WO2024080847A1 - 구강 미생물총 기반 구강암의 진단 - Google Patents

구강 미생물총 기반 구강암의 진단 Download PDF

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WO2024080847A1
WO2024080847A1 PCT/KR2023/015885 KR2023015885W WO2024080847A1 WO 2024080847 A1 WO2024080847 A1 WO 2024080847A1 KR 2023015885 W KR2023015885 W KR 2023015885W WO 2024080847 A1 WO2024080847 A1 WO 2024080847A1
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spp
prevotella
oral cancer
species
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김미경
최성원
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국립암센터
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis of oral cancer based on oral microflora, and relates to a composition for diagnosing oral cancer based on oral microflora, a kit for diagnosing oral cancer containing the same, and a method of providing information for diagnosing oral cancer.
  • the oral cavity hosts a complex collection of bacteria that is considered the second largest microbial community in the human body after the intestines. It is estimated that 700 types of bacteria that play an important role in maintaining oral health exist in the human oral cavity.
  • oral cancer is one of the most common malignancies worldwide, both in developed countries and especially in developing countries with high incidence and mortality rates.
  • Oral squamous cell carcinoma (OSCC) the most common form (more than 90% of oral cancers), is often diagnosed at a late stage, and quality of life and survival rates are low for most patients due to complex management procedures for primary tumors. decreases ( ⁇ 50%).
  • the present invention aims to solve the above-described problems and other problems associated therewith.
  • An exemplary object of the present invention is a composition containing an agent for detecting a type of microorganism that shows a significant change in abundance in oral cancer compared to the control group in biological samples, especially saliva, for diagnostic purposes that can accurately and conveniently diagnose oral cancer non-invasively.
  • a composition is provided.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a kit for diagnosing oral cancer including the composition for diagnosing oral cancer.
  • Another exemplary purpose of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing oral cancer, including the step of confirming the abundance of the microorganisms from a biological sample, especially saliva, and comparing the abundance of the microorganisms with the abundance of the microorganisms in a control sample.
  • the present invention provides a composition for diagnosing oral cancer, which includes an agent for detecting microorganisms that show a significant change in abundance in oral cancer patients compared to the control group.
  • oral cancer refers collectively to cancer that occurs in the mouth (tongue, floor of mouth, buccal mucosa, gums, palate, jawbone), lips, or oropharynx (the posterior part of the tongue connected to the throat), and specifically, the salivary glands.
  • Salivary gland cancer that occurs in the mouth, sarcoma that develops in the jawbone or facial muscles, malignant melanoma that forms black spots on the palate and gums, and oral squamous cell carcinoma that originates from the epithelial cells of the oral mucosa.
  • oral cancer drugs include 90% are oral squamous cell carcinoma (OSCC), and the oral cancer of the present invention may be oral squamous cell carcinoma, but is not limited thereto.
  • the term "abundance" of the present invention may mean the relative abundance or relative abundance of a specific type of microorganism, and in particular, may refer to the relative abundance of specific microorganisms associated with oral cancer diagnosis among the microflora in saliva. You can. However, it is not limited to this.
  • agent for detecting microorganisms is a type of substance if it is an agent capable of detecting the presence of one or more selected from the group consisting of microorganisms that show a specific abundance in oral cancer patients compared to the control group for prediction or diagnosis of oral cancer.
  • the microorganism detection agent may be an antisense oligonucleotide, primer pair, probe, peptide, polynucleotide, oligonucleotide, aptamer, or antibody that specifically binds to the 16S rRNA of the microorganism, but is not limited thereto. .
  • Detection of microorganisms using the detection agent can be performed by an amplification reaction using one or more oligonucleotide primers that hybridize to a nucleic acid molecule encoding a microorganism-specific expression gene or the complement of the nucleic acid molecule.
  • Nucleic acid using a primer Detection can be performed by amplifying the gene sequence using an amplification method such as PCR and then confirming whether the gene is amplified by a method known in the art.
  • the 'primer' is a polynucleotide or a variant thereof having a base sequence that can bind complementary to the end of a specific region of a gene used to amplify a specific region corresponding to the target region of the gene using PCR. This means that the primer is not required to be completely complementary to the end of a specific region, and can be used as long as it is complementary enough to hybridize to the end to form a double chain structure.
  • the 'probe' refers to a polynucleotide, a variant thereof, or a polynucleotide having a base sequence capable of complementary binding to the target site of a gene, and a labeling substance bound thereto.
  • the 'hybridization means that two single-stranded nucleic acids form a duplex structure by pairing complementary base sequences, and the complementarity between single-stranded nucleic acid sequences is a perfect match. Hybridization may occur not only in one case, but also in the presence of some mismatched bases.
  • the 'antibody' refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction, for example, one selected from the group consisting of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a recombinant antibody, or a combination thereof.
  • a polyclonal antibody for example, one selected from the group consisting of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a recombinant antibody, or a combination thereof.
  • aptamer is an oligonucleic acid or peptide molecule, and general information on aptamers is described in Bock LC et al., Nature 355(6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine”. J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. “An artificial cell cycle inhibitor isolated from a combinatorial library”. Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727 (1998)].
  • the diagnostic composition of the present invention is not only an agent for measuring the presence or absence of the above-described microorganisms, but also a label that enables quantitative or qualitative measurement of the formation of an antigen-antibody complex, conventional tools and reagents used in immunological analysis, etc. It may further include.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or condition, determining whether the subject currently has a specific disease or condition, and determining whether the subject currently has a specific disease or condition.
  • Determining a subject's prognosis e.g., identifying a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment), or therametrics (e.g., determining the efficacy of a treatment) Includes monitoring the state of an object to provide information.
  • the diagnosis is to determine or predict the occurrence or likelihood (risk) of developing oral cancer.
  • 'microorganisms showing significant abundance changes in oral cancer patients compared to the control group' refers to the types of microorganisms significantly increased or decreased in oral cancer patients compared to the healthy control group, specifically, 18 genera (Abiotrophia).
  • microorganisms with significant differences in abundance were discovered among the oral microorganisms of normal controls and oral cancer patients, and it was confirmed that they can be used as biomarkers for oral cancer diagnosis.
  • the abundance of Bacteroidetes, Fusobacteria, and Proteobacteria is significantly reduced in oral cancer compared to the normal control group, while the abundance of Actinobacteria and Firmicutes is significantly increased in oral cancer.
  • Actinomyces, Streptococcus, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Allo Alloprevotella, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella, and Veillonella can be included as biomarkers for oral cancer diagnosis. there is.
  • the abundance of Actinomyces, Streptococcus, Capnocytophaga, Granulicatella, and Lautropia was significantly increased in oral cancer compared to the normal control group, while the abundance of Alloprevotella, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella, and Veillonella was significantly increased in oral cancer compared to the normal control group. It can be characterized as being gradually reduced.
  • Fusobacterium nucleatum Fusobacterium periodonticum, Granulicatella adiacens, Haemophilus Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Lautropia mirabilis, Nisseria meningitidis, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri ), Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salive ( Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Veillonella dispar , Veillonella parvula can be included as a biomarker for oral cancer diagnosis.
  • the abundance of Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Streptococcus sanguinis was significantly increased in oral cancer compared to the normal control group, while Fusobacterium peridonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius, Veillonella dispar, and Veillonella parvula can be characterized as having significantly reduced abundance in oral cancer compared to normal controls.
  • the fold change and AUC values of the relative abundance of these selected microorganisms support that these microorganisms can be used as biomarkers. do.
  • the Prevotella and Streptococcus genera may be particularly meaningful biomarkers with an AUC value of 0.7 or higher.
  • the abundance of Abiotrophia, Actinomyces, Capnocytophaga, Dialister, Mogibacterium, Parvimonas, and Streptococcus increased in oral cancer compared to normal controls, while the abundance of Mannheimia, Pasteurellaceae_uc, Pophyromonas, Prevotella, and Saccharimonas was significantly higher in oral cancer compared to normal controls. It can be characterized as being reduced to .
  • AF385567_s Actionmyces odontolyticus, Alloprevotella tannerae, Capnocytophaga spumblea, Dialister pneumosintes, Fusobacterium periodonticum, Lactobacillus iners, Lactobacillus sakei, Leuconostoc gelidum, Neisseria elongate, Paraburkholderia graminis, Prevotella baroniae, ella melaninogenica, Prevotella pallens, Streptococcus constellatus and Streptococcus pneumoniae can be included as biomarkers for oral cancer diagnosis.
  • ActionMyces Odontolyticus, Alloprevotella Tannerae, Capnocytophaga Spumblea, Dialister PNEUMOSINTES, NEISSERIA Ococcus constellatus, Streptococcus pneumoniae increases rich in oral cancer compared to normal control, while fusobacterium periodonticum, prevotella melaninogenica, prevotella pallens In comparison, oral cancer can be characterized by a significant decrease in abundance.
  • Actinomyces genus As an exemplary embodiment of the present invention, Actinomyces genus, Capnocytophaga genus, Porphyromonas genus, Prevotella genus, Streptococcus genus , at least one of Fusobacterium periodonticum species, Prevotella melaninogenica species, Prevotella pallens species, and Streptococcus pneumoniae species. It relates to a composition for diagnosing oral cancer comprising an agent that detects a single microorganism.
  • the genus Granulicatella, the genus Lautropia, the genus Alloprevotella, the genus Fusobacterium, and the genus Haemophilus. Veillonella genus, Fusobacterium nucleatum spp., Granulicatella adiacens spp., Haemophilus parainfluenzae spp., KV831974_s spp., Lautropia Lautropia mirabilis spp., Nisseria meningitidis spp., Neisseria subflava spp., PAC001345_s spp., Porphyromonas pasteri spp., Prevotella histi Prevotella histicola spp., Prevotella nanceiensis spp., Prevotella salivae spp., Prevotella_uc spp., Streptococc
  • it may further include an agent for detecting at least one microorganism among the genus Howardella, Paraburkholderia, and Sphingomonas.
  • the detecting agent may be to diagnose oral cancer at an early stage.
  • it may further include an agent for detecting a gene encoding at least one of acyl-CoA dehydrogenase and dihydrofolate reductase, and the agent for detecting the gene may be used at an early stage. It may be a diagnosis of oral cancer.
  • the early stage oral cancer may mean stages 1 and 2 when divided into stages 1 to 4 depending on the size of the primary cancer, metastasis to lymph nodes in the neck, or distant metastasis.
  • stage 1 refers to the case where the size of the primary cancer is 2 cm or less and there is no metastasis to the lymph nodes in the neck or distant metastasis
  • stage 2 refers to the case where the size of the primary cancer is 2 cm to 4 cm and there is no metastasis to the lymph nodes in the neck or distant metastasis. This refers to the case where there is no metastasis.
  • Stage 3 refers to the case where the size of the primary cancer is 4 cm or more, there is one lymph node metastasis of 3 cm or less in the neck, and there is no distant metastasis.
  • Stage 4 refers to the case where the primary cancer spreads to the bone, skin of the face, or tongue.
  • the present invention provides a kit for diagnosing oral cancer, including a composition for diagnosing oral cancer.
  • oral cancer diagnosis kit refers to a kit containing a composition for oral cancer diagnosis.
  • the kit may further include instructions describing a method for using the kit necessary for diagnosis.
  • the kit has increased abundance of Actinomyces, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Leptotrichia, Rothisa, and Streptococcus at the genus level compared to samples derived from normal people, Alloprevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Haemophilus, Neisseria, The abundance of Porphyromonas, Prevotella, and Veillonella is decreased, and at the species level, the abundance of Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, and Streptococcus sanguinis is increased, and Fusobacterium periodonticum.
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosing oral cancer.
  • the information provision method includes (a) confirming the abundance of microbial species whose abundance was significantly changed in oral cancer patients compared to the control group from biological samples; and (b) comparing the abundance with the abundance of microorganisms in a control sample.
  • the 'types of microorganisms whose abundance was significantly changed in oral cancer patients compared to the control group' are Actinomyces, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Leptotrichia, Rothia, Streptococcus, Alloprevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Haemophilus, and Neisseria at the genus level.
  • Porphyromonas Prevotella, Veillonella, Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis, Fusobacterium periodonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, at the species level.
  • Prevotella histicola Prevotella melaninogenica
  • It may include one or more selected from the group consisting of Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius, Veillonella dispar, and Veillonella parvula.
  • the 'types of microorganisms whose abundances were significantly changed in oral cancer patients compared to the control group' are a group consisting of the genus Howardella, Paraburkholderia, and Sphingomonas. It may include one or more selected from.
  • the step of confirming the abundance of specific types of microorganisms from the biological sample involves extracting DNA from the biological sample and analyzing the abundance of the microorganisms.
  • step (a) may be a step of analyzing the abundance of microorganisms in the oral cavity using the microorganism detection agent according to an example of the present invention, for example, by extracting DNA from the microorganisms.
  • a PCR primer set for 16S rRNA may be used, but is not limited thereto.
  • step (b) is a step of comparing the abundance analysis results of step (a) with a healthy normal control, and at the genus level, Actinomyces, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Leptotrichia, Rothia, Streptococcus, and Howardella , Dialister, Paraburkholderia, and Sphingomonas are increased in abundance, and Alloprevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Haemophilus, Neisseria, Porphyromonas, Prevotella, and Veillonella are decreased in abundance.
  • Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, and Neisseria The abundance of meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis, Fusobacterium periodonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius , Veillonella dispar, and Veillonella parvula can be diagnosed as having a risk of developing oral cancer or oral cancer if the abundance is reduced.
  • the abundance of the genera Howardella, Paraburkholderia, Capnocytophaga and Sphingomonas is increased, or Porphyromonas ( If the abundance of the genus Porphyromonas is reduced, oral cancer can be diagnosed at an early stage.
  • the method of providing information may further include the step of confirming the expression level of a gene encoding at least one of acyl-CoA dehydrogenase and dihydrofolate reductase. If the expression level of the gene encoding the acyl-CoA dehydrogenase increases, it can be diagnosed as early-stage oral cancer, and if the expression level of the gene encoding the dihydrofolate reductase decreases, it can be diagnosed as early-stage oral cancer. It can be diagnosed as
  • biological sample refers to any material, biological fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells.
  • Peripheral blood mononuclear cells buffy coat, plasma, serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate (nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, ascites, cystic fluid, meningeal fluid) , amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid.
  • the collected liquid biopsy for histopathological examination may be, for example, tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, sputum, or ascites of the diagnostic target.
  • it may be saliva collected from a diagnostic subject.
  • the present invention provides a method for selecting a candidate drug for treating, improving or preventing oral cancer.
  • the method includes (a) the genus Actinomyces, the genus Capnocytophaga, and the genus Porphyromonas from biological samples obtained from a subject before processing a candidate drug for the treatment, improvement, or prevention of oral cancer.
  • step (c) screening a candidate drug by comparing the abundance of microorganisms analyzed in step (a) with the abundance of microorganisms analyzed in step (b).
  • step of analyzing the abundance of microorganisms in steps (a) and (b) is the same as previously mentioned in the information provision method for oral cancer diagnosis.
  • the type of candidate drug is not limited and may include, for example, natural products, compounds, biological materials, prebiotics, and other pharmaceutical and functional food materials.
  • the present invention provides a method for predicting or monitoring oral cancer treatment response.
  • the method is (a) genus Actinomyces, genus Capnocytophaga, genus Porphyromonas, genus Prevotella, and Streptococcus genus from biological samples obtained from oral cancer patients. Streptococcus genus, Fusobacterium periodonticum spp., Prevotella melaninogenica spp., Prevotella pallens spp. and Streptococcus pneumoniae ) Analyzing the abundance of at least one microorganism among the species;
  • step (c) predicting, evaluating, or monitoring the treatment response by comparing the abundance of the microorganisms analyzed in step (a) with the abundance of the microorganisms analyzed in step (b).
  • the present invention provides a probiotic composition for treating, improving or preventing oral cancer.
  • oral cancer can be treated, improved, or prevented by increasing the abundance of microorganisms in the oral cancer patient group compared to the control group. Therefore, the present invention provides the genus Porphyromonas, genus Prevotella, Fusobacterium periodonticum species, and Prevotella melaninose, whose abundance was reduced in the oral cancer patient group compared to the normal control group.
  • Nica (Prevotella melaninogenica) species, Prevotella pallens species, Alloprevotella genus, Fusobacterium genus, Haemophilus genus, Veillonella genus, Haemophilus parainfluenzae spp., KV831974_s spp., Lautropia mirabilis spp., Nisseria meningitidis spp., Neisseria subflava spp., PAC001345_s spp., Por.
  • Porphyromonas pasteri spp. Prevotella histicola spp., Prevotella nanceiensis spp., Prevotella salivae spp., Prevotella_uc( Prevotella_uc) species, Streptococcus salivarius species, Veillonella dispar species, Veillonella parvula species, Mannheimia genus, Pasteurellacea_uc
  • a probiotic composition for treating, improving, or preventing oral cancer comprising at least one microorganism of the genus Pasteurellaceae_uc and Saccharimonas is provided.
  • probiotics are defined as live microorganisms that provide health benefits.
  • the probiotic composition of the present invention can be provided in the form of a food or feed composition for humans or animals, or in the form of various quasi-drugs and pharmaceutical compositions for preventing, treating or improving oral cancer.
  • the present invention provides a method for diagnosing oral cancer.
  • the present invention provides use of the composition for diagnosing oral cancer.
  • the present invention provides a method for treating, improving, or preventing oral cancer.
  • the present invention provides the use of the probiotic composition for the production of a medicament for treating, improving or preventing oral cancer.
  • composition for diagnosing oral cancer according to the present invention and the method for providing information for diagnosing oral cancer using the same can easily and accurately diagnose the occurrence or possibility of oral cancer at an early stage by analyzing the abundance of biomarker microorganisms from biological samples and comparing them with the control group. .
  • Figure 1 shows the results of confirming the CHAO index (A), Shannon index (B), beta diversity (C, D), and degree of overlap at the species (E) and genus (F) levels between groups in the healthy control group and oral cancer patient group. It was confirmed that the bacterial diversity of the oral microbiota in oral cancer patients was significantly high.
  • Figure 2 shows the oral microbiota showing differences between the healthy control group and the oral cancer patient group at the phylum (A), genus (B), and species (C) levels.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the functional imbalance and co-occurrence network of oral microorganisms.
  • Figure 4 shows the results of confirming POD values and AUC values in healthy controls and oral cancer patients for selected genus-based markers in order to identify and verify oral microorganism genus-based markers of oral cancer.
  • Figure 5 shows the results of confirming POD values and AUC values in healthy controls and oral cancer patients for selected species-based markers in order to identify and verify oral microbial species-based markers of oral cancer.
  • Figure 6 shows the results of confirming the difference in abundance of five oral microbiomes by stage of oral cancer in the control group and oral cancer patients in order to identify and verify oral microbiome genus-based markers of oral cancer.
  • Figure 7 shows the results of confirming the AUC value of the ROC (receiver operating characteristics) curve for five oral microbiomes to identify and verify oral microbiome genus-based markers of oral cancer.
  • Figure 8 shows the results of confirming the difference in abundance by stage of oral cancer in the control group and oral cancer patients for the two orthologs.
  • Bacterial DNA extraction was performed using the Fast DNA Spin extraction kit (MP Biomedical, Santa Ana, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Data quality was confirmed by uploading to the EzBioCloud 16S-based MTP app (ChunLab, Inc., Seoul, Korea), and then DNA sequencing was performed with Illumina iSeq100 to generate single-end reads. Low-quality sequences with read length (2,000 bp) and average Q value less than 25 were detected and filtered using the cloud app of Ezbiocloud software. Denoising and extraction of non-redundant reads were performed using DUDE-Seq software. The UCHIME algorithm was applied to the Ezbiocloud 16S chimera free database to identify and remove chimera sequencing.
  • the PICRUST algorithm was used to evaluate the functional profile of the microbial community identified by 16s rRNA sequencing.
  • Raw sequencing reads were calculated using the EzBioCloud 16S microbiome pipeline with default parameters and identifiable reads against reference databases.
  • the functional abundance profile of the oral microbiome was based on bioinformatics analysis, specifically using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) orthology, module, and pathway database to estimate the number of gene vectors for each OUT plus the number of OUTs within each sample. It was predicted (annotated) by multiplying the abundance of .
  • Predicted metagenomic profiles were classified into clusters of KEGG orthology, KEGG modules, and KEGG pathways, and compared between groups. The accuracy of each functional profile was determined according to the closest sequence taxon index.
  • Actinomyces, Streptococcus, Capnocytophaga, Granulicatella, and Lautropia were significantly higher in patients, whereas Alloprevotella, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella, and Veillonella were significantly lower in cancer patients ( Figure 2B and Table 2).
  • Alloprevotella, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella, and Veillonella were significantly lower in cancer patients (Figure 2B and Table 2).
  • All 21 species with a relative abundance of 1% or more showed significant differences in oral cancer (Table 2).
  • Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Streptococcus sanguinis were significantly higher in patients, but other species, including six Prevotella spp., were significantly decreased ( Figure 2C and Table 2).
  • Taxon level Taxon name median abundance Multiple Difference (FC) AUC b patient control group Patient/Control p-value adjustment value a Genus Actinomyces 1.18 0.82 1.43 1.54E-02 0.57 Alloprevotella 0.86 2.07 0.42 2.62E-08 0.65 Campylobacter 0.88 1.02 0.86 4.86E-02 0.55 Capnocytophaga 1.26 0.73 1.72 1.32E-06 0.63 Fusobacterium 3.45 4.53 0.76 2.26E-03 0.58 Granulicatella 0.9 0.67 1.35 9.65E-03 0.57 Haemophilus 5.12 10.73 0.48 7.95E-11 0.67 Lautropia 0.65 0.39 1.70 1.76E-02 0.56 Leptotrichia 1.29 1.05 1.23 2.08E-01 0.53 Neisseria 12.32 14.65 0.84 5.43E-02 0.55 Porphyromonas 1.77 3.55 0.50 1.32E-06 0.62 Prevotella 9.92 16.95 0.59 8.04E-14 0.70 Rothia 2.11 1.87 1.
  • a p-value was calculated using Kruskal-Wallis using the false discovery rate (FDR) developed by Benjamini-Hochberg.
  • FDR false discovery rate
  • b The area under the curve (AUC) of the receiver operating characteristics (ROC) curve was calculated using five-fold cross-validation on the entire data set to characterize the general diagnostic accuracy of oral cancer versus healthy controls.
  • Fusobacterium nucleatum, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Streptococcus sanguinis were significantly associated with increased risk of oral cancer, with a higher risk identified in the highest tertile compared to the lowest tertile.
  • multi-step feature screening was performed on genera and species with one or more sequences in more than 5% of all subjects.
  • the model adopts a two-step machine-learning approach consisting of LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) and Random Forest (RF), which use the R packages 'glmnet' and 'random forest', respectively, to reduce features. carried out.
  • LASSO Local Absolute Shrinkage and Selection Operator
  • RF Random Forest
  • LASSO adjusts the lambda parameter to efficiently select relevant taxa to improve model accuracy and interpretability, and then a subset of important taxa selected by the LASSO algorithm to generate the final model.
  • RF was applied to.
  • over-fitting bias was prevented through five-fold cross-validation (CV).
  • CV cross-validation
  • the data set was randomly divided into five parts, four parts were combined into a training set to generate a prediction model, and the remaining part was used as a test set to verify model performance.
  • the number of features was reduced by using a model with ⁇ less than one standard error of the minimum.
  • RF an optimistic number of trees was selected by training the model with sequences from 40 to 400 using a default threshold defined by the model. Taxa were then selected based on the average reduced accuracy model.
  • machine learning on the discovery set consists of a two-step procedure of the least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) feature selection, followed by random forest (RF). model was used. In this process, the same data set for LEfSe analysis was input and used, and 10-fold cross-validation (CV) was applied to both LASSO and RF. At the genus level, 18 genera were selected as the optimal genus panel using machine learning (Table 4). In the discovery set (106 patients; 381 controls), the probability of disease (POD) index was significantly higher in cancer patients compared to healthy controls ( Figure 4A), and this POD index achieved an area under the curve (AUC) value of 0.92.
  • LASSO least absolute shrinkage and selection operator
  • RF random forest
  • Prevotella and Streptococus which show high AUC values of over 0.7, may be particularly potential single biomarkers for oral cancer (Table 4).
  • 16 species were selected as the optimal biomarker set (Table 4).
  • the POD index was significantly higher in the oral cancer group in all data sets ( Figures 5A-5C).
  • AUC values were 0.92 (sensitivity 0.66; specificity 0.96), 0.93 (sensitivity 0.77; specificity 0.98), and 0.93 (sensitivity 0.70; specificity 0.97) for the discovery, validation, and total sets, respectively ( Figures 5D-5F).
  • Taxon level Taxon name median abundance Multiple Difference (FC) AUC patient control group
  • Patient/Control p-value adjustment value a discovery set validation set full set Genus Abiotrophia 0.00 0.00 2.45 8.52E-07 0.61 0.64 0.62 Actinomyces 1.18 0.82 1.43 1.16E-02 0.57 0.59 0.57 Alloscardovia 0.00 0.00 N.A. 6.76E-08 0.66 0.51 0.61 Capnocytophaga 1.26 0.73 1.72 8.52E-07 0.56 0.75 0.63 Dialister 0.18 0.08 2.11 1.43E-08 0.61 0.70 0.65 Howardella 0.00 0.00 N.A. 3.11E-23 0.66 0.76 0.69 Leuconostoc 0.00 0.00 N.A.
  • stage of oral cancer was divided into stages 1 to 4 depending on the size (T) of the primary cancer. Stages 1 and 2 were classified as early stage oral cancer, and stages 3 and 4 were classified as late stage oral cancer.
  • stage 4 As a result, for strains of the Howardella genus, it was relatively higher in stage 4 compared to stage 2 (p ⁇ 0.001). However, there was no significant expression difference between stage 1 and other stages (Figure 6A).
  • stage 2 In the case of strains of the Capnocytophaga genus, the expression rate was relatively high in stage 2 compared to the control group between the control group and oral cancer patients divided by stage (p ⁇ 0.01). Additionally, stage 3 showed relatively low expression compared to stage 1 (p ⁇ 0.01) ( Figure 6D).
  • the five oral microbiomes had an AUC of 0.794 for late-stage oral cancer, while the AUC for early-stage oral cancer was 0.834, showing higher performance, especially in the diagnosis of early-stage oral cancer. It was confirmed that it appears.
  • Ortholog refers to a gene that evolved through speciation while retaining its original function from the same ancestor. A gene that has a certain function in one species has the same function in another species.
  • acyl-CoA dehydrogenase was confirmed to have a higher expression level in steps 1 and 2 compared to the control group, and dihydrofolate reductase showed significant differences in steps 1 to 4, especially in the control group. It was confirmed that the expression level was low in stage 1 and stage 2 compared to . Additionally, the level of dihydrofolate reductase was significantly lower in stage 2 compared to stage 3 (p ⁇ 0.001). Therefore, it was confirmed that (acyl-CoA dehydrogenase (K06445), dihydrofolate reductase (K18590)) has the potential as a biomarker to distinguish early-stage oral cancer from late-stage oral cancer (Figure 8) .

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Abstract

본 발명은 대조군 대비 구강암 환자의 타액에서 유의미하게 증가 또는 감소하는 미생물 군을 규명한 것으로, 상기 미생물 군을 검출하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 조성물 및 이러한 미생물을 이용한 구강암 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 구강암 진단용 조성물 및 진단을 위한 정보제공방법은 정상 대조군 대비 유의미하게 변화를 보이는 미생물 풍부도 수준을 분석, 확인함으로써 구강암의 발병 여부나 발병 가능성을 간편하고 정확하게 조기 진단할 수 있다.

Description

구강 미생물총 기반 구강암의 진단
본 발명은 구강 미생물총 기반 구강암의 진단에 관한 것으로, 구강 미생물총 기반 구강암의 진단용 조성물, 이를 포함하는 구강암의 진단용 키트, 구강암 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
소화 시스템의 관문에 해당되는 위치에 있는 구강은 장에 이어 인체에서 두 번째로 큰 미생물 군집으로 간주되는 복잡한 박테리아 집합체를 보유하고 있다. 구강 건강 유지에 중요한 역할을 하는 700종의 박테리아가 사람의 구강에 존재하는 것으로 추정된다.
최근 일부 연구 그룹은 인체의 다른 부위 내 구강 미생물의 존재와 이러한 미생물과 수많은 전신 질환 사이의 연관성을 보고하였다. 또한, 최근 연구에서 구강 미생물총(microbiota)은 대장암, 식도암, 폐암과 같은 다양한 암 부위와 강한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 연구들 중, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)와 후소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)은 종종 강력한 발암 가능성을 보인 두 가지 경구 종으로, 이는 구강 마이크로바이옴의 암 바이오마커로써 가치가 있음을 시사한다.
한편, 구강암은 선진국, 그리고 특히 발병률과 사망률이 높은 개발 도상국 모두에서 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나이다. 가장 흔한 형태(구강암의 90% 이상)인 구강편평세포암종(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)은 후기에 진단되는 경우가 많고, 원발성 종양의 복잡한 관리 절차로 인해 대부분의 환자에서 삶의 질 및 생존율이 저하된다(<50%).
따라서, 이러한 환자의 삶의 질 향상, 그리고 의료 비용 절감을 위해, 구강암의 조기 진단, 바이오마커 개발을 위한 노력이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 생물학적 시료, 특히 타액에서 대조군 대비 구강암에서 유의미하게 풍부도 변화를 보이는 미생물 종류를 검출하는 제제를 포함하는 조성물로서, 비침습적으로 정확하고 간편하게 구강암을 진단할 수 있는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 생물학적 시료, 특히 타액으로부터 상기 미생물의 풍부도를 확인하고, 이를 대조군 시료 내 미생물의 풍부도와 비교하는 단계를 포함하는 구강암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 대조군 대비 구강암 환자에서 유의하게 풍부도 변화를 보이는 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "구강암"은 입안(혀, 구강저, 볼점막, 잇몸, 입천장, 턱뼈)이나 입술, 구인두(혀의 후방부로서 목과 연결되는 부위)에 발생하는 암을 총칭하며, 구체적으로는 침샘에서 발생하는 타액선암, 턱뼈나 얼굴근육 등에서 발생하는 육종, 입천장, 잇몸 등에 검은 반점을 형성하는 악성 흑색종, 입안 점막의 상피세포에서 유래한 구강 편평상피세포암종 등이 있으며, 이 중 구강암의 약 90%는 구강편평상피세포암종(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)으로 본 발명의 구강암은 구강편평상피세포암종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "풍부도(abundance)" 특정 미생물 종류의 상대적 풍부도 또는 상대적 존재비를 의미하는 것일 수 있으며, 특히 타액 내 미생물총 중 구강암 진단과 연관된 특정 미생물에 대한 상대 존재비의 풍부도를 의미할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "미생물을 검출하는 제제"는 구강암의 예측 또는 진단을 위해, 대조군 대비 구강암 환자에서 특이적 풍부도를 보이는 미생물들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재를 검출할 수 있는 제제라면 물질의 종류에는 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 미생물 검출 제제는 상기 미생물의 16S rRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 제제를 이용한 미생물 검출은 미생물 특이적 발현 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 혼성화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있는 것으로, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
상기 '프라이머(primer)'는 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미하는 것으로, 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.
상기 '프로브(probe)'는 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.
상기 '혼성화(hybridization)'는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미하며, 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전(perfect match)한 경우 뿐만 아니라, 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 혼성화가 발생할 수 있다.
상기 '항체' (또는 면역글로불린)은 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 말하며, 예를 들면, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 구체적으로는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv를 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cellcycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
또한, 본 발명의 진단용 조성물은 상기 미생물의 존재 여부를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 구강암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 판별 또는 예측하는 것이다.
본 발명에서 '대조군 대비 구강암 환자에서 유의하게 풍부도 변화를 보이는 미생물'은 건강한 대조군 대비 구강암 환자에서 유의하게 증가 또는 감소한 미생물 종류를 의미하는 것으로, 구체적으로는 18개의 속(아비오트로피아(Abiotrophia), 악티노마이세스(Actinomyces), 알로스카르도비아(Alloscardovia), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 다이얼리스터(Dialister), 하워드델라(Howardella), 류코노스톡(Leuconostoc), 만헤이미아(Mannheimia), 모기박테리움(Mogibacterium), 올세넬라(Olsenella), 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia), 파르비모나스(Parvimonas), 파스퇴렐라세아_uc(Pasteurellaceae_uc), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 사카리모나스(Saccharimonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 스트렙토코커스(Streptococcus)) 및 16개의 종(AF385567_s, 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스(Actinomyces odontolyticus), 알로프레보텔라 탄네라(Alloprevotella tannerae), 카프노사이토파가 스푸티제나(Capnocytophaga sputigena), 다이얼리스터 뉴모신트(Dialister pneumosintes), 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum), 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 겔리덤(Leuconostoc Gelidum), 나이세리아 일롱게이트(Neisseria elongate), 파라부르크홀데리아 그라미니스(Paraburkholderia Graminis), 프레보텔라 바로니아(Prevotella baroniae), 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens), 스트렙토코커스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)) 중 어느 하나 이상의 미생물일 수 있으며, 높은 진단 정확도(AUC 값) 및 모든 분석에서 일관된 결과를 보이는 측면에서는 5개의 속(Actinomyces, Capnocytophaga, Porphyromonas, Prevotella, Streptococcus) 및 4 개의 종 (푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum), Prevotella melaninogenica, Prevotella pallens, Streptococcus pneumoniae) 중 어느 하나 이상의 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는, 정상 대조군과 구강암 환자의 구강내 미생물 중 풍부도의 유의적인 차이를 갖는 미생물들을 발견하고, 이들이 구강암 진단의 바이오마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 구강암 환자와 정상 대조군 구강 내 미생물군 프로파일의 확인 결과를 기초로, 본 발명에서, 문(phylum) 수준에서는 악티노박테리아(Actinobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 피르미쿠테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)가 구강암 진단을 위한 바이오마커로써 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 Bacteroidetes, Fusobacteria 및 Proteobacteria는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 감소되는 반면, Actinobacteria와 Firmicutes는 구강암에서 풍부도가 유의적으로 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 속(genus) 수준에서, 악티노마이세스(Actinomyces), 스트렙토코커스(Streptococcus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 그래눌리카텔라(Granulicatella), 라우트로피아(Lautropia), 알로프레보텔라(Alloprevotella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella) 및 베일로넬라(Veillonella)가 구강암 진단을 위한 바이오마커로써 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 Actinomyces, Streptococcus, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 증가하는 반면, Alloprevotella, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella 및 Veillonella는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 미생물 종(species) 수준에서, 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum), 그래눌리카텔라 아디아센스(Granulicatella adiacens), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), KV831974_s, 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis), 나이세리아 메닌지티디스(Nisseria meningitidis), 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava), PAC001345_s, 포르피로모나스 파스테리(Porphyromonas pasteri), 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola), 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica), 프레보텔라 낸시엔시스(Prevotella nanceiensis), 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens), 프레보텔라 살리베(Prevotella salivae), 프레보텔라_uc(Prevotella_uc), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguinis), 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar), 베일로넬라 파불라(Veillonella parvula)가 구강암 진단을 위한 바이오마커로써 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae 및 Streptococcus sanguinis은 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 증가하는 반면, Fusobacterium peridonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius, Veillonella dispar, Veillonella parvula 은 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.
미생물총 불균형 분석을 위한 LEfSE의 선형 판별 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 이러한 상기 선발된 미생물들의 상대적 풍부도에 폴드 체인지값(fold change) 및 AUC 값이 이들 미생물들이 바이오마커로써 활용될 수 있음을 뒷받침한다.
또한, LASSO 및 RF 분석을 통해, 속(genus) 수준에서는, Abiotrophia, Actinomyces, Alloscardovia, Capnocytophaga, Dialister, Howardella, Leuconostoc, Mannheimia, Mogibacterium, Olsenella, Paraburkholderia, Parvimonas, Pasteurellaceae_uc, Porphyromonas, Prevotella, Saccharimonas, Sphingomonas, Streptococcus 가 구강암 진단을 위한 바이오마커로써 포함될 수 있다. 여기서, 상기 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속은 특히 AUC값이 0.7 이상으로 특히 더 유의미한 바이오마커일 수 있다.
구체적으로, 상기 Abiotrophia, Actinomyces, Capnocytophaga, Dialister, Mogibacterium, Parvimonas, Streptococcus는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 증가하는 반면, Mannheimia, Pasteurellaceae_uc, Pophyromonas, Prevotella, Saccharimonas는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 종(species) 수준에서는, AF385567_s, Actionmyces odontolyticus, Alloprevotella tannerae, Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Fusobacterium periodonticum, Lactobacillus iners, Lactobacillus sakei, Leuconostoc gelidum, Neisseria elongate, Paraburkholderia graminis, Prevotella baroniae, Prevotella melaninogenica, Prevotella pallens, Streptococcus constellatus, Streptococcus pneumoniae 가 구강암 진단을 위한 바이오마커로써 포함될 수 있다.
구체적으로, Actionmyces odontolyticus, Alloprevotella tannerae, Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Neisseria elongate, Prevotella baroniae, Streptococcus constellatus, Streptococcus pneumoniae 는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 증가하는 반면, Fusobacterium periodonticum, Prevotella melaninogenica, Prevotella pallens 는 정상 대조군 대비 구강암에서 풍부도가 유의적으로 감소되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 예시적 구현예로써, 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예시적 구현예로써, 그래눌리카텔라(Granulicatella) 속, 라우트로피아(Lautropia) 속, 알로프레보텔라(Alloprevotella) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속, 헤모필루스(Haemophilus) 속, 베일로넬라(Veillonella) 속, 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 종, 그래눌리카텔라 아디아센스(Granulicatella adiacens) 종, 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae) 종, KV831974_s 종, 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 종, 나이세리아 메닌지티디스(Nisseria meningitidis) 종, 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava) 종, PAC001345_s 종, 포르피로모나스 파스테리(Porphyromonas pasteri) 종, 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 종, 프레보텔라 낸시엔시스(Prevotella nanceiensis) 종, 프레보텔라 살리베(Prevotella salivae) 종, 프레보텔라_uc(Prevotella_uc) 종, 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 종, 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguinis) 종, 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 종 및 베일로넬라 파불라(Veillonella parvula) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물을 검출하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시적 구현예로써, 다이얼리스터(Dialister) 속, 모기박테리움(Mogibacterium) 속, 파르비모나스(Parvimonas) 속, 만헤이미아(Mannheimia) 속, 파스퇴렐라세아_uc(Pasteurellaceae_uc) 속, 사카리모나스(Saccharimonas) 속, 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스(Actinomyces odontolyticus) 종, 알로프레보텔라 탄네라(Alloprevotella tannerae) 종, 카프노사이토파가 스푸티제나(Capnocytophaga sputigena) 종, 다이얼리스터 뉴모신트(Dialister pneumosintes) 종, 나이세리아 일롱게이트(Neisseria elongate) 종, 프레보텔라 바로니아(Prevotella baroniae) 종 및 스트렙토코커스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus) 종 중 적어도 하나의 미생물을 검출하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시적 구현예로써, 하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속, 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 중 적어도 하나의 미생물을 검출하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속 및 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 중 적어도 어느 하나의 미생물을 검출하는 제제는 조기 단계의 구강암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시적 구현예로써, 아실-CoA 탈수소 효소 및 디하이드로폴레이트 환원 효소 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자를 검출하는 제제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유전자를 검출하는 제제는 조기 단계의 구강암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조기 단계의 구강암이란 원발암의 크기나 목의 림프절의 전이, 원격전이 여부에 따라 단계 1 내지 4로 나누었을 때, 단계 1 및 2를 의미하는 것일 수 있다. 구체적으로, 단계 1은 원발암의 크기가 2cm 이하이고 목의 림프절로의 전이나 원격전이가 없는 경우를 말하고, 단계 2는 원발암의 크기가 2cm 이상 4cm 이하이고 목의 림프절로의 전이나 원격전이가 없는 경우를 말하며, 단계 3은 원발암의 크기가 4cm 이상이고 목에 3cm 이하의 림프절 전이가 한 개 있고 원격전이가 없는 경우를 말하고, 단계 4는 원발암이 뼈나 얼굴의 피부, 혀의 심부근육을 침범했거나 원발부위 쪽에 3 내지 6cm의 림프절 전이가 1개 있는 경우, 목에 6cm 이하의 림프절 전이가 2개 이상이거나, 양측 또는 병변의 반대측 림프절에도 전이된 경우로 원격전이는 없는 경우, 목에 6cm 이상의 큰 림프절 전이가 있는 경우 또는 원발부위의 수술이 불가능한 경우로 원격전이가 없는 경우 또는 원격전이가 된 경우를 말한다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 "구강암 진단용 키트"는 구강암 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미하는 것으로, 상기 키트는 상기 진단용 조성물 이외에도 진단에 필요한 키트를 사용하기 위한 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로써, 상기 키트는 정상인 유래 샘플과 비교하여 속 수준에서 Actinomyces, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Leptotrichia, Rothisa, Streptococcus의 풍부도가 증가되어 있고, Alloprevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Haemophilus, Neisseria, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella의 풍부도가 감소되어 있고, 종 수준에서 Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis의 풍부도가 증가되어 있고, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum), Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius, Veillonella dispar, Veillonella parvula의 풍부도가 감소되어 있는 경우 구강암으로 진단하는 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 정보제공방법은 (a)생물학적 시료로부터 대조군 대비 구강암 환자에서 풍부도가 유의하게 변화된 미생물 종류의 풍부도를 확인하는 단계; 및 (b)상기 풍부도를 대조군 시료 내 미생물의 풍부도와 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 예시로써, 상기 '대조군 대비 구강암 환자에서 풍부도가 유의하게 변화된 미생물 종류'는 속 수준에서 Actinomyces, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Leptotrichia, Rothia, Streptococcus, Alloprevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Haemophilus, Neisseria, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, 종 수준에서 Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis, Fusobacterium periodonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius, Veillonella dispar, Veillonella parvula으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로써, 상기 ‘대조군 대비 구강암 환자에서 풍부도가 유의하게 변화된 미생물 종류’는 하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속, 스핑고모나스(Sphingomonas) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 생물학적 시료로부터 특정 미생물 종류의 풍부도를 확인하는 단계는 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하여 미생물의 풍부도를 분석하는 것이다.
본 발명의 일 예시로써, (a) 단계는 본 발명의 일 예시에 따른 상기 미생물 검출 제제를 이용하여 구강 내 미생물의 풍부도를 분석하는 단계일 수 있으며, 예를 들어 상기 미생물로부터 DNA를 추출하여 16S rRNA에 대한 PCR 프라이머 세트를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로써, (b)단계는 상기 (a) 단계의 풍부도 분석 결과를 건강한 정상 대조군과 비교하는 단계로서, 속 수준에서 Actinomyces, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia, Leptotrichia, Rothia, Streptococcus, Howardella, Dialister, Paraburkholderia, Sphingomonas의 풍부도가 증가되어 있고, Alloprevotella, Campylobacter, Fusobacterium, Haemophilus, Neisseria, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella의 풍부도가 감소되어 있고, 종 수준에서 Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sanguinis의 풍부도가 증가되어 있고, Fusobacterium periodonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Streptococcus salivarius, Veillonella dispar, Veillonella parvula의 풍부도가 감소되어 있는 경우 구강암 또는 구강암이 발병할 위험성이 있는 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 예시로써, 하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속 및 스핑고모나스(Sphingomonas) 속의 풍부도가 증가되어 있거나, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속의 풍부도가 감소되어 있는 경우 조기 단계의 구강암인 것으로 진단할 수 있다.
상기 정보제공방법은 아실-CoA 탈수소 효소 및 디하이드로폴레이트 환원 효소 중 적어도 하나를 암호화하는 유전자의 발현수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 아실-CoA 탈수소 효소를 암호화하는 유전자의 발현수준이 증가하는 경우 조기 단계의 구강암인 것으로 진단할 수 있고, 상기 디하이드로폴레이트 환원 효소를 암호화하는 유전자의 발현수준이 감소하는 경우 조기 단계의 구강암인 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 용어 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 진단 대상으로부터 비침습적으로 채취한 병리조직학적 검사용 액체 생검, 예를 들면, 진단 대상의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 복수(ascites) 등일 수 있다. 본 발명의 일 예시로써, 진단 대상으로부터 채취한 타액일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암 치료, 개선 또는 예방을 위한 후보 약물의 선정 방법을 제공한다.
상기 방법은, (a)구강암의 치료, 개선 또는 예방을 위한 후보 약물을 처리하기 전 대상으로부터 수득한 생물학적 시료로부터 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계;
(b) 상기 후보 약물을 처리 후 대상으로부터 수득한 생물학적 시료로부터 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
(c)상기 (a) 단계에서 분석된 미생물 풍부도와 (b) 단계에서 분석된 미생물의 풍부도를 비교함으로써, 후보 약물을 스크리닝 하는 단계;를 포함할 수 있다.
여기서 상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서의 미생물의 풍부도를 분석하는 단계는, 앞서, 구강암 진단을 위한 정보제공방법에서 언급한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 상기 후보 약물에는 그 종류에 제한이 없고, 일 예로, 천연물, 화합물, 생체 물질, 프리바이오틱스 등 의약, 기능성 식품 소재를 모두 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암 치료 반응의 예측 또는 모니터링 방법을 제공한다.
상기 방법은, (a)구강암 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계;
(b) 구강암 치료 후 환자로부터 수득한 생물학적 시료로부터 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
(c)상기 (a) 단계에서 분석된 미생물 풍부도와 (b) 단계에서 분석된 미생물의 풍부도를 비교함으로써, 치료 반응을 예측, 평가 또는 모니터링 하는 단계;를 포함할 수 있다.
구강암 발병, 진행 단계에 따라 적절한 치료법의 제시와 평가, 치료 계획의 수립이 중요한데, 본 발명에 따른 미생물들의 풍부도를 환자 시료에서 분석함으로써, 환자의 치료 반응을 정확도 높게 예측, 모니터링할 수 있다.
구체적으로, 목적한 구강암의 치료 전과 후의 환자 시료 내 바이오마커 미생물들의 풍부도를 분석하고 비교함으로써, 해당 구강암 치료가 치료 반응이 양성, 또는 음성으로 나타나는지를 평가, 모니터링할 수 있으며, 향후 치료 반응을 예측할 수도 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암 치료, 개선 또는 예방을 위한 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시예에서 대조군 대비 구강암 환자군에서 풍부도가 감소된 미생물들에 대해서는, 구강 내 풍부도 증진을 통해 구강암 치료, 개선 또는 예방이 가능하다. 따라서, 본 발명은 구강암 환자군에서 정상 대조군 대비 풍부도가 감소된 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종, 알로프레보텔라(Alloprevotella) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속, 헤모필루스(Haemophilus) 속, 베일로넬라(Veillonella) 속, 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae) 종, KV831974_s 종, 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 종, 나이세리아 메닌지티디스(Nisseria meningitidis) 종, 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava) 종, PAC001345_s 종, 포르피로모나스 파스테리(Porphyromonas pasteri) 종, 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 종, 프레보텔라 낸시엔시스(Prevotella nanceiensis) 종, 프레보텔라 살리베(Prevotella salivae) 종, 프레보텔라_uc(Prevotella_uc) 종, 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 종, 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 종, 베일로넬라 파불라(Veillonella parvula) 종, 만헤이미아(Mannheimia) 속, 파스퇴렐라세아_uc(Pasteurellaceae_uc) 속 및 사카리모나스(Saccharimonas) 속 중 적어도 하나의 미생물을 포함하는 구강암 치료, 개선, 또는 예방을 위한 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "프로바이오틱스"는 건강에 이익을 제공하는 살아있는 미생물로 정의된다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 인체 또는 동물을 대상으로 하는 식품 또는 사료 조성물의 형태로 제공이 가능하고, 또는 구강암 예방, 치료 또는 개선을 위한 각종 의약외품, 의약품 조성물의 형태로도 제공 가능하다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암을 진단하기 위한 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암을 진단하기 위한, 상기 조성물의 용도를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암의 치료, 개선, 또는 예방 방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 양태로서, 본 발명은 구강암의 치료, 개선 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 상기 프로바이오틱스 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 구강암 진단용 조성물 및 이를 이용한 구강암 진단을 위한 정보제공방법은 생물학적 시료로부터 바이오마커 미생물들의 풍부도를 분석 및 대조군과 비교함으로써 구강암의 발병 여부나 발병 가능성을 간편하고 정확하게 조기 진단할 수 있다.
도 1은 건강 대조군 및 구강암 환자군의 CHAO 지수(A), Shannon 지수(B), 베타 다양성(C, D) 및 그룹 간 종(E) 및 속(F) 수준에서의 중복 정도를 확인한 결과로서, 구강암 환자에서 구강 미생물군의 박테리아 다양성이 유의미하게 높음을 확인하였다.
도 2는 건강 대조군 및 구강암 환자군에서 차이를 보이는 구강 미생물군을 문(A), 속(B) 및 종(C) 수준에서 나타낸 것이다.
도 3은 구강내 미생물의 기능 불균형 및 동시발생 네트워크를 분석한 결과이다.
도 4는 구강암의 구강 미생물 속(genus)-기반 마커에 대한 규명 및 검증을 위해, 선별한 속-기반 마커에 대해 건강 대조군과 구강암 환자에서의 POD 값 및 AUC 값을 확인한 결과이다.
도 5는 구강암의 구강 미생물 종(species)-기반 마커에 대한 규명 및 검증을 위해, 선별한 종-기반 마커에 대해 건강 대조군과 구강암 환자에서의 POD 값 및 AUC 값을 확인한 결과이다.
도 6은 구강암의 구강 미생물 속(genus)-기반 마커에 대한 규명 및 검증을 위해, 5개의 구강 마이크로바이옴에 대해 대조군과 구강암 환자에서의 구강암의 단계별로 풍부도의 차이를 확인한 결과이다.
도 7은 구강암의 구강 미생물 속(genus)-기반 마커에 대한 규명 및 검증을 위해, 5개의 구강 마이크로바이옴에 대해 ROC(receiver operating characteristics) 곡선의 AUC 값을 확인한 결과이다.
도 8는 2개의 ortholog에 대해 대조군과 구강암 환자에서의 구강암의 단계별로 풍부도의 차이를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 샘플 준비 및 시퀀싱 수행
1.1. 연구 집단 샘플 내 DNA 추출
(1) 연구 피험자 및 샘플 수집
환자-대조군 연구는 국립암센터(환자 106명)와 서울대학교 치과병원(환자 61명)에서 조직학적으로 확인된 혀, 위 잇몸, 아래 잇몸, 협측 점막, 구개후 삼각근, 경구개, 연구개, 입바닥 및 아랫 입술의 OSCC를 진단받은 167명의 남성과 여성(19세 이상)을 등록하였다. 등록 당시 암이 없는 건강한 대조군 569명이 국립암센터의 암 검진 코호트에서 모집되었으며, 치료 또는 수술을 받거나 면역억제제를 사용한 피험자는 등록시 제외되었다. 모든 피험자는 등록 전 서면 동의서에 서명하고, 등록 시 알코올 소비 관련 행동에 대한 질문을 포함한 상세한 자가 관리 건강 및 생활 습관 설문지를 작성하였다. 본 연구는 국립암센터 기관윤리위원회(IRB No. NCC2018-0217)의 승인을 받았다. 타액 샘플은 시험관에 수집되어, 직후 추가 분석이 있을 때까지 -80℃에서 동결되었다.
(2) DNA 추출 및 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱
박테리아 DNA 추출은 Fast DNA Spin 추출 키트(MP Biomedical, Santa Ana, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. EzBioCloud 16S 기반 MTP 앱(ChunLab, Inc., 대한민국 서울)에 업로드하여 데이터 품질을 확인하고, 이후 Illumina iSeq100으로 DNA 시퀀싱을 수행하여 단일 방향 리드(single-end reads)를 생성하였다. Ezbiocloud 소프트웨어의 클라우드 앱을 사용하여 리드 길이(2,000bp) 및 25 미만의 평균 Q 값을 가지는 낮은 품질의 시퀀스를 감지하고 필터링 하였다. DUDE-Seq 소프트웨어를 사용하여 비-중복(redundant) 리드의 노이즈 제거 및 추출이 수행되었다. 키메라(chimera) 시퀀싱을 확인하고 제거하기 위해 Ezbiocloud 16S 키메라 프리 데이터베이스에 UCHIME 알고리즘을 적용하였다. USEARCH 프로그램으로 분류학적 과제를 수행하여 EzBioCloud 16S 데이터베이스에 대한 쿼리 단일 방향 리드의 시퀀스 유사성을 감지하고 계산하였다. EzBioCloud 시퀀싱 리드는 UPARSE 알고리즘을 사용하여 97% 시퀀스 유사도로 OTU로 클러스터링되었다. 각 샘플의 단일 방향 리드는 전술한 컷오프 값과 함께 UCLUST 툴을 사용하여 많은 OTU로 클러스터링되었다.
1.2. 연구 집단 특성
그룹간 미생물군 불균형을 조사하기 위해, 총 736명의 피험자(환자 167명; 대조군 569명)가 포함 및 제외 기준에 따라 선택되었다. 환자는 모집 위치, 국립암센터(106명) 또는 서울대학교 병원(61명)에 따라 디스커버리 세트 또는 검증 세트로 추가 할당되었고, 대조군은 381명은 디스커버리 세트로, 188명은 검증 세트로 무작위로 나누었다. 구강암 환자와 건강한 대조군의 인구통계학적 특성과 임상적 특성은 표 1에 요약하였다.
변수 디스커버리 데이터 세트 검증 데이터 세트
대조군(N=381) 환자(N=106) P-valuea 대조군(N=188) 환자(N=61) P-valuea
성별 남성 171 (44.9) 65 (61.3) <0.001 67 (35.6) 34 (55.7) <0.001
여성 210 (55.1) 41 (38.7) 121 (64.4) 27 (44.3)
나이(세) 나이 (평균±SD) 55.8±8.0 63.2±13.9 <0.001 61.0±8.1 68.0±11.7 <0.001
Ⅰ(나이< 40) 11 (2.9) 6 (5.7) <0.001 4 (2.1) 2 (3.3) <0.001
Ⅱ(나이< 50) 35 (9.2) 9 (8.5) 10 (5.3) 3 (4.9)
Ⅲ(나이< 60) 220 (57.7) 30 (28.3) 48 (25.5) 7 (11.5)
Ⅳ(나이< 70) 103 (27.0) 22 (20.8) 112 (59.6) 18 (29.5)
Ⅴ (나이≥70) 12 (3.1) 39 (36.8) 14 (7.4) 31 (50.8)
흡연b 현재 흡연자 51 (13.4) 25 (23.6) 0.07 13 (6.9) 8 (13.1) 0.001
음주c 현재 음주가 243 (63.8) 39 (36.4) <0.001 99 (52.7) 20 (32.8) 0.003
T 단계 T0 0 (0.0) 2 (3.3) <0.001
T1 17 (16.0) 14 (23.0)
T2 18 (17.0) 17 (27.9)
T3 26 (24.5) 1 (1.6)
T4 35 (33.0) 15 (24.6)
미정 10 (9.4) 12 (19.7)
N 단계 N0 53 (50.0) 34 (55.7) 0.45
N1 10 (9.4) 6 (9.8)
N2 14 (13.2) 8 (13.1)
N3 6 (5.7) 0 (0.0)
미정 23 (21.7) 13 (21.3)
단계 0 0 (0.0) 1 (1.6) 0.01
1 16 (15.1) 12 (19.7)
2 13 (12.3) 13 (21.3)
3 21 (19.8) 4 (6.6)
4 45 (42.5) 17 (27.9)
미정 11 (10.4) 14 (23.0)
분화 저분화(Poor) 12 (11.3) 0 (0.0) <0.001
중증도분화(Moderate) 41 (38.7) 4 (6.6)
고분화(Well) 36 (34.0) 40 (65.6)
미정 17 (16.0) 17 (27.9)
위치 입술 1 (0.9) 0 (0.0) 0.21
혀 30 (28.3) 11 (18.0)
입바닥 4 (3.8) 1 (1.6)
소구치 삼각근(Retromolar trigone) 5 (4.7) 0 (0.0)
하드 플레이트 7 (6.6) 5 (8.2)
치조 능선d 45(42.4) 29(47.6)
기타e 14 (13.2) 15 (24.6)
변수의 결과는 %로 표시되며, a P-value는 연속 변수에 대한 Kruskal-Wallis 테스트와 범주형 변수에 대한 카이 제곱 테스트를 사용하여 계산하였다. b 흡연 상태는 2개 그룹(현재 흡연 중/현재 흡연하지 않는 그룹)으로 분류되었습니다. c 음주상태도 2개 그룹(현재 음주를 하고 있는 사람/현재 술을 마시지 않는 사람)으로 분류하였다. d 치조능선: 상부 잇몸, 하부 잇몸 및 협측 점막; e 기타: 상악동, 연구개, 턱밑샘 및 기타. SD: 표준 오차.
실시예 2. 건강 대조군 대비 구강암 환자의 타액 내 미생물 다양성 확인
2.1. 시퀀싱 결과 분석
(1) 기능적 메타 유전체 분석
EzBioCloud 16S 기반 MTP 파이프라인의 경우, PICRUST 알고리즘을 사용하여 16s rRNA 시퀀싱으로 확인한 미생물군집의 기능적 프로파일을 평가하였다. 가공하지 않은 시퀀싱 리드는 기본 매개변수가 있는 EzBioCloud 16S 마이크로바이옴 파이프라인과 참조 데이터베이스와 대립하는 식별 가능한 리드를 사용하여 계산되었다. 구강 미생물군집의 기능적 풍부도 프로파일은 생물정보학 분석을 기반으로, 특히 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) orthology, 모듈 및 경로(pathway) 데이터베이스를 사용하여 각 OUT에 대한 유전자 벡터 수에 각 샘플 내 OUT의 풍부도를 곱하여, 예측되었다(annotated). 예측된 메타게놈 프로파일은 KEGG orthology, KEGG 모듈 및 KEGG 경로의 클러스터로 분류되고, 그룹 간에 비교되었다. 각 기능 프로파일의 정확도는 가장 가까운 서열 분류군 인덱스에 따라 결정되었다.
(2) 통계적 분석
피험자의 인구 통계학적 특성과 임상적 특성의 그룹 간 차이를 연속형 변수와 범주형 변수에 대해 각각 Kruskal-Wallis 및 카이-제곱 테스트를 사용하여 비교하였다. CHAO 및 Shannon 지수의 알파 다양성은 각 그룹에 대해 계산되었으며, 베타 다양성은 가중(weighted) 및 비가중 UniFrac 거리에 따라 주좌표 분석(PCoA)으로 계산되었다. 그룹 간 거리의 유의성을 결정하기 위해 순열 다변량 분산 분석(PERMANOVA)이 수행되었고, 다양성과 PERMANOVA 결과는 R의 "GUniFrac" 패키지를 사용하여 분석되었다. 웹사이트 https:/huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root의 기본 설정으로 속, 종 수준의 분류군 및 기능 데이터 KEGG 경로, KEGG 모듈, KEGG 정형 분류군에 대해 Wilcoxon 순위 합 테스트 및 LEfSe 방법을 사용하여 특이적 풍부도 분석(differential abundance analysis)을 수행하였다. 적은 수의 분류군을 제외시키기 위해, 전체 피험자의 최소 5% 내 적어도 하나 이상의 서열을 갖는 속과 종만을 포함시켰다. 히트맵 상관 분석은 R 패키지 "heatmaply"를 사용하여 수행하였다. |상관 계수| 0.4이상의 상관관계에 대한 네트워크 모델은 Cytoscape 버전 3.9.0을 사용하여 표시하였다. 이후 분류 및 기능적 구성 프로파일은 배수 차이(fold-change) 분석, 다변수 조정된 조건부 로지스틱 회귀 및 AUC 값을 기반으로 분석되었다. 유의미한 그룹 간 차이를 규명하기 위해, Bonferroni 방법을 사용한 사후(Post hoc) 다중 비교가 이용되었다. 성별, 연령, 흡연, 알코올 소비에 대해 조정된 OR 및 해당 95% CI를 추정하기 위해 조정된 조건부 로지스틱 회귀가 수행되었다. ROC(receiver operating characteristics) 곡선의 AUC는 구강암 및 건강 대조군 상태에 대한 바이오마커의 진단 정확도를 특성화하기 위해 발견, 검증 및 전체 세트에서 5중 교차 검증을 사용하여 계산되었다. 모든 통계적 테스트는 p<0.05로 설정된 유의성과 함께 양방향이었으며, 다른 모든 통계 분석 및 시각화는 R 버전 4.1.1(R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)의 ggplot2 패키지를 사용하여 수행되었다.
2.2. 구강암 환자의 구강 내 미생물군 프로파일 확인
(1) 구강암 환자에서 상이한 풍부도를 나타내는 미생물군 프로파일
총 31개의 문(phyla), 116개의 강(class), 244개의 목(order), 492개의 과(family), 1574개의 속(genus), 3936개의 종(species)이 연구 표본에서 확인되었다. 알파 다양성의 분석에서 CHAO 및 Shannon 지수는 모두 대조군 대비 구강 환자에서 유의하게 더 높았다(도 1A 및 1B). 또한, 그룹 간의 미생물군집 공간(space)을 나타내는 베타 다양성은 가중 및 비가중 UniFrac 거리를 기반으로 하는 PCoA(Principal Coordinate Analysis)에 의해 수행되었다. 변이 검정의 순열 분석 결과도 베타 다양성이 구강암 환자와 대조군 간에 유의하게 다른 것으로 나타났다(도 1C 및 1D). 벤 다이어그램은 664개의 속 및 1,455개의 종이 2개 그룹 사이에 중복되어 있음을 나타낸다(도 1E 및 1F).
우선, 상대적 풍부도가 1% 이상인 상위 미생물군집의 프로파일을 분석하였으며, 문(phylum) 수준에서는 Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria 및 Proteobacteria가 박테리아 군집의 90% 이상을 차지하는 5종류의 가장 풍부한 문이었다(도 2A). Bacteroidetes, Fusobacteria 및 Proteobacteria는 구강암에서 대폭 감소된 반면, Actinobacteria와 Firmicutes는 구강암에서 유의하게 풍부했다(도 2A). 속(genus) 수준에서, 상위 15개 속은 타액 미생물군의 86% 이상을 차지했다(도 2B). Actinomyces, Streptococcus, Capnocytophaga, Granulicatella, Lautropia는 환자에서 유의하게 높았지만, Alloprevotella, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella 및 Veillonella는 암 환자에서 유의하게 낮았다(도 2B 및 표 2). 종(species) 수준에서 상대적 풍부도가 1% 이상인 21종 모두 구강암에서 유의한 차이를 보였다(표 2). Fusobacterium nucleatum, Granulicatella adiacens, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae 및 Streptococcus sanguinis은 환자에서 유의하게 높았으나, 6종류의 Prevotella spp.을 포함한 다른 종에서는 유의하게 감소했다(도 2C 및 표 2).
분류군 수준 분류군 명칭 풍부도 중앙값 배수 차이(FC) AUCb
환자 대조군 환자/ 대조군 p-value 조정값a
속(Genus) Actinomyces 1.18 0.82 1.43 1.54E-02 0.57
Alloprevotella 0.86 2.07 0.42 2.62E-08 0.65
Campylobacter 0.88 1.02 0.86 4.86E-02 0.55
Capnocytophaga 1.26 0.73 1.72 1.32E-06 0.63
Fusobacterium 3.45 4.53 0.76 2.26E-03 0.58
Granulicatella 0.9 0.67 1.35 9.65E-03 0.57
Haemophilus 5.12 10.73 0.48 7.95E-11 0.67
Lautropia 0.65 0.39 1.70 1.76E-02 0.56
Leptotrichia 1.29 1.05 1.23 2.08E-01 0.53
Neisseria 12.32 14.65 0.84 5.43E-02 0.55
Porphyromonas 1.77 3.55 0.50 1.32E-06 0.62
Prevotella 9.92 16.95 0.59 8.04E-14 0.70
Rothia 2.11 1.87 1.13 7.44E-01 0.50
Streptococcus 9.77 4.94 1.98 6.31E-17 0.72
Veillonella 8.13 11.92 0.68 3.17E-08 0.65
종(Species) Fusobacterium nucleatum group 1.94 1.11 1.74 3.64E-05 0.61
Fusobacterium periodonticum group 0.82 2.68 0.31 9.71E-22 0.75
Granulicatella adiacens group 0.81 0.65 1.24 2.70E-02 0.55
Haemophilus parainfluenzae group 4.88 10.17 0.48 8.14E-13 0.69
KV831974_s group 0.77 1.01 0.76 6.36E-03 0.57
Lautropia mirabilis group 0.65 0.39 1.70 1.33E-02 0.56
Neisseria meningitidis group 0.99 0.25 4.01 1.86E-06 0.62
Neisseria subflava group 6.59 12.14 0.54 1.44E-07 0.64
PAC001345_s group 0.31 1.31 0.24 1.72E-17 0.72
Porphyromonas pasteri group 0.5 2.05 0.25 8.14E-13 0.68
Prevotella histicola 0.05 0.56 0.10 2.37E-10 0.67
Prevotella melaninogenica 1.7 5.13 0.33 1.38E-21 0.75
Prevotella nanceiensis group 0.16 0.99 0.16 2.95E-22 0.74
Prevotella pallens 0.29 1.37 0.21 9.26E-15 0.70
Prevotella salivae 0.4 0.69 0.59 5.83E-04 0.59
Prevotella_uc 0.27 0.72 0.37 1.13E-10 0.67
Streptococcus pneumoniae group 5.07 2.40 2.11 6.41E-17 0.72
Streptococcus salivarius group 0.39 0.55 0.70 4.88E-04 0.40
Streptococcus sanguinis group 2.39 1.24 1.93 1.20E-06 0.63
Veillonella dispar 5.17 6.91 0.75 2.39E-03 0.57
Veillonella parvula group 1.53 2.50 0.61 2.35E-05 0.61
a p-value는 Benjamini-Hochberg가 개발한 FDR(false discovery rate)를 사용한 Kruskal-Wallis으로 계산하였다. b ROC(receiver operating characteristics) 곡선의 AUC(area under the curve)는 구강암 대 건강 대조군의 일반적인 진단 정확도를 특성화하기 위하여 전체 데이터 세트에서 5중 교차 검증을 사용하여 계산하였다.
건강한 대조군 대비 암 환자의 구강 미생물총 불균형을 조사하기 위해, 속 및 종 수준에서 효과 크기(LEfSe) 의 선형 판별 분석을 수행하였으며, 적은 수의 분류군을 제외하기 위해, 전체 피험자의 최소 5%에서 하나 이상의 서열을 갖는 속과 종만 포함시켰다.
LEfSe의 결과에 따라, 그룹 간에 유의하게 조절되지 않는 19개의 속과 39개의 종을 규명하였다. 표 2에서 나타난 바와 같이, 상위 우성 마이크로바이옴의 유의미하지 않은 1개의 속을 제외하고, 15개 속 중 11개 및 21개 종 모두 LEfSe 결과에서 반복되어 유의미한 바이오마커들로 확인되었다.
구강암 위험도와 환자에서 풍부도가 높은 속 및 종의 연관성을 추가로 조사하기 위해 성별, 연령, 흡연 및 음주 상태에 대해 조정된 다중 조건부 로지스틱 회귀를 수행하였다(표 3, 전체 연구집단에서의 구강암 위험도와 상위 15 속 및 21 종 간의 연관성). 각 분류군은 연속 변수 및 건강한 대조군간의 삼분위(tertiles) 분포에 의해 정의된 범주형 변수로 테스트되었다. 속 수준에서 Actinomyces, Capnocytophaga, Lautropia 및 Streptococcus는 최저 삼분위 대비 최고 삼분위에서 확인된 높은 위험도와 함께 구강 발암 위험 증가와 유의하게 연관되었다. 대조적으로, Fusobacterium, Haemophilus, Porphyromonas, Prevotella 및 Veillonella는 최고 삼분위 대비 최저 삼분위에서 더 높은 위험도와 유의한 음의 연관성을 보였다.
분류군수준 분류군 명칭 환자/대조군 삼분위(Tertiles)a 대조군 (n=569) 구강암(n=167) 다변수 OR(95% CI)b p-value 조정값c
속(Genus) Actinomyces 상향(up) 3 (>1.19) 190 83 1.76(1.1-2.85) 1.88E-02
2 (0.57-1.19) 189 36 0.76(0.44-1.31) 3.25E-01
1 (<0.57) 190 48 ref
연속 스케일 1.22(1.09-1.37) 8.57E-04
Capnocytophaga 상향 3 (>1.15) 190 89 2.58(1.58-4.31) 2.09E-04
2 (0.47-1.15) 189 41 1.1(0.62-1.93) 7.51E-01
1 (<0.47) 190 37 ref
연속 스케일 1.36(1.2-1.57) 4.24E-06
Granulicatella 상향 3 (>0.98) 190 77 1.29(0.8-2.1) 2.91E-01
2 (0.47-0.98) 189 44 0.87(0.52-1.46) 5.99E-01
1 (<0.47) 190 46 ref
연속 스케일 1.05(0.95-1.16) 3.13E-01
Lautropia 상향 3 (>0.70) 190 81 1.79(1.13-2.87) 1.44E-02
2 (0.18-0.70) 189 33 0.61(0.35-1.06) 8.17E-02
1 (<0.18) 190 53 ref
연속 스케일 1.14(1.06-1.24) 6.29E-04
Leptotrichia 상향 3 (>1.48) 190 74 1.17(0.73-1.88) 5.03E-01
2 (0.73-1.48) 189 37 0.6(0.35-1.02) 6.04E-02
1 (<0.73) 190 56 ref
연속 스케일 1.07(0.96-1.18) 2.15E-01
Rothia 상향 3 (>2.88) 190 64 0.8(0.49-1.28) 3.48E-01
2 (1.17-2.88) 189 44 0.67(0.41-1.11) 1.21E-01
1 (<1.167) 190 59 ref
연속 스케일 0.99(0.94-1.04) 5.98E-01
Streptococcus 상향 3 (>6.47) 190 118 3.83(2.27-6.67) 9.67E-07
2 (3.81-6.47) 189 25 1.01(0.53-1.93) 9.78E-01
1 (<3.81) 190 24 ref
연속 스케일 1.07(1.04-1.09) 1.90E-07
Alloprevotella 하향(down) 3 (>3.16) 190 36 ref
2 (1.23-3.16) 189 28 0.76(0.42-1.36) 3.53E-01
1 (<1.23) 190 103 2.39(1.48-3.93) 4.75E-04
연속 스케일 0.96(0.9-1.03) 3.01E-01
Campylobacter 하향 3 (>1.39) 190 52 ref
2 (0.68-1.39) 189 45 0.9(0.54-1.51) 7.03E-01
1 (<0.68) 190 70 1.33(0.83-2.15) 2.39E-01
연속 스케일 0.86(0.69-1.06) 1.65E-01
Fusobacterium 하향 3 (>5.84) 190 43 ref
2 (3.30-5.84) 189 47 1.27(0.75-2.18) 3.76E-01
1 (<3.30) 190 77 2.26(1.38-3.77) 1.51E-03
연속 스케일 0.92(0.86-0.97) 6.88E-03
Haemophilus 하향 3 (>13.61) 190 38 ref
2 (8.16-13.61) 189 26 0.51(0.28-0.94) 3.20E-02
1 (<8.16) 190 103 2.09(1.29-3.42) 2.96E-03
연속 스케일 0.96(0.93-0.98) 1.74E-03
Neisseria 하향 3 (>20.81) 190 55 ref
2 (9.31-20.81) 189 43 0.76(0.45-1.28) 3.06E-01
1 (<9.31) 190 69 1.17(0.73-1.88) 5.25E-01
연속 스케일 1(0.98-1.01) 6.98E-01
Porphyromonas 하향 3 (>5.73) 190 31 ref
2 (2.04-5.73) 189 43 1.58(0.89-2.84) 1.20E-01
1 (<2.04) 190 93 3.02(1.81-5.18) 3.59E-05
연속 스케일 0.93(0.88-0.98) 5.77E-03
Prevotella 하향 3 (>23.25) 190 22 ref
2 (12.58-23.25) 189 41 1.78(0.97-3.34) 6.47E-02
1 (<12.58) 190 104 4.11(2.38-7.34) 7.73E-07
연속 스케일 0.94(0.92-0.96) 8.57E-09
Veillonella 하향 3 (>15.82) 190 25 ref
2 (8.54-15.82) 189 52 2.71(1.53-4.94) 8.61E-04
1 (<8.54) 190 90 3.58(2.07-6.38) 8.08E-06
연속 스케일 0.94(0.92-0.97) 6.47E-05
종(Species) Fusobacterium nucleatum group 상향 3 (>1.84) 190 86 2(1.23-3.3) 5.73E-03
2 (0.65-1.84) 189 43 0.98(0.57-1.69) 9.47E-01
1 (<0.65) 190 38 ref
연속 스케일 1.15(1.06-1.24) 5.70E-04
Granulicatella adiacens group 상향 3 (>0.96) 190 71 1.13(0.7-1.85) 6.13E-01
2 (0.45-0.96) 189 50 1.1(0.66-1.82) 7.14E-01
1 (<0.45) 190 46 ref
연속 스케일 1.04(0.93-1.14) 5.06E-01
Lautropia mirabilis group 상향 3 (>0.70) 190 81 1.79(1.13-2.87) 1.44E-02
2 (0.18-0.70) 189 33 0.61(0.35-1.06) 8.17E-02
1 (<0.18) 190 53 ref
연속 스케일 1.14(1.06-1.24) 6.07E-04
Neisseria meningitidis group 상향 3 (>0.64) 190 92 1.89(1.19-3.05) 7.75E-03
2 (0.07-0.64) 189 30 0.66(0.37-1.16) 1.48E-01
1 (<0.07) 190 45 ref
연속 스케일 1.13(1.07-1.2) 3.98E-05
Streptococcus pneumoniae group 상향 3 (>3.35) 190 115 2.74(1.68-4.56) 7.62E-05
2 (1.75-3.35) 189 22 0.62(0.32-1.17) 1.43E-01
1 (<1.75) 190 30 ref
연속 스케일 1.11(1.07-1.16) 9.87E-08
Streptococcus sanguinis group 상향 3 (>1.79) 190 101 2.14(1.34-3.46) 1.55E-03
2 (0.85-1.79) 189 24 0.5(0.27-0.91) 2.67E-02
1 (<0.85) 190 42 ref
연속 스케일 1.11(1.04-1.18) 1.60E-03
Fusobacterium periodonticum group 하향 3 (>3.83) 190 13 ref
2 (1.60-3.83) 189 38 3.54(1.75-7.59) 6.91E-04
1 (<1.60) 190 116 9.26(4.87-18.99) 1.10E-10
연속 스케일 0.64(0.56-0.72) 2.16E-11
Haemophilus parainfluenzae group 하향 3 (>13.01) 190 35 ref
2 (7.80-13.01) 189 26 0.54(0.29-0.99) 4.85E-02
1 (<7.80) 190 106 2.27(1.4-3.77) 1.17E-03
연속 스케일 0.95(0.92-0.98) 4.62E-04
KV831974_s group 하향 3 (>1.76) 190 46 ref
2 (0.58-1.76) 189 51 1.35(0.8-2.3) 2.64E-01
1 (<0.58) 190 70 1.98(1.21-3.32) 7.64E-03
연속 스케일 0.86(0.77-0.95) 3.78E-03
Neisseria subflava group 하향 3 (>17.85) 190 36 ref
2 (7.87-17.85) 189 39 0.83(0.47-1.47) 5.27E-01
1 (<7.87) 190 92 2(1.22-3.31) 6.24E-03
연속 스케일 0.97(0.95-0.99) 4.75E-03
PAC001345_s group 하향 3 (>2.29) 190 16 ref
2 (0.65-2.29) 189 33 2.21(1.12-4.5) 2.49E-02
1 (<0.65) 190 118 6.35(3.51-12.19) 4.63E-09
연속 스케일 0.74(0.64-0.85) 4.17E-05
Porphyromonas pasteri group 하향 3 (>3.80) 190 21 ref
2 (0.92-3.80) 189 44 1.99(1.08-3.76) 2.97E-02
1 (<0.92) 190 102 4.36(2.5-7.93) 5.19E-07
연속 스케일 0.85(0.79-0.92) 5.22E-05
Prevotella histicola 하향 3 (>1.36) 190 34 ref
2 (0.15-1.36) 189 37 1.1(0.61-1.98) 7.48E-01
1 (<0.15) 190 96 3.46(2.1-5.87) 2.07E-06
연속 스케일 0.9(0.82-0.97) 1.30E-02
Prevotella melaninogenica 하향 3 (>7.30) 190 17 ref
2 (3.13-7.30) 189 33 2.2(1.13-4.45) 2.32E-02
1 (<3.13) 190 117 6.57(3.66-12.49) 1.51E-09
연속 스케일 0.83(0.78-0.88) 4.39E-09
Prevotella nanceiensis group 하향 3 (>1.67) 190 10 ref
2 (0.53-1.67) 189 37 3.72(1.77-8.48) 9.18E-04
1 (<0.53) 190 120 10.01(5.07-21.84) 4.42E-10
연속 스케일 0.59(0.47-0.73) 2.39E-06
Prevotella pallens 하향 3 (>2.23) 190 18 ref
2 (0.67-2.23) 189 44 2.33(1.25-4.49) 9.19E-03
1 (<0.67) 190 105 4.87(2.75-9.03) 1.55E-07
연속 스케일 0.68(0.57-0.78) 7.92E-07
Prevotella salivae 하향 3 (>1.33) 190 37 ref
2 (0.31-1.33) 189 55 1.61(0.95-2.74) 7.67E-02
1 (<0.31) 190 75 2.07(1.24-3.48) 5.67E-03
연속 스케일 0.82(0.69-0.96) 1.59E-02
Prevotella_uc 하향 3 (>1.51) 190 23 ref
2 (0.32-1.51) 189 53 2.32(1.31-4.24) 4.90E-03
1 (<0.32) 190 91 3.77(2.19-6.72) 3.28E-06
연속 스케일 0.75(0.63-0.86) 2.55E-04
Streptococcus salivarius group 하향 3 (>1.06) 190 44 ref
2 (0.30-1.06) 189 43 1.15(0.67-1.99) 6.07E-01
1 (<0.30) 190 80 2.04(1.26-3.38) 4.50E-03
연속 스케일 0.95(0.86-1.05) 3.15E-01
Veillonella dispar 하향 3 (>11.02) 190 30 ref
2 (3.46-11.02) 189 69 2.21(1.31-3.82) 3.57E-03
1 (<3.46) 190 68 2.08(1.23-3.61) 7.54E-03
연속 스케일 0.96(0.93-0.99) 5.30E-03
Veillonella parvula group 하향 3 (>4.28) 190 33 ref
2 (1.47-4.28) 189 51 1.57(0.92-2.71) 1.01E-01
1 (<1.47) 190 83 1.89(1.13-3.2) 1.66E-02
연속 스케일 0.93(0.87-0.99) 2.12E-02
a 각 대사산물의 삼분위는 대조군 간의 분포만을 기준으로 나누었다. b 다중 조건부 로지스틱 회귀(MCLR)는 성별, 연령, 흡연 및 음주 상태에 대해 조정되었다. c p-value는 Benjamini-Hochberg가 개발한 FDR(false discovery rate)를 사용한 Kruskal-Wallis으로 계산하였다. OR: 오즈비(odd rate), 95% CI: 신뢰 구간
종 수준에서, 상향 조절된 군에서는 Fusobacterium nucleatum, Lautropia mirabilis, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae 및 Streptococcus sanguinis이 최저 삼분위 대비 최고 삼분위에서 확인된 높은 위험도와 함께 구강암 위험 증가와 유의하게 연관되었다. 하향 조절된 군에서, Fusobacterium periodonticum, Haemophilus parainfluenzae, KV831974_s, Neisseria subflava, PAC001345_s, Porphyromonas pasteri, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella pallens, Prevotella salivae, Prevotella_uc, Veillonella dispar, Veillonella parvula는 최고 삼분위 대비 최저 삼분위에서 확인된 더 높은 위험도와 유의한 음의 연관성을 보였다.
(2) 기능적 불균형 및 네트워크 분석
736명의 참가자의 모든 샘플로부터, PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States) 내장 참조 데이터베이스를 사용하여 총 446개의 KEGG 경로를 규명하였으며, 그 다음 LEfSe 분석을 수행하여 구강암 미생물총의 기능적 변화를 연구하였다. 그 결과, 9개의 KEGG 경로가 그룹 간에 유의하게 차이가 있는 것으로 규명되었다(도 3A). 5개 경로(지질다당류 생합성, 포르피린 및 엽록소 대사, 대사 경로, 2차 대사산물의 생합성, 리보솜)는 대조군에서 활성화된(enriched) 반면, 4개 경로(쿼럼 센싱, ABC 수송체, Two_component 시스템, 포스포트랜스퍼라제 시스템_PTS)는 구강암 환자에서 활성화되었다.
도 3B에 나타난 바와 같이, 속 수준에서 2개의 공동-풍부도 그룹이 있다(그룹 1은 Actinomyces와 Streptococus을 포함하는 반면, 그룹 2는 Prevotella와 Porphyromonas를 포함). 약한 상관 관계(|r|<0.4)를 제외한 엄격한(stringent) 네트워크도 이러한 연관성 경향을 나타낸다(도 3C). 종 수준에서 Prevotella spp. 은 서로 강하게 양의 상관관계가 있는 반면, Porphyromonas pasteri는 다른 문(phylum)의 종(species)과 강한 상관 관계가 있다(도 3D 및 3E).
실시예 3. 유전체 분석을 기반으로 한 바이오마커 규명
3.1. 바이오마커 규명을 위한 모델 구축
구강암에 대한 바이오마커를 발굴하기 위해, 전체 피험자의 5% 이상에서 1개 이상의 서열을 갖는 속 및 종에 대해 다단계 특징 선별을 수행하였다.
구체적으로는 특징을 줄이기 위해 각각 R 패키지 'glmnet'과 'random forest'를 사용하는, LASSO(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) 및 랜던 포레스트(RF)의 2단계로 구성된 기계-학습 접근법을 채택한 모델을 수행하였다.
첫째, LASSO는 람다 매개변수를 조정하여 관련 분류군(taxa)을 효율적으로 선택하여 모델 정확도와 해석 가능성을 향상시키고 그 후, 최종 모델을 생성하기 위해 LASSO 알고리즘에 의해 선택된 중요 분류군의 부분집합(subset)에 RF를 적용하였다. 모델 성능에 대한 편향되지 않은 추정치를 얻기 위해 5배(five-fold) 교차 검증(CV)을 통해 과적합(over-fitting) 편향을 방지했다. 5배 CV의 각 반복 내에서, 데이터 세트를 무작위로 5개 부분으로 나누고 4개 부분을 트레이닝 세트로 결합하여 예측 모델을 생성하고, 나머지 1개 부분은 모델 성능을 검증하기 위한 테스트 세트로 사용했다. LASSO에서는, 최소값의 1 표준 오차보다 작은 λ를 갖는 모델을 사용하여 특징 수를 줄였다. RF에서는, 모델에 의해 정의된 기본 임계값을 사용하여 40에서 400까지의 시퀀스로 모델을 훈련하여 낙관적인(optimistic) 수의 트리가 선택되었다. 그 후 평균 감소 정확도 모델을 기반으로 분류군을 선택하였다.
3.2. 구강암 진단 바이오마커 규명 및 검증
구강암에 대한 속- 및 종-기반의 바이오마커를 규명하기 위해, LASSO(the least absolute shrinkage and selection operator) 특징 선별, 이어서 랜덤 포레스트(RF)의 2단계 절차로 구성된 디스커퍼리 세트에 대한 기계 학습 모델을 사용하였다. 이 과정에서 LEfSe 분석을 위한 동일한 데이터 세트가 입력되어 사용되었으며, 10배 교차 검증(CV)이 LASSO 및 RF 모두에 적용되었다. 속 수준에서, 기계 학습을 통해 18개의 속을 최적의 속(genus) 패널로 선택했다(표 4). 디스커버리 세트에서(106명의 환자; 381명의 대조군), 질병 확률(POD) 지수는 건강한 대조군 대비 암 환자에서 유의하게 더 높았고(도 4A) 이러한 POD 지수는 0.92의 AUC(area under the curve) 값을 달성했다(민감도 0.67; 특이도 0.97)(도 4B). 유사하게 검증 세트(61명의 환자; 188명의 대조군)에서, POD도 0.92(민감도 0.80; 특이도 0.98)의 AUC 값을 달성한 환자군(도 4C)에서 유의하게 더 높았다(도 4D). 이러한 속 바이오마커 패널의 진단 가능성을 추가로 확인하기 위해, 전체 데이터 세트에 대해 POD 지수 및 AUC도 계산하였다(167명의 환자; 569명의 대조군). POD 지수는 0.93의 AUC 값을 갖는 구강암군에서 유의하게 더 높았다(민감도 0.70; 특이도 0.96)(도 4E 및 4F). 동시에, AUC 값은 단일 속에 대해서도 계산되었다. 18개 속 중에서 0.7 이상의 높은 AUC 값을 보이는 Prevotella와 Streptococus는 특히 구강암의 잠재적 단일 바이오마커일 수 있다(표 4). 종 수준에서, 16종이 최적의 바이오마커 세트로 선택되었다(표 4). POD 지수는 모든 데이터 세트에서 구강암 그룹에서 유의하게 더 높았다(도 5A 내지 5C). AUC 값은 디스커버리, 검증 및 총 세트에 대해 각각 0.92(민감도 0.66; 특이도 0.96), 0.93(민감도 0.77; 특이도 0.98) 및 0.93(민감도 0.70; 특이도 0.97)이었다(도 5D 내지 5F). 16종 중 6종이(AF385567_s, Fusobacterium periodonticum, Prevotella melaninogenica, Prevotella pallens, Streptococcus constellatus, Streptococcus pneumoniae) 구강암에 대한 잠재적인 단일 마커일 수도 있다(AUC >= 0.7)(표 4). 모든 분석에서 5속(Actinomyces, Capnocytophaga, Porphyromonas, Prevotella, Streptococcus) 및 4종(Fusobacterium periodonticum group, Prevotella melaninogenica, Prevotella pallens, Streptococcus pneumoniae group)은 모든 분석에서 일관되게 반복되었음을 알 수 있다.
분류군 수준 분류군 명칭 풍부도 중앙값 배수 차이(FC) AUC
환자 대조군 환자/대조군 p-value 조정값 a 발견 세트 검증 세트 전체 세트
속(Genus) Abiotrophia 0.00 0.00 2.45 8.52E-07 0.61 0.64 0.62
Actinomyces 1.18 0.82 1.43 1.16E-02 0.57 0.59 0.57
Alloscardovia 0.00 0.00 NA 6.76E-08 0.66 0.51 0.61
Capnocytophaga 1.26 0.73 1.72 8.52E-07 0.56 0.75 0.63
Dialister 0.18 0.08 2.11 1.43E-08 0.61 0.70 0.65
Howardella 0.00 0.00 NA 3.11E-23 0.66 0.76 0.69
Leuconostoc 0.00 0.00 NA 1.23E-25 0.64 0.67 0.65
Mannheimia 0.01 0.02 0.80 9.63E-01 0.48 0.53 0.50
Mogibacterium 0.05 0.03 1.55 5.48E-06 0.59 0.66 0.61
Olsenella 0.00 0.00 NA 5.55E-09 0.64 0.63 0.63
Paraburkholderia 0.00 0.00 NA 6.56E-25 0.58 0.87 0.69
Parvimonas 0.25 0.07 3.49 6.46E-11 0.65 0.71 0.67
Pasteurellaceae_uc 0.08 0.17 0.49 1.96E-02 0.43 0.44 0.44
Porphyromonas 1.77 3.55 0.50 8.52E-07 0.68 0.53 0.62
Prevotella 9.92 16.95 0.59 3.22E-14 0.66 0.77 0.70
Saccharimonas 0.05 0.10 0.48 1.26E-06 0.70 0.50 0.38
Sphingomonas 0.00 0.00 NA 1.09E-22 0.61 0.84 0.69
Streptococcus 9.77 4.94 1.98 1.52E-17 0.70 0.76 0.72
종 (Species) AF385567_s 0.00 0.00 NA 3.54E-23 0.66 0.76 0.70
Actinomyces odontolyticus group 0.57 0.49 1.15 6.17E-01 0.51 0.52 0.51
Alloprevotella tannerae 0.10 0.09 1.13 2.02E-01 0.57 0.46 0.54
Capnocytophaga sputigena group 0.20 0.07 2.69 5.52E-07 0.57 0.73 0.63
Dialister pneumosintes 0.06 0.02 3.69 4.35E-11 0.63 0.75 0.67
Fusobacterium periodonticum group 0.82 2.68 0.31 4.93E-22 0.75 0.74 0.75
Lactobacillus iners 0.00 0.00 NA 9.14E-09 0.58 0.52 0.56
Lactobacillus sakei group 0.00 0.00 NA 4.89E-20 0.63 0.64 0.64
Leuconostoc gelidum group 0.00 0.00 NA 7.38E-22 0.61 0.57 0.59
Neisseria elongata group 0.18 0.18 1.04 7.53E-01 0.49 0.54 0.51
Paraburkholderia graminis group 0.00 0.00 NA 3.11E-31 0.57 0.86 0.68
Prevotella baroniae 0.02 0.01 2.45 2.02E-02 0.57 0.56 0.56
Prevotella melaninogenica 1.70 5.13 0.33 7.38E-22 0.75 0.77 0.74
Prevotella pallens 0.29 1.37 0.21 4.70E-15 0.69 0.71 0.70
Streptococcus constellatus group 0.09 0.03 3.33 1.53E-16 0.68 0.77 0.71
Streptococcus pneumoniae group 5.07 2.40 2.11 3.49E-17 0.69 0.80 0.72
실시예 4. 조기(early stage) 구강암에서의 진단 효과 확인
구강암 진단에 잠재적인 단일 마커로 사료되는 구강 마이크로바이옴(microbiome)과 구강암 환자와 대조군 사이에서 유의미한 발현 차이를 나타내는 2개의 ortholog 를 대상으로 초기 단계의 구강암 조기 진단에 대한 분석을 수행하였다. 데이터는 log2 정규화(normalization) 후 분석을 진행하였다.
4.1. 구강 마이크로바이옴(microbiome)
구강암 진단에 유의한 구강 마이크로바이옴, 즉, Howardella 속, Paraburkholderia 속, Porphyromonas 속, Capnocytophaga 속 및 Sphingomonas 속 균주의 구강암 조기 진단에서의 분석을 수행하였다. 구강암의 병기는 원발암의 크기(T)에 따라 단계 1 내지 4로 나뉘었으며 단계 1, 2는 조기 단계 (early stage) 구강암, 단계 3, 4는 후기 단계 (late stage) 구강암으로 구분했다.
그 결과, Howardella 속 균주의 경우, 단계 2에 비해 단계 4에서 상대적으로 높았다 (p<0.001). 하지만 단계 1과 이외의 단계들 사이에서 유의한 발현 차이는 나타내지 않았다 (도 6A).
Paraburkholderia 속 균주의 경우, 대조군과 단계에 따라 그룹을 나눈 구강암 환자 사이에서 단계 3을 제외하고 유의한 발현의 차이를 나타내었다. 또한, Paraburkholderia 발현 수준은 단계 3에 비해 단계 2에서 상대적으로 높았으며 (p<0.01), 각각 단계 1과 단계 2, 단계 3과 단계 4 사이에서도 유의한 발현 차이를 나타내었다 (도 6B).
Porphyromonas 속 균주의 경우, 대조군과 단계에 따라 그룹을 나눈 구강암 환자 사이에서 단계 3을 제외하고 유의한 발현의 차이를 나타내었다. 또한, 발현 수준이 단계 3에 비해 단계 1에서 상대적으로 높았다 (p<0.01) (도 6C).
Capnocytophaga 속 균주의 경우, 대조군과 단계에 따라 그룹을 나눈 구강암 환자 사이에서 대조군에 비해 단계 2에서 상대적으로 높은 발현 비율을 나타내었다 (p<0.01). 또한, 단계 1에 비해 단계 3에서 상대적으로 낮은 발현을 나타내었다 (p<0.01) (도 6D).
Sphingomonas 속 균주의 경우, 대조군과 단계에 따라 그룹을 나눈 구강암 환자 사이에서 유의한 발현의 차이를 나타내었다. 또한 Sphingomonas의 발현 수준의 단계 4에서 단계 2에 비해 상대적으로 낮음을 나타내었으며 (p<0.001), 이는 Sphingomonas 이 초기 단계의 구강암 진단에 유효함을 뒷받침할 수 있다 (도 6E).
또한, 상기 언급된 5개의 구강 마이크로바이옴의 조기 구강암 진단 바이오마커로서의 성능을 평가하기 위해, ROC(receiver operating characteristics) 곡선 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 5개의 구강 마이크로바이옴은 후기 구강암에 대해서는 AUC가 0.794인 것에 비해 초기 단계의 구강암에 대한 AUC는 0.834로, 특히 초기 단계의 구강암의 진단에서 더 높은 성능을 나타냄을 확인하였다.
4.2. Orthology
Ortholog는 같은 조상으로부터 본래의 기능을 간직한 채 종 분화를 통해 진화한 유전자를 말하며 임의의 한 종에서 어떤 기능을 가진 유전자에 대해서 다른 종에서도 동일한 기능을 가진다.
조기 구강암 진단을 위한 Orthology 기반의 바이오마커 규명하기 위해, 구강암 환자와 건강한 대조군 사이에서 유의한 차이를 나타내는 Ortholog의 구강암 조기단계와 후기 단계에서의 분석을 수행하였다. 구체적으로, 대조군과 구강암 단계에 따른 단계 1 내지 단계 4 그룹을 나눈 구강암 환자 사이에서 발현의 차이를 확인하였다.
그 결과, 2개 Ortholog 중 아실-CoA 탈수소 효소는 대조군에 비해 단계 1 및 2에서 발현 수준이 높은 것을 확인하였고, 디하이드로폴레이트 환원효소는 단계 1 내지 4에서 모두 유의미한 차이를 확인하였으며, 특히 대조군에 비해 단계 1 및 단계 2에서 발현 수준이 낮은 것을 확인하였다. 또한, 디하이드로폴레이트 환원효소의 수준은 단계 3에 비해 단계 2에서 유의하게 낮았다 (p<0.001). 따라서, (아실-CoA 탈수소 효소(K06445), 디하이드로폴레이트 환원효소(K18590))는 초기 단계 구강암과 후기 단계의 구강암을 구분할 수 있는 바이오마커로써의 잠재력이 있음을 확인할 수 있었다 (도 8).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (24)

  1. 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Phorphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물을 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    그래눌리카텔라(Granulicatella) 속, 라우트로피아(Lautropia) 속, 알로프레보텔라(Alloprevotella) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속, 헤모필루스(Haemophilus) 속, 베일로넬라(Veillonella) 속, 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 종, 그래눌리카텔라 아디아센스(Granulicatella adiacens) 종, 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae) 종, KV831974_s 종, 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 종, 나이세리아 메닌지티디스(Nisseria meningitidis) 종, 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava) 종, PAC001345_s 종, 포르피로모나스 파스테리(Porphyromonas pasteri) 종, 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 종, 프레보텔라 낸시엔시스(Prevotella nanceiensis) 종, 프레보텔라 살리베(Prevotella salivae) 종, 프레보텔라_uc(Prevotella_uc) 종, 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 종, 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguinis) 종, 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 종 및 베일로넬라 파불라(Veillonella parvula) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물을 추가로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    다이얼리스터(Dialister) 속, 모기박테리움(Mogibacterium) 속, 파르비모나스(Parvimonas) 속, 만헤이미아(Mannheimia) 속, 파스퇴렐라세아_uc(Pasteurellaceae_uc) 속, 사카리모나스(Saccharimonas) 속, 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스(Actinomyces odontolyticus) 종, 알로프레보텔라 탄네라(Alloprevotella tannerae) 종, 카프노사이토파가 스푸티제나(Capnocytophaga sputigena) 종, 다이얼리스터 뉴모신트(Dialister pneumosintes) 종, 나이세리아 일롱게이트(Neisseria elongate) 종, 프레보텔라 바로니아(Prevotella baroniae) 종 및 스트렙토코커스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus) 종 중 적어도 하나의 미생물을 추가로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속 및 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 중 적어도 어느 하나의 미생물을 추가로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속 및 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 중 적어도 어느 하나의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물로서,
    상기 구강암은 조기 단계의 구강암인, 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커 조성물에 아실-CoA 탈수소 효소 및 디하이드로폴레이트 환원 효소 중 적어도 어느 하나를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 제제을 추가로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물로서,
    상기 구강암은 조기 단계의 구강암인, 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  8. 제1항의 구강암 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 키트는 생물학적 시료에 포함된 미생물 풍부도를 기반으로 구강암을 진단하는 구강암 진단용 키트.
  10. (a)생물학적 시료로부터 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
    (b)상기 (a)단계에서 분석된 미생물 풍부도와 대조군 시료에서 미생물의 풍부도를 비교하는 단계;를 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 타액인, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하여 미생물의 풍부도를 확인하는 것인, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 (a)단계에서, 시료 내 그래눌리카텔라(Granulicatella) 속, 라우트로피아(Lautropia) 속, 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 종, 그래눌리카텔라 아디아센스(Granulicatella adiacens) 종, 알로프레보텔라(Alloprevotella) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속, 헤모필루스(Haemophilus) 속, 베일로넬라(Veillonella) 속, 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae) 종, KV831974_s 종, 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 종, 나이세리아 메닌지티디스(Nisseria meningitidis) 종, 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava) 종, PAC001345_s 종, 포르피로모나스 파스테리(Porphyromonas pasteri) 종, 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 종, 프레보텔라 낸시엔시스(Prevotella nanceiensis) 종, 프레보텔라 살리베(Prevotella salivae) 종, 프레보텔라_uc(Prevotella_uc) 종, 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 종, 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguinis) 종, 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 종 및 베일로넬라 파불라(Veillonella parvula) 종 중 적어도 하나의 추가적인 미생물의 풍부도를 분석하는 단계를 더 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 (a)단계에서, 시료 내 다이얼리스터(Dialister) 속, 모기박테리움(Mogibacterium) 속, 파르비모나스(Parvimonas) 속, 악티노마이세스 오돈톨리티쿠스(Actinomyces odontolyticus) 종, 알로프레보텔라 탄네라(Alloprevotella tannerae) 종, 카프노사이토파가 스푸티제나(Capnocytophaga sputigena) 종, 다이얼리스터 뉴모신트(Dialister pneumosintes) 종, 나이세리아 일롱게이트(Neisseria elongate) 종, 프레보텔라 바로니아(Prevotella baroniae) 종 및 스트렙토코커스 콘스텔라투스(Streptococcus constellatus) 종, 만헤이미아(Mannheimia) 속, 파스퇴렐라세아_uc(Pasteurellaceae_uc) 속 및 사카리모나스(Saccharimonas) 속 중 적어도 하나의 추가적인 미생물의 풍부도를 분석하는 단계를 더 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 (a)단계에서, 시료 내 하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속 및 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 중 적어도 하나의 추가적인 미생물의 풍부도를 분석하는 단계를 더 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 시료 내 하워드델라(Howardella) 속, 파라부르크홀데리아(Paraburkholderia) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속 및 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 중 적어도 하나의 미생물의 풍부도를 분석하는 단계는, 조기 단계의 구강암을 진단하기 위한 것인, 구강암 진단을 위한 정보제공방법.
  17. 제10항에 있어서,
    상기 (a)단계에서, 아실-CoA 탈수소 효소 및 디하이드로폴레이트 환원 효소 중 어느 하나 이상을 암호화하는 유전자의 발현수준을 확인하는 단계를 더 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공방법으로서,
    상기 구강암은 조기 단계의 구강암인, 정보제공방법.
  18. (a)구강암의 치료, 개선 또는 예방을 위한 후보 약물을 처리하기 전 대상으로부터 수득한 생물학적 시료에서 악티노미세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계;
    (b) 상기 후보 약물을 처리 후 대상으로부터 수득한 생물학적 시료에서 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
    (c)상기 (a)단계에서 분석된 미생물 풍부도와 (b)단계에서 분석된 미생물의 풍부도를 비교함으로써, 후보 약물을 스크리닝 하는 단계;를 포함하는, 구강암 치료, 개선 또는 예방을 위한 후보 약물의 선정 방법.
  19. (a)구강암 환자로부터 수득한 생물학적 시료에서 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계;
    (b) 구강암 치료 후 환자로부터 수득한 생물학적 시료에서 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
    (c)상기 (a)단계에서 분석된 미생물 풍부도와 (b)단계에서 분석된 미생물의 풍부도를 비교함으로써, 치료 반응을 예측, 또는 모니터링 하는 단계;를 포함하는, 구강암 치료 반응 예측 또는 모니터링 방법.
  20. 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종, 알로프레보텔라(Alloprevotella) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속, 헤모필루스(Haemophilus) 속, 베일로넬라(Veillonella) 속, 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae) 종, KV831974_s 종, 라우트로피아 미라빌리스(Lautropia mirabilis) 종, 나이세리아 메닌지티디스(Nisseria meningitidis) 종, 나이세리아 서브플라바(Neisseria subflava) 종, PAC001345_s 종, 포르피로모나스 파스테리(Porphyromonas pasteri) 종, 프레보텔라 히스티콜라(Prevotella histicola) 종, 프레보텔라 낸시엔시스(Prevotella nanceiensis) 종, 프레보텔라 살리베(Prevotella salivae) 종, 프레보텔라_uc(Prevotella_uc) 종, 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 종, 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 종, 베일로넬라 파불라(Veillonella parvula) 종, 만헤이미아(Mannheimia) 속, 파스퇴렐라세아_uc(Pasteurellaceae_uc) 속 및 사카리모나스(Saccharimonas) 속 중 적어도 하나의 미생물을 포함하는 구강암 치료, 개선, 또는 예방을 위한 프로바이오틱스 조성물.
  21. (a)생물학적 시료로부터 악티노마이세스(Actinomyces) 속, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 속, 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 프레보텔라(Prevotella) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 푸소박테리움 페리오돈티쿰(Fusobacterium periodonticum) 종, 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica) 종, 프레보텔라 팔렌스(Prevotella pallens) 종 및 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 종 중 적어도 어느 하나의 미생물의 풍부도(abundance)를 분석하는 단계; 및
    (b)상기 (a)단계에서 분석된 미생물 풍부도와 대조군 시료에서 미생물의 풍부도를 비교하는 단계;를 포함하는, 구강암을 진단하기 위한 방법.
  22. 구강암을 진단하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  23. 제20항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구강암 치료, 개선, 또는 예방 방법.
  24. 구강암의 치료, 개선 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 제20항에 따른 조성물의 용도.
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