WO2024094543A1 - Interferenzreflexionsmikroskop und verfahren zum analysieren einer probe - Google Patents

Interferenzreflexionsmikroskop und verfahren zum analysieren einer probe Download PDF

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irm
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interference reflection
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Erik SCHÄFFER
Anita Jannasch
Sandro Münch
Tom Stumpp
Viktoria Wedler
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Eberhard Karls Universität Tübingen
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Definitions

  • the invention relates to an interference reflection microscope and a method for analyzing a sample by means of such an interference reflection microscope.
  • Microscopes are generally used for different types of examination or observation of samples.
  • One possible design of a microscope is an interference reflection microscope, which typically illuminates a sample with an excitation light and uses reflected light for evaluation. Due to interference effects, information content can arise in the light, which allows, for example, photometric mass spectrometry of molecules.
  • a central obstruction filter is used to suppress speckle patterns.
  • the invention relates to an interference reflection microscope.
  • the interference reflection microscope has a light source, an illumination optics, a sample arrangement, a detection optics and a detector.
  • the illumination optics direct light from the light source as excitation light onto the sample arrangement.
  • the detection optics direct light reflected from the sample arrangement onto the detector. It is expedient for the light source to be spatially coherent. It is also expedient for the light source to be temporally incoherent.
  • the design of the light source has the advantage that the temporal incoherence of the light source can prevent the formation of speckle patterns in the reflected light.
  • speckle patterns typically arise as interference phenomena due to unavoidable roughness, contamination or chemical heterogeneity of a surface of the sample arrangement and/or the illumination or detection optics.
  • they typically interfere significantly with the evaluation, which is why they are filtered out using strong filters in the beam path.
  • filters allow better evaluation without significant interference from the speckle patterns, a significant portion of the light reflected back from the sample is lost.
  • Such high light outputs can lead to bleaching or destruction, particularly when examining organic molecules.
  • it is possible to significantly reduce the power density on a sample which in turn allows a longer exposure time without damaging molecules.
  • An interference reflection microscope is basically a microscope in which a sample is illuminated and in which reflected and/or scattered light is captured and evaluated, in particular in a direction that is at least approximately opposite to the illuminating light.
  • This light basically contains information that arises due to interference effects.
  • interference effects can occur in particular due to interface transitions, for example between glass and liquid or between liquid and sample or due to distances between sample and glass.
  • a transparent plastic can also be used, for example.
  • the sample can be, for example, a molecule, in particular an organic molecule and in particular a molecule with a mass of for example, several kDa (kilodaltons). Several such molecules can also be used.
  • a characteristic feature of an interference reflection microscope is that the interference occurs on the sample or at least in the immediate vicinity of the sample, for example at a distance of no more than 100 nm, no more than 1 m, no more than 10 pm, no more than 100 pm or no more than 1 mm from the sample, for example at an interface between glass and liquid or between liquid and sample.
  • the light source is used to generate the excitation light.
  • the illumination optics direct the excitation light onto the sample arrangement.
  • the sample arrangement can in particular be an arrangement that can hold and/or provide the sample.
  • the sample arrangement can be a vessel in which a liquid can be accommodated, whereby one or more molecules can be present in the liquid. Such molecules can be referred to as a sample. They can in particular be examined using the interference reflection microscope.
  • a sample arrangement can also represent the sample itself, for example. In this case, such a sample, such as a solid object, can be examined directly.
  • the detection optics direct the light reflected and/or scattered from the sample arrangement to the detector. This typically generates a signal indicative of an intensity or intensities of the light incident on the detector.
  • the detector can be a two-dimensional detector that is divided into pixels. This allows the recording of a two-dimensional image that can be evaluated in a suitable manner.
  • the structure of the optics and the other components of the interference reflection microscope reference is made in particular to the description of an embodiment below with reference to the accompanying drawing.
  • the light source can be temporally incoherent in that a value of a coherence length is at most 100 pm, at most 75 pm or at most 50 pm.
  • the coherence length can be defined in particular on the basis of the spectrum of the light source.
  • the coherence length can be defined as the maximum wavelength squared divided by the half-width in the spectrum of the light source.
  • Such a definition has proven to be a useful definition of a coherence length for assessing temporal coherence or incoherence.
  • the values given one can speak of a temporally incoherent light source. The values have proven to be particularly advantageous for the application at hand.
  • the coherence length is typically not exactly zero, but is, for example, at least one wavelength.
  • a half-width can be defined as the width in the spectrum that connects two points at which the intensity from a maximum is half compared to the maximum.
  • the light source can be a superluminescent light-emitting diode or a superluminescent diode.
  • Such superluminescent light-emitting diodes generate spatially coherent and temporally incoherent light, which has proven to be advantageous for the application in question for the reasons already mentioned.
  • the use of other light sources is also possible, provided they have the required properties.
  • the light source is not a laser light source.
  • Laser light sources are typically optical amplifiers with resonant feedback that generate light based on stimulated emission.
  • Laser light sources are typically not suitable for the application relevant here.
  • the light source can be spatially coherent in that a value of an area over which the emitted light has a fixed phase relationship is at least 1 pm 2 , at least 5 pm 2 , at least 10 pm 2 , at least 100 pm 2 , at least 250 pm 2 and/or a total radiating area of the light source. This has proven to be a useful definition of a coherence area for defining a spatially coherent light source. With the values given, it can be assumed that a spatially coherent light source provides the performance required here and enables the necessary light power density to illuminate the sample.
  • Attenuating filter is understood to be an element whose task is to attenuate the light beam, in particular to attenuate it considerably, for example by at least one, two or three orders of magnitude.
  • Other optical elements such as lenses, which for technical reasons never have 100% transmission, or beam splitters, which have the purpose of splitting a beam and thus naturally only allow part of the incident light to pass through in a certain direction, are not understood to be attenuating filters.
  • At least 10%, at least 25%, at least 50%, at least 80% or at least 90% of the light reflected from the sample arrangement can reach the detector.
  • Such values can typically be achieved if, for example, an attenuating filter is used in this beam path. is dispensed with.
  • the positive effects described above can be achieved through the high transmission from the sample arrangement to the detector.
  • the values mentioned are also realistic, for example, if there is a beam splitter in the beam path from the sample arrangement to the detector, which inevitably does not allow part of the light to pass through to the detector, but redirects it in another direction.
  • a proportion of light may in particular refer to the power of the light which is transmitted, for example, at least to the stated proportion.
  • the interference reflection microscope has a beam splitter.
  • the illumination optics can in particular direct the light from the light source onto the beam splitter and the beam splitter can in particular direct the light at least partially onto the sample arrangement.
  • the beam splitter can in particular direct the light reflected from the sample arrangement at least partially onto the detection optics.
  • the light source and/or the illumination optics can in particular direct the light from the light source in a polarized manner onto the beam splitter.
  • this can be a linear polarization.
  • the beam splitter can in particular be polarization-sensitive in such a way that it directs at least 70%, at least 80% or at least 90% of the polarized light from the light source onto the sample arrangement.
  • the reflected light from the sample arrangement can be incident on the beam splitter in a polarized manner.
  • the beam splitter can in particular be polarization-sensitive in such a way that it can at least 70%, at least 80% or at least 90% is directed at the detection optics. This means that a polarization-sensitive design of the beam splitter in the beam path from the sample arrangement to the detector can ensure that less light is directed by the beam splitter in a direction in which it cannot be used, and a higher proportion of the light is passed through to the detector.
  • the polarization of the light reflected from the sample arrangement and striking the beam splitter can be aligned in particular transversely, for example at an angle of 90° or at an angle between 85° and 95°, to the polarization of the light striking the beam splitter from the light source. This can be achieved, for example, by using an X/4 plate between the beam splitter and the sample arrangement.
  • the illumination optics between the light source and the beam splitter and the detection optics between the beam splitter and the detector are designed completely separately from one another.
  • a completely separate design can be understood in particular to mean that the respective optical components such as mirrors, lenses or apertures are only used for one of the two optics. This is not contradicted by joint installation on an optical table or in a holder. It can also be provided that the illumination optics are designed completely separately from the detection optics.
  • a beam path in the illumination optics between the light source and the beam splitter and a beam path in the detection optics between the beam splitter and the detector are completely separate from each other.
  • the beam splitter is the first optical element after the light source or the last optical element before the detector, which is hit by both the beam of the excitation optics and the beam of the detection optics. It can also be provided that a beam path in the illumination optics and a beam path in the detection optics are completely separate from each other.
  • the interference reflection microscope can in particular have an objective lens. This can in particular be arranged optically directly in front of the sample arrangement. In particular, it can be arranged between the beam splitter and the sample arrangement. Using such an objective, the light can be directed and structured specifically onto the sample arrangement. Reflected light can also be captured specifically.
  • an objective lens This can in particular be arranged optically directly in front of the sample arrangement. In particular, it can be arranged between the beam splitter and the sample arrangement. Using such an objective, the light can be directed and structured specifically onto the sample arrangement. Reflected light can also be captured specifically.
  • the objective can, for example, collimate the excitation light towards the sample arrangement.
  • the sample arrangement is illuminated with an excitation light whose diameter remains constant at least over the relevant area.
  • the objective it is also possible for the objective to focus the excitation light onto the sample arrangement.
  • the illumination optics can focus the excitation light.
  • a focus can be arranged in the beam path between the illumination optics and the objective.
  • the focus can be arranged in a rear conjugated plane of the objective.
  • the beam then widens again before it hits the objective and is processed in the objective in the way it should hit the sample arrangement.
  • the illumination optics and/or the beam splitter can in particular direct the excitation light onto the lens in such a way that it is incident parallel to an optical axis of the lens.
  • the optical axis can in particular be an axis of symmetry of the lens. It can in particular be arranged centrally in a cross-section in the lens. By making the light incident parallel onto the lens, it can in particular be achieved that the beam also exits the lens parallel to this optical axis. It should be understood that “parallel” here also includes “identical”.
  • the excitation light can therefore also be incident on the lens in such a way that a center point of the excitation light lies on the optical axis of the lens.
  • the illumination optics and/or the beam splitter can direct the excitation light onto the lens in such a way that a center of the excitation light is incident adjacent to the optical axis of the lens. It does not coincide with the optical axis. It can also be said that the center of the excitation light is spaced from the optical axis of the lens. i.e. has a non-vanishing distance.
  • the excitation light can emerge from the objective at an angle to the optical axis of the objective. This enables illumination of the sample arrangement at an angle to the optical axis.
  • the excitation light can strike a surface of the sample arrangement at an angle, be reflected by the sample arrangement and reflected back to the objective. Such a reflected beam is then also typically at an angle to the surface of the sample arrangement. It is then also typically at an angle to an optical axis of the objective.
  • the excitation light hits the surface of the sample arrangement at an angle of at least 0°, greater than 0°, at least 1°, at least 5°, at least 10°, at least 20° or at least 40°. It can be provided that the excitation light hits the surface of the sample arrangement at an angle of at most 1°, at most 5°, at most 10°, at most 20°, at most 40° or at most 80°.
  • a suitable interval can be formed from each lower value with each larger upper value.
  • a normal on the surface is typically used as a reference for defining the angle. The angle is therefore typically specified in relation to the surface normal. An angle of 0° therefore corresponds to a non-oblique incidence.
  • the excitation light can also hit the surface of the sample arrangement at the Brewster angle. This allows unwanted reflections to be avoided as best as possible.
  • the Brewster angle depends on the materials used, in particular the material of the sample arrangement, which is typically glass. However, it can be easily calculated using the known formula.
  • the light reflected from the sample arrangement strikes the objective at a different location on the objective than the location at which the excitation light exits the objective toward the sample arrangement.
  • the designs described above enable oblique illumination of the sample arrangement. This can in particular ensure that the light reflected from the sample arrangement contains less directly reflected light. excitation light and a greater proportion of light that has interacted with the sample. This can further increase the information content in the detected light.
  • the excitation light can exit the objective parallel to the optical axis and/or it can impinge on a surface of the sample arrangement perpendicular to this surface.
  • the light can be reflected back, for example, opposite to the excitation light, i.e. with an offset of exactly or at least approximately 180°, for example at an angle of at least 170° and/or at most 190°.
  • the objective may in particular have a numerical aperture of at least 1.1, at least 1.2, at least 1.3 or at least 1.4. Such numerical apertures have proven to be advantageous for typical interference reflection microscopes.
  • the sample arrangement can, for example, have a vessel for a liquid, the vessel being optically transparent at least to the extent that the light directed at the sample arrangement can penetrate and light reflected within the liquid can escape.
  • a sample in the form of one or more molecules can be present within such a liquid, and such molecules can be observed.
  • the vessel can, for example, be made of glass or a transparent plastic.
  • the liquid can, for example, be present statically, or it can be passed through the vessel as part of a flow.
  • the light source has a substrate and a waveguide that is inclined compared to the substrate.
  • the inclined waveguide can, for example, have two parallel outer surfaces that are inclined compared to a surface of the substrate. This makes it possible to generate spatially incoherent light.
  • the waveguide can be coated with an anti-reflective coating on two opposite sides. This prevents the formation of modes in the waveguide, which would lead to temporally coherent light.
  • the Light source does not have a resonator. This can also prevent the formation of modes that would lead to temporally coherent light.
  • the light source cannot be a laser light source.
  • Laser light is typically temporally and spatially coherent, so it is not suitable for the application envisaged here.
  • the light source's light output can be 10 mW or less, 20 mW or less, 100 mW or less, or 1,000 mW or less.
  • Such light outputs can be used for typical applications, but other light outputs are also possible.
  • the light source has a radiating surface of at most 1 pm 2 , at most 5 pm 2 , at most 10 pm 2 , at most 50 pm 2 , at most 100 pm 2 , at most 500 pm 2 or at most 1,000 pm 2 .
  • Such sizes of radiating surfaces of the light source have proven to be advantageous for the embodiment present here.
  • the light source can in particular illuminate the sample with a power density of at most 1,000 kW/cm 2 , at most 500 kW/cm 2 , at most 100 kW/cm 2 , at most 50 kW/cm 2 , at most 10 kW/cm 2 , at most 2 kW/cm 2 , at most 1 kWcm 2 or at most 0.5 kW/cm 2 .
  • a filter in the beam path to the detector can be dispensed with.
  • a particularly high transmission from the sample arrangement to the detector can be used, which enables the use of such small power densities.
  • the small power densities in turn have the advantage that a longer exposure time is possible.
  • the power density is specified in particular on the sample.
  • the detector can be a 2D camera or a 1D camera.
  • it can be designed as a CCD detector and/or as a CMOS camera.
  • the detector is designed two-dimensionally so that a two-dimensional pattern or interference pattern can be advantageously detected. This can be used for photographic mass spectrometry, for example. Depending on the application, a one-dimensional detector design may be sufficient. Typically, the detector has several pixels, each of which measures a light intensity.
  • the invention further relates to a method for analyzing a sample using an interference reflection microscope.
  • this can be an interference reflection microscope as described herein.
  • the interference reflection microscope all embodiments and variants described herein can be used.
  • the method has the following steps in particular:
  • a difference image can be generated between this image and a previously recorded image or an averaged image.
  • An averaged image can be generated, for example, as a mean or median over several previously recorded images.
  • an average is typically generated for each pixel over intensity values of the images to be averaged, in particular for the same pixels.
  • an average can be formed for each pixel over respective intensity values or other measured values. This can be an arithmetic mean or a geometric mean.
  • a mathematical mean is not typically generated, but rather a value is determined at which the respective intensity value for the respective pixel is below half of the images to be averaged and above it for the other half.
  • Such averaged images can be used in particular to provide a basis for comparison with a respective image recorded. In images averaged in this way, noise effects are eliminated. averaged. This can be done by calculating the mean or the median. By generating difference images, a change in comparison to previous images can be recognized. This can be used, for example, to recognize molecules that have landed on a surface. These can be measured and then observed, for example, when they move away from the surface again.
  • the sample can be, for example, one molecule or can comprise several molecules.
  • these can be organic molecules which can be dissolved in a solution.
  • the molecule or molecules can, for example, each have a mass of at least 2 kDa, at least 3 kDa or at least 10 kDa.
  • Such molecules can be analyzed particularly advantageously using the method described herein and/or using the interference reflection microscope described herein.
  • a mass of a molecule or several molecules can be determined based on one or more images or difference images.
  • an automated image evaluation can be used for this. This can be based on artificial intelligence, neural networks and/or machine learning, for example.
  • a video can be created from these images.
  • Such a video is typically a series of several images recorded one after the other. This makes it possible, for example, to observe molecules landing on a surface and/or moving away from a surface. A change in the orientation of molecules can also be observed.
  • the illumination of the sample and/or the recording of one or more images can, for example, be carried out over a continuous period of at least one minute, at least two minutes, at least five minutes, at least ten minutes or at least twenty minutes. Such periods are typically possible using the embodiment described herein, since the power density of the Illumination of the sample can be significantly reduced compared to known designs. In particular, the power densities or other data of the light source or the interference reflection microscope described above can be used for this purpose.
  • the embodiments described herein can be used for simultaneous localization measurements and/or mass photometry. For example, they can be used to examine biomolecules such as proteins or nanoparticles.
  • a marker can be dispensed with, which is otherwise typically used for nanoparticles or proteins.
  • single molecule detection, molecular weight determination or other evaluation can be carried out.
  • the light source can in particular be linearly polarized. This can be used as already explained above, in particular in conjunction with a polarization-sensitive beam splitter.
  • Spatial coherence typically allows light to be collimated and focused like a laser. Temporal incoherence prevents speckle patterns.
  • Polarization enables efficient use of the light output.
  • a polarization-sensitive beam splitter can be used for this, as described above.
  • the excitation light can have a wavelength of 450 nm, for example. Any other wavelength that is suitable for the respective purpose can also be used.
  • the light can be collimated, focused or expanded using several lenses, for example, and cut off at two irises, for example, before it falls on a sample behind an objective. Appropriate use of retardation plates (X/2 or A/4) and a polarization beam splitter can reduce the loss of light output.
  • the incident light can be reflected by sample glass surfaces and/or biomolecules or nanoparticles, it interferes and reaches the detector or camera via the detection path.
  • frame rates of more than 100 frames per second, more than 500 frames per second, more than 1,000 frames per second, more than 2,000 frames per second and/or up to 2,000 frames per second, up to 5,000 frames per second, or up to 10,000 frames per second.
  • Such images can then be partially averaged to create differential images.
  • the image contrast is typically proportional to the molecular weight of the sample.
  • molecules or particles with a molecular weight of a few MDa up to the specified values can be detected and localized. If the molecules are moving, they can be tracked for several minutes because only a very low light output is required, which does not cause photodamage. Due to the measured background noise, the designs described here can measure down to a molecular weight of a few kDa.
  • protein analysis for example, protein analysis, molecular weight determination, protein complex formation, oligomerization, biomolecular interaction or interaction, macromolecule assembly, single particle tracking, or single molecule localization can be realized with the embodiments described herein.
  • a temporally incoherent light source by the coherence length, which can be determined as stated above, for example, being smaller than a distance between the light source and the nearest optical interface.
  • Such an optical interface can be provided by a lens, for example.
  • Typical coherence lengths of lasers used in microscopy are in the order of magnitude of meters.
  • the temporally incoherent light sources used here therefore typically have a coherence length that is, for example, at least four to six orders of magnitude smaller.
  • the light source used here is not a laser.
  • a normal light-emitting diode typically has an emitting surface of the order of a few square millimeters or larger.
  • a superluminescent light-emitting diode, or more generally a light source used here typically has emitting surfaces of the order of a few square micrometers, i.e. about six orders of magnitude smaller. With a similar beam angle, the emitted light output of a light-emitting diode is therefore about 100 times greater than that of a superluminescent light-emitting diode.
  • Light-emitting diodes for example 500 mW for light-emitting diodes compared to 5 mW for superluminescent light-emitting diodes. Accordingly, the power density of a superluminescent light-emitting diode is typically about four orders of magnitude higher than that of a simple light-emitting diode. At the same time, however, it is significantly lower than that of a laser.
  • Spatial coherence can also be defined, for example, by the fact that a light source has the same phase regardless of its position on a radiating surface.
  • Fig. 1 an interference reflection microscope
  • Fig. 2 a representation of a contrast depending on a molecular mass.
  • Fig. 1 shows an interference reflection microscope IRM according to an embodiment of the invention.
  • the interference reflection microscope IRM has a light source LI. This emits light which is used as excitation light and is shown in dash-dotted lines. This light first hits a first lens L1 and a subsequent second lens L2. The first lens L1 collimates the light, the second lens L2 focuses it on an iris diaphragm, which is also referred to as an aperture iris AI. This blocks out interfering components of the light. Next in the beam path is a third lens L3, which in turn collimates the light. Next is an X/2 plate, by means of which the polarization of the light can be adjusted so that the polarization is optimized with respect to the beam splitter described below.
  • the objective lens 0 collimates the light and directs it onto a sample arrangement PA.
  • the sample arrangement PA is in the form of a transparent plate with a sample applied to it.
  • a reservoir for a liquid for example a reservoir for a liquid.
  • the excitation light is reflected at the sample arrangement PA, and a component of the excitation light is also reflected by interaction with interfaces, in particular with a sample such as an organic molecule. This creates interference patterns which are contained in the light reflected back.
  • the light reflected back is shown in dashed lines by a surrounding beam in Fig. 1. This is first guided via the third mirror M3 to the X/4 plate and then hits the beam splitter ST.
  • the beam splitter ST is designed in such a way that it allows a very high proportion of the light arriving with the polarization of the excitation light to pass through in the direction of the objective 0, and is also designed to direct light with the polarization that the reflected light has after passing through the X/4 plate twice, predominantly to a fourth mirror M4. This makes it possible to exploit the polarization dependence of the beam splitter ST in order to direct as much of the desired light as possible to the desired elements. Components of the light that are not used are directed to a beam blocker SB.
  • the fourth mirror M4 directs the light through a Bertrand lens LB, which can be inserted into the beam path for control purposes but is normally not in the beam path for image acquisition, and then through a fifth lens L5.
  • the light is refocused and then hits a sixth lens L6, which in turn collimates it and directs it to a seventh lens L7.
  • This focuses the light onto a detector D.
  • the detector D records a two-dimensional image of the incoming light and thus enables evaluation.
  • a two-dimensional image can, for example, contain an interference pattern that provides an indication of the size of a molecule in the sample arrangement PA.
  • several images can be recorded one after the other to create a video or, for example, to create respective differences between images, which enable changes to be better tracked.
  • the first to fourth lenses L1, L2, L3, L4, the aperture iris AI, the X/2 plate, the field iris Fl and the first and second mirrors M1, M2 together form an illumination optics BO.
  • the fourth mirror M4, the Bertrand lens LB and the fifth to seventh lenses L5 to L7 together form a detection optics DO.
  • the light source LI is a spatially coherent, temporally non-coherent light source in the form of a superluminescent light-emitting diode.
  • the temporal non-coherence makes it possible to effectively prevent the formation of speckle patterns on the sample arrangement PA.
  • light reaches the detector D that does not contain such disturbing speckle patterns, and filters known in the prior art that attenuate the light in front of the detector D in order to block out this speckle pattern can thus be dispensed with.
  • This in turn allows the use of a light source LI with a significantly reduced power density compared to known designs, so that even sensitive samples can be irradiated for longer without destroying them.
  • Fig. 2 shows a diagram showing the molecular mass in kDa for different molecules and the contrast that can be achieved using the experimentally implemented design of an interference reflection microscope described here. Different molecules are shown, and it is clear that the contrast increases with the molecular mass. In comparison to known designs, however, better contrasts can generally be achieved.
  • the contrasts were achieved with a light power density of less than 0.5 kW/cm 2 . With this power density, for example, a contrast of 1.1% results for a molecular mass of 100 kDa.
  • the implementation disclosed in Young et al., Science 360, 423-427 (2016) achieves contrasts of only 0.7% with a power density of 420 kW/cm 2 for a molecular mass of 100 kDa. The implementation described here thus enables significantly lower power densities and at the same time even better contrast.
  • Mentioned steps of the method according to the invention can be carried out in the order given. However, they can also be carried out in a different order carried out as long as this is technically reasonable.
  • the method according to the invention can be carried out in one of its embodiments, for example with a certain combination of steps, in such a way that no further steps are carried out. However, in principle further steps can also be carried out, even those which are not mentioned.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Interferenzreflexionsmikroskop, welches mit einer Lichtquelle betrieben wird, die räumlich kohärent und zeitlich inkohärent ist. Dadurch kann die Entstehung von Speckle-Mustern vermieden werden und es kann auf Filter zum Ausfiltern solcher Speckle-Muster verzichtet werden. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein zugehöriges Verfahren.

Description

Interferenzreflexionsmikroskop und Verfahren zum Analysieren einer Probe
Die Erfindung betrifft ein Interferenzreflexionsmikroskop sowie ein Verfahren zum Analysieren einer Probe mittels eines solchen Interferenzreflexionsmikroskops.
Mikroskope werden grundsätzlich für unterschiedliche Arten der Untersuchung oder Beobachtung von Proben eingesetzt. Eine mögliche Ausführung eines Mikroskops ist ein Interferenzreflexionsmikroskop, welches typischerweise eine Probe mit einem Anregungslicht beleuchtet und reflektiertes Licht zur Auswertung heranzieht. Dabei können aufgrund von Interferenzeffekten Informationsgehalte im Licht entstehen, welche beispielsweise eine photometrische Massenspektrometrie von Molekülen erlauben.
Eine beispielhafte Implementierung ist in Young et al., Science 360, 423-427 (2018) sowie dem zugehörigen Begleitmaterial offenbart. In dieser Implementierung wird ein Central Obstruction Filter verwendet, um Speckle-Muster zu unterdrücken.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Interferenzreflexionsmikroskop bereitzustellen, welches im Vergleich zu bekannten Ausführungen alternativ oder besser ausgeführt ist. Es ist des Weiteren eine Aufgabe der Erfindung, ein zugehöriges Verfahren zum Analysieren einer Probe bereitzustellen.
Dies wird erfindungsgemäß durch ein Interferenzreflexionsmikroskop und ein Verfahren gemäß den jeweiligen Hauptansprüchen erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen können beispielsweise den jeweiligen Unteransprüchen entnommen werden. Der Inhalt der Ansprüche wird durch ausdrückliche Inbezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Die Erfindung betrifft ein Interferenzreflexionsmikroskop. Das Interferenzreflexionsmikroskop weist eine Lichtquelle, eine Beleuchtungsoptik, eine Probenanordnung, eine Detektionsoptik und einen Detektor auf. Die Beleuchtungsoptik richtet Licht der Lichtquelle als Anregungslicht auf die Probenanordnung. Die Detektionsoptik richtet von der Probenanordnung reflektiertes Licht auf den Detektor. Zweckmäßig ist vorgesehen, dass die Lichtquelle räumlich kohärent ist. Ebenfalls ist zweckmäßig vorgesehen, dass die Lichtquelle zeitlich inkohärent ist.
Bei einem solchen Interferenzreflexionsmikroskop ergibt sich durch die Ausführung der Lichtquelle der Vorteil, dass durch die zeitliche Inkohärenz der Lichtquelle die Entstehung von Speckle-Mustern im reflektierten Licht verhindert werden kann. Derartige Muster entstehen typischerweise als Interferenzphänomene aufgrund von unvermeidlichen Rauigkeiten, Verunreinigungen oder chemischer Heterogenität einer Oberfläche der Probenanordnung und/oder der Beleuchtungs- oder Detektionsoptik. Bei bekannten Ausführungen stören sie typischerweise in erheblicher Weise die Auswertung, weshalb sie mittels starker Filter im Strahlengang herausgefiltert werden. Derartige Filter erlauben zwar eine bessere Auswertung ohne erhebliche Störeinflüsse durch die Speckle-Muster, jedoch geht dadurch auch ein erheblicher Teil des von der Probe zurückreflektierten Lichts verloren. Dies bedeutet wiederum, dass bei bekannten Ausführungen erheblich mehr Strahlungsdichte verwendet werden muss, um auch nach einem Filter noch eine ausreichende Lichtintensität zum Auswerten zu haben. Derart hohe Lichtleistungen können insbesondere bei der Untersuchung von organischen Molekülen dazu führen, dass diese ausbleichen oder zerstört werden. Bei der hier vorliegenden Ausführung eines Interferenzreflexionsmikroskops ist es dagegen möglich, die Leistungsdichte an einer Probe deutlich zu verringern, was wiederum eine längere Belichtungsdauer ohne Beschädigung von Molekülen erlaubt.
Unter einem Interferenzreflexionsmikroskop wird grundsätzlich ein Mikroskop verstanden, bei welchem eine Probe beleuchtet wird und bei welchem reflektiertes und/oder gestreutes Licht aufgefangen und ausgewertet wird, insbesondere in einer Richtung, welche einem beleuchtenden Licht zumindest in etwa entgegengesetzt ist. Dieses Licht enthält grundsätzlich Informationen, welche aufgrund von Interferenzeffekten entstehen. Derartige Interferenzeffekte können insbesondere aufgrund von Grenzflächenübergängen beispielsweise zwischen Glas und Flüssigkeit oder zwischen Flüssigkeit und Probe oder aufgrund von Abständen zwischen Probe und Glas auftreten. Anstelle eines Glases kann beispielsweise auch ein transparenter Kunststoff verwendet werden. Als Probe kann beispielsweise ein Molekül, insbesondere ein organisches Molekül und insbesondere ein Molekül mit einer Masse von beispielsweise mehreren kDa (Kilodalton) verwendet werden. Auch mehrere solcher Moleküle können verwendet werden.
Charakteristisch ist bei einem Interferenzreflexionsmikroskop, dass die Interferenz an der Probe oder zumindest in unmittelbarer Nachbarschaft zur Probe, beispielsweise in einer Entfernung von höchstens 100 nm, höchstens 1 m, höchstens 10 pm, höchstens 100 pm oder höchstens 1 mm zur Probe, beispielsweise an einer Grenzfläche zwischen Glas und Flüssigkeit oder zwischen Flüssigkeit und Probe auftritt. Damit grenzt sich ein Interferenzreflexionsmikroskop ab von Ausführungen von Mikroskopen, welche einen separaten Pfad aufweisen, in welchen Licht aus einem Hauptlichtstrahl eingekoppelt wird, welches dann mit einem von der Probe reflektierten Licht interferiert. Derartige separate Pfade sind bei Interferenzreflexionsmikroskopen typischerweise nicht vorhanden.
Die Lichtquelle dient der Erzeugung des Anregungslichts. Die Beleuchtungsoptik richtet das Anregungslicht auf die Probenanordnung. Hierfür kann beispielsweise eine Köhler- Anordnung verwendet werden. Bei der Probenanordnung kann es sich insbesondere um eine Anordnung handeln, welche die Probe halten und/oder bereitstellen kann. Beispielsweise kann es sich bei der Probenanordnung um ein Gefäß handeln, in welchem eine Flüssigkeit aufnehmbar ist, wobei sich in der Flüssigkeit eines oder mehrere Moleküle befinden können. Derartige Moleküle können als Probe bezeichnet werden. Sie können insbesondere mittels des Interferenzreflexionsmikroskops untersucht werden. Alternativ kann eine Probenanordnung beispielsweise auch die Probe selbst darstellen. In diesem Fall kann eine solche Probe wie beispielsweise ein festes Objekt direkt untersucht werden.
Die Detektionsoptik leitet das von der Probenanordnung reflektierte und/oder gestreute Licht zum Detektor. Dieser erzeugt typischerweise ein Signal, welches anzeigend ist für eine Intensität oder Intensitäten des auf den Detektor auftreffenden Lichts.
Beispielsweise kann der Detektor ein zweidimensionaler Detektor sein, welcher in Pixel unterteilt ist. Dies erlaubt die Aufnahme eines zweidimensionalen Bilds, welches in geeigneter Weise ausgewertet werden kann. Bezüglich des Aufbaus der Optiken und der sonstigen Komponenten des Interferenzreflexionsmikroskops sei insbesondere auch auf die weiter unten erfolgte Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die beiliegende Zeichnung verwiesen.
Insbesondere kann die Lichtquelle dadurch zeitlich inkohärent sein, dass ein Wert einer Kohärenzlänge höchstens 100 pm, höchstens 75 pm oder höchstens 50 pm beträgt. Die Kohärenzlänge kann dabei insbesondere anhand des Spektrums der Lichtquelle definiert sein. Insbesondere kann die Kohärenzlänge als die maximale Wellenlänge zum Quadrat geteilt durch die Halbwertsbreite im Spektrum der Lichtquelle definiert sein. Eine derartige Definition hat sich als sinnvolle Definition einer Kohärenzlänge zur Beurteilung der zeitlichen Kohärenz oder Inkohärenz erwiesen. Bei den angegebenen Werten kann von einer zeitlich inkohärenten Lichtquelle gesprochen werden. Die Werte haben sich für die hier vorliegende Anwendung als besonders vorteilhaft erwiesen. Auch bei zeitlich inkohärenten Lichtquellen ist die Kohärenzlänge typischerweise nicht exakt Null, sondern beträgt beispielsweise mindestens eine Wellenlänge.
Eine Halbwertsbreite kann insbesondere als diejenige Breite im Spektrum definiert werden, welche zwei Punkte verbindet, bei welchen die Intensität von einem Maximum aus gesehen jeweils die Hälfte im Vergleich zum Maximum beträgt.
Insbesondere kann es sich bei der Lichtquelle um eine Superlumineszenz-Leuchtdiode bzw. um eine Superlumineszenzdiode handeln. Derartige Superlumineszenz- Leuchtdioden erzeugen räumlich kohärentes und zeitlich inkohärentes Licht, welches sich für die hier vorliegende Anwendung aus den bereits genannten Gründen als vorteilhaft herausgestellt hat. Grundsätzlich ist jedoch auch die Verwendung anderer Lichtquellen möglich, sofern diese die geforderten Eigenschaften haben.
Typischerweise ist die Lichtquelle keine Laserlichtquelle. Laserlichtquellen sind typischerweise optische Verstärker mit resonanter Rückkopplung, die Licht basierend auf stimulierter Emission erzeugen. Laserlichtquellen sind für die hier relevante Anwendung typischerweise nicht geeignet. Insbesondere kann die Lichtquelle dadurch räumlich kohärent sein, dass ein Wert einer Fläche, über welche das ausgestrahlte Licht eine feste Phasenbeziehung hat, mindestens 1 pm2, mindestens 5 pm2, mindestens 10 pm2, mindestens 100 pm2, mindestens 250 pm2 und/oder eine gesamte abstrahlende Fläche der Lichtquelle beträgt. Dies hat sich als sinnvolle Definition einer Kohärenzfläche zur Definition einer räumlich kohärenten Lichtquelle erwiesen. Bei den angegebenen Werten kann von einer räumlich kohärenten Lichtquelle ausgegangen werden, welche die hier erforderlichen Leistungen erbringt und die notwendige Lichtleistungsdichte zur Beleuchtung der Probe ermöglicht.
Es sei verstanden, dass die gegebenen Definitionen von zeitlicher Inkohärenz bzw. räumlicher Kohärenz auch als Alternative für die im Anspruch 1 der Anmeldung verwendeten Formulierungen verstanden werden können.
Vorzugsweise ist vorgesehen, dass im Strahlengang von der Probenanordnung durch die Detektionsoptik zum Detektor kein abschwächender Filter vorhanden ist. Unter einem abschwächenden Filter wird dabei insbesondere ein Element verstanden, dessen Aufgabe darin besteht, den Lichtstrahl abzuschwächen, insbesondere erheblich abzuschwächen, beispielsweise um mindestens eine, zwei oder drei Größenordnungen abzuschwächen. Andere optische Elemente wie beispielsweise Linsen, welche technisch bedingt niemals eine 100%ige Transmission haben, oder Strahlteiler, welche den Zweck verfolgen, einen Strahl aufzuteilen und somit naturgemäß nur einen Teil des einfallenden Lichts in eine bestimmte Richtung durchlassen, werden dagegen nicht als abschwächende Filter verstanden. Durch den Verzicht auf einen abschwächenden Filter kann in vorteilhafter Weise erreicht werden, dass ein erheblich höherer Anteil des reflektierten Lichts auf den Detektor trifft und somit eine niedrigere Leistungsdichte bei der Anregung verwendet werden kann. Dies ermöglicht längere Belichtungszeiten ohne Beschädigung von Proben.
Insbesondere kann im Strahlengang von der Probenanordnung durch die Detektionsoptik zum Detektor mindestens 10 %, mindestens 25 %, mindestens 50 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % des von der Probenanordnung reflektierten Lichts zum Detektor gelangen. Derartige Werte können typischerweise erreicht werden, wenn beispielsweise auf einen abschwächenden Filter in diesem Strahlengang verzichtet wird. Durch die hohe Transmission von der Probenanordnung zum Detektor können die bereits beschriebenen positiven Effekte erreicht werden. Die genannten Werte sind beispielsweise auch dann realistisch, wenn sich in diesem Strahlengang von der Probenanordnung zum Detektor ein Strahlteiler befindet, welcher einen Teil des Lichts unweigerlich nicht zum Detektor durchlässt, sondern in eine andere Richtung umlenkt.
Sofern hierin ein Anteil von Licht erwähnt wird, kann es sich insbesondere um die Leistung des Lichts handeln, welche beispielsweise mindestens zum angegebenen Anteil durchgelassen wird.
Gemäß einer Ausführung weist das Interferenzreflexionsmikroskop einen Strahlteiler auf. Die Beleuchtungsoptik kann insbesondere das Licht der Lichtquelle auf den Strahlteiler richten und der Strahlteiler kann insbesondere das Licht zumindest teilweise auf die Probenanordnung richten. Der Strahlteiler kann insbesondere das von der Probenanordnung reflektierte Licht zumindest teilweise auf die Detektionsoptik richten. Ein solcher Strahlteiler ermöglicht einen einfachen und zweckmäßigen Aufbau eines Interferenzreflexionsmikroskops, da eine Überlagerung von Anregungslichtstrahl und reflektiertem Licht durch den Strahlteiler ermöglicht wird.
Die Lichtquelle und/oder die Beleuchtungsoptik können insbesondere das Licht der Lichtquelle polarisiert auf den Strahlteiler richten. Insbesondere kann es sich dabei um eine lineare Polarisation handeln. Der Strahlteiler kann insbesondere derart polarisationssensitiv sein, dass er das polarisierte Licht der Lichtquelle zu mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % auf die Probenanordnung richtet. Durch die Verwendung eines polarisationssensitiven Strahlteilers und eines polarisierten Lichts der Lichtquelle kann somit insbesondere erreicht werden, dass ein höherer Anteil als bei Verwendung eines zu 50 % reflektierenden und transmittierenden Strahlteilers auf die Probenanordnung trifft. Dadurch geht weniger Licht der Lichtquelle aufgrund der Aufteilung im Strahlteiler verloren.
Insbesondere kann das reflektierte Licht von der Probenanordnung polarisiert auf den Strahlteiler auftreffen. Der Strahlteiler kann insbesondere derart polarisationssensitiv sein, dass er das polarisierte, von der Probenanordnung reflektierte Licht zu mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % auf die Detektionsoptik richtet. Dadurch kann auch im Strahlengang von der Probenanordnung zum Detektor eine polarisationssensitive Ausführung des Strahlteilers dafür sorgen, dass weniger Licht vom Strahlteiler in eine Richtung geleitet wird, in welcher es nicht verwendet werden kann, und ein höherer Anteil des Lichts zum Detektor durchgeleitet wird. Die Polarisation des von der Probenanordnung reflektierten, auf den Strahlteiler auftreffenden Lichts kann insbesondere quer, also beispielsweise mit einem Winkel von 90° oder mit einem Winkel zwischen 85° und 95°, zur Polarisation des von der Lichtquelle auf den Strahlteiler auftreffenden Lichts ausgerichtet sein. Dies kann beispielsweise durch ein X/4-Blättchen zwischen Strahlteiler und Probenanordnung erreicht werden.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Beleuchtungsoptik zwischen Lichtquelle und Strahlteiler und die Detektionsoptik zwischen Strahlteiler und Detektor vollständig getrennt voneinander ausgeführt sind. Unter einer vollständig getrennten Ausführung kann insbesondere verstanden werden, dass die jeweiligen optischen Komponenten wie Spiegel, Linsen oder Blenden nur für eine der beiden Optiken verwendet werden. Eine gemeinsame Montage auf einem optischen Tisch oder in einer Halterung steht dem nicht entgegen. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Beleuchtungsoptik vollständig getrennt zur Detektionsoptik ausgeführt ist.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass ein Strahlengang in der Beleuchtungsoptik zwischen Lichtquelle und Strahlteiler und ein Strahlengang in der Detektionsoptik zwischen Strahlteiler und Detektor vollständig getrennt voneinander sind. Dies kann insbesondere bedeuten, dass sich die Strahlen im genannten Bereich nicht überschneiden und nicht ein Strahl in der einen Optik aus einem Strahl der anderen Optik erzeugt wird. Typischerweise ist der Strahlteiler das erste optische Element nach der Lichtquelle bzw. das letzte optische Element vor dem Detektor, welches sowohl vom Stahl der Anregungsoptik wie auch vom Strahl der Detektionsoptik getroffen wird. Es kann auch vorgesehen sein, dass ein Strahlengang in der Beleuchtungsoptik und ein Strahlengang in der Detektionsoptik vollständig getrennt voneinander sind.
Das Interferenzreflexionsmikroskop kann insbesondere ein Objektiv aufweisen. Dieses kann insbesondere optisch unmittelbar vor der Probenanordnung angeordnet sein. Insbesondere kann es zwischen Strahlteiler und Probenanordnung angeordnet sein. Mittels eines solchen Objektivs kann das Licht gezielt auf die Probenanordnung gerichtet und strukturiert werden. Ebenso kann reflektiertes Licht gezielt eingefangen werden.
Das Objektiv kann beispielsweise das Anregungslicht in Richtung auf die Probenanordnung kollimieren. In diesem Fall wird die Probenanordnung mit einem Anregungslicht beleuchtet, dessen Durchmesser zumindest über den hier relevanten Bereich konstant bleibt. Alternativ ist es auch möglich, dass das Objektiv das Anregungslicht auf die Probenanordnung fokussiert.
Insbesondere kann die Beleuchtungsoptik das Anregungslicht fokussieren. Dabei kann insbesondere ein Fokus im Strahlengang zwischen Beleuchtungsoptik und Objektiv angeordnet sein. Insbesondere kann der Fokus in einer hinteren konjugierten Ebene des Objektivs angeordnet sein. Typischerweise weitet sich dann nach diesem Fokus der Strahl wieder auf, bevor er auf das Objektiv trifft und im Objektiv derart verarbeitet wird, wie er auf die Probenanordnung treffen soll.
Die Beleuchtungsoptik und/oder der Strahlteiler können insbesondere das Anregungslicht derart auf das Objektiv richten, dass es parallel zu einer optischen Achse des Objektivs einfällt. Die optische Achse kann dabei insbesondere eine Symmetrieachse des Objektivs sein. Sie kann insbesondere in einem Querschnitt mittig im Objektiv angeordnet sein. Durch einen parallelen Einfall des Lichts auf das Objektiv kann insbesondere erreicht werden, dass der Strahl auch wieder parallel zu dieser optischen Achse auf dem Objektiv austritt. Es sei verstanden, dass mit „parallel“ hier auch „identisch“ mit umfasst wird. Das Anregungslicht kann also auch derart auf das Objektiv einfallen, dass ein Mittelpunkt des Anregungslichts auf der optischen Achse des Objektivs zum Liegen kommt.
Die Beleuchtungsoptik und/oder der Strahlteiler können gemäß einer Ausführung das Anregungslicht derart auf das Objektiv richten, dass ein Mittelpunkt des Anregungslichts benachbart zur optischen Achse des Objektivs einfällt. Er fällt also nicht mit der optischen Achse zusammen. Es kann auch davon gesprochen werden, dass der Mittelpunkt des Anregungslichts zur optischen Achse des Objektivs beabstandet ist, also einen nichtverschwindenden Abstand hat. Dadurch kann eine asymmetrische Beleuchtung des Objektivs erreicht werden. Das Anregungslicht kann insbesondere schräg zur optischen Achse des Objektivs aus dem Objektiv austreten. Dadurch wird eine Beleuchtung der Probenanordnung schräg zur optischen Achse ermöglicht. Insbesondere kann das Anregungslicht schräg auf eine Oberfläche der Probenanordnung auftreffen, an der Probenanordnung reflektiert werden und zum Objektiv zurückreflektiert werden. Auch ein solcher zurückreflektierter Strahl ist dann typischerweise schräg zur Oberfläche der Probenanordnung. Er ist dann typischerweise auch schräg zu einer optischen Achse des Objektivs.
Es kann vorgesehen sein, dass das Anregungslicht mit einem Winkel von mindestens 0°, größer als 0°, mindestens 1 °, mindestens 5°, mindestens 10°, mindestens 20° oder mindestens 40° auf die Oberfläche der Probenanordnung auftrifft. Es kann vorgesehen sein, dass das Anregungslicht mit einem Winkel von höchstens 1 °, höchstens 5°, höchstens 10°, höchstens 20°, höchstens 40° oder höchstens 80° auf die Oberfläche der Probenanordnung auftrifft. Aus jedem unteren Wert kann mit jedem größeren oberen Wert ein geeignetes Intervall gebildet werden. Als Referenz zur Definition des Winkels dient dabei typsicherweise eine Normale auf der Oberfläche. Der Winkel ist somit typischerweise zur Oberflächennormalen angegeben. Ein Winkel von 0° entspricht somit einem nicht schrägen Einfall. Das Anregungslicht kann auch im Brewsterwinkel auf die Oberfläche der Probenanordnung auftreffen. Damit können unerwünschte Reflexionen bestmöglich vermieden werden. Der Brewsterwinkel hängt von den verwendeten Materialien ab, insbesondere vom Material der Probenanordnung, welches typischerweise ein Glas ist. Er kann jedoch einfach berechnet werden, wobei die zugehörige Formel bekannt ist.
Gemäß einer Ausführung kann vorgesehen sein, dass das an der Probenanordnung reflektierte Licht auf das Objektiv an einer anderen Stelle des Objektivs auftrifft als diejenige Stelle, an welcher das Anregungslicht aus dem Objektiv zur Probenanordnung hin austritt.
Die eben beschriebenen Ausführungen ermöglichen eine schräge Beleuchtung der Probenanordnung. Dadurch kann insbesondere erreicht werden, dass in dem von der Probenanordnung reflektierten Licht weniger Anteil an unmittelbar reflektiertem Anregungslicht und mehr Anteil an Licht enthalten ist, welches mit der Probe interagiert hat. Dadurch kann der Informationsgehalt im detektierten Licht weiter erhöht werden.
Das Anregungslicht kann gemäß einer Ausführung parallel zur optischen Achse aus dem Objektiv austreten und/oder es kann quer zu einer Oberfläche der Probenanordnung auf diese Oberfläche auftreffen. Das Licht kann beispielsweise entgegengesetzt zum Anregungslicht, also mit einem Versatz von exakt oder zumindest in etwa 180°, zurückreflektiert werden, beispielsweise mit einem Winkel von mindestens 170° und/oder höchstens 190°.
Das Objektiv kann insbesondere eine numerische Apertur von mindestens 1 ,1 , mindestens 1 ,2, mindestens 1 ,3 oder mindestens 1 ,4 aufweisen. Derartige numerische Aperturen haben sich für typische Interferenzreflexionsmikroskope als vorteilhaft erwiesen.
Die Probenanordnung kann beispielsweise ein Gefäß für eine Flüssigkeit aufweisen, wobei das Gefäß mindestens insoweit optisch transparent ist, dass das auf die Probenanordnung gerichtete Licht eindringt und innerhalb der Flüssigkeit reflektiertes Licht ausdringen kann. Dadurch kann beispielsweise innerhalb einer solchen Flüssigkeit eine Probe in Form von einem Molekül oder mehreren Molekülen vorhanden sein, wobei derartige Moleküle beobachtet werden können. Das Gefäß kann beispielsweise aus Glas oder aus einem transparenten Kunststoff ausgebildet sein. Die Flüssigkeit kann beispielsweise statisch vorhanden sein, oder sie kann im Rahmen eines Durchflusses durch das Gefäß geleitet werden.
Gemäß einer Ausführung weist die Lichtquelle ein Substrat sowie einen im Vergleich zum Substrat schrägen Wellenleiter auf. Der schräge Wellenleiter kann beispielsweise zwei parallele Außenflächen haben, welche im Vergleich zu einer Oberfläche des Substrats schräggestellt sind. Dadurch kann räumlich inkohärentes Licht erzeugt werden.
Beispielsweise kann der Wellenleiter an zwei entgegengesetzten Seiten antireflektiv beschichtet sein. Dies verhindert die Ausbildung von Moden im Wellenleiter, welche zu zeitlich kohärentem Licht führen würden. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Lichtquelle keinen Resonator aufweist. Auch dadurch kann die Ausbildung von Moden verhindert werden, welche zu zeitlich kohärentem Licht führen würden.
Insbesondere kann es sich bei der Lichtquelle nicht um eine Laserlichtquelle handeln. Laserlicht ist typischerweise zeitlich und räumlich kohärent, so dass es für die hier vorgesehene Anwendung nicht geeignet ist.
Eine Lichtleistung der Lichtquelle kann beispielsweise höchstens 10 mW, höchstens 20 mW, höchstens 100 mW oder höchstens 1.000 mW betragen. Derartige Lichtleistungen können für typische Anwendungen verwendet werden, auch andere Lichtleistungen sind jedoch möglich.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführung weist die Lichtquelle eine abstrahlende Fläche von höchstens 1 pm2, höchstens 5 pm2, höchstens 10 pm2, höchstens 50 pm2, höchstens 100 pm2, höchstens 500 pm2 oder höchstens 1.000 pm2 auf. Derartige Größen von abstrahlenden Flächen der Lichtquelle haben sich für die hier vorliegende Ausführung als vorteilhaft herausgestellt.
Die Lichtquelle kann insbesondere die Probe mit einer Leistungsdichte von höchstens 1.000 kW/cm2, höchstens 500 kW/cm2, höchstens 100 kW/cm2, höchstens 50 kW/cm2, höchstens 10 kW/cm2, höchstens 2 kW/cm2, höchstens 1 kWcm2 oder höchstens 0,5 kW/cm2 beleuchten. Derartige niedrige Leistungsdichten an der Probe können mit der hier vorgesehenen Ausführung verwendet werden, da auf einen Filter im Strahlengang zum Detektor wie bereits erwähnt verzichtet werden kann. Anders ausgedrückt kann eine besonders hohe Transmission von der Probenanordnung zum Detektor verwendet werden, was die Verwendung derart kleiner Leistungsdichten ermöglicht. Die kleinen Leistungsdichten wiederum erzeugen den Vorteil, dass eine längere Belichtungszeit möglich ist. Die Leistungsdichte wird insbesondere an der Probe angegeben.
Insbesondere kann der Detektor eine 2D-Kamera oder eine 1 D-Kamera sein. Er kann beispielsweise als CCD-Detektor und/oder als CMOS-Kamera ausgeführt sein.
Derartige Ausführungen haben sich für typische Anwendungen als vorteilhaft herausgestellt. Typischerweise ist der Detektor zweidimensional ausgeführt, so dass in vorteilhafter Weise ein zweidimensionales Muster oder Interferenzmuster erkannt werden kann. Dies kann beispielsweise für eine fotografische Massenspektrometrie verwendet werden. Je nach Anwendung ist jedoch auch eine eindimensionale Ausführung des Detektors ausreichend. Typischerweise weist der Detektor mehrere Pixel auf, welche jeweils eine Lichtintensität messen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Analysieren einer Probe mittels eines Interferenzreflexionsmikroskops. Insbesondere kann es sich dabei um ein Interferenzreflexionsmikroskop wie hierin beschrieben handeln. Bezüglich des Interferenzreflexionsmikroskops kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden. Das Verfahren weist insbesondere folgende Schritte auf:
Einbringen der Probe in die Probenanordnung oder als Probenanordnung, und Beleuchten der Probe mittels der Lichtquelle, dabei Aufnehmen mindestens eines Bilds mittels des Detektors.
Ein solches Verfahren ermöglicht eine vorteilhafte Analyse einer Probe unter Verwendung des hierin beschriebenen Interferenzreflexionsmikroskops. Die dabei bereits beschriebenen Vorteile können auch beim Verfahren erreicht werden.
Insbesondere können mehrere Bilder mittels des Detektors aufgenommen werden. Nach Aufnahme eines jeweiligen Bilds kann insbesondere ein Differenzbild zwischen diesem Bild und einem vorher aufgenommenen Bild oder einem gemittelten Bild erzeugt werden. Ein gemitteltes Bild kann beispielsweise als Mittelwert oder Median über mehrere vorher aufgenommene Bilder erzeugt werden. Bei einem Mittelwert wird dabei typischerweise für jedes Pixel ein Mittelwert über Intensitätswerte der zu mittelnden Bilder erzeugt, insbesondere bei jeweils den gleichen Pixeln. Anders ausgedrückt kann für jedes Pixel ein Mittelwert über jeweilige Intensitätswerte oder sonstige gemessene Werte gebildet werden. Es kann sich um einen arithmetischen Mittelwert oder um einen geometrischen Mittelwert handeln. Bei einem Median wird typischerweise kein mathematischer Mittelwert erzeugt, sondern es wird ein Wert ermittelt, bei welchem bei der Hälfte der zu mittelnden Bilder der jeweilige Intensitätswert bei dem jeweiligen Pixel darunter und bei der anderen Hälfte darüber ist. Derartige gemittelte Bilder können insbesondere dazu verwendet werden, um eine Basis zum Vergleich mit einem jeweils aufgenommenen Bild darzustellen. Bei derart gemittelten Bildern werden Rauscheffekte ausgemittelt. Dies kann sowohl durch Mittelwertbildung wie auch durch Medianbildung erfolgen. Durch die Erzeugung von Differenzbildern wird insbesondere erreicht, dass eine Veränderung im Vergleich zu vorherigen Bildern erkannt wird. Dadurch können beispielsweise neu auf einer Oberfläche landende Moleküle erkannt werden. Diese können vermessen werden und es kann beispielsweise anschließend beobachtet werden, wenn diese sich wieder von der Oberfläche entfernen.
Die Probe kann beispielsweise ein Molekül sein oder kann mehrere Moleküle aufweisen. Insbesondere kann es sich dabei um organische Moleküle handeln, welche in einer Lösung gelöst sein können. Das Molekül oder die Moleküle können beispielsweise eine Masse von jeweils mindestens 2 kDa, mindestens 3 kDa oder mindestens 10 kDa aufweisen. Derartige Moleküle können insbesondere vorteilhaft mittels des hierin beschriebenen Verfahrens und/oder mittels des hierin beschriebenen Interferenzreflexionsmikroskops analysiert werden.
Insbesondere kann eine Masse eines Moleküls oder mehrerer Moleküle basierend auf einem oder mehreren Bildern oder Differenzbildern bestimmt werden. Hierfür kann beispielsweise eine automatisierte Bildauswertung verwendet werden. Diese kann beispielsweise auf künstlicher Intelligenz, neuronalen Netzen und/oder maschinellem Lernen basieren. Durch die hierin beschriebenen Vorteile der hierin beschriebenen Ausführung ist eine längere und zerstörungsfreie Beleuchtung möglich.
Insbesondere können mehrere Bilder hintereinander mittels des Detektors aufgenommen werden. Aus diesen Bildern kann ein Video erstellt werden. Ein solches Video ist typischerweise eine Aneinanderreihung von mehreren hintereinander aufgenommenen Bildern. Dadurch können beispielsweise Moleküle beim Landen auf einer Oberfläche und/oder beim Entfernen von einer Oberfläche beobachtet werden. Auch kann eine Änderung von Orientierungen von Molekülen beobachtet werden.
Das Beleuchten der Probe und/oder das Aufnehmen von einem oder mehreren Bildern kann beispielsweise über einen zusammenhängenden Zeitraum von mindestens einer Minute, mindestens zwei Minuten, mindestens fünf Minuten, mindestens zehn Minuten oder mindestens zwanzig Minuten erfolgen. Derartige Zeiträume sind typischerweise mittels der hierin beschriebenen Ausführung möglich, da die Leistungsdichte der Beleuchtung der Probe im Vergleich zu bekannten Ausführungen deutlich reduziert werden kann. Insbesondere können die bereits beschriebenen Leistungsdichten oder sonstigen Daten der Lichtquelle oder des Interferenzreflexionsmikroskops hierfür verwendet werden.
Insbesondere können die hierin beschriebenen Ausführungen für simultane Lokalisationsmessungen und/oder Massenphotometrie verwendet werden. Beispielsweise können sie für die Untersuchung von Biomolekülen wie Proteine oder Nanopartikel verwendet werden. Bei den hierin beschriebenen Ausführungen kann beispielsweise auf einen Marker verzichtet werden, welcher ansonsten typischerweise bei Nanopartikeln oder Proteinen verwendet wird. Beispielsweise kann eine Einzelmoleküldetektion, eine Molekulargewichtsbestimmung oder eine sonstige Auswertung durchgeführt werden.
Die Lichtquelle kann insbesondere linear polarisiert sein. Dies kann wie weiter oben bereits erläutert verwendet werden, insbesondere in Verbindung mit einem polarisationssensitiven Strahlteiler.
Eine räumliche Kohärenz erlaubt es typischerweise, Licht wie einen Laser zu kollimieren und zu fokussieren. Die zeitliche Inkohärenz verhindert Speckle-Muster. Eine Polarisation ermöglicht eine effiziente Nutzung der Lichtleistung. Hierfür kann beispielsweise auf einen polarisationssensitiven Strahlteiler zurückgegriffen werden, wie weiter oben beschrieben. Das Anregungslicht kann beispielsweise eine Wellenlänge von 450 nm aufweisen. Auch jede andere Wellenlänge, welche für die jeweiligen Zwecke geeignet ist, kann beispielsweise verwendet werden. Das Licht kann beispielsweise mit mehreren Linsen kollim iert, fokussiert bzw. aufgeweitet und an beispielsweise zwei Iriden abgeschnitten werden, bevor es auf eine Probe hinter einem Objektiv fällt. Eine geeignete Verwendung von Verzögerungsplatten (X/2 bzw. A/4) sowie ein Polarisationsstrahlteiler können den Verlust an Lichtleistung vermindern. Das einfallende Licht kann an Probenglasoberflächen und/oder Biomolekülen oder Nanopartikeln reflektiert werden, es interferiert und gelangt über den Detektionspfad zum Detektor bzw. zur Kamera. Beispielsweise können Bildraten mit mehr als 100 Bildern pro Sekunde, mehr als 500 Bildern pro Sekunde, mehr als 1.000 Bildern pro Sekunde, mehr als 2.000 Bildern pro Sekunde und/oder bis zu 2.000 Bildern pro Sekunde, bis zu 5.000 Bildern pro Sekunde, oder bis zu 10.000 Bildern pro Sekunde aufgenommen werden. Derartige Aufnahmen können anschließend zum Teil gemittelt werden, um differenzielle Bilder zu erstellen. Der Bildkontrast ist typischerweise proportional zum Molekulargewicht der Probe. Somit können beispielsweise Moleküle oder Partikel mit einem Molekulargewicht von einigen MDa bis zu den angegebenen Werten detektiert und lokalisiert werden. Wenn die Moleküle sich bewegen, können sie über mehrere Minuten verfolgt werden, da nur eine sehr geringe Lichtleistung benötigt wird, die keine Lichtschäden verursacht. Aufgrund des gemessenen Hintergrundrauschens kann mit den hierin beschriebenen Ausführungen bis zu einem Molekulargewicht von wenigen kDa gemessen werden.
Beispielsweise können eine Analyse von Proteinen, eine Molekulargewichtsbestimmung, eine Proteinkomplexbildung, eine Oligomerisation, eine biomolekulare Interaktion oder Wechselwirkung, eine Makromolekülzusammensetzung, ein Single-Particle-Tracking oder eine Einzelmoleküllokalisation mit den hierin beschriebenen Ausführungen realisiert werden.
Es ist auch möglich, eine zeitlich inkohärente Lichtquelle dadurch zu definieren, dass die Kohärenzlänge, welche beispielsweise wie weiter oben angegeben ermittelt werden kann, kleiner ist als ein Abstand zwischen der Lichtquelle und der nächsten optischen Grenzfläche. Eine solche optische Grenzfläche kann beispielsweise durch eine Linse gegeben sein. Typische Kohärenzlängen von Lasern, welche in der Mikroskopie verwendet werden, liegen dagegen in der Größenordnung von Metern. Die hier verwendeten zeitlich inkohärenten Lichtquellen haben somit typischerweise eine Kohärenzlänge, welche um beispielsweise mindestens vier bis sechs Größenordnungen kleiner ist. Insbesondere handelt es sich bei der hier verwendeten Lichtquelle nicht um einen Laser.
Bei einer normalen Leuchtdiode ist typischerweise eine emittierende Fläche von der Größenordnung einiger Quadratmillimeter oder größer. Bei einer Superlumineszenz- Leuchtdiode bzw. allgemeiner bei einer hier verwendeten Lichtquelle sind typische abstrahlende Flächen in der Größenordnung von einigen Quadratmikrometern, also etwa sechs Größenordnungen kleiner. Bei ähnlichem Abstrahlwinkel ist die abgestrahlte Lichtleistung einer Leuchtdiode also etwa 100-mal größer als bei Superlumineszenz- Leuchtdioden, beispielsweise 500 mW bei Leuchtdioden im Vergleich zu 5 mW bei Superlumineszenz-Leuchtdioden. Dementsprechend ist die Leistungsdichte bei einer Superlumineszenz-Leuchtdiode typischerweise etwa vier Größenordnungen höher im Vergleich zu einer einfachen Leuchtdiode. Gleichzeitig ist sie jedoch deutlich geringer als bei einem Laser.
Eine räumliche Kohärenz kann beispielsweise auch dadurch definiert werden, dass eine Lichtquelle die gleiche Phase unabhängig von einer Position auf einer Abstrahlfläche hat.
Weitere Merkmale und Vorteile wird der Fachmann dem nachfolgend mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschriebenen Ausführungsbeispiel entnehmen. Dabei zeigen: Fig. 1 : ein Interferenzreflexionsmikroskop, und
Fig. 2: eine Darstellung eines Kontrasts in Abhängigkeit von einer Molekularmasse.
Fig. 1 zeigt ein Interferenzreflexionsmikroskop IRM gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Das Interferenzreflexionsmikroskop IRM weist eine Lichtquelle LI auf. Diese sendet Licht aus, welches als Anregungslicht verwendet wird und strichpunktiert dargestellt ist. Dieses Licht trifft zunächst auf eine erste Linse L1 und eine nachfolgende zweite Linse L2. Die erste Linse L1 kollim iert das Licht, die zweite Linse L2 fokussiert es auf eine Irisblende, welche auch als Apertur-Iris AI bezeichnet wird. Dadurch werden störende Komponenten des Lichts ausgeblendet. Nachfolgend im Strahlengang befindet sich eine dritte Linse L3, welche das Licht wiederum kollimiert. Nachfolgend befindet sich ein X/2-Plättchen, durch welches eine Polarisation des Lichts so eingestellt werden kann, dass die Polarisation mit Bezug auf den nachfolgend beschriebenen Strahlteiler optimiert ist. Nach dem X/2-Plättchen befinden sich eine Feld-Iris Fl zum Formen des Lichtstrahls sowie ein erster Spiegel M1 und ein zweiter Spiegel M2, welche das Licht auf eine vierte Linse L4 um lenken. Diese vierte Linse L4 fokussiert das Licht, welches nachfolgend auf einen Strahlteiler ST trifft. Der transmittierte Teil durchläuft dann ein X/4-Plättchen, wodurch aus der zunächst linearen Polarisation eine zirkulare Polarisation wird. Durch einen dritten Spiegel M3 wird das Licht umgelenkt auf ein Objektiv 0, wobei ein Fokus des durch die vierte Linse L4 fokussierten Lichts vor dem Objektiv 0 liegt. Der Fokus liegt insbesondere in einer hinteren konjugierten Ebene des Objektivs 0. Das Objektiv 0 kollim iert das Licht und leitet es auf eine Probenanordnung PA. Die Probenanordnung PA ist vorliegend in Form einer durchsichtigen Platte mit einer aufgebrachten Probe realisiert. Auch andere Lösungen sind hier möglich, beispielsweise ein Reservoir für eine Flüssigkeit. An der Probenanordnung PA wird das Anregungslicht reflektiert, und es wird ferner eine Komponente des Anregungslichts durch Interaktion mit Grenzflächen, insbesondere zu einer Probe wie beispielsweise einem organischen Molekül, reflektiert. Dadurch entstehen Interferenzmuster, welche im zurückreflektierten Licht enthalten sind. Das zurückreflektierte Licht ist durch einen umgebenden Strahl in Fig. 1 gestrichelt dargestellt. Dieses wird zunächst über den dritten Spiegel M3 zu dem X/4-Plättchen geleitet und trifft dann auf den Strahlteiler ST.
Der Strahlteiler ST ist so ausgebildet, dass er einen sehr hohen Anteil des mit der Polarisation des Anregungslichts eintreffenden Lichts in Richtung auf das Objektiv 0 hindurchlässt, und ist ferner dazu ausgebildet, Licht mit derjenigen Polarisation, welche das reflektierte Licht nach zweimaligem Durchgang durch das X/4-Plättchen hat, überwiegend auf einen vierten Spiegel M4 zu leiten. Dadurch kann eine Polarisationsabhängigkeit des Strahlteilers ST ausgenutzt werden, um möglichst viel vom gewünschten Licht auf die gewünschten Elemente zu lenken. Jeweils nicht benutzte Komponenten des Lichts werden auf einen Strahlblockierer SB geleitet.
Der vierte Spiegel M4 leitet das Licht durch eine Bertrand-Linse LB, die zur Kontrolle in den Strahlengang eingefügt werden kann, sich zur Bildaufnahme jedoch normalerweise nicht im Strahlengang befindet, und anschließend durch eine fünfte Linse L5. Dabei wird das Licht erneut fokussiert und trifft dann auf eine sechste Linse L6, welches es wiederum kollimiert und auf eine siebte Linse L7 leitet. Diese fokussiert das Licht auf einen Detektor D. Der Detektor D nimmt ein zweidimensionales Bild des eintreffenden Lichts auf und ermöglicht somit eine Auswertung. Ein zweidimensionales Bild kann beispielsweise ein Interferenzmuster enthalten, welches einen Hinweis auf die Größe eines in der Probenanordnung PA befindlichen Moleküls gibt. Es können insbesondere mehrere Bilder hintereinander aufgenommen werden, um ein Video zu erstellen, oder um beispielsweise jeweilige Differenzen zwischen Bildern zu erstellen, welche eine bessere Verfolgung von Änderungen ermöglichen. Auf die diesbezüglich weiter oben bereits gegebenen Ausführungen sei verwiesen. Die ersten bis vierten Linsen L1 , L2, L3, L4, die Apertur-Iris AI, das X/2-Plättchen, die Feld-Iris Fl sowie die ersten und zweiten Spiegel M1 , M2, bilden zusammen eine Beleuchtungsoptik BO. Der vierte Spiegel M4, die Bertrand-Linse LB sowie die fünften bis siebten Linsen L5 bis L7 bilden zusammen eine Detektionsoptik DO.
Die Lichtquelle LI ist vorliegend eine räumlich kohärente, zeitlich nicht kohärente Lichtquelle in Form einer Superlumineszenz-Leuchtdiode. Durch die zeitliche Nichtkohärenz ist es möglich, das Entstehen von Speckle-Mustern an der Probenanordnung PA wirkungsvoll zu verhindern. Dadurch gelangt ein Licht zum Detektor D, welches derartige störenden Speckle-Muster nicht enthält, und es kann somit auf im Stand der Technik bekannte Filter, welche das Licht vor dem Detektor D abschwächen, um dieses Speckle-Muster auszublenden, verzichtet werden. Dies erlaubt wiederum die Verwendung einer Lichtquelle LI mit im Vergleich zu bekannten Ausführungen deutlich verringerter Leistungsdichte, so dass eine längere Bestrahlung auch von empfindlichen Proben möglich ist, ohne diese zu zerstören.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm, welches bei unterschiedlichen Molekülen die Molekülmasse in kDa sowie den mittels der hier beschriebenen, experimentell umgesetzten Ausführung eines Interferenzreflexionsmikroskops erzielbaren Kontrast darstellt. Dabei sind unterschiedliche Moleküle angegeben, wobei ersichtlich ist, dass der Kontrast mit der Molekülmasse ansteigt. Im Vergleich zu bekannten Ausführungen können jedoch grundsätzlich bessere Kontraste erzielt werden.
Die Kontraste wurden mit einer Leistungsdichte des Lichts von weniger als 0,5 kW/cm2 erreicht. Mit dieser Leistungsdichte resultiert zum Beispiel bei einer Molekülmasse von 100 kDa ein Kontrast von 1 ,1 %. Im Vergleich dazu werden bei der Implementierung, welche in Young et al., Science 360, 423-427 (2018) offenbart ist, bei einer Molekülmasse von 100 kDa Kontraste von nur 0,7 % mit einer Leistungsdichte von 420 kW/cm2 erreicht. Die hierin beschriebene Implementierung ermöglich somit erheblich geringere Leistungsdichten und gleichzeitig sogar einen besseren Kontrast.
Erwähnte Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden. Sie können jedoch auch in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden, soweit dies technisch sinnvoll ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer seiner Ausführungen, beispielsweise mit einer bestimmten Zusammenstellung von Schritten, in der Weise ausgeführt werden, dass keine weiteren Schritte ausgeführt werden. Es können jedoch grundsätzlich auch weitere Schritte ausgeführt werden, auch solche welche nicht erwähnt sind.
Es sei darauf hingewiesen, dass in den Ansprüchen und in der Beschreibung Merkmale in Kombination beschrieben sein können, beispielsweise um das Verständnis zu erleichtern, obwohl diese auch separat voneinander verwendet werden können. Der Fachmann erkennt, dass solche Merkmale auch unabhängig voneinander mit anderen Merkmalen oder Merkmalskombinationen kombiniert werden können.
Rückbezüge in Unteransprüchen können bevorzugte Kombinationen der jeweiligen Merkmale kennzeichnen, schließen jedoch andere Merkmalskombinationen nicht aus.
Bezugszeichenliste
LI Lichtquelle
L Linsen
AI Apertur-Iris
Fl Feld-Iris
BO Beleuchtungsoptik
DO Detektionsoptik
M Spiegel
ST Strahlteiler
0 Objektiv
PA Probenanordnung
SB Strahlblockierer
LB Bertrand-Linse
D Detektor
IRM Interferenzreflexionsmikroskop

Claims

Patentansprüche
1. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM), aufweisend eine Lichtquelle (LI), eine Beleuchtungsoptik (BO), eine Probenanordnung (PA), eine Detektionsoptik (DO), und einen Detektor (D), wobei die Beleuchtungsoptik (BO) Licht der Lichtquelle (LI) als Anregungslicht auf die Probenanordnung (PA) richtet, wobei die Detektionsoptik (DO) von der Probenanordnung (PA) reflektiertes Licht auf den Detektor (D) richtet, und wobei die Lichtquelle (LI) räumlich kohärent und zeitlich inkohärent ist.
2. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 1 , wobei die Lichtquelle (LI) dadurch zeitlich inkohärent ist, dass ein Wert einer Kohärenzlänge, welche durch die maximale Wellenlänge zum Quadrat geteilt durch die Halbwertsbreite im Spektrum der Lichtquelle (LI) definiert ist, höchstens 100 pm, höchstens 75 pm oder höchstens 50 pm beträgt.
3. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LI) eine Superlumineszenz-Leuchtdiode ist.
4. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle keine Laserlichtquelle ist.
5. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LI) dadurch räumlich kohärent ist, dass ein Wert einer Fläche, über welche das ausgestrahlte Licht eine feste Phasenbeziehung hat, mindestens 1 pm2, mindestens 5 pm2, mindestens 10 pm2, mindestens 100 pm2, mindestens 250 m2 und/oder eine gesamte abstrahlende Fläche der Lichtquelle (LI) beträgt. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Strahlengang von der Probenanordnung (PA) durch die Detektionsoptik (DO) zum Detektor (D) kein abschwächender Filter vorhanden ist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im Strahlengang von der Probenanordnung (PA) durch die Detektionsoptik (DO) zum Detektor (D) mindestens 10 %, mindestens 25 %, mindestens 50 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % des von der Probenanordnung (PA) reflektierten Lichts zum Detektor (D) gelangen. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches einen Strahlteiler (ST) aufweist, wobei die Beleuchtungsoptik (BO) das Licht der Lichtquelle (LI) auf den Strahlteiler (ST) richtet, und der Strahlteiler (ST) das Licht zumindest teilweise auf die Probenanordnung (PA) richtet, und wobei der Strahlteiler (ST) das von der Probenanordnung (PA) reflektierte Licht zumindest teilweise auf die Detektionsoptik (DO) richtet. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 8, wobei die Lichtquelle (LI) und/oder die Beleuchtungsoptik (BO) das Licht der Lichtquelle (LI) polarisiert auf den Strahlteiler (ST) richten, wobei der Strahlteiler (ST) derart polarisationssensitiv ist, dass er das polarisierte Licht der Lichtquelle (LI) zu mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % auf die Probenanordnung (PA) richtet. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 9, wobei reflektiertes Licht von der Probenanordnung (PA) polarisiert auf den Strahlteiler (ST) auftrifft, und wobei der Strahlteiler (ST) derart polarisationssensitiv ist, dass er das polarisierte, von der Probenanordnung (PA) reflektierte Licht zu mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % auf die Detektionsoptik (DO) richtet. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Beleuchtungsoptik (BO) zwischen Lichtquelle (LI) und Strahlteiler (ST) und die Detektionsoptik (DO) zwischen Strahlteiler (ST) und Detektor (D) vollständig getrennt voneinander ausgeführt sind. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 8 bis 11 , wobei ein Strahlengang in der Beleuchtungsoptik (BO) zwischen Lichtquelle (LI) und Strahlteiler (ST) und ein Strahlengang in der Detektionsoptik (DO) zwischen Strahlteiler (ST) und Detektor (D) vollständig getrennt voneinander sind. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beleuchtungsoptik (BO) vollständig getrennt zur Detektionsoptik (DO) ausgeführt ist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Strahlengang in der Beleuchtungsoptik (BO) und ein Strahlengang in der Detektionsoptik (DO) vollständig getrennt voneinander sind. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches ein Objektiv (0) aufweist, welches optisch unmittelbar vor der Probenanordnung (PA) angeordnet ist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 15, wobei das Objektiv (O) das Anregungslicht in Richtung auf die Probenanordnung (PA) kollimiert. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 15, wobei das Objektiv (0) das Anregungslicht auf die Probenanordnung (PA) fokussiert. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Beleuchtungsoptik (BO) das Anregungslicht fokussiert, wobei ein Fokus im Strahlengang zwischen Beleuchtungsoptik (BO) und Objektiv (0) angeordnet ist, und/oder wobei ein Fokus in einer hinteren konjugierten Ebene des Objektivs (0) angeordnet ist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die Beleuchtungsoptik (BO) und/oder der Strahlteiler (ST) das Anregungslicht derart auf das Objektiv (0) richten, dass es parallel zu einer optischen Achse des Objektivs (0) einfällt. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Beleuchtungsoptik (BO) und/oder der Strahlteiler (ST) das Anregungslicht derart auf das Objektiv (0) richten, dass ein Mittelpunkt des Anregungslichts benachbart zur optischen Achse des Objektivs (0) einfällt. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei das Anregungslicht schräg zur optischen Achse des Objektivs (0) aus dem Objektiv (0) austritt. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 15 bis 21 , wobei das Anregungslicht schräg auf eine Oberfläche der Probenanordnung (PA) auftrifft, an der Probenanordnung (PA) reflektiert wird und zum Objektiv (0) zurückreflektiert wird. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 22, wobei das Anregungslicht mit einem Winkel von mindestens 0°, größer als 0°, mindestens 1°, mindestens 5°, mindestens 10°, mindestens 20° oder mindestens 40° zur Oberflächennormalen auf die Oberfläche der Probenanordnung (PA) auftrifft, und/oder wobei das Anregungslicht mit einem Winkel von höchstens 1°, höchstens 5°, höchstens 10°, höchstens 20°, höchstens 40° oder höchstens 80° zur Oberflächennormalen auf die Oberfläche der Probenanordnung (PA) auftrifft, und/oder wobei das Anregungslicht im Brewsterwinkel auf die Oberfläche der Probenanordnung (PA) auftrifft. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der Ansprüche 22 oder 23, wobei das an der Probenanordnung (PA) reflektierte Licht auf das Objektiv (O) an einer anderen Stelle des Objektivs (O) auftrifft als diejenige Stelle, an welcher das Anregungslicht aus dem Objektiv (0) zur Probenanordnung (PA) hin austritt. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probenanordnung (PA) ein Gefäß für eine Flüssigkeit aufweist, wobei das Gefäß mindestens insoweit optisch transparent ist, dass das auf die Probenanordnung (PA) gerichtete Licht eindringen und innerhalb der Flüssigkeit reflektiertes Licht ausdringen kann. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LI) ein Substrat sowie einen im Vergleich zum Substrat schrägen Wellenleiter aufweist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach Anspruch 26, wobei der Wellenleiter an zwei entgegengesetzten Seiten antireflektiv beschichtet ist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LI) keinen Resonator aufweist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LI) eine abstrahlende Fläche von höchstens 1 pm2, höchstens 5 pm2, höchstens 10 pm2, höchstens 50 pm2, höchstens 100 pm2, höchstens 500 pm2 oder höchstens 1 .000 pm2aufweist. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (LI) die Probe mit einer Leistungsdichte von höchstens 1.000 kW/cm2, höchstens 500 kW/cm2, höchstens 100 kW/cm2, höchstens 50 kW/cm2, höchstens 10 kW/cm2, höchstens 2 kW/cm2, höchstens 1 kW/cm2 oder höchstens 0,5 kW/cm2 beleuchtet. Interferenzreflexionsmikroskop (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Detektor (D) eine 2D-Kamera oder eine 1 D-Kamera, und/oder ein CCD-Detektor und/oder eine CMOS-Kamera ist. Verfahren zum Analysieren einer Probe mittels eines Interferenzreflexionsmikroskops (IRM) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
Einbringen der Probe in die Probenanordnung (PA) oder als Probenanordnung (PA), und
Beleuchten der Probe mittels der Lichtquelle (LI), dabei Aufnehmen mindestens eines Bilds mittels des Detektors (D). Verfahren nach Anspruch 32, wobei mehrere Bilder mittels des Detektors (D) aufgenommen werden, und wobei nach Aufnahme eines jeweiligen Bilds ein Differenzbild zwischen diesem Bild und einem vorher aufgenommenen Bild oder einem gemittelten Bild erzeugt wird, wobei ein gemitteltes Bild als Mittelwert oder Median über mehrere vorher aufgenommene Bilder erzeugt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 oder 33, wobei die Probe ein Molekül ist oder mehrere Moleküle aufweist. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Molekül oder die Moleküle eine Masse von mindestens 2 kDa, mindestens 3 kDa oder mindestens 10 kDa aufweisen. Verfahren nach einem der Ansprüche 34 oder 35, welches ferner folgenden Schritt aufweist:
Bestimmen einer Masse eines Moleküls oder mehrerer Moleküle basierend auf einem oder mehreren Bildern oder Differenzbildern. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36, wobei mehrere Bilder hintereinander mittels des Detektors (D) aufgenommen werden, und wobei aus diesen Bildern ein Video erstellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37, wobei das Beleuchten der Probe und/oder das Aufnehmen von einem oder mehreren Bildern über einen zusammenhängenden Zeitraum von mindestens 1 min, mindestens 2 min, mindestens 5 min, mindestens 10 min oder mindestens 20 min erfolgt.
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