WO2024072111A1 - Digital real-time pcr analysis method - Google Patents

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WO2024072111A1
WO2024072111A1 PCT/KR2023/015053 KR2023015053W WO2024072111A1 WO 2024072111 A1 WO2024072111 A1 WO 2024072111A1 KR 2023015053 W KR2023015053 W KR 2023015053W WO 2024072111 A1 WO2024072111 A1 WO 2024072111A1
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WO
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sample
time pcr
fractions
analysis method
digital real
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PCT/KR2023/015053
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송현우
김재헌
엄재원
변재오
이도영
최경학
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(주)옵토레인
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/90—Determination of colour characteristics
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/10—Image acquisition

Definitions

  • the present invention relates to a digital real-time PCR analysis method, which allows digital real-time PCR analysis of high or low concentration samples beyond existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
  • Gene amplification technology is an essential process in molecular diagnosis and is a technology that repeatedly copies and amplifies a specific base sequence of trace amounts of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) in a sample.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • PCR polymerase chain reaction
  • digital PCR is a new PCR technology that detects and quantifies nucleic acids.
  • the goal is to generate thousands to millions of nanoliter to picoliter size fractions and determine the presence or absence of nucleic acids in each fraction.
  • the number of nucleic acids can be calculated. Therefore, there is no need to rely on a standard curve using standard substances for quantification, and it is an absolute quantification method that can be quantified with just one PCR. It has high measurement precision and enables analysis of complex mixtures and linear quantitative detection of the results.
  • ddPCR droplet digital PCR
  • a droplet generator to form droplets of a sample, a special device called a droplet generator must be used, and the formed droplets must be transferred to a 96-well PCR plate and then proceed with the PCR reaction.
  • the droplets are easily broken and some of the sample is lost.
  • 5 to 6 other equipment are required, and skilled personnel are required for analysis, and it has the disadvantage of being difficult to measure real-time curves.
  • the end-point method has a limited dynamic range that can be measured in one test, which is determined by the number of fractions and the volume of the fractions. For example, if there are 1 nanoliter per fraction and the number of fractions is 20,000, the dynamic range that can detect a target is from 1 to a minimum of 100,000 and a maximum of 300,000. If 20 microliters of a sample contains 1 million high-concentration targets, it cannot be quantified in a single test.
  • the present invention relates to a digital real-time PCR analysis method, and is intended to provide a digital real-time PCR analysis method capable of performing digital real-time PCR analysis on high or low concentration samples that exceed existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention includes a microfluidic chamber in which a liquid sample to be analyzed is stored; a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber; And using a digital real-time PCR cartridge including a CMOS photosensor array located on the bottom of the well array and capturing in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array, the present invention
  • the digital real-time PCR analysis method is,
  • It may include a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention can provide a digital real-time PCR analysis method capable of performing digital real-time PCR analysis on high- or low-concentration samples that exceed existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention can implement digital PCR that provides real-time graphs for individual fractions, thereby eliminating false positive or false negative errors.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention can achieve the same effect as repeatedly evaluating digital real-time PCR tens of thousands of times with one cartridge, and calculates the number of targets present in each unit compartment based on the values measured in each unit compartment. By doing so, the initial concentration in the sample can be calculated.
  • Figure 1 is a perspective view schematically explaining a cartridge for digital real-time PCR according to an embodiment.
  • Figure 2 is an exploded perspective view of the cartridge for digital real-time PCR shown in Figure 1.
  • FIG. 3 is a perspective view schematically illustrating an example of the well array shape shown in FIG. 2.
  • Figures 4a and 4b are diagrams showing digital real-time PCR results.
  • FIG. 5A is a front perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber shown in FIG. 2
  • FIG. 5B is a rear perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber shown in FIG. 2
  • FIG. 5C is a front perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber shown in FIG. 2. This is an exploded perspective view of the microfluidic chamber.
  • Figure 6 is a cross-sectional view schematically explaining the PCR module shown in Figure 2.
  • Figures 7 to 21 are cross-sectional views showing the schematic use of a cartridge for digital real-time PCR.
  • Figure 22 is a block diagram showing the digital real-time PCR analysis method of the present invention.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention includes a microfluidic chamber in which a liquid sample to be analyzed is stored; a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber; And a digital real-time PCR cartridge including a CMOS photosensor array located on the bottom of the well array and capturing in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array may be used.
  • It may include a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
  • the microfluidic chamber may be made of polydimethylsiloxane (PDMS) material.
  • the well array may be completely brought into close contact with the CMOS photosensor array.
  • the raw data acquisition step (S20) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention is performed after confirming that the sample to be analyzed is filled in all of the plurality of fractions, and in the raw data acquisition step (S20), the plurality of fractions
  • the image for may be acquired as the raw data.
  • the raw data may be collected at least once per cycle.
  • a fluorescence intensity function with fluorescence intensity as a dependent variable and time or cycle number as an independent variable is used for each of the plurality of fractions from the raw data.
  • the Ct value may be the time or cycle number value at which the second derivative of the fluorescence intensity function is maximum.
  • each of the plurality of target numbers for each of the plurality of fractions may be calculated using Equation 1 above.
  • N i is the number of targets in the ith fraction
  • Ct i is the Ct value of the ith fraction
  • Ct ref is determined by at least one of the number of amplicons required to measure Ct and the fluorescence efficiency of the probe,
  • a is a constant determined by PCR efficiency.
  • the Ct ref may be calculated using Equation 2 below.
  • Ct 0 may be a Ct value obtained from a standard sample.
  • the concentration of the standard sample in the digital real-time PCR analysis method of the present invention may be 10 7 copies/rxn to 10 8 copies/rxn.
  • the concentration Con of the sample to be analyzed may be calculated using Equation 3 below.
  • n is the total number of the plurality of fractions.
  • the negative or positive nature of the sample to be analyzed may be determined based on the Con value.
  • the terms “center”, “top”, “bottom”, “left”, “right”, “vertical”, “horizontal”, “inside”, “outside”, “one side” The orientation or positional relationship indicated by “, “other side”, etc. is based on the orientation or positional relationship shown in the drawings or the orientation or positional relationship normally placed when using the product of the present invention, and is for the purpose of explanation and brief explanation of the present invention. However, it does not suggest or imply that the displayed device or element must necessarily be constructed or operated in a specific orientation and should not be construed as limiting the present invention.
  • first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, a first component may be referred to as a second component without departing from the scope of the present invention, and similarly, the second component may also be referred to as a first component. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise.
  • the present invention is a structure for mounting samples, sample volumes or reaction volumes in a certain arrangement on a substrate, and more specifically, relates to mounting samples in a certain arrangement of respective reaction positions in the substrate.
  • devices, devices, systems, and methods are provided for loading samples into articles used to detect targets in large quantities of small volume samples.
  • targets may be any suitable biological target, but may also include DNA sequences (including cell-free DNA), RNA sequences, genes, oligonucleotides, molecules, proteins, biomarkers, and cells (e.g., circulating tumors). cells), or other suitable target biomolecules.
  • these biological components may be used in applications such as prenatal diagnosis, multiplexed PCR, virus detection, and quantitative normalization, genotyping, sequence verification, mutation detection, genetic biology, rare allele detection, and copy number change detection. It may also be used in connection with various PCR, qPCR, and/or dPCR methods and systems.
  • PCR quantitative polymerase chain reaction
  • Suitable PCR methods include, for example, digital PCR, allele-specific PCR, asymmetric PCR, ligationmediated PCR, multiplex PCR, nested PCR, qPCR, casting PCR, genome walking, bridge ( bridge) including but not limited to PCR.
  • reaction locations include, but are not limited to, for example, through holes, sample holding areas, wells, indentations, spots, cavities, and reaction chambers. It doesn't work.
  • dPCR digital PCR
  • solutions containing relatively small numbers of target polynucleotides or nucleic acid sequences may be further divided into a larger number of smaller samples, whereby each sample typically contains one molecule of the target nucleotide sequence. It may or may not contain the target nucleotide sequence.
  • samples are thermally cycled in a PCR protocol, procedure, or experiment, samples containing the target nucleotide sequence are amplified and produce a positive detection signal, while samples that do not contain any target nucleotide sequence are not amplified and are detected. Does not generate signal.
  • Poisson statistics the number of target nucleotide sequences in the original solution may be correlated with the number of samples producing a positive detection signal.
  • a simple and cost-effective method can be used to sample tens or hundreds of thousands of samples, i.e., samples with volumes of a few nanoliters, 1 or approximately 1 nanoliter, or less than 1 nanoliter, respectively.
  • the initial sample solution can be divided. Because the number of target nucleotide sequences can be very small, the entire contents of the initial solution may also be important in those environments where multiple reaction sites are taken into account.
  • Embodiments described herein address these and other dPCR design constraints by distributing the initial sample solution to a plurality of reaction sites in a manner that takes into account all, or all of the essentials, of the sample solution.
  • the array of reaction volumes of the liquid sample may be a substrate with a plurality of reaction sites.
  • Reaction locations may be, but are not limited to, through holes, wells, recesses, points, cavities, reaction chambers, or any structures capable of holding a sample according to various embodiments described herein. It doesn't work.
  • the through holes or wells may be tapered in diameter.
  • reaction volumes can be further increased by reducing the reaction volume of the liquid sample so that more reactions can be performed within a given area.
  • an array of reaction sites consisting of 300 ⁇ m diameter through through holes in the substrate may contain a reaction volume of approximately 30 nL.
  • each reaction volume may be, for example, 100 pL of liquid sample.
  • Reaction volumes according to various embodiments described herein may range from about 1 pL to 30 nL of liquid sample.
  • the dynamic range may be increased by using more than one dilution of the liquid sample.
  • a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber;
  • a cartridge for digital real-time PCR may be used, which is located on the bottom of the well array and includes a CMOS photosensor array that captures in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array.
  • Figure 1 is a perspective view schematically illustrating a cartridge for digital real-time PCR according to an embodiment.
  • Figure 2 is an exploded perspective view of the cartridge for digital real-time PCR shown in Figure 1.
  • the cartridge for digital real-time PCR is a cartridge-type test module and includes an upper case 110, a bottom case 120, a microfluidic chamber 130, and a well array 140. , CMOS photosensor array 150 and PCB 160.
  • the cartridge for digital real-time PCR may be detachably coupled to the reader system of the digital real-time PCR equipment.
  • the microfluidic chamber 130, well array 140, CMOS image sensor 150, and PCB 160 may define a PCR module.
  • the upper case 110 includes a donut-shaped cover body including an upper hole formed in a central area and a window member disposed in the upper hole.
  • the upper case 110 is fastened to the bottom case 120.
  • the upper case 110 and the bottom case 120 are shown as having a flat cylindrical shape, but various shapes are possible.
  • the window member may include a transparent material.
  • the window member may include PDMS material.
  • the bottom case 120 accommodates the microfluidic chamber 130, the well array 140, the CMOS photosensor array 150, and the PCB 160, and is fastened to the upper case 110.
  • the bottom case 120 and the upper case 110 may be fastened using a hook method.
  • the microfluidic chamber 130 includes a membrane switch protruding upward and an inlet formed on one side of the membrane switch for injection of a liquid sample.
  • the lower edge area of the microfluidic chamber 130 contacts the edge area of the PCB 160.
  • a receding space is formed in the lower central area of the microfluidic chamber 130 to accommodate the CMOS photosensor array 150 and the well array 140 mounted on the PCB 160.
  • the microfluidic chamber 130 may be made of a material such as PDMS.
  • the microfluidic chamber 130 has flexibility, transparency, PCR compatibility, and low autofluorescence, and can be injection molded.
  • the well array 140 is attached to the lower surface of the microfluidic chamber 130 and disposed on the CMOS photosensor array 150.
  • the well array 140 may be made of an etched silicon material.
  • the well array 140 includes a plurality of micro wells (approximately 1,000 to 100,000) that serve as PCR reaction sites.
  • FIG. 3 is a perspective view schematically illustrating an example of the well array shape shown in FIG. 2.
  • the shape of the micro well is shown in Figure 3 as being circular, various shapes such as hexagon, square, etc. are possible.
  • the shape, size, and volume of the microwell can be adjusted.
  • the micro-well has a shape with upper and lower portions penetrating.
  • the micro-well may have a thickness of less than 700 ⁇ m and a pitch of less than 150 ⁇ m.
  • the microwell may have various shapes such as hexagonal shape, circular shape, etc.
  • Well array 140 may be treated with a hydrophilic coating.
  • Well array 140 may be attached to microfluidic chamber 130 by plasma or thermal or UV curing adhesive.
  • the CMOS photosensor array 150 is disposed below the well array 140, and photographs PCR reaction products in a plurality of micro-wells of the well array 140 in real time. Specifically, the CMOS photosensor array 150 is arranged to correspond to the substrate hole formed in the PCB 160 to receive the light emitted from the well array 140 to produce the PCR reaction product performed in the PCR device as shown in FIG. 4A. As shown, measure. The measured PCR reaction product can be analyzed graphically, etc., as shown in FIG. 4B.
  • Figures 4a and 4b are diagrams showing digital real-time PCR results.
  • Figure 4a is a photograph showing PCR positive/negative results in a well array
  • Figure 4b is a graph that measures fluorescence in each micro-well in real time to determine whether the well is positive or negative.
  • the upper surface of the CMOS photosensor array 150 may be coated with a thin layer of a material such as PDMS to form the bottom of the micro-well after sealing.
  • the PCB 160 accommodates the CMOS image sensor 150.
  • a vent 152 for vacuum processing may be formed in the PCB 160 so that the liquid sample introduced through the inlet is quickly provided to the well array 140.
  • the vent 152 is connected to the space between the CMOS photosensor array 150 and the well array 140.
  • the cartridge for digital real-time PCR may further include a heater 170 for thermal circulation.
  • thermal cycling uses a thermal cycler, isothermal amplification, thermal convention, infrared mediated thermal cycling, or helicase dependent amplification. It may also include steps to:
  • the chip may be integrated with an embedded heating element.
  • the chip may be integrated with semiconductors. Detection of a target according to various embodiments may be performed singly or in combination, for example, fluorescence detection, positive or negative ion detection, acidity (pH) detection, voltage detection, or current detection, but is not limited thereto.
  • FIG. 5A is a front perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber 130 shown in FIG. 2
  • FIG. 5B is a rear perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber 130 shown in FIG. 2
  • FIG. 5C. is an exploded perspective view of the microfluidic chamber 130 shown in FIG. 2.
  • the microfluidic chamber 130 includes a square-shaped base member 132 and a square-shaped top member 134 disposed on the base member 132.
  • the base member 132 and the top member 134 are shown as physically separated, but may be formed as one piece.
  • the base member 132 includes a square-shaped first flat part 132a, a square-shaped support hole 132b formed in the center area of the first flat part 132a, and a corner area of the first flat part 132a. It includes a circular flat hole 132c. Guide protrusions protruding from the central area may be formed in the support hole 132b to define a square sawtooth shape.
  • the top member 134 includes a square-shaped second flat part 134a, a dish-shaped membrane switch 134b, and a perupe-shaped inlet part 134c.
  • the second flat portion 134a is in close contact with the upper surface of the first flat portion 132a.
  • the membrane switch 134b is disposed in the central area of the second flat portion 134a and protrudes upward.
  • the lower area of the membrane switch 134b corresponds to the support hole 132b of the base member 132. Accordingly, a receding space is formed at the bottom of the microfluidic chamber 130.
  • the CMOS image sensor 150 and the well array 140 can be accommodated in the retreated space.
  • the inlet portion 134c has a fence shape and protrudes upward on one side of the membrane switch 134b to block the liquid sample from flowing out to the outside.
  • An inlet 134d is formed in the central area of the inlet portion 134c in the vertical direction of the base member 132.
  • a micro channel 134e is formed in an area connecting the inlet 134d of the inlet portion 134c and the bottom edge area of the membrane switch 134b.
  • the liquid sample injected into the inlet 134d of the inlet portion 134c reaches the bottom edge area of the membrane switch 134b through the micro flow path 134e.
  • the top member 134 may further include a grip portion 134f protruding upward from the observer's viewpoint on the other side of the membrane switch 134b.
  • the grip portion 134f is disposed to face the inlet portion 134c with respect to the membrane switch 134b.
  • the height of the grip portion 134f may be higher than the height of the inlet portion 134c.
  • the height of the inlet portion 134c and the height of the membrane switch 134b are the same.
  • the inlet 134d and the micro channel 134e are connected to each other.
  • the liquid sample falls into the space formed below the membrane switch 134b through the micro flow path 134e.
  • each of the plurality of micro wells of the well array 140 exposed through the micro flow path 134e may be completely filled with the liquid sample.
  • Figure 6 is a cross-sectional view schematically explaining the PCR module shown in Figure 2.
  • Figure 7 is an exploded cross-sectional view for schematically explaining the PCR module shown in Figure 6.
  • the PCR module includes a microfluidic chamber 130, a well array 140, a CMOS photosensor array 150, and a PCB 150.
  • a receding space is formed in the bottom area of the microfluidic chamber 130 to accommodate the CMOS photosensor array 150 and the well array 140 disposed on the PCB 150. Since the microfluidic chamber 130 has been described in FIGS. 5A to 5C, its description is omitted.
  • the well array 140 is attached to the lower surface of the microfluidic chamber 130.
  • the well array 140 is disposed on the CMOS photosensor array 150 and is inserted into a substrate hole formed in the PCB 150.
  • the well array 140 includes a plurality of micro wells 142.
  • the shape, size, number, etc. of the micro wells 142 may vary.
  • Each of the plurality of micro wells 142 may contain an analysis sample such as a powder sample or a liquid sample.
  • the analysis sample is a specific component for analyzing biological substances.
  • the analysis sample refers to a component for quantitative or qualitative analysis of a specific biological material, such as protein, DNA, RNA, etc., and refers to primers, probes, antibodies, aptamers, DNA or RNA polymerase, etc., especially in real time. It refers to ingredients needed to perform polymerase chain reaction, constant temperature enzyme reaction, or LCR (Ligase Chain Reaction).
  • the CMOS photosensor array 150 is disposed below the well array 140 and captures images of PCR reaction products performed in the plurality of micro wells 142 of the well array 140 in real time.
  • the CMOS photosensor array 150 is inserted and placed into a substrate hole formed in the PCB 150.
  • the CMOS photosensor array 150 receives the emitted light and photographs the PCR reaction product performed in the PCR device in real time. That is, the CMOS photosensor array 150 detects fluorescence (emission light) generated from a plurality of probes by excitation light. Detection of the above-mentioned fluorescence may be performed by a time separation method or a wavelength separation method.
  • the fluorescent sensor array or a single sensor constituting the array detects the emission light passing through the emission filter and sets the time constant of the detected emission light. Obtain and detect fluorescence.
  • the fluorescent sensor array or a single sensor constituting the array detects the emission light passing through the emission filter and specifies the spectrum of the detected emission light. Fluorescence is detected through analysis.
  • the PCB 150 is disposed below the microfluidic chamber 130 and accommodates the mounted CMOS photosensor array 150.
  • the PCB 150 is placed in contact with the bottom edge area of the microfluidic chamber 130.
  • a vent hole 152 is formed in a portion of the PCB 150 that is in contact with the bottom edge area of the microfluidic chamber 130.
  • the vent 152 is connected to the space between the CMOS photosensor array 150 and the well array 140.
  • the inlet 134d When a liquid sample is introduced into the inlet 134d, air is pumped through a vacuum device (not shown) connected to the vent 152. According to the pumping of air, the liquid sample introduced into the inlet 134d passes through the micro channel 134e formed in the microfluidic chamber 130 to a partial region of the well array 140, an upper region of the partial region, and the partial region. It is provided in the lower area of .
  • a sticker 180 forming the bottom of the micro channel 134e formed in the microfluidic chamber 130 may be further included. By attaching the sticker 180, the liquid sample flowing into the micro channel 134e can be provided intact to the well array 140 without flowing out to other areas.
  • the thickness of the sticker 180 may be the same as the thickness of the well array 140.
  • the PCR module may further include a light provider (not shown) arranged to irradiate an excitation light toward the probe accommodated in each of the plurality of micro wells 142 of the well array 140.
  • the light providing unit may include a light source that emits light, such as a light emitting diode (LED) light source, a laser light source, or the like. Light emitted from the light source passes through or reflects the micro well 142 of the well array 140, and in this case, the CMOS photosensor array 150 can detect the optical signal generated by nucleic acid amplification.
  • LED light emitting diode
  • the PCR module may further include an emission filter (not shown) that serves to select light having a predetermined wavelength.
  • the emission filter may be disposed on the CMOS photosensor array 150.
  • Figures 8 to 16 are cross-sectional views showing the process of injecting a liquid sample into the well array 140.
  • an empty PCR module is placed in a flat position.
  • a liquid sample is pipetted into the inlet 134d of the microfluidic chamber 130.
  • the amount of liquid sample pipetted into the inlet 134d is preferably an amount that can fill the space between the well array 140 and the microfluidic chamber 130 and the plurality of microwells 142 of the well array 140.
  • the liquid sample pipetted into the inlet 134d cannot flow into the micro channel 134e due to air resistance present in the micro channel 134e (shown in FIG. 3B).
  • liquid sample pipetted into the inlet 134e is provided to the well array 140 along the micro flow path 134e.
  • the liquid sample provided to the well array 140 reaches the CMOS photosensor array 150 through the micro well 142 adjacent to the end of the micro channel 134e.
  • Liquid samples can be provided more quickly to a plurality of microwells through the pumping of such a vacuum device. Additionally, air that may exist in the corners or edge areas of the well array can be more easily removed through pumping of the vacuum device.
  • the vacuum device connected to the vent 152 stops operating. As the negative pressure caused by the vacuum device is eliminated, the liquid sample that has reached the lower space of the well array 140 is gradually pulled up to the upper space of the well array 140 by capillary force.
  • the liquid sample is filled in the space between the well array 140 and the microfluidic chamber 130 and the plurality of micro wells 142 of the well array 140.
  • CMOS photosensor array 150 when the window member disposed in the center area of the upper case 110 is pressed according to pressure from the user or pressure from machinery, a plurality of micro wells 142 ) The well array 140, each of which has a filled liquid sample, is pressed against the CMOS photosensor array 150.
  • It may include a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
  • the microfluidic chamber may be made of polydimethylsiloxane (PDMS) material.
  • the plurality of fractions may correspond to the plurality of micro wells 142 described above. That is, one fraction may be one microwell.
  • the sample to be analyzed may be the liquid sample described above.
  • the sample injection step (S10) the sample to be analyzed may be injected into a plurality of fractions through the above-described processes. At this time, it can be confirmed that the injection of the sample to be analyzed into the plurality of fractions has been completed through the Emptywell algorithm. Images obtained after it is confirmed that the sample to be analyzed have arrived can be used as raw data.
  • the raw data acquisition step (S20) is performed after confirming that all of the plurality of fractions are filled with the sample to be analyzed, and in the raw data acquisition step (S20), images for the plurality of fractions are converted into the raw data. It may be obtained as.
  • the raw data may be collected at least once per cycle.
  • a cycle is a temperature-controlled time period provided to repeat the denaturation, annealing, and elongation steps.
  • the area between fractions can be distinguished through a contour algorithm.
  • the wall between microwells can be distinguished through the contour algorithm.
  • the fluorescence intensity value can be calculated by extracting the color variable of the image area for each of the plurality of fractions.
  • Fluorescence intensity values can be obtained as time series (cycle number) data. That is, the fluorescence intensity value for each of the plurality of fractions can be obtained as real-time data (every cycle period).
  • a color variable may include at least one of brightness, saturation, hue, contrast, and color code.
  • a fractional image can be processed into a complementary color image, and a contrast value can be assigned to each pixel to extract it as a color variable.
  • the saturation value of each pixel can be extracted as a color variable.
  • the brightness value, saturation value, color value, and contrast value can be extracted from each pixel, and a linear function value with independent weights for each variable can be extracted as a color variable.
  • the target number may be the copy number of the target gene in the sample to be analyzed.
  • Each of the plurality of target numbers for each of the plurality of fractions may be calculated using Equation 1 above.
  • N i is the number of targets in the ith fraction.
  • Ct i is the Ct value of the ith fraction.
  • Ct ref is determined by at least one of the number of amplicons required to measure Ct and the fluorescence efficiency of the probe.
  • a is a constant determined by PCR efficiency.
  • PCR efficiency may indicate the rate at which a target gene is amplified by a PCR reaction. For example, 100% PCR efficiency means that the target is amplified 2-fold for each PCR reaction cycle, and 90% PCR efficiency means that the target is amplified 1.8-fold for each PCR reaction cycle.
  • the relationship between a and PCR efficiency Ep may be equivalent to Equation 4 below.
  • PCR efficiency can be set to 90% to 110%, so a can be -3.103 to -3.587.
  • Equation 1 above may be derived from Equation 5 below.
  • Equation 5 may be the value obtained in the Ct extraction step (S30).
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention obtains the value of Ct ref through a standard sample, making it possible to analyze even ultra-high concentration samples that cannot be analyzed conventionally.
  • the Ct ref may be calculated using Equation 2 below.
  • Vunit is the volume of one fraction. For example, it may mean the volume of one microwell, and may actually be the average volume of a plurality of microwells.
  • Ct 0 may be a Ct value obtained from a standard sample.
  • Ct 0 is the Ct value obtained by PCR amplification when the initial target number in all of the plurality of fractions is 1.
  • the Ct value may be obtained by PCR amplification when the number of targets is 1 in a volume of 20,000
  • Ct0 is a value obtained by measuring a standard sample of known concentration after serial dilution.
  • the concentration of the standard sample may be 10 7 copies/rxn to 10 8 copies/rxn.
  • the standard sample may be an international standard material or a self-produced standard material.
  • standard samples may be WHO biological reference materials (WHO international standards and reference materials).
  • the concentration Con of the sample to be analyzed may be calculated using Equation 3 below.
  • n is the total number of the plurality of fractions.
  • the final calculation step (S50) it may be determined whether the sample to be analyzed is negative or positive based on the Con value.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention can provide a digital real-time PCR analysis method capable of performing digital real-time PCR analysis on high- or low-concentration samples that exceed existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention can implement digital PCR that provides real-time graphs for individual fractions, thereby eliminating false positive or false negative errors.
  • the digital real-time PCR analysis method of the present invention can achieve the same effect as repeatedly evaluating digital real-time PCR tens of thousands of times with one cartridge, and calculates the number of targets present in each unit compartment based on the values measured in each unit compartment. By doing so, the initial concentration in the sample can be calculated.

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Abstract

The present invention relates to a digital real-time PCR analysis method and aims to provide a digital real-time PCR method that enables digital real-time PCR analysis for samples across a wide concentration range, including both high and low concentration samples that exceed the measurement limits of conventional methods.

Description

디지털 실시간 PCR 분석 방법Digital real-time PCR analysis method
본 출원은 2022.09.30. 출원된 한국특허출원 10-2022-0125179호 및 2023.09.27. 출원된 한국특허출원 10-2023-0130511호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.This application was filed on 2022.09.30. Korean Patent Application No. 10-2022-0125179 filed on September 27, 2023. The benefit of priority is claimed based on the filed Korean Patent Application No. 10-2023-0130511, and all content disclosed in the document of the Korean Patent Application is incorporated as part of this specification.
본 발명은 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것으로, 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a digital real-time PCR analysis method, which allows digital real-time PCR analysis of high or low concentration samples beyond existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
유전자 증폭기술은 분자진단에 있어서 필수적인 과정으로서 시료 내 미량의 디옥시리보핵산(Deoxyribonucleic Acid; DNA) 또는 리보핵산(Ribonucleic Acid; RNA)의 특정 염기서열을 반복적으로 복제하여 증폭하는 기술이다. 그 중 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)은 대표적인 유전자 증폭 기술로서 DNA 변성단계(denaturation), 프라이머(Primer) 결합단계(annealing), DNA 복제단계(extension)의 3단계로 구성되어 있으며 각 단계는 시료의 온도에 의존되어 있으므로 시료의 온도를 반복적으로 변하게 함으로서 DNA를 증폭할 수 있다. Gene amplification technology is an essential process in molecular diagnosis and is a technology that repeatedly copies and amplifies a specific base sequence of trace amounts of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) in a sample. Among them, polymerase chain reaction (PCR) is a representative gene amplification technology and consists of three steps: DNA denaturation, primer annealing, and DNA replication. Since the step depends on the temperature of the sample, DNA can be amplified by repeatedly changing the temperature of the sample.
PCR 분석 중, 디지털 PCR은 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 PCR 기술로서, 나노리터에서 피코 리터 크기의 분획(Partition) 수천개~수백만개를 생성하고 각 분획에 핵산의 존재 유무를 파악하는 방식으로 목표 핵산의 개수를 계산할 수 있다. 따라서 정량을 위해 표준물질을 이용한 표준곡선에 의존할 필요가 없고 단 한 번의 PCR로 정량할 수 있는 절대정량법이며, 높은 측정 정밀도를 가지고, 복잡한 혼합물의 분석 및 결과물의 선형적 정량 검출이 가능하다.Among PCR analyses, digital PCR is a new PCR technology that detects and quantifies nucleic acids. The goal is to generate thousands to millions of nanoliter to picoliter size fractions and determine the presence or absence of nucleic acids in each fraction. The number of nucleic acids can be calculated. Therefore, there is no need to rely on a standard curve using standard substances for quantification, and it is an absolute quantification method that can be quantified with just one PCR. It has high measurement precision and enables analysis of complex mixtures and linear quantitative detection of the results.
현재 가장 많이 이용되는 기술은 액적(droplet)으로 분획하는 방식을 채용한 액적 디지털 PCR(droplet digital PCR, ddPCR)방식으로서 20 마이크로리터의 시료를 20,000개의 액적으로 쪼개어 증폭시키는 기술이다. 그러나 시료의 액적화는 액적생성기라는 특수 장치를 이용하여야 하며, 형성된 액적을 96-well PCR 플레이트로 옮긴 후 일단 PCR 반응을 진행해야 한다. 또한, 액적이 깨지기 쉬워 시료 일부를 상실하는 단점이 있다. 분석 장비 외에도 5~6개의 기타 장비가 필요하며, 또한 분석을 위해 숙련된 인력이 필요하며 Real-time curve의 측정이 어렵다는 단점이 있다.Currently, the most widely used technology is the droplet digital PCR (ddPCR) method, which uses a droplet fractionation method to amplify a 20 microliter sample by splitting it into 20,000 droplets. However, to form droplets of a sample, a special device called a droplet generator must be used, and the formed droplets must be transferred to a 96-well PCR plate and then proceed with the PCR reaction. Additionally, there is a disadvantage in that the droplets are easily broken and some of the sample is lost. In addition to the analysis equipment, 5 to 6 other equipment are required, and skilled personnel are required for analysis, and it has the disadvantage of being difficult to measure real-time curves.
상기를 포함하여 현존하는 대부분의 Digital PCR 기술은 PCR 과정을 모두 마친 후 각 분획의 형광세기를 측정하는 End-point 방식이다. 형광세기가 높은 분획들은 양성, 형광세기가 낮은 분획들은 음성으로 판정한다. end-point 방식은 분획 내에 타겟 핵산의 존재 여부만 확인 가능하고 각 분획내 얼마나 존재하는지 알 수 없으므로 Poisson 확률 분포를 적용하여 시료내 타겟 핵산의 수를 계산한다. 이러한 Digital PCR 기술은 두가지 한계를 가진다. Most existing digital PCR technologies, including the above, are end-point methods that measure the fluorescence intensity of each fraction after completing the PCR process. Fractions with high fluorescence intensity are judged positive, and fractions with low fluorescence intensity are judged negative. The end-point method can only confirm the presence of target nucleic acid in a fraction and does not know how much is present in each fraction, so Poisson probability distribution is applied to calculate the number of target nucleic acids in the sample. This digital PCR technology has two limitations.
우선, 각 분획에서 양성 및 음성을 분명히 구분하기 어려운 경우가 존재한다. 어떤 분획의 형광의 세기가 양성분획과 음성분획의 형광세기 중간에 위치하여 양성인지 음성인지 판정하기 어려운 경우가 해당된다. 사용자가 임의로 설정한 기준으로 분획을 양성, 음성으로 판정하게 되면 분획 단위의 위양성, 위음성 오류를 포함하게 된다. 이는 고농도의 시료보다는 저농도 시료, 즉 민감하게 검출하면서 정량을 해야한 경우에 정량 값의 정확도에 문제를 일으킬 수 있다. 극단적으로, 단 하나의 분획에서 양성으로 보이는 반응이 나올 때 이를 양성으로 분류할 지 음성으로 분류할지 판정하기 매우 어렵다. 이러한 저농도의 정확도 문제는 정량진단제품의 최소검출한계(Limit of Detectiom, LOD), 최소정량한계(Limit of Quatitation, LOQ)를 떨어뜨리는 원인이 될 수 있다. 저농도의 검체의 LOD를 향상시키기 위하여 분획의 수와 시료의 양을 증가시키더라도 이 문제를 해결하기 어렵다. 분획과 시료가 증가하더라도 양성, 음성 중간 세기의 분획도 같이 증가하기 때문이다. 신호의 세기를 증가시키면 잡음의 세기도 같이 증가하는 원리와 같다.First of all, there are cases where it is difficult to clearly distinguish between positive and negative in each fraction. This applies to cases where the fluorescence intensity of a certain fraction is located between the fluorescence intensities of the positive and negative fractions, making it difficult to determine whether it is positive or negative. If a fraction is determined to be positive or negative based on standards arbitrarily set by the user, false positive and false negative errors in fraction units are included. This may cause problems with the accuracy of quantitative values in cases where low-concentration samples, that is, sensitive detection and quantitation are required, rather than high-concentration samples. In the extreme, when a positive-looking reaction occurs in only one fraction, it is very difficult to determine whether to classify it as positive or negative. These low-concentration accuracy problems can cause a decrease in the minimum limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of quantitative diagnostic products. Even if the number of fractions and the amount of sample are increased to improve the LOD of low-concentration samples, it is difficult to solve this problem. This is because even if the fraction and sample increase, the fraction of positive and negative intermediate intensities also increases. This is similar to the principle that if the signal strength increases, the noise strength also increases.
두번째로, 모든 분획이 양성으로 판정되는 경우 Poisson 확률분포를 사용할 수 없기 때문에 타겟 핵산의 수를 알 수 없다. 이런 경우 일반적으로 해당 시료를 Serial Dilution 하여 다시 테스트하고 음성 분획이 나오는 테스트에서 Poisson 확률분포를 사용하여 타겟 핵산의 수를 계산한다. 즉 End-point 방식은 한번의 테스트로 측정할 수 있는 dynamic range가 제한적인데 이는 분획의 수와 분획의 부피로 결정된다. 예를 들어 분획당 1나노리터, 분획수는 20,000개인 경우, 타겟을 검출할 수 있는 범위(Dynamic Range)는 1개에서 최소 10만개, 최대 30만개 정도된다. 만일 어떤 시료 20 마이크로리터에 100만개의 고농도 타겟이 들어 있다면, 한번의 테스트로 이를 정량할 수 없다.Second, if all fractions are determined to be positive, the number of target nucleic acids cannot be known because the Poisson probability distribution cannot be used. In this case, the sample is generally serial diluted and retested, and the number of target nucleic acids is calculated using the Poisson probability distribution in the test that produces a negative fraction. In other words, the end-point method has a limited dynamic range that can be measured in one test, which is determined by the number of fractions and the volume of the fractions. For example, if there are 1 nanoliter per fraction and the number of fractions is 20,000, the dynamic range that can detect a target is from 1 to a minimum of 100,000 and a maximum of 300,000. If 20 microliters of a sample contains 1 million high-concentration targets, it cannot be quantified in a single test.
본 발명은 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것으로, 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.The present invention relates to a digital real-time PCR analysis method, and is intended to provide a digital real-time PCR analysis method capable of performing digital real-time PCR analysis on high or low concentration samples that exceed existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems to be achieved by the present invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below. You will be able to.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버; 상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및 상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 것으로서, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,The digital real-time PCR analysis method of the present invention includes a microfluidic chamber in which a liquid sample to be analyzed is stored; a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber; And using a digital real-time PCR cartridge including a CMOS photosensor array located on the bottom of the well array and capturing in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array, the present invention The digital real-time PCR analysis method is,
상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);A sample injection step (S10) of injecting the analysis target sample of the microfluidic chamber into each of the plurality of fractions;
상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);A raw data acquisition step (S20) of acquiring raw data by capturing a reaction image of the analysis target sample filled in the plurality of fractions in real time through the CMOS photosensor array;
상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);A Ct extraction step (S30) of extracting a plurality of Ct (cycle threshold) values for each of the plurality of fractions from the raw data;
상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및An individual fraction target number calculation step (S40) of calculating a plurality of target numbers for each of the plurality of fractions based on the plurality of Ct values; and
상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것일 수 있다.It may include a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 제공할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention can provide a digital real-time PCR analysis method capable of performing digital real-time PCR analysis on high- or low-concentration samples that exceed existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 개별 분획에 대하여 실시간 그래프를 제공하는 디지털 PCR을 구현할 수 있고, 이를 통해 위양성 또는 위음성의 오류를 제거할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention can implement digital PCR that provides real-time graphs for individual fractions, thereby eliminating false positive or false negative errors.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 하나의 카트리지로 디지털 실시간 PCR을 수만 번 반복 평가하는 것과 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 각 단위 구획에서 측정된 값을 기반으로 각 단위 구획 내에 존재하는 타겟 수를 계산함으로써, 샘플내 초기 농도를 산출할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention can achieve the same effect as repeatedly evaluating digital real-time PCR tens of thousands of times with one cartridge, and calculates the number of targets present in each unit compartment based on the values measured in each unit compartment. By doing so, the initial concentration in the sample can be calculated.
도 1 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. Figure 1 is a perspective view schematically explaining a cartridge for digital real-time PCR according to an embodiment.
도 2는 도 1에 도시된 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 분해 사시도이다. Figure 2 is an exploded perspective view of the cartridge for digital real-time PCR shown in Figure 1.
도 3은 도 2에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. FIG. 3 is a perspective view schematically illustrating an example of the well array shape shown in FIG. 2.
도 4a 및 도 4b는 디지털 실시간 PCR 결과를 보여주는 도면들이다.Figures 4a and 4b are diagrams showing digital real-time PCR results.
도 5a는 도 2에 도시된 미소유체 챔버를 개략적으로 설명하기 위한 정면 사시도이고, 도 5b는 도 2에 도시된 미소유체 챔버를 개략적으로 설명하기 위한 배면 사시도이고, 도 5c는 도 2에 도시된 미소유체 챔버의 분해 사시도이다. FIG. 5A is a front perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber shown in FIG. 2, FIG. 5B is a rear perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber shown in FIG. 2, and FIG. 5C is a front perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber shown in FIG. 2. This is an exploded perspective view of the microfluidic chamber.
도 6은 도 2에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다. Figure 6 is a cross-sectional view schematically explaining the PCR module shown in Figure 2.
도 7 내지 도 21은 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 개략적인 이용을 나타내는 단면도들이다.Figures 7 to 21 are cross-sectional views showing the schematic use of a cartridge for digital real-time PCR.
도 22는 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 나타내는 블록도이다.Figure 22 is a block diagram showing the digital real-time PCR analysis method of the present invention.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버; 상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및 상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 것일 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention includes a microfluidic chamber in which a liquid sample to be analyzed is stored; a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber; And a digital real-time PCR cartridge including a CMOS photosensor array located on the bottom of the well array and capturing in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array may be used.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,The digital real-time PCR analysis method of the present invention,
상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);A sample injection step (S10) of injecting the analysis target sample of the microfluidic chamber into each of the plurality of fractions;
상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);A raw data acquisition step (S20) of acquiring raw data by capturing a reaction image of the analysis target sample filled in the plurality of fractions in real time through the CMOS photosensor array;
상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);A Ct extraction step (S30) of extracting a plurality of Ct (cycle threshold) values for each of the plurality of fractions from the raw data;
상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및An individual fraction target number calculation step (S40) of calculating a plurality of target numbers for each of the plurality of fractions based on the plurality of Ct values; and
상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것일 수 있다.It may include a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 시료 주입 단계(S10)에서, 상기 미소유체 챔버는 PDMS(polydimethylsiloxane) 소재로 마련되는 것일 수 있다.In the sample injection step (S10) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, the microfluidic chamber may be made of polydimethylsiloxane (PDMS) material.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 시료 주입 단계(S10)에서, 상기 복수의 분획 각각에 상기 분석대상 시료가 주입되면 상기 웰 어레이를 상기 CMOS 포토센서 어레이에 완전히 밀착시키는 것일 수 있다.In the sample injection step (S10) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, when the analysis target sample is injected into each of the plurality of fractions, the well array may be completely brought into close contact with the CMOS photosensor array.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)는 모든 상기 복수의 분획에 상기 분석대상 시료가 채워짐을 확인한 후 수행되고, 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 복수의 분획에 대한 이미지를 상기 원시 데이터로서 획득하는 것일 수 있다.The raw data acquisition step (S20) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention is performed after confirming that the sample to be analyzed is filled in all of the plurality of fractions, and in the raw data acquisition step (S20), the plurality of fractions The image for may be acquired as the raw data.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 원시 데이터는 적어도 사이클 당 1회 이상 수집되는 것일 수 있다.In the raw data acquisition step (S20) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, the raw data may be collected at least once per cycle.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 Ct 추출 단계(S30)에서, 상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대해서 형광 세기를 종속 변수로 하고, 시간 또는 사이클 수를 독립 변수로 하는 형광 세기 함수가 획득되고, 상기 Ct 값은 형광 세기 함수를 2차 미분한 값이 최대인 시간 또는 사이클 수 값인 것일 수 있다.In the Ct extraction step (S30) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, a fluorescence intensity function with fluorescence intensity as a dependent variable and time or cycle number as an independent variable is used for each of the plurality of fractions from the raw data. obtained, the Ct value may be the time or cycle number value at which the second derivative of the fluorescence intensity function is maximum.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 상기 복수 분획 각각에 대한 상기 복수의 타겟 수 각각은, 상기 수학식 1로 산출되는 것인 것일 수 있다.In the target number calculation step (S40) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, each of the plurality of target numbers for each of the plurality of fractions may be calculated using Equation 1 above.
[수학식 1][Equation 1]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000001
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000001
,
Ni는 i번째 분획에서의 타겟 수이고, N i is the number of targets in the ith fraction,
Cti는 i번째 분획의 Ct 값이며,Ct i is the Ct value of the ith fraction,
Ctref는 Ct를 측정하기 위해 필요한 앰플리콘(amplicon) 수, 프로브의 형광 효율 중 적어도 하나 이상에 의해서 결정되는 것이고,Ct ref is determined by at least one of the number of amplicons required to measure Ct and the fluorescence efficiency of the probe,
a는 상수로서 PCR 효율에 의해서 결정되는 상수이다.a is a constant determined by PCR efficiency.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 상기 Ctref는 하기 수학식 2로 산출되는 것일 수 있다.In the target number calculation step (S40) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, the Ct ref may be calculated using Equation 2 below.
[수학식 2][Equation 2]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000002
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000002
,
Ct0는 표준 시료로부터 획득되는 Ct값일 수 있다.Ct 0 may be a Ct value obtained from a standard sample.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 표준 시료의 농도는 107 copies/rxn 내지 108 copies/rxn 인 것일 수 있다.The concentration of the standard sample in the digital real-time PCR analysis method of the present invention may be 10 7 copies/rxn to 10 8 copies/rxn.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 분석대상 시료의 농도 Con은 하기 수학식 3으로 산출되는 것일 수 있다.In the final calculation step (S50) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, the concentration Con of the sample to be analyzed may be calculated using Equation 3 below.
[수학식 3][Equation 3]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000003
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000003
,
n은 상기 복수의 분획의 총 개수이다.n is the total number of the plurality of fractions.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 Con 값을 근거로 상기 분석대상 시료의 음성 또는 양성을 판단하는 것일 수 있다.In the final calculation step (S50) of the digital real-time PCR analysis method of the present invention, the negative or positive nature of the sample to be analyzed may be determined based on the Con value.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 실시예를 상세히 설명한다. 이 과정에서 도면에 도시된 구성요소의 크기나 형상 등은 설명의 명료성과 편의상 과장되게 도시될 수 있다. 또한, 본 발명의 구성 및 작용을 고려하여 특별히 정의된 용어들은 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 한다.Hereinafter, an embodiment according to the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings. In this process, the size or shape of the components shown in the drawings may be exaggerated for clarity and convenience of explanation. Additionally, terms specifically defined in consideration of the configuration and operation of the present invention may vary depending on the intention or custom of the user or operator. Definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification.
본 발명의 설명에 있어서, 유의하여야 할 점은 용어 "중심", "상", "하" "좌", "우", "수직", "수평", "내측", "외측", “일면”, “타면” 등이 지시한 방위 또는 위치 관계는 도면에서 나타낸 방위 또는 위치 관계, 또는 평소에 본 발명 제품을 사용할 시 배치하는 방위 또는 위치관계에 기초한 것이고, 본 발명의 설명과 간략한 설명을 위한 것일 뿐, 표시된 장치 또는 소자가 반드시 특정된 방위를 가지고 특정된 방위로 구성되거나 조작되어야 하는 것을 제시 또는 암시하는 것이 아니므로 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 아니 된다.In the description of the present invention, the terms “center”, “top”, “bottom”, “left”, “right”, “vertical”, “horizontal”, “inside”, “outside”, “one side” The orientation or positional relationship indicated by “, “other side”, etc. is based on the orientation or positional relationship shown in the drawings or the orientation or positional relationship normally placed when using the product of the present invention, and is for the purpose of explanation and brief explanation of the present invention. However, it does not suggest or imply that the displayed device or element must necessarily be constructed or operated in a specific orientation and should not be construed as limiting the present invention.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.Terms such as first, second, etc. may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The above terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another. For example, a first component may be referred to as a second component without departing from the scope of the present invention, and similarly, the second component may also be referred to as a first component. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise.
본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.In this application, terms such as “comprise” or “have” are intended to designate the presence of features, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof described in the specification, but are not intended to indicate the presence of one or more other features. It should be understood that this does not exclude in advance the possibility of the existence or addition of elements, numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. Additionally, unless otherwise defined, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as generally understood by a person of ordinary skill in the technical field to which the present invention pertains. Terms defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related technology, and should not be interpreted in an ideal or excessively formal sense unless explicitly defined in the present application. No.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 설명하고자 한다. 도면상의 동일한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 사용하고 동일한 구성요소에 대해서 중복된 설명은 생략한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to the attached drawings. The same reference numerals are used for the same components in the drawings, and duplicate descriptions for the same components are omitted.
본 발명은 기판에 일정 배열로 시료들, 시료 용적들 또는 반응 용적들을 탑재하기 위한 구조이며, 보다 구체적으로는 기판 내의 각각의 반응 위치들의 일정한 배열로 시료들을 탑재하는 것에 관한다.The present invention is a structure for mounting samples, sample volumes or reaction volumes in a certain arrangement on a substrate, and more specifically, relates to mounting samples in a certain arrangement of respective reaction positions in the substrate.
다양한 실시예들에서, 대량의 작은 용적 시료들에서 타겟들을 검출하기 위해 사용되는 물품 내에 시료들을 탑재하기 위한 장치, 기기, 시스템, 및 방법들이 제공된다. 이러한 타겟들은 임의의 적절한 생물학적 타겟일 수 있지만, DNA 서열(무 세포 DNA를 포함함), RNA 서열, 유전자, 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotides), 분자, 단백질, 생체표식(biomarkers), 세포(예, 순환 종양 세포), 또는 다른 적당한 타겟 생체 분자를 포함하는 것들로서, 그들로 한정되지 않는다. 다양한 실시예들에서, 이러한 생물학적 성분들은 태아 진단, 다중화 dPCR, 바이러스 검출, 및 정량 표준화, 유전자형(genotyping), 서열 검증, 돌연변이 검출, 유전자 생물, 희귀 대립 유전자 검출, 및 복제 수 변화 검출 등의 응용들에서 다양한 PCR, qPCR, 및/또는 dPCR 방법 및 시스템과 연관하여 사용될 수도 있다.In various embodiments, devices, devices, systems, and methods are provided for loading samples into articles used to detect targets in large quantities of small volume samples. These targets may be any suitable biological target, but may also include DNA sequences (including cell-free DNA), RNA sequences, genes, oligonucleotides, molecules, proteins, biomarkers, and cells (e.g., circulating tumors). cells), or other suitable target biomolecules. In various embodiments, these biological components may be used in applications such as prenatal diagnosis, multiplexed PCR, virus detection, and quantitative normalization, genotyping, sequence verification, mutation detection, genetic biology, rare allele detection, and copy number change detection. It may also be used in connection with various PCR, qPCR, and/or dPCR methods and systems.
일반적으로, 대량의 시료들이 처리되는 정량 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)에 적용가능하지만, 임의의 적절한 PCR 방법은 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따라 사용될 수도 있음을 인식해야 한다. 적절한 PCR 방법들은, 예를 들어, 디지털 PCR, 대립 유전자 특이 PCR, 비대칭 PCR, 결합 매개(ligationmediated) PCR, 다중 PCR, 맞춤형(nested) PCR, qPCR, 캐스팅 PCR, 게놈 워킹(genome walking), 브리지(bridge) PCR을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.Although generally applicable to quantitative polymerase chain reaction (qPCR) where large quantities of samples are processed, it should be recognized that any suitable PCR method may be used in accordance with the various embodiments described herein. Suitable PCR methods include, for example, digital PCR, allele-specific PCR, asymmetric PCR, ligationmediated PCR, multiplex PCR, nested PCR, qPCR, casting PCR, genome walking, bridge ( bridge) including but not limited to PCR.
본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 후술되는 바와 같이, 반응 위치들은 예를 들어 관통 구멍, 시료 보유 영역, 우물, 요홈(indentations), 지점(spots), 공동, 및 반응 챔버들을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.As described below in accordance with various embodiments described herein, reaction locations include, but are not limited to, for example, through holes, sample holding areas, wells, indentations, spots, cavities, and reaction chambers. It doesn't work.
여기에 설명되는 다양한 실시예들은 특히 디지털 PCR(dPCR)에 적합하다. 디지털 PCR에서, 타겟 폴리 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열의 상대적으로 적은 수를 내장하는 용액을 각각의 시료를 대량의 작은 시료들로 더 분할할 수도 있으며, 그에 의해 각 시료는 일반적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열의 한 분자를 포함하던가 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않을 수도 있다. 연이어, 시료들이 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험에서 열적으로 순환되는 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료가 증폭되어 양의 검출 신호를 생성하는 반면 어떠한 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 시료들은 증폭되지 않고 검출 신호를 생성하지 않는다. 푸아송 통계(Poisson statistics)를 사용하여, 원래 용액에서 타겟 뉴클레오타이드 서열들의 숫자를 양의 검출 신호를 생성하는 시료들의 개수와 상관할 수도 있다.The various embodiments described herein are particularly suitable for digital PCR (dPCR). In digital PCR, solutions containing relatively small numbers of target polynucleotides or nucleic acid sequences may be further divided into a larger number of smaller samples, whereby each sample typically contains one molecule of the target nucleotide sequence. It may or may not contain the target nucleotide sequence. Subsequently, when samples are thermally cycled in a PCR protocol, procedure, or experiment, samples containing the target nucleotide sequence are amplified and produce a positive detection signal, while samples that do not contain any target nucleotide sequence are not amplified and are detected. Does not generate signal. Using Poisson statistics, the number of target nucleotide sequences in the original solution may be correlated with the number of samples producing a positive detection signal.
전형적인 dPCR 프로토콜, 절차, 또는 실험을 위해서, 간단하여 비용에 효과적인 방법으로 수만 또는 수십만의 시료들에, 즉 각각 수 나노리터, 1 또는 대략 1 나노리터, 또는 1 나노리터 미만의 용적을 갖는 시료들에 초기 시료 용액을 분할할 수 있는 이점이 있다. 타겟 뉴클레오타이드 서열의 수를 매우 작게 할 수 있기 때문에, 초기 용액의 전체 내용물이 복수의 반응 위치들을 고려하여 내장하는 그러한 환경들에서도 중요할 수도 있다.For a typical dPCR protocol, procedure, or experiment, a simple and cost-effective method can be used to sample tens or hundreds of thousands of samples, i.e., samples with volumes of a few nanoliters, 1 or approximately 1 nanoliter, or less than 1 nanoliter, respectively. There is an advantage in that the initial sample solution can be divided. Because the number of target nucleotide sequences can be very small, the entire contents of the initial solution may also be important in those environments where multiple reaction sites are taken into account.
본원에서 설명되는 실시예들은 이들 및 기타 dPCR 설계 제약들을 초기 시료 용액을 복수의 반응 위치들에 시료 용액의 모두, 또는 필수적인 것들 모두를 고려하는 방식으로 분배함으로써 해결한다.Embodiments described herein address these and other dPCR design constraints by distributing the initial sample solution to a plurality of reaction sites in a manner that takes into account all, or all of the essentials, of the sample solution.
높은 처리량의 PCR 분석들 및 dPCR 방법들 때문에, 한번에 수행되는 반응들의 수를 증가시키면서 액체시료의 반응 용적을 감소시키기 위해 배열 형식을 사용하는 전략이 적용될 수도 있다. 액체시료의 반응 용적들의 배열은 복수의 반응 위치들을 갖는 기판 일 수도 있다. 반응 위치들은 관통 구멍들, 우물들, 요부들, 지점들, 공동들, 반응실들, 또는 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따른 시료를 보유할 수 있는 임의의 구조들일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 관통 구멍 또는 우물들은 지름이 테이퍼질 수도 있다.Due to high throughput PCR assays and dPCR methods, a strategy of using array formats to reduce the reaction volume of liquid samples while increasing the number of reactions performed at once may be applied. The array of reaction volumes of the liquid sample may be a substrate with a plurality of reaction sites. Reaction locations may be, but are not limited to, through holes, wells, recesses, points, cavities, reaction chambers, or any structures capable of holding a sample according to various embodiments described herein. It doesn't work. In some embodiments, the through holes or wells may be tapered in diameter.
주어진 영역 내에서 더 많은 반응이 수행될 수 있도록 액체시료의 반응 용적을 줄이면 반응 용적들의 밀도를 더 높일 수도 있다. 예를 들어, 기판 내의 관통 구멍들을 통해 300 ㎛의 직경으로 구성되는 일정 배열의 반응 위치들은 약 30 nL의 반응 용적을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 배열 내의 각 관통 구멍의 사이즈를 직경 60 내지 70 ㎛로 줄임으로써 예를 들어 각 반응 용적은 100 pL의 액체시료일 수도 있다. 본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 반응 용적들은 약 1 pL 로부터 30 nL까지의 액체시료일 수도 있다. 더욱이, 동적 범위는 액체시료의 희석액을 1이상 사용하여 증가될 수도 있다.The density of reaction volumes can be further increased by reducing the reaction volume of the liquid sample so that more reactions can be performed within a given area. For example, an array of reaction sites consisting of 300 μm diameter through through holes in the substrate may contain a reaction volume of approximately 30 nL. For example, by reducing the size of each through hole in the array to a diameter of 60 to 70 μm, each reaction volume may be, for example, 100 pL of liquid sample. Reaction volumes according to various embodiments described herein may range from about 1 pL to 30 nL of liquid sample. Moreover, the dynamic range may be increased by using more than one dilution of the liquid sample.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,The digital real-time PCR analysis method of the present invention,
액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버;A microfluidic chamber in which a liquid sample to be analyzed is stored;
상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber; and
상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 것일 수 있다.A cartridge for digital real-time PCR may be used, which is located on the bottom of the well array and includes a CMOS photosensor array that captures in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array.
이하, 도 1 내지 도 23을 참조하여, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 이용되는 디지털 실시간 PCR용 카트리지에 대해서 설명한다.Hereinafter, with reference to FIGS. 1 to 23, a cartridge for digital real-time PCR used in the digital real-time PCR analysis method of the present invention will be described.
도 1은 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 2는 도 1에 도시된 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 분해 사시도이다.Figure 1 is a perspective view schematically illustrating a cartridge for digital real-time PCR according to an embodiment. Figure 2 is an exploded perspective view of the cartridge for digital real-time PCR shown in Figure 1.
도 1 및 도 2를 참조하면, 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 카트리지 타입의 검사 모듈로서 어퍼 케이스(110), 바텀 케이스(120), 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 포함한다. 본 실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 디지털 실시간 PCR 장비의 리더 시스템에 탈착 가능하도록 결합될 수 있다. 본 실시예에서, 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 이미지 센서(150) 및 PCB(160)는 PCR 모듈을 정의할 수 있다.Referring to Figures 1 and 2, the cartridge for digital real-time PCR according to one embodiment is a cartridge-type test module and includes an upper case 110, a bottom case 120, a microfluidic chamber 130, and a well array 140. , CMOS photosensor array 150 and PCB 160. In this embodiment, the cartridge for digital real-time PCR may be detachably coupled to the reader system of the digital real-time PCR equipment. In this embodiment, the microfluidic chamber 130, well array 140, CMOS image sensor 150, and PCB 160 may define a PCR module.
어퍼 케이스(110)는 중심 영역에 형성된 어퍼홀을 포함하는 도우넛 형상의 커버 몸체와 상기 어퍼홀에 배치된 윈도우 부재를 포함한다. 어퍼 케이스(110)는 바텀 케이스(120)에 체결된다. 본 실시예에서, 어퍼 케이스(110) 및 바텀 케이스(120)는 납작한 원통 형상인 것을 도시하였으나, 다양한 형상이 가능하다. 상기 윈도우 부재는 투명 재질을 포함할 수 있다. 상기 윈도우 부재는 PDMS 재질을 포함할 수 있다. The upper case 110 includes a donut-shaped cover body including an upper hole formed in a central area and a window member disposed in the upper hole. The upper case 110 is fastened to the bottom case 120. In this embodiment, the upper case 110 and the bottom case 120 are shown as having a flat cylindrical shape, but various shapes are possible. The window member may include a transparent material. The window member may include PDMS material.
바텀 케이스(120)는 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 수용하고, 어퍼 케이스(110)에 체결된다. 바텀 케이스(120)와 어퍼 케이스(110)는 후크 방식으로 체결될 수 있다. The bottom case 120 accommodates the microfluidic chamber 130, the well array 140, the CMOS photosensor array 150, and the PCB 160, and is fastened to the upper case 110. The bottom case 120 and the upper case 110 may be fastened using a hook method.
미소유체 챔버(130)는 상향으로 돌출된 멤브레인 스위치, 상기 멤브레인 스위치의 일측에 형성되어 액체시료의 주입을 위한 인렛을 포함한다. 미소유체 챔버(130)의 하부 에지 영역은 PCB(160)의 에지 영역에 접한다. 미소유체 챔버(130)의 하부 중앙 영역에는 PCB(160)에 탑재된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하기 위해 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 미소유체 챔버(130)는 PDMS와 같은 재질로 구성될 수 있다. 미소유체 챔버(130)는 유연성, 투명성, PCR 호환성 및 낮은 자가 형광성을 갖고서, 사출 성형이 가능하다.The microfluidic chamber 130 includes a membrane switch protruding upward and an inlet formed on one side of the membrane switch for injection of a liquid sample. The lower edge area of the microfluidic chamber 130 contacts the edge area of the PCB 160. A receding space is formed in the lower central area of the microfluidic chamber 130 to accommodate the CMOS photosensor array 150 and the well array 140 mounted on the PCB 160. The microfluidic chamber 130 may be made of a material such as PDMS. The microfluidic chamber 130 has flexibility, transparency, PCR compatibility, and low autofluorescence, and can be injection molded.
웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착되고, CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치된다. 웰 어레이(140)는 에칭된 실리콘 재질로 구성될 수 있다. 웰 어레이(140)는 PCR 반응 위치의 역할을 수행하는 복수의 마이크로 웰(대략 1,000개~100,000개)을 포함한다. The well array 140 is attached to the lower surface of the microfluidic chamber 130 and disposed on the CMOS photosensor array 150. The well array 140 may be made of an etched silicon material. The well array 140 includes a plurality of micro wells (approximately 1,000 to 100,000) that serve as PCR reaction sites.
도 3은 도 2에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 3에서 마이크로 웰의 형상이 원형상인 것을 도시하였으나, 육각형, 사각형 등과 같이 다양한 형상이 가능하다. FIG. 3 is a perspective view schematically illustrating an example of the well array shape shown in FIG. 2. Although the shape of the micro well is shown in Figure 3 as being circular, various shapes such as hexagon, square, etc. are possible.
도 3을 참조하면, 상기 마이크로 웰의 형태, 크기 및 부피는 조절이 가능하다. 상기 마이크로 웰은 상하부가 관통된 형상을 갖는다. 본 실시예에서, 상기 마이크로 웰은 700um미만의 두께와 150um 미만의 피치를 가질 수 있다. 상기 마이크로 웰은 육각 형상, 원형상 등과 같은 다양한 형상을 가질 수 있다. 웰 어레이(140)는 친수성 코팅으로 처리될 수 있다. 웰 어레이(140)는 플라즈마 또는 열 또는 UV 경화 접착제에 의해 미소유체 챔버(130)에 부착될 수 있다. Referring to Figure 3, the shape, size, and volume of the microwell can be adjusted. The micro-well has a shape with upper and lower portions penetrating. In this embodiment, the micro-well may have a thickness of less than 700 μm and a pitch of less than 150 μm. The microwell may have various shapes such as hexagonal shape, circular shape, etc. Well array 140 may be treated with a hydrophilic coating. Well array 140 may be attached to microfluidic chamber 130 by plasma or thermal or UV curing adhesive.
도 1 및 도 2를 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140) 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰에서 PCR 반응 산물을 실시간으로 촬영한다. 구체적으로, CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(160)에 형성된 기판홀에 대응하도록 배치되어 웰 어레이(140)에서 방출되는 광을 수용하여 PCR 장치에서 수행되는 PCR 반응 산물을 도 4a에 도시된 바와 같이, 측정한다. 측정된 PCR 반응 산물은 도 4b에 도시된 바와 같이, 그래프 등의 방식으로 분석될 수 있다.Referring again to FIGS. 1 and 2, the CMOS photosensor array 150 is disposed below the well array 140, and photographs PCR reaction products in a plurality of micro-wells of the well array 140 in real time. Specifically, the CMOS photosensor array 150 is arranged to correspond to the substrate hole formed in the PCB 160 to receive the light emitted from the well array 140 to produce the PCR reaction product performed in the PCR device as shown in FIG. 4A. As shown, measure. The measured PCR reaction product can be analyzed graphically, etc., as shown in FIG. 4B.
도 4a 및 도 4b는 디지털 실시간 PCR 결과를 보여주는 도면들이다. 특히, 도 4a는 웰 어레이에서 PCR 양성/음성 결과를 표시한 사진이고, 도 4b는 각 마이크로 웰에서 실시간으로 형광을 측정하여 해당 웰이 양성인지 음성인지를 판별하게 하는 그래프이다.Figures 4a and 4b are diagrams showing digital real-time PCR results. In particular, Figure 4a is a photograph showing PCR positive/negative results in a well array, and Figure 4b is a graph that measures fluorescence in each micro-well in real time to determine whether the well is positive or negative.
도 1 및 도 2를 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)의 상부면에는 밀봉후 마이크로 웰의 바닥을 형성하기 위해 PDMS와 같은 물질의 얇은 층이 코팅될 수 있다.Referring again to FIGS. 1 and 2, the upper surface of the CMOS photosensor array 150 may be coated with a thin layer of a material such as PDMS to form the bottom of the micro-well after sealing.
PCB(160)는 CMOS 이미지 센서(150)를 수용한다. 상기 인렛을 통해 투입된 액체시료가 웰 어레이(140)에 빠르게 제공되도록, PCB(160)에는 진공 처리를 위한 통풍구(152)가 형성될 수 있다. 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 사이의 공간과 도통한다.The PCB 160 accommodates the CMOS image sensor 150. A vent 152 for vacuum processing may be formed in the PCB 160 so that the liquid sample introduced through the inlet is quickly provided to the well array 140. The vent 152 is connected to the space between the CMOS photosensor array 150 and the well array 140.
본 실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 열 순환을 위해 히터(170)를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 열 순환은 열 순환기(thermal cycler), 등온 증폭, 열 관습(thermal convention), 적외선 매개 열 사이클링(infrared mediated thermal cycling), 또는 헬리카제 의존 증폭(helicase dependent amplification)을 사용하는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 칩이 내장된 가열 소자와 통합될 수도 있다. 다양한 실시예들에서, 칩은 반도체들과 통합될 수도 있다. 다양한 실시예들에 따른 타겟의 검출은 예를 들어, 형광 검출, 양 또는 음 이온 검출, 산도(pH) 검출, 전압 검출, 또는 전류 검출을 단독 또는 조합할 수도 있지만, 그들로 한정되지 않는다.In this embodiment, the cartridge for digital real-time PCR may further include a heater 170 for thermal circulation. As used herein, thermal cycling uses a thermal cycler, isothermal amplification, thermal convention, infrared mediated thermal cycling, or helicase dependent amplification. It may also include steps to: In some embodiments, the chip may be integrated with an embedded heating element. In various embodiments, the chip may be integrated with semiconductors. Detection of a target according to various embodiments may be performed singly or in combination, for example, fluorescence detection, positive or negative ion detection, acidity (pH) detection, voltage detection, or current detection, but is not limited thereto.
도 5a는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)를 개략적으로 설명하기 위한 정면 사시도이고, 도 5b는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)를 개략적으로 설명하기 위한 배면 사시도이고, 도 5c는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)의 분해 사시도이다.FIG. 5A is a front perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber 130 shown in FIG. 2, FIG. 5B is a rear perspective view for schematically explaining the microfluidic chamber 130 shown in FIG. 2, and FIG. 5C. is an exploded perspective view of the microfluidic chamber 130 shown in FIG. 2.
도 2 내지 도 5c를 참조하면, 본 실시예에 따른 미소유체 챔버(130)는 사각 형상의 베이스부재(132)와 베이스부재(132) 위에 배치되는 사각 형상의 탑부재(134)를 포함한다. 본 실시예에서, 베이스부재(132)와 탑부재(134)는 물리적으로 분리된 것을 도시하였으나, 일체형으로 구성될 수도 있다.Referring to FIGS. 2 to 5C , the microfluidic chamber 130 according to this embodiment includes a square-shaped base member 132 and a square-shaped top member 134 disposed on the base member 132. In this embodiment, the base member 132 and the top member 134 are shown as physically separated, but may be formed as one piece.
베이스부재(132)는, 사각 형상의 제1 플랫부(132a), 제1 플랫부(132a)의 중심영역에 형성된 사각 형상의 지지홀(132b), 제1 플랫부(132a)의 모서리 영역에 형성된 원형상의 플랫홀(132c)을 포함한다. 지지홀(132b)에는 중심 영역으로 돌출된 가이드 돌기들이 형성되어 사각 톱니 형상을 정의할 수 있다.The base member 132 includes a square-shaped first flat part 132a, a square-shaped support hole 132b formed in the center area of the first flat part 132a, and a corner area of the first flat part 132a. It includes a circular flat hole 132c. Guide protrusions protruding from the central area may be formed in the support hole 132b to define a square sawtooth shape.
탑부재(134)는 사각 형상의 제2 플랫부(134a), 접시 형상의 멤브레인 스위치(134b) 및 페루프 형상의 인렛부(134c)를 포함한다. 제2 플랫부(134a)는 제1 플랫부(132a)의 상부면에 밀착된다. 멤브레인 스위치(134b)는 제2 플랫부(134a)의 중심영역에 배치되고 상향으로 돌출된다. 멤브레인 스위치(134b)의 하부 영역은 베이스부재(132)의 지지홀(132b)에 대응한다. 이에 따라 미소유체 챔버(130)의 바닥부에는 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 후퇴된 공간에는 CMOS 이미지 센서(150)와 웰 어레이(140)가 수용될 수 있다.The top member 134 includes a square-shaped second flat part 134a, a dish-shaped membrane switch 134b, and a perupe-shaped inlet part 134c. The second flat portion 134a is in close contact with the upper surface of the first flat portion 132a. The membrane switch 134b is disposed in the central area of the second flat portion 134a and protrudes upward. The lower area of the membrane switch 134b corresponds to the support hole 132b of the base member 132. Accordingly, a receding space is formed at the bottom of the microfluidic chamber 130. The CMOS image sensor 150 and the well array 140 can be accommodated in the retreated space.
인렛부(134c)는 울타리 형상(fence shape)을 갖고서, 멤브레인 스위치(134b)의 일측에 상향으로 돌출되어 액체시료가 외부로 유출되는 것을 차단한다. 인렛부(134c)의 중심영역에는 베이스부재(132)의 수직 방향으로 인렛(134d)이 형성된다.The inlet portion 134c has a fence shape and protrudes upward on one side of the membrane switch 134b to block the liquid sample from flowing out to the outside. An inlet 134d is formed in the central area of the inlet portion 134c in the vertical direction of the base member 132.
인렛부(134c)의 인렛(134d)과 멤브레인 스위치(134b)의 바닥 에지 영역을 연결하는 영역에는 마이크로 유로(134e)가 형성된다. 인렛부(134c)의 인렛(134d)에 투입된 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 통해 멤브레인 스위치(134b)의 바닥 에지 영역까지 도달된다.A micro channel 134e is formed in an area connecting the inlet 134d of the inlet portion 134c and the bottom edge area of the membrane switch 134b. The liquid sample injected into the inlet 134d of the inlet portion 134c reaches the bottom edge area of the membrane switch 134b through the micro flow path 134e.
탑부재(134)는 멤브레인 스위치(134b)의 타측에 관찰자 관점에서 상향으로 돌출된 그립부(134f)를 더 포함할 수 있다. 그립부(134f)는 멤브레인 스위치(134b)를 기준으로 인렛부(134c)와 마주하도록 배치된다. 그립부(134f)의 높이는 인렛부(134c)의 높이보다 높을 수 있다. 인렛부(134c)의 높이와 멤브레인 스위치(134b)의 높이는 동일하다.The top member 134 may further include a grip portion 134f protruding upward from the observer's viewpoint on the other side of the membrane switch 134b. The grip portion 134f is disposed to face the inlet portion 134c with respect to the membrane switch 134b. The height of the grip portion 134f may be higher than the height of the inlet portion 134c. The height of the inlet portion 134c and the height of the membrane switch 134b are the same.
이상에서 설명된 바와 같이, 미소유체 챔버(130)에서 인렛(134d)과 마이크로 유로(134e)는 서로 도통된다. 인렛(134d)을 통해 액체시료가 투입되면, 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 통해 멤브레인 스위치(134b)의 아래에 형성된 공간으로 낙하한다. 또한 멤브레인 스위치(134b)가 눌려지는 경우, 마이크로 유로(134e)를 통해 노출된 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰 각각에 액체시료가 완전 충전될 수 있다.As described above, in the microfluidic chamber 130, the inlet 134d and the micro channel 134e are connected to each other. When a liquid sample is introduced through the inlet 134d, the liquid sample falls into the space formed below the membrane switch 134b through the micro flow path 134e. Additionally, when the membrane switch 134b is pressed, each of the plurality of micro wells of the well array 140 exposed through the micro flow path 134e may be completely filled with the liquid sample.
도 6은 도 2에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다. 도 7은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 분해 단면도이다.Figure 6 is a cross-sectional view schematically explaining the PCR module shown in Figure 2. Figure 7 is an exploded cross-sectional view for schematically explaining the PCR module shown in Figure 6.
도 2 내지 도 7을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 PCR 모듈은 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(150)을 포함한다.2 to 7, the PCR module according to an embodiment of the present invention includes a microfluidic chamber 130, a well array 140, a CMOS photosensor array 150, and a PCB 150.
미소유체 챔버(130)의 바닥 영역에는 PCB(150)에 배치된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하도록 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 미소유체 챔버(130)는 도 5a 내지 도 5c에서 설명하였으므로 그 설명은 생략한다.A receding space is formed in the bottom area of the microfluidic chamber 130 to accommodate the CMOS photosensor array 150 and the well array 140 disposed on the PCB 150. Since the microfluidic chamber 130 has been described in FIGS. 5A to 5C, its description is omitted.
웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착된다. 웰 어레이(140)는 CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치되고, PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. 웰 어레이(140)는 복수의 마이크로 웰(142)을 포함한다. 마이크로 웰(142)의 형상이나, 치수, 개수 등은 다양할 수 있다. 복수의 마이크로 웰(142) 각각에는 분말시료 또는 액체시료와 같은 분석시료가 수용될 수 있다. 상기 분석시료는 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분이다. 즉, 상기 분석시료란 특정한 생물학적 물질, 예를 들어 단백질, DNA, RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미하며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행하기 위해 필요한 성분을 의미한다. The well array 140 is attached to the lower surface of the microfluidic chamber 130. The well array 140 is disposed on the CMOS photosensor array 150 and is inserted into a substrate hole formed in the PCB 150. The well array 140 includes a plurality of micro wells 142. The shape, size, number, etc. of the micro wells 142 may vary. Each of the plurality of micro wells 142 may contain an analysis sample such as a powder sample or a liquid sample. The analysis sample is a specific component for analyzing biological substances. In other words, the analysis sample refers to a component for quantitative or qualitative analysis of a specific biological material, such as protein, DNA, RNA, etc., and refers to primers, probes, antibodies, aptamers, DNA or RNA polymerase, etc., especially in real time. It refers to ingredients needed to perform polymerase chain reaction, constant temperature enzyme reaction, or LCR (Ligase Chain Reaction).
CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140)의 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142)에서 수행되는 PCR 반응 산물의 영상을 실시간으로 촬영한다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 방출되는 광을 수용하여 PCR 장치에서 수행되는 PCR 반응 산물을 실시간으로 촬영한다. 즉, CMOS 포토센서 어레이(150)는 여기 광선에 의하여 다수의 프로브에서 발생하는 형광(emission light)을 검출한다. 상기한 형광의 검출은 시간 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있고, 파장 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있다.The CMOS photosensor array 150 is disposed below the well array 140 and captures images of PCR reaction products performed in the plurality of micro wells 142 of the well array 140 in real time. The CMOS photosensor array 150 is inserted and placed into a substrate hole formed in the PCB 150. The CMOS photosensor array 150 receives the emitted light and photographs the PCR reaction product performed in the PCR device in real time. That is, the CMOS photosensor array 150 detects fluorescence (emission light) generated from a plurality of probes by excitation light. Detection of the above-mentioned fluorescence may be performed by a time separation method or a wavelength separation method.
상기한 시간 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 시상수를 구하여 형광을 감지한다. In the case of the time separation method described above, as the fluorescent material responds to the excitation light and produces emission light, the fluorescent sensor array or a single sensor constituting the array detects the emission light passing through the emission filter and sets the time constant of the detected emission light. Obtain and detect fluorescence.
상기한 파장 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 스펙트럼 분석을 통해 형광을 감지한다. In the case of the above-described wavelength separation method, as the fluorescent material responds to the excitation light and produces emission light, the fluorescent sensor array or a single sensor constituting the array detects the emission light passing through the emission filter and specifies the spectrum of the detected emission light. Fluorescence is detected through analysis.
PCB(150)는 미소유체 챔버(130) 아래에 배치되고, 탑재되는 CMOS 포토센서 어레이(150)를 수납한다. PCB(150)는 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하도록 배치된다. 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하는 PCB(150)의 일부 영역에는 통풍구(vent hole)(152)가 형성된다. 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 간의 공간과 도통된다.The PCB 150 is disposed below the microfluidic chamber 130 and accommodates the mounted CMOS photosensor array 150. The PCB 150 is placed in contact with the bottom edge area of the microfluidic chamber 130. A vent hole 152 is formed in a portion of the PCB 150 that is in contact with the bottom edge area of the microfluidic chamber 130. The vent 152 is connected to the space between the CMOS photosensor array 150 and the well array 140.
액체시료가 인렛(134d)에 투입되면, 통풍구(152)에 연결된 진공 장치(미도시)를 통해 공기가 펌핑된다. 공기의 펌핑에 따라, 인렛(134d)에 투입된 액체시료는 미소유체 챔버(130)에 형성된 마이크로 유로(134e)를 경유하여 웰 어레이(140)의 일부 영역, 상기 일부 영역의 상부 영역 및 상기 일부 영역의 하부 영역에 제공된다.When a liquid sample is introduced into the inlet 134d, air is pumped through a vacuum device (not shown) connected to the vent 152. According to the pumping of air, the liquid sample introduced into the inlet 134d passes through the micro channel 134e formed in the microfluidic chamber 130 to a partial region of the well array 140, an upper region of the partial region, and the partial region. It is provided in the lower area of .
본 실시예에서, 미소유체 챔버(130)에 형성된 마이크로 유로(134e)의 바닥을 형성하는 스티커(180)를 더 포함할 수 있다. 스티커(180)의 부착에 따라 마이크로 유로(134e)에 유입된 액체시료는 다른 영역으로 유출되지 않고 웰 어레이(140)에 온전하게 제공될 수 있다. 스티커(180)의 두께는 웰 어레이(140)의 두께와 동일할 수 있다. In this embodiment, a sticker 180 forming the bottom of the micro channel 134e formed in the microfluidic chamber 130 may be further included. By attaching the sticker 180, the liquid sample flowing into the micro channel 134e can be provided intact to the well array 140 without flowing out to other areas. The thickness of the sticker 180 may be the same as the thickness of the well array 140.
본 실시예에서, 상기 PCR 모듈은 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142) 각각에 수용된 프로브를 향해 여기 광선(excitation light)을 조사하도록 배치된 광 제공부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 광 제공부는 LED(Light Emitting Diode) 광원, 레이저 광원 등과 같이 광을 방출하는 광원을 포함할 수 있다. 광원으로부터 방출된 광은 웰 어레이(140)의 마이크로 웰(142)을 통과하거나 반사하고, 이 경우 핵산 증폭에 의해 발생하는 광신호를 CMOS 포토센서 어레이(150)가 검출할 수 있다.In this embodiment, the PCR module may further include a light provider (not shown) arranged to irradiate an excitation light toward the probe accommodated in each of the plurality of micro wells 142 of the well array 140. You can. In one embodiment, the light providing unit may include a light source that emits light, such as a light emitting diode (LED) light source, a laser light source, or the like. Light emitted from the light source passes through or reflects the micro well 142 of the well array 140, and in this case, the CMOS photosensor array 150 can detect the optical signal generated by nucleic acid amplification.
본 실시예에서, 상기 PCR 모듈은 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 역할을 수행하는 이미션 필터(미도시)를 더 포함할 수 있다. 상기 이미션 필터는 CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치될 수 있다. In this embodiment, the PCR module may further include an emission filter (not shown) that serves to select light having a predetermined wavelength. The emission filter may be disposed on the CMOS photosensor array 150.
그러면, 이하에서, 본 발명의 실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 사용 방법을 순차적으로 나타낸 도면들을 이용하여 설명한다. 설명의 편의를 위해, 어퍼 케이스(110; 도 2에 도시됨) 및 바텀 케이스(120; 도 2에 도시됨)에 대한 도시는 생략한다.Then, below, a method of using a cartridge for digital real-time PCR according to an embodiment of the present invention will be described using sequential drawings. For convenience of explanation, illustration of the upper case 110 (shown in FIG. 2) and the bottom case 120 (shown in FIG. 2) is omitted.
도 8 내지 도 16은 액체시료가 웰 어레이(140)에 주입되는 과정을 나타내는 단면도이다.Figures 8 to 16 are cross-sectional views showing the process of injecting a liquid sample into the well array 140.
도 8을 참조하면, 빈 상태의 PCR 모듈을 평평한 위치에 배치한다.Referring to Figure 8, an empty PCR module is placed in a flat position.
도 9을 참조하면, 액체시료를 미소유체 챔버(130)의 인렛(134d)에 피펫한다. 인렛(134d)에 피펫되는 액체시료의 양은 웰 어레이(140)와 미소유체 챔버(130) 사이의 공간 및 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142)에 채워질 수 있는 양인 것이 바람직하다. 인렛(134d)에 피펫된 액체시료는 마이크로 유로(134e; 도 3b에 도시됨)에 존재하는 공기의 저항에 의해 마이크로 유로(134e)에 흐르지 못한다.Referring to FIG. 9, a liquid sample is pipetted into the inlet 134d of the microfluidic chamber 130. The amount of liquid sample pipetted into the inlet 134d is preferably an amount that can fill the space between the well array 140 and the microfluidic chamber 130 and the plurality of microwells 142 of the well array 140. The liquid sample pipetted into the inlet 134d cannot flow into the micro channel 134e due to air resistance present in the micro channel 134e (shown in FIG. 3B).
도 10, 도 11, 도 12 및 도 13을 참조하면, 인렛(134e)에 액체시료가 피펫된 후 통풍구(152)에 연결된 진공 장치(미도시)로 음압을 형성한다.Referring to FIGS. 10, 11, 12, and 13, after a liquid sample is pipetted into the inlet 134e, negative pressure is created using a vacuum device (not shown) connected to the vent 152.
이에 따라, 공기는 통풍구(152)를 통해 펌핑되고, 인렛(134e)에 피펫된 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 따라 웰 어레이(140)에 제공된다. 웰 어레이(140)에 제공된 액체시료는 마이크로 유로(134e)의 종단부에 근접한 마이크로 웰(142)을 통해 CMOS 포토센서 어레이(150) 위까지 도달한다. 이러한 진공 장치의 펌핑을 통해 복수의 마이크로 웰에 액체시료가 보다 빠르게 제공될 수 있다. 또한, 진공 장치의 펌핑을 통해 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 존재할 수 있는 공기를 보다 용이하게 제거할 수 있다. Accordingly, air is pumped through the vent 152, and the liquid sample pipetted into the inlet 134e is provided to the well array 140 along the micro flow path 134e. The liquid sample provided to the well array 140 reaches the CMOS photosensor array 150 through the micro well 142 adjacent to the end of the micro channel 134e. Liquid samples can be provided more quickly to a plurality of microwells through the pumping of such a vacuum device. Additionally, air that may exist in the corners or edge areas of the well array can be more easily removed through pumping of the vacuum device.
도 14, 도 15 및 도 16을 참조하면, 통풍구(152)에 연결된 진공 장치는 작동이 정지된다. 상기 진공 장치에 의한 음압이 해소됨에 따라, 웰 어레이(140)의 하부 공간에 도달된 액체시료는 모세관 힘에 의해 웰 어레이(140)의 상부 공간까지 점진적으로 끌어 올려진다.Referring to FIGS. 14, 15, and 16, the vacuum device connected to the vent 152 stops operating. As the negative pressure caused by the vacuum device is eliminated, the liquid sample that has reached the lower space of the well array 140 is gradually pulled up to the upper space of the well array 140 by capillary force.
이에 따라, 액체시료는 웰 어레이(140)와 미소유체 챔버(130) 사이의 공간 및 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142)에 채워진다. Accordingly, the liquid sample is filled in the space between the well array 140 and the microfluidic chamber 130 and the plurality of micro wells 142 of the well array 140.
도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21을 참조하면, 사용자의 가압 또는 기계류의 가압에 따라 어퍼 케이스(110)의 중심 영역에 배치된 윈도우 부재가 눌려지면, 복수의 마이크로 웰(142) 각각에 채워진 액체시료를 갖는 웰 어레이(140)는 CMOS 포토센서 어레이(150)에 눌려진다.Referring to FIGS. 17, 18, 19, 20, and 21, when the window member disposed in the center area of the upper case 110 is pressed according to pressure from the user or pressure from machinery, a plurality of micro wells 142 ) The well array 140, each of which has a filled liquid sample, is pressed against the CMOS photosensor array 150.
이에 따라, 웰 어레이(140)의 코너나 에지 영역에 에어 포켓이 생성되는 것을 차단할 수 있다. 상기 에어포켓은 PCR 과정 중의 온도변화에 의해 팽창하거나 수축하여 시험결과에 오류가 발생한다. 하지만, 본 발명에 따르면 진공 장치의 펌핑을 통해 PCR 용액을 이동시키고 그 용액이 반응공간을 채울 때, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에서 에어 포켓의 생성이 차단되므로 PCR 시험결과에서 에어포켓에 의한 시험결과에 오류가 발생되는 것을 방지할 수 있다. 또한 CMOS 포토센서 어레이 위에 웰 어레이가 위치하므로 실시간 PCR 반응을 측정할 수 있다.Accordingly, it is possible to prevent air pockets from being created in the corners or edge areas of the well array 140. The air pocket expands or contracts due to temperature changes during the PCR process, causing errors in test results. However, according to the present invention, when the PCR solution is moved through pumping of a vacuum device and the solution fills the reaction space, the creation of air pockets is blocked at the corners or edge areas of the well array, which is the reaction space, so air pockets are not present in the PCR test results. It is possible to prevent errors from occurring in test results. Additionally, since the well array is located on the CMOS photosensor array, real-time PCR reactions can be measured.
이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르면, PCR 모듈의 웰 어레이에 시약이 내장된 상태로 출시되기 때문에, 시약을 셋팅하기 위한 별도의 절차가 불필요하여 오염가능성이 획기적으로 저하되고 검사 준비를 위한 별도의 절차가 필요하지 않다.As explained above, according to the present invention, since the reagent is released with the reagent built into the well array of the PCR module, a separate procedure for setting the reagent is not necessary, drastically reducing the possibility of contamination and No separate procedures are required.
또한 디지털 실시간 PCR의 경우, 반응 공간인 웰 어레이의 복수의 마이크로 웰의 크기가 매우 작고 그 숫자가 매우 많더라도 반응 공간들 각각에 시료를 투입하는 것이 가능하다. Additionally, in the case of digital real-time PCR, it is possible to inject a sample into each of the reaction spaces even if the size of the plurality of micro wells in the well array, which is the reaction space, is very small and the number is very large.
또한 시료가 웰 어레이의 코너나 에지 영역까지 주입되어, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 에어포켓이 생성되는 것이 방지되고, 시험결과의 신뢰성이 향상된다. Additionally, since the sample is injected to the corner or edge area of the well array, air pockets are prevented from being created in the corner or edge area of the well array, which is the reaction space, and the reliability of the test results is improved.
이하에서는, 상술된, 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 대해서 설명한다.Below, the digital real-time PCR analysis method of the present invention using the above-described cartridge for digital real-time PCR will be described.
도 22에 도시된 바와 같이, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,As shown in Figure 22, the digital real-time PCR analysis method of the present invention,
상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);A sample injection step (S10) of injecting the analysis target sample of the microfluidic chamber into each of the plurality of fractions;
상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);A raw data acquisition step (S20) of acquiring raw data by capturing a reaction image of the analysis target sample filled in the plurality of fractions in real time through the CMOS photosensor array;
상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);A Ct extraction step (S30) of extracting a plurality of Ct (cycle threshold) values for each of the plurality of fractions from the raw data;
상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및An individual fraction target number calculation step (S40) of calculating a plurality of target numbers for each of the plurality of fractions based on the plurality of Ct values; and
상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것일 수 있다.It may include a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
상기 시료 주입 단계(S10)에서, 상기 미소유체 챔버는 PDMS(polydimethylsiloxane) 소재로 마련되는 것일 수 있다. 복수의 분획은 상술된 복수의 마이크로 웰(142)에 대응할 수 있다. 즉, 하나의 분획은 하나의 마이크로 웰일 수 있다. 분석대상 시료는 상술된 액체시료일 수 있다. 상기 도 7 내지 도 21에 도시된 바와 같이, 상기 시료 주입 단계(S10)는 상술된 과정들을 거쳐 분석대상 시료는 복수의 분획에 주입될 수 있다. 이때, 엠프티웰 알고리즘을 통해 상기 복수의 분획에 분석대상 시료가 주입이 완료됨을 확인할 수 있다. 분석대상 시료가 도달함이 확인된 이후부터 획득된 이미지를 원시 데이터로서 활용될 수 있다.In the sample injection step (S10), the microfluidic chamber may be made of polydimethylsiloxane (PDMS) material. The plurality of fractions may correspond to the plurality of micro wells 142 described above. That is, one fraction may be one microwell. The sample to be analyzed may be the liquid sample described above. As shown in FIGS. 7 to 21, in the sample injection step (S10), the sample to be analyzed may be injected into a plurality of fractions through the above-described processes. At this time, it can be confirmed that the injection of the sample to be analyzed into the plurality of fractions has been completed through the Emptywell algorithm. Images obtained after it is confirmed that the sample to be analyzed have arrived can be used as raw data.
즉, 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)는 모든 상기 복수의 분획에 상기 분석대상 시료가 채워짐을 확인한 후 수행되고, 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 복수의 분획에 대한 이미지를 상기 원시 데이터로서 획득하는 것일 수 있다.That is, the raw data acquisition step (S20) is performed after confirming that all of the plurality of fractions are filled with the sample to be analyzed, and in the raw data acquisition step (S20), images for the plurality of fractions are converted into the raw data. It may be obtained as.
상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 원시 데이터는 적어도 사이클 당 1회 이상 수집되는 것일 수 있다. 사이클은 변성(Denaturation), 결합(Annealing), 신장(Elongation) 단계를 반복하기 위해 제공되는 온도컨트롤 시간 주기일 있다.In the raw data acquisition step (S20), the raw data may be collected at least once per cycle. A cycle is a temperature-controlled time period provided to repeat the denaturation, annealing, and elongation steps.
상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 컨투어(contour) 알고리즘를 통해 분획과 분획 간의 영역을 구분할 수 있다. 즉, 컨투어 알고리즘를 통해 마이크로 웰과 마이크로 웰 사이의 벽을 구분할 수 있다. In the raw data acquisition step (S20), the area between fractions can be distinguished through a contour algorithm. In other words, the wall between microwells can be distinguished through the contour algorithm.
상기 Ct 추출 단계(S30)에서, 복수의 분획 각각에 대한 이미지 영역의 색변수를 추출하여 형광 세기 값을 산출할 수 있다. 형광 세기 값은 시계열(사이클 수) 데이터로 획득될 수 있다. 즉, 복수의 분획 각각에 대한 형광 세기 값은 실시간 데이터로(사이클 주기마다) 획득될 수 있다. 색변수는 명도, 채도, 색상, 대비, 컬러 코드 중 적어도 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 분획 이미지를 보색 이미지로 가공하고, 각 픽셀에 대비 값을 부여하여 색변수로 추출할 수 있다. 다른 예를 들어, 각 픽셀의 채도 값을 색변수로 추출할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 각 픽셀에 명도 값, 채도 값, 색상 값, 대비 값을 추출하고 각 변수에 독립적인 가중치를 둔 선형 함수 값을 색변수로 추출할 수 있다.In the Ct extraction step (S30), the fluorescence intensity value can be calculated by extracting the color variable of the image area for each of the plurality of fractions. Fluorescence intensity values can be obtained as time series (cycle number) data. That is, the fluorescence intensity value for each of the plurality of fractions can be obtained as real-time data (every cycle period). A color variable may include at least one of brightness, saturation, hue, contrast, and color code. For example, a fractional image can be processed into a complementary color image, and a contrast value can be assigned to each pixel to extract it as a color variable. For another example, the saturation value of each pixel can be extracted as a color variable. As another example, the brightness value, saturation value, color value, and contrast value can be extracted from each pixel, and a linear function value with independent weights for each variable can be extracted as a color variable.
상기 Ct 추출 단계(S30)에서, 복수의 분획 각각에 대해서 형광 세기를 종속 변수로 하고, 시간(사이클 수)을 독립 변수로 하는 형광 세기 함수가 획득될 수 있다. 상기 형광 세기 함수는 원시 데이터로부터 추출되는 것일 수 있다. Ct 값은 형광 세기 함수를 시간(또는 사이클 수)으로 2차 미분한 값이 최대인 지점(시간 또는 사이클 수 값)일 수 있다. 형광 세기 함수는 피팅 함수일 수 있다.In the Ct extraction step (S30), a fluorescence intensity function with fluorescence intensity as a dependent variable and time (number of cycles) as an independent variable can be obtained for each of the plurality of fractions. The fluorescence intensity function may be extracted from raw data. The Ct value may be the point (time or cycle number value) at which the second derivative of the fluorescence intensity function with time (or cycle number) is maximum. The fluorescence intensity function may be a fitting function.
상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 타겟 수는 분석대상 시료에서의 타겟 유전자의 카피 수일 수 있다. 상기 복수 분획 각각에 대한 상기 복수의 타겟 수 각각은, 상기 수학식 1로 산출되는 것일 수 있다.In the target number calculation step (S40), the target number may be the copy number of the target gene in the sample to be analyzed. Each of the plurality of target numbers for each of the plurality of fractions may be calculated using Equation 1 above.
[수학식 1][Equation 1]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000004
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000004
,
Ni는 i번째 분획에서의 타겟 수이다.N i is the number of targets in the ith fraction.
Cti는 i번째 분획의 Ct 값이다.Ct i is the Ct value of the ith fraction.
Ctref는 Ct를 측정하기 위해 필요한 앰플리콘(amplicon) 수, 프로브의 형광 효율 중 적어도 하나 이상에 의해서 결정되는 것이다.Ct ref is determined by at least one of the number of amplicons required to measure Ct and the fluorescence efficiency of the probe.
a는 상수로서 PCR 효율에 의해서 결정되는 상수이다. PCR 효율은 PCR 반응에 의해 타겟 유전자가 증폭되는 비율을 나타내는 것일 수 있다. 예를 들어, PCR 효율 100%는 PCR 반응 사이클 마다 타겟이 2배씩 증폭되는 것을 의미하고, PCR 효율 90%는 PCR 반응 사이클 마다 타겟이 1.8배씩 증폭되는 것을 의미한다. a와 PCR 효율 Ep간 하기 수학식 4와 같을 수 있다.a is a constant determined by PCR efficiency. PCR efficiency may indicate the rate at which a target gene is amplified by a PCR reaction. For example, 100% PCR efficiency means that the target is amplified 2-fold for each PCR reaction cycle, and 90% PCR efficiency means that the target is amplified 1.8-fold for each PCR reaction cycle. The relationship between a and PCR efficiency Ep may be equivalent to Equation 4 below.
[수학식 4][Equation 4]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000005
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000005
,
일반적으로 PCR 효율은 90% 내지 110%로 설정될 수 있으며, 따라서 a는 -3.103 내지 -3.587일 수 있다.Typically, PCR efficiency can be set to 90% to 110%, so a can be -3.103 to -3.587.
상기의 수학식 1은 하기의 수학식 5로부터 도출되는 것일 수 있다. Equation 1 above may be derived from Equation 5 below.
[수학식 5][Equation 5]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000006
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000006
,
상기 수학식 5의 좌변은 상기 Ct 추출 단계(S30)에서 획득된 값일 수 있다.The left side of Equation 5 may be the value obtained in the Ct extraction step (S30).
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 표준 시료를 통해 Ctref의 값을 획득하여 종래에 분석이 불가능한 초고농도의 시료에 대해서도 분석이 가능할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention obtains the value of Ct ref through a standard sample, making it possible to analyze even ultra-high concentration samples that cannot be analyzed conventionally.
상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 상기 Ctref는 하기 수학식 2로 산출되는 것일 수 있다.In the target number calculation step (S40), the Ct ref may be calculated using Equation 2 below.
[수학식 2][Equation 2]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000007
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000007
,
Vunit는 한 분획의 부피이다. 예를 들어, 하나의 마이크로 웰의 용적을 의미할 수 있으며, 실질적으로는 복수의 마이크로 웰의 평균 용적일 수 있다.Vunit is the volume of one fraction. For example, it may mean the volume of one microwell, and may actually be the average volume of a plurality of microwells.
Ct0는 표준 시료로부터 획득되는 Ct값일 수 있다. 구체적으로, Ct0는 복수의 분획 전체에 최초 타겟 수가 1일 때 PCR 증폭하여 얻어지는 Ct 값이다. 예를 들어, 분획 수가 20,000이라면 20,000 X Vunit의 부피에 타겟 수가 1일 때 PCR 증폭하여 얻어지는 Ct 값일 수 있다. Ct0는 알려진 농도의 표준 시료를 단계 희석 후 측정하여 획득되는 값이다.Ct 0 may be a Ct value obtained from a standard sample. Specifically, Ct 0 is the Ct value obtained by PCR amplification when the initial target number in all of the plurality of fractions is 1. For example, if the number of fractions is 20,000, the Ct value may be obtained by PCR amplification when the number of targets is 1 in a volume of 20,000 Ct0 is a value obtained by measuring a standard sample of known concentration after serial dilution.
상기 표준 시료의 농도는 107 copies/rxn 내지 108 copies/rxn 인 것일 수 있다. 상기 표준 시료는 국제표준물질 및 자체제작표준물질일 수 있다. 예를 들어, 표준 시료는 WHO biological reference materials(WHO international standards and reference materials)일 수 있다.The concentration of the standard sample may be 10 7 copies/rxn to 10 8 copies/rxn. The standard sample may be an international standard material or a self-produced standard material. For example, standard samples may be WHO biological reference materials (WHO international standards and reference materials).
상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 분석대상 시료의 농도 Con은 하기 수학식 3으로 산출되는 것일 수 있다.In the final calculation step (S50), the concentration Con of the sample to be analyzed may be calculated using Equation 3 below.
[수학식 3][Equation 3]
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000008
,
Figure PCTKR2023015053-appb-img-000008
,
n은 상기 복수의 분획의 총 개수이다.n is the total number of the plurality of fractions.
상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 Con 값을 근거로 상기 분석대상 시료의 음성 또는 양성을 판단하는 것일 수 있다.In the final calculation step (S50), it may be determined whether the sample to be analyzed is negative or positive based on the Con value.
이상에서 본 발명에 따른 실시예들이 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 분야에서 통상적 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 범위의 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 다음의 특허청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.Although embodiments according to the present invention have been described above, they are merely illustrative, and those skilled in the art will understand that various modifications and equivalent scope of embodiments are possible therefrom. Therefore, the true technical protection scope of the present invention should be determined by the following patent claims.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 제공할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention can provide a digital real-time PCR analysis method capable of performing digital real-time PCR analysis on high- or low-concentration samples that exceed existing measurement limits, that is, samples with a wide concentration range.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 개별 분획에 대하여 실시간 그래프를 제공하는 디지털 PCR을 구현할 수 있고, 이를 통해 위양성 또는 위음성의 오류를 제거할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention can implement digital PCR that provides real-time graphs for individual fractions, thereby eliminating false positive or false negative errors.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 하나의 카트리지로 디지털 실시간 PCR을 수만 번 반복 평가하는 것과 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 각 단위 구획에서 측정된 값을 기반으로 각 단위 구획 내에 존재하는 타겟 수를 계산함으로써, 샘플내 초기 농도를 산출할 수 있다.The digital real-time PCR analysis method of the present invention can achieve the same effect as repeatedly evaluating digital real-time PCR tens of thousands of times with one cartridge, and calculates the number of targets present in each unit compartment based on the values measured in each unit compartment. By doing so, the initial concentration in the sample can be calculated.

Claims (11)

  1. 액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버;A microfluidic chamber in which a liquid sample to be analyzed is stored;
    상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및a well array attached to the bottom of the microfluidic chamber and receiving the sample to be analyzed from the microfluidic chamber; and
    상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 있어서,A digital real-time PCR analysis method using a digital real-time PCR cartridge that is located on the bottom of the well array and includes a CMOS photosensor array that captures in real time a reaction image of the sample to be analyzed filled in a plurality of fractions provided in the well array. In
    상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);A sample injection step (S10) of injecting the analysis target sample of the microfluidic chamber into each of the plurality of fractions;
    상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);A raw data acquisition step (S20) of acquiring raw data by capturing a reaction image of the analysis target sample filled in the plurality of fractions in real time through the CMOS photosensor array;
    상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);A Ct extraction step (S30) of extracting a plurality of Ct (cycle threshold) values for each of the plurality of fractions from the raw data;
    상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및An individual fraction target number calculation step (S40) of calculating a plurality of target numbers for each of the plurality of fractions based on the plurality of Ct values; and
    상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.A digital real-time PCR analysis method comprising a final calculation step (S50) of calculating the target concentration in the sample to be analyzed based on the plurality of target numbers.
  2. 제1항에 있어서,According to paragraph 1,
    상기 시료 주입 단계(S10)에서,In the sample injection step (S10),
    상기 미소유체 챔버는 PDMS(polydimethylsiloxane) 소재로 마련되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.A digital real-time PCR analysis method wherein the microfluidic chamber is made of PDMS (polydimethylsiloxane) material.
  3. 제1항에 있어서,According to paragraph 1,
    상기 시료 주입 단계(S10)에서,In the sample injection step (S10),
    상기 복수의 분획 각각에 상기 분석대상 시료가 주입되면 상기 웰 어레이를 상기 CMOS 포토센서 어레이에 완전히 밀착시키는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.A digital real-time PCR analysis method wherein when the sample to be analyzed is injected into each of the plurality of fractions, the well array is completely adhered to the CMOS photosensor array.
  4. 제3항에 있어서,According to paragraph 3,
    상기 원시 데이터 획득 단계(S20)는 모든 상기 복수의 분획에 상기 분석대상 시료가 채워짐을 확인한 후 수행되고,The raw data acquisition step (S20) is performed after confirming that all of the plurality of fractions are filled with the sample to be analyzed,
    상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 복수의 분획에 대한 이미지를 상기 원시 데이터로서 획득하는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.In the raw data acquisition step (S20), a digital real-time PCR analysis method of acquiring images of the plurality of fractions as the raw data.
  5. 제4항에 있어서,According to paragraph 4,
    상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서,In the raw data acquisition step (S20),
    상기 원시 데이터는 적어도 사이클 당 1회 이상 수집되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.Digital real-time PCR analysis method, wherein the raw data is collected at least once per cycle.
  6. 제4항에 있어서,According to paragraph 4,
    상기 Ct 추출 단계(S30)에서, In the Ct extraction step (S30),
    상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대해서 형광 세기를 종속 변수로 하고, 시간 또는 사이클 수를 독립 변수로 하는 형광 세기 함수가 획득되고,From the raw data, a fluorescence intensity function is obtained for each of the plurality of fractions, with fluorescence intensity as a dependent variable and time or cycle number as an independent variable,
    상기 Ct 값은 형광 세기 함수를 2차 미분한 값이 최대인 시간 또는 사이클 수 값인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.The Ct value is a digital real-time PCR analysis method in which the second derivative of the fluorescence intensity function is the time or cycle number value at which the value is maximum.
  7. 제6항에 있어서,According to clause 6,
    상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서,In the target number calculation step (S40),
    상기 복수 분획 각각에 대한 상기 복수의 타겟 수 각각은,Each of the plurality of target numbers for each of the plurality of fractions is:
    상기 수학식 1로 산출되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법:Digital real-time PCR analysis method calculated by Equation 1 above:
    [수학식 1][Equation 1]
    Figure PCTKR2023015053-appb-img-000009
    ,
    Figure PCTKR2023015053-appb-img-000009
    ,
    Ni는 i번째 분획에서의 타겟 수이고,N i is the number of targets in the ith fraction,
    Cti는 i번째 분획의 Ct 값이며,Ct i is the Ct value of the ith fraction,
    Ctref는 Ct를 측정하기 위해 필요한 앰플리콘(amplicon) 수, 프로브의 형광 효율 중 적어도 하나 이상에 의해서 결정되는 것이고,Ct ref is determined by at least one of the number of amplicons required to measure Ct and the fluorescence efficiency of the probe,
    a는 상수로서 PCR 효율에 의해서 결정되는 상수이다.a is a constant determined by PCR efficiency.
  8. 제7항에 있어서,In clause 7,
    상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서,In the target number calculation step (S40),
    상기 Ctref는 하기 수학식 2로 산출되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법:The Ct ref is a digital real-time PCR analysis method calculated by the following equation 2:
    [수학식 2][Equation 2]
    Figure PCTKR2023015053-appb-img-000010
    ,
    Figure PCTKR2023015053-appb-img-000010
    ,
    Vunit는 한 분획의 부피이고,V unit is the volume of one fraction,
    Ct0는 표준 시료로부터 획득되는 Ct값이다.Ct 0 is the Ct value obtained from the standard sample.
  9. 제8항에 있어서,According to clause 8,
    상기 표준 시료의 농도는 107 copies/rxn 내지 108 copies/rxn 인 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.A digital real-time PCR analysis method in which the concentration of the standard sample is 10 7 copies/rxn to 10 8 copies/rxn.
  10. 제7항에 있어서,In clause 7,
    상기 최종 산출 단계(S50)에서,In the final calculation step (S50),
    상기 분석대상 시료의 농도 Con은 하기 수학식 3으로 산출되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법:A digital real-time PCR analysis method in which the concentration Con of the sample to be analyzed is calculated using Equation 3 below:
    [수학식 3][Equation 3]
    Figure PCTKR2023015053-appb-img-000011
    ,
    Figure PCTKR2023015053-appb-img-000011
    ,
    n은 상기 복수의 분획의 총 개수이다.n is the total number of the plurality of fractions.
  11. 제10항에 있어서,According to clause 10,
    상기 최종 산출 단계(S50)에서,In the final calculation step (S50),
    상기 Con 값을 근거로 상기 분석대상 시료의 음성 또는 양성을 판단하는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.A digital real-time PCR analysis method that determines whether the sample to be analyzed is negative or positive based on the Con value.
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PHILIPJ. WILSON;STEPHENL.R. ELLISON: "Extending digital PCR analysis by modelling quantification cycle data", BMC BIOINFORMATICS, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON, UK, vol. 17, no. 1, 12 October 2016 (2016-10-12), London, UK , pages 1 - 10, XP021237535, DOI: 10.1186/s12859-016-1275-3 *

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