WO2023277505A1 - 서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023277505A1
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bacillus subtilis
surfactin
subtilis
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enzyme
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조양래
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주식회사 프록스엔렘
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a Bacillus subtilis strain excellent in producing surfactin and enzymes, and more particularly, to Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP having an excellent ability to produce surfactin, proteolytic enzymes and polysaccharide degrading enzymes.
  • Bacillus subtilis a number of microorganisms including Bacillus subtilis are being developed as antibiotic substitutes. Since the Bacillus subtilis developed for use in animals is only a few species and the demand is increasing, the need to develop microorganisms with excellent efficacy is constantly raised.
  • surfactin which has excellent antibiotic efficacy as a bio-surfactant, is a substance with high potential to be used as an animal growth promoter replacing existing antibiotics.
  • Surfactin is made up of 7 amino acids (Glu, Asp, Val, Leu) of 4 types by 3 non-ribosomal pepetide synthase (NRPS), which are connected in a ring form, and 12-17 carbon backbones are attached to the surfactin. It is a lipopolypeptide that is composed of lipid acids bound together.
  • NRPS non-ribosomal pepetide synthase
  • B. subtillis Bacillus subtilis
  • Bacillus pmilus B. pumilus
  • Bacillus amyloliquefaciens B.
  • Bacillus subtilis Bacillus licheniformis
  • Bacillus mozaben It is produced by B. mojavensis ) et al. (Hmidet et al., 2017). Since most of the surfactin produced by the Bacillus subtilis produces a very small amount of surfactin during cultivation even when the fermentation conditions of the Bacillus subtilis are good (Chen et al., 2015), Bacillus subtilis that produces surfactin or sulfactin There is a limit to its use as a livestock growth promoter.
  • enzymes such as starch degrading enzymes (amylases), proteases (proteases), and plant cell wall degrading enzymes (cellulases, hemicelluloses, pectinases, xylanases) are used in various industries. These enzymes are generally known to be added to laundry detergents to increase washing efficiency, and industrial enzyme proteins are also used as feed supplements in the livestock industry to help animals digest and increase the effectiveness of feed. Industrial enzyme proteins are generally produced in large quantities in fungi. However, since most of the enzymes produced by fungi are not suitable for human or animal consumption, a new method is needed to produce and manufacture them in a form that can be consumed by humans and animals.
  • Korean Patent Registration No. 1155158 relates to a new Bacillus subtilis with excellent survival rate. It can efficiently decompose fibrous and semi-fibrous components, which are difficult to decompose in the body, to increase the efficiency of feed use for livestock animals, suggesting the possibility of using it as a feed additive.
  • the strains in the prior art are not only different from the strains in the present invention, but also different from the present invention in that the production functions of surfactin, proteolytic enzymes, and starch degrading enzymes usable as components of animal growth promoters are not disclosed at all. There is a difference.
  • subtilis ps4100 KACC81159BP was excellent in producing surfactin and digestive enzymes, and it was confirmed that it could be used as an animal growth promoter or feed additive, and the present invention was completed.
  • the main object of the present invention is to provide a novel microorganism, Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP, which is excellent in producing surfactin and digestive enzymes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing surfactin using the Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP.
  • Another object of the present invention is to provide a composition capable of promoting animal growth and reducing harmful gases using the Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP or its culture.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for adding feed using the Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP or its culture.
  • the present invention provides Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP having the whole genome represented by SEQ ID NO: 1 that produces surfactin and enzymes.
  • Bacillus subtilis have been developed as beneficial bacteria (hereinafter referred to as 'probiotics', probiotics) for use in animals and humans. Some are used as antibiotic substitutes instead of adding antibiotics to animal feed. However, since Bacillus subtilis generally produces very small amounts of surfactin, even if it is used as an antibiotic substitute, various animals (particularly chicks and pigs) can still prevent or treat diseases (diarrhea, lethality, etc.) caused by harmful microorganisms infection. There were limits.
  • feed for economic animals commonly used in the market is composed of plant tissue composed of starch, cellulose and protein, including 30% corn, 40% wheat, and 25% soybean.
  • starch cellulose
  • protein including 30% corn, 40% wheat, and 25% soybean.
  • amylase or cellulase has been used as a feed supplement to facilitate the decomposition of starch or cellulose, but they are easily destroyed in the stomach and difficult to reach the small intestine, so it is difficult to maximize the digestive efficacy.
  • the present inventors have made research efforts to isolate and identify strains with excellent surfactin and enzyme production ability in order to promote animal growth by replacing classical antibiotics and promoting animal digestion.
  • Bacillus subtilis was isolated from, and their emulsifying ability was compared to finally select strains with excellent plant-derived nutrient degrading enzyme production ability among strains with excellent emulsifying ability, and whole genome sequencing and genetic analysis were performed.
  • the present inventors registered the entire genome sequence of the selected strain in NCBI's “GenomeProject database”.
  • the selected strain was named “Bacillus subtilis ps4100” as a new microorganism, and the National Institute of Agricultural Sciences Microbial Bank of the Rural Development Administration ( KACC) on June 15, 2021 and was given the accession number KACC81159BP.
  • nucleotide sequence of the entire genome of Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP selected in an example of the present invention was read 200 times by the Pacific Bioscience long reads sequencing method, and then these sequences were concatenated to determine the entire genome.
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention is characterized by including a 16S rDNA gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the enzyme may be a digestive enzyme that helps digestion of animals, such as polysaccharide degrading enzyme, monosaccharide degrading enzyme, disaccharide degrading enzyme, oligosaccharide degrading enzyme, proteolytic enzyme and It may be a lipolytic enzyme, preferably a proteolytic enzyme or a polysaccharide degrading enzyme.
  • the polysaccharide in the polysaccharide degrading enzyme may be dextrin, dextran, starch, glycogen and cellulose, preferably starch or cellulose.
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention is characterized in that its ability to produce surfactin is 2 times, preferably 1.5 to 5.5 times higher than that of the Bacillus subtilis strain ( B. subtilis ATCC21332).
  • the content of pure surfactin contained in the precipitate (dry state) produced by culturing the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention is up to 60%, whereas the subspecies Bacillus subtilis The content of pure surfactin contained in the precipitate (dry state) produced by culturing B. subtilis ATCC21332 was only up to 25%.
  • the amount of pure surfactin in Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP was about twice as high as that of ATCC21332 (see Experimental Example 3).
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention has proteolytic enzyme production more than twice as high as B. subtilis strain ( B. subtilis ATCC21332), a subspecies producing surfactin, and more than five times higher than B. subtilis pb2441. characterized by
  • the amount of proteolytic enzyme secreted by culturing the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention is up to 8.84ug / ml, whereas the subspecies Bacillus subtilis strain ( B. subtilis ATCC21332 ), the maximum amount of protease secreted by culturing was 3.57ug/ml, and the amount of protease secreted by culturing B. subtilis pb2441 was only up to 3.93 ug/ml (see Experimental Example 4).
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention is characterized in that the polysaccharide degrading enzyme production is more than twice as high as that of B. subtilis ATCC21332 and B. subtilis pb2441, which are subspecies that produce surfactin. .
  • the amount of polysaccharide degrading enzymes (starch degrading enzyme, cellulose degrading enzyme) secreted by culturing the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 of the present invention is subspecies Bacillus subtilis strain ( B. subtilis ATCC21332 ) and B. subtilis pb2441 were cultured to confirm that the amount of secreted proteolytic enzyme was more than twice as high (see Experimental Examples 5 and 6). These results show that the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention is significantly superior in polysaccharide degrading enzyme production ability compared to conventional Bacillus subtilis strains.
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention secretes polysaccharides during growth, unlike the subspecies B. subtilis strains ( B. subtilis ATCC21332) and B. subtilis pb2441. These polysaccharides are known to enhance the immunity of animals and are related to the production of surfactin. Specifically, according to the results of studies investigating the relationship between the growth of Bacillus subtilis and surfactin production, when biomass increases, pores are created by quorum sensing, and surfactin production is stopped. That is, as the number of Bacillus subtilis increases by culturing, the content of surfactin they produce temporarily increases.
  • Bacillus subtilis of the present invention is separated into polysaccharides, so there is a possibility that chorom sensing may occur late.
  • the polysaccharide material of the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 of the present invention is an important feature that can improve the production of surfactin.
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 of the present invention grows vigorously in the presence of starch at a high temperature of 55 ° C., where microorganisms generally do not grow well.
  • ATCC21332 grows vigorously at 37 ° C, but the growth rate decreases at 55 ° C
  • ps4100 of the present invention grows more vigorously at 55 ° C than at 37 ° C. Using this property, contamination of infectious bacteria and fungi can be easily prevented when making animal feed supplements using solid media.
  • the present invention provides (a) culturing Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP having the whole genome represented by SEQ ID NO: 1 of claim 1 on a solid medium to form colonies; (b) inoculating and culturing the colony in a liquid medium; and (c) obtaining surfactin from the precipitate after centrifuging the culture medium.
  • surfactin can be produced by generating bubbles in the liquid medium inoculated with colonies in step (b) and obtaining surfactin from the generated bubbles.
  • the culturing in step (a) is characterized in that it is performed at 25 ° C to 37 ° C for 24 to 48 hours.
  • the incubation temperature is less than 25 ° C, a problem in which the growth rate of the strain is slowed may occur, and when the incubation temperature exceeds 42 ° C, a problem in which the strain does not grow may occur.
  • the incubation time is less than 24 hours, colonies may not grow sufficiently, and if it exceeds 48 hours, colonies of strains may clump together and completely cover the plate, causing aging of the strain.
  • the culturing in step (b) is characterized in that it is performed at 28 ° C to 42 ° C for 45 to 60 hours.
  • the incubation temperature is less than 28 ° C, the strain does not grow sufficiently, which may cause a decrease in surfactin production, and when the incubation temperature exceeds 42 ° C, the growth of the strain may stop.
  • the incubation time is less than 45 hours, the nutrients contained in the culture medium cannot be sufficiently used, so the surfactin production rate may decrease, and if the culture time exceeds 60 hours, the surfactin production rate does not increase, wasting time and power problems can arise.
  • the liquid medium in step (b) is glucose, yeast extract, peptone, dibasic potassium phosphate (K 2 HPO 4 ), sodium chloride (NaCl), sodium carbonate (Na 2 CO 3 ) and magnesium sulfate (MgSO 4 ) are included, sucrose can be used instead of glucose as a carbon source, and ammonium can be used instead of peptone as a nitrogen source. Not limited.
  • the present invention provides a composition for promoting animal growth comprising Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP having the whole genome represented by SEQ ID NO: 1 or a culture medium thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for adding feed containing Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP having the whole genome represented by SEQ ID NO: 1 or a culture medium thereof as an active ingredient.
  • the novel microorganism Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention has a remarkably excellent ability to produce surfactin and digestive enzymes
  • the new strain or its culture medium according to the present invention is used for animal growth promotion or feed It is very suitable as an additive composition.
  • the composition for promoting animal growth or the composition for adding feed of the present invention includes organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, and lactic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate, polyphenol, and catechin. , alpha-tocopherol, vitamin C, chitosan, tannic acid, may further include any one or more than one of natural antioxidants such as phytic acid.
  • composition for promoting animal growth or the composition for adding feed according to the present invention may be in the form of a dry or liquid formulation, and may include an excipient.
  • Excipients include, for example, zeolite, jade powder or rice bran, but are not limited thereto.
  • Animals that can be used for the composition for promoting animal growth or the composition for adding feed of the present invention are, for example, livestock such as edible cattle, dairy cows, calves, pigs, piglets, sheep, goats, horses, rabbits, dogs, cats, and chicks.
  • poultry such as chickens, domestic chickens, roosters, ducks, geese, turkeys, quails, small birds, etc.
  • Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP of the present invention has an excellent ability to produce surfactin and digestive enzymes
  • Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP or its culture promotes the growth of animals and is generated by intestinal microorganisms It can be used for the purpose of reducing the generation of harmful gases.
  • Figure 1 shows the phylogenetic tree of Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP ( Figure 1a: phylogenetic tree created by the Maximumlikelyhood method using 16S rDNA, Figure 1b: phylogenetic tree using 720 orthologs amino acid sequences. Figure 1c: Bootstrap value 0.5 or less nodes removed phylogenetic tree).
  • FIG. 2 is a diagram showing vegetative cells and spores of Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP (FIG. 2a: vegetative cells grown in solid medium, FIG. 2b: vegetative cells grown in liquid medium, FIG. 2c, FIG. 2d: Spore cells grown in sporulation medium).
  • Figure 3 is a diagram comparing the structure of the whole genome of Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP and other Bacillus subtilis.
  • Figure 5 is a result of comparing surfactin production (Figure 5a: weight of the precipitate (mg), Figure 5b: relative amount of surfactin (%) mixed in the precipitate, Figure 5c: amount of surfactin (mg) ).
  • FIG. 7 is a result of comparing the amount of protease secretion during culture in liquid medium (FIG. 7a, 7b: width of clear zone, FIGS. 7c to 7e: amount of proteolytic enzyme).
  • FIG. 8 is a result of comparing the secretion amount of starch degrading enzyme (FIG. 8a: width of clear zone, FIG. 8b: amount of starch degrading enzyme).
  • Figure 9 is a result of comparing the amount of cellulolytic enzyme secretion (Fig. 9a: the width of the clear zone, Figs. 9b, 9c: the amount of cellulolytic enzyme).
  • Feces of third instar larvae were collected to investigate the intestinal bacteria of Protaetia brevitarsis taughtensis larvae.
  • the larvae were collected from Taean-eup, Taean-gun, Chungcheongnam-do, and were maintained by supplying fermented sawdust as food.
  • the feces produced during this breeding were diluted in distilled water, heat-treated at 80 ° C for 15 minutes, spread on a 15 mm diameter plate on which LB agar medium was hardened, and incubated at 30 ° C for 16 hours. More than 100 bacterial colonies appeared on the cultured plate, and they were individually inoculated on a new plate at intervals of 0.5 to 1 cm to separate pure bacteria.
  • Example 1 20-40 of the well-separated bacterial colonies in Example 1 were individually transferred to LB agar medium plates and cultured at 30° C. for 16-48 hours. After culturing, soybean oil was sprayed on the plate on which the colonies grew, and strains secreting surfactant were selected. At this time, a round transparent part is formed around the colony secreting the surfactant, and the larger the amount of the surfactant, the wider the transparent part appears. Each of the separated strains was inoculated into an Erlenmeyer flask containing 50ml LB and cultured for 48 hours to 72 hours while maintaining a temperature of 30° C. while shaking at a speed of 200 rpm on a stirrer.
  • the culture solution was centrifuged to remove microorganisms, and the remaining culture solution was tested by the water drop-collapse method.
  • strains and strain residues were completely removed by passing the culture solution remaining in the upper layer through a 0.45 ⁇ m filter.
  • Water drop-collapse assay was performed as follows. A drop of microbial culture was added to each well of an oiled 96-well plate. The culture medium without surfactant is water-based and remains in the form of water droplets on the oil, but the culture medium containing surfactant is mixed with the oil and the water droplets spread widely. Through the above experiments, strains were selected that allow the culture solution droplets to mix well with the oil on the film formed of oil.
  • strains with the most excellent emulsification ability of the cultured liquid were selected through an assay experiment.
  • mineral oil was used in the initial discovery experiment, and mineral oil and soybean oil were used in the additional confirmation verification experiment.
  • the 96-well plate has a diameter of 8 mm and a depth of 30 mm. 7ul of oil was added to each well and stored at room temperature for 24 hours. Thereafter, 20ul of the culture medium was carefully dropped into each well through a needle or pipette.
  • distilled water was used instead of the culture medium. After 1 minute had elapsed after the culture solution was added, the degree of change of the culture solution droplet was visually assessed. All experiments were repeated at least three times.
  • Example 3 Identification through 16S rRNA sequence of Bacillus subtilis ps4100 strain
  • the strain selected in Example 2 was presumed to be Bacillus subtilis when observed under a microscope, and the nucleotide sequence of 1600 nucleic acids of 16S rRNA was determined to be identified by molecular biological methods.
  • the strain was cultured on an LB agar plate for 24 hours. The cultured colonies were placed in an aliquot, washed with distilled water, heat-treated at 95° C. for 15 minutes, centrifuged to remove cell debris, and the supernatant was used as template DNA for PCR. For PCR amplification, DNA polymerase was used as described in the manual.
  • the nucleic acid sequences were compared with bacteria registered in public databases by the BlastN method. As a result, as shown in Table 1, the 16S rRNA sequence (SEQ ID NO: 2) obtained through PCR was 100% identical to the NCBI-registered B. subtilis 16S rRNA sequence.
  • SEQ ID NO: 2 (16S rRNA nucleic acid base sequence of Bacillus subtilis ps4100) gtagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgtgagtctga
  • ITS sequence Internal transcribed spacer (ITS) sequence with high mutation fixation rate is used to distinguish subspecies within bacterial species or differences between strains. Since the 16S rRNA sequence of the ps4100 strain was the same as that of B. subtilis , the ITS sequence was checked to confirm the difference from known strains. When ITS was amplified using PCR, an elongation reaction was performed for 40 seconds using 16S_1094F 5'-CAGCTCGTGTCGTGAGATGT-3' (SEQ ID NO: 6) and 23S_197R 5'-TCCTCCGGGTACTTAGATGTTT-3' (SEQ ID NO: 7), Other conditions were the same as for amplifying 16S rRNA. For sequencing, the primers used for PCR were used.
  • SEQ ID NO: 3 Bacillus subtilis 16S rRNA, internal transcribed spacer (ITS), 23S rRNA sequence TTTTTCGAGTGT 1 TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCCGGT
  • the nucleotide sequence of this region was also identical to the sequence of B. subtilis registered in GenBank, and was identical to 15 strains identified as subspecies subtilis among B. subtilis .
  • the sites where these subspecies are found are diverse, such as plant tissue, soil, coastal-silt soil, and fermented materials including soybean paste. They have been shown to produce secondary metabolites that exhibit antibiotic efficacy or antifungal efficacy against certain fungi that cause plant diseases.
  • the ps4100 strain derived from the digestive system of an insect was identified as a subspecies subtilis (hereinafter referred to as Bacillus subtilis subsp.
  • Example 5 Full-length genome sequencing of Bacillus subtilis ps4100 strain
  • the extracted DNA was sequenced by creating a library according to the protocol of PacBio's bacterial genome sequencing kits at DNA Link. After reading the nucleotide sequence of the whole genome 200 times, a map of the whole genome was completed using a known algorithm (Koren et al., 2013). The map of the whole genome was registered (SubmissionID: SUB9765542, BioProjectID: PRJNA733820, accession ID: CP076445) in NCBI's GenomeProject database.
  • Example 6 Establishment of phylogenetic tree of Bacillus subtilis ps4100 strain
  • 16S rRNA described above may not represent ps4100, all rRNA sequences in the whole genome were confirmed.
  • 16S rRNA with a length of 1547 nt was repeated 10 times, and their base sequences were distinguished into four types. The four sequences are very similar, and mutations at 1547 nt appeared only in 4 places, and the maximum difference was only a difference of 3 bases among 1547 nt.
  • Sequence information of rRNA contained in the genomes of ps4100 and other Bacillus strains was extracted from the NCBI database. Other strains also possessed a large number of rRNAs with different nucleotide sequences and included all sequences with different nucleotide sequences. Sequences of rRNA of Bacillus subtilis containing 9 base sequences in ps4100 were aligned using MEGA software and a phylogenetic tree was created (Kumar et al., 2018).
  • a phylogenetic tree was constructed using 728 homologous protein genes as shown in FIG. 1B. Specifically, 12 strains representing Bacillus subtilis were downloaded from the NCBI database and annotation was performed using PGAP (Tatusova et al., 2016). Homologous proteins were selected using CD-HIT when the following conditions were met (Fu et al., 2012). 1) The length of the amino acid sequence is at least 90% higher than that of the longest sequence, 2) the amino acids in this region are at least 70% identical, and 3) 728 present in all 12 strains and ps4100 strains for which the whole genome sequence is available Dog genes were selected. A phylogenetic tree was reconstructed with the MEGA program using all of these genes (Kumar et al., 2018).
  • Example 7 Biochemical characteristics of Bacillus subtilis ps4100 strain
  • the genetic information contained in the whole genome of the 8 strains was analyzed to confirm the G+C content, number of proteins, number of ribosomal RNA operons, and t-RNA of the Bacillus subtilis ps4100 strain.
  • the G+C content of the whole genome was calculated using the algorithm used when assembling the whole genome (Koren et al., 2013), and the genes containing protein information were generated using the GeneMark.HMM (Besemer et al., 2001) package. 4,068 genes were predicted using .
  • tRNAs scattered throughout the entire genome were discovered using a package called tRNA-Scan (Schattner et al., 2005), and a total of 86 were identified.
  • Ribosome RNA was discovered with RNAmmer (Lagesen et al., 2007), and it was confirmed that it consisted of a total of 30 and 10 rRNA operons (Table 3). As a result, as can be seen in Table 3 below, the length of the whole genome, the G + C content, the number of proteins, the number of ribosomal RNA operons, and the number of t-RNAs all show that the ps4100 strain has more Bacillus subtilis than other Bacillus subtilis species. It was confirmed to be similar to B. subtilis .
  • amyloliquefaciens MT45 a B. amyloliquefaciens DSM7 T a B. velezensis FZB42 a B. licheniformis DSM13T a B. pumilus SAFR-032 a B. cereus ATCC14579T a B. subtilis 168 a B. subtilis pb2441 B.
  • subtilis ps4100 Accession NZ_CP011252.1 NC_014551.1 NC_009725.1 NC_006322.1 NC_009848.4 NC_004722.1 NC_000964.3 CP068982 CP076445 Genome size (bp) 3,897,521 3,980,199 3,918,589 4,222,645 3,704,641 5,411,809 4,215,606 4,288,724 4,106,342 G+C content (%) 46.09 46.08 46.48 46.19 41.29 35.28 43.51 43.46 43.78 CDS 3,752 3,870 3,687 4,223 3,598 5,210 4,328 4,328 4,068 rRNA 24 30 29 24 21 42 30 30 30 30 t-RNAs 81 94 88 72 72 108 86 86 86 86
  • Example 8 Morphological characteristics of Bacillus subtilis ps4100 strain
  • Colonies of the Bacillus subtilis ps4100 strain grown on LB agar plates form a helper in a round shape when viewed externally, and when incubated for more than 16 hours, polysaccharides are secreted to reflect light, and the colonies are easily combined and flow like thick runny nose and become sticky. When the number of colonies is large, it flows down thickly, evenly covering the entire plate.
  • vegetative cells growing on solid medium or actively undergoing growth and metabolism are rod-shaped (Fig. 2a: cells grown on solid medium; most vegetative cells, but many spores) A few are visible as black dots, Fig. 2b: cells grown in broth; all show only feeder cells).
  • a normal medium less than 10% of the cells turn into spores even when the conditions deteriorate, and when cultured in a sporulation medium, ⁇ 100% of the cells form spores under special conditions.
  • ps4100 turns ⁇ 100% of vegetative cells into spores (Berikashvili et al., 2018; Monteiro et al., 2014), Fig. 2c , Fig. 2d no vegetative cells, all showing only spores).
  • Example 9 Novelty of Bacillus subtilis ps4100 strain
  • ps4100 is another B. subtilis sub. subtilis , but it is distinctly different from previously known B. subtilis in terms of the length of the whole genome and the arrangement (macrosyntany) of the genes in the whole genome (Fig. 3).
  • ps4100 is a novel strain that has no identical genome length and gene arrangement among known strains. For example, compared to B. subtilis strain 168, which has the most similar sequence and genome structure, the genome size is 109,264 nt shorter.
  • ps4100 is 182,382 nt shorter than the entire genome of B. subtilis pb2441, which was confirmed by the present inventors to produce surfactin.
  • Bacillus subtilis ps4100 strain is inoculated on LB agar solid medium and cultured for 24 to 48 hours in an incubator at 25 to 37 ° C, inoculated directly into a liquid culture medium, or stored at 4 ° C for up to 1 month. Inoculate one or more colonies properly grown in the solid medium into the five liquid media in Table 4 below, and incubate for 48-72 hours while shaking at 180-240 rpm while maintaining 30 ° C. in a shaking-incubator.
  • a quantitative method can be used to inoculate a liquid culture medium with a relatively accurate amount of strain. For example, it is similar to inoculating 1ml of a 50ml medium by dissolving colonies in sterile water and then diluting them to 600nm absorbance (OD600nm) of 0.8 ⁇ 1.5 using a spectrophotometer (UV-vis Spectrophotometer, Mecasys, Korea). . Additional strains may be inoculated, and surfactin production is not significantly affected by the inoculation amount.
  • the ps4100 strain was cultured for 48 hours while shaking at 200 rpm while maintaining 30 ° C. in a shaking incubator by putting 50 ml medium in a 250 ml Erlenmeyer flask. After incubation, the culture medium was transferred to a clean tube, centrifuged at 8,000 g for 10 minutes, and 30 ml of the supernatant was transferred to a clean tube. After correcting the pH to 2.0 by adding 6M hydrochloric acid (HCl) to the supernatant, the mixture was aged at 4° C. for 16 hours and centrifuged at 8,000 g for 15 minutes. The supernatant was discarded and the remaining concentrated precipitate was referred to as crude surfactin. The concentrated surfactin precipitate was lyophilized and 10mg was dissolved in 1ml 100% methanol. The amount of surfactin was analyzed using HPLC, and the results are shown in Table 4.
  • the growth rate of ps4100 was compared with B. subtilis ATCC21332, a subspecies widely used as an experimental species worldwide, and B. subtilis ps4100 , a subspecies discovered by the present inventors, while culturing on a solid medium.
  • the solid medium is Luria-Bertani (LB), 1% starch with 1/4 x LB, 1% skim milk, 1% methyl-cellulose with 1/4 x LB, 0.3% pectin with 1/4 x agar.
  • LB, 1% xylan with 1/4 x LB was added. After inoculating the same amount with the tip of a pipette, the size of bacterial colonies was compared while culturing for 24-96 hours.
  • the absolute colony size was about twice as large and the growth rate was about twice as fast (FIG. 4). That is, surfactin was produced in a similar or slightly higher amount than pb2441, but the growth rate in most media including LB was markedly different. Compared to ATCC21332, the growth rate was similar in most media, but ps4100 grew faster than pb2441 in media containing 1% starch. In particular, pb2441 did not grow at all at 55 ° C, but ps4100 grew well and appeared to be slightly faster than ATCC21332. That is, the growth rate of ATCC21332 was similar in most media, but the surfactin production was 2-5 times higher.
  • the ps4100 strain was cultured in a 250ml Erlenmeyer flask with 50ml No. 5 medium (Table 4) maintained at 30° C. while shaking at 200rpm for 60 hours in a shaking incubator. After the incubation, 35 ml of the culture medium was transferred to a high-speed spin bottle and centrifuged at 8,000 g for 10 minutes. After transferring the supernatant to a clean tube, the supernatant was calibrated to pH 2.0 by adding 33% HCl. The pH-corrected supernatant was aged at 4° C. for >16 hours and then centrifuged at 12,000 g for 30 minutes.
  • surfactin produced by ps4100 showed a pattern in which the molecular weight increased by 14 and -CH 2 increased by one, similar to standard surfactin purchased from Sigma Aldrich.
  • the surfactin produced by ps4100 was C-type ( m/z 1036) molecules with a long lipid tail and A-type ( m /z 1036) molecules with a short tail. /z 1008) and B-type ( m/z 1022) molecules.
  • Milk which contains a large amount of protein, can supply carbon and nitrogen at the same time and contains sufficient nutrients necessary for growth.
  • proteolytic enzymes must be secreted and digested to absorb nutrients.
  • the round transparent part that is, the part where the skim milk powder was decomposed, appeared larger than that of pb2441.
  • 1% skim milk powder When 1% skim milk powder is included in the agar plate, it has an opaque milky color, but when the milk powder is dissolved, it becomes transparent.
  • the area of the clear zone in the agar plate indirectly indicates the secreted amount of enzymes that degrade milk powder, especially enzymes that degrade protein.
  • the diameter of the cleared area was 3.5 times longer than that of pb2441 and slightly longer than that of ATCC21332 when compared after culturing for 3.5 days (FIGS. 7a and 7b).
  • each strain was inoculated into 1/4 x LBA solid medium containing 1% C-methylcellulose dissolved in water, incubated at 37 ⁇ C for 24 hours, and then the degree of cellulose degradation was measured using Congo Reds. Confirmed. The fact that ps4100 decomposed more starch than other strains was confirmed as a clear zone that turned to a clear color (FIG. 9a). An experiment was conducted to measure the amount of cellulolytic enzymes expressed in green plants in water in a liquid medium.
  • Bacillus subtilis ps4100 (KACC81159BP) of the present invention was confirmed through an in vivo test.
  • a total of 100 finishing pigs [Landrace ⁇ Hampshire] ⁇ Duroc) with an average weight (BW) of 54.15 ⁇ 1.70 kg were used in the 10-week experiment.
  • the four experimental diets were randomly assigned to pigs according to their initial BW, but sex ratios were applied. There were 10 replicate pens for each treatment, with 5 pigs per pen (each averaging 50% castrated males and 50% females).
  • a total of 20 stool samples per group were stored at -20 °C until analysis, then dried at 70 °C for 72 h, and then finely ground to less than 1 mm in diameter.
  • Dietary dry matter (DM), nitrogen and digestible energy (DE) were analyzed according to the procedures of the International Society of Official Analytical Chemists (USDA, 2006).
  • USDA International Society of Official Analytical Chemists
  • the boxes were fermented at room temperature for 7 days and methyl mercaptan, NH 3 , H 2 S, acetic acid and CO 2 were measured using MultiRAe Lite (model PGE-6208, RAE, USA).
  • Basal diet corn-soybean meal-based diet
  • TRT Basal diet + supplement (including bacillus subtilis ps4100).
  • ADG average daily gain (average daily weight gain)
  • ADFI average daily feed intake (average daily feed intake)
  • CON Basal diet
  • TRT Basal diet + Bacillus subtilis supplement
  • SEQ ID NO: 1 Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP
  • SEQ ID NO:2 Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP 16S rDNA
  • SEQ ID NO: 3 Bacillus subtilis 16S rRNA, internal transcribed spacer (ITS), 23S rRNA sequence
  • SEQ ID NO: 4 Bac27F (forward primer)

Abstract

본 발명은 신규 미생물 서팩틴, 단백질 분해 효소 및 다당류 분해 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP에 관한 것으로, 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서팩틴 및 소화 효소의 생산능이 우수하므로, 동물성장 촉진제 또는 사료 첨가제로 이용할 수 있으며, 분변에 포함되는 유해가스의 양을 감소시킬 수 있다.

Description

서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도
본 발명은 서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서팩틴, 단백질 분해 효소 및 다당류 분해 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP에 관한 것이다.
1960년대부터 인류의 고기 섭취 양이 급등한 이후 매년 증가하는 수요를 충족시키기 위한 생산량도 증가하고 있다. 고기의 생산량을 증가시키는 과정에 가축질병 발생빈도가 높아졌으며, 생산량을 증가시키기 위해 항생제를 대량으로 사용하게 되었다. 사람과 동물에게 치료용으로 사용하는 양보다 가축의 생장촉진을 위하여 사용하는 항생제 양이 더 많은 때가 있었다. 항생제 과다사용은 인류에게 위험한 결과를 가져올 수 있으므로 1998년 덴마크에서 항생제를 가축생장 촉진제로 사용하는 것을 금지하였다. 유럽연합(2006년), 한국(2011년), 미국(2017년), 중국(2020년)도 유사한 입법을 통과하였다. 동물생장촉진 목적으로 항생제의 사용을 규제는 입법과 제도는 세계적인 추세로 정착되고 있다. 이에 따라 고초균을 포함한 다수의 미생물들이 항생제 대체제로 개발되고 있다. 동물에 사용할 수 있도록 개발된 고초균은 수종에 지나지 않으며 수요는 점점 증가하고 있으므로 효능이 뛰어난 미생물을 개발할 필요가 꾸준히 제기되고 있다.
한편, 바이오 계면활성제로서 항생 효능이 우수한 서팩틴은 기존 항생제를 대체하여 동물생장 촉진제로 사용할 수 있는 가능성이 높은 물질이다. 서팩틴은 3개의 non-ribosomal pepetide synthase(NRPS)에 의해서 4 종류의 아미노산(Glu, Asp, Val, Leu) 7개가 결합하여 고리형태로 연결되고 여기에 12-17개의 탄소기둥(carbon backbone)으로 이루어진 지질산이 결합된 지질다중아미노산(lipopolypeptide)이다. 서팩틴은 고초균인 바실러스 스브틸리스(B. subtillis), 바실러스 프밀루스(B. pumilus), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 라이케니포미스 (B. licheniformis), 바실러스 모자벤시스(B. mojavensis) 등 (Hmidet et al., 2017)에 의해서 생산된다. 상기 고초균에 의해 생산되는 서팩틴은 고초균의 발효조건이 좋아도 대부분 고초균은 배양하는 동안 매우 적은 양의 서팩틴을 생산하므로(Chen et al., 2015), 서팩틴이나 설팩틴을 생산하는 고초균을 가축 성장촉진제로 이용하는데 한계가 있다.
전분 분해효소(amylases), 단백질 분해효소(proteases), 식물세포벽 분해효소(cellulases, hemicelluloses, pectinases, xylanases) 등 다양한 효소들이 다양한 산업에 이용되고 있다. 이런 효소들은 일반적으로 세탁제에 첨가하여 세탁 효능을 높이는 것으로 알려져 있으며, 축산업에서도 동물들의 소화기능을 돕고 사료의 효능을 높이기 위하여 산업용 효소단백질을 사료보조제로도 사용한다. 산업용 효소 단백질들은 일반적으로 곰팡이류에서 많이 생산된다. 그러나 곰팡이에서 생산한 효소들은 사람이나 동물들이 섭취하기에 적합하지 않은 경우가 대부분이므로, 사람 및 동물들이 섭취 가능한 형태로 생산 및 제조할 수 있는 새로운 방법이 필요하다.
종래에 미생물 또는 이의 배양물을 동물성장촉진제 또는 사료 첨가제로 이용한 기술이 알려진 바 있다. 구체적으로, 한국등록특허 제1155158호는 생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스에 관한 것으로, 신규 균주인 서브틸리스 5-B 균주(KCTC 11550BP)는 셀룰라아제, 자일라나아제 및 만나아제를 분비함으로써 가축의 체내에서 분해되기 어려운 성분인 섬유질계 및 반섬유질계 성분을 효율적으로 분해하여 가축 동물의 사료 이용 효율을 높여줄 수 있어 사료 첨가제로 이용 가능성을 제시하고 있다. 그러나 상기 종래 기술에서의 균주는 본 발명에서의 균주와 상이할 뿐 아니라 동물성장 촉진제의 성분으로서 이용가능한 서팩틴, 단백질 분해효소 및 전분분해효소의 생산 기능이 전혀 개시되어 있지 않다는 점에서 본 발명과 차이가 있다.
이에, 본 발명자들은 고전적인 항생제를 대체하고, 동물의 소화를 촉진함으로써 동물의 성장을 촉진하기 위한 새로운 방법을 연구노력한 결과, 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충의 분변으로부터 분리한 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP가 서팩틴 및 소화 효소의 생산능이 우수한 것을 발견하고, 이를 동물성장 촉진제 또는 사료 첨가제로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 서팩틴 및 소화 효소의 생산능이 우수한 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP를 이용한 서팩틴의 생산방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양물을 이용한 동물성장을 촉진시키고, 유해가스를 저감시킬 수 있는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양물을 이용한 사료 첨가용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서팩틴 및 효소를 생산하는 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP를 제공한다.
종래에 다수의 고초균들은 동물과 사람에게 사용할 수 있도록 유익균(이하 ‘프로바이오틱스’, probiotics)으로 개발되어 왔다. 일부는 동물사료에 항생제를 첨가하는 대신 항생제 대체물질로 사용되고 있다. 그러나 일반적으로 고초균은 매우 적은 양의 서팩틴을 생산하기 때문에 이를 항생제 대체물질로 사용하더라도 여전히 다양한 동물(특히, 병아리와 양돈)은 유해한 미생물 감염에 의한 질병(설사병, 치사 등)을 예방하거나 치료하는데 한계가 있었다.
또한, 일반적으로 시장에 통용되는 경제동물의 사료는 옥수수 30% 및 소맥 40%와 콩 25%를 포함하는 전분, 셀룰로오스와 단백질로 이루어진 식물조직으로 구성되어 있다. 이들이 소화가 잘될수록 영양분의 흡수가 많이 되어 동물들의 몸무게 증가율을 높일 수 있으므로, 사료의 효율성이 증가한다. 이에 따라, 종래에는 사료 보조제로서 전분 또는 셀룰로오스의 분해가 용이하도록 아밀라아제 또는 셀룰라아제를 사용하였으나, 이들은 위장에서 쉽게 파괴되어 소장까지 도달하기 어려워 소화 효능을 최대로 발휘하기 어렵다는 한계가 있었다.
이에, 본 발명자들은 고전적인 항생제를 대체하고, 동물의 소화를 촉진함으로써 동물의 성장을 촉진하기 위하여 서팩틴 및 효소의 생산능이 우수한 균주를 분리 동정하기 위하여 연구노력한 결과, 흰점박이꽃무지 유충의 분변으로부터 고초균들을 분리하고, 이들의 유화능력을 비교하여 유화능력이 탁월한 균주들 중에서 식물유래 영양분 분해효소 생산능이 우수한 균주를 최종적으로 선별하여, 이에 대한 전장 유전체 염기서열 및 유전자 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 선별된 균주의 전장 유전체 염기서열을 NCBI의 “GenomeProject database"에 등록하였다. 또한, 선별된 균주를 신규 미생물로서 “바실러스 서브틸리스 ps4100”라 명명하고, 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2021년 6월 15일자로 기탁하였고 기탁번호 KACC81159BP를 부여 받았다.
본 발명의 일 실시예에서 선별된 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP의 전장 유전체의 염기서열은 PacificBioscience long reads sequencing 방법으로 200 배수를 읽은 다음 이 시퀀스들을 연결하여 전장유전체를 결정하였다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP에 있어서, 상기 효소는 동물의 소화를 돕는 소화 효소일 수 있으며, 예컨대 다당류 분해 효소, 단당류 분해효소, 이당류 분해효소, 올리고당 분해효소, 단백질 분해효소 및 지방 분해효소일 수 있으며, 바람직하게는 단백질 분해 효소 또는 다당류 분해 효소인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP에 있어서, 상기 다당류 분해 효소에서 다당류는 덱스트린, 덱스트란, 전분, 글리코젠 및 셀룰로오스일 수 있으며, 바람직하게는 전분 또는 셀룰로오스인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332)보다 서팩틴 생산능이 2배, 바람직하게는 1.5배 내지 5.5배 높은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP를 배양하여 생성된 침전물(건조상태)에 포함된 순수한 서팩틴의 함량은 최대 60%인데 반해 아종인 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332)를 배양하여 생성된 침전물(건조상태)에 포함된 순수한 서팩틴의 함량은 최대 25%에 불과하였다. 또한, 순수한 서팩틴의 양은 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP이 ATCC21332보다 약 2배 정도 높은 것을 확인하였다(실험예 3 참조). 이러한 결과는 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP이 종래의 바실러스 서브틸리스 균주들보다 서팩틴 생산능이 현저히 우수함을 보여준다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서팩틴을 생산하는 아종인 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332)보다 단백질 분해효소 생산량이 2배 이상, B. subtilis pb2441보다 5배 이상 높은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP를 배양하여 분비된 단백질 분해효소의 양은 최대 8.84ug/ml인대 반해 아종인 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332)를 배양하여 분비된 단백질 분해효소의 양은 최대 3.57ug/ml이고, B. subtilis pb2441를 배양하여 분비된 단백질 분해효소의 양은 최대 3.93 ug/ml에 불과했다(실험예 4 참조). 이러한 결과는 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP이 종래의 바실러스 서브틸리스 균주들보다 단백질 분해효소 생산능이 현저히 우수함을 보여준다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서팩틴을 생산하는 아종인 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332) 및 B. subtilis pb2441보다 다당류 분해효소 생산량이 2배 이상 높은 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100를 배양하여 분비된 다당류 분해 효소(전분 분해효소, 셀룰로오스 분해효소) 양은 아종인 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332) 및 B. subtilis pb2441를 배양하여 분비된 단백질 분해효소의 양보다 2배 이상 높은 것을 확인하였다(실험예 5 및 6 참조). 이러한 결과는 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP이 종래의 바실러스 서브틸리스 균주들보다 다당류 분해효소 생산능이 현저히 우수함을 보여준다.
본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 아종인 바실러스 서브틸리스 균주(B. subtilis ATCC21332) 및 B. subtilis pb2441와 다르게 생장하는 동안에 다당체(polysaccharides)를 분비한다. 이러한 다당체는 동물의 면역을 증강시키는 것으로 알려져 있으며, 서팩틴의 생산량과 관련있다. 구체적으로, 고초균의 성장과 서팩틴 생산의 관계를 규명한 연구결과에 따르면 바이오 매스가 높아지면 코럼센싱(quorum sensing)에 의해 스포어가 만들어져 서팩틴 생산이 중단된다. 즉, 배양에 의해 바실러스 서브틸리스의 수가 증가되면서 이들이 생산하는 서팩틴의 함량이 일시적으로 증가한다. 그러나 자신들이 생산한 서팩틴과 단백질 분해효소와 같은 1차 및 2차 대사산물들이 배지에 누적되어 바실러스 서브틸리스가 생장하기 어려운 환경이 되면서 포자가 형성되며 서팩틴의 생산이 중단 혹은 감소한다. 서팩틴 생산을 중단한 개체는 다시 환경이 호전되더라도 뒤집을 수 없는 상태(irreversible state)로 변하여 서팩틴 생산이 재개되지 않는다. 본 발명의 고초균들은 각각 다당체로 분리되어 코롬센싱이 늦게 일어날 가능성이 있다. 이러한 측면에서 본 발명의 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100의 다당체 물질은 서팩틴의 생산을 향상시킬 수 있는 중요한 특징이 된다.
구체적으로 본 발명의 실험예에 따르면, 본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100는 일반적으로 미생물들이 잘 자라지 못하는 55℃ 고온에서 전분이 있으면 왕성하게 생장한다. 특히 ATCC21332는 37℃에서 왕성하게 자라지만 55℃에서는 성장속도가 떨어지는 사실과 반대로 본 발명의 ps4100는 55℃에서 37℃보다 더 왕성하게 자란다. 이 특성을 이용하면 고체배지를 이용하여 동물사료 보조제를 만들 때 감염성 박테리아와 곰팡이들의 오염을 쉽게 막을 수 있다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제1항의 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP을 고체배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 단계; (b) 상기 콜로니를 액체배지에 접종 및 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양액을 원심 분리한 후, 침전물로부터 서팩틴을 수득하는 단계를 포함하는 서팩틴의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 서팩틴의 생산방법에서, 상기 (b) 단계에서 콜로니가 접종된 액체배지에 거품을 발생시키고, 발생된 거품으로부터 서팩틴을 수득하는 방법을 이용하여 서팩틴을 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 25℃ 내지 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양 온도가 25℃ 미만일 경우 균주의 자라는 속도가 느려지는 문제점이 발생할 수 있고, 배양 온도가 42℃ 초과할 경우 균주가 자라지 않는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 배양 시간이 24시간 미만일 경우 콜로니가 충분히 자라지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 48시간 초과할 경우 균주들의 콜로니가 서로 뭉쳐 플레이트를 완전히 덮고 균주가 늙어지는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 배양은 28℃ 내지 42℃에서 45시간 내지 60시간 동안 수행하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양 온도가 28℃ 미만일 경우 균주가 충분히 자라지 않아 서팩틴 생산량이 감소하는 문제점이 발생할 수 있고, 배양 온도가 42℃ 초과할 경우 균주의 성장이 멈추는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 배양 시간이 45시간 미만일 경우 배양액에 포함된 영양분을 충분히 이용하지 못하므로 서팩틴 생산율이 감소하는 문제점이 발생할 수 있고, 60시간 초과할 경우 서팩틴 생산량은 증가하지 않는데 시간과 전력을 낭비하는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 서팩틴의 생산방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 액체배지는 글루코오스(Glucose), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(peptone), 제2인산칼륨(K2HPO4), 염화나트륨(NaCl), 탄산나트륨(Na2CO3) 및 황산마그네슘(MgSO4)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 탄소원인 글루코오스 대신 수크로오스(sucrose)를 사용할 수 있으며, 질소원으로서 펩톤 대신 암모늄을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물성장 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 실험예에 따르면, 본 발명의 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서팩틴 및 소화효소를 생산하는 능력이 현저히 우수하므로, 본 발명에 따른 신규 균주 또는 이의 배양액을 동물 성장 촉진용 또는 사료 첨가용 조성물로 매우 적합하다.
본 발명의 동물성장 촉진용 조성물 또는 사료 첨가용 조성물에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 비타민 C, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 동물성장 촉진용 조성물 또는 사료 첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 부형제를 포함할 수 있다. 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 동물성장 촉진용 조성물 또는 사료 첨가용 조성물이 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 신규 미생물 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서팩틴, 소화 효소의 생산능이 우수하므로, 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양물을 동물의 성장을 촉진시키고 장내미생물에 의해 발생하는 유해가스의 발생을 저감시키기 위한 용도로 이용 가능하다.
도 1은 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP의 계통수를 나타낸다(도 1a: 16S rDNA 를 이용하여 Maximumlikelyhood 방법으로 만든 계통수, 도 1b: 720 개 orthologs 아미노산 서열을 이용한 계통수. 도 1c: Bootstrap value 0.5 이하 nodes를 제거한 계통수).
도 2는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP의 영양세포(vegetative cells)와 포자 (spores)를 보여주는 도면이다(도 2a: 고체배지에서 자란 영양세포, 도 2b: 액체배지에서 자란 영양세포, 도 2c, 도 2d: 포자생성배지에서 자라 만들어진 포자세포).
도 3은 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP과 다른 고초균의 전장유전체의 구조를 비교한 도면이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP의 성장 속도를 37℃ 및 55℃에서 비교한 결과이다(x-축: day, y-축: 콜로니의 크기를 나타내는 지름길이).
도 5는 서팩틴 생산량을 비교한 결과이다(도 5a: 생성된 침전물의 무게 (mg), 도 5b: 침전물에 섞여 있는 서팩틴의 상대적인 양 (%), 도 5c: 서팩틴의 양 (mg)).
도 6은 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP가 생산한 서팩틴을 정성분석한 결과이다.
도 7은 액체배지에서 배양하는 동안 단백질 분해효소 분비량을 비교한 결과이다(도 7a, 도 7b: clear zone의 넓이, 도 7c 내지 도 7e: 단백질 분해효소의 양).
도 8은 전분 분해효소의 분비량을 비교한 결과이다(도 8a: clear zone의 넓이, 도 8b: 전분 분해효소의 양).
도 9는 셀룰로오스 분해효소의 분비량을 비교한 결과이다(도 9a: clear zone의 넓이, 도 9b, 도 9c: 셀룰로오스 분해효소의 양).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
2021년 산학융합 R&D 지원사업에서 충북산학융합센터로부터 지원받아 "고초균을 이용한 동물사료보조제 시제품 생산과 서팩틴의 항진균 및 항균효능 검사개시"에 대한 연구를 진행하였다.
실시예 1: 미생물의 분리
흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충의 장내세균을 조사하기 위하여 제 3령 유충의 분변을 채취하였다. 유충은 충청남도 태안군 태안읍에서 채집하였으며 유충을 발효한 톱밥을 먹이로 공급하면서 유지하였다. 이렇게 사육하면서 생산된 분변을 증류수에 희석하여 80℃에서 15분간 열처리한 후에 LB agar 배지가 굳혀진 지름 15mm 플레이트에 펴고 섭씨 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양을 마친 플레이트에는 100개 이상의 박테리아 집락들(colonies)이 나타났으며 이들을 새로운 플레이트에 0.5~1cm 간격으로 개별적으로 접종하여 순수 분리하였다.
실시예 2: 신규한 바실러스 서브틸리스 균주의 분리
LB agar 배지 플레이트에 상기 실시예 1에서 잘 분리된 박테리아 집락을 개별적으로 플레이트당 20-40개 옮기고 30℃에서 16~48시간 배양하였다. 배양 후 집락들이 자란 플레이트에 콩기름을 분사하여 계면활성제를 분비하는 스트레인들을 선별하였다. 이때 계면활성제를 분비하는 집락의 주위에는 동그랗게 투명한 부분이 생기며, 계면활성제의 양이 많을수록 투명한 부분이 넓게 나타난다. 분리한 각 균주를 50ml LB를 담은 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에 접종하고 교반기 위에서 200rpm 속도로 흔들면서 섭씨 30℃를 유지하면서 48시간에서 72시간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 미생물을 제거하고 남은 배양액을 water drop-collapse 방법으로 테스트하였다. 추가적으로 확인하는 실험에서는 상층에 남은 배양액을 0.45μm 필터를 통과하여 균주와 균주 찌꺼기를 완전히 제거하였다.
Water drop-collapse assay는 다음과 같이 실시했다. 기름을 발라 놓은 96웰 플레이트의 각 웰에 미생물 배양액을 한 방울 떨어뜨렸다. 계면활성제가 포함되지 않은 배양액은 수성으로 기름 위에 물방울형태로 남아 있으나, 계면활성제가 포함된 배양액은 기름과 섞여 물방울이 넓게 펴진다. 상기와 같은 실험을 통하여 기름으로 형성된 막 위에서 배양액 물방울이 기름과 잘 섞이도록 하는 균주들을 선발했다.
1차적으로 선발된 미생물들 중에서 검정 실험을 통하여 배양한 액체의 유화능력이 가장 탁월한 균주를 선별하였다. 이 실험에서는 초기 발견실험에 미네랄 오일을 사용하였으며 추가적으로 확인 검증하는 실험에서는 미네랄 오일과 콩기름을 사용하였다. 96웰 플레이트의 직경은 8mm이며 깊이는 30mm이다. 각 웰에는 7ul의 오일을 넣고 24시간 실온에 보관하였다. 그 후에 배양액 20ul를 주사바늘 혹은 파이펫을 통하여 조심스럽게 각 웰에 떨어뜨렸다. 컨트롤 실험으로 배양액 대신 증류수를 사용하였다. 배양액을 넣어주고 1분이 경과한 후 배양액 방울이 변하는 정도를 눈으로 가늠하였다. 모든 실험은 최소한 3회 반복하였다.
실시예 3: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 16S rRNA 시컨스를 통한 동정
상기 실시예 2에서 선별된 균주는 현미경으로 관찰했을 때 고초균으로 추정되었으며, 분자생물학적인 방법으로 동정하기 위해 16S rRNA의 1600개 핵산의 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 결정하기 위하여 균주를 LB agar 플레이트에서 24시간 배양하였다. 배양된 집락을 엘리쿼트에 넣고 증류수로 씻은 후 95℃에서 15분간 열처리한 후 원심분리하여 세포찌꺼기를 제거하고, 상층액을 PCR용 주형(template) DNA로 사용하였다. PCR 증폭을 위해 DNA 중합효소(DNA polymerase)를 매뉴얼에 기록된 대로 사용하였다. 간단히 서술하면 타카라 폴리머레이즈(TaKaRa polymerase)로 94℃에서 1분 변성(denaturation)이후, 94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 1분 동안 30 사이클 증폭하였으며, 마지막으로 72℃에서 3분간 연장 반응을 시행했다. 증폭된 16S rRNA는 1% 아가로스겔(agarose gel)에서 전기영동으로 확인했으며, PCR purification kit로 DNA를 정제하여 바로 시컨싱 주형(template)로 이용하였다. 16S rRNA 증폭을 위해 forward primer(앞쪽 프라이머) Bac27F 5'-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'(서열번호 4)와 reverse primer(뒤쪽 프라이머) 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 5)를 이용하였다. 상기 핵산 염기서열을 BlastN 방법으로 공용 데이터베이스에 등록된 박테리아들과 비교했다. 그 결과, 표 1과 같이 PCR을 통하여 획득한 16S rRNA의 시컨스(서열번호 2)는 NCBI에 등록된 B.subtilis 16S rRNA 시컨스와 100% 동일하였다.
서열번호 2(바실러스 서브틸리스 ps4100의 16S rRNA 핵산 염기 서열)
gtagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaataggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgcccgcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgggtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgt
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 ITS 시컨스를 통한 동정
박테리아 종안에서 아종을 구분하거나 균주간의 차이를 구분하기 위하여 돌연변이 고정율(mutation fixation rate)이 높은 Internal transcribed spacer (ITS) 시컨스를 사용한다. ps4100 균주의 16S rRNA 시컨스는 B. subtilis와 동일하였으므로, 알려진 균주와의 차이를 확인하기 위해 ITS 시컨스를 확인했다. PCR을 사용하여 ITS를 증폭할 때 16S_1094F 5'-CAGCTCGTGTCGTGAGATGT-3'(서열번호 6)와 23S_197R 5'-TCCTCCGGGTACTTAGATGTTT-3'(서열번호 7)를 사용하여 40초간 신장 반응(enlongation reaction) 시행했으며, 다른 조건은 16S rRNA를 증폭하는 방법과 동일했다. 시컨싱은 PCR에 사용했던 프라이머들을 사용하였다.
서열번호 3 (바실러스 서브틸리스 16S rRNA, internal transcribed spacer (ITS), 23S rRNA sequence
TTTTTCGAGTGT1TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTA2AGGATATTATACGGAATATAAGACCTTGGGTCTTATAAGCAGAACGTTCCCTGTCTTGTTTAGTTTTGAAGGATCATTCCTTCGAAACGTGTTCTTTGAAAACTAGATAACAGTAGACATCACATTCAATTAGTAACACAAGATATCACATAGTGATTCTTTTTAACGGTTAAGTTAGAAAGGGCGCACGGTGGATGCCTTGGCACTAGGAGCCGATGAAGGACGGG3ACGAACACCGATATGCTTCGGGGAGCTGTAAGCAAGCTTTGATCCGGAGATTTCCGAATGGGGAAACCCACCACTCGTAATGGAGTGGTATCCATATCTGAATTCATAGGATATGAGAAGGCAGACCCGGGGAACTGAAACATCTATTCCCCC4
1 = 16S priming site, 2 = 16S rRNA 3’ end sequence, 3 = 23S rRNA 5’ sequence, 4 = 23S rRNA priming site. Internal trascribed spacer (ITS) sequence 는 16S와 26S rRNA gene 사이에 있다.
이 부위의 염기서열도 GenBank에 등록된 B. subtilis 의 시컨스와 동일했으며 B. subtilis 중에서도 아종 (subspecies) subtilis로 확인된 15개 균주와 동일했다. 이 아종들이 발견된 장소는 식물조직, 토양, 해안-침적토, 된장을 포함한 발효물질과 같이 다양하다. 이들은 항생제 효능 혹은 식물병의 원인인 특정한 진균에 대한 항진균제 효능을 보이는 2차 대사산물을 생산하는 것으로 나타났다. 16S rRNA와 ITS 시컨스의 염기서열로 보아 곤충의 소화기관에서 유래한 ps4100 균주는 Bacillus subtilis 중에서, 서팩틴을 다량 합성하여 방출하는 아종인 subspecies subtilis (이하 Bacillus subtilis subsp. subtilis)로 확인되었다.
실시예 5: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 전장 유전체 염기서열 해독
ps4100이 이미 밝혀진 균주들과 다른 점을 증명하기 위해서 전장유전체를 비교해야 할 필요가 있었다. 균주를 LB broth에서 24시간 배양한 후 균주의 DNA를 GeneElute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라서 분리하였다. 간단히 균주를 키운 배양액 1.5ml을 원심분리 방법으로 모았다. 이 균주 펠렛에 180ul 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 넣어 세포를 풀어준 후 20ul 단백질분해효소 K(ProteinaseK) 용액을 넣고 섞는다. 55℃에서 10분 동안 숙성한 후 200ul 에탄올을 넣어 섞고, 미리 준비된 칼럼에 세포가 깨진 용액을 옮겨 원심분리 방법으로 DNA를 추출하였다. 이렇게 추출된 DNA는 디엔에이 링크에서 PacBio의 bacterial genome sequencing kits의 프로토콜을 따라서 라이브러리를 만들어 시컨싱하였다. 전장유전체를 200회 염기서열을 읽은 후 알려진 알고리듬(Koren et al., 2013)을 사용하여 전장유전체의 지도를 완성하였다. 전장유전체의 지도는 NCBI의 GenomeProject database"에 등록 (SubmissionID: SUB9765542, BioProjectID: PRJNA733820, accession ID: CP076445) 하였다.
실시예 6: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 계통수 설립
위에서 기술한 16S rRNA는 ps4100를 대표하지 못할 가능성이 있으므로 전장유전체에 있는 모든 rRNA 시컨스들을 확인하였다. ps4100 균주의 전장유전체 안에는 길이가 1547nt인 16S rRNA가 10회 반복되어 있었으며 이들의 염기서열은 4가지로 구별되었다. 네 가지 시컨스들은 매우 유사하며 1547nt에서 변이는 4곳에서만 나타났으며 최대 차이는 1547nt 중에서 3염기의 차이밖에 없었다. ps4100외 타 바실러스 균주들의 게놈에 들어있는 rRNA의 시컨스 정보를 NCBI database에서 추출하였다. 타 균주들도 염기서열이 다른 rRNA를 다수 보유하고 있으며 염기서열이 다른 시퀀스들을 모두 포함하였다. ps4100에 들어 있는 9가지 염기서열을 포함하는 고초균들의 rRNA의 시컨스들을 MEGA software를 이용하여 align하고 계통수를 만들었다(Kumar et al., 2018).
그 결과, 도 1a에서 확인할 수 있듯이 ps4100에 들어있는 4가지 rRNA는 모두 계통수상에서 B. subtilis 균주들과 섞여서 나타났다. 구체적으로, ps4100 균주의 전장유전체에 들어 있는 10개 rRNA 중에서 시컨스의 차이를 보이는 4가지 rRNA 염기서열과 다른 균주에서 선정한 다수 염기서열을 포함하여 제작된 계통수를 보면 ps4100 균주가 Bacillus subtilis로 확인되었다.
ps4100을 좀 더 정확하게 동정하기 위하여 도 1b와 같이 상동 단백질 유전자 728개를 이용하여 계통수를 제작하였다. 구체적으로 Bacillus subtilis를 대표하는 12개의 균종들을 NCBI database에서 download 받아 PGAP를 이용하여 annotation을 수행했다(Tatusova et al., 2016). 상동 단백질들은 CD-HIT를 이용하여 다음과 같은 조건에 맞을 경우에 선별하였다(Fu et al., 2012). 1) 아미노산 서열의 길이가 가장 긴 시컨스에 비해 최소한 90%이상이며, 2)이 영역안에 아미노산들이 70% 이상 동일하며, 3)전장유전체 시컨스가 가용한 12개 균주와 ps4100 균주에 모두 존재하는 728개 유전자를 선별하였다. 이 유전자를 모두 이용하여 MEGA 프로그램으로 계통수를 재구성하였다(Kumar et al., 2018).
도 1b에서 확인할 수 있듯이 ps4100, ATCC21332, pb2441, OH131의 관계가 명확하게 나타났으며, ps4100는 알려진 B. subtilis sub species subtilis중에서 ATCC21332 및 알려진 균종과 다르며 OH131과 가장 유사한 균종으로 판명되었다(도 1b, 도 1c).
실시예 7: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 생화학적 특성
8 균주들의 전장유전체에 들어있는 유전정보들을 분석을 통해 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 G+C 함량, 단백질의 수, 리보솜RNA 오페론의 수, t-RNA를 확인하였다. 전장유전체의 G+C 함량은 전장유전체를 어셀블할 때 사용한 알고리듬(Koren et al., 2013)으로 계산하였으며, 단백질에 대한 정보를 담은 유전자들은 GeneMark.HMM(Besemer et al., 2001) 패키지를 이용하여 4,068개 유전자를 예측하였다. 전장유전체에 산재되어 있는 tRNA는 tRNA-Scan (Schattner et al., 2005)이라는 패키지를 사용하여 발굴하였는데 총 86개가 있는 것으로 확인되었다. 라이보소옴 RNA는 RNAmmer(Lagesen et al., 2007)로 발굴하였으며 총 30개 10개 rRNA 오페론으로 이루어진 사실이 확인되었다(표 3). 그 결과, 하기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 전장유전체의 길이, G+C 함량, 단백질의 수, 리보솜RNA 오페론의 수, t-RNA 수 모두 ps4100 균주는 다른 고초균 종(species)들 보다 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)와 유사한 것으로 확인되었다.
Features B. amyloliquefaciens MT45 a B. amyloliquefaciens DSM7T a B. velezensis FZB42 a B. licheniformis DSM13T a B. pumilus SAFR-032 a B. cereus ATCC14579T a B. subtilis 168 a B. subtilis pb2441 B. subtilis ps4100
Accession NZ_CP011252.1 NC_014551.1 NC_009725.1 NC_006322.1 NC_009848.4 NC_004722.1 NC_000964.3 CP068982 CP076445
Genome size (bp) 3,897,521 3,980,199 3,918,589 4,222,645 3,704,641 5,411,809 4,215,606 4,288,724 4,106,342
G+C content (%) 46.09 46.08 46.48 46.19 41.29 35.28 43.51 43.46 43.78
CDS 3,752 3,870 3,687 4,223 3,598 5,210 4,328 4,328 4,068
rRNA 24 30 29 24 21 42 30 30 30
t-RNAs 81 94 88 72 72 108 86 86 86
전장유전체 길이 = Genome size (bp), G+C 함량 (%) = G+C content (%), 단백질 유전자 수 = number of protein-coding sequences (CDS)
실시예 8: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 형태학적 특성
LB agar 플레이트에서 자란 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 콜로니는 외형적으로 보았을 때 동그란 형태로 도움을 형성하며 16시간 이상 배양하면 다당체가 분비되어 빛을 반사하며 콜로니들이 쉽게 합쳐져 진한 콧물처럼 흐르며 끈적인다. 콜로니 수가 많을 경우에는 플레이트 전체를 고르게 덮으며 걸쭉하게 흘러내린다. 현미경으로 관찰하면 고체배지에서 자라거나 액체배지에서 자라거나 성장과 대사를 활동적으로 진행하는 영양세포(vegetative cells)는 막대형이다 (도 2a: 고체배지에서 자란 세포; 대부분 영양세포이지만 다수의 포자들이 까만 점으로 몇 개 보인다, 도 2b: 액체배지에서 자란 세포; 모두 영양세포만 보인다). 영양분 부족, 세포밀도 증가, 대산-산물 농도 증가와 같은 조건 때문에 생육환경이 나빠지면 포자(spores, 스포어)를 형성한다. 일반적인 배지에서 배양하면 조건이 나빠져도 10% 미만의 세포만 포자로 변하며, 포자생산용 배지로 배양하면 특별한 조건하에서 ~100% 세포들이 포자를 형성한다. 동물사료 보조제 또는 동물 질병예방을 위한 약으로 사용하기 위하여 알려진 포자 생산방법을 사용하면 ps4100은 영양세포들이 ~100% 포자로 변한다(Berikashvili et al., 2018; Monteiro et al., 2014), 도 2c, 도 2d 영양세포는 없으며 모두 포자만 보인다).
실시예 9: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 신규성
ps4100은 rRNA 오페론의 시컨스로 보면 다른 B. subtilis sub. subtilis와 차이점이 없으나 전장유전체의 길이와 전장유전체에서 유전자들의 배치(macrosyntany)를 보면 기존에 알려진 B. subtilis들과 확연히 다르다(도 3). ps4100은 알려진 균종들 중에서 유전체의 길이와 유전자들의 배치 형태가 동일한 경우가 없는 신규 균주이다. 예를 들어, 시컨스와 게놈의 구조가 가장 비슷한 B. subtilis strain 168과 비교해보면 게놈의 사이즈가 109,264nt 더 짧다. ps4100은 본 발명자들에 의해 서팩틴을 생산하는 것으로 확인한 B. subtilis pb2441의 전장유전체보다도 182,382nt 짧다. 매크로 신테니는 비슷하지만 게놈의 중간부위에 ps4100에만 있는 유전자들이 있는 사실이 확연하게 보인다(도 3). Bacillus subtilis strain pb2441과 ps4100에 각각 유일하게 존재하는 즉 한 스트레인에는 있지만 다른 스트레인에 없는 유전자들이 있는데 이런 부분은 커다란 공백으로 표시되었다. 2022년 4월 30일까지 NCBI database에 기록된 스트레인 중에서 동일한 균종이 없었다.
실험예 1: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주 배양과 서팩틴 분리
바실러스 서브틸리스 ps4100 균주는 엘비아가(LB agar) 고체배지에 접종하여 25~37℃ 배양기 안에서 24~48시간 배양하여 바로 액체 배양액에 접종하거나, 4℃에 1달까지 보관하면서 사용한다. 고체배지에서 적당히 자란 콜로니 하나 혹은 다수를 하기 표 4의 다섯 가지 액체배지에 접종하여 진탕-배양기 안에서 30℃를 유지하며 180-240rpm으로 흔들면서 48-72시간 동안 배양한다.
액체배양액에 균주를 비교적 정확한 양으로 접종하려면 정량적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 콜로니를 멸균수에 풀어 준 다음 스펙트로 포토메터 (UV-vis Spectrophotometer, Mecasys, Korea)를 이용하여 600nm의 흡광분도 (OD600nm) 0.8~1.5로 희석하여 50ml 배지에 1ml을 접종하는 것과 비슷하다. 균주를 더 접종해도 되며, 서팩틴 생산량은 접종양에 크게 영향을 받지 않는다.
구체적으로, ps4100 균주는 250ml 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 50ml 배지를 넣고 진탕 배양기 안에서 30℃를 유지하며 200rpm으로 흔들면서 48시간 배양하였다. 배양이 끝나면 배양액을 깨끗한 튜브에 옮기고 8,000g에서 10분동안 원심분리하고 30ml 상등액을 깨끗한 튜브에 옮겼다. 상등액에 6M 염산 (HCl)을 넣어 pH 2.0으로 보정한 후 4℃에서 16시간 숙성한 후 8,000g에서 15분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 농축된 남은 침전물을 정제되지 않은 서팩틴이라 한다. 농축된 서팩틴 침전물을 동결 건조하여 10mg을 1ml 100% 메탄올에 녹였다. 서팩틴의 양은 HPLC를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
배지 1 배지 2 배지 3 배지 4 배지5
Sucrose - 15g - 15g
Glucose 6g - 6g - 40g
Yeast extract 8g 8g 5g 5g 5g
peptone - - 10g 10g 10g
K2HPO4 2.5g 2.5g 2.5g 2.5g 2.5g
NaCl 1.5g 1.5g 1.5g 1.5g 1.5g
Na2CO3 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g
MgSO4 1g 1g 1g 1g 1g
서팩틴 생산량 (g/l로 환산) <0.1g <0.1g 0.1 g 0.1 g 2.0g
실험예 2: 바실러스 서브틸리스 ps4100의 성장률
ps4100의 성장속도를 고체배지에 배양하면서 세계적으로 실험종으로 많이 사용하는 아종인 B. subtilis ATCC21332 및 본 발명자들이 발굴한 아종인 B. subtilis ps4100과 비교해 보았다. 고체배지는 아가(agar)에 Luria-Bertani (LB), 1% starch with 1/4 x LB, 1% skim milk, 1% methyl-cellulose with 1/4 x LB, 0.3% pectin with 1/4 x LB, 1% xylan with 1/4 x LB를 넣어서 만들었다. 동일한 양을 파이펫 끝으로 접종한 후 24-96시간 배양하면서 박테리아 집락의 크기를 비교하였다.
ps4100은 pb2441과 24시간 마다 집락의 크기를 지름의 길이로 비교하였을 때 절대적인 집락 크기가 약 2배 이상 클 뿐 아니라 자라는 속도도 2배 정도 빨랐다(도 4). 즉, 서팩틴은 pb2441과 비슷하거나 조금 더 많이 생산하지만 LB를 포함한 대부분의 배지에서 자라는 속도는 현저하게 차이를 보였다. ATCC21332와 비교하면 대부분의 배지에서 자라는 속도가 비슷하였지만, 1% 전분이 들어있는 배지에서는 ps4100가 pb2441보다 빨리 자랐다. 특히, 55℃에서는 pb2441은 전혀 자라지 못하였지만, ps4100은 잘 자랐으며 ATCC21332보다도 조금 빠른 것으로 나타났다. 즉, 자라는 속도는 ATCC21332는 대부분의 배지에서 비슷했지만 서팩틴 생산량은 2-5배 많았다.
실험예 3: 바실러스 서브틸리스 ps4100 균주의 서팩틴 정성분석
ps4100 균주는 250ml 엘렌마이어 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 50ml 5번 배지(표 4)를 넣고 진탕 배양기 안에서 30℃를 유지하며 200rpm으로 흔들면서 60시간 배양하였다. 배양이 끝나면 35ml 배양액을 고속회전용 병에 옮겨 8,000g에서 10분동안 원심분리 하였다. 상등액을 깨끗한 튜브에 옮긴 후 상등액에 33% HCl을 넣어 pH 2.0으로 보정하였다. pH를 보정한 상등액을 4℃에서 >16시간 숙성한 후 12,000g에서 30분 동안 원심분리 하였다. 2차 상등액을 버리고 남은 농축된 서팩틴 침전물을 동결건조한 후 10mg을 1ml 100% 메탄올에 녹여 HPLC를 이용하여 서팩틴의 양과 침전된 대사산물을 분석하였다. HCl을 첨가하여 생성된 침전물의 무게(도 5a)와 침전물에 섞여 있는 서팩틴의 상대적인 양을 %로 환산하고 (도 5b), 서팩틴의 양(도 5c)을 나타내었다.
그 결과 도 6에서 나타내는 바와 같이, ps4100에 의해 생성된 서팩틴은 시그마 알드리히에서 구입한 표준 서팩틴(standard surfactin)과 비슷하게 분자량이 14씩 증가하여 -CH2가 하나씩 증가하는 양상을 보였다. ps4100에 의해 생선된 서팩틴이 시그마에서 구입한 스탠다드와 아종인 B. subtilis ATCC21332가 생산하는 서팩틴에 비해 지질꼬리가 긴 C-형 (m/z 1036) 분자들이 꼬리가 짧은 A-형 (m/z 1008)과 B-형 (m/z 1022) 분자들 보다 상대적으로 많이 포함되어 있다. 서팩틴의 HPLC-프로파일은 ps4100-서팩틴과 pb2441-서팩틴이 구분하기 어려울 만큼 비슷했지만 정제하기 전에 침전물에서 상대적인 농도가 높았다 (도 6 서팩틴 HPLC chart 비교). ATCC21332 균주가 생산하는 서팩틴은 표준 서팩틴과 프로파일이 비슷한데 반해 본원발명의 ps4100가 생산하는 서팩틴은 B-형의 피크조합의 수가 많으며 주요 피크의 패턴도 이들과 확연히 상이하다.
실험예 4: 바실러스 서브틸리스 ps4100의 단백질 분해효소 분비량
단백질을 다량 포함하고 있는 우유는 탄소와 질소를 동시에 공급할 수 있으며 성장에 필요한 영양분을 충분히 함유하고 있다. 다만 우유를 사용하기 전에 단백질 분해효소들을 분비하여 소화해야만 영양분을 흡수할 수 있다. 지방을 제거한 우유(탈지분유, skim milk)를 주 영양원으로 한 배지에서 3.5일간 자란 집락의 지름을 비교한 결과, 집락의 크기가 작아서 ps4100은 아종인 B. subtilis ATCC21233와 차이를 구분하기 힘들었다. 단, 동그랗게 투명해진 부분, 즉 탈지분유가 분해된 부분은 pb2441보다는 크게 나타났다. 1주일이상 계속 배양하면 다른 균종들은 자라지만 ps4100 균종은 집락이 커지는 속도가 늦어져 다른 균종들보다 훨씬 집락이 작은 상태로 남아있으나, 단백질 분해효소 생산 효율을 보여주는 투명한 부분은 매우 넓게 나타난다.
탈지분유 1%를 아가 플레이트에 포함시키면 불투명한 우유 빛을 띄는데 분유가 분해되면 투명하게 변하게 된다. 아가플레이트에서 투명해진 부위(clear zone)의 넓이는 간접적으로 분유를 분해하는 효소들, 특히 단백질을 분해하는 효소들이 분비된 양을 간접적으로 나타내 준다. 투명해진 부위의 지름은 3.5일간 배양한 후에 비교했을 때 pb2441보다 3.5배 길었으며 ATCC21332보다는 약간 길었다 (도 7a, 도 7b).
또한, 탈지분유 (skim milk)를 주 영양원으로 이용하여 액체배지에서 배양하면서 분비되는 단백질 분해효소의 양을 113시간 추적 조사한 결과 pb2441보다는 최대 10배 이상, ATCC21332보다는 최대 2배 이상 더 발현되는 것으로 확인되었다 (도 7c, 도 7d, 표 5).
배양시간 (hr) 단백질 분해효소 양 (ug/ml)
ATCC21332 pb2441 ps4100
16 2.76±0.06 1.32±1.15 3.19±0.17
20 3.09±0.34 3.93±1.77 4.00±0.55
24 2.49±0.17 0.96±0.76 5.17±0.62
40 3.40±0.17 0.34±0.16 6.73±0.35
72 3.57±0.29 0.37±0.49 8.84±0.26
91 3.44±0.49 0.94±0.42 7.92±0.07
113 2.86±0.21 0.41±0.44 7.29±1.17
137 2.92±0.41 0.21±0.14 5.17±0.32
실험예 5: 바실러스 서브틸리스 ps4100의 전분 분해효소 분비량
전분 1%를 포함한 1/4 x LBA 고형배지에 각 균종을 접종하고 37˚C에서 24시간배양한 고 콩고레드(Congo Reds)를 이용하여 전분분해 정도를 알아보았다. ps4100이 다른 균종보다 전분을 많이 분해한 사실을 맑은 색으로 변한 동그란 부분(clear zone)으로 확인되었다(도 8a). 균종에서 발현되는 전분분해 효소의 양을 액체배지에서 측정하는 실험을 했다. 전분을 5%포함한 50ml 1/4 x LB 액체배지에 ps4100, pb2441, ATCC 21332를 각각 접종하고 260rpm으로 흔들면서 37˚C에서 배양하면서 세포의 성장을 43시간 추적하였다. 동시에 배지 내에 남아있는 포도당의 양과 각 균종에서 분비되어 배지에 남아있는 아밀라아제의 양을 측정하였다. 세포는 접종 후 10시간 동안 기하급수적으로 증가하여 10시간 후에 안정기에 이르렀다(도 8b 점선). 아밀라아제는 접종한 초기에 적은 양 발현되다가 세포가 기하급수적으로 자라는 시기에는 발현양이 증가하며 안정기에 최고로 발현하여 계속 유지된다(도 8b 실선). 아밀라아제의 발현양은 ps4100 > ATCC21332 > pb2441 순으로 ps4100이 가장 높았으며 통계적으로 유의미한 것으로 확인되었다.
실험예 6: 바실러스 서브틸리스 ps4100의 셀룰로오스 분해효소 분비량
물에 녹지 않는 셀룰로오스 대신 물에 녹은 C-methylcellulose 1%를 포함한 1/4 x LBA 고형배지에 각 균종을 접종하고 37˚C에서 24시간 배양한 후 콩고레드(Congo Reds)를 이용하여 셀룰로오스 분해 정도를 확인하였다. ps4100이 다른 균종보다 전분을 많이 분해한 사실을 맑은 색으로 변한 동그란 부분(clear zone)으로 확인되었다(도 9a). 물에 녹지 균종에서 발현되는 셀룰로오스 분해 효소의 양을 액체배지에서 측정하는 실험을 했다. C-methylcellulose를 2% 포함한 50ml 1/4 x LB 액체배지에 ps4100, pb2441, ATCC 21332를 각각 접종하고 37˚C에서 260rpm으로 흔들어 배양하면서 세포의 성장을 24시간 추적하였다. 세포는 접종 후 8시간 동안 기하급수적으로 증가하여 8시간 후에 안정기에 이르렀다(도 9b). 셀룰로오스 분해효소는 접종한 지 2시간이 지난 때부터 발현되기 시작하였다(도 9c). 셀룰레이즈의 발현양은 ps4100 ≒ pb2441 > ATCC21332 순으로 나타났다. ps4100은 셀룰레이즈를 지속적으로 많은 양을 발현하였다.
실험예 7: In vivo 시험
본원발명 바실러스 서브틸리스 ps4100(KACC81159BP)의 동물성장 촉진용/사료 첨가용 조성물로서의 이용 가능성을 in vivo 시험을 통해 확인하고자 하였다.
1) 시험 디자인, 동물 및 보관
10주 동안의 실험에서 평균 체중(BW) 54.15 ± 1.70 kg인 비육돈 총 100마리([Landrace × Yorkshire] × Duroc)를 사용하였다. 4개의 실험용 식이는 초기 BW에 따라 돼지에게 무작위로 할당되었지만 성별 비율을 적용하였다. 각 처리를 위해 10개의 복제 우리가 있었고, 우리당 5마리의 돼지가 있었다(각각 평균 50%의 거세한 수컷 돼지와 50%의 암컷 돼지). 식이 그룹은 (1) CON = 기본 식단 및 (2) TRT = 기본 식단 + 1g 보충제/kg이고, 보충제에는 1 x 109 cfu/g의 B. subtilis ps4100이 포함되어 있다. 식단은 저단백 식단에 대한 국가 연구 위원회의 2012년 판 영양 요구 사항을 충족하도록 하였다. 모든 돼지는 실험 기간 동안 사료와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 환경적으로 통제된 방에 수용되었다.
2) 체중, 소화율 및 가스 배출에 대한 실험 과정 및 데이터 수집
50마리의 돼지를 5주 및 10주의 시작과 끝에서 개별적으로 무게를 측정하였다. 실험 전반에 걸쳐 우리당 사료 소비량을 기록하였다. 평균 일일 증가량(ADG), 평균 일일 사료 섭취량(ADFI) 및 증가/사료 비율(G:F)을 계산하였다. 건조 물질(DM)과 질소(N)의 겉보기 총 소화관 소화율(ATTD)을 결정하기 위해 10주차 동안 돼지에게 소화 불가능한 지표로 5g/kg의 산화크롬을 먹였다(Fenton and Fenton, 1979). 5주차와 10주차 말에 영양소 소화율 분석을 위해, 우리 당 돼지 2마리, 암컷 돼지 1마리, 거세한 수컷 돼지 1마리로부터 직장 마사지를 통해 대변 샘플을 수집하였다.
그룹당 총 20개의 대변 샘플을 분석할 때까지 -20℃에서 보관한 후 70℃에서 72시간 동안 건조시킨 후 직경 1mm 미만으로 미세하게 분쇄했습니다. 식이 건조 물질(DM), 질소 및 소화 가능 에너지(DE)는 국제 공식 분석 화학자 협회(USDA, 2006)의 절차에 따라 분석하였다. 분변 가스 배출량 분석을 위해 각 처리에서 자연적으로 배출된 신선한 분변을 수집하고 300g을 2.6L 플라스틱 상자에 보관하여 펜당 2개씩, 각 그룹에 총 20개의 샘플을 보관하였다. 각 상자에는 접착 석고로 밀봉된 측면 중 하나에 작은 구멍이 있다. 상자를 실온에서 7일 동안 발효시키고 MultiRAe Lite(model PGE-6208, RAE, USA)를 사용하여 메틸 메르캅탄(methyl mercaptan), NH3, H2S, 아세트산 및 CO2를 측정하였다.
3) 통계 분석
Independent Student-t Test는 대조군과 각 실험군 간의 평균을 비교하는데 사용되었다. ANOVA 및 Student-t 테스트에 추가하여 제어 그룹과 실험 그룹 간의 순위를 비교하는 p-값은 가스 배출 데이터에 대한 Mann-Whitney 테스트로 계산되었다. 선형 p-값은 Spearman의 상관 계수에 의해 계산되었다.
4) 결과
상기와 같은 실험 결과, 단백질 함량이 낮은 사료를 사용하여도 증체량이 현저하게 증가하였고(표 5), 분변의 냄새의 주요원인인 황화수소의 양을 30%까지 감소시켰으며 메틸메르캅탄, 아세트산 이산화탄소의 양도 10-16% 감소시켰다(표 6).
Items CON TRT (ps4100) P-value % increase
Body weight, kg
Initial (15주령) 54.15 54.15 0.99
Week 5 (19주령) 83.12 83.79 0.22
Finish (24주령) 114.33 116.47 <0.001 1.9
Week 6 - 10 주
(20 ~ 24주령)
ADG, g 892 934 <0.001 4.7
ADFI, g 2865 2887 0.54
G:F 0.312 0.324 0.16
Overall
ADG, g 860 890 <0.001 3.5
ADFI, g 2620 2634 0.44
G:F 0.328 0.338 0.17
Abbreviation: CON, Basal diet = 옥수수-대두박 위주 사료; TRT = Basal diet + 보충제(bacillus subtilis ps4100 포함). ADG = average daily gain (하루평균 몸무게 증가), ADFI = average daily feed intake (하루평균 사료 섭취량),
Items, (ppm) CON TRT
(ps4100)		 P-value2 % decrease
Week 10 (24주령)
Methyl mercaptans 5.00 4.18 0.003 16.4
NH3 5.40 4.93 0.399 8.7
H2S 5.48 5.09 0.019 7.1
Acetic acid 11.38 9.54 0.048 16.2
CO2 18725 15700 0.001 16.2
1Abbreviation: CON, Basal diet; TRT, Basal diet + 고초균 보조제
SEQ ID NO:1: Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP
SEQ ID NO:2: Bacillus subtilis ps4100 KACC81159BP 16S rDNA
SEQ ID NO:3: Bacillus subtilis 16S rRNA, internal transcribed spacer (ITS), 23S rRNA sequence
SEQ ID NO:4: Bac27F(forward primer)
SEQ ID NO:5: 1492R(reverse primer)
SEQ ID NO:6: 16S_1094F(forward primer)
SEQ ID NO:7: 23S_197R(reverse primer)
[미생물기탁]
기탁기관명: 한국 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC)
수탁번호: 81159BP
수탁일자:2021.05.21
Figure PCTKR2022009188-appb-img-000001

Claims (8)

  1. 서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP는 서열번호 2에 기재된 염기서열을 갖는 16S rDNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 단백질 분해 효소 또는 다당류 분해 효소인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 다당류는 전분 또는 셀룰로오스인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP.
  5. 다음 단계를 포함하는 서팩틴의 생산방법:
    (a) 제1항의 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP을 고체배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 콜로니를 액체배지에 접종 및 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 배양액을 원심 분리한 후, 침전물로부터 서팩틴을 수득하는 단계.
  6. 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물성장 촉진용 조성물.
  7. 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81159BP 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물.
  8. 서열번호 1로 표시되는 전장유전체를 갖는 바실러스 서브틸리스 ps4100 KACC81161BP 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유해가스 저감용 사료 조성물.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102411380B1 (ko) * 2021-06-28 2022-06-22 주식회사 프록스엔렘 서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040055035A (ko) * 2002-12-20 2004-06-26 (주) 엔바이오이엔지 소듐 서펙틴의 제조방법 및 그 용도
KR20090066410A (ko) * 2007-12-20 2009-06-24 (주) 비엔씨바이오팜 바실러스 서브틸리스 ｂｃ1212 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물
KR20130047329A (ko) * 2011-10-31 2013-05-08 대한뉴팜(주) 바실러스 서브틸리스 ｎｐ１５ 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물
KR20190119303A (ko) * 2018-04-12 2019-10-22 재단법인 전라북도생물산업진흥원 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 균주 및 이를 함유하는 사료
KR102044365B1 (ko) * 2018-11-09 2019-11-13 재단법인 발효미생물산업진흥원 장 부착능이 우수하고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 scdb 291 균주 및 이의 용도
US20200359652A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-19 Agri-King, Inc. Bacterial strain compositions and methods of using same
KR102411380B1 (ko) * 2021-06-28 2022-06-22 주식회사 프록스엔렘 서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101155158B1 (ko) 2009-09-30 2012-06-11 윤기홍 생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 ５?ｂ 균주 및 이를 포함하는 사료용 첨가제 조성물

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040055035A (ko) * 2002-12-20 2004-06-26 (주) 엔바이오이엔지 소듐 서펙틴의 제조방법 및 그 용도
KR20090066410A (ko) * 2007-12-20 2009-06-24 (주) 비엔씨바이오팜 바실러스 서브틸리스 ｂｃ1212 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물
KR20130047329A (ko) * 2011-10-31 2013-05-08 대한뉴팜(주) 바실러스 서브틸리스 ｎｐ１５ 균주를 포함하는 사료첨가용 조성물
KR20190119303A (ko) * 2018-04-12 2019-10-22 재단법인 전라북도생물산업진흥원 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 균주 및 이를 함유하는 사료
KR102044365B1 (ko) * 2018-11-09 2019-11-13 재단법인 발효미생물산업진흥원 장 부착능이 우수하고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 scdb 291 균주 및 이의 용도
US20200359652A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-19 Agri-King, Inc. Bacterial strain compositions and methods of using same
KR102411380B1 (ko) * 2021-06-28 2022-06-22 주식회사 프록스엔렘 서팩틴 및 효소 생산능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도

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