WO2024080414A1 - 대식세포 분화 및 분포에 따른 면역세포 치료제의 치료 반응성 예측 방법 - Google Patents

대식세포 분화 및 분포에 따른 면역세포 치료제의 치료 반응성 예측 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting a cancer patient's responsiveness to an immune cell therapeutic agent by measuring the expression levels of CD68, CD163, and CD14 genes around cancer tissue.
  • Immune anticancer drugs are anticancer drugs that have a mechanism to kill cancer cells by activating suppressed immune cells of the body. They are third generation anticancer drugs that improve the side effects of chemical anticancer drugs, which are first generation anticancer drugs, and the resistance of targeted anticancer drugs, which are second generation anticancer drugs.
  • Anti-cancer immunotherapy that shows innovative clinical effects in various cancers is an immune cell therapy (immune checkpoint inhibitor). Immune cell therapy is a combination of PD-L1 expressed as an immune evasion mechanism in cancer cells or cells surrounding the tumor and PD-1 expressed in T cells. Induces T cell activation by inhibiting binding.
  • the present inventor confirmed that the reactivity of an immune cell therapeutic agent can be predicted based on the ratio of specific macrophages based on the differentiation and distribution of macrophages existing around cancer tissue and completed the present invention.
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to measure the expression levels of CD68, CD163, and CD14 genes from biological samples obtained from cancer patients and provide a method for predicting the responsiveness of cancer patients to immune cell therapy based on the expression levels of the genes. It is done.
  • the present invention includes the steps of measuring the expression levels of CD68, CD163, and CD14 genes from biological samples obtained from cancer patients; and b) predicting therapeutic responsiveness to an immune cell therapeutic agent based on the measured expression level of the gene.
  • step b) may be characterized by predicting treatment responsiveness to an immune cell therapeutic agent by counting the number of cells expressing the gene and calculating the ratio of macrophages expressed by the formula below,
  • Percentage of M1 macrophages (number of M1 macrophages) / (number of all cells),
  • Percentage of M2 macrophages (number of M2 macrophages) / (number of all cells),
  • the patient may be determined to have high responsiveness to the immune cell therapeutic agent, and the set The cut-off value may be characterized as 0.59.
  • the expression level of the gene may be the expression level of the mRNA of the gene or the expression level of the protein encoded by the gene. Measuring the mRNA expression level of the gene is performed using RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), and Northern It may be selected from the group consisting of Northern blotting and DNA chip, but is not limited thereto.
  • the expression level of the protein encoded by the gene can be measured using Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmunoassay), radioimmunodiffusion, and Ouchterlony immunoassay.
  • Diffusion method rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)), and protein chip. It may be selected from the group consisting of, but is not limited to.
  • the present invention provides a composition for predicting the responsiveness of an immune cell therapeutic agent in cancer patients, including an agent capable of measuring the expression levels of CD68, CD163, and CD14 genes, and measuring the expression levels of the genes.
  • the agent may be characterized as being at least one selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, primer pairs, and probes that specifically bind to the mRNA of the gene.
  • the agent capable of measuring the expression level of the gene may be characterized as being at least one selected from the group consisting of antibodies, ligands, and aptamers that specifically bind to the protein encoded by the gene.
  • the present invention provides a kit for predicting the responsiveness of an immune cell therapeutic agent for cancer patients containing the composition.
  • the present invention it is possible to predict a patient's therapeutic responsiveness to an immune cell therapeutic agent through the degree of macrophage differentiation and distribution around the cancer tissue, making it possible to perform appropriate treatment for the patient group predicted to show a therapeutic effect of the immune cell therapeutic agent. there is.
  • Figure 1 shows the process of the present invention (antibody preparation-staining-imaging-analysis).
  • Figure 2 compares the distribution of macrophages around cancer tissue in a responder group of patients with good responsiveness to immune cell therapeutics (Responder) and a non-responder group of patients with poor responsiveness.
  • Figure 3 confirms the ROC curve of reactivity prediction.
  • Figures 4 and 5 show images confirming the distribution of macrophages around cancer tissue in the responder group ( Figure 4) and the non-response group ( Figure 5) to the immune cell therapeutic agent.
  • the present invention measures the expression level of CD68, CD163, and CD14 genes to determine the level of expression of genes present around cancer tissue. It is characterized by predicting responsiveness to immune cell therapeutic agents by analyzing the degree of differentiation and distribution of macrophages. Furthermore, the present invention calculates the ratio of macrophages by counting the number of M1 macrophages CD68 + /CD163 - and CD68 + /CD14 + and the number of M2 macrophages CD163 + /CD68 - and sets a cut off value. The calculation made it possible to more accurately predict the patient's responsiveness to immune cell therapy.
  • the term “immune anticancer agent” refers to an anticancer agent that kills cancer cells by activating the body's immune cells, and may refer to a drug that exhibits a cancer treatment effect by strengthening the patient's own immunity.
  • the immuno-anticancer agent may be an immune cell therapy.
  • the term “immune checkpoint inhibitor” refers to T cells by blocking the activation of immune checkpoint proteins involved in T cell suppression, such as PD-L1 expressed in tumor cells. It may refer to an immune anti-cancer drug that activates and attacks cancer cells.
  • the immune cell therapy includes NK cell therapy, T cell therapy, CAR-immune cell therapy, DC vaccine, CTL therapy, anti-PD-L1, anti-PD-1, and anti-CTLA-4. It may be any one or more selected from the group consisting of.
  • the immune cell therapeutic agent may inhibit the binding between PD-L1 and PD-1.
  • cancer or tumor refers to a problem in the normal division, differentiation, and death control function of cells, which causes abnormal hyperproliferation, infiltrates surrounding tissues and organs, forms a lump, and destroys existing structures. It means the state of destroying or transforming.
  • the cancer is non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, melanoma, Hodgkin's lymphoma, stomach cancer, urothelial cancer, head and neck cancer, liver cancer, colon cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer, It may be any one selected from the group consisting of endometrial cancer, cervical cancer, bladder cancer, brain cancer, breast cancer, and kidney cancer. In the present invention, samples from patients with advanced gastric cancer were targeted, but the method is not limited thereto.
  • expression level generally refers to the amount of a biomarker in a biological sample. “Expression” may refer to transcription into a polynucleotide, translation into a polypeptide, or even polynucleotide and/or polypeptide modification (e.g., post-translational modification of a polypeptide). “Expressed genes” include those that are transcribed as mRNA into polynucleotides and then translated into polypeptides, as well as those that are transcribed into RNA but not translated into polypeptides (e.g., tRNA and rRNA).
  • the present invention consists of antibody preparation, tissue staining, imaging and analysis processes according to the sequence shown in Figure 1.
  • the expression level of CD68, CD163, and CD14 present around the tissues of cancer patients was measured, and the number of CD68 + /CD163 - , CD68 + /CD14 + and CD163 + / CD68 - macrophages was counted to calculate the ratio of macrophages.
  • Methods for measuring, imaging, and analyzing gene expression levels can be used without limitation as long as they are widely used in the art to achieve the purpose of the present invention.
  • Figures 4 and 5 the degree of macrophage distribution in the response group and non-response group to the immune cell therapy was confirmed.
  • Surgical tissue without any treatment Baseline
  • surgical tissue after one round of chemotherapy before immune cell therapy were stained using an antibody that specifically binds to a protein that can label immune cells.
  • Figure 4 is a representative example of a patient response group that is highly responsive to immune cell therapy. It was confirmed that the expression level of CD68 was increased at baseline and the expression level of CD163 was relatively low. In addition, it was confirmed that the expression level of CD68 was noticeably higher than that of CD163 in tissue after one round of chemotherapy (Treatment On).
  • Figure 5 is a representative example of a non-responsive group of patients with poor response to immune cell therapy. Unlike Figure 4, it was confirmed that the expression level of CD163 was very high compared to the expression level of CD68. This confirmed that M1 macrophages, i.e., CD68 + /CD163 - and CD68 + /CD14 + cells, were expressed very highly in the responder group, and M2 macrophages, i.e., CD163 + /CD68 - cells, were significantly higher compared to M1 macrophages in the non-response group. This means that it is relatively widely distributed.
  • M1 macrophages i.e., CD68 + /CD163 - and CD68 + /CD14 + cells
  • M2 macrophages i.e., CD163 + /CD68 - cells
  • the total volume of antibodies at a specific concentration was calculated and brought to the final volume of 0.5% BSA in Maxpar PBS.
  • Slides were placed in a hydration chamber and the antibody master mix was pipetted onto the sections and incubated overnight with the antibody cocktail at 4°C in the hydration chamber. The slide was washed with 0.2% Triton X-100 in Maxpar PBS for 8 minutes with gentle agitation in a Coplin bottle. Slides were washed repeatedly in Maxpar PBS for 8 minutes with gentle agitation.
  • tissues were stained (DNA staining) with Intercalator-Ir in Maxpar PBS (300-500 ⁇ L/section for 20 mm 2 sections in 1:400 solution) for 30 min in a hydration chamber at room temperature and in Maxpar Water with gentle agitation. Slides were washed for 5 minutes. The slides were then air dried at room temperature for at least 20 minutes.
  • Protein markers were scanned using the Hyperion Imaging System (Standard Bio Tool, Inc.), and images were analyzed with MCD Viewer.
  • Pankeratin-positive cells PanCK + and DNA +
  • Pankeratin-negative cells Pankeratin-negative cells
  • Percentage of M1 macrophages (Number of M1 macrophages) / (Number of all cells)
  • Percentage of M2 macrophages (Number of M2 macrophages) / (Number of all cells)
  • the ratio of M1 macrophages and M2 macrophages was calculated using the formula below.
  • the present invention relates to a method for predicting the responsiveness of cancer patients to immune cell therapy by measuring the expression levels of CD68, CD163, and CD14 genes around cancer tissue. It is useful because it is possible to predict a patient's treatment responsiveness to a therapeutic agent, allowing appropriate treatment to be performed on patient groups predicted to show therapeutic effects from immune cell therapy.

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Abstract

본 발명은 암 조직 주변의 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정하여 면역세포 치료제에 대한 암 환자의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 암 조직 주변의 마크로파지 분화 및 분포 정도를 통해 면역세포 치료제에 대한 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있어, 면역세포 치료제의 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군에 대해 적합한 치료를 수행할 수 있다.

Description

대식세포 분화 및 분포에 따른 면역세포 치료제의 치료 반응성 예측 방법
본 발명은 암 조직 주변의 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정하여 면역세포 치료제에 대한 암 환자의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
면역 항암제는 억제되어 있던 인체의 면역세포를 활성화시켜서 암세포를 사멸시키는 기전을 갖는 항암제로, 1세대 항암제인 화학 항암제의 부작용과 2 세대 항암제인 표적 항암제의 내성을 개선한 3세대 항암제이다. 여러 암에서 혁신적인 임상 효과를 보이는 면역 항암제는 면역 세포 치료제(immune checkpoint inhibitor)로, 면역 세포 치료제는 암세포나 종양 주위 세포에서 면역 회피 기작으로 발현하는 PD-L1과 T세포에서 발현하는 PD-1의 결합을 억제함으로써 T세포의 활성화를 유도한다. 현재 면역 세포 치료제는 뇌종양을 비롯하여, 악성흑색종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 난소암 등 10개 이상의 암종에서 활발히 개발이 되고 임상 연구가 진행이 되고 있는 상태로, 면역 세포 치료제에 대한 치료 반응을 예측하기 위한 바이오마커의 개발은 소모적인 의료비 지출을 막고 면역 항암제의 올바른 사용을 위해 절실히 요구된다.
하지만 종래에는 면역세포 치료제에 대한 반응성을 예측하기 위해 단일 면역세포의 발현량을 확인하여 반응성 예측에 사용되고 그 예측의 정확성도 크지 않은 한계가 있었다.
이에 본 발명자는 암 조직 주변에 존재하는 대식세포의 분화와 분포를 토대로 특정 대식세포들의 비율에 근거하여 면역세포 치료제의 반응성을 예측할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 유전자의 발현 수준을 토대로 암 환자의 면역세포 치료제에 대한 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 측정된 유전자의 발현 수준을 토대로 면역세포 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 단계;를 포함하는 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 상기 유전자가 발현된 세포의 수를 카운팅하여 아래 식으로 표현되는 대식세포의 비율을 계산하여 면역세포 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 것을 특징으로 할 수 있고,
대식세포의 비율 =
(M1 대식세포의 백분율) / {(M1 대식세포의 백분율) + (M2 대식세포의 백분율)}
여기서,
M1 대식세포의 백분율 = (M1 대식세포의 수) / (모든 세포의 수)이고,
M2 대식세포의 백분율 = (M2 대식세포의 수) / (모든 세포의 수)이며,
M1 대식세포의 수 = (CD68+/CD163-) + (CD68+/CD14+) 이고,
M2 대식세포의 수 = (CD163+/CD68-) 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 대식세포의 비율이 ROC 곡선 분석에 의해 설정된 컷 오프(cut off) 값 보다 높은 경우 상기 환자는 면역세포 치료제에 대한 반응성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 설정된 컷 오프 값은 0.59인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA:Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 실시예에서 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 리간드 및 앱타머로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 실시예에서 상기 조성물을 포함하는 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면 암 조직 주변의 대식세포 분화 및 분포 정도를 통해 면역세포 치료제에 대한 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있어, 면역세포 치료제의 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군에 대해 적합한 치료를 수행할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 과정(항체준비-염색-이미징-분석)을 나타낸 것이다.
도 2는 면역세포 치료제에 대한 반응성이 좋은 환자 반응군(Responder)과 반응성이 좋지 않은 환자 무반응군(Non-responder)의 암 조직 주변 대식세포의 분포 정도를 비교한 것이다.
도 3은 반응성 예측의 ROC 곡선을 확인한 것이다.
도 4 및 5는 면역세포 치료제에 대한 반응군(도 4)과 무반응군(도 5)의 암 조직 주변 대식세포의 분포 정도를 이미지로 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 어떤 구성요소를 '포함' 한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
종래에는 면역관문억제제 치료제에 대한 반응성을 예측하기 위해 단일 면역세포의 발현량을 확인하여 치료의 방향성을 제시해 온 반면, 본 발명은 CD68, CD163 및 CD14 유전자 발현량을 측정하여 암 조직 주변에 존재하는 마크로파지의 분화 및 분포 정도를 분석함으로써 면역세포 치료제에 대한 반응성을 예측하는 것을 특징으로 한다. 나아가, 본 발명은 M1 대식세포의 수 CD68+/CD163- 및 CD68+/CD14+ 와 M2 대식세포의 수 CD163+/CD68- 를 카운팅하여 대식세포의 비율을 계산하고컷 오프(cut off) 값을 계산하여 면역세포 치료제에 대한 환자의 반응성을 더욱 정확하게 예측할 수 있게 하였다.
본 명세서에서 용어 “면역 항암제”는 인체의 면역세포를 활성화시켜서 암세포를 사멸시키는 항암제로, 환자 스스로의 면역 강화를 통해 암의 치료효과를 나타내는 약제를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 항암제는 면역 세포 치료제일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “면역 세포 치료제(immune checkpoint inhibitor)”는 T 세포 억제에 관여하는 면역 관문 단백질(immune checkpoint protein) 예컨대, 종양세포에서 발현되는 PD-L1과 같은 단백질의 활성화를 차단함으로써 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 면역 항암제를 의미할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 세포 치료제는 NK 세포 치료제, T 세포 치료제, CAR-면역세포 치료제, DC 백신, CTL 치료제, 항-PD-L1, 항-PD-1, 및 항-CTLA-4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 면역 세포 치료제는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합을 억제시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 "암(cancer) 또는 종양(tumor)"은 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비 정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다. 일 구체예에 있어서, 상기 암은 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 흑색종, 호지킨림프종, 위암, 요로상피세포암, 두경부암, 간암, 대장암, 전립선암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 유방암, 및 신장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 본 발명에서는 진행성 위암 환자의 시료를 대상으로 하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "발현 수준"은 일반적으로 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양을 지칭한다. "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 폴리펩티드로의 번역 또는 심지어 폴리 뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)을 지칭할 수 있다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 이어서 폴리펩티드로 번역되는 것, 또한 RNA로 전사되지만 폴리펩티드로 번역되지 않는 것(예를 들어, tRNA 및 rRNA)을 포함한다.
본 발명은 도 1에 나타난 순서에 따라 항체의 준비, 조직 염색, 이미징 및 분석 과정으로 이루어진다. 암 환자의 조직 주변에 존재하는 CD68, CD163 및 CD14의 발현 정도를 측정, CD68+/CD163-, CD68+/CD14+ 및 CD163+/ CD68- 대식세포의 수를 카운팅하여 대식세포의 비율을 계산하였다. 유전자 발현 수준의 측정, 이미징 및 분석 방법은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 것으로 당업계에서 널리 사용되는 것이라면 제한되지 않고 사용될 수 있다.
도 4 및 5에서는 면역세포 치료제의 반응군과 무반응군의 대식세포 분포 정도를 확인하였다. 아무 치료도 받지 않은 수술 조직(Baseline)과 면역세포 치료제 전 항암화학요법 1회를 받은 후의 수술 조직(Treatment on)을 면역 세포를 표지할 수 있는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 염색하였다. 도 4는 면역세포 치료제에 반응성이 좋은 환자 반응군의 대표 예시로, Baseline에서 CD68의 발현량이 증가해 있고, 상대적으로 CD163의 발현량이 거의 없는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 항암화학요법 1회 이후의 조직(Treatment On) 에서도 CD68의 발현량이 CD163에 비해 눈에 띄게 높은 것을 확인하였다. 도 5는 면역세포 치료제에 대한 반응성이 좋지 않은 환자 무반응군의 대표 예시로, 도 4와 달리 CD163의 발현량이 CD68의 발현량에 비해 매우 높은 것을 확인하였다. 이는 M1 대식세포, 즉 CD68+/CD163-과 CD68+/CD14+의 세포가 반응군에서 매우 높게 발현됨을 확인했고, M2 대식세포, 즉 CD163+/CD68-가 무반응군에서 M1 대식세포와 비교해 상대적으로 많이 분포하는 것을 의미한다.
실험의 준비
삼성서울병원으로부터 진행성 위암 환자 중에서 면역세포 치료제를 받기 전 아무런 치료도 받지 않은 환자를 대상으로 실시한 임상시험의 조직을 제공받았다.. 면역세포 분포를 조사하기 위해 아무 치료도 받지 않은 환자에서의 조직(Baseline)과 면역세포 치료 이전에 항암화학요법을 1회 받은 후의 조직(Treatment On)으로 실험을 실시하였다.
실시예 1. 암 조직의 염색
슬라이드를 오븐/건조기에서 60℃에서 2시간 동안 굽고 눈에 보이는 모든 왁스가 제거되었는지 확인하였다. 이후 베이킹 단계에서 가열 블록을 96℃로 켜고, 탈랍하기 전 40mL의 항원 검색 용액(1X로 희석된 10X)을 포함하는 50mL 원추형 튜브를 준비하여 튜브를 느슨한 뚜껑이 있는 수조(96℃)에 넣었다. 흄 후드에서 느슨한 뚜껑으로 20분 동안 신선한 자일렌으로 슬라이드의 왁스를 제거하고, 슬라이드를 내림차순 에탄올(100%, 95%, 80%, 70%)로 각각 5분씩 수화하였다. 부드럽게 교반하면서 오비탈 쉐이커 플레이트에 놓인 코플린 병에서 Maxpar Water로 슬라이드를 5분 동안 세척하였다. 그 다음, 조직이 있는 슬라이드를 예열된 항원 검색 용액에 삽입하고 뚜껑을 느슨하게 한 상태에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 수조에서 슬라이드를 꺼내고 항원 회수 용액과 슬라이드가 들어 있는 튜브를 실험실 벤치에 놓고 약 10분 동안 AR 용액의 온도를 모니터링하여 70℃로 냉각하였다. 그 후, 부드럽게 교반하면서 Coplin jar(orbital shaker)에서 Maxpar Water로 슬라이드를 10분 동안 세척하고, Maxpar PBS로 슬라이드를 10분 동안 세척하였다. 수화 챔버에서 실온에서 45분 동안 Maxpar PBS에 3% BSA로 차단하였다.
한편, 항체 칵테일을 준비하기 위하여 특정한 농도에서 항체의 총 부피를 계산하고 Maxpar PBS에서 0.5% BSA의 최종 부피까지 가져왔다. 슬라이드를 수화 챔버에 놓고 항체 마스터 믹스를 섹션에 파이펫으로 놓고, 수화실에서 4℃의 항체 칵테일과 함께 밤새 배양하였다. Coplin 병에서 천천히 교반하면서 Maxpar PBS에서 0.2% Triton X-100으로 슬라이드를 8분 동안 세척하는 과정을 반복하였다. Maxpar PBS에서 슬라이드를 부드럽게 교반하면서 8분 동안 세척합기를 반복하였다. 그 후, Maxpar PBS(1:400 용액의 20mm2 섹션의 경우 300-500μL/섹션)의 Intercalator-Ir로 조직을 실온에서 수화 챔버에서 30분 동안 염색하고(DNA 염색), 부드럽게 교반하면서 Maxpar Water에서 슬라이드를 5분 동안 세척하였다. 그 후 슬라이드를 실온에서 최소 20분 동안 공기 건조하였다.
실시예 2. 통계분석
Hyperion 이미징 시스템(Standard Bio Tool, Inc.)을 이용하여 단백질 마커를 스캔하고 MCD Viewer로 이미지를 분석하였다.
핵 염색(DNA 염색)에 기초하여 세포를 분할하고, 분할된 세포를 Pankeratin 염색을 이용하여 종양 세포와 종양 아닌 다른 세포로 구분하였다. Pankeratin 양성 세포(PanCK+ 및 DNA+)는 종양 세포, Pankeratin 음성 세포 (PanCK- 및 DNA+)는 다른 세포로 하였다.
또한, CD14, CD68, CD163 염색 정보를 사용하여 대식세포를 식별하기 위해 아래와 같이 정의하고, 각 대식세포의 백분율을 아래 식으로 계산하였다.
M1 대식세포의 수 = (CD68+/CD163-) + (CD68+/CD14+)
M2 대식세포의 수 = (CD163+/CD68-)
M1 대식세포의 백분율 = (M1 대식세포의 수) / (모든 세포의 수)
M2 대식세포의 백분율 = (M2 대식세포의 수) / (모든 세포의 수)
그 후, M1 대식세포와 M2 대식세포의 비율을 아래 식으로 계산하였다.
대식세포의 비율 =
(M1 대식세포의 백분율) / {(M1 대식세포의 백분율) + (M2 대식세포의 백분율)}
대식세포 비율의 컷오프 값을 최적화하여 환자를 반응군과 무반응군(펨브롤리주맙)으로 구별하였다. 도 3과 같이 반응성 예측의 ROC 곡선, AUC를 산출하고(AUC=0.99) 컷 오프 값이 0.59 초과인 경우를 반응군(Responder)인 것으로 확인하였다. 산출된 AUC 값은 0.99로 예측 정확도가 높은 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 암 조직 주변의 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정하여 면역세포 치료제에 대한 암 환자의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것으로, 암 조직 주변의 대식세포 분화 및 분포 정도를 통해 면역세포 치료제에 대한 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있어, 면역세포 치료제의 치료 효과가 나타날 것으로 예측되는 환자군에 대해 적합한 치료를 수행할 수 있어 유용하다.

Claims (11)

  1. a)암 환자로부터 수득된 생물학적 시료로부터 CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 측정된 유전자의 발현 수준을 토대로 면역세포 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 단계;를 포함하는 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 b) 단계는 상기 유전자가 발현된 세포의 수를 카운팅하여 아래 식으로 표현되는 대식세포의 비율을 계산하여 면역세포 치료제에 대한 치료 반응성을 예측하는 것인, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
    대식세포의 비율 =
    (M1 대식세포의 백분율) / {(M1 대식세포의 백분율) + (M2 대식세포의 백분율)}
    여기서,
    M1 대식세포의 백분율 = (M1 대식세포의 수) / (모든 세포의 수)이고,
    M2 대식세포의 백분율 = (M2 대식세포의 수) / (모든 세포의 수)이며,
    M1 대식세포의 수 = (CD68+/CD163-) + (CD68+/CD14+) 이고,
    M2 대식세포의 수 = (CD163+/CD68-) 임.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 대식세포의 비율이 ROC 곡선 분석에 의해 설정된 컷 오프(cut off) 값 보다 높은 경우 상기 환자는 면역세포 치료제에 대한 반응성이 높은 것으로 판단하는 것인, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 설정된 컷 오프 값은 0.59인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA:Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. CD68, CD163 및 CD14 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 조성물.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 리간드 및 앱타머로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 조성물.
  11. 청구항 8항의 조성물을 포함하는 암 환자의 면역세포 치료제의 반응성을 예측하기 위한 키트.
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