WO2023287186A1 - 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체 및 그 용도 - Google Patents

전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체 및 그 용도 Download PDF

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artificial antibody
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김종호
이신
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한양대학교 에리카산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a transition metal dichalcogenide-based artificial antibody and its use, and more particularly, to an antibody or peptide detection-based bio-based antibody used for the recognition and treatment of existing pathogens or biomarkers based on TMD, a non-bio material. It relates to a transition metal dichalcogenide-based artificial antibody that can effectively solve the limitations of and its use.
  • Selective molecular recognition is an essential element in examination and treatment.
  • One of the key components in this specific molecular recognition is an antibody composed of a flexible fragment antigen-binding (Fab) region and a rigid crystallizable fragment (Fc).
  • Fab flexible fragment antigen-binding
  • Fc rigid crystallizable fragment
  • Fab domain antibodies There are many types of flexible Fab domain antibodies, and they can have multiple interactions with biological interfaces, allowing them to selectively recognize various target molecules with high avidity.
  • these protein antibodies have inherent limitations such as low structural stability, short shelf life, long discovery time, and high production cost.
  • strategies have been attempted to provide more stable non-protein-based molecular recognition components to date. For example, aptamers, molecular imprinting, affinity polymer nanoparticles, peptides, and nanointerfaces are such attempts.
  • BBI Bloodstream infections
  • Blood culture is currently the standard method for the detection and identification of pathogenic bacteria.
  • the blood culture method is time-consuming and less sensitive, and has problems in that rapid identification of pathogenic bacteria and accurate treatment with antibiotics are delayed. Therefore, it is necessary to develop new non-bio-based artificial antibodies that can quickly and effectively detect pathogenic bacteria in the bloodstream.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel non-bio-based artificial antibody capable of rapidly and effectively detecting pathogenic bacteria.
  • the present invention is a transition metal dichalcogenide-based artificial antibody, a transition metal dichalcogenide (TMD) nanosheet; And it provides a transition metal dichalcogenide-based artificial antibody comprising a polymeric phase formed on the nanosheet.
  • TMD transition metal dichalcogenide
  • the polymer phase specifically binds to pathogenic bacteria.
  • the transition metal dichalcogenide (TMD) nanosheet is at least one nanosheet selected from the group consisting of MoS 2 , MoSe 2 , WS 2 and WSe 2 .
  • the polymer phase contains at least one of the compounds of formulas (1) to (3) below.
  • the compound of formula (1) specifically binds to S. aureus
  • the compound of formula (2) specifically binds to E. coli O157:H7.
  • the present invention also provides a substance for detecting pathogenic bacteria including the above-described transition metal dichalcogenide-based artificial antibody.
  • the present invention also provides a pathogenic bacteria inactivating material comprising the transition metal dichalcogenide-based artificial antibody described above.
  • the present invention comprises the steps of culturing the above-described pathogenic bacteria detection substance and bacteria; It provides a method for diagnosing pathogens comprising measuring a Raman signal and intensity from the bacterial detection material, wherein the Raman signal is generated from the TMD nanosheet, and the Raman signal is generated and detected from the bacteria at the single cell level. .
  • the present invention provides a method for inactivating pathogenic bacteria, characterized by inactivating the bacteria by irradiating the above-described pathogenic bacteria inactivating material with NIR light.
  • the present invention is based on TMD, which is a non-bio material, and can effectively replace the limitations of antibody or peptide detection-based materials used for the recognition and treatment of existing pathogens or biomarkers.
  • TMD is a non-bio material
  • a non-biological material structure based on an organic-inorganic nanohybrid having target recognition function, signal generation function, and killing function at the same time without a post-processing process is used, and selectivity to pathogens can be adjusted according to the type and characteristics of the polymer.
  • selectivity to pathogens can be adjusted according to the type and characteristics of the polymer.
  • 1 is a structural formula of a polymeric phase compound for recognizing a specific pathogen according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram explaining the structures of TMD nanosheets (Bulk TMD) bound to dextran (Dex), carboxymethylated dextran (CM-dex), and amino acid-dextran (AA-dex).
  • FIG. 3 is a TEM image of (A) dex-WS 2 , (B) CM-dex-WS 2 , and (C) mLys-dex-WS 2
  • FIG. 4 is (D) dex-WS 2
  • 5 is the FT-IR spectrum of bulk WS 2 , dex-WS 2 , CM-dex-WS 2 and mLys-dex-WS 2
  • FIG. 6 shows bulk WS 2 , dex-WS 2 , CM-dex-WS 2 and C 1s XPS spectra of mLys-dex-WS 2
  • FIG. 7 is Raman scattering and fluorescence spectra of bulk WS 2 , dex-WS 2 , CM-dex-WS 2 and mLys-dex-WS 2 .
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating recognition selectivity for bacteria of the TMD-based nanohybrid artificial airborne body according to the present invention.
  • 10 is a representative Raman mapping image of four different bacteria based on the Raman intensity at 352 cm ⁇ 1 of bound artificial antibodies on a glass array.
  • FIG. 12 is a diagram explaining a method of detecting pathogenic bacteria in vitro and in vivo and treating diseases such as infection by inactivating the pathogenic bacteria.
  • FIG. 13 is a diagram showing the Raman intensity of S. aureus-selective dex-WS 2 as a function of S. aureus in human serum.
  • FIG. 14 shows the Raman intensity of E. coli O157:H7-selective CM-dex-WS 2 as a function of E. coli O157:H7 in human serum.
  • Figure 16 is an agar gel image showing the selective bactericidal effect of dex-MoSe 2 and CM-dex-MoSe 2 on four different pathogenic bacteria while NIR irradiation (808 nm, 5 W cm -2 ) for 20 minutes (Agar gel image), and FIG. 17 is a result of quantitatively measuring the result.
  • 19 is a histological section of mouse skin biopsies using H&E staining from 10 mice per group. 19 shows (1) bacteria, (2) polymorphic infiltrates, (3) disrupted epidermal layer, (4) inflammatory exudates, (5) fibroblasts, and (6) regenerated epithelial cells.
  • the present invention provides a transition metal dichalcogenide (TMD) as a recognition component capable of rapidly and sensitively detecting and inactivating pathogens or biomarkers with high affinity.
  • TMD transition metal dichalcogenide
  • Transition-metal dichalcogenide (TMD) nanosheets are one of the nanomaterials with excellent physicochemical and optical properties.
  • the stable nanointerfaces of TMD nanosheets with a large surface area are non-covalently functionalized to provide strong Raman signals for signal transmission in detection and treatment. New functions can be induced while maintaining scattering properties.
  • TMD nanosheets prepared by being exfoliated with additives have high colloidal stability and biocompatibility, and can serve as a robust scaffold motif for artificial antibodies for the selective detection and inactivation of pathogenic bacteria.
  • an artificial antibody according to an embodiment of the present invention is a multivalent polymeric recognition phase for sensitive detection, rapid identification, and effective inactivation of pathogenic bacteria, and a solid TMD in which the multivalent polymeric recognition phase material is combined. It is composed of nanosheets.
  • a polymeric phase capable of selectively binding to a specific material is formed in the TMD nanosheet (WS 2 or MoSe 2 ) through the process of simultaneous exfoliation and functionalization in water. formed on the sheet.
  • One of the advantages of the artificial antibody according to the present invention is that the specific recognition selectivity of the TMD artificial antibody for each strain of pathogenic bacteria is controlled by changing the macromolecular phase of the TMD surface. That is, WS 2 nanosheets with a clear dextran phase (denoted as dex-WS 2 ) selectively recognize S. aureus and contain a carboxymethylated dextran (CM-dex) phase (CM-dex-WS 2 ). WS 2 nanosheets capable of binding selectively to E. coli O157:H7.
  • FIG. 1 and 2 are structural formulas of polymeric phase compounds for recognizing specific pathogens according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is TMD nanosheets (Bulk TMD) with dextran (Dex) and carboxymethylated dex It is a figure explaining the structure bound to trans (CM-dex) and amino acid-dextran (AA-dex).
  • the polymer phase having a flexible recognition function that binds to a specific substance may include at least one of the compounds of Formulas (1) to (2) below.
  • the compound of formula (1) can specifically bind to S. aureus
  • the compound of formula (2) can specifically bind to E. coli O157:H7.
  • Functional dextran polymers are synthesized by carboxymethylation of dextran, followed by coupling amino acids such as lysine (Lys), methyl ester lysine (mLys), phenylalanine (Phe) or isoleucine (Ile) to the carboxyl group of CM-dex. , as shown in Figure 1.
  • amino acids such as lysine (Lys), methyl ester lysine (mLys), phenylalanine (Phe) or isoleucine (Ile)
  • the TMD-based artificial body having a polymer recognition phase was prepared by sonicating the functionalized dextran polymer (F-dex) and bulk WS 2 in water, as shown in FIG. 2 .
  • MoSe 2 nanosheets were also prepared in a similar way to WS 2 .
  • F-dex-TMD F-dex-TMD
  • 50 ⁇ L of bacterial solution (1X10 9 CFU mL ⁇ 1 ) was added to 500 ⁇ L of 0.1 mM F-dex-TMD (10 mM PBS, pH 7.4).
  • the resulting mixture was shaken at 25 degrees Celsius for 1 hour, and then the solution was centrifuged at 1,977xg for 5 minutes to obtain bacteria and remove unbound artificial bodies.
  • the bacteria were then washed several times with 950 ⁇ L PBS to completely remove unbound artificial bodies. Finally, after adding 50 ⁇ L of PBS to the bacteria, 2 ⁇ L of the bacteria solution was dropped on each point of the glass array having a diameter of 5 ⁇ m, and the Raman intensity of the bound F-dex-TMD was increased to 352 ( WS 2 ) and 240 (MoSe 2 ) cm -1 was measured. In this embodiment, the Raman intensity of 121 regions in each array was measured by irradiating a 532 nm laser with an output of 9 W.
  • each bacterial strain (10 9 CFU mL ⁇ 1 ) was mixed with 500 ⁇ L of 0.1 mM F-dex-TMD solution (10 mM PBS, pH 7.4). The mixture was shaken at 25 degrees Celsius for 1 hour, then the bacteria were washed twice with PBS to remove unbound F-dex-TMD. 10 ⁇ L of the target bacterial solution was transferred to a 96-well plate and irradiated with an 808 nm laser (5 W cm ⁇ 2 ) for 20 minutes.
  • Bacteria were diluted to 1X10 4 CFU mL -1 , 30 ⁇ L of the bacterial solution was applied to an agar plate, and the agar plate was incubated at 37 degrees Celsius for 12 hours, and then bacterial colonies were counted.
  • the dorsal skin excision wound of the mouse was infected with 5 ⁇ L of E. coli O157:H7 solution (1 ⁇ 10 5 CFU mL -1 , PBS) for 10 minutes, and then 5 ⁇ L of PBS or CM-dex-MoSe 2 (2 mg mL -1 - 1 ) for 15 minutes.
  • a laser (808 nm, 2 W cm ⁇ 1 ) was irradiated to the wound for 2 minutes, and after turning off the power for 1 minute, secondary light was irradiated for 1 minute. After adding 5 ⁇ L PBS to the wound and leaving it for 4 minutes, the laser was irradiated to the wound again for 2 minutes, the power was turned off for 1 minute, and the secondary light was irradiated for 1 minute.
  • the wounds were then dressed with Tegaderm to protect them from contamination and monitored for 3, 7, and 14 days.
  • the infected skin tissue was collected, fixed in 4% fixative, and then stained with hematoxylin and eosin (H&E). Tissues were examined using a digital microscope on each skin section by pathologists without prior knowledge of the treatment groups and scored independently.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • FIG. 3 is a TEM image of (A) dex-WS 2 , (B) CM-dex-WS 2 , and (C) mLys-dex-WS 2
  • FIG. 4 is (D) dex-WS 2
  • 5 is the FT-IR spectrum of bulk WS 2 , dex-WS 2 , CM-dex-WS 2 and mLys-dex-WS 2
  • FIG. 6 shows bulk WS 2 , dex-WS 2 , CM-dex-WS 2 and C 1s XPS spectra of mLys-dex-WS 2
  • FIG. 7 is Raman scattering and fluorescence spectra of bulk WS 2 , dex-WS 2 , CM-dex-WS 2 and mLys-dex-WS 2 .
  • all WS 2 nanosheet interfaces including the dex, CM-dex, and mLys-dex phases have an average lateral size of 43 nm and a height of 4.5 nm. That is, the increased thickness of the WS 2 nanosheets means that a polymer phase is formed on the surface, and transmission electron microscope (TEM) and atomic force microscope (AFM) data show that the WS 2 -based nanohybrid structure according to the present invention has almost the same physical structure. indicates to indicate.
  • TEM transmission electron microscope
  • AFM atomic force microscope
  • the above results clearly show that the WS 2 nanohybrid having different polymer phases at the interface was well prepared according to the method described above.
  • the strong Raman band of the WS 2 nanohybrid indicates that it can be used as a detection signal for sensitive detection of pathogenic bacteria. That is, the WS 2 nanohybrid exhibits photoluminescence (PL) at 614 nm, further indicating the exfoliation of the WS 2 monolayer (see the right side of FIG. 7 ).
  • PL photoluminescence
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating recognition selectivity for bacteria of the TMD-based nanohybrid artificial airborne body according to the present invention.
  • the selective recognition ability of the artificial construct according to the present invention against pathogenic bacteria such as E. coli O157:H7, S. typhimurium, S. aureus and B. cereus was analyzed.
  • pathogenic bacteria such as E. coli O157:H7, S. typhimurium, S. aureus and B. cereus was analyzed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the strong Raman signal of dex-WS 2 was observed only in Gram-positive S. aureus, whereas the strong Raman signal of CM-dex-WS 2 was only found in the Gram-negative bacterium E. coli O157:H7.
  • FIG. 10 is a representative Raman mapping image of four different bacteria based on the Raman intensity at 352 cm ⁇ 1 of a ⁇ 1 bound artificial antibody on a glass array.
  • Raman signals of dex-WS 2 and CM-dex-WS 2 for other Gram-positive B. cereus and Gram-negative S. typhimurium were not observed in Raman mapping images.
  • FIGS. 9 and 10 show the bacteria-specific selectivity of the nanohybrid material according to the present invention.
  • FIG. 11 shows (D) total Raman intensity of TMD artificial antibodies bound to four different bacteria of S. aureus, B. cereus, E. coli O157:H7 and S. typhimurium at 352 cm ⁇ 1 , (E) on polymers. Normalized Raman intensities of the artificial antibody CM-dex-WS 2 bound to four different bacteria at 352 cm ⁇ 1 as a function of carboxyl group content, (F) 352 (WS 2 ) and 240 (MoSe 2 ) cm ⁇ 1 , respectively.
  • mLys-dex-WS 2 having an amino group hardly binds to pathogenic bacteria
  • Lys-dex-WS 2 having both an amino group and a carboxyl group is resistant to E-coli O157:H7. Binding increased slightly.
  • WS 2 nanohybrids Phe-dex-WS 2 and Ile-dex-WS 2
  • the recognition selectivity of CM-dex-WS 2 for E. coli O157:H7 became more pronounced as the content of carboxyl groups on the polymer increased (see FIG. 11E).
  • the recognition selectivity of artificial antibodies dex-WS 2 and CM-dex-WS 2 for target bacteria is not affected by the rigid TMD scaffold support, that is, as WS 2 nanosheets are replaced by MoSe 2 in artificial antibodies, S It can be seen that the recognition selectivity of dex-MoSe 2 and CM-dex-MoSe 2 for E. aureus and E. coli O157:H7 remained constant (see FIG. 11F).
  • FIG. 12 is a diagram explaining a method of detecting pathogenic bacteria in vitro and in vivo and treating diseases such as infection by inactivating the pathogenic bacteria.
  • the TMD-based artificial antibody according to the present invention can rapidly and sensitively detect and inactivate pathogenic bacteria in human serum.
  • FIG. 13 is a diagram showing the Raman intensity of S. aureus-selective dex-WS 2 as a function of S. aureus in human serum.
  • the Raman intensity of S. aureus-selective dex-WS 2 at 352 cm ⁇ 1 gradually increases as the concentration of S. aureus in human serum increases. This indicates that the artificial antibody according to the present invention can selectively detect pathogenic bacteria without additional post-processing such as amplification or labeling.
  • FIG. 14 shows the Raman intensity of E. coli O157:H7-selective CM-dex-WS 2 as a function of E. coli O157:H7 in human serum.
  • E. coli O157:H7-selective CM-dex-WS 2 can easily and rapidly detect E. coli O157:H7 in human serum.
  • CM-dex-WS 2 is optical and Raman mapping of a single copy of S. aureus targeted by dex-WS 2 and a single copy of E. coli O157:H7 targeted by CM-dex-WS 2 according to an embodiment of the present invention. It is an image. Here, a Raman mapping image was generated based on the Raman intensity at 352 cm -1 .
  • the TMD-based artificial antibody according to the present invention can detect S. aureus and E. coli O157:H7 at a low concentration of a single copy level without a separate concentration or purification process.
  • TMD-based artificial antibodies enable rapid and sensitive detection of pathogenic bacteria in human serum, and the performance of the artificial antibodies of the present invention with only non-biological components was similar to that of previous antibody mimics containing peptides. In terms of detection sensitivity, it was greater than other nanomaterials functionalized with antibodies or aptamers.
  • Figure 16 is an agar gel image showing the selective bactericidal effect of dex-MoSe 2 and CM-dex-MoSe 2 on four different pathogenic bacteria while NIR irradiation (808 nm, 5 W cm -2 ) for 20 minutes (Agar gel image), and FIG. 17 is a result of quantitatively measuring the result.
  • the wounds of the infected mice showed severe bacterial abscesses and edema over time when treated with only CM-dex-MoSe 2 without treatment or near-infrared irradiation.
  • CM-dex- Treatment of infected mice with MoSe 2 effectively cured abscesses and edema at the wound site, which means that E. coli O157:H7 in the wounds of mice was effectively killed by CM-dex-MoSe 2 under NIR irradiation.
  • 19 is a histological section of mouse skin biopsies using H&E staining from 10 mice per group. 19 shows (1) bacteria, (2) polymorphic infiltrates, (3) disrupted epidermal layer, (4) inflammatory exudates, (5) fibroblasts, and (6) regenerated epithelial cells.
  • histological analysis of scar tissue using hematoxylin and eosin (H&E) staining showed that fibroblasts and dense epithelial cells were regenerated in tissues treated with CM-dex-MoSe 2 under near-infrared irradiation conditions.
  • H&E hematoxylin and eosin

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Abstract

전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체로서, 전이금속 디칼코게나이드(TMD) 나노시트; 및 상기 나노시트에 형성된 고분자상(polymeric phase를 포함하는 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체가 제공된다.

Description

전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체 및 그 용도
본 발명은 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비바이오 물질인 TMD 기반으로, 기존 병원균 또는 바이오마커의 인식 및 치료에 사용되고 있는 항체 또는 펩타이드 검출기반 바이오 기반 항체의 한계를 효과적으로 해결할 수 있는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체 및 그 용도에 관한 것이다.
기존 단백질 항체기술은 생산 단가가 높고, 초저온 보관을 해야 하는 문제점이 있다. 타겟을 인식하였을 때, 신호를 발생할 수 있는 물질을 부착하기 위해 후처리 공정이 필요하다. 즉, 검출과 치료에 광범위하게 사용되는 일차 인식체인 항체는 낮은 감도, 긴 생산시간, 낮은 안정성, 및 비용 문제 등의 한계가 있다.
선택적 분자 인식(Selective molecular recognition)은 검사 및 치료 등에 있어서 필수적 요소이다. 이러한 특이적 분자 인식에 있어서 핵심 구성 중 하나는 유연한 단편 항원 결합(Fab) 영역과 단단한 결정화 가능한 단편(Fc)으로 구성된 항체이다. 유연한 Fab 영역 항체의 종류는 매우 다양하며 생체 계면과 다중 상호작용을 할 수 있어 결합력이 높은 다양한 표적 분자를 선택적으로 인식할 수 있다. 하지만, 이러한 단백질 항체는 구조적 안정성이 낮고 보관 수명이 짧고 발견 시간이 길며 생산 비용이 높다는 본질적 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 현재까지 보다 안정적인 비단백질 기반 분자 인식 성분을 제공하기 위한 전략이 시도되고 있다. 예를 들어, 압타머, 분자 임프린팅, 어피니티 폴리머(affinity polymer) 나노 입자, 펩타이드 및 나노 인터페이스 등이 이러한 시도들이다.
하지만, 이러한 대안의 달성에도 불구하고 광학 신호 특성과 함께 높은 친화도를 갖는 단단한 스캐폴드에 다가 결합 모티프를 갖는 항체를 모사하는 효과적인 방법이 여전히 필요하며, 특정 병원성 박테리아를 검출 또는 비활성시키기 위해서는 이를 선택적으로 인식할 수 있는 비생물학적 식별 구조를 개발할 필요가 있다.
한편 병원성 박테리아는 인간 감염의 주요 원인이며 사망률이 높은 치명적인 질병을 유발하며, 혈류 감염(BSI)은 혈류의 병원성 박테리아에 의해 유발되어 심각한 염증 반응을 유발한다.
따라서 인간의 혈류에서 병원성 세균의 검출 및 동정을 통한 BSI의 진단 및 치료가 필요하다. 현재 혈액 배양은 병원성 세균의 검출 및 동정을 위한 표준 방법이다. 하지만, 혈액 배양 방법은 시간이 많이 걸리고 덜 민감하며, 병원성 세균의 신속한 동정과 항생제의 정확한 치료가 지연되는 문제가 있다. 따라서 혈류에서 병원성 세균을 신속하고 효과적으로 검출할 수 있는 새로운 비바이오기반 인공항체 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 병원성 세균을 신속하고 효과적으로 검출할 수 있는 새로운 비바이오기반 인공항체를 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체로서, 전이금속 디칼코게나이드(TMD) 나노시트; 및 상기 나노시트에 형성된 고분자상(polymeric phase)를 포함하는 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 고분자상은 병원성 박테리아에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 전이금속 디칼코게나이드(TMD) 나노시트는 MoS2, MoSe2, WS2 및 WSe2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 나노시트이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 고분자상은 하기 식(1) 내지 (3)의 화합물 중 적어도 어느 하나 포한다.
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000001
(1),
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000002
(2),
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000003
(3)
(상기 식에서 X, Y, Z는 각각 1 내지 50의 정수이고, R은
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000004
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000005
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000006
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000007
중 적어도 어느 하나임)
본 발명의 일 실시예에서, 상기 식 (1)의 화합물은 S. aureus와 특이적으로 결합하고, 상기 식 (2)의 화합물은 E. coli O157:H7와 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 상술한 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공항체를 포함하는 병원균 박테리아 검출물질을 제공한다.
본 발명은 또한 상술한 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공항체를 포함하는 병원균 박테리아 비활성화 물질을 제공한다.
본 발명은 상술한 병원균 박테리아 검출물질과 박테리아를 배양하는 단계; 상기 박테리아 검출물질로부터 라만 신호 및 강도를 측정하는 단계를 포함하는 병원균 진단방법을 제공하며, 상기 라만신호는 상기 TMD 나노시트로부터 발생하고, 상기 라만신호는 상기 단일세포 수준의 박테리아로부터 발생하여 검출된다.
본 발명은 상술한 병원균 박테리아 비활성화 물질에 NIR 광을 조사하여 상기 박테리아를 비활성화하는 것을 특징으로 하는 병원균 박테리아 비활성화 방법을 제공한다.
본 발명은 비바이오 물질인 TMD 기반으로, 기존 병원균 또는 바이오마커의 인식 및 치료에 사용되고 있는 항체 또는 펩타이드 검출기반 물질의 한계를 효과적으로 대체할 수 있다. 또한, 후처리 공정 없이 타겟 인식 기능과 신호 발생 기능, 사멸 기능을 동시에 갖는 유기-무기 나노하이브리드 기반의 비바이오 물질 구조체를 이용하며, 고분자의 종류 및 특성에 따라 병원균에 대한 선택성을 조절할 수 있다. 더 나아가, 식품, 혈액 및 소변 내에 존재하는 병원균을 2시간 이내에 신속하게 정성 및 정량 검출이 가능하며, 특정 병원균에 결합한 물질에 빛을 조사할 경우 물질의 광열효과에 의해 병원균을 사멸시킬 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 특정 병원균 인식을 위한 고분자 인식상(polymeric phase) 화합물의 구조식이다.
도 2는 TMD 나노시트(Bulk TMD)에 덱스트란(Dex), 카르복시메틸화 덱스트란(CM-dex), 그리고 아미노산-덱스트란(AA-dex)에 결합된 구조를 설명하는 도면이다.
도 3은 (A) dex-WS2, (B) CM-dex-WS2, 및 (C) mLys-dex-WS2의 TEM 이미지이고, 도 4는 (D) dex-WS2, (E) CM-dex-WS2, 및 (F) mLys-dex-WS2의 AFM 이미지이다. 또한 도 5는 bulk WS2, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 FT-IR 스펙트럼이고, 도 6은 bulk WS2, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 C 1s XPS 스펙트럼이고, 도 7은 bulk WS2, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 라만 산란 및 형광 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명에 따른 TMD 기반 나노하이브리드 인공항체의 박테리아에 대한 인식 선택성을 설명하는 모식도이다.
도 9는 4개의 상이한 세포주와 결합된 dex-WS2 및 CM-dex-WS2의 라만 스펙트럼 결과이다.
도 10은 유리 어레이에서 결합된 인공 항체의 352 cm-1에서 라만 강도를 기반으로 하는 4개의 다른 박테리아의 대표적인 라만 매핑 이미지이다.
도 11은 (D) 352 cm-1에서 S. aureus, B. cereus, E. coli O157:H7 및 S. typhimurium의 4가지 다른 박테리아에 결합된 TMD 인공 항체의 총 라만 강도, (E) 고분자 상의 카르복실기 함수로서 352 cm-1에서 4개의 다른 박테리아에 결합한 인공 항체 CM-dex-WS2의 정규화된 라만 강도, (F) 352(WS2) 및 240(MoSe2)cm-1에서 4개의 다른 박테리아에 결합한 dex-WS2, dex-MoSe2, CM-dex-WS2 및 CM-dex-MoSe2의 352(WS2) 및 240(MoSe2)cm-1에서의 정규화된 라만 강도이다.
도 12는 시험관 내 및 생체 내에서 병원성 박테리아의 검출과, 병원성 박테리아를 비활성화시켜 감염 등의 질환을 치료하는 방식을 설명하는 도면이다.
도 13은 인간 혈청에서 S. aureus의 함수로서의 S. aureus-선택성 dex-WS2의 라만 강도를 나타내는 도면이다.
도 14는 인간 혈청에서 E. coli O157:H7의 함수로서 E. coli O157:H7-선택성 CM-dex-WS2의 라만 강도를 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 dex-WS2가 표적으로 하는 S. aureus의 single copy과 CM-dex-WS2가 표적으로 하는 E. coli O157:H7의 single copy의 광학 및 라만 매핑 이미지이다.
도 16은 20분간 NIR 조사(808 nm, 5 W cm-2 )를 진행하면서, 4가지 다른 병원성 박테리아에 대한 dex-MoSe2 및 CM-dex-MoSe2의 선택적 살균 효과를 나타내는 한천 겔 이미지(Agar gel image)이고, 도 17은 그 결과를 정량적으로 측정한 결과이다.
도 18은 대표적인 병원균인 E. coli O157:H7로 감염된 후 쥐의 피부 상처 사진으로, 처리되지 않은 경우, CM-dex-MoSe2로 처리된 경우 및 CM-dex-MoSe2 + NIR 조사(2 W cm-2, 2 min-on, 1 min-off 펄스 방식)로 처리된 경우에 대한 대표사진이다.
도 19는 그룹 당 10마리의 마우스에서 H&E 염색을 사용한 마우스 피부 생검의 조직학적 절개사진이다. 도 19에서 (1) 박테리아, (2) 다형 침윤물, (3) 파괴된 표피층, (4) 염증성 삼출물, (5) 섬유아세포, (6) 재생된 상피 세포를 나타낸다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위하여, 병원균 또는 바이오마커에 높은 친화성으로 빠르고 민감하게 검출하고 불활성화할 수 있는 인식 성분으로 전이금속 디칼코게나이드(TMD)를 제공한다.
TMD(Transition-metal dichalcogenide) 나노시트는 뛰어난 물리화학적 및 광학적 특성을 가진 나노재료 중 하나로, 넓은 표면적을 갖는 TMD 나노시트의 안정적인 나노계면은 비공유적으로 기능화되어 검출 및 치료에서 신호 전달을 위한 강력한 라만 산란 특성을 유지하면서 새로운 기능을 유도할 수 있다. 또한 첨가제에 의하여 박리되는 방식으로 제조되는 TMD 나노시트는 높은 콜로이드 안정성과 바이오 적합성을 가지며, 병원성 박테리아의 선택적 검출 및 비활성화를 위한 인공항체의 견고한 스캐폴드 모티프가 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 인공항체는, 병원성 박테리아의 민감한 검출, 신속한 식별 및 효과적인 비활성화를 위한 다가 고분자 인식상(multivalent polymeric recognition phase)과, 이러한 다가 고분자 인식상 물질이 결합된 단단한 TMD 나노시트로 구성된다.
본 발명의 일 실시예에서는, 물에서 박리와 기능화를 동시에 진행하는 과정을 통하여 TMD 나노시트(WS2 또는 MoSe2)에서 특정 물질과 선택적으로 결합할 수 있는 고분자 물질상(polymeric phase)이 TMD 나노시트에 형성된다.
본 발명에 따른 인공항체의 장점 중 하나는 병원성 박테리아의 각 균주에 대한 TMD 인공 항체의 특이적 인식 선택성이 TMD 표면의 고분자 상을 변화시켜 조절된다는 점이다. 즉, 깨끗한 덱스트란 상(dex-WS2로 표시)이 있는 WS2 나노시트는 S. aureus를 선택적으로 인식하고, 카르복시메틸화 덱스트란(CM-dex)상(CM-dex-WS2)을 포함하는 WS2 나노시트는 E. coli O157:H7에 선택적으로 결합할 수 있다.
도 1 내지 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 특정 병원균 인식을 위한 고분자 인식상(polymeric phase) 화합물의 구조식이며, 도 2는 TMD 나노시트(Bulk TMD)에 덱스트란(Dex), 카르복시메틸화 덱스트란(CM-dex), 그리고 아미노산-덱스트란(AA-dex)에 결합된 구조를 설명하는 도면이다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서 특정 물질과 결합하는 유연한 인식 기능의 고분자상은 하기 식(1) 내지 (2)의 화합물 중 적어도 어느 하나 포함할 수 있으며.
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000008
(1),
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000009
(2),
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000010
(3)
(상기 식에서 X, Y, Z는 각각 1 내지 20의 정수이고, R은
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000011
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000012
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000013
Figure PCTKR2022010178-appb-img-000014
중 적어도 어느 하나임)
이 중 식 (1)의 화합물은 S. aureus와 특이적으로 결합하고, 상기 식 (2)의 화합물은 E. coli O157:H7와 특이적으로 결합할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명은 보다 상세히 설명한다. 하지만, 하기 설명되는 사항은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.
실시예 1
실시예 1-1
기능성 덱스트란(F-dex) 합성
기능성 덱스트란 중합체는 덱스트란의 카르복시메틸화에 의해 합성된 후 라이신(Lys), 메틸 에스테르 라이신(mLys), 페닐알라닌(Phe) 또는 이소류신(Ile)과 같은 아미노산을 CM-dex의 카르복실기에 커플링함으로써 합성되었으며, 이는 도 1에 도시된 바와 같다.
보다 구체적으로 이를 설명하면, 0.432 mmol N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC) 및 0.864 mmol N- 하이드록시숙신이미드(NHS)이 첨가된 10 mL의 PBS(100 mM, pH 6)에 400 mg의 CM-dex를 용해시킨 다음, 그 혼합물을 30분 동안 교반하고, 2.16 mmol의 아미노산(또는 펩타이드)을 첨가, 섭씨 25도에서 6시간 동안 교반하였다. 이후 용액을 2일 동안 물에 대해 투석하였다(MWCO 10 kDa). 마지막으로, 용액을 동결건조하여 기능성 덱스트란(F-dex) 중합체를 얻었다.
실시예 1-2
F-dex-TMD의 합성
본 실시예에서는 폴리머 인식상을 갖는 TMD 기반 인공항체는 물에서 상기 기능화된 덱스트란 폴리머(F-dex)와 벌크 WS2 를 초음파 처리하여 제조하였으며, 이는 도 2에 도시된 바와 같다. MoSe2 나노시트 또한 WS2와 유사한 방식으로 제조되었다.
이를 보다 상세히 설명하면, 먼저 600 mg의 벌크 TMD와 40 mg의 실시예 1-1의 F-dex를 20 mL의 DI water에 첨가하였다. 이후 이 혼합물을 17W 및 6초 온 및 2초 오프 방식의 펄스로 팁 초음파 처리를 얼음 수조에서 5시간 동안 하였다. 다음, 이 혼합물을 1,977xg에서 1시간 동안 원심분리하여 18 mL 분량의 상층액을 얻었다. 상층액을 1.5시간 동안 15,344xg에서 다시 원심분리하여 침전물의 2.5 mL 부분을 얻은 다음, 이를 1.5시간 동안 3,000xg에서 원심분리하여 나노하이브리드 2 mL 용액을 얻었다.
실시예 1-3
박테리아 선택성 나노하이브리드 인공항체의 선별
박테리아에 대한 F-dex-TMD의 인식 선택성을 확인하기 위해 박테리아 용액(1X109 CFU mL-1) 50μL를 0.1 mM F-dex-TMD(10mM PBS, pH 7.4) 500 μL에 첨가하였다.
생성된 혼합물을 섭씨 25도에서 1시간 동안 흔든 후 용액을 1,977xg에서 5분간 원심분리하여 박테리아를 획득하고 결합되지 않은 인공항체를 제거하였다.
그 다음, 박테리아를 950 μL PBS로 여러 번 세척하여 결합되지 않은 인공항체를 완전히 제거하였다. 마지막으로, 50 μL의 PBS를 박테리아에 첨가한 후, 2 μL의 박테리아 용액을 5 μm의 직경을 갖는 유리 어레이의 각 지점에 떨어뜨려 결합된 F-dex-TMD의 라만강도를 라만 강도를 352(WS2)와 240(MoSe2) cm-1에서 측정하였다. 본 실시예에서는 9W의 출력으로 532 nm 레이저를 조사하여 각 어레이 내 121 개 구역의 라만 강도를 측정하였다.
실시예 1-4
인간 혈청에서 병원성 박테리아의 검출.
특정 농도의 병원성 박테리아(E. coli O157:H7 또는 S. aureus)를 갖는 인간 혈청 10 μL를 0.1 mM 농도의 실시예 1-3의 F-dex-TMD 용액(PBS, pH 7.4) 500 μL에 첨가하였다. 혼합물을 섭씨 25도에서 500 rpm으로 1시간 동안 흔들어 혼합하고, 1,977xg에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 수집, PBS로 2회 세척하였다.
세균 침전물에 PBS 20 μL를 첨가한 후, 표적 세균에 결합된 나노하이브리드 인공항체의 라만 강도를 측정하기 위해 유리 어레이의 각 스폿(총 5개 스폿)에 4 μL의 세균 용액을 떨어뜨리고, 532 nm의 레이저와 9W의 출력을 가진 라만 현미경을 사용하여 라만강도를 측정하였다.
실시예 1-5
인-비보 박테리아의 광열 비활성화
각 박테리아 균주(109 CFU mL-1) 50 μL를 0.1 mM F-dex-TMD 용액(10 mM PBS, pH 7.4) 500 μL와 혼합하였다. 혼합물을 섭씨 25도에서 1시간 동안 흔든 다음, 박테리아를 PBS로 두 번 세척하여 결합되지 않은 F-dex-TMD를 제거하였다. 표적 박테리아 용액 10 μL를 96 웰 플레이트에 옮기고 808 nm 레이저(5 W cm-2)로 20분 동안 조사하였다. 박테리아를 1X104 CFU mL-1로 희석하고 30 μL의 박테리아 용액을 한천 플레이트에 도포하고, 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양한 후, 박테리아의 콜로니를 계수하였다.
실시예 1-5
감염된 마우스의 상처 치유를 위한 박테리아의 생체내 비활성화
마우스의 등쪽 피부 절제 상처를 E. coli O157:H7 용액(1 x 105 CFU mL-1, PBS) 5 μL로 10분간 감염시킨 후 5 μL의 PBS 또는 CM-dex-MoSe2(2 mg mL-1)로 15분 동안 처치하였다.
레이저(808 nm, 2 W cm-1)를 상처 부위에 2분간 조사하고 1분간 전원을 끈 후 1분간 2차 광을 조사하였다. 5 μL PBS를 상처에 첨가하고 4분 동안 방치한 후, 다시 상처에 2분 동안 레이저를 조사하고 1분 동안 전원을 껐다가 1분 동안 2차 광을 조사하였다. 이후 상처를 오염으로부터 보호하기 위해 Tegaderm으로 드레싱하고 3, 7, 14일 동안 모니터링하였다.
이후, 나노하이브리드 인공항체의 생체 내 치료 효능을 평가하기 위해 감염된 피부 조직을 채취하여 4% 고정액에 고정한 후 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 조직은 병리학자들이 치료 그룹에 대한 사전 지식 없이 각 피부 섹션에 디지털 현미경을 사용하여 검사한 후 독립적으로 점수를 매기는 방식을 사용하였다. CM-dex-MoSe2 및 808 nm 레이저 처리 전후에 감염된 상처 부위의 박테리아 수를 결정하기 위해 감염된 조직을 PBS(1 mL)에서 균질화하고 희석된 조직 용액을 LB 한천에 도말하고, 이후 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션하였다(3개의 중복).
실험예
실험예 1
도 3은 (A) dex-WS2, (B) CM-dex-WS2, 및 (C) mLys-dex-WS2의 TEM 이미지이고, 도 4는 (D) dex-WS2, (E) CM-dex-WS2, 및 (F) mLys-dex-WS2의 AFM 이미지이다. 또한 도 5는 bulk WS2, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 FT-IR 스펙트럼이고, 도 6은 bulk WS2, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 C 1s XPS 스펙트럼이고, 도 7은 bulk WS2, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 라만 산란 및 형광 스펙트럼이다.
도 3 내지 4를 참조하면, dex, CM-dex 및 mLys-dex 상을 포함하는 모든 WS2 나노시트 계면에서 평균 측면 크기가 43 nm이고 높이가 4.5 nm인 구조인 것을 알 수 있다. 즉, WS2 나노시트의 증가된 두께는 표면에 고분자상이 형성되었음을 의미하며, 투과전자현미경(TEM) 및 원자력현미경(AFM) 데이터 모두 본 발명에 따른 WS2 기반 나노하이브리드 구조체가 거의 동일한 물리적 구조를 나타냄을 나타낸다.
도 5 및 6을 참조하면, dex-WS2, CM-dex-WS2 및 mLys-dex-WS2의 FT-IR 스펙트럼은 1732(에스테르 C=O), 1643(아미드 C=O) 및 1244 cm-1(C-N)에서의 진동모드를 나타낸다(도 5 참조). O=C-O와 O=C-N 결합 밴드는 CM-dex-WS2와 mLys-dex-WS2의 C1s XPS 스펙트럼에서 각각 289.1과 288.7 eV에 존재했지만 dex의 스펙트럼에는 없었다(도 6 참조). 이상의 결과는 상술한 방법에 따라 계면에서 다른 고분자 상을 지닌 WS2 나노하이브리드가 잘 준비되었음을 분명히 보여준다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 WS2 나노하이브리드의 강한 라만 밴드는 병원성 박테리아의 민감한 검출을 위한 검출 신호로 사용될 수 있음을 나타낸다. 즉, WS2 나노 하이브리드는 614 nm에서 광발광(PL)을 나타내어 WS2 단층의 박리를 추가로 나타낸다(도 7 우측 참조). 이 결과는 서로 다른 고분자 상을 가진 모든 WS2 나노하이브리드는 유사한 물리적 구조 외에도 일관된 광학적 특성을 나타냄을 보여준다.
실험예 2
도 8은 본 발명에 따른 TMD 기반 나노하이브리드 인공항체의 박테리아에 대한 인식 선택성을 설명하는 모식도이다.
도 8에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 인공항체의 E. coli O157:H7, S. typhimurium, S. aureus 및 B. cereus 와 같은 병원성 박테리아에 대한 선택 인식성을 분석하였다. 이를 위하여 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에서 각 박테리아와 함께 각 WS2 나노하이브리드를 배양한 후, 결합되지 않은 나노하이브리드를 용액에서 제거한 다음, 352 cm-1에서 결합된 WS2의 라만 신호를 앙상블 측정하였다.
도 9는 4개의 상이한 세포주와 결합된 dex-WS2 및 CM-dex-WS2의 라만 스펙트럼 결과이다.
도 9를 참조하면, dex-WS2의 강한 라만 신호는 그람 양성 S. aureus에서만 관찰된 반면 CM-dex-WS2의 강한 라만 신호는 그람 음성 박테리아 E. coli O157:H7에서만 나타났다.
도 10은 유리 어레이에서 -1결합된 인공 항체의 352 cm-1에서 라만 강도를 기반으로 하는 4개의 다른 박테리아의 대표적인 라만 매핑 이미지이다.
도 10을 참조하면, 다른 그람 양성 B. cereus와 그람 음성 S. typhimurium에 대한 dex-WS2 및 CM-dex-WS2의 라만 신호는 라만 매핑 이미지에서 관찰되지 않았다.
도 9 및 10의 결과는 이것은 본 발명에 따른 나노하이브리드 물질이 가지는 박테리아 특이적 선택성을 잘 증명한다.
실험예 3
도 11은 (D) 352 cm-1에서 S. aureus, B. cereus, E. coli O157:H7 및 S. typhimurium의 4가지 다른 박테리아에 결합된 TMD 인공 항체의 총 라만 강도, (E) 고분자 상의 카르복실기 함량의 함수로서 352 cm-1에서 4개의 다른 박테리아에 결합한 인공 항체 CM-dex-WS2의 정규화된 라만 강도, (F) 352(WS2) 및 240(MoSe2)cm-1에서 4개의 다른 박테리아에 결합한 dex-WS2, dex-MoSe2, CM-dex-WS2 및 CM-dex-MoSe2의 352(WS2) 및 240(MoSe2)cm-1에서의 정규화된 라만 강도이다.
도 11을 참조하면, 아미노 그룹이 있는 mLys-dex-WS2는 병원성 박테리아에 거의 결합하지 않은 반면, 아미노 그룹과 카르복실 그룹이 모두 있는 Lys-dex-WS2는 E-coli O157:H7에 대한 결합이 약간 증가하였다. 또한 소수성 고분자 상을 가진 WS2 나노하이브리드(Phe-dex-WS2 및 Ile-dex-WS2)는 병원성 박테리아에 대한 인식 선택성을 잃었다(도11D 참조). E. coli O157:H7에 대한 CM-dex-WS2의 인식 선택성은 고분자 상에서 카르복실기의 함량이 증가함에 따라 더욱 뚜렷해졌다(도 11E 참조). 이러한 결과는 병원성 박테리아에 대한 WS2 항체 모방체의 인식 선택성이 WS2 계면에서 중합체 상을 변화시킴으로써 조절될 수 있음을 시사한다.
또한 표적 박테리아에 대한 인공 항체 dex-WS2 및 CM-dex-WS2의 인식 선택성은 단단한 TMD 스캐폴드 지지체에 의하여 영향을 받지 않는다 즉, 인공 항체에서 WS2 나노시트가 MoSe2로 대체됨에 따라 S. aureus 및 E. coli O157:H7에 대한 dex-MoSe2 및 CM-dex-MoSe2의 인식 선택성은 각각 일정하게 유지되는 것을 알 수 있다(도 11F 참조).
*이상의 실험결과는, 표적물질에 대한 특이성은 단단한 TMD 지지체보다는 유연한 고분자 상의 유형에 의존적이며, 표적 박테리아에 대한 인공 항체의 인식 선택성을 위해 TMD 나노시트에 특정 고분자상의 형성이 필수적이다는 것을 시사한다.
실험예 4
도 12는 시험관 내 및 생체 내에서 병원성 박테리아의 검출과, 병원성 박테리아를 비활성화시켜 감염 등의 질환을 치료하는 방식을 설명하는 도면이다.
도 12를 참조하면, 본 발명에 따른 TMD 기반 인공 항체는 인간 혈청에서 병원성 박테리아의 신속하고 민감한 검출과 비활성화가 가능하다.
도 13은 인간 혈청에서 S. aureus의 함수로서의 S. aureus-선택성 dex-WS2의 라만 강도를 나타내는 도면이다.
도 13을 참조하면, 352 cm-1에서 S. aureus 선택성 dex-WS2의 라만 강도는 인간 혈청에서 S. aureus의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하는 것을 알 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 인공항체는 별도의 증폭이나 표지화와 같은 후 공정 없이 병원성 세균을 선택적으로 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 14는 인간 혈청에서 E. coli O157:H7의 함수로서 E. coli O157:H7-선택성 CM-dex-WS2의 라만 강도를 나타내는 도면이다.
도 14를 참조하면, E. coli O157:H7-선택성 CM-dex-WS2는 인간 혈청에서 E. coli O157:H7을 간단하고 신속하게 검출할 수 있는 것을 알 수 있다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 dex-WS2가 표적으로 하는 S. aureus의 single copy과 CM-dex-WS2가 표적으로 하는 E. coli O157:H7의 single copy의 광학 및 라만 매핑 이미지이다. 여기에서 라만 매핑 이미지는 352 cm-1에서의 라만 강도를 기반으로 생성되었다.
도 15를 참조하면, 본 발명에 따른 TMD 기반 인공항체는 S. aureus와 E. coli O157:H7를 별도의 농축이나 정제 과정 없이 single copy 수준의 낮은 농도에서 검출 가능하다는 것을 알 수 있다.
이러한 결과는 TMD 기반 인공 항체는 인간 혈청에서 병원성 박테리아의 신속하고 민감한 검출을 가능하게 하며, 비생물학적인 구성요소만을 가지는 본 발명의 인공 항체 성능은 펩타이드를 포함하는 이전 항체 모방체의 성능과 비슷했으며 검출 감도 측면에서 항체 또는 압타머로 기능화된 다른 나노물질보다 컸다.
도 16은 20분간 NIR 조사(808 nm, 5 W cm-2)를 진행하면서, 4가지 다른 병원성 박테리아에 대한 dex-MoSe2 및 CM-dex-MoSe2의 선택적 살균 효과를 나타내는 한천 겔 이미지(Agar gel image)이고, 도 17은 그 결과를 정량적으로 측정한 결과이다.
도 16 및 17에서 20분간 NIR 조사(808 nm, 5 W cm-2)를 진행하면서, 4가지 다른 병원성 세균에 대한 dex-MoSe2 및 CM-dex-MoSe2의 선택적 살균 효과를 확인하였다. 이때 MoSe2가 근적외선(NIR) 전자기 복사에 의해 더 큰 광열 효과를 나타내기 때문에 MoSe2 기반 인공 항체가 살균 효과에 사용되었으며, CM-dex-MoSe2 또는 dex-MoSe2를 4개의 다른 박테리아에 첨가하고 결합되지 않은 인공 항체를 제거한 후 NIR 광을 조사하였다.
도 16 및 17을 참조하면, CM-dex-MoSe2는 E. coli O157:H7을 선택적으로 죽인 반면, dex-MoSe2는 S. aureus에서만 콜로니 수를 효과적으로 감소시키는 것을 알 수 있다.
도 18은 대표적인 병원균인 E. coli O157:H7로 감염된 후 쥐의 피부 상처 사진으로, 처리되지 않은 경우, CM-dex-MoSe2로 처리된 경우 및 CM-dex-MoSe2 + NIR 조사(2 W cm-2, 2 min-on, 1 min-on 펄스 방식)로 처리된 경우에 대한 대표사진이다.
도 18을 참조하면, 감염된 마우스의 상처는 치료가 없는 경우 또는 근적외선 조사 없이 CM-dex-MoSe2 로만 치료된 경우 시간이 지남에 따라 심한 세균성 농양과 부종을 보였다, 그러나 NIR 조사 하에서 CM-dex-MoSe2로 감염된 마우스를 치료하면 상처 부위의 농양과 부종이 효과적으로 치료되었는데, 이것은 쥐의 상처에 있는 E. coli O157:H7은 NIR 조사에서 CM-dex-MoSe2에 의해 효과적으로 사멸되었다는 것을 의미한다.
도 19는 그룹당 10마리의 마우스에서 H&E 염색을 사용한 마우스 피부 생검의 조직학적 절개사진이다. 도 19에서 (1) 박테리아, (2) 다형 침윤물, (3) 파괴된 표피층, (4) 염증성 삼출물, (5) 섬유아세포, (6) 재생된 상피 세포를 나타낸다.
도 19를 참조하면, 또한, 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 이용한 상처 조직의 조직학적 분석은 근적외선 조사 조건에서 CM-dex-MoSe2로 처리된 조직에서 섬유아세포와 조밀한 상피 세포가 재생되는 반면 박테리아, 다형 침윤, 파괴된 표피층 및 염증성 삼출물이 완전히 사라지는 것을 알 수 있다. 이것은 생체 내에서 병원성 박테리아의 선택적 인식 및 비활성화를 통한 치료제로서의 TMD 인공 항체의 가능성을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체로서,
    전이금속 디칼코게나이드(TMD) 나노시트; 및
    상기 나노시트에 형성된 고분자상(polymeric phase)를 포함하는 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 고분자상은 병원성 박테리아에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 전이금속 디칼코게나이드(TMD) 나노시트는 MoS2, MoSe2, WS2 및 WSe2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 나노시트인 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 고분자상은 하기 식(1) 내지 (3)의 화합물 중 적어도 어느 하나 포함하는 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체.
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000015
    (1),
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000016
    (2),
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000017
    (3)
    (상기 식에서 X, Y, Z는 각각 1 내지 20의 정수이고, R은
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000018
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000019
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000020
    Figure PCTKR2022010178-appb-img-000021
    중 적어도 어느 하나임)
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 식 (1)의 화합물은 S. aureus와 특이적으로 결합하고, 상기 식 (2)의 화합물은 E. coli O157:H7와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공 항체.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공항체를 포함하는 병원균 박테리아 검출물질.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 전이금속 디칼코게나이드 기반 인공항체를 포함하는 병원균 박테리아 비활성화 물질.
  8. 제 6항에 따른 병원균 박테리아 검출물질과 박테리아를 배양하는 단계;
    상기 박테리아 검출물질로부터 라만 신호 및 강도를 측정하는 단계를 포함하는 병원균 진단방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 라만신호는 상기 TMD 나노시트로부터 발생한 것을 특징으로 하는 병원균 진단방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 라만신호는 상기 단일세포 수준의 박테리아로부터 발생하여 검출되는 것을 특징으로 하는 병원균 진단방법.
  11. 제 7항에 따른 병원균 박테리아 비활성화 물질에 NIR 광을 조사하여 상기 박테리아를 비활성화하는 것을 특징으로 하는 병원균 박테리아 비활성화 방법.
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