WO2024048602A1 - Buffer composition for hybridization, and hybridization method - Google Patents
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Abstract
The purpose of the present invention is to suppress nonspecific hybridization with a nucleic acid probe and achieve excellent detection efficiency for a target nucleic acid even when there are a plurality of adjacent mutated sites. A nucleic acid for blocking according to the present invention includes a base sequence that is complementary to a non-target nucleic acid containing a plurality of bases not subject to detection that correspond to a plurality of bases to be detected.
Description
本発明は、検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法に関する。
The present invention relates to a hybridization buffer composition and a hybridization method used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected and a nucleic acid probe containing a complementary base sequence to the target nucleic acid.
一本鎖の核酸分子同士が相補的な塩基間で水素結合し、これら核酸分子が二本鎖を形成することを、ハイブリダイゼーションと呼んでいる。言い換えると、測定対象の核酸分子の塩基配列が既知であれば、当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸分子を用いて測定対象の核酸分子を検出することができる。より具体的には、測定対象の核酸分子に相補的な塩基配列を有する核酸プローブを固定化した固相に、蛍光標識した測定対象となる核酸を反応させ、その後、未反応の核酸分子を洗浄・除去し、そして、固相に結合している標識物質の活性を測定する方法である。ハイブリダイゼーション方法においてはＤＮＡの配列を正確に認識することで、測定対象の核酸分子を検出することができる。
Hybridization is a process in which single-stranded nucleic acid molecules form double-stranded molecules through hydrogen bonding between complementary bases. In other words, if the base sequence of the nucleic acid molecule to be measured is known, the nucleic acid molecule to be measured can be detected using a nucleic acid molecule having a complementary base sequence to the base sequence. More specifically, a fluorescently labeled nucleic acid to be measured is reacted with a solid phase on which a nucleic acid probe having a complementary base sequence to the nucleic acid molecule to be measured is immobilized, and then unreacted nucleic acid molecules are washed away.・This is a method of removing and measuring the activity of the labeling substance bound to the solid phase. In the hybridization method, the nucleic acid molecule to be measured can be detected by accurately recognizing the DNA sequence.
このようなハイブリダイゼーションにおいて、測定対象の核酸分子を正確に検出するには、核酸プローブが核酸分子を正確に認識することが重要である。よって従来、ハイブリダイゼーションを行う際は、反応液の塩濃度や反応温度を適宜調節する方法や、核酸プローブと測定対象以外の核酸分子との非特異的なハイブリダイズを抑制するブロッキング剤を使用する方法が用いられている。ブロッキング剤としては、例えば、サケ精子ＤＮＡや酵母ｔＲＮＡなどの測定対象の核酸分子や核酸プローブに対して、相補的な塩基配列を有しない核酸成分、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｎラウロイルサルコシン（Ｎ－ＬＳ）などの界面活性剤、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインなどのタンパク質が知られている。
In such hybridization, in order to accurately detect the nucleic acid molecule to be measured, it is important that the nucleic acid probe accurately recognize the nucleic acid molecule. Therefore, conventionally, when performing hybridization, methods include adjusting the salt concentration of the reaction solution and reaction temperature as appropriate, and using blocking agents to suppress nonspecific hybridization between the nucleic acid probe and nucleic acid molecules other than the target to be measured. method is used. Blocking agents include, for example, nucleic acid components that do not have a complementary base sequence to the nucleic acid molecule or nucleic acid probe to be measured, such as salmon sperm DNA or yeast tRNA, SDS (sodium dodecyl sulfate), N lauroyl sarcosine (N Surfactants such as -LS), proteins such as bovine serum albumin (BSA), and casein are known.
特許文献１には、測定対象の核酸分子における固有の配列にハイブリダイズし、且つ固相上へ捕捉される核酸配列を含む捕捉配列プローブに対して特異的にハイブリダイズするブロッカープローブを使用する方法が開示されている。特許文献１に記載の方法では、捕捉配列プローブが測定対象の核酸分子にハイブリダイズした後、ブロッカープローブを反応液に添加することで、ハイブリダイズしていない捕捉配列プローブが測定対象の核酸分子に存在する交差反応性核酸配列にハイブリダイズすることを防ぎ、そのために検出の特異性を向上させることができる。
Patent Document 1 describes a method using a blocker probe that hybridizes to a unique sequence in a nucleic acid molecule to be measured and specifically hybridizes to a capture sequence probe containing a nucleic acid sequence to be captured onto a solid phase. is disclosed. In the method described in Patent Document 1, after the capture sequence probe hybridizes to the nucleic acid molecule to be measured, a blocker probe is added to the reaction solution, so that the unhybridized capture sequence probe is hybridized to the nucleic acid molecule to be measured. Hybridization to existing cross-reactive nucleic acid sequences can be prevented, thereby improving the specificity of detection.
さらに、特許文献２には、測定対象の核酸分子をマイクロアレイを用いて検出する際にブロッキング剤として、ロックド核酸（ＬＮＡ）といった改変ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用することが開示されている。
Further, Patent Document 2 discloses the use of an oligonucleotide containing a modified nucleotide such as locked nucleic acid (LNA) as a blocking agent when detecting a nucleic acid molecule to be measured using a microarray.
さらにまた、特許文献３には、測定対象の核酸分子における検出対象塩基よりも５’末端側にハイブリダイズする５’末端側ブロック核酸、検出対象塩基よりも３’末端側にハイブリダイズする３’末端側ブロック核酸を用いて、測定対象の核酸分子を核酸プローブで検出する方法が開示されている。特許文献３によれば、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける塩基配列特異性が高く、塩基配列中の一塩基のみの相違を高精度に検出する必要のあるＳＮＰのタイピングや、特定の塩基配列を有する核酸の検出や分離の効率及び特異性を向上できるとされている。
Furthermore, Patent Document 3 describes a 5' end block nucleic acid that hybridizes to the 5' end side of the detection target base in a nucleic acid molecule to be measured, and a 3' end block nucleic acid that hybridizes to the 3' end side of the detection target base. A method is disclosed in which a nucleic acid molecule to be measured is detected with a nucleic acid probe using an end-blocked nucleic acid. According to Patent Document 3, the base sequence specificity in hybridization between a probe nucleic acid and a target nucleic acid is high, and SNP typing that requires highly accurate detection of a difference in only one base in a base sequence or a specific base It is said that the efficiency and specificity of detection and separation of nucleic acids having a sequence can be improved.
さらにまた、特許文献４には、検出対象の塩基（例えば、ＳＮＰにおけるマイナーアレル）を含むターゲット核酸をプローブ核酸とのハイブリダイゼーションで検出する際に、検出対象以外の塩基（同ＳＮＰにおけるメジャーアレル）を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を使用することが開示されている。特許文献４によれば、ブロッキング用核酸を使用することで、検出対象塩基を含むターゲット核酸以外の核酸分子とプローブ核酸との非特異的ハイブリダイズを抑制することができ、ターゲット核酸とプローブ核酸との特異的ハイブリダイズに基づく、ターゲット核酸の検出効率を大幅に向上させることができる。
Furthermore, Patent Document 4 discloses that when a target nucleic acid containing a base to be detected (for example, a minor allele in the same SNP) is detected by hybridization with a probe nucleic acid, a base other than the base to be detected (for example, a major allele in the same SNP) is detected. The use of a blocking nucleic acid comprising a complementary base sequence to a non-target nucleic acid comprising: According to Patent Document 4, by using a blocking nucleic acid, it is possible to suppress non-specific hybridization between a probe nucleic acid and a nucleic acid molecule other than the target nucleic acid containing a base to be detected, and the target nucleic acid and the probe nucleic acid can be The detection efficiency of target nucleic acids based on specific hybridization can be greatly improved.
しかしながら、ＳＮＰのような変異箇所が隣接、近接して複数存在する場合、検出対象塩基を含むターゲット核酸を核酸プローブで検出する際、上述したようなブロッキング用核酸ではターゲット核酸の検出効率が低下するといった問題があった。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ＳＮＰのような変異箇所が隣接、近接して複数存在する場合であっても核酸プローブに対する非特異的ハイブリダイズを抑制し、ターゲット核酸の優れた検出効率を達成することを目的としている。
However, when multiple mutation sites such as SNP exist adjacently or in close proximity, the detection efficiency of the target nucleic acid decreases with the above-mentioned blocking nucleic acid when detecting the target nucleic acid containing the target base with a nucleic acid probe. There was such a problem. Therefore, in view of the above-mentioned circumstances, the present invention suppresses non-specific hybridization to a nucleic acid probe even when there are multiple mutation sites such as SNPs adjacent to each other, and provides excellent detection of target nucleic acids. The aim is to achieve efficiency.
本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、プローブ核酸を用いて、ＳＮＰのような変異箇所が隣接、近接して複数含まれるターゲット核酸を検出する際の検出効率を向上できるブロッキング用核酸を設計することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned purpose, the present inventors have determined that the detection efficiency when detecting a target nucleic acid containing multiple mutation sites such as SNPs adjacent to each other using a probe nucleic acid has been determined. We have succeeded in designing a blocking nucleic acid that can improve the performance of the present invention, and have completed the present invention. The present invention includes the following.
（１）所定の変異箇所について検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物であって、前記ターゲット核酸には上記所定の変異箇所の他に１又は複数の変異箇所が含まれ、これら変異箇所における検出対象塩基に対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含有する、ハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（２）上記ブロッキング用核酸は、前記複数の変異箇所における非検出対象塩基に対応する塩基が５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（３）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を２０塩基以内に有することを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（４）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも１カ所が５～２０塩基離間していることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（５）上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに使用されることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（６）上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液と混合されることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（７）所定の変異箇所について検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーション方法であって、前記ターゲット核酸には上記所定の変異箇所の他に１又は複数の変異箇所が含まれ、これら変異箇所における検出対象塩基に対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含有するハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記ターゲット核酸を含有する溶液とを混合し、その後、上記核酸プローブと上記ターゲット核酸とのハイブリダイズを行う、ハイブリダイゼーション方法。
（８）上記ブロッキング用核酸は、前記複数の変異箇所における非検出対象塩基に対応する塩基が５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（９）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を２０塩基以内に有することを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１０）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも１カ所が５～２０塩基離間していることを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１１）上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに、上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記ターゲット核酸を含有する溶液とを混合した混合液を接触させることを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１２）上記ターゲット核酸を含有する溶液は、上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液であり、当該反応液と上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合することを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-139527号の開示内容を包含する。 (1) A buffer composition used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected at a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, the buffer composition comprising: contains one or more mutation sites in addition to the above-mentioned predetermined mutation sites, and includes a base sequence complementary to a non-target nucleic acid containing multiple non-detection target bases corresponding to the detection target bases at these mutation sites. A hybridization buffer composition containing a blocking nucleic acid.
(2) The blocking nucleic acid is characterized in that the base corresponding to the non-detection target base at the plurality of mutation sites is located two bases inward from the 5' side and three bases inward from the 3' side. The hybridization buffer composition according to (1).
(3) The hybridization buffer composition according to (1), wherein the blocking nucleic acid has a plurality of bases within 20 bases corresponding to a plurality of non-detection target bases.
(4) The blocking nucleic acid is characterized in that among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart (1) The hybridization buffer composition described above.
(5) The hybridization buffer composition according to (1), which is used in a microarray in which the nucleic acid probe is immobilized on a substrate.
(6) The hybridization buffer composition according to (1), which is mixed with a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid.
(7) A method for hybridizing a target nucleic acid containing a base to be detected with respect to a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, wherein the target nucleic acid has the predetermined mutation. Contains one or more mutation sites in addition to the mutation site, and contains a blocking nucleic acid that includes a complementary base sequence to a non-target nucleic acid that includes multiple non-detection target bases corresponding to the detection target bases at these mutation sites. A hybridization method comprising mixing a hybridization buffer composition containing the target nucleic acid with a solution containing the target nucleic acid, and then hybridizing the nucleic acid probe with the target nucleic acid.
(8) The above-mentioned blocking nucleic acid is characterized in that the base corresponding to the non-detection target base at the plurality of mutation sites is located within two bases from the 5' side and within three bases from the 3' side. The hybridization method according to (7).
(9) The hybridization method according to (7), wherein the blocking nucleic acid has a plurality of bases within 20 bases corresponding to a plurality of non-detection target bases.
(10) The blocking nucleic acid is characterized in that among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart (7) Hybridization methods described.
(11) A mixture of the hybridization buffer composition and a solution containing the target nucleic acid is brought into contact with the microarray in which the nucleic acid probes are immobilized on a substrate (7) Hybridization methods described.
(12) The solution containing the target nucleic acid is a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid, and the reaction solution is mixed with the hybridization buffer composition ( 7) Hybridization method described.
This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-139527, which is the basis of the priority of this application.
（２）上記ブロッキング用核酸は、前記複数の変異箇所における非検出対象塩基に対応する塩基が５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（３）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を２０塩基以内に有することを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（４）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも１カ所が５～２０塩基離間していることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（５）上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに使用されることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（６）上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液と混合されることを特徴とする（１）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
（７）所定の変異箇所について検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーション方法であって、前記ターゲット核酸には上記所定の変異箇所の他に１又は複数の変異箇所が含まれ、これら変異箇所における検出対象塩基に対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含有するハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記ターゲット核酸を含有する溶液とを混合し、その後、上記核酸プローブと上記ターゲット核酸とのハイブリダイズを行う、ハイブリダイゼーション方法。
（８）上記ブロッキング用核酸は、前記複数の変異箇所における非検出対象塩基に対応する塩基が５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（９）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を２０塩基以内に有することを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１０）上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも１カ所が５～２０塩基離間していることを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１１）上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに、上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記ターゲット核酸を含有する溶液とを混合した混合液を接触させることを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
（１２）上記ターゲット核酸を含有する溶液は、上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液であり、当該反応液と上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合することを特徴とする（７）記載のハイブリダイゼーション方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-139527号の開示内容を包含する。 (1) A buffer composition used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected at a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, the buffer composition comprising: contains one or more mutation sites in addition to the above-mentioned predetermined mutation sites, and includes a base sequence complementary to a non-target nucleic acid containing multiple non-detection target bases corresponding to the detection target bases at these mutation sites. A hybridization buffer composition containing a blocking nucleic acid.
(2) The blocking nucleic acid is characterized in that the base corresponding to the non-detection target base at the plurality of mutation sites is located two bases inward from the 5' side and three bases inward from the 3' side. The hybridization buffer composition according to (1).
(3) The hybridization buffer composition according to (1), wherein the blocking nucleic acid has a plurality of bases within 20 bases corresponding to a plurality of non-detection target bases.
(4) The blocking nucleic acid is characterized in that among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart (1) The hybridization buffer composition described above.
(5) The hybridization buffer composition according to (1), which is used in a microarray in which the nucleic acid probe is immobilized on a substrate.
(6) The hybridization buffer composition according to (1), which is mixed with a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid.
(7) A method for hybridizing a target nucleic acid containing a base to be detected with respect to a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, wherein the target nucleic acid has the predetermined mutation. Contains one or more mutation sites in addition to the mutation site, and contains a blocking nucleic acid that includes a complementary base sequence to a non-target nucleic acid that includes multiple non-detection target bases corresponding to the detection target bases at these mutation sites. A hybridization method comprising mixing a hybridization buffer composition containing the target nucleic acid with a solution containing the target nucleic acid, and then hybridizing the nucleic acid probe with the target nucleic acid.
(8) The above-mentioned blocking nucleic acid is characterized in that the base corresponding to the non-detection target base at the plurality of mutation sites is located within two bases from the 5' side and within three bases from the 3' side. The hybridization method according to (7).
(9) The hybridization method according to (7), wherein the blocking nucleic acid has a plurality of bases within 20 bases corresponding to a plurality of non-detection target bases.
(10) The blocking nucleic acid is characterized in that among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart (7) Hybridization methods described.
(11) A mixture of the hybridization buffer composition and a solution containing the target nucleic acid is brought into contact with the microarray in which the nucleic acid probes are immobilized on a substrate (7) Hybridization methods described.
(12) The solution containing the target nucleic acid is a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid, and the reaction solution is mixed with the hybridization buffer composition ( 7) Hybridization method described.
This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-139527, which is the basis of the priority of this application.
本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物及びハイブリダイゼーション方法によれば、複数の検出対象塩基を含むターゲット核酸以外の核酸分子とプローブ核酸との非特異的ハイブリダイズをブロッキング用核酸により抑制することができ、当該ブロッキング用核酸がターゲット核酸とプローブ核酸との特異的ハイブリダイズを阻害することなく、ターゲット核酸の検出効率を大幅に向上させることができる。
According to the hybridization buffer composition and hybridization method of the present invention, non-specific hybridization between a probe nucleic acid and a nucleic acid molecule other than a target nucleic acid containing a plurality of bases to be detected can be suppressed by a blocking nucleic acid. Therefore, the detection efficiency of the target nucleic acid can be greatly improved without the blocking nucleic acid inhibiting specific hybridization between the target nucleic acid and the probe nucleic acid.
以下、本発明を詳細に説明する。
Hereinafter, the present invention will be explained in detail.
本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、所定の変異箇所について検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物である。特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物には、核酸プローブに対する非特異的ハイブリダイズを抑制する機能を有するブロッキング用核酸が含まれている。
The hybridization buffer composition according to the present invention is a buffer composition used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected at a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid. It is a thing. In particular, the hybridization buffer composition according to the present invention contains a blocking nucleic acid that has the function of suppressing non-specific hybridization to a nucleic acid probe.
ここで、ターゲット核酸とは、所定の変異箇所について検出対象塩基を含む核酸分子、すなわち核酸断片を意味する。ターゲット核酸は、ＤＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＲＮＡからなる核酸分子でも良いし、ＤＮＡとＲＮＡとを含む核酸分子（ＤＮＡ－ＲＮＡ複合体）でもよい。また、核酸としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、並びに、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）等の人工核酸を含む意味である。
Here, the target nucleic acid means a nucleic acid molecule, ie, a nucleic acid fragment, containing a base to be detected at a predetermined mutation site. The target nucleic acid may be a nucleic acid molecule consisting of DNA, a nucleic acid molecule consisting of RNA, or a nucleic acid molecule containing DNA and RNA (DNA-RNA complex). Furthermore, the term "nucleic acid" includes adenine, cytosine, guanine, thymine, and uracil, as well as artificial nucleic acids such as peptide nucleic acid (PNA) and locked nucleic acid (LNA).
検出対象塩基とは、例えば染色体の所定の位置における変異箇所の特定の塩基を意味しており、特に限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）等の変異箇所における特定の塩基の種類を意味している。例えば、所定の一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうるとして、いずれか一方の塩基、すなわち当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とすることができる。ここで、検出対象塩基としては、遺伝子多型におけるメジャーアレル及びマイナーアレルのいずれでも良いし、リスクアレルであってもなくても良い。なお、所定の変異箇所について、特定の塩基を検出対象塩基とした場合、当該特定の塩基以外の塩基を非検出対象塩基と称する。すなわち、所定の一塩基多型がＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を取りうるとして、当該一塩基多型におけるＡ（アデニン）を検出対象塩基とした場合、当該一塩基多型におけるＣ（シトシン）が非検出対象塩基となる。
The base to be detected means, for example, a specific base at a mutation site at a predetermined position on a chromosome, and includes, but is not limited to, a specific type of base at a mutation site such as a single nucleotide polymorphism (SNP). ing. For example, assuming that a predetermined single nucleotide polymorphism can be A (adenine) or C (cytosine), either one of the bases, that is, A (adenine) in the single nucleotide polymorphism, can be the base to be detected. Here, the base to be detected may be either a major allele or a minor allele in a genetic polymorphism, and may or may not be a risk allele. In addition, when a specific base is set as a detection target base for a predetermined mutation site, bases other than the specific base are referred to as non-detection target bases. That is, assuming that a given single nucleotide polymorphism can be A (adenine) or C (cytosine), and if A (adenine) in the single nucleotide polymorphism is the base to be detected, C (cytosine) in the single nucleotide polymorphism ) becomes the non-detection target base.
本発明においては、ターゲット核酸は、複数の変異箇所を含んでおり、そのうちの少なくとも１つの変異箇所について検出対象塩基を含んでいる。なお通常、ターゲット核酸は、複数の変異箇所を含んでおり、そのうちの１つの変異箇所のみが検出対象塩基であり、他の変異箇所が全て非検出対象塩基となっている。ただし、ターゲット核酸は、複数の変異箇所の全てが検出対象塩基であっても良いし、２以上の変異箇所が検出対象塩基であり、他の変異箇所が非検出対象塩基であってもよい。
In the present invention, the target nucleic acid includes a plurality of mutation sites, and at least one of the mutation sites contains a base to be detected. Note that the target nucleic acid usually includes a plurality of mutation sites, of which only one mutation site is a base to be detected, and all other mutation sites are bases to be detected. However, in the target nucleic acid, all of the plurality of mutation sites may be detection target bases, or two or more mutation sites may be detection target bases, and other mutation sites may be non-detection target bases.
複数の変異箇所を含むターゲット核酸は、これら複数の変異箇所を含む所定の領域を核酸増幅法により増幅することで調整することができる。また、ターゲット核酸としては、生物個体、組織及び細胞採取から採取した転写産物から逆転写反応により得られるｃＤＮＡとしても良い。ターゲット核酸の塩基長としては、特に限定されないが、例えば６０～１０００塩基とすることができ、６０～５００塩基とすることが好ましく、６０～４００塩基とすることがより好ましい。
A target nucleic acid containing multiple mutation sites can be prepared by amplifying a predetermined region containing these multiple mutation sites using a nucleic acid amplification method. Furthermore, the target nucleic acid may be cDNA obtained by reverse transcription reaction from transcripts collected from individual organisms, tissues, and cells. The base length of the target nucleic acid is not particularly limited, but can be, for example, 60 to 1000 bases, preferably 60 to 500 bases, and more preferably 60 to 400 bases.
なお、複数の変異箇所のうちの少なくとも１つの変異箇所が検出対象塩基であるターゲット核酸に対して、当該検出対象塩基に対応する変異箇所が非検出対象塩基である核酸分子（核酸断片）を非ターゲット核酸と称する。非ターゲット核酸は、変異箇所の塩基が非検出対象塩基である場合、上述したターゲット核酸を取得する際に同時に取得される。例えば、ターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、一方のアレルが非検出対象塩基であれば、ターゲット核酸とともに非ターゲット核酸が増幅されることとなる。本発明においては、非ターゲット核酸は、複数の変異箇所のうちの少なくとも１つの変異箇所が非検出対象塩基であればよく、その他の変異箇所については検出対象塩基及び非検出対象塩基のいずれであってもよい。すなわち、非ターゲット核酸は、全ての変異箇所が非検出対象塩基でも良いし、ターゲット核酸における検出対象塩基に対応する塩基が非検出対象塩基であれば、その他の変異箇所のうち一部が非検出対象塩基でも良い。
In addition, for a target nucleic acid in which at least one mutation site among multiple mutation sites is a detection target base, a nucleic acid molecule (nucleic acid fragment) in which a mutation site corresponding to the detection target base is a non-detection target base is non-targeted. It is called target nucleic acid. If the base at the mutation site is a non-detection target base, the non-target nucleic acid is acquired at the same time as the target nucleic acid described above. For example, when a target nucleic acid is obtained by a nucleic acid amplification reaction such as a polymerase chain reaction, if one allele is a non-detection target base, the non-target nucleic acid will be amplified together with the target nucleic acid. In the present invention, in the non-target nucleic acid, at least one mutation site among a plurality of mutation sites may be a non-detection target base, and the other mutation sites may be either a detection target base or a non-detection target base. It's okay. In other words, in the non-target nucleic acid, all mutation sites may be non-detectable bases, or if the base corresponding to the detection target base in the target nucleic acid is a non-detection target base, some of the other mutation sites may be non-detectable bases. It may be a target base.
以上のように、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸とは、特定の変異箇所に関して検出対象塩基であるか非検出対象塩基であるかによって決まるものであり、他の変異箇所が検出対象塩基であるか非検出対象塩基であるかは問わない。例えば、核酸増幅方法により得られた核酸断片について、特定の変異箇所に関して検出対象塩基であれば当該変異箇所に関してターゲット核酸であるが、他の変異箇所が非検出対象塩基であれば当該他の変異箇所に関しては非ターゲット核酸となる。
As mentioned above, target nucleic acids and non-target nucleic acids are determined by whether a specific mutation site is a detection target base or a non-detection target base, and whether other mutation sites are detection target bases or non-detection target bases. It does not matter whether it is a base to be detected. For example, for a nucleic acid fragment obtained by a nucleic acid amplification method, if a base to be detected with respect to a specific mutation site is detected, it is a target nucleic acid with respect to that mutation site, but if another mutation site is a base to be detected, it is a target nucleic acid. Regarding the location, it becomes a non-target nucleic acid.
検出対象塩基を含むターゲット核酸を検出するには、ターゲット核酸において、少なくとも検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸プローブを使用する。核酸プローブは、特に限定されないが、例えば１０～３０塩基長とすることができ、１５～２６塩基長とすることが好ましい。また、検出対象塩基に相補的な塩基は、核酸プローブを構成する塩基を文字列として見たときに、当該文字列の中心となる位置とすることが好ましい。なお、文字列の中心とは、偶数個の塩基からなる核酸プローブについては５’末端又は３’末端方向に１つずれている場合を含む意味である。
To detect a target nucleic acid containing a base to be detected, a nucleic acid probe having a base sequence complementary to at least a region containing the base to be detected is used in the target nucleic acid. Although the nucleic acid probe is not particularly limited, it can be, for example, 10 to 30 bases long, and preferably 15 to 26 bases long. Furthermore, the base complementary to the base to be detected is preferably positioned at the center of the character string when the bases constituting the nucleic acid probe are viewed as a character string. Note that the center of the character string includes the case where it is shifted by one toward the 5' end or 3' end for nucleic acid probes consisting of an even number of bases.
なお、本発明において、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸には複数の変異箇所が含まれている。これら複数の変異箇所は、それぞれ異なる核酸プローブによって検出される。すなわち、変異箇所毎に検出対象塩基に対応する核酸プローブを準備し、これら核酸プローブによって検出対象塩基を検出する。
Note that in the present invention, the target nucleic acid and the non-target nucleic acid contain multiple mutation sites. These multiple mutation sites are detected by different nucleic acid probes. That is, a nucleic acid probe corresponding to the base to be detected is prepared for each mutation site, and the base to be detected is detected by these nucleic acid probes.
本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸は、非ターゲット核酸における複数の非検出対象塩基を含む領域に対して相補的な塩基配列を有する。よって、ブロッキング用核酸は、複数の変異箇所のうち少なくとも１つの変異箇所について検出対象塩基を有するターゲット核酸と、当該検出対象核酸に対応する核酸プローブとがハイブリダイズできる条件下において、複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とハイブリダイズすることができる。
In the hybridization buffer composition according to the present invention, the blocking nucleic acid has a base sequence complementary to a region containing a plurality of non-detection target bases in the non-target nucleic acid. Therefore, the blocking nucleic acid is capable of detecting a plurality of non-detection bases under conditions in which a target nucleic acid having a base to be detected for at least one of the plurality of mutation sites and a nucleic acid probe corresponding to the nucleic acid to be detected can hybridize. It is capable of hybridizing with non-target nucleic acids containing the base of interest.
ブロッキング用核酸において、非検出対象塩基に対応する塩基は、複数の検出対象塩基に対応して複数含まれるが、それらの位置は特に限定されない。特に、非検出対象塩基に対応する塩基は、ブロッキング用核酸における５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することが好ましい。ブロッキング用核酸において非検出対象塩基に対応する塩基の位置を上記範囲とすることによって、ターゲット核酸と核酸プローブとがハイブリダイズできる条件下において、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸とを確実にハイブリダイズさせることができる。
In the blocking nucleic acid, a plurality of bases corresponding to non-detection target bases are included corresponding to a plurality of detection target bases, but their positions are not particularly limited. In particular, the base corresponding to the non-detection target base is preferably located two bases inward from the 5' side and three bases inward from the 3' side in the blocking nucleic acid. By setting the position of the base corresponding to the non-detection target base in the blocking nucleic acid within the above range, the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid can be reliably hybridized under conditions where the target nucleic acid and the nucleic acid probe can hybridize. be able to.
また、ブロッキング用核酸において、複数の非検出対象塩基に対応する塩基同士の位置関係は特に限定されないが、複数の非検出対象塩基に対応する塩基の間隔が２０塩基以内であることが好ましい。さらに前記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも1カ所が５～２０塩基離間していることが好ましい。ブロッキング用核酸における、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基の位置関係が上記範囲にあると、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸とを確実にハイブリダイズさせることができ、核酸プローブを用いてターゲット核酸を高精度に検出することができる。言い換えると、非ターゲット核酸における複数の非検出対象塩基が２０塩基以内にあるか、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも1カ所が５～２０塩基離間している場合には、非ターゲット核酸とのハイブリダイズ精度の高いブロッキング用核酸を設計することができる。
In addition, in the blocking nucleic acid, the positional relationship between the bases corresponding to the plurality of non-detection target bases is not particularly limited, but it is preferable that the interval between the bases corresponding to the plurality of non-detection target bases is 20 bases or less. Further, in the blocking nucleic acid, it is preferable that among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart. When the positional relationship of the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases in the blocking nucleic acid is within the above range, the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid can be reliably hybridized, and a nucleic acid probe can be used. Target nucleic acids can be detected with high precision. In other words, multiple non-detection target bases in the non-target nucleic acid are within 20 bases, or at least one of the multiple bases corresponding to the multiple non-detection target bases has an interval of 5 to 20 bases between adjacent bases. If they are spaced apart, it is possible to design a blocking nucleic acid with high hybridization accuracy with the non-target nucleic acid.
また、ブロッキング用核酸としては、特に限定されないが、核酸プローブの塩基長に対して６０％以上の長さであることが好ましい。また、ブロッキング用核酸は、核酸プローブの塩基長よりも短い長さであることが好ましい。例えば核酸プローブの長さが２５塩基長とすると、ブロッキング用核酸の塩基長は１４～２４塩基長であることが好ましい。
Further, the blocking nucleic acid is not particularly limited, but preferably has a length of 60% or more of the base length of the nucleic acid probe. Further, it is preferable that the blocking nucleic acid has a length shorter than the base length of the nucleic acid probe. For example, if the length of the nucleic acid probe is 25 bases, the base length of the blocking nucleic acid is preferably 14 to 24 bases.
さらにまた、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度は、特に限定されないが、例えば、非ターゲット核酸の濃度及び/又はターゲット核酸の濃度に応じて、プライマー濃度に応じて適宜設定することができる。具体的にブロッキング用核酸の組成物中の濃度は、０．０１～１．０μＭとすることができ、０．０５～１．０μＭとすることが好ましく、０．１２５～１．０μＭとすることがより好ましい。
Furthermore, in the hybridization buffer composition of the present invention, the concentration of the blocking nucleic acid is not particularly limited; It can be set as appropriate. Specifically, the concentration of the blocking nucleic acid in the composition can be 0.01 to 1.0 μM, preferably 0.05 to 1.0 μM, and preferably 0.125 to 1.0 μM. is more preferable.
以上のように、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、ブロッキング用核酸を含むため、非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、ターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。また、ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する塩基を有するため、複数の検出対象塩基に対応する複数の核酸プローブのいずれともハイブリダイズすることを防止することができる。このため、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することによって、ターゲット核酸における複数の検出対象塩基のそれぞれを核酸プローブで検出する場合であっても高精度に検出することができる。
As described above, since the hybridization buffer composition according to the present invention contains a blocking nucleic acid, it is possible to suppress non-specific hybridization between a non-target nucleic acid and a nucleic acid probe, and between a target nucleic acid and a nucleic acid probe. This can prevent inhibition of specific hybridization with. Moreover, since the blocking nucleic acid has a base corresponding to a plurality of non-detection target bases, it can be prevented from hybridizing with any of the plurality of nucleic acid probes corresponding to a plurality of detection target bases. Therefore, by using the hybridization buffer composition according to the present invention, it is possible to detect each of a plurality of bases to be detected in a target nucleic acid with high precision even when using a nucleic acid probe.
本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、核酸分子同士の相補的な結合を意味するハイブリダイゼーションを含むならば、如何なる系にも使用することができる。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、in situ ハイブリダイゼーションに使用することができる。特に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、担体（基板、中空繊維、微粒子を含む）に核酸プローブを固定し、固定化した核酸プローブを用いてターゲット核酸を検出（定性、定量を含む）する系に使用することが好ましい。より具体的に、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、核酸プローブを基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いてターゲット核酸を検出する際に使用することが最も好ましい。
The hybridization buffer composition according to the present invention can be used in any system as long as it involves hybridization, which refers to complementary binding between nucleic acid molecules. That is, the hybridization buffer composition according to the present invention can be used for Southern hybridization, Northern hybridization, and in situ hybridization. In particular, the hybridization buffer composition according to the present invention immobilizes a nucleic acid probe on a carrier (including a substrate, a hollow fiber, and a microparticle), and detects a target nucleic acid (including qualitative and quantitative methods) using the immobilized nucleic acid probe. ) is preferably used in systems where More specifically, the hybridization buffer composition according to the present invention is most preferably used when detecting a target nucleic acid using a DNA microarray (DNA chip) in which nucleic acid probes are immobilized on a substrate.
以下、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いてターゲット核酸を検出する際に使用する系を例示的に説明する。なお、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物の実施形態は、以下の例に限定されるものではない。
Hereinafter, a system in which the hybridization buffer composition according to the present invention is used to detect a target nucleic acid using a DNA microarray (DNA chip) will be exemplified. Note that the embodiments of the hybridization buffer composition according to the present invention are not limited to the following examples.
骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：ＭＤＳ）は、血球の形態異常と無効造血を特徴とする造血幹細胞腫瘍である。ＭＤＳで高頻度に変異がみられる遺伝子としてＳＦ３Ｂ１遺伝子が知られている。より具体的には、ＳＦ３Ｂ１遺伝子におけるＥ６２２Ｄ変異、Ｒ６２５Ｃ変異、Ｒ６２５Ｈ変異、Ｒ６２５Ｌ変異、Ｈ６６２Ｑ変異、Ｋ６６６Ｎ変異、Ｋ６６６Ｔ変異、Ｋ６６６Ｒ変異、Ｋ６６６Ｅ変異、Ｋ６６６Ｑ変異、Ｋ６６６Ｍ変異、Ｋ７００Ｅ変異及びＧ７４２Ｄ変異がＭＤＳの予後と関連することが知られている。
Myelodysplastic syndromes (MDS) are hematopoietic stem cell tumors characterized by abnormal blood cell morphology and ineffective hematopoiesis. The SF3B1 gene is known as a gene that is frequently mutated in MDS. More specifically, the E622D mutation, R625C mutation, R625H mutation, R625L mutation, H662Q mutation, K666N mutation, K666T mutation, K666R mutation, K666E mutation, K666Q mutation, K666M mutation, K700E mutation, and G742D mutation in the SF3B1 gene are associated with MDS. It is known to be associated with prognosis.
これらＳＦ３Ｂ１遺伝子における変異を検出する際には、Ｅ６２２をコードする領域、Ｒ６２５をコードする領域、Ｈ６６２をコードする領域及びＫ６６６をコードする領域を含むターゲット核酸、並びにＫ７００をコードする領域及びＧ７４２をコードする領域を含むターゲット核酸の２種類を核酸増幅反応によって準備する。この例において、Ｅ６２２をコードする領域、Ｒ６２５をコードする領域及びＫ６６６をコードする領域の各領域には、それぞれ複数の検出対象塩基が含まれる。またＥ６２２をコードする領域とＲ６２５をコードする領域、Ｈ６６２をコードする領域とＫ６６６をコードする領域は、それぞれ１５塩基長以内の近傍に位置する。
When detecting mutations in these SF3B1 genes, target nucleic acids containing a region encoding E622, a region encoding R625, a region encoding H662, and a region encoding K666, as well as a region encoding K700 and a region encoding G742, are used. Two types of target nucleic acids containing a region are prepared by a nucleic acid amplification reaction. In this example, each of the E622-encoding region, the R625-encoding region, and the K666-encoding region each contains a plurality of detection target bases. Furthermore, the region encoding E622, the region encoding R625, the region encoding H662, and the region encoding K666 are located close to each other within 15 bases in length.
よって、これら複数の変異箇所を含むターゲット核酸に対しては、複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸とハイブリダイズする、複数の非検出対象塩基に対応する塩基を含むブロッキング用核酸を準備する。なお、この例では、上述した４種類の領域を含むターゲット核酸に対応する非ターゲット核酸の全てについてブロッキング用核酸を準備しても良いし、一部の非ターゲット核酸についてブロッキング用核酸を準備しても良い。後述する実施例では、上述の変異箇所について野生型を非検出対象塩基とし、Ｅ６２２をコードする領域からＲ６２５をコードする領域をカバーするブロッキング用核酸と、Ｈ６６２をコードする領域からＫ６６６をコードする領域をカバーするブロッキング用核酸をそれぞれ準備している。
Therefore, for a target nucleic acid containing these multiple mutation sites, a blocking nucleic acid containing a base corresponding to a plurality of non-detection target bases that hybridizes with a non-target nucleic acid containing a plurality of non-detection target bases is prepared. . In this example, blocking nucleic acids may be prepared for all of the non-target nucleic acids corresponding to the target nucleic acids containing the four types of regions described above, or blocking nucleic acids may be prepared for some of the non-target nucleic acids. Also good. In the examples described later, the wild type is used as a non-detection target base for the above-mentioned mutation site, and a blocking nucleic acid covering the region encoding E622 to the region encoding R625, and a region encoding K666 from the region encoding H662 are used. We have prepared blocking nucleic acids that cover the following.
なお、Ｋ７００をコードする領域及びＧ７４２をコードする領域を含むターゲット核酸については、Ｋ７００をコードする領域とＧ７４２をコードする領域とが４０塩基長以上離れており、それぞれ個別にひとつの非検出対象塩基を含むブロッキング用核酸を準備することができる。
For target nucleic acids containing a region encoding K700 and a region encoding G742, the region encoding K700 and the region encoding G742 are separated by 40 bases or more, and each has one non-detection target base. A blocking nucleic acid containing the following can be prepared.
なお、核酸プローブ及びブロッキング用核酸は、より好ましくは一本鎖ＤＮＡである。核酸プローブ及びブロッキング用核酸は、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
Note that the nucleic acid probe and the blocking nucleic acid are more preferably single-stranded DNA. Nucleic acid probes and blocking nucleic acids can be obtained by chemically synthesizing them using a nucleic acid synthesizer, for example. As the nucleic acid synthesis device, devices called DNA synthesizers, fully automatic nucleic acid synthesis devices, automatic nucleic acid synthesis devices, etc. can be used.
本例において、核酸プローブは、その５’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイの形態で用いるのが好ましい。担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
In this example, the nucleic acid probes are preferably used in the form of a microarray by immobilizing their 5' ends on a carrier. Materials for the carrier may be those known in the art and are not particularly limited. For example, conductive materials such as noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and carbon such as graphite and carbon fiber; single crystal silicon, amorphous silicon, and carbide. Silicon materials such as silicon, silicon oxide, and silicon nitride; composite materials of these silicon materials such as SOI (silicon on insulator); glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, forsterite, photosensitive materials Inorganic materials such as polyethylene, ethylene, polypropylene, cyclic polyolefin, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin , polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene-acrylonitrile copolymer, acrylonitrile-butadiene styrene copolymer, polyphenylene oxide, polysulfone, and other organic materials. Can be mentioned. Although the shape of the carrier is not particularly limited, it is preferably flat.
なお担体として、好ましくは表面にダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｋｅ Ｃａｒｂｏｎ）等のカーボン層と、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基及び活性エステル基等の化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
The carrier preferably has a carbon layer such as diamond-like carbon (DLC) on the surface and a chemically modified group such as an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group, and an active ester group. Use a carrier. The carrier having a carbon layer and a chemical modification group on its surface includes those having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of the substrate, and those having a chemical modification group on the surface of a substrate consisting of a carbon layer. As the material for the substrate, materials known in the art can be used, and there are no particular limitations, and materials similar to those listed as the above-mentioned carrier material can be used.
このように作製したＤＮＡマイクロアレイを用いて被検者における、ターゲット核酸を検出することができる。これには、被検者由来の試料からＤＮＡを抽出する工程と、抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の上記変異を含む領域を増幅する工程と、ＤＮＡマイクロアレイを用いて増幅された核酸を検出する工程とを含む。
The target nucleic acid in a subject can be detected using the DNA microarray prepared in this way. This involves a step of extracting DNA from a sample derived from a subject, a step of amplifying the region containing the above mutation of the SF3B1 gene using the extracted DNA as a template, and a step of detecting the amplified nucleic acid using a DNA microarray. and a step of doing so.
被検者は通常ヒトであり、骨髄異形成症候群に罹患した患者を挙げることができる。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿、骨髄液など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
The subject is usually a human, and can include a patient suffering from myelodysplastic syndrome. The sample derived from the subject is not particularly limited. Examples include blood-related samples (blood, serum, plasma, bone marrow fluid, etc.), lymph fluid, feces, cancer cells, crushed materials and extracts of tissues or organs, and the like.
まず、被検者から採取した試料からＤＮＡを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、ＣＴＡＢなどを用いたＤＮＡ抽出法を用いることができる。
First, DNA is extracted from a sample collected from a subject. The extraction means is not particularly limited. For example, a DNA extraction method using phenol/chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB, etc. can be used.
次に、得られたＤＮＡを鋳型として用いて増幅反応を行い、ＳＦ３Ｂ１遺伝子をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
Next, an amplification reaction is performed using the obtained DNA as a template to amplify the nucleic acid, preferably DNA, encoding the SF3B1 gene. Examples of amplification reactions include polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), and ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification). Nucleic acids) method, etc. can be applied. In the amplification reaction, it is desirable to add a label so that the region after amplification can be identified. At this time, the method of labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited, but for example, a method may be used in which the primers used in the amplification reaction are labeled in advance, or a method in which a labeled nucleotide is used as a substrate in the amplification reaction. You may also use the method. The labeling substance is not particularly limited, but a radioactive isotope, a fluorescent dye, or an organic compound such as digoxigenin (DIG) or biotin can be used.
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＦ３Ｂ１遺伝子に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
This reaction system also includes a buffer necessary for nucleic acid amplification and labeling, a thermostable DNA polymerase, a primer specific to the SF3B1 gene, and a labeled nucleotide triphosphate (specifically, a nucleotide triphosphate with a fluorescent label added). , nucleotide triphosphate, magnesium chloride, etc.
上記のようにして得られた増幅核酸には、ターゲット核酸及び非ターゲット核酸が含まれる。核酸プローブとターゲット核酸のハイブリダイゼーション反応を行い、核酸プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、核酸プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。
The amplified nucleic acids obtained as described above include target nucleic acids and non-target nucleic acids. A hybridization reaction between a nucleic acid probe and a target nucleic acid is performed, and the amount of nucleic acid hybridized to the nucleic acid probe can be measured, for example, by detecting a label. For example, when a fluorescent label is used, the signal from the label can be quantified by detecting the fluorescent signal using a fluorescent scanner and analyzing it using image analysis software. Furthermore, the amplified nucleic acid hybridized to the nucleic acid probe can also be quantified, for example, by creating a standard curve using a sample containing a known amount of DNA.
このとき、上述した本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することで、ブロッキング用核酸により非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができる。ハイブリダイゼーション用バッファー組成物を用いたハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、５０℃で１６時間ハイブリダイズ反応させた後、２×ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ、２５℃、１０分および２×ＳＳＣ、２５℃、５分の条件で洗浄する条件をさす。すなわち、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物には、ハイブリダイゼーション反応に必要な塩、例えばＳＳＣや、公知のブロッキング剤、例えばＳＤＳが含まれていても良い。
At this time, by using the hybridization buffer composition according to the present invention described above, non-specific hybridization between the non-target nucleic acid and the nucleic acid probe can be suppressed by the blocking nucleic acid. A hybridization reaction using a hybridization buffer composition is preferably performed under stringent conditions. Stringent conditions refer to conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, after a hybridization reaction at 50°C for 16 hours, 2×SSC/0.2% SDS , 25°C, 10 minutes and 2x SSC, 25°C, 5 minutes. That is, the hybridization buffer composition according to the present invention may contain a salt necessary for the hybridization reaction, such as SSC, and a known blocking agent, such as SDS.
また、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを予め混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズを行った後、反応液をＤＮＡマイクロアレイに接触させてターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を進行させても良い。或いは、増幅反応後のターゲット核酸及び非ターゲット核酸を含む反応液と本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物とをＤＮＡマイクロアレイ上にて混合して、非ターゲット核酸とブロッキング用核酸との特異的なハイブリダイズ並びにターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズを同時に進行させても良い。
Further, a reaction solution containing a target nucleic acid and a non-target nucleic acid after the amplification reaction is mixed in advance with the hybridization buffer composition according to the present invention to carry out specific hybridization between the non-target nucleic acid and the blocking nucleic acid. After that, the reaction solution may be brought into contact with a DNA microarray to allow the hybridization reaction between the target nucleic acid and the nucleic acid probe to proceed. Alternatively, a reaction solution containing a target nucleic acid and a non-target nucleic acid after an amplification reaction and a hybridization buffer composition according to the present invention may be mixed on a DNA microarray to form a specific combination of a non-target nucleic acid and a blocking nucleic acid. Hybridization and specific hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe may proceed simultaneously.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the following Examples.
［実施例１］
１．サンプル調製
本実施例では、野生型及び変異型モデル検体として、SF3B1遺伝子配列を搭載したプラスミドDNAを用いた。5％変異型モデル検体は野生型プラスミドと変異型プラスミドを95：5の割合で混合したものである。 [Example 1]
1. Sample Preparation In this example, plasmid DNA carrying the SF3B1 gene sequence was used as wild type and mutant model specimens. The 5% mutant model sample is a mixture of wild type plasmid and mutant plasmid at a ratio of 95:5.
１．サンプル調製
本実施例では、野生型及び変異型モデル検体として、SF3B1遺伝子配列を搭載したプラスミドDNAを用いた。5％変異型モデル検体は野生型プラスミドと変異型プラスミドを95：5の割合で混合したものである。 [Example 1]
1. Sample Preparation In this example, plasmid DNA carrying the SF3B1 gene sequence was used as wild type and mutant model specimens. The 5% mutant model sample is a mixture of wild type plasmid and mutant plasmid at a ratio of 95:5.
本実施例では、表１に示した遺伝子変異を検出するため、当該遺伝子変異を含む対象領域を増幅した。
In this example, in order to detect the genetic mutations shown in Table 1, the target region containing the genetic mutations was amplified.
本実施例では、表１に示した対象領域を増幅するため、表２に示したプライマーを設計した。
In this example, the primers shown in Table 2 were designed to amplify the target regions shown in Table 1.
以上のように調製したDNAサンプルを用いて、SF3B1遺伝子について対象領域をPCRにより増幅した。なお、PCRでは鋳型となるモデル検体を2pg/μLとした。反応液組成を表３に示した。
Using the DNA sample prepared as described above, the target region of the SF3B1 gene was amplified by PCR. In addition, in PCR, the model sample serving as a template was set at 2 pg/μL. Table 3 shows the reaction solution composition.
そして、PCRのサーマルサイクルを、９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とし、最終的に４℃を維持した。
Then, PCR thermal cycles were performed at 95°C for 5 minutes, followed by 40 cycles of 95°C for 30 seconds, 56°C for 30 seconds, and 72°C for 90 seconds, and then at 72°C for 10 minutes. Finally, the temperature was maintained at 4°C.
本実施例では、表１に示したSF3B1遺伝子における1986C>G、1997A>G変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表４にまとめて示した。
In this example, mutant probes corresponding to the 1986C>G and 1997A>G mutations in the SF3B1 gene shown in Table 1 and wild-type probes corresponding thereto were designed. The base sequences of each probe are summarized in Table 4.
２．遺伝子変異の検出
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規定温度（52℃）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標識オリゴDNA（ライフテクノロジーズジャパン社製））2μLを混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せた後、チップを予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱ごと52℃に設定したハイブリダイズオーブン内で１時間反応させた。ハイブリダイズ反応終了後、ハイブリカバーをはずしたチップを0.1×SSC/0.1% SDS溶液中で上下に数回振とうして洗浄した。その後、チップの蛍光強度を検出するまで1×SSC溶液（室温）に浸した。 2. Detection of Genetic Mutation Hybridization was performed as follows using a chip containing the above probe. First, a wet box was placed in a chamber set at a specified temperature (52° C.), and the chamber and the wet box were sufficiently preheated. Mix 4 μL of PCR reaction solution and 2 μL of hybridization buffer (2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5-labeled oligo DNA (manufactured by Life Technologies Japan)), take 3 μL of this solution, and place it on the central convex part of the hybrid cover. After the chip was covered with it, the chip was placed in a preheated wet box, and the wet box was reacted for 1 hour in a hybridization oven set at 52°C. After the hybridization reaction was completed, the chip from which the hybrid cover was removed was washed in a 0.1×SSC/0.1% SDS solution by shaking it up and down several times. Then, the chip was immersed in 1× SSC solution (room temperature) until the fluorescence intensity was detected.
上記プローブを有するチップを用いて以下のようにハイブリダイズを行った。先ず、規定温度（52℃）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び湿箱を十分予熱しておいた。PCR反応液4μLとハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5標識オリゴDNA（ライフテクノロジーズジャパン社製））2μLを混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せた後、チップを予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱ごと52℃に設定したハイブリダイズオーブン内で１時間反応させた。ハイブリダイズ反応終了後、ハイブリカバーをはずしたチップを0.1×SSC/0.1% SDS溶液中で上下に数回振とうして洗浄した。その後、チップの蛍光強度を検出するまで1×SSC溶液（室温）に浸した。 2. Detection of Genetic Mutation Hybridization was performed as follows using a chip containing the above probe. First, a wet box was placed in a chamber set at a specified temperature (52° C.), and the chamber and the wet box were sufficiently preheated. Mix 4 μL of PCR reaction solution and 2 μL of hybridization buffer (2.25×SSC/0.23%SDS/0.2 nM IC5-labeled oligo DNA (manufactured by Life Technologies Japan)), take 3 μL of this solution, and place it on the central convex part of the hybrid cover. After the chip was covered with it, the chip was placed in a preheated wet box, and the wet box was reacted for 1 hour in a hybridization oven set at 52°C. After the hybridization reaction was completed, the chip from which the hybrid cover was removed was washed in a 0.1×SSC/0.1% SDS solution by shaking it up and down several times. Then, the chip was immersed in 1× SSC solution (room temperature) until the fluorescence intensity was detected.
また、本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表５に示したブロッカーオリゴDNA（ブロッキング用核酸）を添加した。ブロッカーオリゴDNAは、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるように、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計されている。従来は一つの変異に対して1種類のブロッカーを添加する方法をとっていたが、本実施例では、近接する複数の変異箇所を含む配列のブロッカーオリゴDNAを設計した。すなわち、複数の変異箇所に対して1種類のブロッカーオリゴDNAを添加することで感度向上を図った。比較例として、複数の変異箇所それぞれに対して設計したブロッカーオリゴDNAを添加する従来手法で設計されたブロッカー配列を表６に示した。
Furthermore, in this example, blocker oligo DNA (nucleic acid for blocking) shown in Table 5 was added to the hybridization buffer. Blocker oligo DNA is added for the purpose of suppressing non-specific hybridization of mutation detection probes, so that sufficient detection sensitivity can be obtained even when the mutation rate of the target gene is small. It is designed to specifically hybridize with the amplification product derived from the type. Conventionally, a method was used in which one type of blocker was added for one mutation, but in this example, a blocker oligo DNA was designed with a sequence containing multiple mutation sites in close proximity. That is, we attempted to improve sensitivity by adding one type of blocker oligo DNA to multiple mutation sites. As a comparative example, Table 6 shows blocker sequences designed by the conventional method of adding blocker oligo DNA designed for each of a plurality of mutation sites.
検出直前にチップにカバーフィルムを被せ、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）でチップの蛍光強度を検出した。
Immediately before detection, the chip was covered with a cover film, and the fluorescence intensity of the chip was detected using BIOSHOT (manufactured by Toyo Kohan).
結果を図１に示した。1986は、従来のブロッカー（1986W-3B）を添加したとき、ブロッカー濃度の上昇に伴い変異型プローブの特異的シグナルが減少していることが分かる。これは、近接する1997のブロッカー（1997W-4B）の配列が変異型プローブの配列と一部重なっていることから、1986を含む変異産物と結合したことが要因と考えられる。一方、共通ブロッカー（1986_1997W-4）を使用した場合には、ブロッカー濃度が上昇しても変異型プローブの特異的シグナルが維持されていることが分かる。複数の変異部位を含むブロッカーを使用することで、変異型産物への意図しない結合が抑えられ、特異性が高まったと考えられる。1997でも同様に、従来のブロッカー（1997W-4B）ではブロッカー濃度が上昇するとともに変異プローブの特異的シグナルが減少する傾向にあるが、共通ブロッカー（1986_1997W-4）ではブロッカー濃度が上昇しても変異型プローブの特異的シグナルが維持されていることが確認された。
The results are shown in Figure 1. 1986 shows that when a conventional blocker (1986W-3B) is added, the specific signal of the mutant probe decreases as the blocker concentration increases. This is thought to be due to the fact that the sequence of the adjacent 1997 blocker (1997W-4B) partially overlaps with the sequence of the mutant probe, so it binds to the mutant product containing 1986. On the other hand, it can be seen that when the common blocker (1986_1997W-4) was used, the specific signal of the mutant probe was maintained even if the blocker concentration increased. It is thought that the use of a blocker containing multiple mutation sites suppressed unintended binding to the mutant product and increased specificity. Similarly, in 1997, with the conventional blocker (1997W-4B), the specific signal of the mutation probe tends to decrease as the blocker concentration increases, but with the common blocker (1986_1997W-4), even if the blocker concentration increases, the mutation probe's specific signal tends to decrease. It was confirmed that the specific signal of the type probe was maintained.
［実施例２］
本実施例では、実施例１で使用したモデル検体、実施例１で設計したプライマーを用いて実施例１と同様の手順によりPCRを実施した。本実施例では、表１に示したSF3B1遺伝子における1866G>T、1874G>T変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表７にまとめて示した。 [Example 2]
In this example, PCR was carried out in the same manner as in Example 1 using the model specimen used in Example 1 and the primers designed in Example 1. In this example, mutant probes corresponding to the 1866G>T and 1874G>T mutations in the SF3B1 gene shown in Table 1 and wild type probes corresponding thereto were designed. The base sequences of each probe are summarized in Table 7.
本実施例では、実施例１で使用したモデル検体、実施例１で設計したプライマーを用いて実施例１と同様の手順によりPCRを実施した。本実施例では、表１に示したSF3B1遺伝子における1866G>T、1874G>T変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表７にまとめて示した。 [Example 2]
In this example, PCR was carried out in the same manner as in Example 1 using the model specimen used in Example 1 and the primers designed in Example 1. In this example, mutant probes corresponding to the 1866G>T and 1874G>T mutations in the SF3B1 gene shown in Table 1 and wild type probes corresponding thereto were designed. The base sequences of each probe are summarized in Table 7.
ハイブリダイズ反応およびチップ蛍光強度の検出を実施した。なお、本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表８に示したブロッカーオリゴDNAを添加した。また、非検出対象塩基に対応する塩基が端部近傍に位置するように設計したブロッカーオリゴDNAを表９に示した。
Hybridization reaction and detection of chip fluorescence intensity were performed. In this example, the blocker oligo DNA shown in Table 8 was added to the hybridization buffer. Table 9 also shows blocker oligo DNAs designed so that the bases corresponding to the non-detection target bases are located near the ends.
結果を図２に示した。実施例１と同様に、表９に示したブロッカーオリゴDNAを使用した場合、ブロッカー濃度の上昇に伴い変異型プローブの特異的シグナルが減少していることが分かる。表９に示したブロッカーオリゴDNAの配列には、1866、1874の両方の変異が含まれており、変異型産物は1塩基のミスマッチが存在する。しかし、非検出対象塩基に対応する塩基が端部近傍（末端から1塩基）であるため特異性が低く、変異型産物と結合したと考えられる。一方、表８に示した共通ブロッカーでは、1866、1874共にブロッカー濃度が上昇しても特異的シグナルが維持されており、共通ブロッカーが有効に作用していることが確認された。
The results are shown in Figure 2. As in Example 1, it can be seen that when the blocker oligo DNA shown in Table 9 is used, the specific signal of the mutant probe decreases as the blocker concentration increases. The sequence of the blocker oligo DNA shown in Table 9 includes both mutations 1866 and 1874, and the mutant product has a single base mismatch. However, because the base corresponding to the non-detection target base is near the end (one base from the end), specificity is low, and it is thought that it binds to the mutant product. On the other hand, for the common blockers shown in Table 8, specific signals were maintained even when the blocker concentration increased for both 1866 and 1874, confirming that the common blockers were effective.
［実施例３］
本実施例では、実施例１で使用したモデル検体、実施例１で設計したプライマーを用いてPCRを実施した。本実施例で実施したPCRの反応液組成を表１０に示した。また、本実施例では、PCRのサーマルサイクルを、９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で９０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とし、最終的に４℃を維持した。 [Example 3]
In this example, PCR was performed using the model specimen used in Example 1 and the primers designed in Example 1. Table 10 shows the composition of the reaction solution for PCR carried out in this example. In this example, the thermal cycle of PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 40 cycles of 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 60°C, and 90 seconds at 72°C, and then 40 cycles at 72°C. The temperature was maintained at 4°C for 10 minutes.
本実施例では、実施例１で使用したモデル検体、実施例１で設計したプライマーを用いてPCRを実施した。本実施例で実施したPCRの反応液組成を表１０に示した。また、本実施例では、PCRのサーマルサイクルを、９５℃で５分間の後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で９０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とし、最終的に４℃を維持した。 [Example 3]
In this example, PCR was performed using the model specimen used in Example 1 and the primers designed in Example 1. Table 10 shows the composition of the reaction solution for PCR carried out in this example. In this example, the thermal cycle of PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by 40 cycles of 30 seconds at 95°C, 30 seconds at 60°C, and 90 seconds at 72°C, and then 40 cycles at 72°C. The temperature was maintained at 4°C for 10 minutes.
本実施例では、表１に示したSF3B1遺伝子における変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。また一部のプローブにおいて、検出対象の遺伝子領域とハイブリダイズする塩基配列を繰り返して直列に連結したプローブDNA（タンデムプローブ）を設計した。配列を繰り返すことで得られる蛍光強度を高め、感度向上を図った。各プローブの塩基配列を表１１にまとめて示した。表１１中、Iはデオキシイノシンを意味している。
In this example, a mutant probe corresponding to the mutation in the SF3B1 gene shown in Table 1 and a corresponding wild type probe were designed. In addition, for some of the probes, probe DNA (tandem probes) was designed in which repeating base sequences that hybridize with the gene region to be detected are connected in series. By repeating the sequence, the fluorescence intensity obtained was increased and sensitivity was improved. The base sequences of each probe are summarized in Table 11. In Table 11, I means deoxyinosine.
なお、ハイブリダイズ反応およびチップ蛍光強度の検出については、自動化検出装置(HySHOT HT-32またはBIOSHOT HT-32（医療機器届出番号：13B3X10232HT3201）、東洋鋼鈑製)を使用した。PCR産物30μlとハイブリダイズ緩衝液15μlを混合し、自動化検出装置にセットした。洗浄液（0.1×SSC/0.1%SDS溶液）、リンス液及び検出液（1×SSC）を調製し、装置の取り扱い説明書に従い、混合液、洗浄液、リンス液を自動検出装置にセットした。測定プログラムは表１２のように設定した。
For detection of hybridization reaction and chip fluorescence intensity, an automated detection device (HySHOT HT-32 or BIOSHOT HT-32 (medical device notification number: 13B3X10232HT3201), manufactured by Toyo Kohan) was used. 30 μl of the PCR product and 15 μl of hybridization buffer were mixed and set in an automated detection device. A cleaning solution (0.1×SSC/0.1% SDS solution), a rinsing solution, and a detection solution (1×SSC) were prepared, and the mixed solution, cleaning solution, and rinsing solution were set in the automatic detection device according to the device instruction manual. The measurement program was set as shown in Table 12.
以上のように測定した野生型プローブ及び変異型プローブにおける蛍光強度を用い、表１に示したSF3B1遺伝子変異について下記式によって判定値を算出した。
判定値＝[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの蛍光強度])
本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表１３に示したブロッカーオリゴDNA mixを添加した。 Using the fluorescence intensities of the wild type probe and mutant probe measured as described above, judgment values were calculated for the SF3B1 gene mutations shown in Table 1 using the following formula.
Judgment value = [Fluorescence intensity of mutant probe]/([Fluorescence intensity of wild type probe] + [Fluorescence intensity of mutant probe])
In this example, the blocker oligo DNA mix shown in Table 13 was added to the hybridization buffer.
判定値＝[変異型プローブの蛍光強度]/([野生型プローブの蛍光強度]+[変異型プローブの蛍光強度])
本実施例では、ハイブリダイズ緩衝液に表１３に示したブロッカーオリゴDNA mixを添加した。 Using the fluorescence intensities of the wild type probe and mutant probe measured as described above, judgment values were calculated for the SF3B1 gene mutations shown in Table 1 using the following formula.
Judgment value = [Fluorescence intensity of mutant probe]/([Fluorescence intensity of wild type probe] + [Fluorescence intensity of mutant probe])
In this example, the blocker oligo DNA mix shown in Table 13 was added to the hybridization buffer.
結果を図３に示した。表１で示した遺伝子変異について、野生型モデル検体における各野生型プローブの蛍光強度はすべて10000以上であり、判定に十分な強度を得られた。また、変異型プローブへの非特異的な結合は4000以下であった。次に、変異型5％モデル検体における各プローブの蛍光強度はすべて10000以上と判定に十分な強度を得られた。また、判定値は、変異型モデル検体と野生型モデル検体の差が全て0.2以上であり、良好な分離であった。以上より、野生型モデル検体と５％変異型モデル検体を明確に区別して同時に検出できることが明らかとなった。
The results are shown in Figure 3. Regarding the genetic mutations shown in Table 1, the fluorescence intensity of each wild-type probe in the wild-type model specimen was all 10,000 or more, which was sufficient for determination. In addition, non-specific binding to the mutant probe was less than 4000. Next, the fluorescence intensity of each probe in the mutant 5% model sample was all 10,000 or higher, which was sufficient for determination. Furthermore, as for the judgment values, the differences between the mutant model specimen and the wild type model specimen were all 0.2 or more, indicating good separation. From the above, it has become clear that the wild type model specimen and the 5% mutant model specimen can be clearly distinguished and simultaneously detected.
［実施例４］
本実施例では、マクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫に関連するMYD88(L265P）遺伝子とCXCR4(S338X）遺伝子の体細胞変異を検出するキット（WMチップ）における検討結果を示す。表１４にMYD88/CXCR4の対象検査変異を示した。また解析対象箇所を増幅するためのプライマーセットを表１５に示した。また、野生型および変異型モデル検体として、CXCR4遺伝子配列を搭載したプラスミドDNAを用いた。10％変異型モデル検体は野生型プラスミドと変異型プラスミドを90：10の割合で混合したものである。 [Example 4]
This example shows the results of an investigation using a kit (WM chip) for detecting somatic mutations in the MYD88 (L265P) gene and CXCR4 (S338X) gene, which are associated with macroglobulinemia and lymphoplasmacytic lymphoma. Table 14 shows the target mutations of MYD88/CXCR4. Further, Table 15 shows the primer set for amplifying the analysis target site. In addition, plasmid DNA carrying the CXCR4 gene sequence was used as wild type and mutant model specimens. The 10% mutant model sample is a mixture of wild type plasmid and mutant plasmid at a ratio of 90:10.
本実施例では、マクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫に関連するMYD88(L265P）遺伝子とCXCR4(S338X）遺伝子の体細胞変異を検出するキット（WMチップ）における検討結果を示す。表１４にMYD88/CXCR4の対象検査変異を示した。また解析対象箇所を増幅するためのプライマーセットを表１５に示した。また、野生型および変異型モデル検体として、CXCR4遺伝子配列を搭載したプラスミドDNAを用いた。10％変異型モデル検体は野生型プラスミドと変異型プラスミドを90：10の割合で混合したものである。 [Example 4]
This example shows the results of an investigation using a kit (WM chip) for detecting somatic mutations in the MYD88 (L265P) gene and CXCR4 (S338X) gene, which are associated with macroglobulinemia and lymphoplasmacytic lymphoma. Table 14 shows the target mutations of MYD88/CXCR4. Further, Table 15 shows the primer set for amplifying the analysis target site. In addition, plasmid DNA carrying the CXCR4 gene sequence was used as wild type and mutant model specimens. The 10% mutant model sample is a mixture of wild type plasmid and mutant plasmid at a ratio of 90:10.
表１６のように調整したDNAサンプルを用いて、MYD88及びCXCR4の2つの対象領域をそれぞれPCRにて増幅した。PCRのサーマルサイクルを表１７に示した。
Two target regions, MYD88 and CXCR4, were each amplified by PCR using DNA samples prepared as shown in Table 16. Table 17 shows the thermal cycles of PCR.
また、本実施例では、表１４に示したCXCR4(S338X）遺伝子における変異に対応する変異型プローブとこれに対応する野生型プローブを設計した。各プローブの塩基配列を表１８にまとめて示した。
Additionally, in this example, a mutant probe corresponding to the mutation in the CXCR4 (S338X) gene shown in Table 14 and a corresponding wild type probe were designed. The base sequences of each probe are summarized in Table 18.
調整したハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC、0.23％SDS）、PCR産物を冷凍庫から取り出し、常温に戻した。ハイブリダイズ緩衝液(2.25×SSC、0.23％SDS）は表１９に示したブロッカーオリゴDNAを添加した。ブロッカーオリゴDNAは、解析対象遺伝子の変異割合が小さい場合でも十分な検出感度が得られるに、変異検出用プローブの非特異的なハイブリダイズを抑制することを目的として添加されるもので、野生型由来の増幅産物と特異的にハイブリダイズするように設計された。実施例１、実施例２と同様に、本実施例では、近接する複数の変異を含む配列のブロッカーオリゴDNAを設計し、それらの変異に対して1種類のブロッカーを添加することで感度向上を図った。比較例として変異それぞれに対してブロッカーを添加する従来手法で設計されたブロッカー配列を表２０に示した。
The adjusted hybridization buffer (2.25×SSC, 0.23% SDS) and PCR product were taken out of the freezer and returned to room temperature. Blocker oligo DNA shown in Table 19 was added to the hybridization buffer (2.25×SSC, 0.23% SDS). Blocker oligo DNA is added for the purpose of suppressing non-specific hybridization of the mutation detection probe, and is used to obtain sufficient detection sensitivity even when the mutation rate of the target gene is small. It was designed to specifically hybridize with the derived amplification product. Similar to Examples 1 and 2, in this example, we designed a blocker oligo DNA with a sequence containing multiple mutations in close proximity, and added one type of blocker to those mutations to improve sensitivity. planned. As a comparative example, Table 20 shows blocker sequences designed by the conventional method of adding blockers to each mutation.
PCR産物30μlとハイブリダイズ緩衝液15μlを混合し、自動化検出装置(HySHOT HT-32またはBIOSHOT HT-32)にセットした。洗浄液（0.1×SSC/0.1%SDS溶液）、リンス液及び検出液（1×SSC）を調製し、装置の取り扱い説明書に従い、混合液、洗浄液、リンス液をBIOHSHOTにセットした。その後、蛍光強度推定法により測定した。装置の試験条件は表２１に示した。
30 μl of PCR product and 15 μl of hybridization buffer were mixed and set in an automated detection device (HySHOT HT-32 or BIOSHOT HT-32). A cleaning solution (0.1×SSC/0.1% SDS solution), a rinsing solution, and a detection solution (1×SSC) were prepared, and the mixed solution, cleaning solution, and rinsing solution were set in the BIOHSHOT according to the instruction manual of the device. Thereafter, it was measured using a fluorescence intensity estimation method. The test conditions for the device are shown in Table 21.
結果を図４に示す。共通ブロッカーの分離性能は従来ブロッカーに対し、同等もしくは上回る性能であることが確認された。
The results are shown in Figure 4. It was confirmed that the separation performance of the common blocker is equivalent to or superior to that of conventional blockers.
[実施例５]
本実施例では、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を有するブロッキング用核酸（共通ブロッカー）が適用可能な、当該複数の塩基の位置及び当該塩基同士の間隔の最大値について、計算により求めた。ハイブリダイズ温度を60℃としたとき、標準的なターゲット配列として表２２に示した野生型モデル配列（＝ブロッカーモデル配列）を設定した。 [Example 5]
In this example, the positions of the plurality of bases and the maximum value of the spacing between the bases to which a blocking nucleic acid (common blocker) having a plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases can be applied are calculated by calculation. I asked for it. When the hybridization temperature was 60°C, the wild type model sequence (=blocker model sequence) shown in Table 22 was set as the standard target sequence.
本実施例では、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を有するブロッキング用核酸（共通ブロッカー）が適用可能な、当該複数の塩基の位置及び当該塩基同士の間隔の最大値について、計算により求めた。ハイブリダイズ温度を60℃としたとき、標準的なターゲット配列として表２２に示した野生型モデル配列（＝ブロッカーモデル配列）を設定した。 [Example 5]
In this example, the positions of the plurality of bases and the maximum value of the spacing between the bases to which a blocking nucleic acid (common blocker) having a plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases can be applied are calculated by calculation. I asked for it. When the hybridization temperature was 60°C, the wild type model sequence (=blocker model sequence) shown in Table 22 was set as the standard target sequence.
表２２の配列を5’側、3’側から一塩基ずつT（元来Tの箇所はA）に変換したものを変異型モデル配列とし、野生型モデル配列とのミスマッチTm値を計算した（表２３）。本実施例では、5’側、3’側それぞれ末端から6塩基まで変異させたモデル配列で計算した。なお、ミスマッチTm値と野生型モデル配列Tm値の差（＝ΔTm）が1.5℃以上であることをブロッカーの特異性が良好で共通ブロッカーが適用可能基準とした。
The sequence in Table 22 was converted to a T from the 5' side and 3' side one by one (the original T position was replaced by A), and was used as the mutant model sequence, and the mismatch Tm value with the wild type model sequence was calculated ( Table 23). In this example, calculations were performed using a model sequence in which up to 6 bases from the 5' and 3' ends were mutated. The difference between the mismatch Tm value and the wild type model sequence Tm value (=ΔTm) of 1.5°C or more was defined as a criterion for good blocker specificity and a common blocker to be applicable.
表２３に変異型モデル配列とミスマッチTmの計算結果を示した。ΔTmが1.5℃以上であった変異箇所の位置は5’側から2塩基、3’側から3塩基より内側のときであった。したがって、共通ブロッカーが適用可能な最大の変異間隔（変異を除く内側の塩基数）は、39塩基－(2塩基+3塩基)＝34塩基であった。
Table 23 shows the calculation results of the mutant model sequence and mismatch Tm. The mutation site where ΔTm was 1.5°C or higher was located two bases from the 5' side and three bases from the 3' side. Therefore, the maximum mutation interval (inner base number excluding mutations) to which the common blocker can be applied was 39 bases - (2 bases + 3 bases) = 34 bases.
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
All publications, patents, and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entirety.
Claims (12)
- 所定の変異箇所について検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーションに使用するバッファー組成物であって、前記ターゲット核酸には上記所定の変異箇所の他に１又は複数の変異箇所が含まれ、これら変異箇所における検出対象塩基に対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含有する、ハイブリダイゼーション用バッファー組成物。 A buffer composition used for hybridization between a target nucleic acid containing a base to be detected at a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, the buffer composition comprising: A blocking nucleic acid containing a base sequence complementary to a non-target nucleic acid, which contains one or more mutation sites in addition to the mutation site, and includes a plurality of non-detection target bases corresponding to the detection target bases at these mutation sites. A hybridization buffer composition containing.
- 上記ブロッキング用核酸は、前記複数の変異箇所における非検出対象塩基に対応する塩基が５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。 2. The blocking nucleic acid is characterized in that the base corresponding to the non-detection target base at the plurality of mutation sites is located two bases inward from the 5' side and three bases inward from the 3' side. 1. The hybridization buffer composition according to 1.
- 上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を２０塩基以内に有することを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。 The hybridization buffer composition according to claim 1, wherein the blocking nucleic acid has a plurality of bases within 20 bases corresponding to a plurality of non-detection target bases.
- 上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも１カ所が５～２０塩基離間していることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。 2. The blocking nucleic acid according to claim 1, wherein among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart. Buffer composition for hybridization.
- 上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに使用されることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。 The hybridization buffer composition according to claim 1, which is used in a microarray in which the nucleic acid probe is immobilized on a substrate.
- 上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液と混合されることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。 The hybridization buffer composition according to claim 1, which is mixed with a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid.
- 所定の変異箇所について検出対象塩基を含むターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含む核酸プローブとのハイブリダイゼーション方法であって、前記ターゲット核酸には上記所定の変異箇所の他に１又は複数の変異箇所が含まれ、これら変異箇所における検出対象塩基に対応する複数の非検出対象塩基を含む非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むブロッキング用核酸を含有するハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記ターゲット核酸を含有する溶液とを混合し、その後、上記核酸プローブと上記ターゲット核酸とのハイブリダイズを行う、ハイブリダイゼーション方法。 A hybridization method of a target nucleic acid containing a base to be detected at a predetermined mutation site and a nucleic acid probe containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, the target nucleic acid containing a base sequence complementary to the target nucleic acid, contains one or more mutation sites, and contains a blocking nucleic acid containing a complementary base sequence to a non-target nucleic acid containing multiple non-detection target bases corresponding to the detection target bases at these mutation sites. A hybridization method, comprising: mixing a buffer composition for use with a solution containing the target nucleic acid, and then hybridizing the nucleic acid probe with the target nucleic acid.
- 上記ブロッキング用核酸は、前記複数の変異箇所における非検出対象塩基に対応する塩基が５’側から２塩基より内側、且つ、３’側から３塩基より内側に位置することを特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。 2. The blocking nucleic acid is characterized in that the base corresponding to the non-detection target base at the plurality of mutation sites is located two bases inward from the 5' side and three bases inward from the 3' side. 7. Hybridization method according to 7.
- 上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基を２０塩基以内に有することを特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。 8. The hybridization method according to claim 7, wherein the blocking nucleic acid has a plurality of bases within 20 bases corresponding to a plurality of non-detection target bases.
- 上記ブロッキング用核酸は、複数の非検出対象塩基に対応する複数の塩基のうち、隣り合う塩基の間隔の少なくとも１カ所が５～２０塩基離間していることを特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。 8. The blocking nucleic acid according to claim 7, wherein among the plurality of bases corresponding to the plurality of non-detection target bases, at least one interval between adjacent bases is 5 to 20 bases apart. Bridification method.
- 上記核酸プローブが基板上に固定されてなるマイクロアレイに、上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物と、上記ターゲット核酸を含有する溶液とを混合した混合液を接触させることを特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。 8. The hybridization method according to claim 7, wherein a mixture of the hybridization buffer composition and a solution containing the target nucleic acid is brought into contact with the microarray in which the nucleic acid probe is immobilized on a substrate. Bridification method.
- 上記ターゲット核酸を含有する溶液は、上記ターゲット核酸を増幅する核酸増幅反応の後の反応液であり、当該反応液と上記ハイブリダイゼーション用バッファー組成物とを混合することを特徴とする請求項７記載のハイブリダイゼーション方法。 8. The solution containing the target nucleic acid is a reaction solution after a nucleic acid amplification reaction for amplifying the target nucleic acid, and the reaction solution and the hybridization buffer composition are mixed. hybridization method.
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP2010200701A (en) * | 2009-03-04 | 2010-09-16 | Fukuoka Prefecture | Nucleic acid hybridization method, method for determination of single nucleotide polymorphism, and reaction vessel and determination apparatus for determination of single nucleotide polymorphism |
| US20120244538A1 (en) * | 2009-10-09 | 2012-09-27 | Martin Schuler | Method for detecting gene modifications by means of asymmetrical pcr and blocking agents |
| WO2015045741A1 (en) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | 東洋鋼鈑株式会社 | Buffer composition for hybridization use, and hybridization method |
| JP2018019640A (en) * | 2016-08-03 | 2018-02-08 | 東洋鋼鈑株式会社 | Buffer composition for hybridization and hybridization method |
-
2022
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-
2023
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010200701A (en) * | 2009-03-04 | 2010-09-16 | Fukuoka Prefecture | Nucleic acid hybridization method, method for determination of single nucleotide polymorphism, and reaction vessel and determination apparatus for determination of single nucleotide polymorphism |
| US20120244538A1 (en) * | 2009-10-09 | 2012-09-27 | Martin Schuler | Method for detecting gene modifications by means of asymmetrical pcr and blocking agents |
| WO2015045741A1 (en) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | 東洋鋼鈑株式会社 | Buffer composition for hybridization use, and hybridization method |
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