WO2024117233A1

WO2024117233A1 - 一粒子生物分析のための方法及び装置

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Publication number: WO2024117233A1
Application number: PCT/JP2023/042988
Authority: WO
Inventors: 健石井; 康司小檜山; 英雄根岸; ブルジュテミズオズ; 智哉林
Original assignee: 国立大学法人東京大学
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-06-06

Abstract

本発明は細胞外微粒子を特性評価するための方法等を提供する。本発明は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；前記特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、前記代表ベクトルの成分のうちの少なくとも前記検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成することと；前記第１の散布図に基づいて、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することと；を含む、細胞外微粒子の分析方法を提供する。

Description

一粒子生物分析のための方法及び装置

　本発明は、一粒子生物分析のための分析方法、分析装置、及び分析試料の調製方法等に関する。

　生体内には核酸などの生理活性分子を含んだ数十ナノメートルから数マイクロメートルの細胞外微粒子が存在し、様々な疾患への関与が注目されている。例えば、インフルエンザウイルス感染時には、ウイルス粒子以外にも宿主細胞由来の小胞やNeutrophil extracellular trapsなどの核酸が細胞外へ放出され、病態形成に関与する。したがって、これらの細胞外微粒子の定量は、疾患の病態、並びにワクチン及び治療薬の効果を評価するための新たな指標となりうる。しかしながら、タンパク質レベル及び一細胞レベルの解析法は確立されている一方、細胞外微粒子を一粒子レベルで分析する有用な手法は未だ確立されていない。

　近年、細胞外小胞をはじめとしたナノ粒子を一粒子解析すべく、フローサイトメトリーが注目されている。フローサイトメトリーは細胞解析のために開発されたツールであることから、細胞の１／１００のサイズのナノ粒子をフローサイトメトリー解析することは、これまで技術的に困難であった。しかしながらフローサイトメーターの検出感度が改善されるにしたがって、散乱光に基づくサイズ計測、及び蛍光標識抗体又は低分子蛍光試薬による１～２カラー解析が報告されている（非特許文献１～４）。

Brittain, G.C.IV. et al. A Novel Semiconductor-Based Flow Cytometer with Enhanced Light-Scatter Sensitivity for the Analysis of Biological Nanoparticles. Sci. Rep. 9, 16039 (2019). Danielson, K.M. et al. Diurnal Variations of Circulating Extracellular Vesicles Measured by Nano Flow Cytometry. PLoS One 11, e0144678 (2016). van der Vlist, E.J. et al. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat. Protoc. 7, 1311-1326 (2012). Morales-Kastresana, A. et al. Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry. Sci. Rep. 7, 1878 (2017).

　しかしながら、これまでに報告されている解析技術では微粒子の情報の一部、例えば特定のマーカータンパク質又は構成分子の情報しか得ることができない。

　したがって、本発明の目的は、細胞外微粒子を特性評価するための方法、及び装置等を提供することである。

　本発明の一態様に係る細胞外微粒子の分析方法は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成することと；第１の散布図に基づいて、マッピングされた複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することと；を含む。

　この分析方法は、細胞外微粒子の集団を、細胞外微粒子に光を照射した際に検出される散乱光及び複数の発光に基づいて生成されるベクトルの類似度に基づいて２次元又は３次元上にマッピングするため、サイズ及び構成成分等の複数の特徴を踏まえて細胞外微粒子の集団の類似度の分布を可視化することができる。また、当該マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、類似度の分布が可視化された複数の細胞外微粒子に、細胞外微粒子の構成成分の特徴に関する情報をさらに付与することができる。そして、そのようにして得られた第１の散布図に用いることで、複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することができる。このように、本態様に係る分析方法は、細胞外微粒子の集団の特性を一粒子レベルでクラスター分析することができ、細胞外微粒子の集団の特性を包括的に明らかにすることができる。

　上記態様に係る分析方法は、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を第１の散布図と同様にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにおいて代表ベクトルの成分の検出した複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つを可視化することにより、第２の散布図を作成することをさらに含むことが好ましい。第２の散布図を上記のようにして作成することで、第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子について、例えば所定の構成成分を多く含む又はほとんど含まない細胞外微粒子、及びその細胞外微粒子が属するクラスターを特定することができる。

　また、この態様において、第１及び第２の散布図を表示することと；表示された第１及び第２の散布図に基づいて、クラスターのうちの少なくとも１つの特性を同定することと；をさらに含むことが好ましい。本態様によれば、第１の散布図と第２の散布図とをユーザが対照することができ、第１の散布図におけるクラスターのうちの少なくとも１つに含まれる細胞外微粒子の、所定の構成成分の含有量を確認することができ、当該クラスターがどのような細胞外微粒子を含むかということをより詳細に同定することができる。なお、第１及び第２の散布図を表示することは細胞外微粒子の分析装置及び／又はそれに備えられた情報処理部が実施してよく、特性の同定は細胞外微粒子の分析装置及び／若しくはそれに備えられた情報処理部、並びに／又はユーザが実施してよい。

　上記態様に係る分析方法は、第１又は第２の散布図の作成において、代表ベクトルの成分の検出した複数の発光に対応する複数の成分のうちの全てが閾値以下である細胞外微粒子をマッピングから除外することが好ましい。本態様によれば、分析対象としている細胞外微粒子の構成成分の全ての含有量が低い細胞外微粒子を分析から除外することができ、上記の第１の散布図の作成やクラスター分析の精度を一層高めることができる。

　上記態様に係る分析方法において、細胞外微粒子の集団は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖からなる群より選択される少なくとも３種が染色された細胞外微粒子の集団であることが好ましく、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の全てが染色された細胞外微粒子の集団であることがより好ましい。本態様によれば、上記の第１の散布図の作成やクラスター分析の精度を一層高めることができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析方法は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類することと；を含む。

　この分析方法は、細胞外微粒子の集団を、細胞外微粒子に光を照射した際に検出される散乱光及び複数の発光に基づいて生成されるベクトルの類似度に基づいて２以上のクラスターに分類するため、サイズ及び構成成分等の複数の特徴を踏まえて複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することができる。このように、本態様に係る分析方法は、細胞外微粒子の集団の特性を一粒子レベルでクラスター分析することができ、細胞外微粒子の集団の特性を包括的に明らかにすることができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析方法は、細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；細胞外微粒子の集団を上記態様に係る分析方法のいずれかにより分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子の特性を分析することと；を含む。

　この分析方法は、上記態様に係る分析方法のいずれかにより細胞外微粒子の集団を分析した分析データに基づいて、細胞外微粒子を分析する方法である。したがって、別途分析した細胞外微粒子の集団の分析結果を利用して細胞外微粒子を分析することができるため、より簡便に細胞外微粒子を分析することができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分離方法は、細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；細胞外微粒子の集団を上記態様に係る分析方法のいずれかにより分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断することと；細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離することと；を含む。

　この分離方法は、上記態様に係る分析方法のいずれかにより細胞外微粒子の集団を分析した分析データに基づいて、細胞外微粒子の集団から所定の特性を有する細胞外微粒子を分離する方法である。この方法によれば、細胞外微粒子の集団から特定の特性を有する細胞外微粒子のみを分離することができ、当該細胞外微粒子をさらに分析することなどができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析装置は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；検出された散乱光及び複数の発光に基づいて細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、取得した特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する散布図作成手段、並びに第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成するクラスター生成手段を含む情報処理部と；を備える。

　この分析装置によれば、上記態様に係る分析方法を実施することができる。すなわち、本態様に係る分析装置は、細胞外微粒子の集団の特性を一粒子レベルでクラスター分析することができ、細胞外微粒子の集団の特性を包括的に明らかにすることができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析装置は、細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；検出された散乱光及び複数の発光に基づいて細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに細胞外微粒子の集団を上記態様に係る分析方法のいずれかにより分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子の特性を分析する特性分析手段を含む情報処理部と；を備える。

　この分析装置によれば、上記態様に係る分析方法のいずれかにより細胞外微粒子の集団を分析した分析データに基づいて、細胞外微粒子を分析することができる。したがって、別途分析した細胞外微粒子の集団の分析結果を利用して細胞外微粒子を分析することができるため、より簡便に細胞外微粒子を分析することができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分離装置は、細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；検出された散乱光及び複数の発光に基づいて細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに細胞外微粒子の集団を上記態様に係る分析方法のいずれかにより分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する判断手段を含む情報処理部と；細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離する分離部と；を備える。

　この分離装置は、上記態様に係る分析方法のいずれかにより細胞外微粒子の集団を分析した分析データに基づいて、細胞外微粒子の集団から所定の特性を有する細胞外微粒子を分離することができる。この分離装置によれば、細胞外微粒子の集団から特定の特性を有する細胞外微粒子のみを分離することができ、当該細胞外微粒子をさらに分析することなどができる。

　本発明の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析試料の調製方法は、細胞外微粒子の集団を含む試料を、細胞外微粒子の構成成分に結合する複数の標識物質により標識することを含む。この調製方法は、上記態様に係る分析方法のいずれかに用いる細胞外微粒子の集団を含む試料を調製する方法の一例である。

　この調製方法において、複数の標識物質は、核酸染色試薬、タンパク質染色試薬、脂質染色試薬、及び糖鎖染色試薬からなる群より選択される少なくとも３種であると好ましい。また、複数の標識物質が、分子量が２万以下の化合物を含む場合も好ましい。これらの態様によれば、上記態様に係る分析方法により適した分析試料を提供することができる。

　本発明によれば、細胞外微粒子を特性評価するための方法、及び装置等を提供することができる。

本実施形態の細胞外微粒子の分析方法の一例を示すフローチャートである。本実施形態の細胞外微粒子の分析方法における情報処理の一例を示すフローチャートである。本実施形態の細胞外微粒子の分析装置の構成の一例を示す。本実施形態の細胞外微粒子の分析装置における情報処理部の機能的な構成の一例を示すブロック図である。本実施形態の細胞外微粒子の分析装置における情報処理部の物理的な構成の一例を示すブロック図である。ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘの最適化された前方散乱による細胞外微粒子の検出及びソーティングを示す。ａ，ｂ：ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘ（高分解能セルソーター）（ａ）、及びＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩ（従来のセルソーター）（ｂ）の光学系の概観である。ｃ－ｆ：１００、２００、５００、及び１０００ｎｍの蛍光ビーズの混合物を、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘ（ｃ）又はＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩ（ｄ）を用いたＦＳＣ閾値トリガーにより分析した。ＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩは、ノイズシグナルの飽和のために１００、２００、及び５００ｎｍビーズを検出できなかった。ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘ（１０００、５００、２００、及び１００ｎｍ）又はＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩ　（１０００ｎｍ）で検出されたビーズをソーティングし、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘで再分析した（ｅ，ｆ）。円グラフは、各ビーズの割合及びソートされたビーズの純度（チャートの中心）を示す。インフルエンザウイルス感染中のＢＡＬＦに含まれる細胞外微粒子のマルチパラメトリック分析を示す。ａ－ｃ：ＢＡＬＦを、インフルエンザウイルスに感染していないマウスから、又は感染後４日目のマウスから採取した。（ｂ）ＢＡＬＦ中の細胞と細胞外微粒子を、液滴形成なしでＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘで測定した。細胞外微粒子の形態を分析するために、ＢＡＬＦを４００×ｇで遠心分離し、上清中の細胞外微粒子を、ネガティブ染色後に透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。（ｃ）ＢＡＬＦ中の細胞外微粒子は、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＣｅｌｌＭａｓｋ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄ、ＢＶ５１０　ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、ＣＦ０５Ｍ　ＷＧＡ、ＣＦ５６８　ＰＮＡ、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　Ｎｅａｒ－ＩＲ、及びＲ－ＰＥ－ＣＦ６４７Ｔ　抗ＨＡ抗体で染色後、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘで測定した。ｄ：ｂで検出されたすべての細胞外微粒子をｔ－ＳＮＥにより分析した。染色された各粒子は、図中に示された色によって可視化された。各チャネルの強度は、ヒートマップとして示される。ｅ：ノイズシグナル及び染色されていない粒子を後続のｔ－ＳＮＥ分析から除外するためのゲーティング戦略の概観である。各色の染色粒子をゲートし、「or」ゲートを設定して抽出した。ｆ：染色粒子をｔ－ＳＮＥで分析した結果をｄと同様に示す。ＢＡＬＦにおける細胞と細胞外微粒子の両方のマルチパラメトリック分析によるウイルス感染の重症度の評価を示す。ａ，ｂ：ＬＤ_５０が０．１、１、又は１０であるＰＲ８ウイルスに感染させたマウス、又は非感染マウスに由来するＢＡＬＦを、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＢＶ５１０　ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ、ＣＦ５６８　ＰＮＡ、並びにＨＡ、ＣＤ１１ｃ、ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ、ＣＤ３ｅ、Ｌｙ６Ｇ及びＬｙ６Ｃの抗体で染色した。細胞及び染色された粒子をゲートし、ｔ－ＳＮＥによって分析した。（ａ）各群の細胞（上段）及び染色粒子（下段）のｔ－ＳＮＥ分析の代表的なデータを示した。各細胞集団又は染色粒子は、図に示された色により可視化された。（ｂ）２分間の測定における各粒子及び細胞の数を示した。フローサイトメトリーソーティングによる染色粒子の高性能精製を示す。ａ：ＬＤ_５０が１０であるＰＲ８ウイルスに感染させたマウス由来のＢＡＬＦを、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＣｅｌｌＭａｓｋ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄ、ＣＦ４０５Ｍ　ＷＧＡ、ＬｉｖｅＤｅａｄ　Ｎｅａｒ－ＩＲ、及びＲＰＥ－ＣＦ６４７Ｔ抗ＨＡ抗体で染色した。ｃに示されたゲート戦略に従って、ＨＡ陽性、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性、ＷＧＡ陽性、ＰＮＡ陽性、アネキシンＶ陽性、及びＣｅｌｌＭａｓｋ陽性粒子をソートした。ソートされた粒子の再分析は、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄでソートされた画分の染色後に実施した。分画遠心分離（ＤＣ）又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でもＢＡＬＦを処理し、未精製試料についても同じように測定した。精製されていない試料、及びＤＣ又はＳＥＣで精製された試料中に検出された染色粒子はゲートし、「or」ゲートを設定することにより抽出し、ｔ－ＳＮＥによって分析した。ソートした画分中の標的粒子についてもゲートし、「or」ゲートを設定した後にｔ－ＳＮＥ分析に供した。円グラフは、ｔ－ＳＮＥプロットでゲートされた各集団の割合を示す。ｂ：等容量のソート画分から全ＲＮＡを抽出した。ＰＲ８セグメント５ウイルスＲＮＡの量は、ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量した。ｃ：各集団をソートした際のゲート戦略。ＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓ８による、１００、２００、５００、及び１０００ｎｍの蛍光ビーズの混合物のソーティングを示す。ＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓ８による、インフルエンザウイルス感染中のＢＡＬＦに含まれる細胞外微粒子のマルチパラメトリック分析を示す。ＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓ８による、染色粒子の高性能精製を示す。

　以下、図面を参照して本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付して表している。図面は模式的なものであり、必ずしも実際の寸法や比率等とは一致しない。図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることがある。

［分析方法］
　本実施形態の細胞外微粒子の分析方法は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成することと；第１の散布図に基づいて、マッピングされた複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することと；を含む。

　本実施形態の分析方法は、各細胞外微粒子のサイズ及び構成成分等の複数の特徴を一粒子レベルで取得し、得られたデータを情報処理により解析することにより、細胞外微粒子を、複数の情報に基づいてクラスター分析する。これにより、生体由来サンプルに含まれる多様な細胞外微粒子から疾患の発症、疾患の原因、及び／又は予後予測のバイオマーカーとなる細胞外微粒子を特定することができる。また、環境中微粒子、又は医薬品等に含まれる様々なナノ粒子を一粒子レベルで特性評価することも可能である。

　細胞に対して多色染色を行い、細胞を複数の情報に基づいて分析する方法は既知であるが、本実施形態の分析方法はそのような多色細胞分析とは全く異なる分析手法である。すなわち、細胞外微粒子は細胞と比較して表面積が１００～１，０００，０００分の１程度であり、体積が１，０００～１，０００，０００，０００分の１程度であるため、染色試薬の嵩高さに起因して、細胞外微粒子は細胞と同様の方法では多色染色することが困難である。そのため、上記の非特許文献をはじめとする既存の先行技術においても細胞外微粒子の多色解析は実施されておらず、１又は２つの構成成分を染色することで特定のマーカータンパク質の解析がされているに過ぎない。すなわち、これまで細胞外微粒子を複数の情報に基づいて一粒子レベルで包括的に分析する試みは皆無である。本実施形態の分析方法は、細胞外微粒子の複数の特徴を可視化することにより細胞外微粒子を一粒子レベルで包括的に分析することを可能にする。

　図１は、本実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。以下、本実施形態の分析方法について、適宜図面を参照しながら説明する。なお、図１及び以下の説明における分析方法は本実施形態の分析方法の一例であり、これらの記載により本発明を限定することを意図するものではない。例えば、本実施形態の分析方法は試料を調製する工程を含んでいなくてもよい。その場合、例えば既に細胞外微粒子の構成成分が標識された細胞外微粒子の集団を含む試料を入手して、分析を行えばよい。

（試料調製）
　図１において、まず本実施形態の分析方法に用いる試料を調製する。調製される試料は細胞外微粒子の集団を含む。分析試料中、細胞外微粒子は光照射により発光する構成成分を含んでいるか、そのような構成成分を含んでいない場合は、光照射により発光する標識物質が結合している構成成分を含む。したがって、試料の調製において、細胞外微粒子の構成成分に標識物質を結合させることを含むことが好ましい。光照射により発光する構成成分としては、例えばメラニン等の自家蛍光を生じる構成成分が挙げられる。

　本明細書中、「細胞外微粒子」とは、エクソソーム、微小小胞体及びアポトーシス小体のような細胞外小胞（extracellular vesicles）に加えて、タンパク質－核酸複合体のような細胞外粒子（extracellular particles）を含む、細胞外に放出される数十ナノメートルから数マイクロメートルのサイズの粒子を意味する。細胞外微粒子のサイズは例えば１．０ｎｍ以上５０μｍ以下であってよく、１０ｎｍ以上１０μｍ以下であってよく、５０ｎｍ以上５．０μｍ以下であってよい。

　本明細書中、「標識物質」とは、細胞外微粒子の特定の構成成分に特異的に結合し、かつ光照射により光学的に検出することができる物質を意味する。ここで、標識物質の構成成分への結合態様は特に限定されず、例えば共有結合、疎水性相互作用による結合、水素結合、及びイオン結合等が挙げられる。標識物質は光照射により散乱光を生じる物質であってよく、発光を生じる物質であってよく、中でも蛍光を生じる物質であってよい。標識物質は例えば細胞外微粒子の構成成分の染色試薬であってよい。

　本明細書において、「染色」とは、細胞外微粒子の特定の構成成分に、光照射により発光（典型的には蛍光発光）する分子が特異的に化学的又は物理的に結合していること、及び細胞外微粒子の特定の構成成分に、光照射により発光（典型的には蛍光発光）する分子を特異的に化学的又は物理的に結合させることを意味する。また、「染色試薬」とは、細胞外微粒子の特定の構成成分に特異的に染色するための物質であり、すなわち細胞外微粒子の特定の構成成分に特異的に結合し、かつ光照射により発光（典型的には蛍光発光）を生じる物質を意味する。

　標識物質により標識する細胞外微粒子の構成成分は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の少なくともいずれかを含むことが好ましく、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の少なくとも３種を含むことがより好ましく、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の全てを含むことがさらに好ましい。これらの成分を標識し、それらを検出することにより、細胞外微粒子の集団をより高精度にクラスター分析することができる。分析試料中、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖以外の構成分子が標識物質により標識されていてもよい。

　分析試料において、細胞外微粒子は、３種以上の構成成分が標識物質により標識されていることが好ましく、４種以上の構成成分が標識物質により標識されていることがより好ましい。また、細胞外微粒子は、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、さらにより好ましくは６種以上、なおもさらに好ましくは７種以上、特に好ましくは８種以上の標識物質により構成成分が標識されていてよい。細胞外微粒子の集団に含まれる標識物質の種類の数の上限は特に限定されないが、例えば、４０種、３０種、２０種、１６種、１５種、１２種又は１０種であってよい。

　分析試料は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖からなる群より選択される少なくとも３種が染色された細胞外微粒子の集団を含むことが好ましい。この場合、細胞外微粒子の集団は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖以外の構成分子が染色されていてもよい。後述するクラスター分析の精度を高める観点から、細胞外微粒子の集団は、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の全てが染色されていることが好ましい。

　この場合、細胞外微粒子の集団において、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖のそれぞれは、１種又は１種以上の染色試薬により染色されていてよい。核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の各種が、１種以上１０種以下、１種以上８種以下、１種以上５種以下、２種以上１０種以下、２種以上８種以下、又は２種以上５種以下の染色試薬により染色されていてよい。
　また、細胞外微粒子の集団は、好ましくは３種以上の染色試薬により染色され、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、さらにより好ましくは６種以上、なおもさらに好ましくは７種以上、特に好ましくは８種以上の染色試薬により染色されている。細胞外微粒子の集団に含まれる染色試薬の種類の数の上限は特に限定されないが、例えば、４０種、３０種、２０種、１６種、１５種、１２種又は１０種であってよい。

　上述のとおり、細胞外微粒子は細胞と比較して体積及び表面積が極めて小さい。したがって、細胞外微粒子を複数の標識物質で標識する観点から、細胞外微粒子における標識物質又は染色試薬は、抗体以外の物質を含むことが好ましく、分子量が２万以下の化合物を含むことがより好ましく、低分子化合物を含むことがさらに好ましい。例えば細胞外微粒子は、核酸及び／又は脂質の標識物質又は染色試薬として分子量が２万以下の化合物又は低分子化合物を含んでいてよい。低分子化合物の分子量は、例えば５００以下、又は４００以下であってよく１００以上、又は２００以上であってよい。細胞外微粒子における標識物質又は染色試薬は、分子量が５００以上２万以下の中分子化合物を含んでいてもよい。

　核酸の染色試薬としては、核酸を染色できる物質であれば特に限定されないが、例えば以下の表に示すものが挙げられる。染色する核酸は試料及び分析の目的等に応じて選択してよい。核酸の染色試薬は、結合態様が「Bis-intercalator」である染色試薬、及び「Minor groove binder」である染色試薬が好ましく、中でも以下の表において結合態様が「Bis-intercalator」である染色試薬、及び「Minor groove binder」である染色試薬がより好ましい。

　脂質の染色試薬としては、脂質又は脂質粒子の内部を染色できる物質であれば特に限定されないが、例えばＰＫＨ６７、ＤｉＡ、ＤｉＢ、Ｎｅｕｔｏ－ＤｉＯ、ＤｉＤ、及びＣｅｌｌＭａｓｋ（ＣｅｌｌＭａｓｋ　Ｇｒｅｅｎ、ＣｅｌｌＭａｓｋ　Ｏｒａｎｇｅ、及びＣｅｌｌＭａｓｋ　Ｄｅｅｐ　Ｒｅｄ）のような両親媒性インターカレーター型の染色試薬；5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester（ＣＦＳＥ）、6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester（ＣＦＳＥ）、及びcell trace violet（ＣＴＶ）のような脂質二重膜内のエステラーゼにより分解を受けて蛍光を発するアミン反応性染色試薬；並びにアネキシンＶのようなホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するタンパク質を蛍光標識した物質が挙げられる。染色する脂質は試料及び分析の目的等に応じて選択してよい。脂質の染色試薬は、両親媒性インターカレーター型の染色試薬を含むと好ましく、ＣｅｌｌＭａｓｋを含むとより好ましく、ＣｅｌｌＭａｓｋ　Ｄｅｅｐ　Ｒｅｄを含むとさらに好ましい。

　タンパク質の染色試薬としては、タンパク質を染色できる物質であれば特に限定されないが、例えば蛍光標識抗体、並びにＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ｓｔａｉｎ　Ｎｅａｒ－ＩＲ及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ｆｉｘａｂｌｅ　ｄｅａｄ　ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎのような細胞生存を評価するための染色試薬が挙げられる。染色するタンパク質は試料及び分析の目的等に応じて選択してよい。

　糖鎖の染色試薬としては、糖鎖を染色できる物質であれば特に限定されないが、例えばＣＦ４０５Ｍ　ＷＧＡ、及びＣＦ５６８　ＰＮＡのような蛍光標識レクチンが挙げられる。染色する糖鎖は試料及び分析の目的等に応じて選択してよい。

　細胞外微粒子を染色する際は、上記の染色試薬の中から、ピーク波長が互いに異なる染色試薬を選択する。そのようにすることで、後述の光検出において検出される発光と染色試薬とを一対一対応させることができ、細胞外微粒子の集団をより高精度にクラスター分析することができる。

　本実施形態の分析方法に用いる試料を調製する方法は、例えば細胞外微粒子の集団を含む試料を、細胞外微粒子の構成成分に結合する複数の標識物質により標識することを含み、核酸染色試薬、タンパク質染色試薬、脂質染色試薬、及び糖鎖染色試薬からなる群より選択される少なくとも３種により染色することを含むことが好ましい。用いる標識物質又は染色試薬の種類の数、並びに標識物質及び染色試薬の例は上記のとおりである。例えば、試料調製の際に、細胞外微粒子の集団を含む試料を、核酸染色試薬、タンパク質染色試薬、脂質染色試薬、及び糖鎖染色試薬の全てで染色することが好ましい。

　標識物質又は染色試薬による細胞外微粒子の集団の標識の方法は、用いる標識物質又は染色試薬、及び標識又は染色対象に応じて適宜公知の方法を用いればよい。また、細胞外微粒子の構成成分、例えば核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖は、同時に染色してもよく、段階的に染色してもよい。また、細胞外微粒子の構成成分、例えば核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖のそれぞれについて２種以上の標識物質又は染色試薬を用いる場合も、それらの２種以上の標識物質又は染色試薬により同時に標識又は染色してもよく、段階的に標識又は染色してもよい。段階的に標識又は染色を行う場合、１種目の標識物質又は染色試薬による標識又は染色と、２種目の標識物質又は染色試薬による標識又は染色との間で細胞外微粒子の集団を洗浄してもよいが、細胞外微粒子の流出を防ぐ観点から当該洗浄を実施しないことが好ましい。

　以下、細胞外微粒子の集団について、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖を染色する場合を例にして、分析試料の調製方法の一例を示す。ただし、本実施形態における分析試料の調製方法が以下の例に限定されないことはいうまでもない。

　まず、細胞外微粒子の集団を含む試料を、任意で、適当な濃度まで希釈又は濃縮する。その後、脂質染色試薬、例えばＣｅｌｌＭａｓｋを添加し、例えば０℃以上３０℃以下で、１分以上３０分以下静置する。次に、残りの核酸染色試薬、タンパク質染色試薬、及び糖鎖染色試薬を添加し、例えば０℃以上３０℃以下で、５分以上６０分以下静置する。このように、脂質染色試薬による染色を予め行うことで、脂質の染色効率を高めることができる傾向にある。

　細胞外微粒子の集団を含む試料としては、特に限定されないが、例えば生体試料、生体の洗浄液が挙げられる。非限定的な試料の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）が挙げられる。

（光照射）
　図１において、次に、細胞外微粒子の集団に光を照射する。後述の光検出の際に、細胞外微粒子の集団から一粒子ごとに散乱光及び発光を検出することができれば、光の照射方法は特に限定されない。例えば、細胞外微粒子の集団に一度に光を照射してもよいし、細胞外微粒子を流路に流しながら一粒子又は数粒子（例えば１～１０粒子程度）ごとに光を照射してもよい。ここで、一粒子につき、１種又は１種以上の光が照射されてよい。また、照射する光は白色光であってよく、単色光であってよい。単色光を照射する場合、照射する光の波長は、細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質の励起光の波長に応じて選択すればよい。例えば、励起光の波長が互いに異なる複数種の標識物質により細胞外微粒子の集団が標識されている場合、当該励起光の波長に対応する複数種の単色光を照射してもよい。細胞外微粒子の集団に、一粒子ごとに光を照射する方法としては、特に限定されないが、例えばフローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。照射する光は単色光のレーザであってよい。照射する光の波長は特に限定されないが、例えば４００～６００ｎｍの範囲であってよい。

（光検出）
　上記のようにして細胞外微粒子に光を照射することで、各細胞外微粒子において、散乱光、及び細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質に由来する発光（典型的には蛍光発光）が生じる。本実施形態の分析方法では、各細胞外微粒子について当該散乱光及び発光を検出する。本実施形態の分析方法では、この光検出において、細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる発光が複数検出されるように試料の調製を行うか、そのような試料を準備する。

　検出する散乱光としては、例えば前方散乱光及び側方散乱光が挙げられる。また、通常の散乱光に加えて又は通常の散乱光に代えて、散乱光の一部の偏光成分を検出してもよい。検出可能な細胞外微粒子のサイズの範囲を広くするために、例えば前方散乱光（ＦＳＣ）及び偏光した前方散乱光（ＦＳＣ－ｐｅｒｐ）を同時に検出してもよい。側方散乱光（ＳＳＣ）、前方散乱光（ＦＳＣ）及び偏光した前方散乱光（ＦＳＣ－ｐｅｒｐ）の少なくとも２種以上、又はそれら全てを同時に検出してもよい。

　細胞外微粒子に由来する発光は、自家発光を生じる構成成分の種類の数に、細胞外微粒子が含む標識物質の種類の数を加えた数だけ検出される。すなわち、本実施形態では、ピーク波長が互いに異なる複数の発光が検出される。

　散乱光及び発光の検出には、適当な光検出器を用いればよい。１つ又は１つ以上の光検出器を用いてよい。１つの光検出器を用いる場合は、スペクトルアナライザを用いてピーク波長が互いに異なる複数の発光を検出してもよい。１つ以上の光検出器を用いる場合は、適当な分光素子を用いて上記の光照射により生じた散乱光及び発光をピーク波長毎に分光し、それぞれの光に対応した検出器でそれぞれの光を検出してもよい。

　光検出器としては、例えば光電子増倍管及びフォトダイオードが挙げられる。光検出器は、フローサイトメーターに備え付けられているものであってもよい。

（散布図作成）
　以上のようにして、光照射及び光検出により、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、散乱光強度、及びピーク波長が互いに異なる複数の発光のそれぞれの発光強度が得られる。例えば、発光波長がλ_１、λ_２、及びλ_３である３種の染色試薬により細胞外微粒子の集団が染色されている場合、各細胞外微粒子について、例えば前方散乱光の強度Ｉ_ＦＳＣ、偏光前方散乱光の強度Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}、側方散乱光の強度Ｉ_ＳＳＣ、並びに波長がそれぞれλ_１、λ_２、及びλ_３である３種の発光の強度Ｉ_λ１、Ｉ_λ２、及びＩ_λ３の情報が得られる。すなわち、各細胞外微粒子について、散乱光の強度及び複数の発光の強度を成分とするベクトルが得られる。上記の例で説明すると、各細胞外微粒子について、ベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_ＳＳＣ，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）が得られる。

　本実施形態の分析方法では、情報処理装置又は分析装置の情報処理部（以下、単に「情報処理装置」ともいう。）が、検出した散乱光強度、及びピーク波長が互いに異なる複数の発光のそれぞれの発光強度に基づいて、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成し；特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する。また、当該第１の散布図に基づいて、マッピングされた複数の細胞外微粒子が２以上のクラスターに分類される。以下、図２を参照しながら、本実施形態の分析方法における情報処理について詳述する。また、発光波長がλ_１、λ_２、及びλ_３である３種の染色試薬により細胞外微粒子の集団が染色され、ベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_ＳＳＣ，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）が得られている上記の例を適宜用いる。

　まず、情報処理装置は、検出した散乱光強度、及びピーク波長が互いに異なる複数の発光のそれぞれの発光強度に基づいて、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する。特徴量ベクトルは、検出した散乱光強度、及びピーク波長が互いに異なる複数の発光のそれぞれの発光強度を成分とするベクトルであってよく、当該ベクトルに適当な処理をしたベクトルであってよい。そのような処理としては、連続的な値を離散的な値に変換するビニング処理、又は正規化処理等の、処理前のベクトルにおける各成分の大小関係を実質的に変化させないような処理が挙げられる。処理前のベクトルにおける各成分の大小関係を実質的に変化させないような処理とは、処理前のベクトルにおける各成分の大小関係を変化させないか、処理前のベクトルにおける各成分を離散化する処理を意味する。上記の例では、特徴量ベクトルは、例えばベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_ＳＳＣ，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）であってよいし、ベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_ＳＳＣ，１，１，０）であってよいし、ベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）であってよい。ここで、ベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_ＳＳＣ，１，１，０）は、波長がそれぞれλ_１、λ_２、及びλ_３である３種の発光の強度Ｉ_λ１、Ｉ_λ２、及びＩ_λ３の値に応じて、３種の染色試薬のそれぞれにより染色されているかどうかを０又は１で表すように処理されたベクトルの例である。また、ベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）は、前方散乱光の強度Ｉ_ＦＳＣ、偏光前方散乱光の強度Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}、及び側方散乱光の強度Ｉ_ＳＳＣの強度に応じて、最も特徴的な散乱光の強度Ｉ_ＦＳＣが抽出されたベクトルの例である。この場合の抽出されたＩ_ＦＳＣ成分は、細胞外微粒子のサイズに対応し得る。以下、特徴量ベクトルとしてベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_ＳＳＣ，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）を用いた例を適宜用いる。

　次いで、情報処理装置は、特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルを生成する。代表ベクトルは、特徴量ベクトルの成分のうち、少なくとも散乱光強度に対応する成分、及び発光に対応する成分を含んでいることが好ましい。上記の例では、代表ベクトルは、例えばベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）である。

　特徴量ベクトルの成分のうちいずれを用いて代表ベクトルを生成するかは、情報処理装置のユーザにより設定されてよく、あるいは情報処理装置が所定のアルゴリズムに基づいて設定してもよい。情報処理装置は、各細胞外微粒子について、特徴量ベクトルの成分のうち設定されたものを成分とする代表ベクトルを生成する。代表ベクトルは、特徴量ベクトルと同じベクトルであってもよい。

　次いで、情報処理装置は、細胞外微粒子の集団の中からマッピングする細胞外微粒子を決定する。この際、細胞外微粒子の集団の全ての細胞外微粒子をマッピングしてもよく、細胞外微粒子の集団に含まれる一部の複数の細胞外微粒子をマッピングしてもよい。マッピングする細胞外微粒子の決定は、例えば特徴量ベクトル又は代表ベクトルに基づいて実施される。情報処理装置は、マッピングする細胞外微粒子の決定を実施せずに、細胞外微粒子の集団の全ての細胞外微粒子をマッピングしてもよい。

　情報処理装置は、例えば代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの全てが閾値以下である細胞外微粒子をマッピングから除外してよい。上記の例では、Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３の全てが閾値以下である細胞外微粒子をマッピングから除外することに対応する。この態様は、細胞外微粒子の集団のうち、標識若しくは染色されていないか、又は標識度合若しくは染色度合が低い細胞外微粒子をマッピングから除外することに対応する。このように、標識若しくは染色されていないか、又は標識度合若しくは染色度合が低い細胞外微粒子をマッピングから除外することにより、後述のクラスター分析をより精度高く実施することができる。

　あるいは、情報処理装置は、代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうち、所定の成分が閾値以上、又は閾値以下である細胞外微粒子のみをマッピングしてもよいし、当該細胞外微粒子をマッピングから除外してもよい。この態様は、細胞外微粒子の集団のうち、所定の構成成分の含有量が高い又は低い細胞外微粒子をマッピングに追加、又はマッピングから除外することに対応する。

　上記の閾値は、情報処理装置のユーザにより設定されてよく、あるいは情報処理装置が所定のアルゴリズムに基づいて設定してもよい。例えば、同一の細胞外微粒子の集団から、未標識又は未染色の細胞外微粒子の集団、及び標識済み又は染色済みの細胞外微粒子の集団を調製して、未標識又は未染色の細胞外微粒子の集団について特徴量ベクトル又は代表ベクトルを生成し、当該特徴量ベクトル又は代表ベクトルにおける発光の強度に対応する成分に基づいて上記の閾値を設定してよい。この場合、閾値は、未標識又は未染色の細胞外微粒子の集団における特徴量ベクトル又は代表ベクトルの発光の強度に対応する成分の、最大値、平均値、最頻値、平均値＋２σの値、平均値＋３σの値、又は平均値＋４σの値であってよい。

　次いで、情報処理装置は、上記においてマッピング対象とされた細胞外微粒子を、それぞれの代表ベクトルの類似度に基づいて２次元又は３次元上にマッピングすることで、２次元又は３次元の散布図を作成する。当該マッピングは、例えば各細胞外微粒子に対応する代表ベクトルを次元削減することにより実施してもよく、機械学習により実施してもよい。より具体的には、ｔ－ＳＮＥ（T-distributed Stochastic Neighbor Embedding）、ＳＮＥ、ＵＭＡＰ（Uniform Manifold Approximation and Projection）、及び主成分分析（ＰＣＡ）等の手法を用いることができる。作成される２次元又は３次元の散布図では、複数の細胞外微粒子が代表ベクトルの類似度に基づいてプロットされる。すなわち、代表ベクトルが類似している（サイズ及び染色度合が類似していることに対応する。）細胞外微粒子同士が隣接してプロットされ、代表ベクトルが異なる（サイズ及び染色度合が異なることに対応する。）細胞外微粒子同士が離れてプロットされる。

　次いで、情報処理装置は、散布図の各細胞外微粒子に対応する各点を、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングする。付されるラベルとしては、例えば発光が検出された構成成分又は標識物質の種類、及び発光のピーク波長が挙げられる。例えば、特徴量ベクトル又は代表ベクトルにおける発光の強度に対応する成分のうち最も強度が強い成分に対応する構成成分、標識物質、又は染色試薬でラベリングしてもよいし、以下の方法でラベリングしてもよい。すなわち、各標識物質について、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子が当該標識物質で標識されたか否かを判定し、標識された細胞外微粒子の数が最も少ない標的物質を第１の標識物質とし、標識された細胞外微粒子の数が２番目に少ない標的物質を第２の標識物質とし、第１の標識物質により標識された細胞外微粒子を第１の標識物質でラベリングし、第２の標識物質により標識された細胞外微粒子を第２の標識物質でラベリングし、当該ラベリングを標識物質の数だけ繰り返す方法である。当該ラベリングにおいて、各細胞外微粒子に付すラベルは、情報処理装置のユーザにより設定されてよく、あるいは情報処理装置が所定のアルゴリズムに基づいて設定してもよい。

　以上のようにして、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子がマッピングされ、所定のラベルによりラベリングされた散布図が作成できる。以下、この散布図を第１の散布図という。

　なお、図２を用いて本実施形態の細胞外微粒子の分析方法における情報処理の一例を説明したが、本実施形態の分析方法における情報処理が以上の例に限定されないことはいうまでもない。例えば、上記の情報処理の前又は途中において、機械学習のための特徴量エンジニアリング等のデータ処理を行ってもよい。例えば、細胞外微粒子の集団から得られた各特徴量ベクトルについて、散乱光強度及び／又は各標識物質に由来する発光の強度に基づいてビニング処理を行ってもよい。

（クラスタリング）
　再び図１を参照して本実施形態の分析方法を説明する。次いで、以上のようにして、情報処理装置により作成された第１の散布図に基づいて、第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類する。当該２以上のクラスターへの分類（以下、クラスタリングともいう。）は、第１の散布図のラベルに基づいて実施されてよい。例えば、第１の散布図において同一のラベルが集合している部分に含まれる細胞外微粒子が同一のクラスター含まれるようにクラスタリングを行ってよい。クラスタリングはユーザが実施してもよく、情報処理装置が所定のアルゴリズムに基づいて実施してもよい。例えば、用いるアルゴリズムとしては、例えばｋ－ｍｅａｎｓ、ｋ－ｍｅａｎｓ＋＋、サポートベクトルマシーン（ＳＶＭ）、及びカーネルＳＶＭ等が挙げられる。

　生成するクラスターの数は２以上であれば特に限定されないが、例えば検出した発光の数±５の範囲、検出した発光の数±４の範囲、検出した発光の数±３の範囲、検出した発光の数±２の範囲、若しくは検出した発光の数±１の範囲、又は検出した発光の数と同じ数であってよい。あるいは、代表ベクトルの成分のうち発光に対応する成分の数をｎとすると、ｎ±５の範囲、ｎ±４の範囲、ｎ±３の範囲、ｎ±２の範囲、ｎ±１の範囲、又はｎ個のクラスターを生成してもよい。あるいは、第１の散布図において付されているラベルの数をｍとすると、ｍ±５の範囲、ｍ±４の範囲、ｍ±３の範囲、ｍ±２の範囲、ｍ±１の範囲、又はｍ個のクラスターを生成してもよい。

　情報処理装置は、生成されたクラスターに属する細胞外微粒子について、どのようなクラスターに分類されたかというクラスター情報を当該細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルと紐づけて記録してもよい。

　以上のように、本実施形態の分析方法によれば、特性が未知である細胞外微粒子の集団を分析し、２以上のクラスターに分類することができる。本実施形態の分析方法によれば、例えば疾患の有無によって所定の特性を有する細胞外微粒子が増加又は減少するかということを明らかにし、疾患の発症、疾患の原因、及び／又は予後予測のバイオマーカーとなる細胞外微粒子を特定することができる。また、ワクチン及び治療薬により疾患を有する場合に増加する細胞外微粒子が減少することを確かめることにより、ワクチン及び治療薬の効果を検証することができる。

　図７ｆの左に、本実施形態の分析方法により細胞外微粒子の集団を分析した結果の一例を示す。図７ｆの左に示す図は、８種類の染色試薬により細胞外微粒子の集団を染色し、散乱光及び当該染色試薬に由来する蛍光に基づいて細胞外微粒子の集団をマッピングし、当該８種類の染色試薬のうちのいずれかでラベリングし、細胞外微粒子の集団を少なくとも５つのクラスターに分類した際に得られる結果である。このように、本実施形態の分析方法によれば、細胞外微粒子の集団を包括的に分析することができ、細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類し、細胞外微粒子の集団の全体的な組成を解明することができる。

（クラスターの同定）
　本実施形態の分析方法は、さらに上記のクラスタリングにより得られたクラスターのうちの少なくとも１つのクラスターの特性を同定することを含んでいてもよい。当該同定は、情報処理装置による第２の散布図の作成と、第１及び第２の散布図に基づくクラスターの特性の同定とを含んでいてよい。以下、第２の散布図の作成、並びに第１及び第２の散布図に基づくクラスターの特性の同定について詳述する。

　第２の散布図は、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子が第１の散布図と同様にマッピングされ、当該マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにおいて代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つが可視化されている散布図である。すなわち、第２の散布図は、第１の散布図に対して、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも複数の発光に対応する複数の成分に基づくラベリングに代えて、代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つの値の大小の情報すなわち、複数の発光のうちの１つの強度が可視化されて付与されている点で異なる。

　第２の散布図において、可視化される情報は、色彩の変化により可視化されてもよく、細胞外微粒子に対応する各点のサイズにより可視化されてもよい。例えば、第２の散布図は、細胞外微粒子の所定の染色試薬による染色度合を示すヒートマップである。

　第２の散布図は、情報処理装置により作成される。情報処理装置は、第１の散布図と同様に細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングすることで散布図を作成する。次いで、情報処理装置は、散布図の各細胞外微粒子に対応する各点に、代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つの値の大小の情報を付与する。代表ベクトルとしてベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）が得られている上述の例においては、情報処理装置は、Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３のいずれかの大小の情報を、散布図の各細胞外微粒子に対応する各点に付与する。

　情報処理装置は、強度が可視化されている発光の種類が互いに異なる複数の第２の散布図を作成してもよい。すなわち、代表ベクトルが第１の発光に対応する成分と、第２の発光に対応する成分とを含む場合、情報処理装置は、第１の発光に対応する成分が可視化されている第２の散布図Ａと、第２の発光に対応する成分が可視化されている第２の散布図Ｂとを作成してもよい。代表ベクトルとしてベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）が得られている上述の例においては、情報処理装置は、Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，及びＩ_λ３の大小の情報をそれぞれ散布図の各点に付与した３種の第２の散布図を作成してよい。

　第１及び第２の散布図に基づくクラスターの特性の同定は、第１及び第２の散布図を対比することにより実施してよい。当該クラスターの特性の同定は、第１の散布図と複数の第２の散布図とを対比することにより実施してよい。例えば、代表ベクトルとしてベクトル（Ｉ_ＦＳＣ，Ｉ_{ｐ－ＦＳＣ}，Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，Ｉ_λ３）が得られ、Ｉ_λ１，Ｉ_λ２，及びＩ_λ３の大小の情報をそれぞれ散布図の各点に付与した３種の第２の散布図が作成した場合を例とすると、当該３種の第２の散布図を参照することで、第１の散布図における少なくとも１つのクラスターにおける、発光波長がλ_１、λ_２、及びλ_３である３種の染色試薬による染色度合を確認することができ、細胞外微粒子の各構成成分の含有量等の特性を同定することができる。

　図７ｆの右に、本実施形態の分析方法により細胞外微粒子の集団から複数の第２の散布図を作成した際の一例を示す。図７ｆの右に示す図は、８種類の染色試薬により細胞外微粒子の集団を染色し、散乱光及び当該染色試薬に由来する蛍光に基づいて細胞外微粒子の集団をマッピングし、散乱光強度（２種）又は蛍光強度（８種）を可視化した計１０種のヒートマップである。これらのヒートマップと、図７ｆの左に示した第１の散布図とを対比することにより、第１の散布図において特定されたクラスターがどのような構成成分を多く含むかということを容易に確認することができる。

（分析データを用いた分析）
　以上の分析方法によれば、複数の細胞外微粒子について、その特徴を示す特徴量ベクトルとどのようなクラスターに分類されたかというクラスター情報とを紐づけて取得することができる。したがって、以上の分析方法により細胞外微粒子の集団を分析し、複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む分析データを取得すれば、当該分析データを教師データとして、さらなる分析を実施することもできる。したがって、本実施形態は、上記の分析方法により得られる、複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む教師データ、及びこれにより学習された学習済みモデルを提供できる。

　例えば、本実施形態の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析方法は、細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；細胞外微粒子の集団を上記で詳述した分析方法により分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子の特性を分析することと；を含む。

　この分析方法は、図１に示す分析方法と同様に細胞外微粒子について特徴量ベクトルを取得し、当該特徴量ベクトルと、複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む既存の分析データとに基づいて、特徴量ベクトルを取得した細胞外微粒子の特性を分析する方法である。この分析方法により、例えば、既知の特徴量ベクトルを有する細胞外微粒子がどのようなクラスターに分類されるかということを明らかにすることができる。

　この分析方法は、細胞外微粒子の集団を上記で詳述した分析方法により分析することで得られる分析データを教師データとして機械学習によりモデル（細胞外微粒子特性予想モデル）を生成することを含んでいてもよい。モデルの生成には、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、決定木、ランダムフォレスト、ナイーブベイズ法、及びサポートベクターマシン等の手法を用いてよい。

（変形例）
　本実施形態の別の一態様に係る細胞外微粒子の分析方法は、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類することと；を含む。

　この分析方法は、上記において詳述した分析方法と比較して、第１の散布図を作成せずに代表ベクトルの類似度に基づいて細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類する点で異なる。クラスタリングの方法としては、階層型クラスタリング及び非階層型クラスタリングを用いることができ、例えば単リンク法、Ｗａｒｄ法、ｋ－ｍｅａｎｓ法、及びｋ－ｍｅａｎｓ＋＋法等を用いてよい。その他の点においては上記において詳述した分析方法と同様であり、説明を省略する。

［分離方法］
　また、本実施形態の分析方法により複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む分析データを取得することにより、細胞外微粒子の集団から特定の特性を有する細胞外微粒子を分離することができる。かかる分離において、本実施形態の分析方法で分析した細胞外微粒子の集団から特定の細胞外微粒子を分離してもよいし、本実施形態の分析方法で分析した細胞外微粒子の集団とは異なる細胞外微粒子の集団から特定の細胞外微粒子を分離してもよい。

　例えば、本実施形態の別の一態様に係る細胞外微粒子の分離方法は、細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；細胞外微粒子の集団を本実施形態の分析方法のいずれかにより分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断することと；細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離することと；を含む。

　かかる分離方法は、図１に示す分析方法と同様に細胞外微粒子について特徴量ベクトルを取得し、当該特徴量ベクトルと複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む分析データとに基づいて、特徴量ベクトルを取得した細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断し、所定の特性を有すると判断された細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離する方法である。

　この分離方法において、所定の細胞外微粒子を分離する細胞外微粒子の集団と、分析データを取得する際に用いた細胞外微粒子の集団は同じであってもよく、異なっていてもよい。例えば、第１の細胞外微粒子の集団を本実施形態の分析方法により分析することで複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む分析データを取得し、当該分析データに基づいて、第２の細胞外微粒子の集団から所定の細胞外微粒子を分離してもよいし、第１の細胞外微粒子の集団を本実施形態の分析方法により分析することで複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む分析データを取得し、当該分析データに基づいて、第１の細胞外微粒子の集団から所定の細胞外微粒子を分離してもよい。

　この分離方法において、分離する細胞外微粒子の特性はユーザが設定してよい。例えば、ユーザは、情報処理装置に対して、本実施形態の分析方法により見出された細胞外微粒子のクラスターの１つに属する細胞外微粒子を分離するように指定してよい。この場合、情報処理装置は、分析データに基づいて、指定されたクラスターに属する細胞外微粒子がどのような特徴を有するかについての分析を行う。例えば、情報処理装置は、指定されたクラスターに属する細胞外微粒子における特徴量ベクトル又は代表ベクトルを参照して、特徴量ベクトル又は代表ベクトルの各成分がどのような範囲である場合に、細胞外微粒子を分離すべきかを設定する。あるいは、情報処理装置は、与えられた細胞外微粒子が指定されたクラスターに属するか否かを予測する予測モデルを生成してもよい。当該予測モデルの生成には、指定されたクラスターに属する細胞外微粒子の特徴量ベクトル又は代表ベクトル及びクラスター情報を含むデータを教師データとしてよい。当該予測モデルは回帰モデルであってよく、機械学習により生成されたモデルであってもよい。モデルの生成には、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）、決定木、ランダムフォレスト、ナイーブベイズ法、及びサポートベクターマシン等の手法を用いてよい。

　より具体的には、分離対象とする細胞外微粒子は以下のように定められてよい。まず、ユーザは本実施形態の分析方法により見出された細胞外微粒子のクラスターの１つに属する細胞外微粒子を分離するよう情報処理装置に指定する。情報処理装置は、細胞外微粒子の集団を本実施形態の分析方法により分析することで得られる複数の特徴量ベクトル及びクラスター情報の組み合わせを含む分析データに基づいて、指定されたクラスターの細胞外微粒子について、標識又は染色された細胞外微粒子の構成成分を特定する。標識又は染色の有無の判断は、当該標識物質又は染色試薬に由来する発光の強度又は対応する特徴量ベクトル若しくは代表ベクトルの成分に基づいて行えばよく、例えば当該発光強度又は対応する特徴量ベクトル若しくは代表ベクトルの成分が閾値以上である細胞外微粒子を標識又は染色がされていると判断してよい。次いで、情報処理装置は、分離に用いる細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子に関する特徴量ベクトルを取得し、当該特徴量ベクトルに基づいて、その細胞外微粒子における標識又は染色された構成成分を特定する。情報処理装置は、その細胞外微粒子の標識又は染色された構成成分が、指定されたクラスターの細胞外微粒子の標識又は染色された構成成分と同じである場合に、その細胞外微粒子を分離対象と判断する。

　所定の特性を有すると判断された細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離する方法としては、細胞外微粒子を一粒子レベルで分離することができる方法であれば特に限定されないが、例えばフローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。例えば、細胞外微粒子を含む液滴を形成し、分離対象とする細胞外微粒子を含む液滴を荷電させ、分離対象とする細胞外微粒子を含む液滴のみを電気的に分離する方法を用いてよい。

　このようにして所定の特性を有する複数の細胞外微粒子を分離して、新たに細胞外微粒子の集団を取得することができる。得られた細胞外微粒子の集団は、再度本実施形態の分析方法により分析することでさらなるクラスター分析を行ってもよいし、ＰＣＲのようなその他の分析に供してもよい。

［分析装置］
　図３は、本実施形態の細胞外微粒子の分析装置の構成の一例を示す図である。図３に示すように、本実施形態の分析装置１は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部２と；検出された散乱光及び複数の発光に基づいて細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、取得した特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する散布図作成手段、並びに第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成するクラスター生成手段を含む情報処理部３と；を備える。また、本実施形態の分析装置１は、情報処理部及び検出部に対してユーザが指示を行ったり、データを入力したりするための入力部４、及び分析結果を出力するための出力部５を備える。
　以下、各構成について説明する。

　検出部２は、細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する。図３において、検出部２は、分析する試料を導入するための試料導入手段と、導入した試料を流路に流し細胞外微粒子が略一列に並んで連続的に流れる状態を作り出すフロー手段と、フロー手段により略一列に並んで連続的に流れる細胞外微粒子に光を照射する光照射手段と、光が照射された細胞外微粒子から散乱光及びピーク波長が互いに異なる複数の発光を検出する光検出手段とを備える。検出部２は、上記のように細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について散乱光及びピーク波長が互いに異なる複数の発光を検出することができる限り、そのような構成を有していてもよく、例えば市販のフローサイトメーターを検出部として用いてもよい。

　フロー手段は、導入した試料を流路に流し細胞外微粒子が略一列に並んで連続的に流れる状態を作り出す。フロー手段は、試料導入口及び試料排出口を備えるフローセルと、フローセルに試料を導入するポンプのような圧力印加手段とを備えていてよい。圧力印加手段による圧力は、フローセルにおいて層流が生じる範囲で調整される。

　光照射手段は、細胞外微粒子に含まれる構成成分又は構成成分に結合した標識物質の励起波長を含む光を照射する。照射する光は白色光であってよく、単色光であってよい。励起光の波長が互いに異なる複数種の標識物質により細胞外微粒子の集団が標識されている場合、検出部２は、当該励起光の波長に対応する複数種の単色光を照射する光照射手段を複数備えていてもよい。

　光検出手段は、細胞外微粒子から生じる散乱光及びピーク波長が互いに異なる複数の発光を一粒子ごとに検出する。光検出手段は、例えば回折格子、バンドパスフィルター、及びノッチフィルタのような分光器と、レンズのような集光素子と、光電子増倍管及びフォトダイオードのような検出器と、偏光成分を検出するための偏光素子とを備えていてよい。より具体的には、集光素子と；散乱光を検出するための分光器及び検出器と；偏光された散乱光を検出するための分光器、偏光素子及び検出器と；ピーク波長が互いに異なる複数の発光を検出するための複数の分光器及び検出器とを備えていてよい。

　入力部４は、分析装置１に対する入力を受け付ける。入力部４は、例えばユーザからの入力を受け付けるためのキーボード、マウス、マイク、及び／又はタッチパネルを備える。分析装置１は、入力部４から入力された情報に基づいて、検出部２、情報処理部３、及び出力部５に各機能を実行させる。また、入力部４は、細胞外微粒子の集団を上記で詳述した分析方法により分析することで得られる分析データを受け付けてもよい。

　出力部５は、分析装置１の分析結果を表示する。出力部５は、例えば液晶ディスプレイ又は有機ＥＬディスプレイを備える。

　図４は、情報処理部３の機能的な構成の一例を示すブロック図である。図４において、情報処理部３は、検出部２、入力部４及び出力部５と通信を行う通信手段と、検出部２から得たデータを処理などするデータ処理手段と、処理されたデータから特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段と、特徴量ベクトルに基づいて散布図を作成する散布図作成手段と、散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成するクラスター生成手段とを備える。

　情報処理部３は、検出部２、入力部４、及び／又は出力部５と一体化されて分析装置１を構成していてもよいが、検出部２、入力部４、及び／又は出力部５と有線又は無線により接続されることで分析装置１を構成していてもよい。情報処理部３は、通信手段により分析装置１のその他の構成と通信する。例えば、情報処理部３は、入力部からの通信により検出部から検出データを受け取り、分析結果を出力部に送信して、出力部に表示してよい。通信手段は特に限定されず、装置内での処理であってよく、無線通信又は有線通信であってもよい。

　データ処理手段は、検出部２から受信した検出データを後続の分析のために処理する。例えば、検出データに基づいて各細胞外微粒子と検出された散乱光強度及び発光強度を対応させてよい。データ処理手段は、発光漏れ込み補正を実施してもよい。発光漏れ込み補正とは、ピーク波長が互いに異なる複数の発光が互いの検出強度に及ぼす影響を低減させる補正である。例えば、第１の発光がブロードな発光を示し、ピーク波長が異なる第２の発光のピーク波長に重なってしまう場合に、第２の発光強度から当該第１の発光に起因する強度を差し引くことに対応する。また、データ処理手段は、特徴量ベクトル生成手段により生成された各特徴量ベクトルについて、散乱光強度及び／又は各標識物質に由来する発光の強度に基づいてビニング処理を行ってもよい。

　特徴量ベクトル生成手段は、検出部から受信した検出データ、又はデータ処理手段により処理されたデータに基づいて細胞外微粒子の特徴を示す特徴量ベクトルを生成する。特徴量ベクトルは、検出した散乱光強度、及びピーク波長が互いに異なる複数の発光のそれぞれの発光強度を成分とするベクトルであってよく、当該ベクトルに適当な処理をしたベクトルであってよい。そのような処理としては、連続的な値を離散的な値に変換するビニング処理、又は正規化処理等の、処理前のベクトルにおける各成分の大小関係を実質的に変化させないような処理が挙げられる。

　散布図作成手段は、特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する。また、散布図作成手段は、細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を第１の散布図と同様にマッピングし、マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにおいて代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つを可視化することにより、第２の散布図を作成してもよい。

　図４において、散布図作成手段は、特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルを生成する代表ベクトル生成手段と；細胞外微粒子の集団の中からマッピングする細胞外微粒子を決定するマッピング対象決定手段と；代表ベクトルの類似度に基づいてマッピング対象と決定された複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングするマッピング手段と；マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれをラベリングするラベリング手段と；マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにおいて代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つを可視化する成分可視化手段とを備える。

　代表ベクトル生成手段は、例えば入力部からの指示により、又は所定のアルゴリズムに基づいて特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルを生成する。代表ベクトル生成手段は、例えば全ての細胞外微粒子において値が閾値以下又は閾値以上である成分を特徴量ベクトルから削除して代表ベクトルを生成してもよい。

　マッピング対象決定手段は、例えば特徴量ベクトル又は代表ベクトルに基づいてマッピングする細胞外微粒子を決定する。例えば、代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの全てが閾値以下である細胞外微粒子をマッピングから除外したり、代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうち、所定の成分が閾値以上、又は閾値以下である細胞外微粒子のみをマッピングしたり、当該細胞外微粒子をマッピングから除外したりしてよい。

　マッピング手段は、代表ベクトルの類似度に基づいて２次元又は３次元上にマッピングする。当該マッピングは、例えば各細胞外微粒子に対応する代表ベクトルを次元削減することにより実施してもよく、機械学習により実施してもよい。具体的な手法は、本実施形態の分析方法において詳述したとおりである。

　ラベリング手段は、マッピング手段によりマッピングされた各細胞外微粒子に対応する各点を、代表ベクトルの成分のうちの少なくとも複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングする。各細胞外微粒子に付すラベルは、入力部からの指示により、又は所定のアルゴリズムに基づいて設定してもよい。具体的な手法は、本実施形態の分析方法において詳述したとおりである。

　成分可視化手段は、マッピング手段によりマッピングされた各細胞外微粒子に対応する各点に、代表ベクトルの成分の複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つの値の大小の情報を付与する。成分可視化手段は、当該情報を色彩により可視化してもよく、細胞外微粒子に対応する各点のサイズにより可視化してもよい。成分可視化手段が可視化する代表ベクトルの成分は、入力部からの指示により設定されてよい。

　クラスター生成手段は、第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成する。クラスター生成手段は、第１の散布図における所定の範囲に含まれる細胞外微粒子に同一のクラスター情報を付与してもよい。同一のクラスター情報を付与する範囲は、入力部からの指示により、又は所定のアルゴリズムに基づいて設定されてよい。用いるアルゴリズムとしては、例えばｋ－ｍｅａｎｓ、ｋ－ｍｅａｎｓ＋＋、サポートベクトルマシーン（ＳＶＭ）、及びカーネルＳＶＭ等が挙げられる。

　図５は、情報処理部３の物理的な構成の一例を示すブロック図である。図５において、情報処理部３は、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）３１、ＲＯＭ（リードオンリーメモリ）３２、ストレージ３３、ＣＰＵ（中央処理装置）３４、受信手段３５、及び送信手段３６、並びにこれらを接続するシステムバス３７を有する。

　ＲＡＭ３１は、データの書き換えが可能なメモリであり、メインメモリとしての役割を果たす。ＲＡＭ３１は、例えば半導体記憶素子で構成されてよく、ＣＰＵ３４が実行するアプリケーション等のプログラム及び各種データを記憶する。

　ＲＯＭ３２は、データの読み出しのみが可能なメモリであり、例えば半導体記憶素子で構成されてよい。ＲＯＭ３２は、例えばファームウェア等のプログラム及びデータを記憶する。

　ストレージ３３は、データの書き換えが可能なメモリであり、補助メモリとしての役割を果たす。ストレージ３３は、例えば半導体記憶素子、光学ディスク、ＨＤＤ（ハードディスクドライブ）、又は磁気テープで構成されてよく、プログラムや各種データを格納する。

　ＣＰＵ３４は、ＲＡＭ３１及び／又はＲＯＭ３２に記憶されたプログラムの実行に関する制御、並びにデータの演算及び加工を行う制御部である。情報処理部３は、ＣＰＵ３４の制御の下、細胞外微粒子の分析に関する機能を実現する。ＣＰＵ３４は、受信手段３５から受信した情報及び指示に基づいて分析を実行し、分析結果を送信手段３６で送信したり、ＲＡＭ３１及びストレージ３３等の各種記憶装置に格納したりする。

　受信手段３５は、検出部２及び入力部４からの情報及び指示を情報処理部３に受け付ける手段であり、送信手段３６は情報処理部３からの情報及び分析結果を検出部２及び出力部５に送信する手段である。受信手段３５及び送信手段３６は、無線通信又は有線通信であってよい。

　情報処理部３では、ＣＰＵ３４が細胞外微粒子分析プログラムを実行することにより、図４を用いて説明した種々の機能が実現される。なお、これらの物理的な構成は例示であって、必ずしも独立した構成でなくてもよい。例えば、情報処理部３は、ＣＰＵ３４とＲＡＭ３１、ＲＯＭ３２及び／又はストレージ３３が一体化したＬＳＩ（Large-Scale Integration）を備えていてもよい。

（変形例）
　以上、図３～５を参照して本実施形態の細胞外微粒子の分析装置を説明したが、本実施形態の細胞外微粒子の分析装置はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。例えば分析装置１は、図３～５に示されていない機能構成又は物理構成を備えていてもよく、図３～５に示された機能構成又は物理構成が省略されていてもよい。

　例えば、情報処理部３は、細胞外微粒子の集団を上記で詳述した分析方法により分析することで得られる分析データを教師データとして機械学習によりモデル（細胞外微粒子特性予想モデル）を生成するモデル生成手段を備えていてもよく、第１の散布図を作成せずに代表ベクトルの類似度に基づいて細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類する分類手段を備えていてもよい。

［分離装置］
　本実施形態の別の一態様に係る細胞外微粒子の分離装置は、細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して細胞外微粒子の構成成分又は構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；検出された散乱光及び複数の発光に基づいて細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに細胞外微粒子の集団を上記態様に係る分析方法のいずれかにより分析することで得られる分析データと、取得した特徴量ベクトルとに基づいて、細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する判断手段を含む情報処理部と；細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離する分離部と；を備える。

　本実施形態の分離装置は、例えば上記で説明した本実施形態の分析装置の構成に加えて、細胞外微粒子を細胞外微粒子の集団から分離する分離部をさらに備える。また、情報処理部は、所定の特徴量ベクトルを有する細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する判断手段をさらに備える。

　判断手段は、入力部からの指示により、又は所定のアルゴリズムに基づいて分離する細胞外微粒子の特性を定め、所定の特徴量ベクトルを有する細胞外微粒子が当該定められた細胞外微粒子と同じ特性を有するかどうかを判断する。例えば、判断手段は、細胞外微粒子の集団を上記で詳述した分析方法により分析することで得られる分析データに基づいて、特徴量ベクトル又は代表ベクトルの各成分がどのような範囲である場合に細胞外微粒子を分離すべきかを設定してもよく、所定の特徴量ベクトルを有する細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する予測モデルを生成してもよい。

　分離部は、判断手段が分離対象と判断した細胞外微粒子を分離する。分離部は、例えば細胞外微粒子を含む液滴を形成するための液滴形成手段と、形成した液滴を荷電させる荷電手段と、荷電した液滴に静電力を与え液滴の軌道を変化させる偏向板と、分離対象である細胞外微粒子を含む液滴を捕集する捕集手段とを備えていてよい。あるいは、分離部は、分離対象である細胞外微粒子が検出されたタイミングで弁を開閉することにより分離対象である細胞外微粒子を分離する開閉手段を備えていてもよい。

［付記］
　本発明は、以下の実施形態を含む。
［１］
　細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；
　前記特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、前記代表ベクトルの成分のうちの少なくとも前記検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成することと；
　前記第１の散布図に基づいて、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することと；
　を含む、細胞外微粒子の分析方法。
［２］
　前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を前記第１の散布図と同様にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにおいて前記代表ベクトルの成分の前記検出した複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つを可視化することにより、第２の散布図を作成することをさらに含む、［１］に記載の分析方法。
［３］
　前記第１及び第２の散布図を表示することと；
　前記表示された第１及び第２の散布図に基づいて、前記クラスターのうちの少なくとも１つの特性を同定することと；
　をさらに含む、［２］に記載の分析方法。
［４］
　前記第１の散布図の作成において、前記代表ベクトルの成分の前記検出した複数の発光に対応する複数の成分のうちの全てが閾値以下である細胞外微粒子をマッピングから除外する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の分析方法。
［５］
　前記細胞外微粒子の集団が、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖からなる群より選択される少なくとも３種が染色された細胞外微粒子の集団である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の分析方法。
［６］
　前記細胞外微粒子の集団が、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の全てが染色された細胞外微粒子の集団である、［５］に記載の分析方法。
［７］
　細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；
　前記特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて前記細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類することと；
　を含む、細胞外微粒子の分析方法。
［８］
　細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；
　細胞外微粒子の集団を［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子の特性を分析することと；
　を含む、細胞外微粒子の分析方法。
［９］
　細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；
　細胞外微粒子の集団を［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断することと；
　前記細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、前記細胞外微粒子を前記細胞外微粒子の集団から分離することと；
　を含む、細胞外微粒子の分離方法。
［１０］
　細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、
　前記取得した特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、前記代表ベクトルの成分のうちの少なくとも前記検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する散布図作成手段、並びに
　前記第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成するクラスター生成手段
　を含む情報処理部と；
　を備える、細胞外微粒子の分析装置又は分析システム。
［１０－１］
　細胞外微粒子の分析装置における情報処理部を、
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、
　前記取得した特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、前記代表ベクトルの成分のうちの少なくとも前記検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する散布図作成手段、並びに
　前記第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成するクラスター生成手段
　として機能させる細胞外微粒子の分析プログラム。
［１１］
　細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに
　細胞外微粒子の集団を［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子の特性を分析する特性分析手段
　を含む情報処理部と；
　を備える、細胞外微粒子の分析装置。
［１１－１］
　細胞外微粒子の分析装置における情報処理部を、
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに
　細胞外微粒子の集団を［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子の特性を分析する特性分析手段
　として機能させる細胞外微粒子の分析プログラム。
［１２］
　細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに
　細胞外微粒子の集団を［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する判断手段
　を含む情報処理部と；
　前記細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、前記細胞外微粒子を前記細胞外微粒子の集団から分離する分離部と；
　を備える、細胞外微粒子の分離装置。
［１２－１］
　細胞外微粒子の分離装置における情報処理部を、
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに
　細胞外微粒子の集団を［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する判断手段
　として機能させる細胞外微粒子の分析プログラム。
［１３］
　［１］～［７］のいずれか１つに記載の分析方法に用いる細胞外微粒子の集団を含む試料を調製する方法であって、
　細胞外微粒子の集団を含む試料を、前記細胞外微粒子の構成成分に結合する複数の標識物質により標識することを含む、調製方法。
［１４］
　前記複数の標識物質が、核酸染色試薬、タンパク質染色試薬、脂質染色試薬、及び糖鎖染色試薬からなる群より選択される少なくとも３種を含む、［１３］に記載の調製方法。
［１５］
　前記複数の標識物質が、分子量が２万以下の化合物を含む、［１３］又は［１４］に記載の調製方法。

　以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

１．方法
［ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターのセットアップ］
　クラスＩＩタイプＡＩＩバイオセーフティキャビネット（Ｂａｋｅｒ）内に３５５、４０５、４８８、５６１、及び６４０ｎｍレーザを装着したＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーター（BD Biosciences）を設置した。前方散乱信号を収集するために、高ＮＡの長作動距離の２０倍対物レンズ、直径０．７ｍｍのピンホール、及び異なる偏光方向（ＦＳＣ－ｐａｒ及びＦＳＣ－ｐｅｒ）の光を検出する２つの光電子増倍管（以下、「ＰＭＴ」という。）からなる光学系を用いた。１００ｎｍ粒子を検出するためにＦＳＣの感度を調整すると、５００ｎｍ粒子はＦＳＣで飽和シグナルを示し、偏光ＦＳＣ（ＦＳＣ－ｐｅｒｐ）はより大きな粒子（＞２００ｎｍ）の分析に利用可能であった。そこで、ＦＳＣとＦＳＣ－ｐｅｒｐを用いて、細胞外微粒子の広範囲のサイズを分析した。ＦＳＣのノイズ信号を低減するために、従来の５ｍｍバーより８ｍｍのオブスキュレーションバーの方が優れているとの報告があることから（Arkesteijn, G.J.A. et al. Improved Flow Cytometric Light Scatter Detection of Submicron-Sized Particles by Reduction of Optical Background Signals. Cytometry A 97, 610-619 (2020).）、２ｍｍバー上にアルミニウム製の８ｍｍバーを作製した。

　ノズルのサイズ（７０、８６、１００及び１４０μｍ）は細胞外微粒子分析の解像度に有意な影響を及ぼさなかったが、シース液の流速を速くすると粒子からのシグナルが減少した。そこで、７０μｍノズルを選択し、シース圧を２４．０ｐ．ｓ．ｉ．に調整した。レーザの位置合わせは、ユーザガイドに従い、ultra rainbow fluorescent particles（Spherotech）で最適化した。すべての信号はＰＭＴ検出器によって収集し、対数目盛（１０^０～１０^４）で高さ信号として表示した。細胞外微粒子分析のための最適閾値トリガーを決定するために、ＦＳＣシグナルの電圧を３３で調整し、１００ｎｍ蛍光ビーズ（Invitrogen）を測定した。０．５８～０．６のＦＳＣ閾値を採用した。ＦＳＣ－ｐｅｒｐ電圧は、３３（ＦＳＣとの比較用）又は１４（大きな粒子及び細胞の分析用）に設定した。細胞外微粒子分析では、ノイズの信号強度が１０^１未満になるように蛍光電圧を調整した。特に断りのない限り、サンプル圧力を２４．９～２５．２ｐ．ｓ．ｉ．の間に設定し、検出回数が３０，０００／秒を超えないようにした。

［蛍光ビーズのソーティング］
　１００ｎｍ（Invitrogen）、並びに２００、５００、及び１０００ｎｍ（Polysciences）のビーズをＰＢＳ中で混合し、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターで分析した。ソーティングのセットアップにおいて、液滴形成は、ＳＳＣシグナルを損なうだけでなく、液滴形成によるシース液の液体表面上のレーザービームの入射角の変化に起因すると考えられるＦＳＣ閾値トリガーにおけるノイズシグナルの数も増加させた。この効果は、液滴のノズル位置とブレークオフ位置を下げることによって低減できることを見出した。これらの予備的知見に従い、最も高いブレークオフ位置を得るために、最初に６０．２～６０．８の間に滴下周波数を調整した。次に、ピエゾ振幅を、安定なテスト流（通常３．０～４．５）を形成する最低値に設定した。荷電タイミングはAccuDropビーズ（BD Biosciences）を用いて最適化した。最適な荷電タイミングはノイズの増加によって変化し、ＦＳＣ閾値が０．６での最適な荷電タイミングでは、標的液滴の収集に失敗したため、ノイズ信号を排除するために、荷電タイミングは、増加したＦＳＣ閾値トリガー（約３．０）の下で最適化されるべきであることを見出した。荷電タイミングの調整後、ＦＳＣ閾値トリガーを０．５８～０．６に戻した。次いで、標的粒子を双方向ソーティングモードでソーティングし、コーティングされていない１．５又は５ｍＬチューブに集めた。

　１００、２００、５００、及び１０００ｎｍビーズの混合物を、ＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩセルソーター、及びＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａによっても、オリジナルの光学系を用いて測定した。ＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩによる１００～５００ｎｍの粒子の検出又はＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａによる１００～２００ｎｍの粒子の検出は、ＦＳＣ閾値トリガーによる飽和ノイズシグナルのため困難であった。ＦＳＣ電圧及び閾値を、ノイズシグナルが５０００回／秒未満になるように調整した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ　ＬＸ　（Beckman coulter）を用いた蛍光ビーズの検出には、小粒子分析のユーザガイドに従ってバイオレットＳＳＣ閾値を適用した。ＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩによる１０００ｎｍの粒子のソーティングは純度モードで行った。ソート画分の再分析をＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘで行った。ソートされた試料の純度を、１００、２００、５００、及び１０００ｎｍの集団の合計に対する各集団の比として計算した。

［試料の準備］
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週齢）を日本のCLEAから購入した。血液を２，０００×ｇで１０分間遠心分離することによりマウス血清を採取し、使用するまで－８０℃に保った。マウスＢＡＬＦの分析のために、マウスを麻酔下で、３０μＬのＰＢＳ中の０．１～１０　ＬＤ_５０のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ／８／１９３４インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスで鼻腔内感染させた。
　予防的処置としては、マウスに、Ｎｅｗ　Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）（大阪大学微生物病研所）由来のＨＡを含有する１価インフルエンザスプリットワクチン（ＳＶ）１μｇを、３００ｎｇの水酸化アルミニウム塩（Alum）（Invivogen）又は１０μｇのＫ３　ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（GeneDesign）と共に又はそれらなしで、尾部の付け根に、ウイルス感染の１７日前及び７日前に接種した。
　治療処置としては、マウスに、２０ｍｇ／ｋｇ／日のリン酸オセルタミビル（selleck）を１～３日目（ｄｐｉ）に経口投与した。４日目に肺をＰＢＳ（Natalai tesque）で洗浄してＢＡＬＦを採取した。２２ゲージのプラスチック製カニューレ（Terumo）を切開した気管に挿入した。次いで、１ｍＬシリンジに充填したＰＢＳ０．７ｍＬを注入し、吸引した。初回洗浄時に約０．５ｍＬのＢＡＬＦを採取した（デッドボリュームは約０．２ｍＬ）。次に、ＰＢＳ０．５ｍＬで再度洗浄し、ＢＡＬＦ０．５ｍＬ（計１ｍＬ）を採取した。次いで、大きな凝集体を除去するために、ＢＡＬＦを７０μｍセルストレーナーで濾過し、次のアッセイに使用した。

　インフォームド・コンセントを得た後、健康な成人からヒトヘパリン処理血液を採取した。ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣｓ）及び血漿を得るために、血液を等容量のＰＢＳで希釈し、Ficoll Histopaque（GE healthcare）の頂部に穏やかに層状にした。９００×ｇで２０分間遠心後、ｈＰＢＭＣ含有白色バフィーコートと上層の血漿を回収した。使用するまで血漿を－８０℃に保った。ＰＢＭＣを培地で２回洗浄し、以下に説明するようにその後の実験に使用した。

［細胞外微粒子のマルチパラメトリック分析とその後のデータ処理］
　細胞外微粒子のマルチパラメトリック分析のために、ＢＡＬＦを４００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を除去し、続く染色のために上清を回収した。分析対象が細胞外微粒子と細胞の両方である場合、ＢＡＬ細胞は、４００×ｇで５分間の遠心分離により３０倍濃縮された。次に、試料をアネキシンＶ染色用緩衝液で５倍希釈した。他の染色試薬の存在下ではＣｅｌｌＭａｓｋ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄによる膜性粒子の染色が妨げられたため、ＣｅｌｌＭａｓｋ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄは、他の染色試薬に先立って最初に試料と混合した。その後、その他の染色試薬を以下の終濃度となるように添加した：　ＣｅｌｌＭａｓｋ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄ（１／１００００）、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ（１／５０００）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１／１００）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ｓｔａｉｎ　Ｎｅａｒ－ＩＲ（Invitrogen，１／１０００）、ＢＶ５１０　Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ（１／２０）、ＣＦ４０５Ｍ　ＷＧＡ（１／２００）、ＣＦ５６８　ＰＮＡ（１／２０）、ＲＰＥ－ＣＦ６４７Ｔ抗ＨＡ抗体（１／１００）、ＰＥ－ＣＦ５９４抗ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ抗体（BD bioscicence，１／１００）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ１１ｃ抗体（Biolegend，１／１００）、ＢＶ７８５抗Ｌｙ６Ｃ抗体（Biolegend，１／１００）。２０分間のインキュベーション後、試料をアネキシンＶ染色用緩衝液で希釈し、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターによって測定した。

　データは、ＦｌｏｗＪｏ　（ｖ１０．７．２）で以下の手順に従って分析した。まず、蛍光シグナルの補正を単一染色対照によって手動で行った。補正値は、他のチャネルにおいて染色された粒子として検出されることを回避する最小パーセンテージとして決定した。次に、全ての粒子、又は「or」ゲートを適用することによって抽出された染色された粒子を、ｔ－ＳＮＥ（ｏｐｔ－ＳＮＥ、iterations:　１０００、　perplexity:　３０）、ＵＭＡＰ、又はＦｌｏｗＳＯＭによって分析した。細胞外微粒子を染色するための全ての蛍光パラメータをｔ－ＳＮＥ分析に含めた。細胞をｔ－ＳＮＥで分析する場合、細胞表面マーカーはパラメータとしてのみ含まれた。ｔ－ＳＮＥ分析の結果は、各図に示した順序の優先度で示された色でドットプロット又はカウンタプロットとして可視化された。

［機械学習のためのフローサイトメトリーデータの特徴量エンジニアリング］
　個々のＢＡＬＦのフローサイトメトリー分析のデータを機械学習に利用するために、フローサイトメトリー分析の生データの特徴をビニングにより生成した。詳細には、フローサイトメトリーによって検出された各粒子は、散乱光及び蛍光シグナルからなる多次元情報を有する。そこで、ＢＡＬＦ中の細胞外微粒子濃度をなるべく情報を保持しながら特徴として得るために、７つのビンを作成し、ＦＳＣ信号に基づいて粒子を７サイズに分割した。さらに、各サイズの粒子を、各蛍光強度についてさらに２つのビンに分割した。すべての蛍光シグナルでこの過程を繰り返すことにより、ＢＡＬＦ粒子は３５８４ビンに分類された。これらの手順は、ＦｌｏｗＪｏで実施された。ブランクビンを除去した後、２０００ビンのカウントデータをＢＡＬＦサンプルの特徴として使用した。

［機械学習分析］
　機械学習フレームワークは、ライブラリ（scikit-learn（バージョン１．０．２）、numpy（バージョン１．２１．５）、pandas（バージョン１．４．２））を使って、Python（バージョン３．１０）上に構築した。各予測子は３つのscikit‐learnパイプラインのアンサンブルとして構築した。言い換えれば、応答予測は３つの分類パイプラインによって生成されたスコアの平均として計算された。

［統計解析］
　実験は、独立して少なくとも２回行った。実験結果は平均±ＳＥＭで示した。群間差の統計的有意性は、対応のないスチューデントのｔ検定又はテューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡにより判定した。有意差はアスタリスクでアノテーションした：Ｐ＜０．０５：＊、Ｐ＜０．０１：＊＊、Ｐ＜０．００１：＊＊＊。

２．細胞外微粒子の検出及び分類のための光学系の最適化
　細胞外微粒子のフローサイトメトリー分析の主要な問題の一つは、ノイズシグナルを排除する閾値トリガーを最適化することである。閾値を下げることは、より小さい粒子を検出するために必要であるが、それはまた、ノイズ信号の増加及び信号処理の飽和をもたらし、その結果、対象とする粒子の検出数が減少する。蛍光ベース閾値化（fluorescence-based thresholding）は、ノイズシグナルから蛍光標識粒子を分離するのに効果的な方法であるが、非標識粒子を排除するため包括的な分析には適さない。そこで、サンプル中の全粒子を分析するために、ＦＳＣベース閾値化（FSC-based thresholding）のための光学系の最適化を試みた。

　高感度ＰＭＴ検出器と偏光ユニットによる多重ＦＳＣパラメータにより幅広いＦＳＣを収集することができるので、細胞外微粒子の分析と選別のためにＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターを選択した。既報（Arkesteijn, G.J.A. et al. Improved Flow Cytometric Light Scatter Detection of Submicron-Sized Particles by Reduction of Optical Background Signals. Cytometry A 97, 610-619 (2020).；　Nolte-'t Hoen, E.N. et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine 8, 712-720 (2012).）に従い、１００ｎｍの蛍光ビーズを検出するために、８ｍｍのオブスキュレーションバーを採用した。また、広範囲のサイズをカバーするために偏光ユニットを用いた（図６ａ）。ＦＳＣ閾値化が偏光ＦＳＣ（ＦＳＣ－ｐｅｒｐ）よりも１００ｎｍビーズの検出において好ましい結果を示したため、通常のＦＳＣ及び偏光ＦＳＣにより、それぞれ小さい（１００～２００ｎｍ）粒子及び大きい（＞２００ｎｍ）粒子を分析した（図６ｃ）。

　次に、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターによる粒子のソーティング試験を実施した。最適化された光学系によるＦＳＣ閾値化により、高純度（＞９９％）で異なるサイズの蛍光ビーズを分離することができた（図６ｅ）。フォトダイオードＦＳＣを備えた従来のセルソーターであるＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩは、ノイズシグナルの飽和のために１０００ｎｍ未満のビーズの検出及びソートが困難であった（図６ｂ、ｄ）。ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターにより再分析したところ、ＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩで仕分けられた１０００ｎｍ粒子画分は他のビーズにより有意に汚染されていた。これは、最適化されていないＢＤ　Ａｒｉａ　ＩＩＩでは、１０００ｎｍ及び１００～５００ｎｍ粒子の両方を含有する液滴を排除できないためであると考えられる（図６ｆ）。また、フォトダイオードＦＳＣを搭載したアナライザとしてのＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ及びＣｙｔｏＦＬＥＸは、ＢＤ　ＩｎｆｌｕｘよりもＦＳＣ信号の分解能が低かった。

　ＢＤ　ＩｎｆｌｕｘセルソーターにおけるデュアルＦＳＣシグナルのサイズ範囲をさらに検証するために、細胞と細胞外微粒子の両方を含む試料としてＢＡＬＦを測定した。ＦＳＣ－ｐｅｒｐ及びＳＳＣのスケールをｌｏｇから線形に変化させることにより、細胞は典型的なサイトメトリー分析と同じように検出された（図７ａ）。また、細胞外微粒子はＦＳＣからＦＳＣ－ｐｅｒｐスケールまでの連続した集団として示された。これは細胞外微粒子の不均一なサイズ分布を反映していると考えられる（図７ｂ）。

３．多色染色に基づく細胞外微粒子の高解像度特性評価
　不均一な細胞外微粒子中の集団を同定するための細胞外微粒子染色の可能性を評価するために、洗浄工程なしで、核酸、脂質膜、糖鎖及びタンパク質を標的とすることにより、細胞外微粒子を含有するＢＡＬＦの８色染色を行った（図７ａ）。上記の蛍光プローブに加えて、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ｆｉｘａｂｌｅ　ｄｅａｄ　ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎ、アミン反応性蛍光染色試薬をタンパク質の標識物質として利用した。これらは、大きな細胞外微粒子に対する抗体の非特異的結合の同定のために用いた。また、ウイルス粒子を検出するために、蛍光標識抗血球凝集素（ＨＡ）抗体を調製した。その結果、ＦＳＣ領域の小さな細胞外微粒子は各プローブで染色され、そのうちのいくつかはウイルス感染によって著しく増加した（図７ｃ）。ＢＡＬＦにおける細胞外微粒子の不均一性を可視化するために、蛍光及びＦＳＣシグナルに基づくｔ－ＳＮＥ（T-distributed Stochastic Neighbor Embedding）分析を実施し、プローブで染色された粒子が非染色粒子から分離された集団として示されることを明らかにした（図７ｄ）。主にノイズシグナルから成る非染色粒子が主要集団として示され、染色された集団の解像度を低下させたため、次に、「ｏｒ」ゲートを設定することにより、少なくとも１つの蛍光プローブで染色された粒子のみを含めたｔ－ＳＮＥ分析を実施した（図７ｅ）。このデータ処理は、各集団の解像度を高め、ウイルス粒子、糖鎖又は核酸を含有する粒子、及び他の膜性粒子を別個の集団として提示することを可能にした（図７ｆ）。さらに、他の次元削減アルゴリズムとしてＵＭＡＰ（Uniform Manifold Approximation and Projection）分析を実施した。ＵＭＡＰ分析は、分離した集団としてＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子を示し、それらの独特の特性を示唆した。また、自己組織化マップ（ＦｌｏｗＳＯＭ）により、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性の粒子集団は単一集団としてクラスター化された。

　このマルチパラメトリック分析の有用性をさらに検証するために、本ワークフローをウイルス感染の重症度の評価に適用した。この実験では、細胞外微粒子だけでなく、細胞も表面マーカーを抗体でターゲティングして染色し、従来のゲーティング戦略とその後の機械学習によって分析した。その結果、好中球及び単球を含む炎症細胞がインフルエンザウイルスの投与量に対応して増加した（図８ａ、ｂ）。染色された細胞外微粒子の分析から、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子のようないくつかの集団の数が疾患の重症度と相関することが示唆された（図８ａ、ｂ）。さらに、予防・治療モデルを用いた他の実験でも、糖鎖陽性粒子及びＨＡ陽性粒子がウイルス感染中の状態を反映している可能性が示唆された。さらに、培地中の細胞外微粒子を染色することにより、細胞外微粒子染色がＰＢＭＣの培養上清のような他の液体にも適用可能であることを確認した。

４．細胞外微粒子の選択的分離
　次に、ｔ－ＳＮＥで示された細胞外微粒子の集団がフローサイトメトリーソーティングによって分離できるかどうかを評価した。図９ｃに示したゲート戦略に従い、主要な細胞外微粒子の集団をソートした。選別されたＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子の再分析のためにソート後の溶液のＳＹＢＲ　ｇｏｌｄによる再染色が必要であった。これは、おそらく、ソートされた核酸からの染色試薬の解離に起因すると考えられるが、シース液中のいくつかのより大きな粒子も染色された。標的細胞外微粒子をゲートしたクラスタリング分析は、各集団の濃縮を示した（図９ａ）。ｔ－ＳＮＥプロットで細胞外微粒子の集団をゲーティングし、その比率を計算すると、標的集団の純度が蛍光ビーズをソートしたときの純度より低かった（図６ｅ及び９ａ）。これは、特に結合を維持するためにカルシウムイオンを必要とするアネキシンＶに顕著であると考えられるが、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄと同様に、蛍光プローブの解離に起因すると考えられる。また、従来の細胞外微粒子の分離法との比較のために、分画遠心分離法（ＤＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で捕集した画分中の染色粒子を分析したところ、フローサイトメトリーによるソーティングよりも分離能が低かった（図９ａ）。ＳＥＣ分離後にＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子が細胞外微粒子画分から除去されたことは、洗浄ステップを必要とする分析方法では、非結合染色試薬だけでなく粒子自体も流出してしまい、細胞外微粒子の包括的分析を妨げるという仮説を支持した。ソートされた画分中のウイルスＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲは、ウイルスＲＮＡがＨＡ陽性画分のみに濃縮され、他の集団には濃縮されないことを示した。これは、フローサイトメトリーソーティングによるウイルス粒子の分離に成功したことを示唆している（図９ｂ）。

５．多色分析及び選別に基づく非膜細胞外微粒子の集団の同定
　マルチパラメトリック分析によって分類された細胞外微粒子の中から、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子を含む細胞外核酸の詳細を明らかにすることを試みた。ＢＡＬＦ中の核酸含有粒子は、大部分がＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８陽性集団と、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性集団とに分けられた。さらに、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子をＦＳＣシグナルに基づいて小さな集団と大きな集団に分割した。これらの集団のソーティング及びその後のＰＣＲ分析により、他の集団よりもミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の量が多いという、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性大粒子中の核酸の明確な特徴を見出した。最も豊富な核酸陽性集団であるＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性小粒子をさらに特徴づけるために、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性小粒子がＣｅｌｌＭａｓｋ　ｄｅｅｐ　ｒｅｄに対して陰性であることを確認した。次に、これらの核酸がヒストンのようなタンパク質と複合体を形成しているかどうかを調べた。ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性粒子の抗シトルリン化ヒストンＨ３（ｃｉｔ－Ｈ３）抗体による共染色は、ＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性小粒子が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）から断片化されたＤＮＡ／ヒストン複合体であることを示唆した。ほとんどのｃｉｔ－Ｈ３陽性粒子がＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性小粒子に対応するというフローサイトメトリーの結果をもとに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）でＢＡＬＦ中のｃｉｔ－Ｈ３陽性粒子を分析することによりＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性小粒子の構造を評価した。その結果、ｃｉｔ－Ｈ３陽性粒子は非膜型として観察され、これはクロマチンのＴＥＭ像と類似していた。これらの結果は、細胞外微粒子の分析及びソーティングのための本発明に基づく戦略が膜粒子だけでなく非膜粒子の特性を明らかにできることを示唆する。次いで、これらのＤＮＡ／ヒストン複合体を他のフローサイトメーターで分析できるかどうかを評価した。ナノ粒子分析に特化したｎａｎｏＦＣＭもＳＹＢＲ　ｇｏｌｄ陽性ｃｉｔ－Ｈ３陽性粒子を検出した。ｎａｎｏＦＣＭによるこれらの粒子の推定サイズは約７０ｎｍであり、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターの検出限界が１００ｎｍ未満であることを示唆した。

６．結語
　以上のように、細胞外微粒子全体の染色を実現するために、細胞の詳細な分類を行うための各種蛍光プローブによる細胞の複数の成分の染色の概念を細胞外微粒子の分析に応用することにより、細胞外微粒子の分析・分離のためのロバストなワークフローを開発した。セルソーターの微調整により、１００ｎｍから１μｍ以上の不均一サイズの粒子を検出し、ソートすることができた。脂質、核酸、糖鎖及びタンパク質に対する蛍光プローブのスクリーニングの結果として、洗浄工程を必要としない細胞外微粒子の多色染色のための染色試薬の適切な組み合わせを明らかにした。また、従来の単離法では達成できなかったバルク試料からの標的粒子の高純度分別も確認した。本発明は、例えば簡単な手順で生物学的試料中の全粒子を分析し、ソートするための普遍的方法を提案する。

７．セルソーターの変更
　ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターに代えて他のセルソーターを用いても上記の１．～６．のように細胞外微粒子の分析が実施できることを確認した。セルソーターとしてＢＤ　ＦＡＣＳＤｉｓｃｏｖｅｒ　Ｓ８（Becton, Dickinson and Company）を用いた。セットアップは、ＦＳＣ閾値トリガーに代えてＳＳＣ閾値トリガーを用いたこと以外は、ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターと同様にした。

［蛍光ビーズのソーティング］
　上記の１．に記載の方法により、蛍光ビーズのソーティングを実施した。ＳＳＣ閾値化により、高純度で異なるサイズの蛍光ビーズを分離できることを確認した（図１０）。

［細胞外微粒子の高解像度特性評価］
　上記１．及び３．に記載の方法により、細胞外微粒子の高解像度特性評価を実施した。測定試料として、インフルエンザウイルスで鼻腔内感染させたマウスと、感染させなかったマウスのＢＡＬＦとを、それぞれ用いた。結果を図１１に示す。図１１において、インフルエンザウイルスで鼻腔内感染させたマウスで、所定の種類に分類された細胞外微粒子の割合が増加したことが示されている。

［細胞外微粒子の選択的分離］
　上記１．及び４．に記載の方法により、ｔ－ＳＮＥで示された細胞外微粒子の集団をフローサイトメトリーソーティングによって分離した。ＢＤ　Ｉｎｆｌｕｘセルソーターを用いたときと同様に特定の細胞該微粒子を選択的に分離できることがわかった（図１２）。

　１…分析装置、２…検出部、３…情報処理部、４…入力部、５…出力部、３１…ＲＡＭ、３２…ＲＯＭ、３３…ストレージ、３４…ＣＰＵ、３５…受信手段、３６…送信手段、３７…システムバス。

Claims

　細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；
　前記特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、前記代表ベクトルの成分のうちの少なくとも前記検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成することと；
　前記第１の散布図に基づいて、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子を２以上のクラスターに分類することと；
　を含む、細胞外微粒子の分析方法。
　前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を前記第１の散布図と同様にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにおいて前記代表ベクトルの成分の前記検出した複数の発光に対応する複数の成分のうちの１つを可視化することにより、第２の散布図を作成することをさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
　前記第１及び第２の散布図を表示することと；
　前記表示された第１及び第２の散布図に基づいて、前記クラスターのうちの少なくとも１つの特性を同定することと；
　をさらに含む、請求項２に記載の分析方法。
　前記第１の散布図の作成において、前記代表ベクトルの成分の前記検出した複数の発光に対応する複数の成分のうちの全てが閾値以下である細胞外微粒子をマッピングから除外する、請求項１に記載の分析方法。
　前記細胞外微粒子の集団が、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖からなる群より選択される少なくとも３種が染色された細胞外微粒子の集団である、請求項１に記載の分析方法。
　前記細胞外微粒子の集団が、核酸、タンパク質、脂質、及び糖鎖の全てが染色された細胞外微粒子の集団である、請求項５に記載の分析方法。
　細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成することと；
　前記特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて前記細胞外微粒子の集団を２以上のクラスターに分類することと；
　を含む、細胞外微粒子の分析方法。
　細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；
　細胞外微粒子の集団を請求項１～７のいずれか１項に記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子の特性を分析することと；
　を含む、細胞外微粒子の分析方法。
　細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出することにより、前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを取得することと；
　細胞外微粒子の集団を請求項１～７のいずれか１項に記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断することと；
　前記細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、前記細胞外微粒子を前記細胞外微粒子の集団から分離することと；
　を含む、細胞外微粒子の分離方法。
　細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子の集団の各細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、
　前記取得した特徴量ベクトルの一部又は全部の成分からなる代表ベクトルの類似度に基づいて、前記細胞外微粒子の集団に含まれる少なくとも一部の複数の細胞外微粒子を２次元又は３次元上にマッピングし、前記マッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれを、前記代表ベクトルの成分のうちの少なくとも前記検出した複数の発光に対応する複数の成分に基づいてラベリングすることにより、第１の散布図を作成する散布図作成手段、並びに
　前記第１の散布図にマッピングされた複数の細胞外微粒子のそれぞれにクラスター情報を付与することで、複数の細胞外微粒子が属する２以上のクラスターを生成するクラスター生成手段
　を含む情報処理部と；
　を備える、細胞外微粒子の分析装置。
　細胞外微粒子に光を照射し、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに
　細胞外微粒子の集団を請求項１～７のいずれか１項に記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子の特性を分析する特性分析手段
　を含む情報処理部と；
　を備える、細胞外微粒子の分析装置。
　細胞外微粒子の集団内の細胞外微粒子について、照射された光の散乱光と、照射された光に起因して前記細胞外微粒子の構成成分又は前記構成成分に結合した標識物質から生じる、ピーク波長が互いに異なる複数の発光と、を検出する検出部と；
　前記検出された前記散乱光及び複数の発光に基づいて前記細胞外微粒子に対応する特徴量ベクトルを生成する特徴量ベクトル生成手段、並びに
　細胞外微粒子の集団を請求項１～７のいずれか１項に記載の分析方法により分析することで得られる分析データと、前記取得した特徴量ベクトルとに基づいて、前記細胞外微粒子が所定の特性を有するかを判断する判断手段
　を含む情報処理部と；
　前記細胞外微粒子が所定の特性を有すると判断された場合に、前記細胞外微粒子を前記細胞外微粒子の集団から分離する分離部と；
　を備える、細胞外微粒子の分離装置。
　請求項１～７のいずれか１項に記載の分析方法に用いる細胞外微粒子の集団を含む試料を調製する方法であって、
　細胞外微粒子の集団を含む試料を、前記細胞外微粒子の構成成分に結合する複数の標識物質により標識することを含む、調製方法。
　前記複数の標識物質が、核酸染色試薬、タンパク質染色試薬、脂質染色試薬、及び糖鎖染色試薬からなる群より選択される少なくとも３種を含む、請求項１３に記載の調製方法。
　前記複数の標識物質が、分子量が２万以下の化合物を含む、請求項１３に記載の調製方法。