un gen que codifica para la proteína de inmunidad contra la propia bacteriocina y un que codifica un sistema de exportación (Kolter y Moreno, 1992).
El análisis bioinformático del cluster 1, permitió identificar 10 ORFs {Open Reading Frame) en el genoma de la BA K2I15. Para identificar la estructura característica de una bacteriocina de tipo microcina dentro de este cluster, se compararon las secuencias aminoacídicas derivadas de los distintos ORFs con secuencias previamente descritas para bacteriocinas, mediante la plataforma Blastp {NCBP). El análisis mostró que las secuencias aminoacídicas presentaron principalmente semejanzas con proteínas hipotéticas y no con proteínas de inmunidad, microcinas o transportadores antes descritos. Por lo tanto, la determinación de una posible proteína de inmunidad y un sistema de exportación se realizó en base a la presencia de entre 2 a 8 regiones transmembrana, característica propia de otras proteínas de inmunidad y transportadores descritos, como las correspondientes a las microcinas J25, H47 y V (Etayash et al., 2015). Para este análisis, se utilizó la herramienta bioinformática Phobius Prediction, la cual permitió identificar seis regiones transmembrana sólo en la secuencia aminoacídica derivada del ORF1_3. Por lo tanto, debido a esta característica y a su tamaño, podría corresponder a una proteína de inmunidad. Sin embargo, ninguno de estos análisis permitió identificar un sistema de exportación.
La secuencia candidata a bacteriocina correspondería al ORF1_6, debido a que la secuencia aminoacídica derivada presenta un motivo AG característico de la mayoría de las microcinas descritas, generando un residuo de 65 aminoácidos que correspondería a la proteína madura, con un péptido líder de 18 aminoácidos. Sin embargo, la comparación realizada mediante alineamiento múltiple de secuencias con la herramienta bioinformática Clustal Omega, no
presentó similitud con secuencias de otras bacteriocinas descritas, como la microcina E492 y microcina V. Por lo tanto, el análisis estructural de la organización genética del cluster 1, mostró una secuencia candidata a bacteriocina de tipo microcina, que se ubica cercana a un gen que podría codificar una proteína de inmunidad, pero no a un gen que codifique sistema de exportación.
Por su parte, el análisis bioinformático mediante AntiSmash del cluster 8, permitió identificar 12 ORFs en el genoma de la bacteria K2I15. Para identificar la estructura correspondiente a una bacteriocina de tipo microcina (genes de inmunidad, microcina y sistema de exportación), se compararon las secuencias aminoacídicas derivadas de estos ORFs con secuencias descritas en la base de datos GenBank empleando Blastp en NCBI. Este análisis mostró que la mayoría de los ORFs presentó semejanzas con proteínas hipotéticas, a excepción de los ORFs 33_34 y 33_35 que presentaron 100% de similitud con transportadores de ABC. Por lo tanto, ambos ORFs podrían corresponder a transportadores de tipo ABC que participan en la exportación de la microcina, encontrándose cercanos a posibles proteínas accesorias. El análisis realizado con la herramienta bioinformática Phobius Prediction (como se describió anteriormente), permitió identificar tres regiones transmembrana presentes en la secuencia amnoacídica derivada del ORF33_30, la cual correspondería a una proteína de inmunidad.
La secuencia aminoacídica derivada del ORF33_33 podría corresponder a una bacteriocina de tipo microcina, debido a la presencia de un motivo GS característico de este tipo de proteínas, generándose un residuo de 82 aminoácidos que correspondería a la proteína madura, con un péptido líder de 19 aminoácido (Tabla 7). Interesantemente, el análisis estructural de este cluster mostró que la secuencia aminoacídica candidata a microcina, se encuentra cercana a genes que codifican un sistema de exportación, con sus respectivas proteínas accesorias y un gen que codifica una proteína de inmunidad. Por lo tanto, esta organización genética posee las características básicas de una microcina, dónde la estructura está conformada por al menos tres tipos de genes: un gen que codifica el precursor de la microcina, un gen que codifica para la proteína de inmunidad contra la propia bacteriocina y un que codifica el sistema de exportación (Kolter y Moreno, 1992).
Características fisicoquímicas de ORF 1_6 y ORF33_33.
Para conocer las características fisicoquímicas de las proteínas candidatas a bacteriocinas (correspondientes al ORF1_6 y ORF33_33 respectivamente), se analizaron las secuencias aminoacídicas con la plataforma bioinformática ProtParam (Expasy.org). Esta plataforma entregó características asociadas a la estructura primaria de cada proteína, como número de
aminoácidos, masa molecular, punto isoeléctrico, índice de estabilidad, índice alifático y tiempo de vida media (Tabla 7).
El análisis de los resultados mostró que la proteína ORF1_6 está conformada por 83 aa, con una masa molecular de 8,3 kDa. El análisis de la secuencia de la proteína madura (sin la secuencia del péptido líder) presentó 65 aa y una masa molecular de 6,6 kDa. Por su parte, la proteína ORF33_33 está conformada por 101 aa con una masa molecular de 9,9 kDa. El análisis de la secuencia de la proteína madura (sin la secuencia del péptido líder) presentó 82 aa y una masa molecular de 8,0 kDa (Tabla 7). Por lo tanto, ambas proteínas presentaron una masa inferior a 10 kDa, característica relevante ya que corresponde al tamaño descrito para una bacteriocina de tipo microcina.
Otra característica importante es el punto isoeléctrico de 8.26 para la proteína madura ORF1_6 y 7.89 para ORF33_33 (Tabla 7). El índice de inestabilidad indicó que ambas proteínas maduras son estables debido a que presentaron valores inferiores a 40. El índice alifático define el volumen relativo ocupado por las cadenas laterales alifáticas: alanina, valina, isoleucina y leucina, las que pueden ser interpretadas como un factor positivo para el aumento de la termoestabilidad (Gill et al., 1989; Kite et al., 1982), condición relevante y similar a la obtenida por las moléculas que presentaron actividad antimicrobiana, debido a que resultaron estables a 80 °C. Finalmente, el tiempo de vida media para todas las proteínas fue superior a las 10 h, lo cual hace referencia a una proteína estable.
Los resultados de inhibición de crecimiento frente a otras bacterias producidos por la bacteria K2I15, en conjunto con la búsqueda bioinformática en su genoma de elementos genéticos que codifican para la síntesis de bacteriocinas, permitieron establecer que el cluster 1 y el cluster 8 presentes en el nodo 1 y 33 respectivamente, contendrían los elementos genéticos que participan en la síntesis y secreción de una molécula de tipo bacteriocina, específicamente una microcina. Por lo tanto, las secuencias correspondientes al ORF1_6 y ORF33_33 que codificarían una bacteriocina de tipo microcina, se seleccionaron para ser expresados en E. cali mediante un sistema de expresión heterólogo denominado ProBac.
Para verificar que las proteínas recombinantes producto de los genes ORF1_6 y ORF33_33 son expresadas y secretadas, se realizó un ensayo de detección de actividad antimicrobiana en placa sobre las bacterias indicadoras K. oxytoca y K. pneumoniae, donde el cultivo inicial se indujo con IPTG ImM. Los resultados mostraron que el sistema de expresión heteróloga para el gen ORF1_6, sintetizó una proteína recombinante carente de actividad antimicrobiana. Sin embargo, para el gen ORF33_33 el sistema de expresión sintetizó una proteína con actividad antimicrobiana en ambas cepas indicadoras, debido a que se observó una zona de inhibición de crecimiento (Figura 3). Esta proteína recombinante, obtenida mediante el sistema de expresión heterólogo se denominó MicroPacina K2.
Ejemplo 5
Purificación de la proteína recombinante MicroPacina K2.
La proteína recombinante MicroPacina K2, se purificó el sobrenadante de E. coli clon 33 previamente inducida, a través de una columna hidrofóbica Sep-Pack C18, mediante elución con una gradiente escalonada de metanol y agua entre 10-100%. Para establecer el perfil de elución de cada fracción obtenida desde la columna, se determinó la generación de zonas de
inhibición del crecimiento sobre el césped de la bacteria indicadora K. oxytoca (Figura 4). MicroPacina K2 eluyó principalmente en las fracciones 80% y 90% de metanol, con 6400 UA/mL en este último porcentaje de metanol.
Además, se determinaron las fracciones que presentaron mayor actividad biológica mediante ensayos de actividad en placa sobre las bacterias patógenas indicadoras K. oxytoca y K. pneumoniae. Los resultados mostraron que en las fracciones 80 y 90 se observó una zona de inhibición de crecimiento frente a ambas bacterias indicadoras, tanto sobre césped (Figura 5), como sobre agar blando (Figura 6).
La proteína MicroPacina K2 eluyó entre las fracciones 80% y 90% de metanol, con una actividad de 3200 UA/mL y 6400 UA/mL respectivamente, demostrando que corresponde a una proteína hidrofóbica. La concentración de la proteína fue de 34,2 mg/mL en la fracción 80% y 47,5 mg/mL en la fracción 90%. Estos resultados permitieron determinar que la actividad específica fue mayor en la fracción 90% (Tabla 8). Por este motivo se empleó MicroPacina K2 purificada en esta fracción en los siguientes ensayos.
La SDS-PAGE se realizó con la fracción 90% para verificar la presencia de la proteína MicroPacina K2. Se observó una banda proteica de 8.3 kDa aproximadamente (Figura 7). Estos resultados concuerdan con los mostrados anteriormente mediante análisis bioinformático.
Para determinar si el efecto antimicrobiano in vitro de la proteína MicroPacina K2, ocurre mediante un mecanismo de acción de tipo bacteriostático o bactericida, se realizó un análisis cromogénico en placa sobre la cepa reportera E. coli HB101. La proteína MicroPacina K2 mostró actividad de tipo bactericida (Figura 8), debido a que se observó coloración azul alrededor de la zona de inhibición, esto debido a que la membrana interna de la bacteria reportera sufrió daño y, por lo tanto, X-gal ingresó a la bacteria. Debido a que se han reportado
bacteriocinas de baja masa molecular resistentes a condiciones extremas, como temperatura, pH y solventes, se determinó el efecto sobre la actividad antimicrobiana de MicroPacina K2.
Para determinar el efecto de la temperatura, se incubó 100 mL de MicroPacina K2 con actividad de 6400 UA/mL durante 1 h a diferentes temperaturas. La proteína MicroPacina K2 no modificó su actividad antimicrobiana bajo el efecto de ninguna de las temperaturas a las cuales se incubó, demostrando su termoestabilidad (Tabla 9).
Para determinar el efecto del pH, se resuspendió la proteína MicroPacina K2 en soluciones amortiguadoras con diferentes pH, según lo descrito en materiales y métodos. La proteína recombinante MicroPacina K2 mostró estabilidad frente a todo el rango de pH analizado, debido a que mantuvo su actividad en 6400 UA/mL (Tabla 10).
Para determinar el efecto de solventes, la proteína purificada MicroPacina K2 se resuspendió en diferentes solventes, según lo descrito en materiales y métodos. Los resultados mostraron que la actividad de la proteína MicroPacina K2 se mantuvo estable frente a todos los tratamientos, excepto frente a isopropanol (Tabla 11). Como control se utilizaron los mismos solventes sin la proteína recombinante.
Para verificar la estabilidad a proteasas de MicroPacina K2, la fracción 90% se trató con la enzima proteolítica proteinasa K durante 2 h. La actividad antimicrobiana de MicroPacina K2 mostró una disminución frente a esta enzima (Tabla 12), confirmando la naturaleza proteica de esta bacteriocina de tipo microcina.
Ejemplo 6
Para determinar el espectro de acción antimicrobiano de MicroPacina K2, se realizaron ensayos de detección en placa sobre las bacterias patógenas en estudio. MicroPacina K2 mantuvo el perfil de inhibición mostrado en los ensayos en base a colonias de la BA K2I15 frente a las bacterias indicadoras K. oxytoca, K. pneumoniae, A. baumannii, S. boydii, S. sonnei y E. coli.
Sin embargo, MicroPacina K2 mostró un efecto inhibitorio del crecimiento sobre las bacterias patógenas E. coli O157:H7, V. parahaemolyticus, Eterobacter sp., S. enterica, S. flexneri, C. freundii, P. aeruginosa , demostrando que MicroPacina K2 purificada en la fracción 90% ejerce una acción antimicrobiana sobre un espectro de acción más amplio de bacterias patógenas humanas.
Actividad antibacteriana de composiciones que comprenden MicroPacina K2.
Se prepararon diferentes composiciones que comprendieran el polipéptido MicroPacina K2 en diferentes vehículos: metanol 10% p/v, glicerol 10% p/v, polietilenglicol 0,5% p/v y agua. Para el caso del polipéptido MicroPacina K2 se utilizó a una concentración de 200 UA/mL en cada composición.
De cada una de las composiciones preparadas, se tomó una alícuota de 5 pL y se adicionó en una placa con medio Mueller Hinton que contenía la bacteria indicadora de sensibilidad, sembrada previamente en forma de césped. Luego, las placas se incubaron durante 24 horas y se observó la actividad antibacteriana de las composiciones según la aparición y tamaño del halo de inhibición. Este ensayo, a su vez, se realizó bajo las mismas condiciones con la bacteriocina comercial Nisina como agente de comparación, la cual es considerada una bacteriocina gold estándar por estar aprobada por la FDA Food and Drug Administration).
De acuerdo con lo observado en el ensayo de inhibición, las composiciones con MicroPacina, independiente del vehículo utilizado, son capaces de inhibir el crecimiento de las bacterias Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Listeria monocytogenes, Echerichia coli 0157, Citrobacter freundii, Shigella sonnei (Tabla 14).
Cuando se comparan los resultados obtenidos para las composiciones que comprenden el polipéptido MicroPacina K2 y las que comprenden nisina, se observa que las composiciones que comprenden MicroPacina son capaces de generar una inhibición principalmente para bacterias Gram negativo.
Cabe destacar que para el caso de las bacterias Echerichia coli O157:H7 y Shigella sonnei, nisina no es capaz de inhibir su crecimiento (no se evidencia halo de inhibición), mientras que las composiciones que comprenden la bacteriocina MicroPacina K2 inhiben efectivamente su crecimiento.
Ejemplo 8:
Actividad antibacteriana de composiciones que comprenden MicroPacina K2 y un agente antibacteriano adicional. En este ejemplo se evalúa el efecto antibacteriano de composiciones que comprenden el polipéptido MicroPacina K2 y un agente antibacteriano adicional, incluyendo nisina (5.000 UA/mL), ampicilina (0,01 pg/mL) y tetraciclina (0,05 pg/mL). El ensayo se realizó utilizando agua destilada como vehículo de la composición. La concentración final de MicroPacina K2 en las composiciones evaluadas fue de 200 UA/mL. Los resultados permiten indicar que la combinación de MicroPacina K2 con otros agentes antimicrobianos inhibe el crecimiento de las cepas indicadoras ensayadas (Tabla 15).
CONCLUSIONES
La presente invención se centra en la identificación y caracterización de una bacteria que secreta moléculas antimicrobianas de tipo bacteriocina, aislada desde un ambiente extremo como el continente Antártico, específicamente en la rizósfera de Deschampsia antárctica, debido a que esta zona rizosférica presenta una peculiar diversidad y competencia bacteriana (Texeira et al., 2010). En este aspecto, la interacción que se da entre el suelo y las raíces de esta planta, permite el desarrollo de un microambiente complejo, que promueve el crecimiento y la diversidad de comunidades microbianas (Haldar et al., 2015) donde los microorganismos producen péptidos antimicrobianos que en condiciones naturales utilizan como mecanismo de adaptación y competencia contra otros microorganismos, inhibiendo su crecimiento y favoreciendo su establecimiento en el ecosistema bacteriano (Jenssen et al., 2006).
Debido a que la BA K2I15 corresponde a una bacteria ambiental que se aisló de la rizósfera de D. antárctica en el continente antártico, no se contaba con mayores antecedentes sobre su taxonomía. Por lo tanto, esta bacteria se caracterizó mediante métodos fenotípicos y métodos moleculares, con el fin de establecer las características metabólicas y genéticas que permitieran su identificación. La caracterización morfológica, celular y macroscópica y las condiciones de crecimiento de BA K2I15 son consistentes con lo reportado por Barrientos y et al. (2008) y Berrios et al. (2012), quienes han descrito la presencia de bacterias Gram negativo del género Pseudomonas aisladas desde ambientes fríos, específicamente de la rizósfera de D. antárctica.
La proteína deducida a partir del ORE1_6 tiene una masa molecular de 6,6 kDa como proteína madura (sin el péptido líder) y la proteína deducida del ORE33_33 presenta una masa molecular de 8,0 kDa sin la secuencia del péptido líder. Por lo tanto, ambas proteínas presentaron una masa inferior a lOkDa, característica relevante ya que corresponde al tamaño descrito para una bacteriocina de tipo microcina (Corsini et al., 2010; Rebuffat, 2013) y concuerdan con los resultados descritos en los experimentos de antagonismo con membranas de diálisis, donde el tamaño de la molécula con efecto inhibitorio resultó inferior a lOkDa.
Debido a que las proteínas de tipo microcina presentan alta hidrofobicidad (Óscariz y Pisabarro, 2001) y solubilidad en solventes orgánicos (Kolter y Moreno, 1992), la purificación de MicroPacina K2 se realizó mediante cromatografía, empleando columnas hidrofóbicas Sep-Pack C18 (de Lorenzo, 1984). La proteína eluyó principalmente en la fracción 90% de metanol-agua, por lo que MicroPacina K2 presenta una alta hidrofobicidad, y esto se correlaciona con lo descrito en la literatura para bacteriocinas de baja masa molecular del tipo microcinas de clase II (Baquero y Moreno, 1984). Resultados similares fueron obtenidos por Ferrer (2011) quien describió la elución de una bacteriocina de tipo microcina, aislada a partir de P. aeruginosa 0400 en la fracción 80% metanol-agua, la cual presentó actividad antimicrobiana sobre cepas patógenas de bacterias Gram positivo.
Variaciones en la temperatura y pH no afectaron la actividad de MicroPacina K2 purificada, incluso considerando que las soluciones tampones empleadas presentan un mayor índice de polaridad en comparación al metanol y que por lo tanto podría haber afectado la conformación estructural de la microcina, lo que confirma lo descrito en literatura, dónde se destaca que la mayoría de las bacteriocinas de baja masa molecular son resistentes a condiciones extremas, tanto de pH como temperatura (Héchard y Sahl., 2002; Guillor et al., 2004). Además, estos resultados permitieron corroborar los resultados obtenidos mediante análisis bioinformáticos, manteniendo las características antes descritas para la bacteriocina MicroPacina K2.
Si además se considera que la proteína recombinante MicroPacina K2, presentó una masa inferior a 10 kDa, mantendría las tres características descritas que son propias de las bacteriocinas de tipo microcina: moléculas de baja masa molecular (inferiores a 10 kDa), resistencia a pH y termoestabilidad (Kolter y Moreno, 1992; Gu i llore? al., 2004; Rojaseí al., 2014).
La utilización de un ensayo en medio cromogénico (Mardones y Venegas, 2000) permitió establecer que tanto la proteína secretada por la BA como la proteína recombinante MicroPacina K2 ejercería su acción inhibitoria frente a bacterias patógenas mediante un efecto de tipo bactericida, lo cual indicaría que probablemente su blanco de acción se localiza en la membrana interna de la célula blanco. Este mecanismo de acción ha sido descrito para otras bacteriocinas como la Ent35-MccV que presenta este tipo de actividad bactericida
contra E. coli enterohemorrágica y Listeria monocytogenes (Acuña et al., 2012), así como para microcina E492 (Lagos et al., 2001).
Los resultados de antagonismo en placa sobre bacterias patógenas mostraron que tanto la BA K2I15 como MicroPacina, inhibieron el crecimiento de bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriacea, como K. oxytoca y K. pneumoniae, Shigella boydii, Shigella sonnei, E. coli O157:H7, entre otras. La inhibición del crecimiento de estas especies por MicroPacina resulta relevante, debido a que estas bacterias son agentes causales de enfermedades de importancia clínica para el ser humano, como las infecciones nosocomiales, relevantes tanto en Chile como a nivel mundial (Hijazi et al., 2018; Tommasi et al., 2015; Pendleton et al., 2013; Llaca-Díaz et al., 2012; Livermore, D. 2012). Además, estas bacterias presentan resistencia a los principales antibióticos usados hoy en día, situación por la cual la comunidad médica y científica está en alerta (Eganeí al., 2017). Por lo tanto, esta nueva bacteriocina de tipo microcina producida y caracterizada en esta invención, representa una nueva alternativa para hacer frente a este escenario.
La presente invención proporciona una nueva molécula bioactiva con actividad antimicrobiana: una bacteriocina de tipo microcina denominada MicroPacina K2, obtenida a partir de una nueva bacteria identificada como Pseudomonas sp. K2I15 (Orellana et al., 2017) aislada de la rizósfera de planta antártica D. antárctica, para su potencial uso en biomedicina en el campo de los antimicrobianos, lo cual permitiría hacer frente al aumento significativo de la resistencia bacteriana.
DESCRIPCIÓN DE FIGURAS
Figura 1.- Inhibición del crecimiento de bacterias patógenas humanas por la BA K2I15 en diferentes medios de cultivo a 18 °C, en base al ensayo de antagonismo sobre césped mediante el método de difusión en agar LB. a) Colonias de BA sobre césped de K. oxytoca en agar LB 1/3. b) Colonias de sobre césped de K. oxytoca en agar Nut. c) Colonias sobre césped de K. oxytoca en agar LB. La flecha gris indica la zona de inhibición de la BA KI15.
Figura 2.- Inhibición del crecimiento de bacterias patógenas humanas por la BA K2I15 mediante el método de difusión por membrana, a) y c) A, B y C corresponden a la BA K2I15 sembrada en agar blando sobre una membrana de diálisis e incubada a 4o C (a) y 18°C (b) durante 24 h. Posteriormente, se retiró la membrana con agar blando, se sembraron las distintas bacterias patógenas sobre cada placa con agar LB y se incubaron a 37°C durante 24 h. Como control (D) se empleó agar blando sin la BA K2I15 sobre una membrana de diálisis. 1=K. pneumoniae, 2= K. oxytoca; 3= S. sonnei; 4= A. baumanni. A, B y C, réplicas de cada bacteria patógena, b) y d) Diámetro (mm) de colonia de las bacterias patógenas K. pneumoniae, K. oxytoca, S. sonnei y A. baumannii por efecto de la molécula difusible de tipo bacteriocina secretada por la BA K2I15 a 4°C (a) y 18°C (b). p<0,05.
Figura 3.- Detección de actividad en placa con la proteína recombinante MicroPacina K2 obtenida mediante el sistema de expresión heterólogo. Ensayo realizado con 5pL de sobrenadante sin purificar de la bacteria 33 sobre bacterias patógenas, a) K. pneumoniae; b) K. oxytoca.
Figura 4.- Perfil de elución de la proteína MicroPacina K2 mediante cromatografía en columna C18 con una gradiente escalonada de metanol. En el eje izquierdo se muestra el parámetro de seguimiento, que corresponde a la actividad antimicrobiana en UA/mL (línea continua), en el eje derecho se muestra la gradiente de concentración de metanol utilizada (línea segmentada).
Figura 5. Detección de actividad en placa de la proteína MicroPacina K2 con las fracciones purificadas mediante columna C18. Panel superior: ensayo sobre césped de la bacteria patógena K. pneumoniae. Panel inferior: ensayo sobre césped de la bacteria patógena K.
oxytoca. 80% y 90% representan las fracciones de metanol donde eluyó la proteína recombinante MicroPacina K2. Control +: Control positivo. Control Control negativo.
Figura 6. Detección de actividad en placa de la proteína MicroPacina K2 con las fracciones purificadas mediante cromatografía en columna C18. Panel superior: ensayo sobre agar blando de la bacteria patógena K. pneumoniae. Panel inferior: ensayo sobre agar blando de la bacteria patógena K. oxytoca. 80% y 90% representan las fracciones de metanol donde eluyó la proteína recombinante MicroPacina K2. Control +: Control positivo. Control -: Control negativo.
Figura 7.- Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de MicroPacina K2 purificada. Carril 1, estándar de masa molecular (kDa); Carril 2, MicroPacina K2; Carril 3, sobrenadante purificado; Carril 4, control negativo. 10, 15, 20 y 25 corresponden al estándar de masa molecular en kDa.
Figura 8.- Efecto antimicrobiano de la proteína MicroPacina K2. Ensayo realizado mediante el método de Mardones y Venegas (2000). El color negro oscuro alrededor de la zona de inhibición de crecimiento indica un efecto de tipo bactericida de la molécula de antibacteriana. El color blanco alrededor de la zona de inhibición de crecimiento indica un efecto de tipo bactericida de la molécula antibacteriana, a) MicroPacina K2 purificada, presenta color blanco alrededor de la zona de inhibición de crecimiento, b) Control bactericida (Ampicilina). c) Control bacteriostático (Tetraciclina).
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Claims
1. Un polipéptido antimicrobiano, CARACTERIZADO porque corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1, donde dicho polipéptido tiene actividad antimicrobiana.
2. Una composición antimicrobiana, CARACTERIZADA porque comprende un polipéptido según la reivindicación 1 , opcionalmente un segundo agente antimicrobiano y un vehículo.
3. Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADA porque el vehículo se selecciona de entre: un solvente orgánico, solvente acuoso, solvente no acuoso, un amortiguador de pH y agua destilada.
4. Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 2 y 3, CARACTERIZADA porque el polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1 se encuentra en una concentración de 100-2.000 UA/mL.
5. Una composición antimicrobiana de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 4 CARACTERIZADA porque el polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1 se encuentra a una concentración de 200 UA/mL.
6. Una composición antimicrobiana de acuerdo con las reivindicaciones 2 a 5 CARACTERIZADA porque el segundo agente antimicrobiano se selecciona del grupo de bacteriocinas, antibióticos betalactámicos y antibióticos del tipo tetraciclinas.
7. Uso de la composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 2 a 6, CARACTERIZADO porque sirve para inhibir el crecimiento y proliferación de bacterias Gram positivo y Gram negativo.
8. Uso de la composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 7 CARACTERIZADA porque sirve para inhibir el crecimiento de bacterias seleccionadas del grupo consistente en:
E. coli, E. coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus, Citrobacter freundii, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Klebsiella oxytoca, Kebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morgani, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Satphylococcus saprofiticus, Enterobacter sp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcs pyogenes, Streptococcus mutans, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus cereus, Bacillus subtillis y Cutibacterium acnés entre otras bacterias Gram negativo y Gram positivo.
9. Uso de la composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 2 a 6, CARACTERIZADO porque sirve en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de afecciones y /o enfermedades provocadas por bacterias Gram positivo y Gram negativo.
10. Uso de la composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque sirve en la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de bacterias seleccionadas del grupo consistente en E. coli, E. coli O157:H7, Vibrio parahaemolyticus, Citrobacter freundii, Salmonella enterica, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Klebsiella oxytoca, Kebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morgani, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Satphylococcus saprofiticus, Enterobacter spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococcs pyogenes, Streptococcus mutans, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Bacillus cereus, Bacillus subtillis y Cutibacterium acnés entre otras bacterias Gram negativo y Gram positivo.
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| WO2024138276A1 true WO2024138276A1 (es) | 2024-07-04 |
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