WO2024010064A1 - 細胞培養装置及び細胞培養方法 - Google Patents

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WO2024010064A1
WO2024010064A1 PCT/JP2023/025128 JP2023025128W WO2024010064A1 WO 2024010064 A1 WO2024010064 A1 WO 2024010064A1 JP 2023025128 W JP2023025128 W JP 2023025128W WO 2024010064 A1 WO2024010064 A1 WO 2024010064A1
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WO
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culture solution
solution storage
culture
hydrogel
storage tank
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Application number
PCT/JP2023/025128
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English (en)
French (fr)
Inventor
慎治 杉浦
佳子 柿澤
敏幸 金森
和美 進
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture device and a cell culture method.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-110291 filed in Japan on July 8, 2022, the contents of which are incorporated herein.
  • Patent Document 1 discloses a microchannel device.
  • the microfluidic device comprises a substrate made of an optically transparent material and further includes one or more fluid channels, one or more fluid channel inlets, one or more fluid channel outlets, It includes one or more gel cage regions and a plurality of struts. All or a portion of each gel cage region is flanked by all or a portion of one or more fluid channels, thereby creating one or more gel cage region-fluid channel interface regions.
  • Each gel cage region includes at least one row of struts forming the gel cage region, the at least one row of struts with each strut formed as a triangle, a trapezoid with an interior angle of less than 90°, or a combination thereof.
  • the sum of the inner angle of each strut corner and the contact angle of the gel on the substrate surface in at least one strut row is 180°, and the distance between each adjacent pair of struts in at least one strut row is The distance is said to be 50 micrometers to 300 micrometers.
  • vascular endothelial cells have been placed inside or near a hydrogel to spontaneously construct vascular tissue.
  • Cell culture methods are known.
  • this method has limitations on the size of vascular tissue that can be constructed due to limitations on the supply of oxygen and nutrients into the hydrogel.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and aims to provide a cell culture device and a cell culture method that can efficiently construct large cell tissues in vitro.
  • a cell culture device includes a hydrogel chamber that holds a hydrogel for culturing cells, a first culture fluid storage portion that communicates with a first surface of the hydrogel chamber, and a first culture fluid storage portion that communicates with a first surface of the hydrogel chamber.
  • a culture container including a second culture solution reservoir communicating with a second surface different from the first surface; and a pneumatic device connected to the culture container, the pneumatic device being connected to the first surface.
  • Culture stored in at least one of the first culture solution storage section and the second culture solution storage section by creating a pressure difference based on air pressure between the culture solution storage section and the second culture solution storage section. The liquid is infiltrated into the hydrogel in the hydrogel chamber under pressure.
  • At least one of the first culture solution storage section and the second culture solution storage section includes a culture solution storage tank that stores a culture solution, and the culture solution storage tank. and a microchannel communicating with the hydrogel chamber.
  • the microchannel may be provided with one or a plurality of resistance channels having a smaller cross-sectional area than the microchannel.
  • the flow path resistance (R MC ) of the resistance flow path is determined by the viscosity ( ⁇ ) of the culture solution, the viscosity ( ⁇ ) of the culture solution, and the range from the first surface to the second surface of the hydrogel chamber.
  • the relationship R MC ⁇ 8 ⁇ L/ ⁇ d 4 N may be satisfied.
  • a pair of the microchannels may be provided.
  • the first culture solution storage section includes a first culture solution storage tank as the culture solution storage tank and a first microchannel as the microchannel.
  • the second culture solution storage unit includes a second culture solution storage tank as the culture solution storage tank and a second microchannel as the microchannel, and the second culture solution storage unit includes a second culture solution storage tank as the culture solution storage tank and a second microchannel as the microchannel, and the second culture solution storage unit includes a second culture solution storage tank as the culture solution storage tank and a second microchannel as the microchannel.
  • a culture solution return channel that communicates with the second culture solution storage tank, at least one of the first microchannel and the second microchannel, and a mechanism for preventing backflow of the culture solution are provided in the return channel. You may prepare.
  • a passive valve that prevents air bubbles from entering may be provided as the mechanism for preventing the backflow.
  • the pressure resistance of the passive valve may be within a range of 0.1 [kPa] to 10 [kPa].
  • an opening may be formed directly above the hydrogel chamber.
  • a third culture solution storage portion communicating through the opening is provided, and the second opening has one side facing the hydrogel.
  • a permeable membrane whose other side faces the culture solution may be provided.
  • the pneumatic device may be connected to the third culture fluid reservoir.
  • the pneumatic device may include pneumatic piping connected to the culture container, and the pneumatic piping may be provided with a filter.
  • the hydrogel chamber may include a mechanism for holding the hydrogel in a state where a pressure difference based on the air pressure is generated.
  • cells are cultured in the hydrogel chamber using the cell culture device described above.
  • the cells may be cultured to form vascular tissue within the hydrogel chamber.
  • large cell tissues can be efficiently constructed in vitro.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along arrow II-II shown in FIG. 1.
  • FIG. 3 is a sectional view taken along arrows III-III shown in FIG. 2.
  • FIG. 4 is an enlarged view of area A shown in FIG. 3.
  • FIG. It is a perspective view showing a cell culture device concerning a 2nd embodiment.
  • 6 is a sectional view taken along arrow VI-VI shown in FIG. 5.
  • FIG. 7 is a sectional view taken along arrow VII-VII shown in FIG. 6.
  • FIG. 7 is a perspective view showing a cell culture device concerning a 3rd embodiment.
  • FIG. 7 is a plan cross-sectional view showing main parts of a cell culture device according to a third embodiment.
  • FIG. 7 is a plan cross-sectional view showing main parts of a cell culture device according to a third embodiment.
  • FIG. 7 is a plan cross-sectional view showing main parts of a cell culture device according to a fourth embodiment. 11 is an enlarged view of region B shown in FIG. 10.
  • FIG. It is a perspective view showing a cell culture device concerning a 5th embodiment. 13 is a sectional view taken along arrows XIII-XIII shown in FIG. 12.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view taken along arrows XIV-XIV shown in FIG. 13.
  • FIG. It is a perspective view showing a cell culture device concerning a 6th embodiment.
  • 16 is a sectional view taken along arrows XVI-XVI shown in FIG. 15.
  • FIG. 17 is a sectional view taken along arrow XVII-XVII shown in FIG. 16.
  • FIG. 16 is a sectional view taken along arrow XVII-XVII shown in FIG. 16.
  • FIG. 7 is a schematic plan view showing a cell culture device according to an eighth embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic plan view showing a cell culture device according to a ninth embodiment. It is a graph showing the relationship between blood vessel diameter, shear stress, and flow rate according to the first example.
  • It is a fluorescence microscopy image of vascular tissue in the case of “no resistance flow path” according to the first example.
  • It is a fluorescence microscopy image of vascular tissue in the case of “with resistance flow path” according to the first example.
  • It is a fluorescence microscope image of the entire vascular tissue in the case of "no resistance flow path” according to the first example.
  • FIG. 3 is a schematic plan view showing a cell culture device according to a second example. These are fluorescence microscope images of Calcein immediately after and 50 seconds after pressurizing the culture container according to the second example at 2.0 [kPa]. Rhodamine-Dextran fluorescence interface when the culture container according to the second example is pressurized at 0.5 [kPa], 1.0 [kPa], 2.0 [kPa], and 3.0 [kPa] It is a graph showing the results of measuring the movement of .
  • FIG. 7 is a fluorescence microscope image showing the formation behavior of blood vessels with and without mesenchymal stem cells according to the second example.
  • FIG. 7 is a graph showing the change in blood flow rate in a blood vessel with and without mesenchymal stem cells according to a second example.
  • FIG. 7 is a schematic plan view showing a cell culture device according to a modified example of the second embodiment.
  • FIG. 7 is an image analysis diagram when determining the permeability coefficient of a fluorescent substance through a blood vessel wall in order to evaluate the barrier ability of a blood vessel tissue formed using a cell culture apparatus according to a second example and a modification thereof.
  • FIG. 7 is a diagram showing an image in which vascular endothelial cells formed using the cell culture device according to the second embodiment and a modification thereof are stained with CD31, which is a marker, and an image in which NG2, which is a marker for mesenchymal stem cells, is stained. .
  • FIG. 7 is a diagram showing images of vascular endothelial cells formed using the cell culture apparatus according to the second example and a modification thereof, stained with ZO-1, which constitutes tight junctions in the blood vessel wall.
  • the present invention can be applied to vascular permeability testing of drug candidate compounds in drug discovery, organoid culture for regenerative medicine and cell assays, cancer invasion evaluation, and the like.
  • drug discovery when evaluating the pharmacokinetics of a drug, the permeability of the drug to the blood vessel wall may be evaluated. It can be used as a method. In particular, it can be used as a device and test method that can accurately evaluate the permeability of the blood-brain barrier.
  • organoid culture methods have recently attracted attention, and the cell culture device and cell culture method of the present invention can be used to culture vascularized organoids in order to further mature the organoids.
  • distant metastasis of cancer is related to the movement of cancer cells through blood vessels, and the cell culture device and cell culture method of the present invention can be used as a model for evaluating cancer cell metastasis in drug discovery and clinical testing. Available.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a cell culture device 1 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along arrow II-II shown in FIG.
  • FIG. 3 is a sectional view taken along arrows III-III shown in FIG.
  • FIG. 4 is an enlarged view of area A shown in FIG.
  • the cell culture device 1 includes a culture container 2 that holds a hydrogel 100 for culturing cells and stores a culture solution 101 that supplies oxygen, nutrients, etc. to the cells.
  • the culture container 2 is preferably formed of a transparent material with high light transmittance for purposes such as observation of cells, but may be formed of a material with low light transmittance or no light transmittance. In that case, a glass window or the like may be provided at a position where the cells can be visually recognized.
  • the culture container 2 includes a hydrogel chamber 10, a first culture solution storage section 20, and a second culture solution storage section 30.
  • Hydrogel chamber 10 is arranged between first culture solution reservoir 20 and second culture solution reservoir 30. In the example shown in FIG. 1, the hydrogel chamber 10 is arranged horizontally adjacent to the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30.
  • the X-axis direction is the first horizontal direction in which the first culture solution storage section 20, the hydrogel chamber 10, and the second culture solution storage section 30 are lined up.
  • the Y-axis direction is a second horizontal direction orthogonal to the X-axis direction.
  • the Z-axis direction is a vertical direction orthogonal to the X-axis direction and the Y-axis direction.
  • the hydrogel chamber 10 has a flat internal space 11.
  • the height (dimension in the Z-axis direction) of the internal space 11 of the hydrogel chamber 10 is, for example, within the range of 100 [ ⁇ m] to 500 [ ⁇ m].
  • the internal space 11 of the hydrogel chamber 10 is filled with hydrogel 100.
  • the hydrogel 100 has a three-dimensional polymer network structure and retains water, and also embeds or adheres cells to culture the cells.
  • the hydrogel chamber 10 is formed into a hexagonal shape when viewed from above.
  • the shape of the hydrogel chamber 10 in plan view is not particularly limited, but the length (dimension in the Y-axis direction) adjacent to the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30 is the same as the width (dimension in the X-axis direction). (dimensions) is better.
  • the dimension of the hydrogel chamber 10 in the Y-axis direction is, for example, within the range of 1 [mm] to 20 [mm].
  • the dimension of the hydrogel chamber 10 in the X-axis direction is, for example, within a range of 1 [mm] to 10 [mm].
  • the hydrogel chamber 10 has a first surface 12 that communicates with the first culture solution reservoir 20 and a second surface 13 that communicates with the second culture solution reservoir 30.
  • the first surface 12 and the second surface 13 face each other in the X-axis direction and extend parallel to each other in the Y-axis direction. Both ends of the hydrogel chamber 10 in the Y-axis direction communicate with introduction holes 14 and 15 via introduction paths 14a and 15a.
  • a hydrogel storage tank 16 into which the hydrogel 100 is introduced is formed directly above the hydrogel chamber 10 .
  • the introduction hole 14 connects the top surface of the hydrogel chamber 10 and the bottom surface of the hydrogel storage tank 16 at one end side (-Y side) of the hydrogel chamber 10 in the Y-axis direction.
  • the introduction hole 15 allows the top surface of the hydrogel chamber 10 and the bottom surface of the hydrogel storage tank 16 to communicate with each other on the other end side (+Y side) of the hydrogel chamber 10 in the Y-axis direction.
  • the two introduction holes 14 and 15 facilitate removing air from the hydrogel chamber 10 and filling the hydrogel chamber 10 with the hydrogel 100 from the hydrogel storage tank 16.
  • the first culture solution storage section 20 includes a first culture solution storage tank 21 that stores the culture solution 101.
  • the first culture solution storage tank 21 is formed in a long hole shape or an elliptical shape extending in the Y-axis direction when viewed from above. Note that the shape of the first culture solution storage tank 21 in plan view is not particularly limited.
  • the first culture solution storage tank 21 preferably has a larger internal space (volume) than the hydrogel chamber 10. The side surface of the bottom of the first culture solution storage tank 21 on the hydrogel chamber 10 side (+X side) communicates with the first surface 12 of the hydrogel chamber 10 .
  • the second culture solution storage section 30 includes a second culture solution storage tank 31 that stores the culture solution 101.
  • the second culture solution storage tank 31 is formed in a long hole shape or an elliptical shape extending in the Y-axis direction when viewed from above. Note that the planar shape of the second culture solution storage tank 31 is not particularly limited.
  • the second culture solution storage tank 31 also preferably has a larger internal space (volume) than the hydrogel chamber 10. The side surface of the bottom of the second culture solution storage tank 31 on the hydrogel chamber 10 side (-X side) communicates with the second surface 13 of the hydrogel chamber 10.
  • the culture container 2 configured as described above is connected to a pneumatic device 5, as shown in FIG.
  • the pneumatic device 5 includes a pneumatic pump 50 connected to the first culture solution storage tank 21 and a pneumatic pump 60 connected to the second culture solution storage tank 31.
  • the pneumatic pumps 50 and 60 can continuously pressurize the inside of the culture container 2, for example, while a motor (not shown) is being driven.
  • the pneumatic device 5 generates a pressure difference based on pneumatic pressure between the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31, so that the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31 is infiltrated into the hydrogel 100 of the hydrogel chamber 10 under pressure.
  • the empty Either one of the pressure pumps 50 and 60 may be omitted.
  • pneumatic piping is branched from one pneumatic pump and connected to each of the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31, and a switching valve is provided in the branch pipe of the pneumatic pipe, The culture solution storage tank to which air pressure is applied may be changed.
  • the pneumatic device 5 is equipped with a pressure regulator (not shown), for example, and adjusts the pressure within the range of 0.1 [kPa] to 10 [kPa]. Pressurize at least one of them.
  • the culture container 2 is equipped with strut rows 22 and 32 as a mechanism for holding the hydrogel 100 in the hydrogel chamber 10 even when a pressure difference based on the air pressure is generated. Furthermore, the hydrogel chamber 10 may be subjected to a surface treatment to retain the hydrogel 100 (such as a coating treatment to adjust surface wettability).
  • the column row 22 is provided along the first surface 12 of the hydrogel chamber 10 that communicates with the first culture solution storage tank 21.
  • the height of the strut row 22 is the same as the height of the internal space 11 of the hydrogel chamber 10. Further, the distance between each pillar of the pillar row 22 is within a range of, for example, 50 [ ⁇ m] to 300 [ ⁇ m]. The detailed structure of the strut row 22 will be described below with reference to FIG. 4.
  • the column row 22 includes a plurality of columns 40 that form an interface area between the hydrogel chamber 10 and the first culture solution storage tank 21.
  • the pillars 40 are formed at equal intervals with gaps in the Y-axis direction.
  • a fluid channel that communicates with the hydrogel chamber 10 and the first culture solution storage tank 21 is formed between the pillars 40 adjacent in the Y-axis direction.
  • the support column 40 is formed into a substantially pentagonal shape in a plan cross-sectional view.
  • the side surface of the support column 40 connects a pair of slopes 41 arranged on the side of the hydrogel chamber 10, a plane 42 arranged on the side of the first culture solution storage tank 21, and a pair of slopes 41 and the plane 42.
  • the ends of the pair of slopes 41 facing inside the hydrogel chamber 10 are connected to each other.
  • the connection angle between the pair of slopes 41 is an acute angle. Furthermore, the angles of the pair of slopes 41 with respect to the XZ plane are equal.
  • the plane 42 forms a plane parallel to the YZ plane.
  • the pair of curved surfaces 43 smoothly connect the end of the +Y side of the plane 42 and the end of the slope 41 arranged on the +Y side, and also connect the end of the -Y side of the plane 42 and the end of the slope 41 arranged on the -Y side.
  • the end of the slope 41 is smoothly connected to the end of the slope 41.
  • the gap (dimension in the Y-axis direction) between adjacent pillars 40 has a width w1 at the plane 42 portion, a minimum width w2 at the curved surface 43 portion, and a maximum width w3 at the end connection portion of the pair of slopes 41.
  • the width w1, the width w2, and the width w3 have a relationship of w2 ⁇ w1 ⁇ w3.
  • the gap between adjacent pillars 40 decreases from the first culture solution storage tank 21 toward the hydrogel chamber 10, and then begins to increase. This makes it easy to supply the culture solution 101 from the first culture solution storage tank 21 to the hydrogel chamber 10, and makes it difficult for the hydrogel 100 to flow out from the hydrogel chamber 10 into the first culture solution storage tank 21 due to the wedge effect. can.
  • the column row 32 is provided along the second surface 13 of the hydrogel chamber 10 that communicates with the second culture solution storage tank 31.
  • the column row 32 includes a plurality of columns 40 that form an interface area between the hydrogel chamber 10 and the second culture solution storage tank 31. Note that the structure of the columns 40 of the column 32 is symmetrical to that of the column 40 of the column 22 placed on the opposite side of the hydrogel chamber 10 (on the side of the first culture solution storage tank 21). I will omit the explanation.
  • the shape of the support column 40 is preferably the above-mentioned shape, but may be formed in a known triangular shape, trapezoid shape, or the like.
  • the culture solution 101 is stored in the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30 adjacent to the hydrogel chamber 10, and the culture solution 101 stored in the culture solution 101 is By applying air pressure, the culture solution 101 can be permeated into the hydrogel 100 and cells can be cultured.
  • the pneumatic device 5 to the culture container 2 and culturing cells (e.g., vascular endothelial cells) while infiltrating the culture solution 101 into the hydrogel 100 using air pressure, blood vessels in the hydrogel 100 are cultured. It can promote tissue formation.
  • the cell culture device 1 includes a hydrogel chamber 10 that holds a hydrogel 100 for culturing cells, and a first culture solution reservoir that communicates with the first surface 12 of the hydrogel chamber 10. 20 and a second culture solution reservoir 30 that communicates with a second surface 13 different from the first surface 12 of the hydrogel chamber 10; a pneumatic device 5 connected to the culture container 2; , the pneumatic device 5 generates a pressure difference based on pneumatic pressure between the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30, and the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30
  • the culture solution 101 stored in at least one of the culture solution storage sections 30 is infiltrated into the hydrogel 100 of the hydrogel chamber 10 under pressure. According to this configuration, a large cell tissue can be efficiently constructed in vitro.
  • the hydrogel chamber 10 includes strut rows 22 and 32 as a mechanism for holding the hydrogel 100 in a state where a pressure difference based on air pressure is generated.
  • the culture solution 101 can be easily supplied from the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30 to the hydrogel chamber 10, and even when air pressure is applied, the culture solution 101 can be easily supplied from the hydrogel chamber 10. In this case, it becomes difficult for the hydrogel 100 to flow out into the first culture solution storage section 20 or the second culture solution storage section 30.
  • the hydrogel chamber 10 may be subjected to a surface treatment to retain the hydrogel 100.
  • cells are cultured in a hydrogel chamber 10 using the cell culture device 1 described above. According to this configuration, a large cell tissue can be efficiently constructed in vitro.
  • cells are cultured to form vascular tissue within the hydrogel chamber 10. According to this configuration, large vascular tissue can be efficiently constructed in vitro.
  • FIG. 5 is a perspective view showing the cell culture device 1 according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a sectional view taken along the line VI-VI shown in FIG.
  • FIG. 7 is a sectional view taken along arrow VII-VII shown in FIG.
  • the second embodiment differs from the above embodiment in that a lid 3 to which pneumatic pipes 51 and 61 are connected is fixed to the top of the culture container 2.
  • the lower surface of the lid 3 has a first concave portion 23 that is concave upward and communicates with the first culture solution storage tank 21, and a first concave portion 23 that is concave toward the top and communicates with the second culture solution storage tank 31.
  • a second recess 33 having a concave shape is formed. Note that the upper part of the hydrogel storage tank 16 is closed by the lower surface of the lid part 3.
  • a pneumatic pipe 51 is connected to the lid 3 so as to communicate with the first recess 23 .
  • a pneumatic pipe 61 is connected to the lid 3 so as to communicate with the second recess 33 .
  • the direction in which the pneumatic pipes 51 and 61 are connected to the lid portion 3 is not limited to the Y-axis direction, but may be the X-axis direction or the Z-axis direction.
  • the pneumatic pipe 51 is connected to the pneumatic pump 50. Further, the pneumatic pipe 61 is connected to the pneumatic pump 60. Thereby, the first culture solution storage tank 21 can be pressurized from the pneumatic pump 50 via the pneumatic piping 51. Further, the second culture solution storage tank 31 can be pressurized from the pneumatic pump 60 via the pneumatic piping 61. It is preferable to provide a filter in a part of the pneumatic piping 51, 61, thereby suppressing foreign matter such as dust from entering the first culture solution storage tank 21 or the second culture solution storage tank 31. It is preferable to use a filter made of a hydrophobic material with a pore diameter of 0.22 [ ⁇ m] or less, for example.
  • O-rings may be placed at the opening edges of the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31 of the culture container 2 and sandwiched between them and the lid 3. Thereby, pressure leakage from the gap in the lid portion 3 can be suppressed.
  • the lid 3 may be fixed to the culture container 2 with bolts or the like so that the O-ring is crushed in the vertical direction. Thereby, the sealing performance between the container body of the culture container 2 and the lid part 3 can be improved.
  • the culture container 2 includes the lid 3.
  • Pneumatic pipes 51 and 61 are connected to the lid part 3. According to this configuration, by removing the pneumatic pipes 51 and 61 from the lid 3, the connection between the culture container 2 and the pneumatic device 5 can be easily disconnected. As a result, after transporting the pneumatic pipes 51 and 61 from the lid 3 to another location such as a clean bench, the lid 3 can be removed and the hydrogel 100 or culture solution 101 can be easily transferred to the culture container 2. can be supplied. Further, the pneumatic pipes 51 and 61 are provided with filters. According to this configuration, when applying air pressure, it is possible to suppress foreign matter such as dust from entering the first culture solution storage tank 21 or the second culture solution storage tank 31.
  • FIG. 8 is a perspective view showing the cell culture device 1 according to the third embodiment.
  • FIG. 9 is a plan cross-sectional view showing the main parts of the cell culture device 1 according to the third embodiment. Note that, like FIGS. 3 and 7 described above, FIG. 9 shows a plan cross-sectional view taken along the hydrogel chamber 10.
  • the first culture solution storage section 20 includes the first microchannel 24 that communicates the first culture solution storage tank 21 and the hydrogel chamber 10.
  • the second culture solution storage section 30 includes a second microchannel 34 that communicates the second culture solution storage tank 31 and the hydrogel chamber 10.
  • the first microchannel 24 includes a flat internal space similarly to the hydrogel chamber 10, and extends in a strip shape in the X-axis direction. Note that the height (dimension in the Z-axis direction) of the internal space of the first microchannel 24 is, for example, the same as that of the hydrogel chamber 10. Further, as shown in FIG. 9, the width (dimension in the Y-axis direction) of the first microchannel 24 is, for example, the same as the width (dimension in the Y-axis direction) of the first surface 12.
  • the second microchannel 34 includes a flat internal space similarly to the hydrogel chamber 10, and extends in a strip shape in the X-axis direction.
  • the height (dimension in the Z-axis direction) of the internal space of the second microchannel 34 is, for example, the same as that of the hydrogel chamber 10.
  • the width of the second microchannel 34 (dimension in the Y-axis direction) is, for example, the same as the width (dimension in the Y-axis direction) of the second surface 13.
  • the dimensions of the first microchannel 24 and the second microchannel 34 are not limited to the above dimensions.
  • the first microchannel 24 can connect the hydrogel chamber 10 and the first culture solution storage tank 21.
  • a space can be secured between the first culture solution storage tank 21 and the hydrogel chamber 10. Therefore, the design space of the culture container 2 for connecting to the pneumatic device 5, the design space of the culture container 2 for widening the opening for introducing the hydrogel 100 into the hydrogel storage tank 16 of the hydrogel chamber 10, etc. This improves the degree of freedom in design.
  • the design space of the culture container 2 can be further secured. It becomes easier.
  • the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30 may not include a microchannel.
  • FIG. 10 is a plan cross-sectional view showing the main parts of the cell culture device 1 according to the fourth embodiment.
  • FIG. 11 is an enlarged view of region B shown in FIG. Note that, like FIGS. 3, 7, and 9 described above, FIG. 10 shows a plan cross-sectional view taken along the hydrogel chamber 10.
  • the fourth embodiment differs from the above embodiments in that the first microchannel 24 includes a resistance channel 25. Note that the resistance flow path 25 may be provided in the second micro flow path 34.
  • the cross-sectional area of the vascular tissue increases as the vascular tissue matures, and the flow rate of the culture solution 101 increases.
  • it is difficult to predict changes in the cross-sectional area of vascular tissue and it is also difficult to predict the flow rate of the culture solution 101. Therefore, for example, by pressurizing the first culture solution storage tank 21 (second culture solution storage tank 31), the culture solution 101 stored in the first culture solution storage section 20 (second culture solution storage section 30) can be hydrolyzed.
  • a resistance flow path 25 having a small cross-sectional area is provided in a part of the first micro flow path 24.
  • the first microchannel 24 is provided with a plurality of resistance channels 25 in parallel, each having a smaller cross-sectional area than the first microchannel 24.
  • a plurality of resistance flow paths 25 in parallel as shown in FIG. 11, and preferably 10 or more resistance flow paths 25 are provided in parallel. It would be good if it was set up in Note that the number of resistance channels 25 may be one (one) as long as there is no concern about clogging due to air bubbles or dust.
  • the flow path resistance of the resistance flow path 25 is determined by the viscosity ( ⁇ ) of the culture solution 101, the length of the flow path (L MC ), the cross-sectional diameter (d MC ) of the flow path, and the It is defined as the following formula (1) in relation to the number of flow paths (N MC ).
  • R MC 8 ⁇ L MC / ⁇ d MC 4 N MC ...(1)
  • d MC indicates the diameter when the channel cross section is circular, but when the channel cross section is non-circular, it can be substituted with the equivalent diameter.
  • the flow path resistance (R V ) of the blood vessels formed in the hydrogel 100 is determined by the viscosity of the culture medium 101 ( ⁇ ), the length of the blood vessels (L V ), the cross-sectional diameter of the blood vessels (d V ), the parallel It can be estimated from the number of blood vessels (N V ) formed in the following equation (3).
  • R V 8 ⁇ L V / ⁇ d V 4 N V ...(3)
  • the diameter and number of blood vessels formed in the hydrogel 100 vary depending on the shape of the hydrogel chamber 10 and change with maturation, but the length ( LV ) of the blood vessels in the direction of blood vessel extension of the hydrogel chamber 10
  • the length (dimension in the X-axis direction), the cross-sectional diameter (d V ) of the blood vessel is the height (dimension in the Z-axis direction) of the hydrogel chamber 10
  • the number of blood vessels formed in parallel (N V ) is the diameter of the hydrogel chamber 10.
  • 10 width dimension in the Y-axis direction of the first surface 12 or second surface 13
  • the cross-sectional diameter ( dV ) of the blood vessel is calculated.
  • Channel resistance can be estimated.
  • the flow rate of the culture solution 101 can also be estimated as described later.
  • the flow path resistance (R V ) of the blood vessels is approximately 2 ⁇ 10 ⁇ 10 [Pa ⁇ s/ ⁇ m 3 ].
  • the resistance channel 25 by setting the resistance channel 25 to have a channel resistance of 2 ⁇ 10 ⁇ 10 [Pa ⁇ s/ ⁇ m 3 ] or more, it can function as a channel resistance that can be used practically as the culture container 2.
  • the flow path resistance (R MC ) of the resistance flow channels 25 is 2 ⁇ 10 -10 [Pa ⁇ s/ ⁇ m 3 ].
  • the width and depth of the flow path may be set to values smaller than this, or the length of the flow path may be set to smaller values.
  • the value may be larger than this, or the number of resistance channels 25 may be reduced by adjusting the gap w4 between the resistance channels 25 as shown in FIG. 11.
  • the flow path resistance (R MC ) of the resistance flow path is determined by the viscosity ( ⁇ ) of the culture solution, the length (L) from the first surface 12 to the second surface 13 of the hydrogel chamber 10, and the length (L) of the hydrogel chamber 10.
  • the height (d) is a value obtained by dividing the width of the first surface 12 or the second surface 13 by the height of the hydrogel chamber 10 as (N)
  • N is preferably a natural number.
  • the maximum flow rate of the culture solution 101 can be estimated in this way, the minimum period of replenishment frequency of the culture solution 101 can be estimated, and the work of performing perfusion culture over a long period of time can be made more efficient.
  • the first microchannel 24 is provided with the resistance channel 25 having a smaller cross-sectional area than the first microchannel 24 .
  • the flow path resistance (R MC ) of the resistance flow path 25 depends on the viscosity ( ⁇ ) of the culture solution, the length (L) from the first surface 12 to the second surface 13 of the hydrogel chamber 10, and the height of the hydrogel chamber 10. (d), when the value obtained by dividing the width of the first surface 12 or the second surface 13 by the height of the hydrogel chamber 10 is (N), the relationship of the above formula (5) is satisfied.
  • the increase in the flow rate of the culture solution 101 can be controlled and the maximum flow rate of the culture solution 101 can be estimated.
  • the work of performing perfusion culture can be made more efficient.
  • FIG. 12 is a perspective view showing the cell culture device 1 according to the fifth embodiment.
  • FIG. 13 is a sectional view taken along arrows XIII-XIII shown in FIG.
  • FIG. 14 is a sectional view taken along arrows XIV-XIV shown in FIG. 13.
  • the fifth embodiment differs from the above embodiments in that a third culture solution reservoir 80 is provided directly above the hydrogel chamber 10.
  • the third culture solution storage section 80 includes a third culture solution storage tank 81 that stores the culture solution 101.
  • the third culture solution storage tank 81 in the example shown in the figure also serves as the hydrogel storage tank 16 for introducing the hydrogel 100 into the hydrogel chamber 10.
  • the third culture solution storage tank 81 is formed in a long hole shape or an elliptical shape extending in the Y-axis direction when viewed from above. Note that the shape of the third culture solution storage tank 81 in plan view is not particularly limited.
  • the third culture solution storage tank 81 preferably has a larger internal space (volume) than the hydrogel chamber 10.
  • one large opening 82 communicating with the top surface of the hydrogel chamber 10 is formed in the center of the bottom surface of the third culture solution storage tank 81.
  • a permeable membrane 82a may be provided in the opening 82.
  • the permeable membrane 82a has one side facing the hydrogel 100 and the other side facing the culture solution 101.
  • the permeable membrane 82a is preferably one that cannot be penetrated by the hydrogel 100 but can be penetrated by the culture solution 101, for example. Further, the permeable membrane 82a may be attached to the opening 82 in a removable structure.
  • the pneumatic device 5 includes a pneumatic pump 90 connected to the third culture solution storage tank 81.
  • the upper part of the third culture solution storage tank 81 is closed by the lid part 3.
  • a third recess 83 that is concave upward and communicates with the third culture solution storage tank 81 is formed on the lower surface of the lid 3 .
  • a pneumatic pipe 91 is connected to the lid 3 so as to communicate with the third recess 83.
  • Pneumatic piping 91 is connected to pneumatic pump 90 . Thereby, the third culture solution storage tank 81 can be pressurized from the pneumatic pump 90 via the pneumatic piping 91.
  • the opening 82 is formed directly above the hydrogel chamber 10.
  • organoids which are cell aggregates
  • perfuse culture solution 101 through the microvessels.
  • FIGS. 13 and 14 by providing one large opening 82 directly above the hydrogel chamber 10, introduction of the hydrogel 100 is facilitated.
  • the cell aggregate can be placed on the hydrogel 100 using the opening 82, and the culture solution 101 can be perfused into the cell aggregate via the microvascular network.
  • a permeable membrane 82a can be provided in the opening 82, with one surface facing the hydrogel 100 and the other surface facing the culture solution 101.
  • the permeation rate of drug candidate compounds through microvessels such as the blood-brain barrier may be evaluated.
  • a permeable membrane 82a is provided in the opening 82 provided directly above the hydrogel chamber 10, so that one surface of the permeable membrane 82a is exposed to the hydrogel 100.
  • the third culture solution storage tank 81 that holds the culture solution 101, compounds exposed in the hydrogel 100 can be collected through the permeable membrane 82a. It becomes possible to analyze.
  • the opening 82 is provided directly above the hydrogel chamber 10 as in the fifth embodiment, at least one of the first culture solution storage section 20 and the second culture solution storage section 30 is pressurized to increase the culture solution 101.
  • the culture solution 101 may leak from the opening 82 of the hydrogel chamber 10.
  • the pneumatic device 5 is connected to the third culture fluid storage section 80.
  • the hydrogel chamber 10 can be directly It is possible to prevent the culture solution 101 from leaking from the upper opening 82.
  • FIG. 15 is a perspective view showing a cell culture device 1 according to the sixth embodiment.
  • FIG. 16 is a sectional view taken along arrows XVI-XVI shown in FIG.
  • FIG. 17 is a sectional view taken along arrow XVII-XVII shown in FIG. 16.
  • the sixth embodiment differs from the above embodiment in that hydrogel storage tanks 16A and 16B are provided separately from the third culture solution storage tank 81.
  • the hydrogel storage tanks 16A and 16B are provided as a pair with the third culture solution storage tank 81 sandwiched therebetween in the Y-axis direction. Hydrogel storage tanks 16A and 16B are circular in plan view. Note that the shape of the hydrogel storage tanks 16A and 16B in plan view is not particularly limited. The hydrogel storage tanks 16A and 16B preferably have a smaller internal space (volume) than the third culture solution storage tank 81, for example, from the viewpoint of installation space.
  • the bottom surface of the hydrogel storage tank 16A communicates with the hydrogel chamber 10 via the introduction hole 14. Further, the bottom surface of the hydrogel storage tank 16B communicates with the hydrogel chamber 10 via the introduction hole 15. As shown in FIG. 17, the hydrogel storage tanks 16A and 16B communicate with the hydrogel chamber 10 through introduction holes 14 and 15 that are sufficiently smaller than the opening 82, and the culture solution from the hydrogel chamber 10 is communicated with the hydrogel storage tanks 16A and 16B. 101 is not connected to the pneumatic device 5 like the third culture solution storage tank 81 because there is little problem of leakage, but even if it is connected to the pneumatic device 5 like the third culture solution storage tank 81. I do not care.
  • the introduction holes 14 and 15 for introducing the hydrogel 100 into the hydrogel chamber 10 are arranged at a different position from the opening 82 directly above the hydrogel chamber 10. For example, it becomes easier to collect and analyze the compounds exposed in the hydrogel 100 through the permeable membrane 82a.
  • FIG. 18 is a schematic plan view showing the cell culture device 1 according to the seventh embodiment. As shown in FIG. 18, the seventh embodiment differs from the above embodiments in that a pair of first microchannels 24 and a pair of second microchannels 34 are provided.
  • the first microchannel 24 includes a pair of microchannels 24A and 24B. That is, the first culture solution storage tank 21 and the hydrogel chamber 10 are connected by two microchannels 24A and 24B.
  • the first microchannel 24 is formed in a C-shape or a U-shape when viewed from above.
  • the first microchannel 24 communicates with the first culture solution storage tank 21 at both C-shaped or U-shaped ends, and connects to the first surface 12 of the hydrogel chamber 10 at a location other than both ends (middle portion). It's communicating.
  • the second microchannel 34 includes a pair of microchannels 34A and 34B. That is, the second culture solution storage tank 31 and the hydrogel chamber 10 are connected by two microchannels 34A and 34B.
  • the second microchannel 34 is formed in a C-shape or a U-shape when viewed from above.
  • the second microchannel 34 communicates with the second culture solution storage tank 31 at both ends of the C-shape or U-shape, and connects to the second surface 13 of the hydrogel chamber 10 at a location other than both ends (middle portion). It's communicating.
  • the first microchannel 24 and the second microchannel 34 are each provided in pairs.
  • the first microchannel 24 by introducing the culture solution 101 from the first culture solution storage tank 21 into either one of the microchannels 24A, 24B, air bubbles in the first microchannel 24 can be easily removed. Can be removed.
  • the second microchannel 34 by introducing the culture solution 101 from the second culture solution storage tank 31 into either one of the microchannels 34A, 34B, air bubbles in the second microchannel 34 are generated. can be easily removed.
  • FIG. 19 is a schematic plan view showing the cell culture device 1 according to the eighth embodiment. As shown in FIG. 19, the eighth embodiment differs from the above embodiments in that a return flow path 110 that communicates the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31 is provided.
  • the white arrows in FIG. 19 indicate the flow of the culture solution 101. That is, in the example shown in FIG. 19, the culture solution 101 is supplied from the first culture solution storage tank 21 to the hydrogel chamber 10 via the first microchannel 24, and from the hydrogel chamber 10 to the second microchannel 34. It flows out into the second culture solution storage tank 31 via the second culture solution storage tank 31 and returns to the first culture solution storage tank 21 via the return channel 110.
  • a passive valve 111 is provided in the return channel 110 as a mechanism for preventing backflow of the culture solution 101 from the first culture solution storage tank 21 to the second culture solution storage tank 31.
  • the passive valve 111 is, for example, It has minute fluid channels, and by adjusting the cross-sectional area, shape, length, wettability, etc. of the fluid channels, the culture solution 101 is transferred to the second culture while preventing air bubbles from entering from the first culture solution storage tank 21.
  • the liquid can flow in one direction from the liquid storage tank 31 to the first culture liquid storage tank 21.
  • the pressure resistance of the passive valve 111 is preferably within the range of 0.1 [kPa] to 10 [kPa]. This makes it possible to perform culture operations within a physiological range within which the culture container 2 can be controlled by a commercially available pressure regulator.
  • the pressure resistance ( ⁇ P Lap ) of the passive valve 111 can be estimated using the interfacial tension ( ⁇ ) and the flow path cross-sectional diameter (d) as shown in the following equation (8).
  • ⁇ P Lap 4 ⁇ /d...(8)
  • check valves 36 are provided at both ends of the second microchannel 34 on the second culture solution storage tank 31 side as a mechanism for preventing backflow of the culture solution 101. Thereby, when pressurizing the second culture solution storage tank 31 and returning the culture solution 101 to the first culture solution storage tank 21, it is possible to prevent the culture solution 101 from flowing back toward the hydrogel chamber 10 side. .
  • the pneumatic device 5 switches between supplying the culture solution 101 and returning the culture solution 101 at predetermined intervals.
  • the supply time of the culture solution 101 is preferably set longer than the return time of the culture solution 101.
  • the pneumatic device 5 pressurizes the first culture solution storage tank 21, and supplies the culture solution 101 to the hydrogel chamber 10 by the pressure difference between the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31.
  • the pneumatic device 5 pressurizes the second culture solution storage tank 31 in which the culture solution has accumulated, and uses the differential pressure with the first culture solution storage tank 21 to send the culture solution through the return channel 110.
  • the culture solution 101 is returned to the first culture solution storage tank 21.
  • the end of the return flow path 110 on the first culture solution storage tank 21 side is preferably higher than the end of the return flow path 110 on the second culture solution storage tank 31 side. Thereby, backflow of the culture solution 101 from the first culture solution storage tank 21 to the second culture solution storage tank 31 can be suppressed.
  • the return channel 110 for the culture solution 101 that communicates the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31, the second microchannel 34, and the return channel 110 A mechanism for preventing backflow of the culture solution 101 is provided. According to this configuration, depletion of the culture solution 101 in the first culture solution storage tank 21 can be prevented, and cells can be cultured for a long period of time.
  • a passive valve 111 that prevents air bubbles from entering is provided as a mechanism for preventing backflow.
  • the introduction of air into the return flow path 110 can be prevented at the position of the passive valve 111, and the air introduced into the return flow path 110 can be prevented from being introduced into the return flow path 110. This makes it possible to prevent air bubbles from being generated in the first culture solution storage tank 21 and the second culture solution storage tank 31, thereby stabilizing the culture operation.
  • the pressure resistance of the passive valve 111 is within the range of 0.1 [kPa] to 10 [kPa]. According to this configuration, culture operations can be performed within a physiological range that can be controlled by a commercially available pressure regulator.
  • FIG. 20 is a schematic plan view showing the cell culture device 1 according to the ninth embodiment. As shown in FIG. 20, the ninth embodiment differs from the above embodiments in that a resistance channel 35 is provided in each of the pair of microchannels 34A, 34B of the second microchannel 34.
  • the resistance flow path 35 provided in the second micro flow path 34 has the same configuration as the resistance flow path 25 provided in the first micro flow path 24 shown in FIG. 11 described above. That is, the second microchannel 34 is provided with one or a plurality of resistance channels 35 having a smaller cross-sectional area than the second microchannel 34 in parallel.
  • the flow path resistance (R MC ) of the resistance flow path 35 is determined by the viscosity ( ⁇ ) of the culture solution, the length (L) from the first surface 12 to the second surface 13 of the hydrogel chamber 10, and the hydrogel chamber 10.
  • the value obtained by dividing the height (d) of the first surface 12 or the second surface 13 by the height of the hydrogel chamber 10 is (N)
  • the relationship R MC ⁇ 8 ⁇ L/ ⁇ d 4 N is satisfied. It's good to do that.
  • the increase in the flow rate of the culture solution 101 can be controlled and the maximum flow rate of the culture solution 101 can be estimated.
  • the work of performing perfusion culture can be made more efficient.
  • the flow path resistance of the passive valve 111 to be greater than the flow path resistance of the blood vessel, it can also serve as the resistance flow path 35 .
  • a channel for blood vessel formation (hydrogel chamber 10, etc.) of the culture container 2 shown in FIGS. 19 and 20 was fabricated by photolithography and PDMS (polydimethylsiloxane) molding.
  • the size of the hydrogel chamber 10 is 5.6 [mm] in the length direction (X-axis direction) of the blood vessel, 9.7 [mm] in the width (Y-axis direction), and 9.7 [mm] in the depth (Z-axis direction). direction dimension) is 0.3 [mm].
  • FIG. 21 is a graph showing the relationship between blood vessel diameter, shear stress, and flow rate according to the first example. Note that FIG. 21 shows the results of estimating the relationship between the blood vessel diameter, shear stress, and flow rate using equation (6).
  • no resistance flow path indicates the calculation result when vascular tissue is formed in the culture vessel 2 without the resistance flow path 35 shown in FIG.
  • with resistance flow path indicates the calculation result when vascular tissue is formed in the culture vessel 2 with the resistance flow path 35 shown in FIG.
  • the inside of the culture container 2 is pressurized at 1 [kPa]
  • the flow path resistance (R MC ) of the resistance channel 25 is set to 2 ⁇ 10 ⁇ 8 [Pa ⁇ s/ ⁇ m 3 ]
  • the culture medium 101 The viscosity ( ⁇ ) was 0.001 [Pa ⁇ s]
  • the length of the blood vessels formed (L V ) was 5600 [ ⁇ m]
  • the number of blood vessels formed in parallel (N V ) was 16.
  • the calculation results for the case are shown below. It can be seen that in the culture vessel 2 with "no resistance flow path", the flow rate of the culture solution 101 increases as the blood vessel diameter increases. On the other hand, it can be seen that in the culture vessel 2 with "resistance flow path", the flow rate of the culture solution does not rise above 230 [ ⁇ L/min] even if the blood vessel diameter increases.
  • poly-L-lysine hydrobromide (molecular weight 30,000 to 70,000: SIGMA- (manufactured by ALDRICH) was injected and allowed to stand at 37 [°C] for 1 hour, and then washed twice with phosphate buffered saline.
  • fibrinogen derived from human plasma (manufactured by Wako) was diluted with D-PBS (-) (manufactured by Wako) to a concentration of 6 [mg/ml] at 37 [°C]. ] and filter sterilized using a 0.22 filter Milliex-GV (manufactured by Millipore) and a Terumo syringe (manufactured by TERMO).
  • cultured human vascular endothelial cells HUVEC were fluorescently stained with CellTracker TM Red CMTPX Dye (manufactured by Invitrogen). Thereafter, the cells were detached by trypsin treatment, centrifuged, resuspended in a resuspension buffer (a cell suspension containing Thrombin at a final concentration of 4 [U/mL]), and the cell concentration was counted. The mixture was diluted again with a resuspension buffer so that the cell concentration was 12 ⁇ 10 6 [cells/mL].
  • a resuspension buffer a cell suspension containing Thrombin at a final concentration of 4 [U/mL]
  • the culture containers 2 shown in FIGS. 19 and 20 were pre-chilled to 4°C, and a pre-gel solution was prepared by mixing a fibrinogen solution and a cell research suspension containing HUVEC at a ratio of 1:1.
  • the pre-gel solution was injected into the hydrogel chamber 10 of. Then, the gel was placed in a 5% CO 2 incubator at 37 [°C] and kept warm for 15 minutes to solidify the gel, and then a special medium EGM TM BulletKit TM EGM TM Endothelial Cell Growth Medium BulletKit TM (manufactured by Lonza) was placed in the medium channel.
  • a check valve 36 was attached to the opening of the second microchannel 34 located in the second culture solution storage tank 31.
  • the first culture solution storage tank 21 is pressurized at 1 [kPa] for 240 [sec] to sequentially feed the medium to the cells
  • the second culture solution storage tank 31 is pressurized at 1 [kPa] for 60 [sec]. The cycle of pressurizing and returning was repeated for 7 days.
  • the day the cells were introduced was defined as day 0, and fluorescence microscopic observation and progressive flow rate measurements were performed on days 3 to 7. Medium exchange was performed on the 3rd and 6th day. Every day from the 4th to the 7th day, 10 [ ⁇ l] of 70 kDa FITC dextran (manufactured by SIGMA) was flowed for 5 minutes using hydrostatic pressure, and then observed under a fluorescence microscope to analyze the shape and conduction of the blood vessels.
  • FIG. 22 is a fluorescence microscope image of vascular tissue in the case of "no resistance flow path” according to the first example.
  • FIG. 23 is a fluorescence microscope image of vascular tissue in the case of "with resistance flow path” according to the first example.
  • FIGS. 22 and 23 show fluorescence microscope images observed on day 0, day 3, day 5, and day 7 of the above results.
  • blood vessels were elongating and expanding, and cells were also oriented along the flow of the medium.
  • the expansion of the blood vessels had further progressed, and a stronger orientation of the cells was observed than on the 3rd day.
  • HUVECs proliferated to such an extent that gel areas between blood vessels could hardly be observed, and cell orientation was also lost.
  • FIG. 24 is a fluorescence microscope image of the entire vascular tissue in the case of "no resistance flow path" according to the first example.
  • FIG. 25 is a fluorescence microscope image of the entire vascular tissue in the case of "with resistance flow path” according to the first example.
  • 24 and 25 show the results of observing the state of the entire blood vessel after flowing 70 kDa FITC dextran for 3 days after blood vessel conduction. As shown in FIG. 24, the blood vessels became conductive on the 5th day with “no resistance flow path" and on the 4th day with “resistance flow path". Over the next three days, the blood vessels in both channels expanded, and no difference was observed in the speed of expansion.
  • FIG. 26 is a graph showing the relationship between the sequential flow rate of the culture solution 101 and the culture period according to the first example.
  • the blood vessels were slightly conductive on the fourth day, and the flow rate was 81.8 [ ⁇ l/min]. Thereafter, the flow rate rapidly increased as the blood vessels expanded, reaching 330.2 [ ⁇ l/min] on the 5th day and 839.2 [ ⁇ l/min] on the 7th day.
  • the blood vessel became conductive on the 4th day, and the flow rate was 288.5 [ ⁇ l/min].
  • vascular tissue with a length of 2 [mm] or less have been reported, but there have been no reports of constructing vascular tissues larger than this.
  • a vascular tissue up to a length of 5.6 [mm] could be constructed by applying the present invention.
  • larger vascular tissue can be used to conduct compound permeability testing using vascular tissue that has a larger surface area.
  • the use of vascular tissue having a larger surface area has the advantage of increasing the amount of compound that has permeated through the vascular wall and improving the sensitivity of the permeability test.
  • the present invention by forming microvascular tissue while continuing to apply air pressure, it has become possible to perfuse the culture solution 101 in accordance with the formation of microvascular tissue.
  • the perfusion flow rate of the culture solution 101 can be reported over time, and the microvascular tissue can be stably maintained over a long period of time.
  • Such perfusion that corresponds to the formation of microvascular tissue and the construction of stable vascular tissue over a long period of time can increase the stability of compound permeability tests, and can also be applied to organoid culture combined with vascular tissue. This allows the formation of more mature organoids.
  • FIG. 27 is a schematic plan view showing the cell culture device 1 according to the second example.
  • a cell culture apparatus 1 shown in FIG. 27 was used.
  • This cell culture device 1 is characterized in that the second culture solution storage tank 31 of the second culture solution storage section 30 is divided into second culture solution storage tanks 31A and 31B, and that the first microchannel 24 has a resistance flow.
  • This embodiment differs from the configuration shown in FIG. 20 (first embodiment) in that a path 25 is provided.
  • the pneumatic pump 60 includes a pneumatic pump 60A connected to the second culture solution storage tank 31A, and a pneumatic pump 60B connected to the second culture solution storage tank 31B.
  • a pneumatic pump 50 is connected to the first culture solution storage tank 21 .
  • a pneumatic pump 90 is connected to the third culture solution storage tank 81 .
  • the second culture solution storage tanks 31A and 31B communicate with each other through a communication channel 37.
  • the communication channel 37 balances the liquid level of the culture solution 101 in the second culture solution storage tanks 31A and 31B.
  • the return channel 110 is connected between the second culture solution storage tank 31A and the first culture solution storage tank 21, but is connected between the second culture solution storage tank 31B and the first culture solution storage tank 21. May be connected.
  • the resistance channel 25 is provided in each of the microchannels 24A and 24B of the first microchannel 24.
  • each channel for blood vessel formation in the culture container 2 was fabricated by photolithography and PDMS (polydimethylsiloxane) molding.
  • the size of the hydrogel chamber 10 is 5.6 [mm] in the length direction (X-axis direction) of the blood vessel, 9.7 [mm] in the width (Y-axis direction), and 9.7 [mm] in the depth (Z-axis direction). direction dimension) is 0.3 [mm].
  • the resistance channel 25 of the first micro channel 24 and the resistance channel 35 of the second micro channel 34 have a length of 1.2 [mm], a width of 0.08 [mm], and a height of 0.06 [mm]. mm].
  • the pressure resistance of the first microchannel 24 and the second microchannel 34 is estimated to be 3.5 [kPa] from equation (8).
  • Resistance flow path 25 also functions as a passive valve.
  • the culture container 2 shown in FIG. 27 has a resistance flow path 25 provided in the first micro flow path 24, compared to the culture container 2 shown in FIGS. 19 and 20. Further, the opening of the second microchannel 34 is approximately 1 cm higher than the bottom surface of the second culture solution storage tank 31A, 31B. The opening of the first microchannel 24 is provided on the bottom surface of the first culture solution storage tank 21. With this configuration, the flow of the culture solution can be restricted only in the direction from the first culture solution storage tank 21 to the second culture solution storage tanks 31A, 31B (in the direction of the arrow in the figure), and backflow can be prevented.
  • the culture solution in the first culture solution storage tank 21 is transferred to the opening of the first microchannel 24, the first microchannel 24 , the hydrogel chamber 10 , and the second microchannel 34 to the opening of the second microchannel 34 .
  • the opening of the second microchannel 34 is higher than the liquid level of the culture solution in the second culture solution storage tanks 31A and 31B. Air flows into the second microchannel 34 from the opening of the second microchannel 34, and the resistance channel 35 acts as a passive valve, stopping the inflow of air and also stopping the flow of the culture solution. Therefore, by alternately pressurizing the pneumatic pump 50 and the pneumatic pump 60 (60A, 60B), a one-way flow from the opening of the first microchannel 24 to the opening of the second microchannel 34 is generated. can be caused.
  • the dimensions of the passive valve 111 of the return flow path 110 are 0.24 [mm] in length, 0.08 [mm] in width, and 0.06 [mm] in height.
  • the pressure resistance of the passive valve is estimated to be 3.5 [kPa] from equation (8).
  • the opening on the first culture solution storage tank 21 side of the return flow path 110 is approximately 1 cm higher than the bottom surface of the first culture solution storage tank 21, and the opening on the second culture solution storage tank 31A side of the return flow path 110 is higher than the bottom surface of the first culture solution storage tank 21.
  • the section is provided on the bottom surface of the second culture solution storage tank 31A.
  • the culture solution 101 in the second culture solution storage tank 31A is transferred to the second culture solution storage tank in the return channel 110. It flows through the opening on the 31A side and the return flow path 110 to the opening of the return flow path 110 on the first culture solution storage tank 21 side.
  • the opening of the return channel 110 on the first culture solution storage tank 21 side is higher than the liquid level of the culture solution in the first culture solution storage tank 21.
  • poly-L-lysine hydrobromide (molecular weight 30,000 to 70,000; SIGMA-ALDRICH Co., Ltd. (manufactured by Nippon Steel & Co., Ltd.) was injected and allowed to stand at 37 [°C] for 1 hour, and then washed with a sterilized 50% ethanol aqueous solution three times or more, and then completely dried.
  • the following test was conducted using the cell culture device 1 shown in FIG. 27 in order to confirm how the medium components permeated into the hydrogel 100 by pressurized perfusion.
  • fibrinogen derived from bovine plasma (manufactured by Wako)
  • D-PBS D-PBS
  • Wako D-PBS
  • the mixture was dissolved and filter sterilized using a 0.22 filter Milliex-GV (manufactured by Millipore) and a Terumo syringe (manufactured by TERMO).
  • a culture solution (EGM-2MV, manufactured by Lonza) containing 4 [U/mL] of Thrombin (manufactured by Wako) was prepared.
  • the culture container 2 was previously cooled to 4 [° C.], a pre-gel solution was prepared by mixing a fibrinogen solution and a culture solution containing Thrombin at a ratio of 1:1, and the pre-gel solution was injected into the hydrogel chamber 10 of the culture container 2. . Then, after placing the gel in a 37 [°C], 5% CO 2 incubator and keeping it warm for 35 minutes to solidify the gel, the culture solution EGM-2MV was introduced through the openings of the second microchannel 34 and the first microchannel 24. The cells were introduced into a 37 [° C.], 5% CO 2 incubator and kept warm for 60 minutes. The culture solution was introduced into the return flow path 110 from the opening on the first culture solution storage tank 21 side of the return flow path 110 .
  • pressurized perfusion was started under the following conditions. Pressurized perfusion was performed in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 .
  • the first culture solution storage tank 21 and the third culture solution storage tank 81 were pressurized at 0.5 kPa for 1440 seconds to feed the culture medium sequentially, and the second culture solution storage tanks 31A and 31B were pressurized for 360 seconds. The cycle of returning the culture solution 101 was repeated.
  • 500 [ ⁇ L] of the culture solution 101 was further added to the first culture solution storage tank 21.
  • pressurization of the first culture solution storage tank 21 is started at 0.5 [kPa], 1.0 [kPa], 2.0 [kPa], and 3.0 [kPa], and the fluorescence Microscopic images were taken.
  • FIG. 28 is a fluorescence microscope image of Calcein immediately after and 50 seconds after pressurizing the culture container 2 according to the second example at 2.0 [kPa]. As shown in FIG. 28, the Calcein fluorescence interface for 50 seconds moves upward by about 2.0 to 2.5 [mm] compared to immediately after pressurization.
  • FIG. 29 shows the Rhodamine- It is a graph showing the results of measuring the movement of the interface of Dextran fluorescence over time.
  • FIG. 30 shows Calcein when the culture container 2 according to the second example was pressurized at 0.5 [kPa], 1.0 [kPa], 2.0 [kPa], and 3.0 [kPa]. It is a graph showing the results of measuring the movement of the fluorescent interface at each time. As shown in FIGS. 29 and 30, the interfacial movement speeds of the fluorescence of Calcein and Rhodamine-Dextran were similar, and it was observed that the interfacial movement speed of the fluorescence became faster in proportion to the pressure.
  • HUVECs were fluorescently stained with CellTracker TM Red CMTPX Dye (manufactured by Invitrogen). Thereafter, HUVECs and mesenchymal stem cells (UE7T-13, JCRB Cell Bank) were detached with 0.05% or 0.25% Trypsin-EDTA at 12 ⁇ 106 [cells/mL] and 4 ⁇ 106 [cells/mL], respectively. /mL] was suspended in EGM-2MV to which 4 [U/mL] of Thrombin (manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) was added.
  • the culture vessels 2 shown in FIG. 27 are pre-chilled to 4 [°C], and a pre-gel solution is prepared by mixing a fibrinogen solution and a Cytochemistry suspension containing HUVEC and MSCs at a ratio of 1:1.
  • a pregel solution was injected into the hydrogel chamber 10.
  • the culture solution EGM-2MV was placed in a 5% CO 2 incubator at 37 [°C] and kept warm for 35 minutes to solidify the gel.
  • the cells were introduced into a 37 [° C.], 5% CO 2 incubator and kept warm for 60 minutes.
  • the culture solution 101 was introduced into the return channel 110 through the opening on the first culture solution storage tank 21 side of the return channel 110 .
  • pressurized perfusion was started under the following conditions.
  • Pressurized perfusion was performed in an incubator at 37°C and 5% CO2 .
  • the first culture solution storage tank 21 and the third culture solution storage tank 81 are pressurized at 2.0 [kPa] for 360 seconds, and the second culture solution storage tanks 31A and 31B are pressurized for 90 seconds.
  • the cycle of pressing and returning was repeated for 12 days.
  • the day on which the cells were introduced was defined as day 0, and fluorescence microscopic observation and progressive flow rate measurements were performed on days 1 to 12.
  • the medium was replaced every time the flow rate was measured.
  • FIG. 31 is a fluorescence microscope image showing the formation behavior of blood vessels with and without mesenchymal stem cells according to the second example.
  • FIG. 32 is a graph showing changes in blood vessel flow rate when mesenchymal stem cells are included and when they are not included according to the second example. As shown in FIG. 31, the formation of microvasculature was confirmed on day 4 regardless of the presence or absence of mesenchymal stem cells. During this time, an increase in the flow rate of the culture solution 101 was confirmed with the formation of vascular tissue (see FIG. 32).
  • the culture container 2 shown in FIG. 27 has a backflow prevention mechanism that controls the flow direction of the culture solution 101 and a return channel 110.
  • the culture solution is configured to flow in one direction toward the culture solution storage tanks 31A and 31B.
  • a culture vessel shown in FIG. 33 was prepared.
  • FIG. 33 is a schematic plan view showing a cell culture device 1 according to a modified example of the second embodiment.
  • the culture container 2 shown in FIG. 33 does not have a return flow path 110.
  • the opening of the second microchannel 34 is provided on the bottom surface of the second culture solution storage tank 31A, 31B.
  • vascular tissue In the formation of vascular tissue, the formation behavior of vascular tissue was compared and studied under the environment of unidirectional flow and reciprocating flow using the culture container 2 shown in FIG. 27 and the culture container 2 shown in FIG. 33. Similar to the above experiment (conditions of culturing in a system containing mesenchymal stem cells using culture vessel 2 shown in Figure 27), HUVEC and mesenchymal cells were introduced into hydrogel 100, and pressurized perfusion was started. . The conditions for pressurized perfusion are, when producing a unidirectional flow, the first culture solution storage tank 21 and the third culture solution storage tank 81 are pressurized at 2.0 [kPa] for 360 seconds, and the first culture solution storage tank 81 is fed sequentially.
  • a cycle of pressurizing the two culture solution storage tanks 31A and 31B for 90 seconds and returning them was repeated for 12 days.
  • the first culture solution storage tank 21 and the third culture solution storage tank 81 are pressurized at 2.0 [kPa] for 360 seconds, and then the second culture solution storage tank 31A, 31B A cycle of applying pressure for 360 seconds was repeated for 12 days.
  • FIG. 34 is a fluorescence microscope image showing the formation behavior of vascular tissue under the environment of unidirectional flow and reciprocating flow according to the second example and a variation thereof.
  • formation of vascular tissue was confirmed from around 4 days after cell introduction.
  • FIG. 34 shows images of vascular tissue 6 days after cell introduction. The formation of vascular tissue can be confirmed in both unidirectional flow and reciprocating flow, but it appears that the vascular tissue is oriented in the direction of flow in the unidirectional flow condition compared to the reciprocating flow condition. observed.
  • FIG. 35 is a graph showing changes in the flow rate of vascular tissue under the environment of unidirectional flow and reciprocating flow according to the second embodiment and a modification thereof. As shown in Figure 35, in both cases of unidirectional flow and reciprocating flow, an increase in flow rate due to the formation of vascular tissue was observed from day 4 to 6 after cell introduction, and the flow rate increased through the vascular tissue until day 12. The flow of the culture solution 101 was confirmed.
  • FIG. 36 is an image analysis diagram when determining the permeability coefficient of the fluorescent substance through the blood vessel wall in order to evaluate the barrier ability of the blood vessel tissue formed with the cell culture device 1 according to the second embodiment and its modification. .
  • the permeability coefficient of fluorescent substances through the vascular wall was determined by image analysis. The permeability coefficient of the fluorescent substance was determined by the following method on the 4th day of culture for the system not containing mesenchymal stem cells, and on the 6th day of culture for the system co-cultured with mesenchymal stem cells.
  • P [cm/sec] is a transmission coefficient.
  • J s [mol/sec] is the amount of substance permeated per unit time.
  • a w [cm 2 ] is the area of the blood vessel wall through which the substance permeates.
  • C L [mol/cm 3 ] is the concentration difference between the inside and outside of the blood vessel wall.
  • ⁇ I ex,mean [ ⁇ ] is the temporal change in the average fluorescence brightness of the region surrounded by blood vessels.
  • a i [cm 2 ] is the area of the region surrounded by blood vessels.
  • ⁇ t [sec] is the amount of change over time.
  • l w [cm] is the circumference of a region surrounded by blood vessels.
  • I i,mean [-] is the average fluorescence intensity on the blood vessel side near the area surrounded by the blood vessels.
  • I b,mean [-] is the average fluorescence intensity of the area surrounded by blood vessels.
  • ImageJ (1.53c, manufactured by NIH) was used to analyze the image data.
  • FIG. 37 shows (i) no mesenchymal stem cells, unidirectional flow, (ii) unidirectional flow, with mesenchymal stem cells, and (iii) with mesenchymal stem cells, according to the second embodiment and a variation thereof.
  • the permeability coefficients of Calcein obtained under three conditions of reciprocating flow are shown.
  • FIG. 38 shows (i) no mesenchymal stem cells and unidirectional flow, (ii) unidirectional flow with mesenchymal stem cells, and (iii) with mesenchymal stem cells and a modified example thereof.
  • the permeability coefficients of Rhodamine-Dextran obtained under three conditions of reciprocating flow are shown.
  • the system containing mesenchymal stem cells has a smaller permeability coefficient. Furthermore, it was observed that the permeability coefficient tended to be lower in unidirectional flow than in reciprocating flow. From this result, the culture container 2 having the configuration shown in FIG. 27, which has a backflow prevention mechanism that controls the flow direction of the culture solution 101 and a return flow path 110, is useful for forming vascular tissue with high barrier ability. Something was suggested.
  • immunostaining was performed using the following method.
  • the vascular tissue formed using only HUVEC was fixed on the 4th day, and the vascular tissue formed by mixing with mesenchymal stem cells was fixed on the 6th day using 4% paraformaldehyde.
  • CD31 was labeled with a 200-fold diluted rabbit monoclonal antibody (28364 or 32457: manufactured by ABCAM).
  • NG2 was labeled with a 200-fold diluted mouse monoclonal antibody (MAB2585: manufactured by R&D Systems).
  • vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), laminin, and Invitrogen 33-9100 were labeled with 100-fold diluted rabbit polyclonal antibodies (CST2158S, abcam11575, and Invitrogen 33-9100, respectively).
  • Fluorescently labeled secondary antibodies (Invitrogen A11011, A11034 or abcam150113) were used at 200- to 400-fold dilutions.
  • Cell nuclei were stained with Cellstain-DAPI solution (manufactured by Dojindo Laboratories) at a dilution of 1:1000.
  • F-actin filaments were stained with Phalloidin-iFluor 488 (Cayman Chemical Company) at a 1:1000 dilution.
  • FIG. 39 shows an image in which vascular endothelial cells formed in the cell culture device 1 according to the second embodiment and a modification thereof are stained with CD31, which is a marker, and an image in which vascular endothelial cells are stained with NG2, which is a mesenchymal stem cell marker.
  • CD31 which is a marker
  • NG2 which is a mesenchymal stem cell marker.
  • FIG. 39 in a mixed culture system with mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells exist around the vascular tissue formed by vascular endothelial cells under both unidirectional flow and reciprocating flow conditions. This was confirmed.
  • FIG. 40 is a diagram showing images of vascular endothelial cells formed in the cell culture device 1 according to the second example and a variation thereof, stained with ZO-1, which constitutes tight junctions in the blood vessel wall.
  • ZO-1 As shown in FIG. 41, under the condition of unidirectional flow with mesenchymal stem cells, ZO-1 is expressed throughout the blood vessel wall compared to other conditions. This suggests that the high barrier capacity of blood vessels, that is, the low permeability coefficient, observed in FIG. 36 is achieved by the expression of tight junction molecules.
  • the culture container 2 having the configuration shown in FIG. It was shown to be useful in forming vascular tissue with high barrier capacity.

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Abstract

この細胞培養装置は、ハイドロゲルチャンバーと、培養容器と、空圧装置と、を備える。ハイドロゲルチャンバーは、細胞を培養するハイドロゲルを保持する。培養容器は、ハイドロゲルチャンバーの第１面と連通する第１培養液貯留部と、ハイドロゲルチャンバーの第１面と異なる第２面と連通する第２培養液貯留部と、を備える。空圧装置は、培養容器に接続され、第１培養液貯留部と第２培養液貯留部との間に空圧に基づく圧力差を生じさせて、第１培養液貯留部及び第２培養液貯留部の少なくとも一方に貯留された培養液を、ハイドロゲルチャンバーのハイドロゲルに加圧浸透させる。

Description

細胞培養装置及び細胞培養方法
　本発明は、細胞培養装置及び細胞培養方法に関するものである。
　本願は、２０２２年７月８日に、日本に出願された特願２０２２－１１０２９１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　下記特許文献１には、マイクロ流路デバイスが開示されている。このマイクロ流路デバイスは、光学的に透明な材料からなる基材を備え、さらに１つ又はそれ以上の流体チャネル、１つ又はそれ以上の流体チャネル入口、１つ又はそれ以上の流体チャネル出口、１つ又はそれ以上のゲルケージ領域、及び複数の支柱を備えている。各ゲルケージ領域の全部又は一部は、１つ又はそれ以上の流体チャネルの全部又は一部が側面に配置され、それにより１つ又はそれ以上のゲルケージ領域－流体チャネルの界面領域を作り出している。
　各ゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する支柱の列を少なくとも１つ備え、少なくとも１つの支柱の列でそれぞれの支柱が、三角形、９０°未満の内角を含む台形、又はそれらの組み合わせで形成されている。また、少なくとも１つの支柱の列でそれぞれの支柱の角の内角と基材表面上のゲルの接触角度との合計が、１８０°であり、少なくとも１つの支柱の列で隣接する各対の支柱間の距離が、５０マイクロメートル～３００マイクロメートルとされている。
特許第６９６７５３５号公報
　従来から、上記のようなマイクロ流路デバイスを使用し、微小血管等を生体外で構築するために、血管内皮細胞をハイドロゲルの内部やその近傍に配置し、自発的に血管組織を構築させる細胞培養方法が知られている。しかしながら、この方法ではハイドロゲル内への酸素や栄養素の供給の制限のため、構築できる血管組織の大きさには制約があった。
　本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、生体外で効率的に大きな細胞組織を構築できる細胞培養装置及び細胞培養方法の提供を目的とする。
　本発明の一態様に係る細胞培養装置は、細胞を培養するハイドロゲルを保持するハイドロゲルチャンバーと、前記ハイドロゲルチャンバーの第１面と連通する第１培養液貯留部と、前記ハイドロゲルチャンバーの前記第１面と異なる第２面と連通する第２培養液貯留部と、を備える培養容器と、前記培養容器に接続された空圧装置と、を備え、前記空圧装置は、前記第１培養液貯留部と前記第２培養液貯留部との間に空圧に基づく圧力差を生じさせて、前記第１培養液貯留部及び前記第２培養液貯留部の少なくとも一方に貯留された培養液を、前記ハイドロゲルチャンバーのハイドロゲルに加圧浸透させる。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記第１培養液貯留部及び前記第２培養液貯留部の少なくとも一方は、培養液を貯留する培養液貯留槽と、前記培養液貯留槽と前記ハイドロゲルチャンバーとを連通させるマイクロ流路と、を備えてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記マイクロ流路には、前記マイクロ流路よりも断面積が小さい抵抗流路が、１つまたは並列に複数設けられていてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記抵抗流路の流路抵抗（ＲＭＣ）は、培養液の粘度（μ）、前記ハイドロゲルチャンバーの前記第１面から前記第２面までの長さ（Ｌ）、前記ハイドロゲルチャンバーの高さ（ｄ）、前記第１面または前記第２面の幅を前記ハイドロゲルチャンバーの高さで割った値を（Ｎ）としたとき、ＲＭＣ≧８μＬ／πｄ４Ｎの関係を満たしてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記マイクロ流路が、一対で設けられていてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記第１培養液貯留部は、前記培養液貯留槽として第１培養液貯留槽と、前記マイクロ流路として第１マイクロ流路と、を備え、前記第２培養液貯留部は、前記培養液貯留槽として第２培養液貯留槽と、前記マイクロ流路として第２マイクロ流路と、を備え、前記第１培養液貯留槽と前記第２培養液貯留槽とを連通させる培養液の返送流路と、前記第１マイクロ流路及び前記第２マイクロ流路の少なくとも一方と、前記返送流路に、培養液の逆流を防止する機構を備えてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記逆流を防止する機構として、気泡の侵入を防ぐ受動バルブを備えてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記受動バルブの耐圧性が、０．１［ｋＰａ］～１０［ｋＰａ］の範囲内であってもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記ハイドロゲルチャンバーの直上部には、開口部が形成されていてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記開口部を介して連通する第３培養液貯留部が設けられており、前記第２開口部には、一方の面がハイドロゲルに面し、他方の面が培養液に面する透過性の膜が設けられていてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記空圧装置は、前記第３培養液貯留部と接続されていてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記空圧装置は、前記培養容器に接続される空圧配管を備え、前記空圧配管には、フィルターが設けられていてもよい。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養装置において、前記ハイドロゲルチャンバーに、前記空圧に基づく圧力差を生じさせた状態でハイドロゲルを保持させる機構を備えてもよい。
　本発明の一態様に係る細胞培養方法は、先に記載の細胞培養装置を用いて、前記ハイドロゲルチャンバー内で細胞を培養する。
　また、本発明の一態様に係る細胞培養方法において、前記細胞を培養し、前記ハイドロゲルチャンバー内で血管組織を形成してもよい。
　上記本発明の一態様によれば、生体外で効率的に大きな細胞組織を構築できる。
第１実施形態に係る細胞培養装置を示す斜視図である。 図１に示す矢視ＩＩ－ＩＩ断面図である。 図２に示す矢視ＩＩＩ－ＩＩＩ断面図である。 図３に示す領域Ａの拡大図である。 第２実施形態に係る細胞培養装置を示す斜視図である。 図５に示す矢視ＶＩ－ＶＩ断面図である。 図６に示す矢視ＶＩＩ－ＶＩＩ断面図である。 第３実施形態に係る細胞培養装置を示す斜視図である。 第３実施形態に係る細胞培養装置の要部を示す平断面図である。 第４実施形態に係る細胞培養装置の要部を示す平断面図である。 図１０に示す領域Ｂの拡大図である。 第５実施形態に係る細胞培養装置を示す斜視図である。 図１２に示す矢視ＸＩＩＩ－ＸＩＩＩ断面図である。 図１３に示す矢視ＸＩＶ－ＸＩＶ断面図である。 第６実施形態に係る細胞培養装置を示す斜視図である。 図１５に示す矢視ＸＶＩ－ＸＶＩ断面図である。 図１６に示す矢視ＸＶＩＩ－ＸＶＩＩ断面図である。 第７実施形態に係る細胞培養装置を示す平面模式である。 第８実施形態に係る細胞培養装置を示す平面模式図である。 第９実施形態に係る細胞培養装置を示す平面模式図である。 第１実施例に係る血管直径とずり応力および流量の関係を示すグラフである。 第１実施例に係る「抵抗流路なし」の場合の血管組織の蛍光顕微鏡画像である。 第１実施例に係る「抵抗流路あり」の場合の血管組織の蛍光顕微鏡画像である。 第１実施例に係る「抵抗流路なし」の場合の血管組織全体の蛍光顕微鏡画像である。 第１実施例に係る「抵抗流路あり」の場合の血管組織全体の蛍光顕微鏡画像である。 第１実施例に係る培養液の順送の流量と培養期間との関係を示すグラフである。 第２実施例に係る細胞培養装置を示す平面模式図である。 第２実施例に係る培養容器を２．０［ｋＰａ］で加圧した直後と５０秒後のＣａｌｃｅｉｎの蛍光顕微鏡画像である。 第２実施例に係る培養容器を０．５［ｋＰａ］、１．０［ｋＰａ］、２．０［ｋＰａ］、及び３．０［ｋＰａ］で加圧した際のＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの蛍光の界面の移動を時間ごとに測定した結果を示すグラフである。 第２実施例に係る培養容器を０．５［ｋＰａ］、１．０［ｋＰａ］、２．０［ｋＰａ］、及び３．０［ｋＰａ］で加圧した際のＣａｌｃｅｉｎの蛍光の界面の移動を時間ごとに測定した結果を示すグラフである。 第２実施例に係る間葉系幹細胞を含む場合と含まない場合の血管の形成挙動を示す蛍光顕微鏡画像である。 第２実施例に係る間葉系幹細胞を含む場合と含まない場合の血管の流量変化を示すグラフである。 第２実施例の一変形例に係る細胞培養装置を示す平面模式図である。 第２実施例とその一変形例に係る一方向流れと往復流れの環境下での血管組織の形成挙動を示す蛍光顕微鏡画像である。 第２実施例とその一変形例に係る一方向流れと往復流れの環境下での血管組織の流量変化を示すグラフである。 第２実施例とその一変形例に係る細胞培養装置で形成した血管組織のバリア能を評価するために、蛍光物質の血管壁の透過係数を求める際の画像解析図である。 第２実施例とその一変形例に係る（ｉ）間葉系幹細胞なし・一方向流れ、（ｉｉ）間葉系幹細胞あり・一方向流れ、（ｉｉｉ）間葉系幹細胞あり・往復流れの３つの条件で求めたＣａｌｃｅｉｎの透過係数を示す。 第２実施例とその一変形例に係る（ｉ）間葉系幹細胞なし・一方向流れ、（ｉｉ）間葉系幹細胞あり・一方向流れ、（ｉｉｉ）間葉系幹細胞あり・往復流れの３つの条件で求めたＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの透過係数を示す。 第２実施例とその一変形例に係る細胞培養装置で形成した血管内皮細胞を、マーカーであるＣＤ３１で染色した画像と、間葉系幹細胞のマーカーであるＮＧ２で染色した画像を示す図である。 第２実施例とその一変形例に係る細胞培養装置で形成した血管内皮細胞を、血管壁のタイトジャンクションを構成するＺＯ―１で染色した画像を示す図である。
　以下、本発明の各実施形態について図面を参照して説明する。
　なお、本発明は、創薬における医薬品候補化合物の血管透過性試験、再生医療や細胞アッセイ用途のオルガノイド培養、がんの浸潤評価などへ応用できる。
　創薬においては、薬物の体内動態を評価する際に、薬剤の血管壁透過性を評価する場合があり、本発明の細胞培養装置及び細胞培養方法は、血管透過性を評価する試験装置や試験方法として利用できる。特に血液脳関門の透過性を正確に評価できる装置や試験方法として利用できる。
　また、再生医療では近年オルガノイド培養法が着目されているが、本発明の細胞培養装置及び細胞培養方法はオルガノイドをより成熟させるために血管化されたオルガノイドの培養に利用できる。
　また、がんの遠隔転移は血管を介したがん細胞の移動が関わっており、本発明の細胞培養装置及び細胞培養方法は、がん細胞の転移を評価するモデルとして創薬や臨床検査に利用できる。
　（第１実施形態）
　図１は、第１実施形態に係る細胞培養装置１を示す斜視図である。図２は、図１に示す矢視ＩＩ－ＩＩ断面図である。図３は、図２に示す矢視ＩＩＩ－ＩＩＩ断面図である。図４は、図３に示す領域Ａの拡大図である。
　図１に示すように、細胞培養装置１は、細胞を培養するハイドロゲル１００を保持し、その細胞に酸素や栄養等を供給する培養液１０１を貯留する培養容器２を備えている。
　なお、図１においては、細胞培養装置１の培養容器２の内部構造の視認性を向上させるため、培養容器２の外形を二点鎖線で示し、その内部構造を透視させている。後述する図５、図８、図１２、及び図１５においても同様である。培養容器２は、細胞の観察等のために、透光性の高い透明材料等で形成されることが好ましいが、透光性の低い若しくは透光性の無い材料で形成されてもよい。その場合、細胞を視認できる位置にガラス窓等を設けてもよい。
　培養容器２は、ハイドロゲルチャンバー１０と、第１培養液貯留部２０と、第２培養液貯留部３０と、を備えている。ハイドロゲルチャンバー１０は、第１培養液貯留部２０と第２培養液貯留部３０との間に配置されている。図１に示す例では、ハイドロゲルチャンバー１０が、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０と水平方向に隣接して配置されている。
　なお、以下の説明において、ＸＹＺ直交座標系を設定し、このＸＹＺ直交座標系を参照しつつ各構成の位置関係について説明することがある。Ｘ軸方向は、第１培養液貯留部２０、ハイドロゲルチャンバー１０、及び第２培養液貯留部３０が並ぶ第１の水平方向である。Ｙ軸方向は、Ｘ軸方向と直交する第２の水平方向である。Ｚ軸方向は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向と直交する鉛直方向である。
　ハイドロゲルチャンバー１０は、図２に示すように、扁平状の内部空間１１を有している。ハイドロゲルチャンバー１０の内部空間１１の高さ（Ｚ軸方向の寸法）は、例えば１００［μｍ］～５００［μｍ］の範囲内である。ハイドロゲルチャンバー１０の内部空間１１には、ハイドロゲル１００が充填されている。ハイドロゲル１００は、高分子の三次元網目構造を有して水分を保持すると共に、細胞を包埋もしくは接着し、細胞を培養する。
　ハイドロゲルチャンバー１０は、図３に示すように、平面視で六角形に形成されている。なお、ハイドロゲルチャンバー１０の平面視形状は特に限定されないが、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０と隣接する長さ（Ｙ軸方向の寸法）は、幅（Ｘ軸方向の寸法）よりも大きいとよい。ハイドロゲルチャンバー１０のＹ軸方向の寸法は、例えば１［ｍｍ］～２０［ｍｍ］の範囲内である。ハイドロゲルチャンバー１０のＸ軸方向の寸法は、例えば１［ｍｍ］～１０［ｍｍ］の範囲内である。
　ハイドロゲルチャンバー１０は、第１培養液貯留部２０に連通する第１面１２と、第２培養液貯留部３０に連通する第２面１３と、を有している。第１面１２及び第２面１３は、Ｘ軸方向で対向し、Ｙ軸方向に互いに平行に延びている。ハイドロゲルチャンバー１０のＹ軸方向の両端部は、導入路１４ａ，１５ａを介して導入孔１４，１５と連通している。ハイドロゲルチャンバー１０の直上部には、ハイドロゲル１００を導入するハイドロゲル貯留槽１６が形成されている。
　導入孔１４は、ハイドロゲルチャンバー１０のＹ軸方向の一端側（－Ｙ側）において、ハイドロゲルチャンバー１０の天面と、ハイドロゲル貯留槽１６の底面とを連通させている。導入孔１５は、ハイドロゲルチャンバー１０のＹ軸方向の他端側（＋Ｙ側）において、ハイドロゲルチャンバー１０の天面と、ハイドロゲル貯留槽１６の底面とを連通させている。２つの導入孔１４，１５により、ハイドロゲルチャンバー１０から空気を抜き、ハイドロゲル貯留槽１６からハイドロゲルチャンバー１０にハイドロゲル１００を充填し易くなる。
　第１培養液貯留部２０は、培養液１０１を貯留する第１培養液貯留槽２１を備えている。第１培養液貯留槽２１は、平面視でＹ軸方向に延びる長孔状ないし楕円状に形成されている。なお、第１培養液貯留槽２１の平面視形状は特に限定されない。第１培養液貯留槽２１は、ハイドロゲルチャンバー１０よりも内部空間（容積）が大きいとよい。第１培養液貯留槽２１の底部のハイドロゲルチャンバー１０側（＋Ｘ側）の側面は、ハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２に連通している。
　第２培養液貯留部３０は、培養液１０１を貯留する第２培養液貯留槽３１を備えている。第２培養液貯留槽３１は、平面視でＹ軸方向に延びる長孔状ないし楕円状に形成されている。なお、第２培養液貯留槽３１の平面形状は特に限定されない。第２培養液貯留槽３１も、ハイドロゲルチャンバー１０よりも内部空間（容積）が大きいとよい。第２培養液貯留槽３１の底部のハイドロゲルチャンバー１０側（－Ｘ側）の側面は、ハイドロゲルチャンバー１０の第２面１３に連通している。
　上記構成の培養容器２は、図３に示すように、空圧装置５と接続されている。空圧装置５は、第１培養液貯留槽２１に接続された空圧ポンプ５０と、第２培養液貯留槽３１に接続された空圧ポンプ６０と、を備えている。空圧ポンプ５０，６０は、例えば図示しないモータの駆動中、継続的に培養容器２内を加圧できる。空圧装置５は、第１培養液貯留槽２１と第２培養液貯留槽３１との間に空圧に基づく圧力差を生じさせて、第１培養液貯留槽２１及び第２培養液貯留槽３１の少なくとも一方に貯留された培養液１０１を、ハイドロゲルチャンバー１０のハイドロゲル１００に加圧浸透させる。
　なお、ハイドロゲルチャンバー１０に対して培養液１０１を供給する方向が、第１培養液貯留槽２１及び第２培養液貯留槽３１のいずれか一方から他方へと一方向に限定される場合、空圧ポンプ５０，６０のいずれか一方は無くても構わない。また、一台の空圧ポンプから空圧配管を分岐させ第１培養液貯留槽２１及び第２培養液貯留槽３１のそれぞれに接続すると共に、空圧配管の枝管に切替バルブを設けて、空圧をかける培養液貯留槽を切り替えてもよい。空圧装置５は、例えば図示しない調圧器を備えており０．１［ｋＰａ］～１０［ｋＰａ］の範囲内で圧力を調整し、第１培養液貯留槽２１及び第２培養液貯留槽３１の少なくともいずれか一方を加圧する。
　培養容器２は、上記空圧に基づく圧力差を生じさせた状態でも、ハイドロゲルチャンバー１０にハイドロゲル１００を保持させる機構として、支柱列２２，３２を備えている。さらにハイドロゲルチャンバー１０に、ハイドロゲル１００を保持させる表面処理（表面の濡れ性を調整するコーティング処理等）を施してもよい。
　支柱列２２は、第１培養液貯留槽２１と連通するハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２に沿って設けられている。支柱列２２の高さは、ハイドロゲルチャンバー１０の内部空間１１の高さと同じである。また、支柱列２２の各支柱間距離は、例えば５０［μｍ］～３００［μｍ］の範囲内である。以下、支柱列２２の詳細な構造について、図４を参照して説明する。
　支柱列２２は、図４に示すように、ハイドロゲルチャンバー１０と第１培養液貯留槽２１との界面領域を形成する複数の支柱４０を備えている。支柱４０は、Ｙ軸方向に隙間をあけて等間隔に形成されている。Ｙ軸方向で隣り合う支柱４０の間には、ハイドロゲルチャンバー１０と第１培養液貯留槽２１と連通させる流体チャネルが形成されている。
　支柱４０は、平断面視で略五角形に形成されている。支柱４０の側面は、ハイドロゲルチャンバー１０側に配置された一対の斜面４１と、第１培養液貯留槽２１側に配置された平面４２と、一対の斜面４１と平面４２との間を接続する一対の曲面４３と、を備えている。
　一対の斜面４１は、ハイドロゲルチャンバー１０の内側に向かう端部同士が互いに接続されている。一対の斜面４１の接続角度は、鋭角である。また、一対の斜面４１のＸ－Ｚ平面に対する角度は、それぞれ等しくなっている。平面４２は、Ｙ－Ｚ平面に平行な面を形成している。一対の曲面４３は、平面４２の＋Ｙ側の端部と＋Ｙ側に配置された斜面４１の端部とを滑らかに接続すると共に、平面４２の－Ｙ側の端部と－Ｙ側に配置された斜面４１の端部とを滑らかに接続している。
　隣り合う支柱４０の隙間（Ｙ軸方向の寸法）は、平面４２部分において幅ｗ１となり、曲面４３部分において最小の幅ｗ２となり、一対の斜面４１の端部接続部分において最大のｗ３となる。幅ｗ１、幅ｗ２、幅ｗ３は、ｗ２＜ｗ１＜ｗ３の関係を有している。つまり、隣り合う支柱４０の隙間は、第１培養液貯留槽２１からハイドロゲルチャンバー１０に向かって減少後、増加に転じている。これにより、第１培養液貯留槽２１からハイドロゲルチャンバー１０に培養液１０１を供給し易く、且つ、くさび効果によりハイドロゲルチャンバー１０からは第１培養液貯留槽２１にハイドロゲル１００が流出し難くできる。
　支柱列３２は、第２培養液貯留槽３１と連通するハイドロゲルチャンバー１０の第２面１３に沿って設けられている。支柱列３２は、ハイドロゲルチャンバー１０と第２培養液貯留槽３１との界面領域を形成する複数の支柱４０を備えている。なお、支柱列３２の支柱４０の構成は、ハイドロゲルチャンバー１０を挟んで反対側（第１培養液貯留槽２１側）に配置された支柱列２２の支柱４０と対称の構成であるため、その説明は割愛する。なお、支柱４０の形状は、上記形状が好ましいが、公知の三角形、台形等で形成されていてもよい。
　上記構成の第１実施形態によれば、ハイドロゲルチャンバー１０に隣接した第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０に培養液１０１を貯留し、貯留された培養液１０１に対して空圧をかけることで、ハイドロゲル１００に培養液１０１を浸透させて細胞を培養できる。このように、培養容器２に空圧装置５を接続し、空圧によってハイドロゲル１００に培養液１０１を浸透させながら細胞（例えば血管内皮細胞）を培養することで、ハイドロゲル１００中での血管組織の形成を促進させることができる。
　培養液１０１に空圧をかけてハイドロゲル１００内に培養液１０１を浸透させることで、より大きな血管組織の形成が可能となる。また、空圧を調整することで、血管組織の成熟に伴って適切な流量で血管組織へ培養液１０１を灌流することが可能となる。また、空圧を調整し、培養液１０１を灌流することで、従来の水柱圧で送液する場合のように送液が進むにしたがって送液流量が減少してしまう問題を回避することができる。
　以上のように、第１実施形態に係る細胞培養装置１は、細胞を培養するハイドロゲル１００を保持するハイドロゲルチャンバー１０と、ハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２と連通する第１培養液貯留部２０と、ハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２と異なる第２面１３と連通する第２培養液貯留部３０と、を備える培養容器２と、培養容器２に接続された空圧装置５と、を備え、空圧装置５は、第１培養液貯留部２０と第２培養液貯留部３０との間に空圧に基づく圧力差を生じさせて、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０の少なくとも一方に貯留された培養液１０１を、ハイドロゲルチャンバー１０のハイドロゲル１００に加圧浸透させる。この構成によれば、生体外で効率的に大きな細胞組織を構築できる。
　また、第１実施形態では、ハイドロゲルチャンバー１０に、空圧に基づく圧力差を生じさせた状態でハイドロゲル１００を保持させる機構として、支柱列２２，３２を備える。この構成によれば、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０からハイドロゲルチャンバー１０に培養液１０１を供給し易く、且つ、空圧をかけた状態でも、ハイドロゲルチャンバー１０からは第１培養液貯留部２０または第２培養液貯留部３０にハイドロゲル１００が流出し難くなる。さらに、ハイドロゲルチャンバー１０にハイドロゲル１００を保持させる表面処理を施すとよい。
　第１実施形態に係る細胞培養方法は、上記細胞培養装置１を用いて、ハイドロゲルチャンバー１０内で細胞を培養する。この構成によれば、この構成によれば、生体外で効率的に大きな細胞組織を構築できる。
　また、第１実施形態では、細胞を培養し、ハイドロゲルチャンバー１０内で血管組織を形成させる。この構成によれば、この構成によれば、生体外で効率的に大きな血管組織を構築できる。
　（第２実施形態）
　次に、本発明の第２実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図５は、第２実施形態に係る細胞培養装置１を示す斜視図である。図６は、図５に示す矢視ＶＩ－ＶＩ断面図である。図７は、図６に示す矢視ＶＩＩ－ＶＩＩ断面図である。　図５に示すように、第２実施形態では、培養容器２の上部に、空圧配管５１，６１が接続された蓋部３が固定されている点で、上記実施形態と異なる。
　図６に示すように、蓋部３の下面には、第１培養液貯留槽２１に連通する上方に向かって凹状の第１凹部２３と、第２培養液貯留槽３１に連通する上方に向かって凹状の第２凹部３３と、が形成されている。なお、ハイドロゲル貯留槽１６の上部は、蓋部３の下面によって閉塞されている。蓋部３には、第１凹部２３に連通するように空圧配管５１が接続されている。また、蓋部３には、第２凹部３３に連通するように空圧配管６１が接続されている。なお、蓋部３に対する空圧配管５１，６１の接続方向は、Ｙ軸方向に限らず、Ｘ軸方向であっても、Ｚ軸方向であってもよい。
　図７に示すように、空圧配管５１は、空圧ポンプ５０に接続されている。また、空圧配管６１は、空圧ポンプ６０に接続されている。これにより、空圧ポンプ５０から空圧配管５１を介して第１培養液貯留槽２１を加圧できる。また、空圧ポンプ６０から空圧配管６１を介して第２培養液貯留槽３１を加圧できる。空圧配管５１，６１の一部には、フィルターを設けるとよい、これにより第１培養液貯留槽２１ないし第２培養液貯留槽３１にほこり等の異物が混入することを抑制できる。フィルターは、例えば細孔径０．２２［μｍ］以下の疎水性の材質のフィルターを用いることが好ましい。
　培養容器２の第１培養液貯留槽２１の開口縁部及び第２培養液貯留槽３１の開口縁部にＯ－リングを配し、蓋部３との間に挟み込んでもよい。これにより、蓋部３の隙間からの圧力漏れを抑制できる。また、Ｏ－リングを上下方向に潰すように、蓋部３をボルト等で培養容器２に固定してもよい。これにより、培養容器２の容器本体と蓋部３との間のシール性を高めることができる。
　このように、上記第２実施形態によれば、培養容器２が蓋部３を備えている。蓋部３には、空圧配管５１，６１が接続されている。この構成によれば、蓋部３から空圧配管５１，６１を取り外すことで、培養容器２と空圧装置５との接続を容易に解除できる。これにより、空圧配管５１，６１を蓋部３から取り外した状態で、クリーンベンチなどの別の場所に搬送した後に、蓋部３を取り外し、容易に培養容器２にハイドロゲル１００や培養液１０１を供給することができる。また、空圧配管５１，６１には、フィルターが設けられている。この構成によれば、空圧をかける際に、第１培養液貯留槽２１ないし第２培養液貯留槽３１にほこり等の異物が混入することを抑制できる。
　（第３実施形態）
　次に、本発明の第３実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図８は、第３実施形態に係る細胞培養装置１を示す斜視図である。図９は、第３実施形態に係る細胞培養装置１の要部を示す平断面図である。なお、図９は、上述した図３、図７と同様に、ハイドロゲルチャンバー１０に沿った平断面図を示している。
　図８に示すように、第３実施形態では、第１培養液貯留部２０が第１培養液貯留槽２１とハイドロゲルチャンバー１０とを連通させる第１マイクロ流路２４を備える点で、上記実施形態と異なる。また、第３実施形態では、第２培養液貯留部３０が第２培養液貯留槽３１とハイドロゲルチャンバー１０とを連通させる第２マイクロ流路３４を備える点で、上記実施形態と異なる。
　第１マイクロ流路２４は、ハイドロゲルチャンバー１０と同様に扁平状の内部空間を備え、Ｘ軸方向に帯状に延びている。なお、第１マイクロ流路２４の内部空間の高さ（Ｚ軸方向の寸法）は、例えばハイドロゲルチャンバー１０と同じである。また、図９に示すように、第１マイクロ流路２４の幅（Ｙ軸方向の寸法）は、例えば第１面１２の幅（Ｙ軸方向の寸法）と同じである。
　また、第２マイクロ流路３４は、ハイドロゲルチャンバー１０と同様に扁平状の内部空間を備え、Ｘ軸方向に帯状に延びている。なお、第２マイクロ流路３４の内部空間の高さ（Ｚ軸方向の寸法）は、例えばハイドロゲルチャンバー１０と同じである。また、第２マイクロ流路３４の幅（Ｙ軸方向の寸法）は、例えば第２面１３の幅（Ｙ軸方向の寸法）と同じである。なお、第１マイクロ流路２４及び第２マイクロ流路３４の各寸法は、上記寸法に限定されるものではない。
　上記構成の第３実施形態によれば、第１培養液貯留部２０において、第１マイクロ流路２４によってハイドロゲルチャンバー１０と第１培養液貯留槽２１との間を接続することができる。この構成によれば、第１培養液貯留槽２１とハイドロゲルチャンバー１０との間にスペースを確保することができる。したがって、空圧装置５に接続するための培養容器２の設計スペースや、ハイドロゲルチャンバー１０のハイドロゲル貯留槽１６にハイドロゲル１００を導入する開口部を広げるための培養容器２の設計スペース等を確保することができ、設計の自由度が向上する。
　また、第２培養液貯留部３０においても、第２マイクロ流路３４によってハイドロゲルチャンバー１０と第２培養液貯留槽３１との間を接続することで、培養容器２の設計スペースをより確保し易くなる。なお、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０のいずれか一方が、マイクロ流路を備えることで、培養容器２の設計スペースを充分に確保できる場合、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０の他方は、マイクロ流路を備えない場合もある。
　（第４実施形態）
　次に、本発明の第４実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図１０は、第４実施形態に係る細胞培養装置１の要部を示す平断面図である。図１１は、図１０に示す領域Ｂの拡大図である。なお、図１０は、上述した図３、図７、図９と同様に、ハイドロゲルチャンバー１０に沿った平断面図を示している。
　図１０に示すように、第４実施形態では、第１マイクロ流路２４が抵抗流路２５を備える点で、上記実施形態と異なる。なお、抵抗流路２５は、第２マイクロ流路３４に設けられていてもよい。
　ハイドロゲル１００内に形成した血管組織に、空圧駆動で培養液１０１を灌流しながら培養する場合、血管組織の成熟に伴って血管組織の断面積が大きくなり、培養液１０１の流量が大きくなるという特徴がある。一方、血管組織の断面積の変化を予測することは、困難であり、培養液１０１の流量を予測することも困難である。したがって、例えば第１培養液貯留槽２１（第２培養液貯留槽３１）を加圧して、第１培養液貯留部２０（第２培養液貯留部３０）に貯留された培養液１０１を、ハイドロゲルチャンバー１０のハイドロゲル１００に加圧浸透させる場合において、第１培養液貯留部２０（第２培養液貯留部３０）に培養液１０１を補充すべきタイミングを予測することは難しく、培養液１０１の流量が大きくなってしまった場合に、培養液１０１を頻繁に補充することは煩雑である。　このため、第４実施形態では、第１マイクロ流路２４の一部に流路の断面積が小さい抵抗流路２５を設けている。抵抗流路２５を設けることで、血管組織の成熟に伴って血管が太くなってしまった場合においても培養液１０１の流量の増大を制御することができる。
　図１１に示すように、第１マイクロ流路２４には、第１マイクロ流路２４よりも断面積が小さい抵抗流路２５が並列に複数設けられている。抵抗流路２５への気泡やほこりによる目詰まり等を回避するためには、図１１に示すように抵抗流路２５を並列に複数設けるとよく、好ましくは１０本以上の抵抗流路２５が並列に設けられているとよい。なお、気泡やほこりによる目詰まり等の懸念がなければ、抵抗流路２５は、１つ（１本）であっても構わない。
　抵抗流路２５の流路抵抗は、ハイドロゲル１００中に形成される血管の流路抵抗より大きくすることで、血管の成熟に伴って血管径が変化しても培養液１０１の流量をより正確に制御することが可能となる。ここで、抵抗流路２５の流路抵抗（ＲＭＣ）は、培養液１０１の粘度（μ）、流路の長さ（ＬＭＣ）、流路の断面径（ｄＭＣ）、並列に配置された流路の本数（ＮＭＣ）の関係で、下式（１）のように定義される。
　ＲＭＣ　＝　８μＬＭＣ／πｄＭＣ ４ＮＭＣ　　…（１）
　ここで、ｄＭＣは、流路断面が円の場合は直径を示すが、流路断面が非円形の場合は相当直径で代用することができる。相当直径（ｄｅｑ）は流路断面積（Ｓ）、流路断面周囲長（ＬＰ）の関係で、下式（２）のように定義される。
　ｄｅｑ　＝　４Ｓ／ＬＰ　　…（２）
　ハイドロゲル１００中に形成される形成される血管の流路抵抗（ＲＶ）は、培養液１０１の粘度（μ）、血管の長さ（ＬＶ）、血管の断面径（ｄＶ）、並列に形成される血管の本数（ＮＶ）から、下式（３）によって見積もることができる。
　ＲＶ　＝　８μＬＶ／πｄＶ ４ＮＶ　　…（３）
　ハイドロゲル１００中に形成される血管の血管径や本数はハイドロゲルチャンバー１０の形状によって異なり、成熟に伴って変化するが、血管の長さ（ＬＶ）はハイドロゲルチャンバー１０の血管伸長方向の長さ（Ｘ軸方向の寸法）、血管の断面径（ｄＶ）はハイドロゲルチャンバー１０の高さ（Ｚ軸方向の寸法）、並列に形成される血管の本数（ＮＶ）はハイドロゲルチャンバー１０の幅（第１面１２または第２面１３のＹ軸方向の寸法）を血管の断面径（ｄＶ）で割った値を代表値として用いて、ハイドロゲル１００中に形成される血管の流路抵抗を推算することができる。これにより、後述のように培養液１０１の流量を推算することもできる。例えば、直径３００［μｍ］、長さ２０００［μｍ］の血管が５０本並列に並ぶと、血管の流路抵抗（ＲＶ）は、約２×１０－１０［Ｐａ・ｓ／μｍ３］となる。
　この場合、抵抗流路２５の流路抵抗が２×１０－１０［Ｐａ・ｓ／μｍ３］以上とすることで、培養容器２として実用に耐える流路抵抗として機能させることができる。例えば、幅２００［μｍ］、深さ２００［μｍ］、長さ２００［μｍ］の抵抗流路２５を１８本並列に並べると、抵抗流路２５の流路抵抗（ＲＭＣ）は２×１０－１０［Ｐａ・ｓ／μｍ３］となる。
　抵抗流路２５の流路抵抗（ＲＭＣ）をこれより大きくするためには、式（１）より、流路の幅や深さをこれより小さい値としてもよいし、流路の長さをこれより大きな値といてもよいし、図１１に示すように抵抗流路２５の隙間ｗ４を調整するなどして、抵抗流路２５の本数をこれより減らしてもよい。
　つまり、抵抗流路の流路抵抗（ＲＭＣ）は、培養液の粘度（μ）、ハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２から第２面１３までの長さ（Ｌ）、ハイドロゲルチャンバー１０の高さ（ｄ）、第１面１２または第２面１３の幅をハイドロゲルチャンバー１０の高さで割った値を（Ｎ）としたとき、下式（５）の関係を満足するとよい。なお、Ｎは自然数であるとよい。
　ＲＭＣ　≧　８μＬ／πｄ４Ｎ　　…（５）
　培養液１０１の流量（Ｑ）は、第１培養液貯留部２０（第２培養液貯留部３０）に印加された圧力（Ｐ）、抵抗流路２５の流路抵抗（ＲＭＣ）、ハイドロゲル１００中に形成されうる血管の流路抵抗（ＲＶ）から、下式（６）によって推算できる。
　Ｑ　＝　Ｐ／（ＲＭＣ＋ＲＶ）　　…（６）
　上述のように、ハイドロゲル１００内に形成した血管組織に空圧駆動で培養液１０１を灌流しながら培養する場合では、血管組織の成熟に伴って血管組織の断面積が大きくなるに従って培養液１０１の流量が大きくなってしまうが、血管組織の断面積が非常に大きくなった場合の培養液１０１の最大流量は、下式（７）によって推算できる。
　Ｑ　＝　Ｐ／ＲＭＣ　　…（７）
　このように培養液１０１の最大流量を推算することができれば、培養液１０１の補充頻度の最短期間を見積もることができ、長期にわたって灌流培養を行う作業を効率化することができる。
　上述した第４実施形態によれば、第１マイクロ流路２４には、第１マイクロ流路２４よりも断面積が小さい抵抗流路２５が設けられている。抵抗流路２５の流路抵抗（ＲＭＣ）は、培養液の粘度（μ）、ハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２から第２面１３までの長さ（Ｌ）、ハイドロゲルチャンバー１０の高さ（ｄ）、第１面１２または第２面１３の幅をハイドロゲルチャンバー１０の高さで割った値を（Ｎ）としたとき、上式（５）の関係を満足する。この構成によれば、血管組織の成熟に伴って血管が太くなってしまった場合においても培養液１０１の流量の増大を制御して、培養液１０１の最大流量を推算することができ、長期にわたって灌流培養を行う作業を効率化することができる。
　（第５実施形態）
　次に、本発明の第５実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図１２は、第５実施形態に係る細胞培養装置１を示す斜視図である。図１３は、図１２に示す矢視ＸＩＩＩ－ＸＩＩＩ断面図である。図１４は、図１３に示す矢視ＸＩＶ－ＸＩＶ断面図である。
　図１２に示すように、第５実施形態では、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部に第３培養液貯留部８０が設けられている点で、上記実施形態と異なる。
　第３培養液貯留部８０は、培養液１０１を貯留する第３培養液貯留槽８１を備えている。なお、図に示す例の第３培養液貯留槽８１は、ハイドロゲル１００をハイドロゲルチャンバー１０に導入するためのハイドロゲル貯留槽１６を兼ねている。第３培養液貯留槽８１は、平面視でＹ軸方向に延びる長孔状ないし楕円状に形成されている。なお、第３培養液貯留槽８１の平面視形状は特に限定されない。第３培養液貯留槽８１は、ハイドロゲルチャンバー１０よりも内部空間（容積）が大きいとよい。
　図１３に示すように、第３培養液貯留槽８１の底面の中央には、ハイドロゲルチャンバー１０の天面に連通する１つの大きな開口部８２が形成されている。開口部８２には、透過性の膜８２ａを設けてもよい。透過性の膜８２ａは、一方の面がハイドロゲル１００に面し、他方の面が培養液１０１に面している。透過性の膜８２ａは、例えばハイドロゲル１００が透過できず、培養液１０１が透過できるものであるとよい。また、透過性の膜８２ａは、開口部８２に対して着脱可能な構造で取り付けるとよい。
　図１４に示すように、空圧装置５は、第３培養液貯留槽８１に接続された空圧ポンプ９０を備えている。図１２に戻り、第３培養液貯留槽８１の上部は、蓋部３によって閉塞されている。蓋部３の下面には、第３培養液貯留槽８１に連通する上方に向かって凹状の第３凹部８３が形成されている。蓋部３には、第３凹部８３に連通するように空圧配管９１が接続されている。空圧配管９１は、空圧ポンプ９０に接続されている。これにより、空圧ポンプ９０から空圧配管９１を介して第３培養液貯留槽８１を加圧できる。
　上述した第５実施形態では、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部に、開口部８２が形成されている。再生医療や創薬開発におけるオルガノイド培養では、細胞集塊であるオルガノイドに微小血管を吻合させ、微小血管を介して培養液１０１を灌流することが求められている。図１３及び図１４に示すように、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部に１つの大きな開口部８２を設けることにより、ハイドロゲル１００の導入が簡便になる。さらに、開口部８２を利用してハイドロゲル１００の上に細胞集塊を配置することができ、細胞集塊へ微小血管網を介した培養液１０１の灌流が可能となる。
　また、第５実施形態では、開口部８２には、一方の面がハイドロゲル１００に面し、他方の面が培養液１０１に面する透過性の膜８２ａが設けることができる。医薬品候補化合物の薬物動態試験では、血液脳関門等の微小血管からの医薬品候補化合物の透過速度を評価することがある。透過速度を評価するためには、微小血管の外側、つまりハイドロゲル１００内に漏出してきた化合物を回収して質量分析等の分析機器で評価する必要がある。これを可能とするため、図１３に示すように、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部に設けた開口部８２に透過性の膜８２ａを設け、透過性の膜８２ａの一方の面がハイドロゲル１００に面し、もう一方の面が培養液１０１を保持する第３培養液貯留槽８１に面する形とすることで、ハイドロゲル１００内に露出した化合物を透過性の膜８２ａを介して回収して分析することが可能となる。
　また、第５実施形態のように、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部に開口部８２を設ける場合、第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０の少なくとも一方を加圧して培養液１０１をハイドロゲル１００に加圧浸透する際に、培養液１０１がハイドロゲルチャンバー１０の開口部８２から漏出してしまうことがある。これを防ぐために、空圧装置５を第３培養液貯留部８０に接続している。第１培養液貯留部２０及び第２培養液貯留部３０の少なくとも一方を加圧する際に、第３培養液貯留部８０に対しても同程度の圧力をかけることで、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部の開口部８２からの培養液１０１の漏出を防ぐことができる。
　（第６実施形態）
　次に、本発明の第６実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図１５は、第６実施形態に係る細胞培養装置１を示す斜視図である。図１６は、図１５に示す矢視ＸＶＩ－ＸＶＩ断面図である。図１７は、図１６に示す矢視ＸＶＩＩ－ＸＶＩＩ断面図である。
　図１５に示すように、第６実施形態では、第３培養液貯留槽８１とは別に、ハイドロゲル貯留槽１６Ａ，１６Ｂが設けられている点で、上記実施形態と異なる。
　ハイドロゲル貯留槽１６Ａ，１６Ｂは、第３培養液貯留槽８１をＹ軸方向で挟んで一対で設けられている。ハイドロゲル貯留槽１６Ａ，１６Ｂは、平面視で円形に形成されている。なお、ハイドロゲル貯留槽１６Ａ，１６Ｂの平面視形状は特に限定されない。ハイドロゲル貯留槽１６Ａ，１６Ｂは、例えば設置スペース等の観点から、第３培養液貯留槽８１よりも内部空間（容積）が小さいとよい。
　図１６に示すように、ハイドロゲル貯留槽１６Ａの底面は、導入孔１４を介してハイドロゲルチャンバー１０に連通している。また、ハイドロゲル貯留槽１６Ｂの底面は、導入孔１５を介してハイドロゲルチャンバー１０に連通している。図１７に示すように、ハイドロゲル貯留槽１６Ａ，１６Ｂは、開口部８２よりも十分に小さい導入孔１４，１５を介してハイドロゲルチャンバー１０に連通しており、ハイドロゲルチャンバー１０からの培養液１０１の漏出の問題は少ないため、第３培養液貯留槽８１のように空圧装置５に接続していないが、第３培養液貯留槽８１と同じように空圧装置５に接続しても構わない。
　上述した第６実施形態によれば、ハイドロゲルチャンバー１０にハイドロゲル１００を導入する導入孔１４，１５が、ハイドロゲルチャンバー１０の直上部の開口部８２とは別の位置に配置されるため、例えば、上述したハイドロゲル１００内に露出した化合物を透過性の膜８２ａを介して回収して分析する作業等が容易になる。
　（第７実施形態）
　次に、本発明の第７実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図１８は、第７実施形態に係る細胞培養装置１を示す平面模式図である。
　図１８に示すように、第７実施形態では、第１マイクロ流路２４及び第２マイクロ流路３４がそれぞれ一対で設けられている点で、上記実施形態と異なる。
　第１マイクロ流路２４は、一対のマイクロ流路２４Ａ，２４Ｂを備えている。つまり、第１培養液貯留槽２１とハイドロゲルチャンバー１０の間は、２本のマイクロ流路２４Ａ，２４Ｂで接続されている。第１マイクロ流路２４は、平面視でＣ字状ないしＵ字状に形成されている。第１マイクロ流路２４は、Ｃ字状ないしＵ字状の両端部で第１培養液貯留槽２１と連通し、両端部以外の場所（中間部分）でハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２に連通している。
　第２マイクロ流路３４は、一対のマイクロ流路３４Ａ，３４Ｂを備えている。つまり、第２培養液貯留槽３１とハイドロゲルチャンバー１０の間は、２本のマイクロ流路３４Ａ，３４Ｂで接続されている。第２マイクロ流路３４は、平面視でＣ字状ないしＵ字状に形成されている。第２マイクロ流路３４は、Ｃ字状ないしＵ字状の両端部で第２培養液貯留槽３１と連通し、両端部以外の場所（中間部分）でハイドロゲルチャンバー１０の第２面１３に連通している。
　上述した第７実施形態によれば、第１マイクロ流路２４及び第２マイクロ流路３４がそれぞれ一対で設けられている。例えば、第１マイクロ流路２４において、第１培養液貯留槽２１からマイクロ流路２４Ａ，２４Ｂのいずれか一方に培養液１０１を導入することで、第１マイクロ流路２４内の気泡を容易に除去できる。また、第２マイクロ流路３４においても同様に、第２培養液貯留槽３１からマイクロ流路３４Ａ，３４Ｂのいずれか一方に培養液１０１を導入することで、第２マイクロ流路３４内の気泡を容易に除去できる。
　（第８実施形態）
　次に、本発明の第８実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図１９は、第８実施形態に係る細胞培養装置１を示す平面模式図である。
　図１９に示すように、第８実施形態では、第１培養液貯留槽２１と第２培養液貯留槽３１とを連通させる返送流路１１０が設けられている点で、上記実施形態と異なる。
　なお、図１９における白抜き矢印は、培養液１０１の流れを示している。つまり、図１９に示す例では、培養液１０１が、第１培養液貯留槽２１から第１マイクロ流路２４を介してハイドロゲルチャンバー１０に供給され、ハイドロゲルチャンバー１０から第２マイクロ流路３４を介して第２培養液貯留槽３１に流出し、第２培養液貯留槽３１から返送流路１１０を介して第１培養液貯留槽２１に戻るようになっている。
　返送流路１１０には、第１培養液貯留槽２１から第２培養液貯留槽３１への培養液１０１の逆流を防止する機構として、受動バルブ１１１が設けられている、受動バルブ１１１は、例えば微小な流体チャネルを有し、流体チャネルの断面積、形状、長さや濡れ性等を調整することで、第１培養液貯留槽２１からの気泡の侵入を防ぎつつ、培養液１０１を第２培養液貯留槽３１から第１培養液貯留槽２１に一方向に流すことができる。
　受動バルブ１１１の耐圧性は、０．１［ｋＰａ］～１０［ｋＰａ］の範囲内であるとよい。これにより、培養容器２が市販の調圧器で制御できる範囲で、なおかつ生理学的な範囲での培養操作が可能となる。なお、受動バルブ１１１の耐圧性（ΔＰＬａｐ）は界面張力（γ）と流路断面径（ｄ）によって下式（８）のように推算できる。
　ΔＰＬａｐ　＝　４γ／ｄ　　…（８）
　さらに、第２マイクロ流路３４の第２培養液貯留槽３１側の両端部には、培養液１０１の逆流を防止する機構として、逆止弁３６が設けられている。これにより、第２培養液貯留槽３１を加圧し、第１培養液貯留槽２１に培養液１０１を返送する際に、ハイドロゲルチャンバー１０側に培養液１０１が逆流することを防止することができる。
　空圧装置５は、培養液１０１の供給、及び、培養液１０１の返送を所定時間毎に切り替える。なお、培養液１０１の供給時間は、培養液１０１の返送時間よりも長く設定するとよい。培養液１０１を供給する場合、空圧装置５は、第１培養液貯留槽２１を加圧し、第２培養液貯留槽３１との差圧により、ハイドロゲルチャンバー１０に培養液１０１を供給する。
　培養液１０１を返送する場合、空圧装置５は、培養液の溜まった第２培養液貯留槽３１を加圧し、第１培養液貯留槽２１との差圧により、返送流路１１０を介して第１培養液貯留槽２１に培養液１０１を返送する。なお、返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の端部は、返送流路１１０の第２培養液貯留槽３１側の端部よりも高くするとよい。これにより、第１培養液貯留槽２１から第２培養液貯留槽３１への培養液１０１の逆流を抑制することができる。
　上述した第８実施形態によれば、第１培養液貯留槽２１と第２培養液貯留槽３１とを連通させる培養液１０１の返送流路１１０と、第２マイクロ流路３４及び返送流路１１０に、培養液１０１の逆流を防止する機構を備える。この構成によれば、第１培養液貯留槽２１における培養液１０１の枯渇を防ぐことができ、長期に亘って細胞を培養することができる。
　また、第８実施形態では、逆流を防止する機構として、気泡の侵入を防ぐ受動バルブ１１１を備える。この構成によれば、空圧によって培養液１０１を返送及び循環する際に返送流路１１０への空気の導入を受動バルブ１１１の位置にて防ぐことができ、返送流路１１０に導入された空気によって第１培養液貯留槽２１及び第２培養液貯留槽３１にて気泡を生じることを防ぐことができ、培養操作が安定する。
　また、第８実施形態では、受動バルブ１１１の耐圧性が、０．１［ｋＰａ］～１０［ｋＰａ］の範囲内である。この構成によれば、市販の調圧器で制御できる範囲で、なおかつ生理学的な範囲での培養操作が可能となる。
　（第９実施形態）
　次に、本発明の第９実施形態について説明する。以下の説明において、上述の実施形態と同一又は同等の構成については同一の符号を付し、その説明を簡略若しくは省略する。
　図２０は、第９実施形態に係る細胞培養装置１を示す平面模式図である。
　図２０に示すように、第９実施形態では、第２マイクロ流路３４の一対のマイクロ流路３４Ａ，３４Ｂのそれぞれに抵抗流路３５が設けられている点で、上記実施形態と異なる。
　第２マイクロ流路３４に設けられた抵抗流路３５は、上述した図１１に示す第１マイクロ流路２４に設けられた抵抗流路２５と同様の構成を有している。つまり、第２マイクロ流路３４には、第２マイクロ流路３４よりも断面積が小さい抵抗流路３５が１つまたは複並列に複数設けられている。抵抗流路２５の流路抵抗は、ハイドロゲル１００中に形成される血管の流路抵抗より大きくすることで、血管の成熟に伴って血管径が変化しても培養液１０１の流量をより正確に制御することが可能となる。
　つまり、抵抗流路３５の流路抵抗（ＲＭＣ）は、培養液の粘度（μ）、ハイドロゲルチャンバー１０の第１面１２から第２面１３までの長さ（Ｌ）、ハイドロゲルチャンバー１０の高さ（ｄ）、第１面１２または第２面１３の幅をハイドロゲルチャンバー１０の高さで割った値を（Ｎ）としたとき、ＲＭＣ≧８μＬ／πｄ４Ｎの関係を満足するとよい。この構成によれば、血管組織の成熟に伴って血管が太くなってしまった場合においても培養液１０１の流量の増大を制御して、培養液１０１の最大流量を推算することができ、長期にわたって灌流培養を行う作業を効率化することができる。
　なお、受動バルブ１１１を構成する流路抵抗を血管の流路抵抗より大きく設計することで抵抗流路３５を兼ねることもできる。
　以下、実施例により本発明の効果をより明らかにする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できる。
　［第１実施例］
　以下に示す第１実施例では、図１９及び図２０に示す培養容器２の血管形成用の流路（ハイドロゲルチャンバー１０等）を、フォトリソグラフィーおよびＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）モールディングにより作製した。ハイドロゲルチャンバー１０の大きさは、血管の長さ方向（Ｘ軸方向の寸法）が５．６［ｍｍ］、幅（Ｙ軸方向の寸法）が９．７［ｍｍ］、深さ（Ｚ軸方向の寸法）が０．３［ｍｍ］となっている。
　図２１は、第１実施例に係る血管直径とずり応力および流量の関係を示すグラフである。なお、図２１においては、血管直径とずり応力および流量の関係を式（６）によって推算した結果を示している。図２１において、「抵抗流路なし」とは、図１９に示す、抵抗流路３５がない培養容器２で血管組織を形成したときの計算結果を示している。また、図２１において、「抵抗流路あり」とは、図２０に示す、抵抗流路３５がある培養容器２で血管組織を形成したときの計算結果を示している。
　第１実施例では、１［ｋＰａ］で培養容器２内を加圧し、抵抗流路２５の流路抵抗（ＲＭＣ）は２×１０－８［Ｐａ・ｓ／μｍ３］とし、培養液１０１の粘度（μ）は０．００１［Ｐａ・ｓ］とし、形成される血管の長さ（ＬＶ）は５６００［μｍ］とし、並列に形成される血管の本数（ＮＶ）は１６とした場合の計算結果を示す。
　「抵抗流路なし」の培養容器２では、血管直径が大きくなるにつれて、培養液１０１の流量が上昇していくことが分かる。一方で、「抵抗流路あり」の培養容器２では、血管直径が大きくなっても、培養液の流量が２３０［μＬ／ｍｉｎ］以上には上昇しないことが分かる。
　また、第１実施例では、培養容器２内の流路をコートするため、予め６１４［μｇ／ｍｌ］に水で調整したポリ－Ｌ－リシン臭化水素酸塩（分子量３００００～７００００：ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）　を注入して３７［℃］で１時間静置し、のちにリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。
　また、ハイドロゲル１００を調整するため、フィブリノーゲン, ヒト血漿由来（Ｗａｋｏ社製）をＤ－ＰＢＳ（－）（Ｗａｋｏ社製）の培養液１０１で６［ｍｇ／ｍｌ］になるように３７［℃］で溶解させ、０．２２　ｆｉｌｔｅｒ　Ｍｉｌｌｉｅｘ－ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）とテルモシリンジ（ＴＥＲＭＯ社製）を用いてフィルター滅菌を行った。
　また、血管形成の過程を観察するため、培養したヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣを、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ　Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で蛍光染色した。その後、トリプシン処理にて剥離させ遠心分離し、ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（最終濃度４［Ｕ／ｍＬ］　Ｔｈｒｏｍｂｉｎを含む細胞懸濁液）で再懸濁して細胞濃度をカウントした。細胞濃度が１２×１０６［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］となるように、ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒで再度希釈調整した。
　図１９および図２０に示す培養容器２は、予め４［℃］に冷やしておき、フィブリノーゲン溶液とＨＵＶＥＣを含む細胞研懸濁液を１：１で混合したプレゲル溶液を調整し、各培養容器２のハイドロゲルチャンバー１０にプレゲル溶液を注入した。そして、３７［℃］，５％　ＣＯ２インキュベーターに入れ、１５分間保温してゲルを固まらせた後に培地用チャネルに専用培地ＥＧＭＴＭ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ　ＥＧＭＴＭ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ　（Ｌｏｎｚａ社製）を第１マイクロ流路２４および第２マイクロ流路３４の開口部より導入し、３７［℃］，５％　ＣＯ２インキュベーターに入れ、６０分間保温した。ゲルと培地の境目に生じた泡をピペッティングにより取り除いた後、第２培養液貯留槽３１に位置する第２マイクロ流路３４の開口部に逆止弁３６を取り付けた。
　そして、第１培養液貯留槽２１に１［ｍＬ］の培地を入れ、加圧循環培養を開始した。具体的には、第１培養液貯留槽２１を１［ｋＰａ］で２４０［ｓｅｃ］加圧して細胞に培地を順送し、第２培養液貯留槽３１を１［ｋＰａ］で６０［ｓｅｃ］加圧して返送するサイクルを７日間繰り返した。
　細胞を導入した日を０日目とし、３～７日目に蛍光顕微鏡観察と順送の流量測定を行った。培地交換は、３日目と６日目に行った。４～７日目まで毎日、１０［μｌ］の７０　ｋＤａ　ＦＩＴＣ　デキストラン（ＳＩＧＭＡ社製）を静水圧により５分間流したのち蛍光顕微鏡観察し、血管の形状および導通を解析した。
　図２２は、第１実施例に係る「抵抗流路なし」の場合の血管組織の蛍光顕微鏡画像である。図２３は、第１実施例に係る「抵抗流路あり」の場合の血管組織の蛍光顕微鏡画像である。　図２２及び図２３では、上記結果の０日目、３日目、５日目、７日目に観察した蛍光顕微鏡画像を示している。３日目には、「抵抗流路なし」及び「抵抗流路あり」のいずれの培養容器２ともに、血管の伸長と拡大が進んでおり、細胞も培地の流れに沿って配向していた。５日目には、血管の拡大が更に進行しており、３日目よりも細胞の強い配向性が見られた。７日目には血管間のゲル部分が殆ど観察できないほどＨＵＶＥＣが増殖し、細胞の配向性も失われた。
　図２４は、第１実施例に係る「抵抗流路なし」の場合の血管組織全体の蛍光顕微鏡画像である。図２５は、第１実施例に係る「抵抗流路あり」の場合の血管組織全体の蛍光顕微鏡画像である。
　図２４及び図２５では、血管導通後それぞれ３日間、７０　ｋＤａ　ＦＩＴＣ　ｄｅｘｔｒａｎを流して血管全体の様子を観察した結果を示している。図２４に示すように「抵抗流路なし」では、５日目、「抵抗流路あり」では４日目に血管が導通した。その後３日間、両流路ともに血管は拡大していき、拡大の進行の速さに違いは見られなかった。「抵抗流路あり」と「抵抗流路なし」のいずれの場合においても、血管の長さ方向に５．６［ｍｍ］の大きさの血管組織をハイドロゲル１００内に構築することが可能であることが示された。これにより、本発明の方法を用いることで、従来の報告よりも大きな血管組織を形成できることが示された。
　図２６は、第１実施例に係る培養液１０１の順送の流量と培養期間との関係を示すグラフである。
　図２６に示すように、「抵抗流路なし」では４日目に血管がやや導通し、流量は８１．８［μｌ／ｍｉｎ］となった。その後、血管の拡大と共に流量は急激に増大していき、５日目には流量は３３０．２［μｌ／ｍｉｎ］となり、７日目には８３９．２［μｌ／ｍｉｎ］となった。「抵抗流路あり」では４日目に血管が導通し、流量は２８８．５［μｌ／ｍｉｎ］となった。なお「抵抗流路あり」では、血管が導通してから７日目まで流量は上昇することなく、２３０［μｌ／ｍｉｎ］程度に維持された。いずれの培養容器２においても、血管が形成されていない状態では培養液１０１をハイドロゲル１００に加圧浸透させつつ、血管の成熟に伴い培養液１０１を血管組織に灌流することが可能であることが示された。
　従来では、２［ｍｍ］以下の長さの血管組織の構築例が報告されているが、これより大きな血管組織の構築例は報告がない。第１実施例では本発明の適用によって長さ５．６［ｍｍ］までの血管組織を構築できることが確認された。血管組織を血管の透過性試験に用いる場合、より大きな血管組織を用いることにより、より大きな表面積を有する血管組織を用いて化合物の透過性試験を実施することができる。また、より大きな表面積を有する血管組織を用いることで、血管壁を透過した化合物の回収量が多くなり、透過性試験の感度が向上するという利点がある。
　このように、本発明によれば、空圧をかけ続けながら微小血管組織を形成させることで、微小血管組織の形成に応じて培養液１０１を灌流することが可能となった。本発明によれば、培養液１０１の灌流の流量を経時的に報告でき、微小血管組織を長期間にわたって安定に維持できる。このような微小血管組織の形成に応じた灌流や、長期間にわたって安定な血管組織の構築は、化合物の透過性試験の安定性を高めることができるとともに、血管組織と結合したオルガノイド培養に適用した際に、より成熟したオルガノイドの形成が可能となる。
　［第２実施例］
　図２７は、第２実施例に係る細胞培養装置１を示す平面模式図である。
　第２実施例では、図２７に示す細胞培養装置１を使用した。この細胞培養装置１は、第２培養液貯留部３０の第２培養液貯留槽３１が、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂに分かれている点、及び、第１マイクロ流路２４に抵抗流路２５が設けられている点で、図２０に示す構成（第１実施例）と異なる。
　空圧ポンプ６０は、第２培養液貯留槽３１Ａに接続された空圧ポンプ６０Ａと、第２培養液貯留槽３１Ｂに接続された空圧ポンプ６０Ｂと、を備えている。第１培養液貯留槽２１には、空圧ポンプ５０が接続されている。第３培養液貯留槽８１には、空圧ポンプ９０が接続されている。第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂは、連絡流路３７によって互いに連通している。連絡流路３７は、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂの培養液１０１の液面を均衡化する。
　返送流路１１０は、第２培養液貯留槽３１Ａと第１培養液貯留槽２１との間に接続されているが、第２培養液貯留槽３１Ｂと第１培養液貯留槽２１との間に接続されていてもよい。抵抗流路２５は、第１マイクロ流路２４のマイクロ流路２４Ａ，２４Ｂのそれぞれに設けられている。
　第２実施例では、培養容器２の血管形成用の各流路（ハイドロゲルチャンバー１０等）を、フォトリソグラフィーおよびＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）モールディングにより作製した。ハイドロゲルチャンバー１０の大きさは、血管の長さ方向（Ｘ軸方向の寸法）が５．６［ｍｍ］、幅（Ｙ軸方向の寸法）が９．７［ｍｍ］、深さ（Ｚ軸方向の寸法）が０．３［ｍｍ］となっている。
　また、第１マイクロ流路２４の抵抗流路２５及び第２マイクロ流路３４の抵抗流路３５は、長さ１．２［ｍｍ］、幅０．０８［ｍｍ］、高さ０．０６［ｍｍ］となっている。培養液と空気の界面張力を［６０ｍＮ／ｍ］としたとき、第１マイクロ流路２４及び第２マイクロ流路３４の耐圧性は、式（８）より３．５［ｋＰａ］と推算される。抵抗流路２５は、受動バルブとしても機能する。
　図２７に示す培養容器２は、図１９及び図２０に示す培養容器２と比較して、第１マイクロ流路２４に抵抗流路２５が設けられている。また、第２マイクロ流路３４の開口部は、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂの底面より約１ｃｍ高くなっている。第１マイクロ流路２４の開口部は、第１培養液貯留槽２１の底面に設けられている。この構成により、培養液の流れを第１培養液貯留槽２１から第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂの方向（図中の矢印の方向）のみに制限し、逆流を防止できる。
　つまり、空圧ポンプ５０により第１培養液貯留槽２１を加圧した際に、第１培養液貯留槽２１内の培養液は、第１マイクロ流路２４の開口部、第１マイクロ流路２４、ハイドロゲルチャンバー１０、第２マイクロ流路３４を介して第２マイクロ流路３４の開口部へと流れる。一方、空圧ポンプ６０Ａ，６０Ｂを加圧した際には、第２マイクロ流路３４の開口部が、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂ内の培養液の液面より高くなっていることにより、第２マイクロ流路３４の開口部より空気が第２マイクロ流路３４に流入し、抵抗流路３５が受動バルブとして働き、空気の流入が停止され、培養液の流れも停止する。従って、空圧ポンプ５０と空圧ポンプ６０（６０Ａ，６０Ｂ）を交互に加圧することにより、第１マイクロ流路２４の開口部から第２マイクロ流路３４の開口部に向かった、一方向流れを生じさせることができる。
　また、返送流路１１０の受動バルブ１１１の寸法は、長さ０．２４［ｍｍ］、幅０．０８［ｍｍ］、高さ０．０６［ｍｍ］となっている。培養液と空気の界面張力を［６０ｍＮ／ｍ］としたとき、受動バルブの耐圧性は、式（８）より３．５［ｋＰａ］と推算される。返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部は、第１培養液貯留槽２１の底面より約１ｃｍ高くなっており、返送流路１１０の第２培養液貯留槽３１Ａ側の開口部は、第２培養液貯留槽３１Ａの底面に設けられている。これにより、培養液１０１の流れを第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂから第１培養液貯留槽２１の方向（図中の矢印の方向）のみに制限し、逆流を防止できる。
　つまり、空圧ポンプ６０Ａ，６０Ｂにより第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂを加圧した際に、第２培養液貯留槽３１Ａ内の培養液１０１は、返送流路１１０の第２培養液貯留槽３１Ａ側の開口部、返送流路１１０を介して返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部へと流れる。一方、空圧ポンプ５０を加圧した際には、返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部が第１培養液貯留槽２１内の培養液の液面より高くなっていることにより、返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部より空気が返送流路１１０に流入し、受動バルブ１１１により空気の流入が停止され、培養液１０１の流れも停止する。従って、空圧ポンプ５０と空圧ポンプ６０を交互に加圧することにより、返送流路１１０の第２培養液貯留槽３１Ａ側の開口部から返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部に向かった、一方向流れを生じさせることができる。
　第２実施例では、培養容器２内の流路をコートするため、予め５００［μｇ／ｍｌ］に水で調整したポリ－Ｌ－リシン臭化水素酸塩（分子量３００００～７００００：ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を注入して３７［℃］で１時間静置し、後に滅菌した５０％エタノール水溶液で３回以上洗浄した後、完全に乾燥させた。
　そして、第２実施例では、図２７に示す細胞培養装置１を用いて、加圧灌流によってハイドロゲル１００内に培地成分がどのように浸透しているかを確認するため、以下の試験を行った。
　ハイドロゲル１００を調整するため、フィブリノーゲン，ウシ血漿由来（Ｗａｋｏ社製）をＤ－ＰＢＳ（－）（Ｗａｋｏ社製）の培養液１０１で５［ｍｇ／ｍｌ］になるように３７［℃］で溶解させ、０．２２　ｆｉｌｔｅｒ　Ｍｉｌｌｉｅｘ－ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）とテルモシリンジ（ＴＥＲＭＯ社製）を用いてフィルター滅菌を行った。Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｗａｋｏ社製）を４［Ｕ／ｍＬ］を含む培養液（ＥＧＭ－２ＭＶ、Ｌｏｎｚａ社製）を調整した。
　培養容器２は、予め４［℃］に冷やしておき、フィブリノーゲン溶液とＴｈｒｏｍｂｉｎを含む培養液を１：１で混合したプレゲル溶液を調整し、培養容器２のハイドロゲルチャンバー１０にプレゲル溶液を注入した。そして、３７［℃］，５％　ＣＯ２インキュベーターに入れ、３５分間保温してゲルを固まらせた後に,培養液ＥＧＭ－２ＭＶを第２マイクロ流路３４及び第１マイクロ流路２４の開口部より導入し、３７［℃］，５％　ＣＯ２インキュベーターに入れ、６０分間保温した。返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部より返送流路１１０に培養液を導入した。
　次に、第１培養液貯留槽２１に１［ｍＬ］の培地を入れ、空圧ポンプ５０、６０、９０を培養容器２に接続後、以下の条件にて加圧灌流を開始した。加圧灌流は３７℃，５％ＣＯ２のインキュベーター内で行った。加圧は、０．５ｋＰａにて第１培養液貯留槽２１及び第３培養液貯留槽８１を１４４０秒間加圧して培地を順送し、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂを３６０秒間加圧して培養液１０１を返送するサイクルを繰り返した。
　一晩、加圧灌流を行った後に、２０［μＭ］のＣａｌｃｅｉｎ（ＤＯＪＩＮＤＯ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）及び２０［μＭ］のＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎ（分子量７０，０００Ｄａ：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含む培養液１０１で第１マイクロ流路２４を置換した後、さらに培養液１０１を第１培養液貯留槽２１に５００［μＬ］添加した。そして、第１培養液貯留槽２１を０．５［ｋＰａ］、１．０［ｋＰａ］、２．０［ｋＰａ］、及び３．０［ｋＰａ］で加圧を開始し、所定時間ごとに蛍光顕微鏡画像を撮像した。
　図２８は、第２実施例に係る培養容器２を２．０［ｋＰａ］で加圧した直後と５０秒後のＣａｌｃｅｉｎの蛍光顕微鏡画像である。
　図２８に示すように、加圧直後に対し、５０秒間のＣａｌｃｅｉｎの蛍光の界面は、２．０～２．５［ｍｍ］程度、上方に移動している。
　図２９は、第２実施例に係る培養容器２を０．５［ｋＰａ］、１．０［ｋＰａ］、２．０［ｋＰａ］、及び３．０［ｋＰａ］で加圧した際のＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの蛍光の界面の移動を時間ごとに測定した結果を示すグラフである。図３０は、第２実施例に係る培養容器２を０．５［ｋＰａ］、１．０［ｋＰａ］、２．０［ｋＰａ］、及び３．０［ｋＰａ］で加圧した際のＣａｌｃｅｉｎの蛍光の界面の移動を時間ごとに測定した結果を示すグラフである。
　図２９及び図３０に示すように、ＣａｌｃｅｉｎとＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの蛍光の界面の移動速度は類似しており、圧力に比例して蛍光の界面の移動速度が速くなっている結果が観測された。
　なお、一般的にＣａｌｃｅｉｎとＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの分子量は、６２３［Ｄａ］及び７０，０００［Ｄａ］と大きく異なるため、拡散の速度は大きく異なることが知られている。このため、図２９及び図３０に示す結果により、拡散ではなく、加圧による浸透によりＣａｌｃｅｉｎやＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎがハイドロゲル１００内に浸透していることが強く示唆され、本発明の加圧による浸透という方法が、培養液１０１に含まれる栄養成分をハイドロゲル１００内に浸透させるのに有効であることが確認された。
　次に、図２７に示す細胞培養装置１を用い、加圧灌流による血管形成を確認するため、以下の試験を行った。この際に、間葉系幹細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を混合して培養する効果についても検証した。
　ハイドロゲル１００を調整するため、フィブリノーゲン，ウシ血漿由来（Ｗａｋｏ社製）をＤ－ＰＢＳ（－）（Ｗａｋｏ社製）の培養液１０１で、５［ｍｇ／ｍｌ］になるように３７［℃］で溶解させ、０．２２　ｆｉｌｔｅｒ　Ｍｉｌｌｉｅｘ－ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）とテルモシリンジ（ＴＥＲＭＯ社製）を用いてフィルター滅菌を行った。
　また、血管形成の過程を観察するため、培養したＨＵＶＥＣを、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ　Ｒｅｄ　ＣＭＴＰＸ　Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で蛍光染色した。その後、０．０５％または０．２５％のＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡにて剥離したＨＵＶＥＣ及び間葉系幹細胞（ＵＥ７Ｔ－１３、ＪＣＲＢ細胞バンク）はそれぞれ１２×１０６［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］、４×１０６［ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］になるように４［Ｕ／ｍＬ］のＴｈｒｏｍｂｉｎ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を添加したＥＧＭ－２ＭＶで懸濁した。
　図２７に示す培養容器２は、予め４［℃］に冷やしておき、フィブリノーゲン溶液とＨＵＶＥＣ、ＭＳＣを含む細胞研懸濁液を１：１で混合したプレゲル溶液を調整し、各培養容器２のハイドロゲルチャンバー１０にプレゲル溶液を注入した。そして、３７［℃］，５％　ＣＯ２インキュベーターに入れ、３５分間保温してゲルを固まらせた後に、培養液ＥＧＭ－２ＭＶを第１マイクロ流路２４及び第２マイクロ流路３４の開口部より導入し、３７［℃］，５％　ＣＯ２インキュベーターに入れ、６０分間保温した。返送流路１１０の第１培養液貯留槽２１側の開口部より返送流路１１０に培養液１０１を導入した。
　次に、第１培養液貯留槽２１に１．２［ｍＬ］の培地を入れ、デバイスを加圧灌流装置に接続後、以下の条件にて加圧灌流を開始した。加圧灌流は、３７℃，　５％ＣＯ２のインキュベーター内で行った。加圧は、２．０［ｋＰａ］にて第１培養液貯留槽２１及び第３培養液貯留槽８１を３６０秒間加圧して順送し、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂを９０秒間加圧して返送するサイクルを、１２日間繰り返した。そして、細胞を導入した日を０日目とし、１～１２日目に蛍光顕微鏡観察と順送の流量測定を行った。培地交換は、流量測定の度に行った。
　図３１は、第２実施例に係る間葉系幹細胞を含む場合と含まない場合の血管の形成挙動を示す蛍光顕微鏡画像である。図３２は、第２実施例に係る間葉系幹細胞を含む場合と含まない場合の血管の流量変化を示すグラフである。
　図３１に示すように、間葉系幹細胞の有無にかかわらず、４日目に微小血管系の形成が確認された。この間、血管組織の形成に伴い、培養液１０１の流量の増大が確認された（図３２参照）。
　図３１に示すように、間葉系幹細胞を含まない系においては、６日目から８日目にかけて血管間のゲル部分が殆ど観察できないほどＨＵＶＥＣが増殖した。一方、間葉系幹細胞を含む系においては、８日目においても血管組織の管腔構造が確認され、図３２に示すように、６日目をピークに間葉系幹細胞の増殖に伴い、培養液の流量の低下が確認されたものの、血管を組織への培養液の一定の流量を保持できることが確認された。
　以上により、血管組織を形成する際に間葉系幹細胞をＨＵＶＥＣと混合して培養することで、１２日間にわたって血管組織を安定保持できることが確認された。
　図２７に示す培養容器２では、培養液１０１の流れの方向を制御する逆流防止機構と返送流路１１０を有しており、ハイドロゲルチャンバー１０に対し、第１培養液貯留槽２１から第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂに向けた方向に一方向に培養液が流れる構成となっている。逆流防止機構の効果、つまり血管組織形成における一方向流れの効果を検証するため、図３３に示す培養容器を作製した。
　図３３は、第２実施例の一変形例に係る細胞培養装置１を示す平面模式図である。
　図３３に示す培養容器２は、返送流路１１０を有していない。また、第２マイクロ流路３４の開口部は、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂの底面に設けられている。この構成とすることにより、空圧ポンプ５０と空圧ポンプ６０Ａ，６０Ｂを交互に加圧することにより、培養液１０１は、第１培養液貯留槽２１と第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂの間を、第１マイクロ流路２４、ハイドロゲルチャンバー１０、第２マイクロ流路３４を介して往復させることができる。
　血管組織の形成において、図２７に示す培養容器２と、図３３に示す培養容器２を用いて、一方向流れと往復流れの環境下での血管組織の形成挙動を比較検討した。上記の実験（図２７に示す培養容器２を用いて間葉系幹細胞を含む系で培養した条件）と同様に、ハイドロゲル１００にＨＵＶＥＣと間葉系細胞を導入し、加圧灌流を開始した。加圧灌流の条件は、一方向流れを生じさせる場合は、２．０［ｋＰａ］にて第１培養液貯留槽２１及び第３培養液貯留槽８１を３６０秒間加圧して順送し、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂを９０秒間加圧して返送するサイクルを１２日間繰り返した。また、往復流れを生じさせる場合は、２．０［ｋＰａ］にて第１培養液貯留槽２１及び第３培養液貯留槽８１を３６０秒間加圧し、その後、第２培養液貯留槽３１Ａ，３１Ｂを３６０秒間加圧するサイクルを１２日間繰り返した。
　図３４は、第２実施例とその一変形例に係る一方向流れと往復流れの環境下での血管組織の形成挙動を示す蛍光顕微鏡画像である。
　一方向流れ及び往復流れいずれの場合においても細胞導入後４日目頃より血管組織の形成が確認された。図３４は、細胞導入後６日目の血管組織の画像を示す。一方向流れ及び往復流れいずれの場合においても血管組織の形成が確認できるが、一方向流れの条件の方が、往復流れの条件と比較して流れの方向に血管組織が配向している様子が観察された。
　図３５は、第２実施例とその一変形例に係る一方向流れと往復流れの環境下での血管組織の流量変化を示すグラフである。
　図３５に示すように、一方向流れ及び往復流れいずれの場合も、細胞導入後、４日目から６日目にかけて血管組織の形成に伴う流量増大が認められ、１２日目まで血管組織を通した培養液１０１の流れが確認された。
　次に、細胞培養装置１で形成された血管組織のバリア能や血管の機能に関わるタンパク質の発現に対する、間葉系幹細胞の有無、及び、一方向流れと往復流れの影響を評価した。このため、図２７に示す培養容器と、図３３に示す培養容器を用いて、（ｉ）間葉系幹細胞なし・一方向流れ、（ｉｉ）間葉系幹細胞あり・一方向流れ、（ｉｉｉ）間葉系幹細胞あり・往復流れの３つの条件下で、血管組織を形成した。
　図３６は、第２実施例とその一変形例に係る細胞培養装置１で形成した血管組織のバリア能を評価するために、蛍光物質の血管壁の透過係数を求める際の画像解析図である。
　血管組織のバリア能を評価するため、蛍光物質の血管壁の透過係数を画像解析によって求めた。間葉系幹細胞を含まない系は培養４日目に、間葉系幹細胞と共培養したものは培養６日目に、蛍光物質の透過係数を以下の方法で求めた。
　２０［μＭ］のＣａｌｃｅｉｎ及び［２０μＭ］のＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎ（分子量７０，０００［Ｄａ］）を含む培養液を、第１培養液貯留槽２１に５００［μＬ］添加した。蛍光顕微鏡は、ＩＸ７１（オリンパス社製）を用い、２０秒ごとに３分間蛍光顕微鏡画像を撮像した。図３６に示す画像は、サンプルごとに２視野ずつ撮像し、１視野毎に２５か所の血管に囲まれた領域を解析領域としてとしてランダムに選んだものである。血管組織からのＣａｌｃｅｉｎ及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの透過係数は、以下の式（９）で算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　ここで、Ｐ［ｃｍ／ｓｅｃ］は、透過係数である。Ｊｓ［ｍｏｌ／ｓｅｃ］は、単位時間あたりに透過した物質の量である。Ａｗ［ｃｍ２］は、物質が透過する血管壁面の面積である。ＣＬ［ｍｏｌ／ｃｍ３］は、血管壁の内外の濃度差である。ΔＩｅｘ，ｍｅａｎ［－］は、血管で囲まれた領域の平均蛍光輝度の時間変化である。Ａｉ［ｃｍ２］は、血管で囲まれた領域の面積である。Δｔ［ｓｅｃ］は、時間変化量である。ｌｗ［ｃｍ］は、血管で囲まれた領域の周囲長である。Ｉｉ，ｍｅａｎ［－］は、血管で囲まれた領域近傍の血管側の平均蛍光強度である。Ｉｂ，ｍｅａｎ［－］は、血管で囲まれた領域の平均蛍光強度である。画像データの解析には、ＩｍａｇｅＪ（１．５３ｃ，　ＮＩＨ社製）を用いた。
　図３７は、第２実施例とその一変形例に係る（ｉ）間葉系幹細胞なし・一方向流れ、（ｉｉ）間葉系幹細胞あり・一方向流れ、（ｉｉｉ）間葉系幹細胞あり・往復流れの３つの条件で求めたＣａｌｃｅｉｎの透過係数を示す。図３８は、第２実施例とその一変形例に係る（ｉ）間葉系幹細胞なし・一方向流れ、（ｉｉ）間葉系幹細胞あり・一方向流れ、（ｉｉｉ）間葉系幹細胞あり・往復流れの３つの条件で求めたＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎの透過係数を示す。
　Ｃａｌｃｅｉｎ及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｄｅｘｔｒａｎのいずれにおいても間葉系幹細胞を含む系の方が、透過係数が小さい。さらに、往復流れに比べて一方向流れの方が、より透過係数が低い傾向が観察された。この結果より、培養液１０１の流れの方向を制御する逆流防止機構及び返送流路１１０を有している図２７の構成の培養容器２が、バリア能の高い血管組織を形成するのに有用であることが示唆された。
　また、血管の機能に関わるタンパク質の発現を確認するため、以下の方法にて免疫染色を行った。ＨＵＶＥＣのみの条件で形成した血管組織は４日目に、間葉系幹細胞と混合して形成した血管組織は６日目に、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。
　そして、リン酸緩衝液で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ水溶液で１５分間透過処理を行った。リン酸緩衝液で２回洗浄後、Ｂｒｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｈｉｓｔ（ナカライテスク社製）を用いて、室温で２時間ブロッキングを行った。Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄後、１次抗体は、以下のものを使用し、４℃で一晩反応させた。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒまたは４‘，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を添加した２次抗体を室温で２時間反応させた。観察前にＰＢＳＴで３回洗浄した。
　ＣＤ３１を２００倍希釈のウサギ・モノクローナル抗体（２８３６４または３２４５７：ａｂｃａｍ社製）で標識した。また、ＮＧ２を２００倍希釈のマウス・モノクローナル抗体（ＭＡＢ２５８５：Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で標識した。また、血管内皮カドヘリン（ＶＥ－カドヘリン）、ラミニン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ３３－９１００を１００倍希釈のウサギ・ポリクローナル抗体（それぞれＣＳＴ２１５８Ｓ、ａｂｃａｍ１１５７５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ３３－９１００）で標識した。
　蛍光標識二次抗体（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡ１１０１１、Ａ１１０３４またはａｂｃａｍ１５０１１３）は、２００倍～４００倍希釈で使用した。細胞核は、Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ－ＤＡＰＩ溶液（同仁化学研究所社製）で、１：１０００希釈で染色した。Ｆ－アクチン　フィラメントは、１：１０００希釈でＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ－ｉＦｌｕｏｒ　４８８（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製）で染色した。
　図３９は、第２実施例とその一変形例に係る細胞培養装置１で形成した血管内皮細胞を、マーカーであるＣＤ３１で染色した画像と、間葉系幹細胞のマーカーであるＮＧ２で染色した画像を示す図である。
　図３９に示すように、間葉系幹細胞と混合培養した系では、一方向流れ、往復流れのいずれの条件においても、血管内皮細胞によって形成された血管組織の周囲に間葉系幹細胞が存在することが確認された。
　図４０は、第２実施例とその一変形例に係る細胞培養装置１で形成した血管内皮細胞を、血管壁のタイトジャンクションを構成するＺＯ―１で染色した画像を示す図である。
　図４１に示すように、間葉系幹細胞あり・一方向流れの条件において、他の条件と比較してＺＯ－１が血管壁全体にわたって発現している。これは、図３６にて観測された血管のバリア能の高さ、つまり、低い透過係数がタイトジャンクション分子の発現によって実現していることを示唆している。
　以上のような第２実施例とその一変形例によれば、培養液１０１の流れの方向を制御する逆流防止機構と返送流路１１０を有している図２７の構成の培養容器２が、バリア能の高い血管組織を形成するのに有用であることが示された。
　以上、本発明の好ましい実施形態及び実施例を記載し説明してきたが、これらは本発明の例示的なものであり、限定するものとして考慮されるべきではないことを理解すべきである。追加、省略、置換、およびその他の変更は、本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。従って、本発明は、前述の説明によって限定されていると見なされるべきではなく、特許請求の範囲によって制限されている。
１…細胞培養装置
２…培養容器
３…蓋部
５…空圧装置
１０…ハイドロゲルチャンバー
１１…内部空間
１２…第１面
１３…第２面
１４…導入孔
１４ａ…導入路
１５…導入孔
１５ａ…導入路
１６…ハイドロゲル貯留槽
１６Ａ…ハイドロゲル貯留槽
１６Ｂ…ハイドロゲル貯留槽
２０…第１培養液貯留部
２１…第１培養液貯留槽
２２…支柱列
２３…第１凹部
２４…第１マイクロ流路
２４Ａ…マイクロ流路
２４Ｂ…マイクロ流路
２５…抵抗流路
３０…第２培養液貯留部
３１…第２培養液貯留槽
３２…支柱列
３３…第２凹部
３４…第２マイクロ流路
３４Ａ…マイクロ流路
３４Ｂ…マイクロ流路
３５…抵抗流路
３６…逆止弁
４０…支柱
４１…斜面
４２…平面
４３…曲面
５０…空圧ポンプ
５１…空圧配管
６０…空圧ポンプ
６０Ａ…空圧ポンプ
６０Ｂ…空圧ポンプ
６１…空圧配管
８０…第３培養液貯留部
８１…第３培養液貯留槽
８２…開口部
８２ａ…膜
８３…第３凹部
９０…空圧ポンプ
９１…空圧配管
１００…ハイドロゲル
１０１…培養液
１１０…返送流路
１１１…受動バルブ

Claims (15)

  1. 　細胞を培養するハイドロゲルを保持するハイドロゲルチャンバーと、
    　前記ハイドロゲルチャンバーの第１面と連通する第１培養液貯留部と、
    　前記ハイドロゲルチャンバーの前記第１面と異なる第２面と連通する第２培養液貯留部と、を備える培養容器と、
    　前記培養容器に接続された空圧装置と、を備え、
    　前記空圧装置は、前記第１培養液貯留部と前記第２培養液貯留部との間に空圧に基づく圧力差を生じさせて、前記第１培養液貯留部及び前記第２培養液貯留部の少なくとも一方に貯留された培養液を、前記ハイドロゲルチャンバーのハイドロゲルに加圧浸透させる、
    　細胞培養装置。
  2. 　前記第１培養液貯留部及び前記第２培養液貯留部の少なくとも一方は、
    　培養液を貯留する培養液貯留槽と、
    　前記培養液貯留槽と前記ハイドロゲルチャンバーとを連通させるマイクロ流路と、を備える、
    　請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 　前記マイクロ流路には、前記マイクロ流路よりも断面積が小さい抵抗流路が、１つまたは並列に複数設けられている、
    　請求項２に記載の細胞培養装置。
  4. 　前記抵抗流路の流路抵抗（ＲＭＣ）は、培養液の粘度（μ）、前記ハイドロゲルチャンバーの前記第１面から前記第２面までの長さ（Ｌ）、前記ハイドロゲルチャンバーの高さ（ｄ）、前記第１面または前記第２面の幅を前記ハイドロゲルチャンバーの高さで割った値を（Ｎ）としたとき、
    　ＲＭＣ　≧　８μＬ／πｄ４Ｎ
    　の関係を満たす、
    　請求項３に記載の細胞培養装置。
  5. 　前記マイクロ流路が、一対で設けられている、
    　請求項２～４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  6. 　前記第１培養液貯留部は、前記培養液貯留槽として第１培養液貯留槽と、前記マイクロ流路として第１マイクロ流路と、を備え、
    　前記第２培養液貯留部は、前記培養液貯留槽として第２培養液貯留槽と、前記マイクロ流路として第２マイクロ流路と、を備え、
    　前記第１培養液貯留槽と前記第２培養液貯留槽とを連通させる培養液の返送流路と、
    　前記第１マイクロ流路及び前記第２マイクロ流路の少なくとも一方と、前記返送流路に、培養液の逆流を防止する機構を備える、
    　請求項２に記載の細胞培養装置。
  7. 　前記逆流を防止する機構として、気泡の侵入を防ぐ受動バルブを備える、
    　請求項６に記載の細胞培養装置。
  8. 　前記受動バルブの耐圧性が、０．１［ｋＰａ］～１０［ｋＰａ］の範囲内である、
    　請求項７に記載の細胞培養装置。
  9. 　前記ハイドロゲルチャンバーの直上部には、開口部が形成されている、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  10. 　前記ハイドロゲルチャンバーの直上部には、前記開口部を介して連通する第３培養液貯留部が設けられており、
    　前記開口部には、一方の面がハイドロゲルに面し、他方の面が培養液に面する透過性の膜が設けられている、
    　請求項９に記載の細胞培養装置。
  11. 　前記空圧装置は、前記第３培養液貯留部と接続されている、
    　請求項１０に記載の細胞培養装置。
  12. 　前記空圧装置は、前記培養容器に接続される空圧配管を備え、
    　前記空圧配管には、フィルターが設けられている、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  13. 　前記ハイドロゲルチャンバーに、前記空圧に基づく圧力差を生じさせた状態でハイドロゲルを保持させる機構を備える、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  14. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養装置を用いて、前記ハイドロゲルチャンバー内で細胞を培養する、
    　細胞培養方法。
  15. 　前記細胞を培養し、前記ハイドロゲルチャンバー内で血管組織を形成する、
    　請求項１４に記載の細胞培養方法。
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