WO2024072079A1 - 이나보글리플로진을 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

이나보글리플로진을 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2024072079A1
WO2024072079A1 PCT/KR2023/014992 KR2023014992W WO2024072079A1 WO 2024072079 A1 WO2024072079 A1 WO 2024072079A1 KR 2023014992 W KR2023014992 W KR 2023014992W WO 2024072079 A1 WO2024072079 A1 WO 2024072079A1
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pharmaceutical composition
present
preventing
aging
cells
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PCT/KR2023/014992
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English (en)
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박선화
박준석
최지수
지혜영
옥민호
고주영
시와코티소우갓
비칼파다칼
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주식회사 대웅제약
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
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    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases containing inavogliflozin as an active ingredient.
  • Senescence is a complex form in which physiological and psychological environmental changes and behavioral changes that occur during the course of human life interact
  • vascular aging is a representative example of human aging.
  • vascular endothelium plays the most important role in regulating vascular homeostasis.
  • Cardiovascular aging diseases such as atherosclerosis rapidly increase due to endothelial dysfunction caused by aging of the vascular endothelium.
  • a strategy is needed to reduce the occurrence of cardiovascular diseases by suppressing the occurrence of vascular aging and the premature aging process induced by specific factors.
  • microplastics are formed by the gradual breakdown of plastic fragments into fine ( ⁇ 5 mm) or nano ( ⁇ 100 nm) particles as they are released into the environment and are ingested by other marine and freshwater organisms, fish, and birds and mammals, including humans. It has been reported that it can accumulate. There is a possibility that accumulation in the body due to exposure to microplastics may cause oxidative stress and affect growth, reproduction, movement, behavior, and aging (lifespan). However, the effects and mechanisms of long-term exposure to microplastics are currently unknown. .
  • SGLT Sodium-glucose co-transporter
  • SGLT-1 is mainly expressed in the small intestine, liver, kidney and heart
  • SGLT-2 is mainly expressed in the kidney.
  • SGLT-2 inhibitors are a new class of antidiabetic drugs that reduce glucose reabsorption in the proximal nephron and increase glucose excretion through mechanisms independent of insulin.
  • SGLT-2 inhibitors have been reported to reduce cardiovascular aging disease mortality and hospitalization rates independently of glycemic control, and non-clinical studies have shown high glucose and angiotensin II (angiotensin II) in endothelial cells, vascular aging and endothelial dysfunction. It was observed that the expression was increased by (main factors involved in).
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases, and as a result, enavogliflozin has been shown to prevent endothelial dysfunction caused by vascular endothelial aging and cardiovascular aging diseases related thereto.
  • the present invention was completed by confirming that it has excellent therapeutic effects.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases containing inavogliflozin as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cardiovascular aging disease, which includes administering to a subject in need of a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging disease containing inabogliflozin as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide the use of inavogliflozin for manufacturing a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases containing inavogliflozin as an active ingredient, and the prevention or treatment of cardiovascular aging diseases using the same.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is useful for preventing or treating cardiovascular aging diseases. It was confirmed that it was significantly superior to .
  • One aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases containing inavogliflozin as an active ingredient.
  • inavogliflozin is a SGLT-2 (Sodium-Glucose Cotransporter 2) inhibitor, which selectively inhibits SGLT-2, which is involved in the reabsorption of glucose in the kidney, to prevent glucose from being absorbed into the body. It is a drug that is excreted in urine.
  • SGLT-2 sodium-Glucose Cotransporter 2
  • inabogliflozin may have the structure of Formula 1 below.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of cardiovascular aging disease by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which cardiovascular aging disease is improved or beneficially altered by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • nanoplastic was used to induce vascular endothelial aging, and it was confirmed that inavogliflozin can prevent or treat endothelial dysfunction caused by vascular endothelial aging and related cardiovascular aging diseases. .
  • Nanoplastics refer to fine plastic pieces ( ⁇ 100 nm) created during the decomposition process of plastic products. It is reported that the accumulation of nanoplastics in the body causes oxidative stress and affects growth, reproduction, movement, movement, and aging (lifespan). In the following examples, nanoplastics penetrate porcine coronary artery endothelial cells and increase ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -Gal) activity, a histochemical marker of cellular aging, causing a decrease in endothelial cell proliferation, and a cellular aging marker.
  • SA- ⁇ -Gal ⁇ -galactosidase
  • SA- ⁇ -Gal is detected in aged retinal vessels, atherosclerotic plaques in the aorta and coronary arteries, and adipose tissue obtained from obese subjects, and p53 is reported to be increased in patients with congestive heart failure or hypertrophic cardiomyopathy ( YE Han & SY Kim, Endothelial senescence in vascular diseases: current understanding and future opportunities in senotherapeutics.Experimental & Molecular Medicine volume 55, pages1-12 (2023).Atherosclerosis of coronary arteries collected from autopsies of individuals with ischemic heart disease.
  • the vascular endothelial aging experiment using nanoplastics was merely adopted as an experimental model to show that inavogliflozin is effective in preventing or treating endothelial dysfunction caused by vascular endothelial aging. This is by no means limited to the prevention or treatment of cardiovascular aging diseases caused by nanoplastics.
  • cardiovascular aging disease is related to endothelial dysfunction caused by vascular endothelial aging, for example, hypertrophic obstructive cardiomyopathy, severe obstructive coronary artery disease, aortic stenosis, and hemodynamically significant aortic or mitral valve disease. It may be one or more types selected from the group consisting of stenosis, aortic aneurysm, coronary artery disease, peripheral artery disease, and carotid artery disease, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention is the prevention or treatment of cardiovascular aging disease, comprising administering a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging disease containing Enavogliflozin as an active ingredient to a subject in need thereof. It's a method.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient, inabogliflozin of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and may be formulated together with the carrier.
  • the term “pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate living organisms and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated as liquid solutions include those that are sterile and biocompatible, such as saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and One or more of these ingredients can be mixed and used, and other common additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents can be added as needed.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical composition may have a dosage form for oral administration such as tablets, capsules, etc.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a tablet.
  • the pharmaceutical composition may have a formulation for parenteral administration.
  • a formulation for parenteral administration containing the composition of the present invention as an active ingredient may be formulated for injection, such as subcutaneous injection, intravenous injection, or intramuscular injection.
  • the composition of the present invention can be mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, and the composition can be formulated for unit administration in ampoules or vials.
  • composition of the present invention may be formulated in various forms for parenteral administration, such as eye drops, microneedles, patches, and depots.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease, and the effective dose level is determined by the type of patient's disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, administration time, and route of administration. and discharge rate, duration of treatment, medications used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. That is, the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to the patient in a single dose, or by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time. . Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the optimal once-daily dosage of inavogliflozin identified during clinical trials is 0.1 mg to 0.5 mg.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition may be 0.1 mg to 0.5 mg.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered once to three times a day, for example, once a day, but is not limited thereto.
  • the dose of inabogliflozin that can be used for the prevention or treatment of cardiovascular aging diseases is not particularly limited and is appropriately adjusted depending on the severity of the disease, body weight, age, gender, and presence of other complications of the administration target. It can be.
  • the method of administering the pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases uses a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases, overlapping content between the two is omitted to avoid excessive description in the specification.
  • inavogliflozin used as an active ingredient in the present invention can be synthesized through known prior literature.
  • inavogliflozin may be crystalline or amorphous.
  • inavogliflozin is crystalline form A, which is reported to have the following It may be Form B, Form C, Form D, Form E or inavogliflozin amorphous.
  • Form A 2[ ⁇ selected from 6.2° ⁇ 0.2°, 7.2° ⁇ 0.2°, 8.8° ⁇ 0.2°, 17.6° ⁇ 0.2°, 19.0° ⁇ 0.2°, 22.5° ⁇ 0.2° and 25.1° ⁇ 0.2°
  • XRD X-ray diffraction
  • Form B 2[ ⁇ selected from 7.0° ⁇ 0.2°, 14.9° ⁇ 0.2°, 17.7° ⁇ 0.2°, 18.8° ⁇ 0.2°, 20.6° ⁇ 0.2°, 21.8° ⁇ 0.2° and 23.5° ⁇ 0.2°
  • XRD X-ray diffraction
  • Form C 2[ ⁇ selected from 5.6° ⁇ 0.2°, 7.3° ⁇ 0.2°, 15.7° ⁇ 0.2°, 17.2° ⁇ 0.2°, 18.9° ⁇ 0.2°, 21.2° ⁇ 0.2° and 21.9° ⁇ 0.2°
  • XRD X-ray diffraction
  • Form D 2[ ⁇ selected from 5.5° ⁇ 0.2°, 7.2° ⁇ 0.2°, 15.3° ⁇ 0.2°, 17.2° ⁇ 0.2°, 17.6° ⁇ 0.2°, 18.9° ⁇ 0.2° and 21.1° ⁇ 0.2°
  • XRD X-ray diffraction
  • Form E 4.93° ⁇ 0.2°, 6.12° ⁇ 0.2°, 7.43° ⁇ 0.2°, 8.89° ⁇ 0.2°, 9.74° ⁇ 0.2°, 14.79° ⁇ 0.2°, 15.79° ⁇ 0.2°, 16.11° ⁇ 0.2° , 19.79° ⁇ 0.2° and 22.83° ⁇ 0.2°
  • the crystalline forms A, B, C, D and E each have an It can be specified as
  • the pharmaceutical composition containing inavogliflozin according to the present invention may have the composition of the pharmaceutical composition of PCT/KR2022/014640.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, an excipient, a disintegrant, and a binder as an active ingredient, and the average particle size of the compound of Formula 1 is 15 um or less. It may be a composition.
  • the average particle size of inavogliflozin may be 15 um or less, preferably 10 um or less.
  • micronization of drug particle size is required, use a conventional mill that can micronize particles, such as a jet mill (Z-mill), hammer mill, ball mill, or fluid energy mill. It can be pulverized. Additionally, the particle size of the drug can be subdivided using a size classification method such as a sieve method or air current classification. Methods for controlling the desired particle size are well known in the art. See, for example, the following literature: [Pharmaceutical dosage forms: volume 2, 2nd edition, Ed.: H.A.Lieberman, L.Lachman, J.B.Schwartz (Chapter 3: SIZE REDUCTION)].
  • D This means that the particle diameter at the point where (calculated) is Y.
  • D(10) is the particle diameter at which 10% is accumulated by accumulating drug particle sizes in descending order
  • D(50) is the particle diameter at which 50% is accumulated by accumulating drug particle sizes in descending order
  • the diameter of D(90) expresses the particle diameter at 90% by accumulating the particle size of the drug in descending order.
  • the particle size distribution D(X) represents a percentage of total accumulated particles by number, volume, or weight depends on the method used to measure the particle size distribution. Methods for measuring particle size distribution and the types of percentages associated therewith are known in the art. For example, when measuring particle size distribution by the well-known laser diffraction method, the value of X in D(X) represents the percentage calculated by volume average. Those skilled in the art are well aware that the particle size distribution measurement results obtained by a particular method may be correlated with those obtained from other techniques based on experience through routine experiments. For example, laser diffraction is sensitive to the volume of the particle and provides volume average particle size, which corresponds to weight average particle size when density is constant.
  • the particle size distribution of drug particles can be measured using a commercially available device based on a laser diffraction/scattering method based on Mie theory.
  • measurement is performed using a commercially available device such as a Mastersizer laser diffraction device from Malvern Instruments.
  • a commercially available device such as a Mastersizer laser diffraction device from Malvern Instruments.
  • a helium-neon laser beam and a blue light-emitting diode are irradiated to particles, scattering occurs and a light scattering pattern appears on the detector, and the particle diameter distribution is obtained by analyzing this light scattering pattern according to Mie theory.
  • the measurement method can be either dry or wet.
  • the particle size of the drug was measured by volume average particle size using laser diffraction.
  • the compound of Formula 1 may be included in less than 1 part by weight based on 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition.
  • the optimal once-daily dosage of inavogliflozin identified during clinical trials is 0.1 mg to 0.5 mg.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition is 0.1 mg to 0.5 mg. It can be.
  • composition according to the present invention contains pharmaceutically acceptable additives in addition to the compound of Formula 1, which is an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes excipients, disintegrants, and binders as additives.
  • excipients examples include lactose (including hydrates), dextrin, mannitol, sorbitol, starch, microcrystalline cellulose (e.g., CelphereTM), silicified microcrystalline cellulose (e.g., ProSolveTM) ProsolvTM)], calcium phosphate hydrate, anhydrous calcium phosphate, calcium carbonate, sugars, or mixtures thereof.
  • the preferred excipient is microcrystalline cellulose.
  • disintegrants examples include crospovidone, croscarmellose sodium, sodium starch glycolate, and low-substituted hydroxypropylcellulose.
  • the preferred excipient is croscarmellose sodium.
  • binders examples include polyvinylpyrrolidone, povidone, gelatin, starch, sucrose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylalkylcellulose (e.g., hydroxypropylmethylcellulose) ), and mixtures thereof.
  • the preferred binder is hydroxypropylcellulose.
  • additives examples include lubricants, colorants, etc.
  • the lubricant includes stearic acid, stearate (e.g., magnesium stearate), light anhydrous silicic acid, talc, corn starch, carnauba wax, magnesium silicate, synthetic aluminum silicate, hydrogenated oil, pewter, titanium oxide, microcrystalline cellulose, macrogol 4000, and 6000, including isopropyl myristate, calcium hydrogen phosphate, and mixtures thereof.
  • stearic acid stearate (e.g., magnesium stearate), light anhydrous silicic acid, talc, corn starch, carnauba wax, magnesium silicate, synthetic aluminum silicate, hydrogenated oil, pewter, titanium oxide, microcrystalline cellulose, macrogol 4000, and 6000, including isopropyl myristate, calcium hydrogen phosphate, and mixtures thereof.
  • the excipient may be included in an amount of 80 to 95 parts by weight based on 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition.
  • the disintegrant may be included in an amount of 2 to 8 parts by weight based on 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition. If the disintegrant is less than 2 parts by weight compared to 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition, the dissolution rate may be delayed due to low initial disintegration power, which may affect Cmax in the body. In addition, if it exceeds 8 parts by weight compared to 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition, the overall flowability of the granules may decrease because the amount of disintegrant in the post-mixing part increases.
  • the binder may be included in an amount of 3 to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition. If the binder is less than 3 parts by weight based on 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition, it may be difficult to form and maintain suitable dry granules, which may affect the maintenance of homogeneous dispersibility of the main ingredient and the flowability of the granules due to the generation of fine powder. In addition, if the amount exceeds 10 parts by weight compared to 100 parts by weight of the total pharmaceutical composition, granules with strong binding force are formed, which affects the solubility of the initially disintegrated granule particles upon dissolution, which may also affect Cmax in the body.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be an immediate release preparation.
  • the pharmaceutical composition may have a dissolution rate of 50% or more, preferably 60% or more, of the total content of the active ingredient after 5 minutes.
  • the pharmaceutical composition may have a dissolution rate of 80% or more of the total content of the active ingredient after 15 minutes, preferably 80% or more.
  • the pharmaceutical composition may have a dissolution rate of 85% or more, preferably 90% or more, of the total content of the active ingredient after 30 minutes.
  • the dissolution rate of the active ingredient in the pharmaceutical composition affects the peak blood concentration (Cmax) and the area under the blood concentration-time curve (AUC) when administering the drug, conversely, the dissolution rate of the pharmaceutical composition must be adjusted to achieve appropriate Cmax and AUC. Adjustment is important. Because inavogliflozin has a Tmax of 1 to 2 hours, the drug absorption rate from the stomach is considered important.
  • the dissolution rate was measured under the conditions of dissolution 1.2 by the Korean Pharmacopoeia Dissolution Test Method 2 (paddle method). For specific conditions, refer to the experimental examples below.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • a pharmaceutical composition comprising granules mixed with pre-mixed granules and post-mixed granules containing the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the granules are prepared by mixing the pre-mixed granules and the post-mixed part.
  • the premixed granules may include the compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, excipients, binders, and lubricants.
  • the post-mixing portion may include excipients, disintegrants, and lubricants.
  • the pre-mixed granules and the post-mixed portion may each include excipients. More specifically, the pre-mixed granules and the post-mixed portion may each include microcrystalline cellulose as an excipient.
  • microcrystalline cellulose included in the pre-mixed granules and post-mixed portion affected the uniformity of drug content depending on its particle size and bulk density.
  • the particle size of microcrystalline cellulose in the premixed granules may be 130 um or less, preferably 60 um to 130 um.
  • the bulk density of microcrystalline cellulose in the premixed granules may be 0.26 to 0.33.
  • the particle size of microcrystalline cellulose in the premixed granules is 130 um or less, the content uniformity of the premixed granules, the content uniformity of the final granule, and the formulation all showed good levels, and the Carr's index value, which indicates the physical properties of the final granule, was also good. The flowability was also confirmed to be excellent.
  • the particle size of microcrystalline cellulose in the premixed granules exceeded 130 um, the content uniformity of the premixed granules and the content uniformity of the final granule both had large deviations and were not suitable, and the uniformity of the formulation was also found to be poor. .
  • the particle size of microcrystalline cellulose in the post-mixing unit may be 130 um or more, preferably 130 um to 250 um.
  • the bulk density of the excipient in the post-mixing section may be 0.28 to 0.37.
  • the particle size of the microcrystalline cellulose contained in the pre-mixed granules is small, whereas the particle size of the microcrystalline cellulose in the post-mixed part is smaller than that contained in the pre-mixed granules. It was found that it was desirable to have a relatively large particle size compared to the particle size of microcrystalline cellulose.
  • the weight ratio of the excipients in the premixed granules and the excipients in the postmixed portion may be 4:1 to 1:1.
  • the proportion of microcrystalline cellulose in the post-mixing part increases, the flowability of the granules becomes better, while the content deviation increases, so it was found that it is desirable to adjust the weight ratio within the above appropriate range.
  • the binder may be one or more selected from the group consisting of hydroxypropylcellulose, povidone, copovidone, and hypromellose.
  • the binder is hydroxypropyl cellulose, and the weight average molecular weight may be less than 200,000.
  • the weight average molecular weight may be less than 200,000.
  • the Carr's index of the granule is preferably 21 to 25.
  • the granules in the pharmaceutical composition of the present invention may be dry granules.
  • the granule may be a wet granule granule.
  • the pharmaceutical composition may have a dosage form for oral administration such as tablets, capsules, etc.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a tablet.
  • the pharmaceutical composition may include the compound of Formula 1 in a dose of 0.3 mg.
  • composition according to the present invention can be administered orally once a day, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular aging diseases containing inavogliflozin as an active ingredient.
  • Inavogliflozin of the present invention is used to treat endothelial dysfunction caused by vascular endothelial aging. It shows excellent effects in the prevention and treatment of cardiovascular and aging diseases related thereto.
  • Figure 1 is a diagram showing the spherical shape of nanoplastic (Nano plastic) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing zeta potential and hydrodynamic diameter according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the cytotoxicity results of nanoplastics according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the penetration of fluorescently tagged nanoplastics into cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram and graph showing the ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -Gal) activity of a coronary artery ring exposed to nanoplastic according to an embodiment of the present invention.
  • SA- ⁇ -Gal ⁇ -galactosidase
  • Figure 6 is a graph showing the improvement in cell proliferation according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram and a graph showing the expression of p53 and p21, which are cellular aging markers, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a diagram and graph showing the production index of ROS in a group exposed to nanoplastics according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a diagram and graph showing the expression of Nox2 and p22 phox , the membrane catalytic subunits of NADPH oxidase, by exposure to nanoplastics according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a graph showing vascular relaxation due to exposure to nanoplastics according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a diagram and graph showing eNOS protein expression in the nanoplastic exposure group according to an embodiment of the present invention.
  • the average particle size of the polystyrene nanoplastic used in the experiment was 25 nm, and the concentration was 10 mg/mL (dissolved in 10% DMSO (Dimethyl sulfoxide)).
  • the shape and structure of nanoplastics were measured using a super-resolution field emission scanning electron microscope (Regulus 8230; Hitachi High-tech, Japan), and the zeta potential distribution and hydrodynamic diameter were measured using a dynamic light scattering device (DLS (Dynamic light scattering) Zetasizer Nano).
  • DLS Dynamic light scattering
  • ZS90 Malvern Instruments, Malvern, UK
  • Pig coronary arteries were extracted, treated with collagenase for 20 minutes, and then centrifuged to obtain pig coronary artery endothelial cells.
  • the cells were cultured in DMEM (high-glucose; GenDEPOT) medium containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ug/mL).
  • DMEM high-glucose
  • GenDEPOT high-glucose
  • FBS penicillin
  • streptomycin 100 U/mL
  • fungizone 250 ug/mL
  • the cytotoxicity of nanoplastic was confirmed by distributing cells at 1 x 10 4 cells/well in a 96 well plate. Nanoplastics were treated at different concentrations (0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, and 100 ⁇ g/mL) and then cultured in a 96 well plate for 24 hours.
  • nanoplastics were treated in medium without serum (FBS) and then cultured for 24 hours. After treatment with MTT (0.1 mg/mL) for 4 hours, 200 ⁇ L DMSO was added to dissolve the formazan crystals. Next, the absorbance was measured at 540 nm (Enspire Multilabel Reader; Perkin Elmer Ltd.), and the results are shown in Figures 1 to 3.
  • the shape of the nanoplastic is spherical ( Figure 1), and the zeta potential and hydrodynamic diameter were confirmed to be -40.93 ⁇ 0.58 mV and 21.97 ⁇ 0.53 nm, respectively ( Figure 2).
  • Figure 1 the shape of the nanoplastic is spherical
  • Figure 2 the zeta potential and hydrodynamic diameter were confirmed to be -40.93 ⁇ 0.58 mV and 21.97 ⁇ 0.53 nm, respectively
  • the nanoplastics are not agglomerating in solution.
  • the cytotoxicity results of nanoplastics showed that no cytotoxicity was observed until 0.1 to 10 ⁇ g/mL was treated, but when treated with 30 ⁇ g/mL and 100 ⁇ g/mL, cell survival rates were 73.33% and 45.15%, respectively. Confirmed (Figure 3).
  • Pig coronary arteries were extracted, treated with collagenase for 20 minutes, and then centrifuged to obtain pig coronary artery endothelial cells.
  • the cells were cultured in DMEM (high-glucose; GenDEPOT) medium containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ug/mL). Cells were seeded at 1 The experiment was conducted separately. Fluorescently tagged nanoplastics were treated at 10 ug/mL.
  • SA- ⁇ -Gal ⁇ -galactosidase
  • Senescence-related ⁇ -galactosidase (SA- ⁇ -Gal) activity is a characteristic of senescent cells and is used as a histochemical marker for aging.
  • a porcine coronary artery was cut into 2 to 3 mm pieces to create a coronary artery ring.
  • the experiment was conducted by dividing the coronary artery rings into three groups: control, nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic 10 ⁇ g/mL+ inabogliflozin by concentration (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M). After culturing for 24 hours, the cells were fixed with 4% formaldehyde, treated with x-gal staining reagent, and reacted for one day.
  • Optimum cutting temperature (OCT) solution leica Biosystems
  • OCT Optimum cutting temperature
  • FIG. 5 the evaluation of ⁇ -galactosidase activity in endothelial cells derived from porcine coronary artery is as follows. Dispense coronary artery-derived endothelial cells at 5 ⁇ 10 4 cells/well in a 12 well plate, and control group, nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic + inabogliflozin by concentration (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M) ) The experiment was conducted by dividing into groups.
  • SA- ⁇ -Gal ⁇ -galactosidase activity increased in the coronary artery ring exposed to nanoplastics.
  • SA- ⁇ -Gal ⁇ -galactosidase activity was significantly decreased.
  • Cell cycle arrest is one of the main characteristics of cellular aging. It was confirmed whether inavogliflozin could reduce endothelial cell proliferation caused by exposure to nanoplastics, that is, improve cellular aging.
  • pig coronary arteries were extracted, treated with collagenase for 20 minutes, and then centrifuged to obtain pig coronary artery endothelial cells, and the cells were distributed at 1 x 10 4 cells/well in a 96-well plate.
  • the cell culture medium was DMEM containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ⁇ M), and cells were cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 .
  • the experiment was conducted by dividing into groups (Control), nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic + inavogliflozin by concentration (0.01, 0.1, and 1 uM), and cell proliferation efficacy was measured using CellTiter 96 Aqueos One Solution Cell Proliferation Assay. (Promega Corporation, USA) was measured using a kit. After processing the samples and culturing the cells for 24 hours, they were treated with MTS tetrazolium solution (20 ⁇ L/well) and reacted for 3 hours, and the absorbance was measured at 490 nm (Enspire Multilabel Reader; Perkin Elmer Ltd.). The results are shown in Figure 6.
  • cells were distributed at 1 x 10 5 cells/well in a 6 well plate.
  • the cell culture medium was DMEM containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ⁇ g/mL), and cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 °C. .
  • the samples were divided into groups (Control), nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic + inavogliflozin by concentration (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M), and the samples were treated with cells and cultured for 24 hours.
  • Oxidative stress was measured using DHE (dihyroethidium) and DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate).
  • porcine coronary artery endothelial cells were dispensed at 1 x 10 4 cells/well in a black 96 well plate. They were divided into groups (Control), nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic 10 ⁇ g/mL + inavogliflozin (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M by concentration), and the experiment was conducted.
  • the cell culture medium was DMEM containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ⁇ g/mL), and cells were cultured in a CO 2 incubator at 37°C. After 24 hours of incubation, the amount of reactive oxygen species (ROS) generated was measured by fluorescence absorbance (excitation/emission 485/535 nm).
  • ROS reactive oxygen species
  • OCT Optimum cutting temperature
  • NADPH oxidase in porcine coronary artery endothelial cells produces peroxide in endothelial cells, causing cellular senescence and causing dysfunction of endothelial cells.
  • Cellular oxidative stress was assessed by measuring the expression of Nox2 and p22phox, the membrane catalytic subunits of NAPDH oxidase.
  • cells were distributed at 1 x 10 5 cells/well in a 6 well plate.
  • the cell culture medium was DMEM containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ⁇ g/mL), and cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 °C. .
  • the samples were divided into groups (Control), nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic + inavogliflozin by concentration (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M), and the samples were treated with cells and cultured for 24 hours.
  • Vascular endothelial cells play an important role in maintaining vascular homeostasis, but aging is known to cause vascular dysfunction. Therefore, we evaluated the vascular reactivity of vascular endothelial cells to see whether inabogliflozin prevents vascular dysfunction caused by exposure to nanoplastics. Additionally, the competing substance empagliflozin was evaluated together to compare its effectiveness.
  • the left anterior descending branch coronary artery of the pig heart was excised and cut into rings of 2 to 3 mm in size.
  • Control group nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic 10 ⁇ g/mL + inavogliflozin group by concentration (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M), and nanoplastic 10 ⁇ g/mL + empagliflozin 1
  • the experiment was conducted by dividing into ⁇ M groups.
  • the coronary artery ring was placed in Krabs solution at 37°C in an organ chamber (95% O 2 , 5% CO 2 ) to measure changes in isometric tension.
  • each coronary ring was confirmed by constant isometric contraction at 5 g for 90 minutes and repeated contraction with up to 80 mM KCl. After washing for 30 minutes, the coronary artery ring was constricted to about 80% (maximum constriction rate) using thromboxane mimetic U46619, treated with bradykinin, and the relaxation rate of blood vessels was calculated for the concentration of bradykinin and the results were shown. It is shown as a graph in Figure 10.
  • Bradykinin is a biological substance.
  • the bradykinin receptor When activated, it activates eNOS (endothelial nitric oxide synthase), which releases NO (nitric oxide) and thus relaxes blood vessels.
  • eNOS endothelial nitric oxide synthase
  • bradykinin significantly increased vascular relaxation at concentrations above 0.3 nM compared to the group treated with nanoplastics alone.
  • bradykinin significantly increased vascular relaxation compared to the group treated with nanoplastics alone at a relatively high concentration of 30 nM or more compared to the group treated with nanoplastics alone.
  • inavogliflozin prevents endothelial dysfunction caused by exposure to nanoplastics, and that it has a better effect on improving vascular dysfunction than empagliflozin.
  • endothelial nitric oxide synthase eNOS
  • eNOS endothelial nitric oxide synthase
  • cells were distributed at 1 x 10 5 cells/well in a 6 well plate.
  • the cell culture medium was DMEM containing 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), and fungizone (250 ⁇ g/mL), and cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 °C. .
  • the samples were divided into groups (Control), nanoplastic 10 ⁇ g/mL, nanoplastic + inavogliflozin by concentration (0.01, 0.1, and 1 ⁇ M), and the samples were treated with cells and cultured for 24 hours.
  • the primary antibodies were reacted with eNOS (1:1,000) and beta-actin (1:1,000) at 4°C for 24 hours and then washed 3 to 5 times for 10 minutes with 1X TBS-T buffer.
  • the secondary antibody was reacted at a 1:20,000 ratio at room temperature for 1 hour and then washed 3 to 5 times for 10 minutes with 1X TBS-T buffer.
  • the protein band was confirmed with an Amersham imager 680 after treatment with ECL solution, and the results are shown in Figure 11.

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Abstract

본 발명은 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 이나보글리플로진은 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피 기능장애 (endothelial dysfunction) 및 이와 관련한 심혈관 노화 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

이나보글리플로진을 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
노화 (senescence)는 인간의 생의 과정에서 나타나는 생리적 및 심리적 환경적 변화와 행동의 변화가 상호작용하는 복합형태로서, 혈관노화는 인간 노화의 대표적인 예이다. 건강한 혈관에서 혈관내피세포 (vascular endothelium)는 혈관의 항상성을 조절하는 가장 중요한 역할을 수행한다. 죽상동맥경화증 등의 심혈관 노화 질환은 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피 기능장애 (endothelial dysfunction)에 의해 급격히 증가한다.
따라서, 심혈관 노화로 유발되는 질환의 예방 및 치료의 혁신적인 표적 도출을 위해서는 혈관노화 발생 및 특정인자들에 의해 유도되는 조기노화 과정을 억제하여, 심혈관질환 발생을 감소시키는 전략이 필요하다.
최근 발생하고 있는 미세먼지 및 미세플라스틱 등 환경오염 물질의 증가는 사회적 이슈로 크게 부각되었으며, 오염현상과 원인, 대책 등 다양한 측면에서 연구가 시도되고 있다. WHO 보고서에 따르면 미세먼지와 관련된 사망의 72%가 심혈관 노화 질환과 연관되어 있으며, 노인 및 기존 심혈관 노화 질환 환자의 상태를 매우 가속화시키는 것으로 보고되고 있다. 미세플라스틱은 플라스틱 조각이 환경으로 방출되면서 점차적으로 미세한 (≤5 mm) 또는 나노(≤100 nm) 입자로 분해됨으로써 형성되며, 다른 해양 및 담수 유기체, 물고기 및 인간을 포함한 조류 및 포유류에 의해 섭취되고 축적될 수 있다고 보고되고 있다. 미세플라스틱 노출에 따른 체내 축적이 산화스트레스를 유발하고 성장, 생식, 운동, 거동 및 노화 (수명)에 영향을 미칠 가능성이 대두되었으나, 현재까지 미세플라스틱의 장기 노출에 의한 영향 및 메커니즘은 알려져 있지 않다.
나트륨-포도당 공동수송체 (sodium-glucose co-transporter; 이하, SGLT)는 포도당 수송 단백질로서, SGLT-1은 소장, 간, 신장 및 심장에서, SGLT-2는 주로 신장에서 발현된다. SGLT-2 저해제는 새로운 종류의 항당뇨병 약물로서 근위 네프론에서 포도당 재흡수를 감소시켜 인슐린과 무관한 메커니즘을 통해 포도당 배설을 증가시킨다. 또한, SGLT-2 저해제는 혈당조절과는 독립적으로 심혈관 노화 질환 사망률 및 입원율을 감소시키는 것으로 보고된 바 있으며, 비임상 연구에서는 내피세포에서 높은 포도당 및 안지오텐신II (angiotensinII, 혈관노화 및 내피기능장애에 관여하는 주요요인)에 의해 발현이 증가됨을 관찰하였다.
이에, SGLT-2 저해제의 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료에 관한 관심이 높아지고 있다.
본 발명자들은 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 이나보글리플로진(enavogliflozin)이 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피 기능장애 (endothelial dysfunction) 및 이와 관련한 심혈관 노화 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가지고 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 투여가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 제조를 위한 이나보글리플로진의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 이를 이용한 심혈관 노화 질환의 예방 또는 치료에 관한 것으로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료에 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.
본 명세서 상 용어 "이나보글리플로진"은 SGLT-2 (Sodium-Glucose Cotransporter 2) 저해제로서, 신장에서 포도당의 재흡수에 관여하는 SGLT-2를 선택적으로 저해하여 포도당이 체내 흡수되지 않도록 하고 이를 소변으로 배출하는 약물이다.
본 발명에 있어서 "이나보글리플로진"은 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023014992-appb-img-000001
본 명세서 상 용어 "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 심혈관 노화 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서 상 용어 "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 심혈관 노화 질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
하기 실시예에서는 나노 플라스틱 (Nano plastic)를 이용하여 혈관내피 노화를 유도하고, 이나보글리플로진이 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피기능 장애 및 이와 관련한 심혈관 노화 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.
나노 플라스틱은 플라스틱 제품이 분해되는 과정에서 생긴 미세한 플라스틱 조각(≤100 nm)을 의미한다. 나노 플라스틱의 체내 축적은 산화스트레스를 유발하고 성장, 생식, 운동, 거동 및 노화(수명)에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 하기 실시예에서는 나노 플라스틱이 돼지 관상동맥 내피세포에 침투하여 세포 노화의 조직화학적 마커인 β-galactosidase (SA-β-Gal) 활성을 증가시키고, 내피세포 증식의 감소를 야기하며, 세포노화 마커인 p53 및 p21의 발현을 증가시키고, 내피세포에서 과산화물을 생성하여 세포노화를 유발하고 내피세포 기능의 장애를 유발하는 것으로 알려진 NADPH 산화효소의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 나노 플라스틱의 축적이 혈관내피 노화 및 이에 의해 발생되는 내피 기능장애(endothelial dysfunction)를 유발함을 보여준다. 내피세포 내 p53 및 p21이 증가하면 세포노화가 일어나며, 심장 기능 저하로 이어지는 것은 잘 알려져 있다. 혈관 기능 저하가 일어나는 것은 이러한 노화세포가 축적되었기 때문이며, 이는 죽상경화증 질환(대동맥류, 관상동맥 질환, 말초동맥 질환, 경동맥 질환)을 야기하는 것으로 보고되어 있다 (G. Katsuumi et al., Vascular Senescence in Cardiovascular and Metabolic Diseases Front Cardiovasc Med. 2018; 5: 18.). 세포 노화는 혈관 항상성을 유지하는데에 내피가 수행하는 필수 역할을 손상시켜 내피 기능장애 및 노화 관련 혈관 질환의 발병을 촉진한다. SA-β-Gal은 노화된 망막혈관, 대동맥 및 관상동맥의 죽상동맥경화반, 비만인 대상에서 얻은 지방조직에서 검출되며, p53 증가는 울혈성 심부전 또는 비대성 심근병증 환자에서 증가되는 것으로 보고되어있다 (YE Han & SY Kim, Endothelial senescence in vascular diseases: current understanding and future opportunities in senotherapeutics. Experimental & Molecular Medicine volume 55, pages1-12 (2023). 허혈성 심장 질환이 있는 개인을 부검하여 채취한 관상 동맥의 죽상동맥경화성 병변에서 강한 SA-β-Gal 염색이 관찰되었으며, anti-factor VIII 항체를 사용한 면역조직화학적 분석 시 SA-β-Gal 염색된 세포가 혈관 내피 세포임을 입증하였다. 혈관 내피 세포 노화는 죽상경화증과 관련된 ICAM-1 발현을 증가시키고 eNOS 활성을 감소시켰다. (T. Minamino et al., Endothelial cell senescence in human atherosclerosis: role of telomere in endothelial dysfunction. Circulation. 2002 Apr 2;105(13):1541-4.). 또한, 죽상동맥경화증 질환 모델로 2-12주 간 고지방식이에 노출시킨 LDLR-/- (low-density lipoprotein receptor-/-) 마우스에서 대동맥 내피세포의 SA-β-Gal 염색하였을 때 SA-β-Gal 활성이 증가하였고, p53 발현이 증가되었다. 대동맥의 외부 curvature (undisturbed flow)와 내부 curvature (disturbed flow)로 비교하였을 때 노화된 내피세포가 동맥경화 과정에서 내부 curvature에 축적된다는 것을 확인하였고, p53- p21 신호전달 경로를 통해 내피세포의 노화를 유도한다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 내피세포의 노화가 죽상동맥경화증의 시작 및 진행에 관여할 수 있음을 나타낸다(C. M. Warboys et al., Disturbed Flow Promotes Endothelial Senescence via a p53-Dependent Pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34:985-995). 노화된 혈관 세포가 인간 죽종 조직에 축적되어 다양한 기능 장애의 특징을 나타내며, 세포 노화가 인간 죽상경화증의 발병에 기여할 수 있다고 보고되어있다. 단핵구와 혈관 내피 세포 사이의 상호작용은 내피세포 노화에 의해 강화되며, 죽상경화증도 촉진될 수 있음이 제시되고 있다 (T. Minamino et al., Vascular Cell Senescence. Circulation Research. 2007;100:15-26).
본 발명에 있어서, 나노 플라스틱을 이용한 혈관내피 노화 실험은 이나보글리플로진이 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피 기능장애의 예방 또는 치료하는데 효과가 있음을 보이기 위한 실험 모델로서 채택된 것일 뿐, 본 발명이 나노 플라스틱에 의해 발병되는 심혈관 노화 질환의 예방 또는 치료에 한정되는 것은 결코 아니다.
본 발명에 있어서, 심혈관 노화 질환은 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피 기능장애와 관련된 것으로, 예를 들어, 비후성 폐쇄성 심근병증, 중증 폐쇄성 관상동맥 질환, 대동맥 협착, 혈역학적으로 의미있는 대동맥 판막 또는 승모판 협착증, 대동맥류, 관상동맥 질환, 말초동맥 질환 및 경동맥 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태는 이나보글리플로진 (Enavogliflozin)을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 이의 투여를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분인 화학식 1의 이나보글리플로진 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 외에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 정제, 캡슐제 등과 같은 경구 투여를 위한 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 정제의 제형을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제형을 가질 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태로 제제화할 수 있다.
주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
다르게는 본 발명의 조성물은 예를 들어, 점안제, 마이크로니들, 패치제, 데포제 등 다양한 형태의 비경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
임상 시험 과정에서 파악된 이나보글리플로진의 적정 1일 1회 투약 용량은 0.1 mg 내지 0.5 mg이다.
상기 약학 조성물이 단위 투여 제형으로 제제화될 경우 약학 조성물 내 유효성분의 함량은 0.1 mg 내지 0.5 mg일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회, 예를 들어, 1일 1회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 심혈관 노화 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있는 이나보글리플로진의 용량은 특별히 제한되지 않으며, 투여 대상의 질환의 중증도, 체중, 연령, 성별 및 기타 합병증의 유무 등에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 투여방법은 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 사용하므로 이 둘 사이에 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 발명에서 유효성분으로 사용되는 이나보글리플로진은 공지된 선행문헌들을 통해 합성할 수 있다. 본 발명에 있어서, 이나보글리플로진은 결정형 또는 무정형일 수 있다. 예를 들어, 이나보글리플로진은 대한민국 공개특허공보 제2017-0142904호 또는 대한민국 특허출원 제2022-0123673호를 통하여 다음과 같은 X설 회절 스펙트럼을 갖는 것으로 보고된 이나보글리플로진 결정형 A, 결정형 B, 결정형 C, 결정형 D, 결정형 E 또는 이나보글리플로진 무정형일 수 있다.
결정형 A: 6.2°±0.2°, 7.2°±0.2°, 8.8°±0.2°, 17.6°±0.2°, 19.0°±0.2°, 22.5°±0.2° 및 25.1°±0.2°로부터 선택되는 2[θ]값에서의 피크들을 포함하는 X-선 회절(XRD) 스펙트럼을 갖는 결정형
결정형 B: 7.0°±0.2°, 14.9°±0.2°, 17.7°±0.2°, 18.8°±0.2°, 20.6°±0.2°, 21.8°±0.2° 및 23.5°±0.2°로부터 선택되는 2[θ]값에서의 피크들을 포함하는 X-선 회절(XRD) 스펙트럼을 갖는 결정형
결정형 C: 5.6°±0.2°, 7.3°±0.2°, 15.7°±0.2°, 17.2°±0.2°, 18.9°±0.2°, 21.2°±0.2° 및 21.9°±0.2° 로부터 선택되는 2[θ]값에서의 피크들을 포함하는 X-선 회절(XRD) 스펙트럼을 갖는 결정형
결정형 D: 5.5°±0.2°, 7.2°±0.2°, 15.3°±0.2°, 17.2°±0.2°, 17.6°±0.2°, 18.9°±0.2° 및 21.1°±0.2° 로부터 선택되는 2[θ]값에서의 피크들을 포함하는 X-선 회절(XRD) 스펙트럼을 갖는 결정형
결정형 E: 4.93°±0.2°, 6.12°±0.2°, 7.43°± 0.2°, 8.89°± 0.2°, 9.74°± 0.2°, 14.79°± 0.2°, 15.79°± 0.2°, 16.11°± 0.2°, 19.79°± 0.2° 및 22.83°±0.2°
상기 결정형 A, B, C, D 및 E는 각각 상기 제시된 2[θ]값에서 4개 이상, 예컨대, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 피크를 가지는 X-선 회절 스펙트럼으로 특정 가능하다.
이에 제한되는 것은 아니나 본 발명에 따른 이나보글리플로진을 포함하는 약학 조성물은 PCT/KR2022/014640호의 약학 조성물의 구성을 가질 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 부형제, 붕해제, 및 결합제를 포함하고, 상기 화학식 1의 화합물의 평균 입도는 15 um 이하인 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 이나보글리플로진의 평균 입도는 15 um 이하, 바람직하게는 10 um 이하일 수 있다.
이나보글리플로진의 평균 입도가 15 um를 초과하는 경우, 5분 용출률이 이나보글리플로진의 총 함량의 40 % 미만으로 매우 낮고, 30분 용출률도 80 % 미만으로 최종 용출률이 부적합한 것으로 파악되었다.
약물 입도의 미분화가 필요한 경우, 제트 밀(Z-mill), 해머 밀(hammer mill), 볼 밀(ball mill), 플루이드 에너지 밀(fluid energy mill) 등 입자를 미분화할 수 있는 통상의 밀을 사용하여 분쇄할 수 있다. 또한, 체(sieve)를 사용하여 수행되는 체과법 또는 기류 분급(air current classification) 등의 분급법(size classification method)이 사용하여 약물의 입도를 세분화할 수 있다. 원하는 입도의 조절 방법에 대해서는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예컨대, 하기 문헌 참조: [Pharmaceutical dosage forms: volume 2, 2nd edition, Ed.: H.A.Lieberman, L.Lachman, J.B.Schwartz (Chapter 3: SIZE REDUCTION)].
본 명세서에서 약물의 입도는 D(X) = Y (여기에서 X 및 Y는 양의 숫자임)와 같은 입도 분포(particle size distribution)를 기준으로 표현된다. D(X) = Y는 제제 내 어떤 약물의 입자 지름을 측정하여 얻어지는 약물의 입도 분포를 누적곡선에 의해 나타낼 때, 입도가 작은 순으로 누적하여 X % (%는 수, 부피 또는 중량을 기준으로 계산됨)가 되는 지점의 입자 지름이 Y 임을 의미한다. 예를 들어, D(10)은 약물의 입도를 작은 순으로 누적하여 10 %가 되는 지점의 입자의 지름을, D(50)은 약물의 입도를 작은 순으로 누적하여 50 %가 되는 지점의 입자의 지름을, D(90)은 약물의 입도를 작은 순으로 누적하여 90 %가 되는 지점의 입자의 지름을 표현한다.
입도 분포 D(X)가 수, 부피, 또는 중량 중 어떠한 것을 기준으로 전체 누적 입자 중의 퍼센트를 나타내는지는 입도 분포를 측정하는데 사용하는 방법에 따라 달라진다. 입도 분포를 측정하는 방법과 이와 관련한 %의 유형은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 잘 알려진 레이저 회절법에 의해 입도 분포를 측정하는 경우, D(X) 중 X 값은 부피 평균에 의해 계산된 퍼센트를 나타낸다. 특정 방법에 의해 얻어진 입도 분포 측정 결과는 통상적인 실험에 의해 경험을 바탕으로 하여 다른 기술로부터 얻은 것과 상관관계에 있을 수 있음을 당업자는 잘 알고 있다. 예를 들어, 레이저 회절법은 입자의 부피에 감응하여 부피 평균 입도를 제공하는데, 이는 밀도가 일정한 경우 중량 평균 입도에 상당한다.
본 발명에서 약물 입자의 입도 분포의 측정은 Mie 이론에 의거한 레이저 회절ㆍ산란법에 의거하여 시판의 장치를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, Malvern Instruments사의 Mastersizer 레이저 회절 장치 등의 시판의 장치를 이용하여 측정한다. 이 장치는 헬륨-네온 레이저빔 및 청색 발광 다이오드를 입자에 조사하면 산란이 일어나 디텍터에 광 산란 패턴이 나타나고, 이 광 산란 패턴을 Mie 이론에 따라 해석함으로써 입자 지름 분포를 구하는 것이다. 측정법은 건식 및 습식법 중 어느 것이라도 가능하다.
참고로, 본 발명의 실시예에서는 레이저 회절법에 의한 부피평균입도에 의해 약물의 입도를 측정하였다.
본 발명의 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 1 중량부 미만으로 포함될 수 있다.
임상 시험 과정에서 파악된 이나보글리플로진의 적정 1일 1회 투약 용량은 0.1 mg 내지 0.5 mg로서, 상기 약학 조성물이 단위 투여 제형으로 제제화될 경우 약학 조성물 내 유효성분의 함량은 0.1 mg 내지 0.5mg일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분인 화학식 1의 화합물 외에 약제학적으로 허용되는 첨가제들을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 첨가제로서 부형제, 붕해제, 및 결합제 등을 포함한다.
부형제의 예로는 락토오스(수화물을 포함), 덱스트린, 만니톨, 소르비톨, 전분, 미결정셀룰로오스[예를 들어, 셀피어TM(CelphereTM)], 규화 미결정셀룰로오스[silicified microcrystalline cellulose, 예를 들어, 프로솔브TM(ProsolvTM)], 인산칼슘수화물, 무수인산칼슘, 탄산칼슘, 당류, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 구체에에서, 바람직한 부형제는 미결정셀룰로오스이다.
붕해제의 예로는 크로스포비돈, 크로스카르멜로오스나트륨, 전분글리콜산나트륨, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스를 포함한다. 본 발명의 구체에에서, 바람직한 부형제는 크로스카르멜로스나트륨이다.
결합제의 예로는 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 젤라틴, 전분, 슈크로즈, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필알킬셀룰로오스(예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로오스), 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 바람직한 결합제는 히드록시프로필셀룰로오스이다.
그 외 첨가제의 예로, 활택제, 착색제 등이 포함된다.
상기 활택제는 스테아린산, 스테아린산염(예를 들어 스테아린산 마그네슘), 경질무수규산, 탈크, 옥수수전분, 카나우바왁스, 규산마그네슘, 합성규산알루미늄, 경화유, 백납, 산화티탄, 미결정셀룰로오스, 마크로골 4000 및 6000, 미리스틴산이소프로필, 인산수소칼슘 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 부형제는 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 80 내지 95 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 붕해제는 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 2 내지 8 중량부로 포함될 수 있다. 붕해제가 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 2 중량부 미만일 경우 초반 붕해력이 낮아 용출율 지연될 수 있고, 이는 체내 Cmax 에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 8 중량부를 초과할 경우, 후혼합부의 붕해제 양이 많아지기 때문에 과립의 전체적인 흐름성이 저하될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 결합제는 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 3 내지 10 중량부로 포함될 수 있다. 결합제가 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 3 중량부 미만일 경우 적합한 건식 과립의 형성 및 유지가 어려울 수 있고, 이는 주성분의 균질한 분산성 유지와 미분 발생에 따른 과립 흐름성 등에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 전체 약학 조성물 100 중량부 대비 10 중량부를 초과할 경우, 강한 결합력을 가진 과립물이 형성되고 이는 용출 시 초반 붕해된 과립 입자들의 용해도에 영향을 미치고 이는 체내 Cmax에도 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 즉시방출형 제제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 5분 후 용출률이 유효성분의 총 함량의 50 %이상, 바람직하게는 60 % 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 15분 후 용출률이 유효성분의 총 함량의 80 %이상, 바람직하게는 80 % 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 30분 후 용출률이 유효성분의 총 함량의 85 %이상, 바람직하게는 90 % 이상일 수 있다.
약학 조성물 내 유효성분의 용출률은 약물 투약시 최고혈중농도(Cmax)와 혈중농도-시간곡선하면적(AUC)에 영향을 미치기 때문에, 역으로 말하면 적정한 Cmax와 AUC를 구현하기 위해 약학 조성물의 용출률을 조정하는 것은 중요하다. 이나보글리플로진은 1~2시간의 Tmax를 가지기 때문에 위에서의 약물 흡수율이 중요하다고 판단된다. 상기 용출률은 대한약전 용출시험 제2법 (패들법)에 의해 용출액 1.2의 조건 하에서의 측정된 것이다. 구체적인 조건은 하기 실험예를 참고할 수 있다.
본 발명은 또한
화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 전혼합 과립 및 후혼합부가 혼합된 과립물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 화학식 1의 화합물의 제제화 연구 과정에서, 과립물을 제조하여 이를 정제 등으로 제형화하는 것이 약물의 함량 균일성, 제제균일성 측면에서 유리함을 확인하였다.
상기 약학 조성물에서 상기 과립물은 전혼합 과립과 후혼합부를 혼합하여 제조된다.
상기 전혼합 과립은 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 부형제, 결합제 및 활택제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 후혼합부는 부형제, 붕해제 및 활택제를 포함할 수 있다.
부형제, 결합제, 붕해제, 활택제 등에 대한 설명은 상술한 내용과 동일하므로 중복기재를 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 전혼합 과립 및 후혼합부는 각각 부형제를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 전혼합 과립 및 후혼합부는 각각 부형제로서 미결정셀룰로오스를 포함할 수 있다.
하기 실시예에 따르면, 상기 전혼합 과립 및 후혼합부에 포함되는 미결정셀룰로오스는 그 입도 및 부피밀도에 따라 약물의 함량 균일성에 영향을 미치는 것으로 파악되었다.
본 발명의 구체예에서, 상기 전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스의 입도는 130 um 이하, 바람직하게는 60 um 내지 130 um일 수 있다. 상기 전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스의 부피밀도는 0.26 내지 0.33일 수 있다. 전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스의 입도 및 부피밀도가 위와 같은 조건일 때 함량 균일성의 편차(SD)가 낮은 제제를 확보할 수 있다. 전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스의 입도는 130 um 이하인 경우엔 전혼합부 과립의 함량균일성과 최종 과립의 함량 균일성, 제제 모두 양호한 수준을 나타냈고 최종과립의 물성을 나태내는 Carr's index 값 또한 양호하여 제제의 흐름성 또한 우수한 것으로 확인되었다. 반면, 전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스의 입도가 130 um를 초과하는 경우, 전혼합부 과립의 함량 균일성 및 최종 과립의 함량 균일성 모두 편차가 커져 적합하지 않았으며, 제제 균일성 또한 좋지 않은 것으로 나타났다.
한편, 상기 후혼합부 내 미결정셀룰로오스의 입도는 130um 이상, 바람직하게는 130 um 내지 250 um일 수 있다. 상기 후혼합부 내 부형제의 부피밀도는 0.28 내지 0.37일 수 있다. 후혼합부 내 미결정셀룰로오스의 입도는 130 um 미만인 경우, 최종과립의 물성을 나태내는 Carr's index 값이 적절하지 않았으며, 과립 흐름성이 취약해짐을 확인할 수 있었다.
전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스와 후혼합부 내 미결정셀룰로오스를 상대적으로 비교해 보면, 전혼합 과립 내 포함되는 미결정셀룰로오스의 입도가 작은 것이 바람직한 것과 달리, 후혼합부의 미결정셀룰로오스의 입도는 전혼합 과립 내 포함되는 미결정셀룰로오스의 입도에 비해 상대적으로 큰 것이 바람직한 것으로 나타났다.
하기 실시예에 따르면, 전혼합 과립 내 미결정셀룰로오스와 후혼합부 내 미결정셀룰로오스의 입도뿐만 아니라, 전혼합 과립 내 부형제 및 후혼합부 내 부형제의 중량비 또한 약물의 함량 균일성에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
본 발명의 구체예에서, 상기 전혼합 과립 내 부형제 및 후혼합부 내 부형제의 중량비는 4:1 내지 1:1일 수 있다. 후혼합부의 미결정셀룰로오스의 비율이 높아질 수록 과립의 흐름성은 우수해지는 반면 함량 편차는 높아져, 상기 적정 범위의 중량비를 맞추는 것이 바람직한 것으로 파악되었다.
한편, 본 발명에 따른 약학 조성물에서 상기 결합제는 히드록시프로필셀룰로오스, 포비돈, 코포비돈 및 히프로멜로오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합제는 히드록시프로필셀룰로오스이고, 중량평균분자량이 200,000 미만일 수 있다. 중량평균분자량이 200,000 이상의 히드록시프로필셀룰로오스를 사용하게 되면 5분 용출률과 30분 용출률이 모두 낮아 생체이용률 측면에서 바람직하지 않다.
한편, 제제화에 있어서 흐름성의 척도로 사용되는 Carr's index와 관련하여, 상기 과립물의 Carr's index는 21 내지 25인 것이 바람직하다.
이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 약학 조성물에서 상기 과립물은 건식과립물일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 과립물은 습식 과립 과립물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 정제, 캡슐제 등과 같은 경구 투여를 위한 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 정제의 제형을 갖는 것일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 화학식 1의 화합물을 0.3 mg의 용량으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 1일 1회 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 이나보글리플로진을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 이나보글리플로진은 혈관내피 노화에 의해 발생되는 내피 기능장애 (endothelial dysfunction) 및 이와 관련한 심혈관 노화 질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱 (Nano plastic)의 구형 형태를 보여주는 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제타전위 및 유체역학적 직경을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱의 세포독성 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 태그가 붙은 나노 플라스틱의 세포 내로 침투를 보여주는 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱에 노출된 관상동맥 링의 β-galactosidase (SA-β-Gal) 활성을 보여주는 도 및 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포증식 개선도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포노화 마커인 p53 및 p21의 발현을 보여주는 도 및 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱에 노출된 그룹에서의 ROS의 생성 지표를 보여주는 도 및 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱 노출에 의한 NADPH 산화효소의 막 촉매 소단위인 Nox2와 p22phox의 발현을 보여주는 도 및 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱 노출에 의한 혈관 이완도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 플라스틱 노출 그룹에서의 eNOS 단백질 발현을 보여주는 도 및 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나노 플라스틱의 물리화학적 특징
실험에 사용된 폴리스틸렌 나노 플라스틱의 입자 크기는 평균 25 nm이며, 농도는 10 mg/mL (10% DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 용해)이다. 나노 플라스틱의 모양 및 구조는 초고해상도 전계방사형 주사전자현미경 (Regulus 8230; Hitachi High-tech, Japan)으로 측정하였으며, 제타전위분포 및 유체역학적 직경은 동적 광 산란 장치 (DLS (Dynamic light scattering) Zetasizer Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, UK)를 이용하였다.
실시예 2. 나노 플라스틱의 세포독성 및 세포내 침투 평가
2-1. 나노 플라스틱의 세포 독성
돼지 관상동맥을 적출한 후 콜라게네이즈를 20분간 처리 후 원심분리를 통해 돼지 관상동맥 내피 세포를 얻었다. 그 다음, 10% FBS, Penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 U/mL), fungizone (250 ug/mL)이 포함된 DMEM (high-glucose; GenDEPOT) 배양액에서 배양하였다. 96 웰 플레이트에 1 x 104 cells/well로 세포를 분주하여 나노 플라스틱의 세포 독성을 확인하였다. 나노 플라스틱을 농도별 (0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100 μg/mL)로 처리한 후, 96 well plate에서 24시간 동안 배양하였다. 나노 플라스틱은 혈청(FBS)에 의해 흡수가 방해받기 때문에 혈청 (FBS)이 들어가지 않은 배지에서 나노 플라스틱을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. MTT (0.1 mg/mL)를 4시간 동안 처리 후, 포르마잔 크리스탈을 녹이기 위해 200 μL DMSO를 처리하였다. 그 다음, 540 nm에서 흡광도를 측정 (Enspire Multilabel Reader; Perkin Elmer Ltd.)하여 그 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 1 내지 3에서 확인할 수 있듯이, 나노 플라스틱의 형태는 구형이며 (도 1), 제타전위와 유체역학적 직경이 각각 -40.93 ± 0.58 mV, 21.97 ± 0.53 nm로 확인되었다 (도 2). 이는 나노 플라스틱이 용액에서 응집하지 않고 있음을 의미한다. 또한, 나노 플라스틱의 세포독성 결과는 0.1 내지 10 μg/mL 처리까지는 세포 독성이 보이지 않았으나, 30 μg/mL 및 100 μg/mL 처리시에서는 세포 생존율이 각각 73.33%, 45.15%로 세포 독성이 나타남을 확인하였다 (도 3).
2-2. 나노 플라스틱의 세포 내 침투
나노 플라스틱의 세포 내 침투를 확인하기 위해 물리화학적 특성을 확인하였다. 돼지 관상동맥을 적출한 후 콜라게네이즈를 20분간 처리 후 원심분리를 통해 돼지 관상동맥 내피 세포를 얻었다. 그 다음, 10% FBS, Penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 U/mL), fungizone (250 ug/mL)이 포함된 DMEM (high-glucose; GenDEPOT) 배양액에서 배양하였다. 2-well Lab-Tek Chamber side (Thermo Scientific, USA)에 1 x 105 cells/well로 세포를 분주하였으며, 대조군 (control) 및 형광 태그가 붙은 나노 플라스틱 (Life Technologies Corporaion, Eugene, Oregon) 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 형광 태그가 붙은 나노 플라스틱은 10 ug/mL로 처리하였다. 24시간 배양 후, PBS (Phospahe buffered saline)로 세포를 세척하고, 4% 포름알데하이드로 15분간 고정시킨 후 DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole, 10 μM)로 세포를 염색하였다. 나노 플라스틱의 세포 내 침투 여부는 공초점 현미경 (ZEISS LSN980 confocal microscope)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 형광 태그가 붙은 나노 플라스틱이 세포 내로 침투되는 것을 확인하였다.
실시예 3. 노화 관련 평가
β-갈락토시다제(galactosidase)(SA-β-Gal) 활성, 세포증식 및 세포노화 마커를 측정하였다.
3-1. β-갈락토시다제 활성 평가
노화 관련 β-galactosidase (SA-β-Gal) 활성은 노화 세포의 특징이며, 노화에 대한 조직화학적 마커로 쓰이고 있다.
구체적으로, 돼지 관상동맥을 2 내지 3 mm 사이즈로 잘라 관상동맥 링을 만들었다. 그 다음, 관상동맥 링을 대조군 (Control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 10 μg/mL+ 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹으로 나누어 처리하여 실험을 진행하였다. 24시간 배양 후, 4% 포름알데하이드로 고정시키고, x-gal 염색 시약을 처리하여 하루 동안 반응시켰다. 그 다음, 관상동맥 링을 최적 절단 온도 (OCT; Optimum cutting temperature) 용액 (leica Biosystems)에 담그고 -25 ℃에서 동결절편기 (Cryotome)을 사용하여 10 μm으로 절편을 만들어 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 5에 사진으로 나타내었다. 또한, 돼지 관상동맥 유래 내피세포에서의 β-갈락토시다제 활성 평가는 다음과 같다. 12 well plate에 5×104 cells/well로 관상동맥 유래 내피세포를 분주하고, 대조군 (control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 + 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 24시간 배양 후, 4% Formaldehyde solution (1 mL/well)을 처리하여 15분간 고정시킨 후, x-gal 염색 시약 (1 mg/mL)을 처리하여 16시간 동안 반응시켰다. X-gal이 β-galactosidase 활성에 의해 가수분해되면서 파란색을 띄게 되며, 그룹별 현상을 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 5에 그래프로 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 나노 플라스틱에 노출된 관상동맥 링에서는 β-galactosidase (SA-β-Gal) 활성이 증가하였다. 반면, 이나보글리플로진을 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 처리한 그룹에서는 β-galactosidase (SA-β-Gal) 활성이 유의하게 감소하였다.
3-2. 세포 증식 효능 평가
세포주기 정지는 세포 노화의 주요 특징 중 하나이다. 이나보글리플로진이 나노 플라스틱 노출에 의한 내피세포 증식의 감소, 즉 세포 노화를 개선시킬 수 있는지를 확인하였다.
구체적으로, 돼지 관상동맥을 적출한 후 콜라게네이즈를 20분간 처리 후 원심분리를 통해 돼지 관상동맥 내피 세포를 얻어 96 웰 플레이트에 1 x 104 cells/well로 세포를 분주하였다. 세포 배양배지는 10% FBS, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 U/mL) 및 fungizone (250 μM)이 포함되어 있는 DMEM으로 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 대조군 (Control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 + 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 uM) 그룹으로 나누어 실험을 진행하였고, 세포 증식 효능은 CellTiter 96 Aqueos One Solution Cell Proliferation Assay (Promega Corporation, USA) kit를 사용하여 측정하였다. 샘플들을 처리하고 세포를 24시간 동안 배양한 후에, MTS tetrazolium solution (20 μL/well)을 처리하여 3시간 동안 반응시킨 후, 490 nm에서 흡광도를 측정 (Enspire Multilabel Reader; Perkin Elmer Ltd.)하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 나노 플라스틱에 노출된 그룹에서는 세포증식이 현저하게 감소되었지만, 이나보글리플로진을 처리한 그룹은 이나보글리플로진에 의해 세포증식이 개선된 것을 확인하였다.
3-3. 내피세포 세포노화 마커의 발현 평가
돼지 관상동맥 내피세포에서 세포노화 마커인 p53 및 p21의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 6 well 플레이트에 1 x 105 cells/well로 세포를 분주하였다. 세포 배양배지는 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), fungizone (250 μg/mL)이 포함되어있는 DMEM이며, 37 °C, CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 대조군 (Control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 + 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹으로 나누고 샘플을 세포에 처리 후 24시간 동안 배양하였다.
돼지 관상동맥 내피세포를 용해시키기 위하여 1X RIPA 버퍼를 각 웰에 첨가하고 10분간 용해시켰다. 세포를 스크래퍼 (Scraper)로 긁어서 14,000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심분리를 하였다. 얻어진 세포 용해물의 단백질 정량은 Bio-Rad DC 단백질 시약을 사용하여 측정하였다. 15 ug의 단백질을 동일하게 로딩하여 분석을 수행하였다.
1차 항체로 p53 (1:1,000), p21 (1:1,000) 및 beta-actin (1:1,000)을 24시간 동안 4 ℃에서 반응시킨 후 1X TBS-T 버퍼로 10분간 3 내지 5회 세척하였다. 2차 항체는 1:20,000 비율로 상온에서 1시간 동안 반응 후, 1X TBS-T 버퍼로 10분간 3 내지 5회 세척하였다. 단백질 밴드는 ECL solution 처리 후 Amersham imager 680으로 확인하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 나노 플라스틱을 처리한 그룹에서는 p53 및 p21 단백질 발현이 크게 증가하였으나, 이나보글리플로진을 처리한 그룹은 농도 의존적 (0.01, 0.1 및 1 μM)으로 세포노화 마커 단백질들을 유의적으로 감소시켰다.
실시예 4. 세포의 산화 스트레스 평가
DHE (dihyroethidium) 및 DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 사용하여 산화 스트레스를 측정하였다.
구체적으로, 검은색 96 웰 플레이트에 1 x 104 cells/well로 돼지 관상동맥 내피 세포를 분주하였다. 대조군 (Control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 10 μg/mL + 이나보글리플로진 (농도별 0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹으로 나누어 처리하고 실험을 진행하였다. 세포 배양배지는 10 % FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), fungizone (250 μg/mL)이 포함되어있는 DMEM이며, 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 24시간 배양 후, 생성된 활성산소 (Reactive oxygen speciese, ROS)량을 형광 흡광도 (excitation/emission 485/535 nm)로 측정하였다.
관상동맥 링에서도 생성된 활성산소를 측정하기 위하여 관상동맥 링에 그룹별로 샘플들을 처리하고, 최적 절단 온도 (OCT; Optimum cutting emperature) 용액 (Leica Biosystems)이 담긴 틀에 담가 액체질소에서 동결시켰다. 동결절편기 (Cryotome)을 사용하여 10 μm으로 절편을 만들고 DHE (10 μM)로 염색하여 37 ℃에서 45분 동안 배양하고 PBS로 세척한 후, 형광 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, 나노 플라스틱에 노출된 그룹에서는 ROS의 생성 지표인 DCF-DA 및 DHE의 형광 강도가 크게 증가하였고, 이나보글리플로진을 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM)로 처리한 그룹에서는 형광 강도가 유의적으로 감소함을 확인하였다.
4-2. 세포의 산화 스트레스 관련 마커 발현 평가
돼지 관상동맥 내피세포에서 NADPH 산화효소는 내피세포에서 과산화물을 생성하여 세포노화를 유발하고 내피세포 기능의 장애를 유발한다고 알려져 있다. NAPDH 산화효소의 막 촉매 소단위인 Nox2 및 p22phox의 발현을 측정하여 세포의 산화 스트레스를 평가하였다.
구체적으로, 6 well 플레이트에 1 x 105 cells/well로 세포를 분주하였다. 세포 배양배지는 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), fungizone (250 μg/mL)이 포함되어있는 DMEM이며, 37 °C, CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 대조군 (Control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 + 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹으로 나누고 샘플을 세포에 처리 후 24시간 동안 배양하였다.
돼지 관상동맥 내피세포를 용해시키기 위하여 1X RIPA 버퍼를 각 웰에 첨가하고 10분간 용해시켰다. 세포를 스크래퍼 (Scraper)로 긁어서 14,000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심분리를 하였다. 얻어진 세포 용해물의 단백질 정량은 Bio-Rad DC 단백질 시약을 사용하여 측정하였다. 15 ug의 단백질을 동일하게 로딩하여 분석을 수행하였다.
1차 항체로 Nox2 (1:1,000), p22phox (1:1,000) 및 beta-actin (1:1,000)을 24시간 동안 4 ℃에서 반응시킨 후 1X TBS-T 버퍼로 10분간 3 내지 5회 세척하였다. 2차 항체는 1:20,000 비율로 상온에서 1시간 동안 반응 후, 1X TBS-T 버퍼로 10분간 3 내지 5회 세척하였다. 단백질 밴드는 ECL solution 처리 후 Amersham imager 680으로 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 9에서 확인할 수 있듯이, NADPH 산화효소의 막 촉매 소단위인 Nox2와 p22phox는 나노 플라스틱 노출에 의하여 유의적으로 증가하였다. 반면, 이나보글리플로진을 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM)로 처리한 그룹에서는 농도 의존적으로 관련 단백질들을 유의적으로 감소시켰다.
이를 통해, 이나보글리플로진이 나노 플라스틱에 의해 야기된 활성 산소 생성을 억제하고 산화 스트레스를 감소시켰음을 확인하였다.
실시예 5. 혈관 반응성 평가
5-1. 혈관 기능 평가
혈관 내피세포는 혈관 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하지만 노화가 일어나면 혈관 기능장애를 유발하게 된다고 알려져 있다. 이에, 이나보글리플로진이 나노 플라스틱 노출에 의한 혈관 기능장애를 예방하는지 혈관 내피세포의 혈관 반응성을 평가하였다. 그리고 경쟁물질인 엠파글리플로진을 함께 평가하여 효과를 비교하였다.
구체적으로, 돼지심장의 좌전하행지 관상동맥을 절제하여 2 내지 3 mm 크기의 링으로 절단하였다. 대조군 (control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 10 μg/mL + 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹, 그리고 나노플라스틱 10 μg/mL + 엠파글리플로진 1 μM 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 관상동맥 링은 오간챔버 (95 % O2, 5 % CO2)에서 37 ℃ 크랩스 용액에 넣어 등척성 장력의 변화를 측정하였다. 90분 동안 5 g으로 일정하게 등축시킨 후 최대 80 mM KCl로 반복 수축하면서 각 관상동맥 링의 생존성을 확인하였다. 30분동안 세척한 후 트롬복산 모방체 U46619를 사용하여 관상동맥 링을 약 80%까지 (최대 수축률) 수축시키고 브래디키닌을 처리하여 브래디키닌의 농도에 대한 혈관의 이완율을 계산하여 그 결과를 도 10의 그래프로 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 이원분산분석 (Two-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Bonferroni를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
브래디키닌은 생체 내 물질로서, 브래디키닌 수용체가 활성화되면 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)를 활성화하여 NO (nitric oxide)가 방출되고 따라서 혈관을 이완시킨다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 혈관기능장애를 보이지 않는 정상혈관은 트롬복산 모방체 U46619에 의해 수축되고 브래디키닌 처리시 농도 의존적으로 이완되며, 고농도인 브래디키닌 100 nM 에서 거의 100% 이완된다 (대조군). 그러나, 대조군과 달리, 나노 플라스틱 처리 그룹은 브래디키닌을 농도의존적으로 처리하더라도 관상동맥 링이 대조군 대비 이완이 감소하였으며, 최대 이완율 역시 100 % 이르지 못하고 여전히 수축된 상태를 유지하였다. 즉, 나노 플라스틱에 의한 내피 기능장애가 발생되었음이 확인되었다. 반면, 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM)로 나노 플라스틱과 함께 처리한 그룹에서는 나노 플라스틱 단독 처리 그룹에 비해 브래디키닌에 의한 혈관 이완이 유의적으로 증가하였으며, 이러한 결과는 이나보글리플로진이 나노플라스틱에 의해 야기된 내피기능장애를 개선함을 보여 주었다 (도 10).
나노 플라스틱과 각각 이나보글리플로진 1 μM과 엠파글리플로진 1 μM을 처리한 그룹에서 브래디키닌에 의한 혈관 이완 효과를 비교하였다. 이나보글리플로진과 나노플라스틱을 처리한 그룹에서 브래디키닌은 0.3 nM 이상에서 나노플라스틱 단독 처리 그룹과 비교하여 유의적으로 혈관이완이 증가하였다. 동일 농도의 엠파글리플로진과 나노플라스틱 처리 그룹에서 브래디키닌은 나노플라스틱을 단독 처리한 그룹과 비교했을 때 비교적 고농도인 30 nM 이상에서 나노플라스틱 단독 처리 그룹과 비교하여 유의적으로 혈관이완이 증가하였다 (도 10).
이를 통해, 이나보글리플로진이 나노 플라스틱 노출로 인하여 야기되는 내피 기능장애를 예방함을 확인하였으며, 엠파글리플로진보다 혈관기능장애 개선효과가 더 뛰어남이 확인되었다.
5-2. 내피산화질소 합성효소 발현 측정
내피노화에서 내피산화질소 합성효소 (eNOS)의 발현 저하는 흔히 나타나는 특성으로, 이로 인하여 내피기능장애를 유발한다고 알려져 있다. 이에, 내피산화질소 합성효소 발현을 측정하여 이나보글리플로진이 나노 플라스틱 노출에 의한 내피기능 손상을 개선하는 것을 확인하였다.
구체적으로, 6 well 플레이트에 1 x 105 cells/well로 세포를 분주하였다. 세포 배양배지는 10% FBS, penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 U/mL), fungizone (250 μg/mL)이 포함되어있는 DMEM이며, 37 °C, CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 대조군 (Control), 나노 플라스틱 10 μg/mL, 나노 플라스틱 + 이나보글리플로진 농도별 (0.01, 0.1 및 1 μM) 그룹으로 나누고 샘플을 세포에 처리 후 24시간 동안 배양하였다.
돼지 관상동맥 내피세포를 용해시키기 위하여 1X RIPA 버퍼를 각 웰에 첨가하고 10분간 용해시켰다. 세포를 스크래퍼 (Scraper)로 긁어서 14,000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심분리를 하였다. 얻어진 세포 용해물의 단백질 정량은 Bio-Rad DC 단백질 시약을 사용하여 측정하였다. 15 ug의 단백질을 동일하게 로딩하여 분석을 수행하였다.
1차 항체로 eNOS (1:1,000) 및 beta-actin (1:1,000)을 24시간 동안 4 ℃에서 반응시킨 후 1X TBS-T 버퍼로 10분간 3 내지 5회 세척하였다. 2차 항체는 1:20,000 비율로 상온에서 1시간 동안 반응 후, 1X TBS-T 버퍼로 10분간 3 내지 5회 세척하였다. 단백질 밴드는 ECL solution 처리 후 Amersham imager 680으로 확인하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
데이터의 통계 분석에는 Prism 5.03 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 시험 결과는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계 방법은 각 군 간의 차이 검증을 위해 일원분산분석 (One-way ANOVA)을 실시하였고, 각 유형별 사후분석 (post hoc test)은 Tukey 함수를 통한 검증방법을 사용하였다. 유의 수준은 p<0.05로 설정하였다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, 나노 플라스틱 노출 그룹에서는 eNOS 단백질 발현이 현저하게 감소되었지만, 이나보글리플로진은 농도 의존적으로 (0.01, 0.1 및 1 μM) eNOS 발현을 유의적으로 증가시킨 것을 확인할 수 있었다.

Claims (5)

  1. 이나보글리플로진(enavogliflozin)을 유효성분으로 포함하는 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 심혈관 노화 질환은 비후성 폐쇄성 심근병증, 중증 폐쇄성 관상동맥 질환, 대동맥 협착, 혈역학적으로 의미있는 대동맥 판막 또는 승모판 협착증, 대동맥류, 관상동맥 질환, 말초동맥 질환 및 경동맥 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여용인, 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 이나보글리플로진의 1회 투여 용량은 0.1 mg 내지 0.5 mg인, 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 1일 1회 투여되는 것인, 심혈관 노화 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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