WO2023243727A1

WO2023243727A1 - 生体試料の保存剤組成物

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Publication number: WO2023243727A1
Application number: PCT/JP2023/022488
Authority: WO
Inventors: 浩介黒田; 英周平田; 大介田中
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2023-06-16
Publication date: 2023-12-21
Anticipated expiration: 2024-12-17
Also published as: US20260176393A1; JPWO2023243727A1

Abstract

凍結保存用培地、凍結保存用液体に従来汎用されているＤＭＳＯなどの細胞浸透性物質の代わりに、又は細胞浸透性物質と併用することにより細胞浸透性物質の毒性を軽減しさらに凍結保存効果を高める保存剤組成物を提供すること。　次の一般式（１）で表される双性イオンポリマー又はその標識体、及びこれを含有する生体試料の保存剤組成物。（式中、　Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示し；　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；　ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）

Description

生体試料の保存剤組成物

　本発明は、細胞などの生体試料の保存剤組成物に関する。

　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やグリセロールは、細胞を凍結保存する際の凍結保存剤として広く用いられており、細胞や細胞小器官を保護するための最も効果的な試薬である。これらの凍結保存剤は、細胞凍結時に細胞内に形成される氷の結晶（氷晶）の成長を抑えることにより細胞を保護するものである。ＤＭＳＯ等は細胞膜透過性であり、細胞の内外で氷晶の成長速度を遅らせ氷晶形成を阻害する。しかし、ＤＭＳＯ及びグリセロールは毒性があり、細胞とともにレシピエントに輸液されるか、又は細胞を扱う担当者の取り扱いにより、高血圧、吐き気及び嘔吐を引き起こすことが知られている。さらに、凍結保存剤としてＤＭＳＯを用いる場合の多くはウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加する。これらは、動物由来のためロットにより品質のばらつきが生じるという課題があった。本発明者らは、これまで培地への添加成分として汎用されているＤＭＳＯなどの代わりに用いることのできる物質として非プロトン性双性イオンを提案し、凍結保存用培地などを提案した（特許文献１）。
　また、細胞を用いた化学物質のアッセイにおいて水に溶けにくい難溶性物質を培地に添加する場合には、その難溶性物質をＤＭＳＯ等の溶媒に溶解してから培地に分散させている。ＤＭＳＯは非常に溶解性の高い溶剤とされているが、一部の難溶性物質はＤＭＳＯにも溶解しないことが知られている。本発明者らは、これまでに難溶性物質を溶解する物質として非プロトン性双性イオンを用いることを提案した（特許文献２）。

　一方、双性イオンポリマーについては、生体適合性ポリマーの表面改質を目的として用いられているほか（特許文献３）、工業的な材料としても注目されている。双性イオンの構造や物性については、学術的な観点からも各種研究が行われている（非特許文献１～３）。

国際公開第２０２０／２３０７２１号明細書特開２０１８－１９１６２３号公報特開２０１５－２１３７５５号公報

Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．４，ｐ．４１５－４２１（１９９０）．ＡＣＳ　Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ　２０１８，１０，１７７７１－１７７８３Ｃｈｅｍ　Ａｓｉａｎ　Ｊ．２０２１，１６，１８９７－１９００

　本発明者らは、これまで培地への添加成分として汎用されているＤＭＳＯなどの代わりに用いることのできる物質として非プロトン性双性イオンを製造し、凍結保存用培地や難溶性物質の溶解剤などに利用できることを提案したが、未だ十分な効果を現すものではない。
　本発明の課題は、生体試料への添加物質として、さらに難溶性物質の溶解剤として用いられているＤＭＳＯなどの代わりに利用できる双性イオンポリマーを提供することである。さらに、そのようなポリマーを細胞浸透性物質と併用することにより細胞浸透性物質の毒性を軽減し、さらに凍結保存効果を高める生体試料の保存剤組成物を提供することにある。

　そこで、本発明者らは、種々の化合物の細胞などの生体試料の凍結保存に対する作用を検討してきたところ、特定の構造を有する双性イオンポリマーを用いれば、電解質などの水溶性化合物を添加することで浸透圧を上げ、当該双性イオンポリマーの溶解度・分散度を調節することで、直接的又は間接的に細胞などの生体試料の保存性が良くなることを見出し、さらに、難溶性物質を溶解させることができることを見出し、本発明を完成した。

　本発明は、次の発明［１］～［１５］を提供するものである。
［１］次の一般式（１）で表される双性イオンポリマー又はその標識体。

（式中、
　Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示し；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
　ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
［２］Ｙ¹及びＹ²が、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-及び－ＳＯ₃ ^-から選ばれるアニオンである［１］記載の双性イオンポリマー又はその標識体。
［３］Ｚが、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド及びＣ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミドから選ばれる基である［１］又は［２］記載の双性イオンポリマー又はその標識体。
［４］次の一般式（１）で表される双性イオンポリマー又はその標識体を含有する生体試料の保存剤組成物。

（式中、
　Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示し；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
　ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
［５］Ｙ¹及びＹ²が、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-及び－ＳＯ₃ ^-から選ばれるアニオンである［４］記載の生体試料の保存剤組成物。
［６］Ｚが、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド及びＣ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミドから選ばれる基である［４］又は［５］記載の生体試料の保存剤組成物。
［７］さらに、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を含有する［４］～［６］のいずれかに記載の生体試料の保存剤組成物。
［８］さらに、細胞浸透性物質を含有する［４］～［７］のいずれかに記載の生体試料の保存剤組成物。
［９］生体試料の凍結保存剤組成物、生体試料の培養用組成物、生体試料の培地組成物、生体試料の保存用組成物、生体試料の機能維持用組成物、又は生体試料の機能試験用組成物である［４］～［８］のいずれかに記載の生体試料の保存剤組成物。
［１０］前記［１］～［３］のいずれかに記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含む難溶性物質溶解剤。
［１１］生体試料に、前記［１］～［３］のいずれかに記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物を接触させることを特徴とする、生体試料の保存方法。
［１２］前記［１］～［３］のいずれかに記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物がさらに、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を含有する［１１］記載の生体試料の保存方法。
［１３］前記［１］～［３］のいずれかに記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物がさらに、細胞浸透性物質を含有する［１１］又は［１２］記載の生体試料の保存方法。
［１４］生体試料の保存が、生体試料の凍結保存、生体試料の培養、生体試料の培地、生体試料の機能維持、又は生体試料の機能試験である［１１］～［１３］のいずれかに記載の生体試料の保存方法。
［１５］難溶性物質を、前記［１］～［３］のいずれかに記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物に溶解することを特徴とする、難溶解性物質の溶解方法。

　本発明の生体試料の保存剤組成物を用いれば、細胞などを冷凍保存した後解凍しても生存率が高く、細胞などの生体試料を保護することができる。また、本発明の保存剤組成物を用いれば、生体材料の保存性、維持性なども向上する。また、本発明の双性イオンポリマーを用いれば、種々の難溶性物質を溶解させることができる。

ＶｉｍＣ₃Ｃ（ＤＭＳＯ－）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）（ｍｅｔｈａｎｏｌ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）＋ＮａＣｌ添加の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）（ｍｅｔｈａｎｏｌ-ｄ６）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）（Ｄ₂Ｏ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。ＶｉｍＣ₃Ｓ（ＤＭＳＯ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｓ）（Ｄ₂Ｏ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）５０（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）４０（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）３０（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）２０（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）１０（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）４０（メタノール－ＮａＣｌ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₈Ｖｉｍ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。双性イオンポリマーの濃度と細胞の凍結保存後の生存率の関係を示す。双性イオンポリマーに添加するＮａＣｌ水溶液の濃度と細胞の凍結保存後の生存率の関係を示す。双性イオンポリマーに添加する溶質の種類の違いによる凍結保存後の細胞の生存率の関係を示す。双性イオンポリマーが細胞に与える毒性を示す。双性イオンポリマーのＮａＣｌ溶液のＤＬＳチャートを示す。双性イオンポリマーのＧＰＣ結果を示す。双性イオンポリマー製造時における触媒／モノマー比と凍結保存後の生存率との関係を示す。図中、左は双性イオンポリマー水溶液のデータ、右は双性イオンポリマー培地溶液のデータを示す。双性イオンポリマー（ｐｏｌｙＶｉｍＣ３Ｃ）のＫ５６２細胞の凍結保存後の生存率について、ＮａＣｌ濃度の効果との関係を示す。双性イオンポリマー（ｐｏｌｙＶｉｍＣ３Ｃ）のＣ６細胞の凍結保存後の生存率についてＮａＣｌ濃度の効果との関係を示す。双性イオンポリマー（ｐｏｌｙＶｉｍＣ３Ｃ）とＯＶＭＡＮＡ細胞の凍結保存後の生存率について、ＮａＣｌ濃度との関係を示す。双性イオンポリマー（ｐｏｌｙＶｉｍＣ３Ｃ）の凍結保存後のＣ６細胞の増殖速度について、ＮａＣｌ濃度との関係を示す。双性イオンポリマー（ｐｏｌｙＶｉｍＣ３Ｃ）の凍結保存後のＯＶＭＡＮＡ細胞の増殖速度について、ＮａＣｌ濃度との関係を示す。双性イオンポリマー存在（ｐｏｌｙＶｉｍＣ３Ｃ）下に静置後した場合の細胞の接着性を示す顕微鏡写真を示す。Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₁₆Ｖｉｍ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。（ａ）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₁₆Ｖｉｍ）のＢＯＳＣ細胞の凍結保存後の生存率を示す図である。（ｂ）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₁₆Ｖｉｍ）のＫ５６２細胞の凍結保存後の生存率を示す図である。（ｃ）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₁₆Ｖｉｍ）のＯＶＭＡＮＡ細胞の凍結保存後の生存率を示す図である。双性イオンポリマーＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₁₆Ｖｉｍ）がＢＯＳＣ細胞に与える毒性を示す図である。双性イオンポリマーＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ－ｃｏ－Ｃ₁₆Ｖｉｍ）がＫ５６２細胞の凍結保存後の生存率を示す図である。細胞にｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－Ｃ１６Ｖｉｍ）を添加した後、共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図である。本発明の双性イオンポリマーが細胞膜を保護する様子を模式的に示した図である。

　本明細書において、ベタイン構造を有する物質について、非プロトン性双性イオン、非プロトン性双性イオンポリマーと記載することがあるが、これは双性イオン、双性イオンポリマーと同義に用いている。

（生体試料）
　本発明の保存剤組成物の対象となる生体試料としては、核酸、タンパク質、細胞小器官、細胞、組織、個体などが挙げられ、このうち細胞小器官、細胞、組織が好ましい。
　使用できる細胞の由来は特に限定されず、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、細菌等の細胞が挙げられる。また、動物細胞としては、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等の細胞が挙げられる。さらに、細菌としては、乳酸菌、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリア等が挙げられる。
　また、細胞の種類も特に限定されず、例えば、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞及び生殖細胞からなる群から適宜選択される。ここで「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称であり、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
　また、「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味し、例えば、骨髄中の造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞等が挙げられる。
　「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞をいう。好ましくは、破骨細胞、線維芽細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ等が挙げられる。
　「生殖細胞」としては、有性生殖のための配偶子、すなわち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子等が挙げられる。
　細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択しても良い。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌であり、軟部肉腫、悪性骨腫瘍等を含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」は、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもち、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。この例として、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）等が挙げられる。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。動物細胞、植物細胞、細菌の形質転換は、従来知られた方法を用いて行われる。
　また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を培養する際に、細胞の増殖や分化に必要な環境を整えるために補助的に用いられるフィーダー細胞を必要に応じて含んでいても良い。フィーダー細胞としては、マウスの線維芽細胞等が挙げられる。これらのフィーダー細胞は、予めガンマ線照射や抗生物質によって増殖しないように処理することができる。

（双性イオンポリマー）
　本発明の双性イオンポリマーの一態様は、次の一般式（１）で表される双性イオンポリマー又はその標識体である。

（式中、
　Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示し；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
　ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）

　本発明の双性イオンポリマーは、少なくともl個の繰り返し単位の側鎖に、非プロトン性双性イオン、すなわち、カチオン部分とアニオン部分とを有する。当該双性イオン構造は、一般式（１）中のＸ¹及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとＹ¹のアニオンとで形成される。また、ｍ個の繰り返し単位の側鎖に、Ｘ²及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとＹ²のアニオンとで形成される双性イオン構造を有していてもよい。
　本発明において双性イオン構造とは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷を持つ原子に解離しうる水素が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物（分子内塩）の総称である。
　このように、本発明のポリマーの繰り返し単位の側鎖に双性イオンを有することにより、細胞膜に対する保護作用を示し、凍結保存剤として機能するもの考えられる。また、本発明のポリマーは、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を添加することにより、前記側鎖の双性イオンにより会合していた状態から分散状態になるため、細胞膜に作用して凍結保護作用を示すものと考えられる。

　一般式（１）において、ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示す。
　ｍ＝ｎ＝０のときは、一般式（１）は側鎖に双性イオン構造の官能基を持つホモポリマーを表す。ｍが０を超える数を示し、ｎ＝０のときは、一般式（１）は２種類の双性イオン構造を有するランダム又はブロック共重合体であることを表す。ｍ＝０であり、ｎが０を超える数を示すときは、一般式（１）は、側鎖に双性イオン構造の官能基を持つ繰り返し単位と、側鎖にＺを有する繰り返し単位とを有するランダム又はブロック共重合体であることを表す。ｍ及びｎが０を超える数を示すときは、一般式（１）は三元系のランダム又はブロック共重合体であることを表す。

　ｐ、ｑ及びｔは、それぞれ独立して０～６の整数を示す。具体的には、この部分は、単結合又は炭素数１～６の直鎖アルキレン基であり、単結合、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基が好ましい。また、この部分は、生体試料の凍結保護作用の観点から、単結合、メチレン基又はエチレン基がより好ましく、単結合又はメチレン基がさらに好ましい。ｐ、ｑ及びｔは、同一でも異なっていてもよい。

　ｒ及びｓは、それぞれ独立して０～６の整数を示し、１～６の整数が好ましい。この部分は、炭素数１～６の直鎖アルキレン基が好ましく、具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基が好ましい。ｒ及びｓは、同一でも異なっていてもよい。

　一般式（１）において、Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示す。
　一般式（１）中、Ｘ¹及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとしては、イミダゾリウムカチオン（Ｘ¹＝Ｎ、ｅ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ¹＝Ｃ、ｅ＝１）、ピロリニウムカチオン（Ｘ¹＝Ｃ、ｅ＝０）、ピラジニウムカチオン（Ｘ¹＝Ｎ、ｅ＝１）が挙げられる。このうち、イミダゾリウムカチオン（Ｘ¹＝Ｎ、ｅ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ¹＝Ｃ、ｅ＝１）が好ましい。
　一般式（１）中、Ｘ²及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとしては、イミダゾリウムカチオン（Ｘ²＝Ｎ、ｆ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ²＝Ｃ、ｆ＝１）、ピロリニウムカチオン（Ｘ²＝Ｃ、ｆ＝０）、ピラジニウムカチオン（Ｘ²＝Ｎ、ｆ＝１）が挙げられる。このうち、イミダゾリウムカチオン（Ｘ²＝Ｎ、ｆ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ²＝Ｃ、ｆ＝１）が好ましい。

　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示す。Ｙ¹及びＹ²としては、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ^-から選ばれるアニオンが好ましく、－ＣＯＯ^-及び－ＳＯ₃ ^-から選ばれるアニオンがより好ましく、－ＣＯＯ^-がさらに好ましい。

　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示す。
　具体的には、水素原子、フェニル基、ナフチル基、Ｃ１－２２アルキル置換フェニル基、Ｃ１－２２アルキル置換ナフチル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、ピリジル基、ピロリル基、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミド、ピロリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムクロリド、ピロリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムブロミド、テトラメチルアンモニウムクロリド、Ｃ２－２２アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムブロミド、Ｃ２－２２アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、テトラフェニルホスホニウムブロミド、トリメチルスルホニウムクロリド、トリメチルスルホニウムブロミド、Ｃ１－２２直鎖又は分岐鎖アルキル基、エトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、エトキシエトキシエトキシエチル基等が挙げられる。
　好ましいＺとしては、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基又はアルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩が挙げられ、より好ましくは、イミダゾリル基、トリアゾリル基、ピリジル基、ピロリル基、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミド、ピロリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムクロリド、ピロリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムブロミドが挙げられる。
　さらに好ましくは、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミドが挙げられる。

　前記一般式（１）の双性イオンポリマーの標識体としては、ラジオアイソトープ標識、酵素標識、化学発光物質標識、蛍光物質標識などが挙げられる。このうち、化学発光物質標識、蛍光物質標識が好ましい。蛍光標識物質としては、フルオレセイン、シアニン、ボディピイ、ダンシル、ピラニン、クマリン、カルボピロニン、フィコシアニンなどが挙げられる。
　これらの標識物質を用いて、双性イオンポリマーを標識するには、双性イオンポリマーの側鎖に標識物質を結合させる手段、標識物質を側鎖に結合したモノマーを共重合させる手段が挙げられる。例えば、一般式（１）で表されるポリマーを構成する１種又は２種以上のモノマーとフルオレセインアクリレートとを共重合させることにより、フルオレセイン標識体を得ることができる。

　本発明に用いられる高分子化合物の分子量は、主鎖の構造、側鎖の構造や全体に占める比率などから考慮する必要があり、それぞれの特徴を反映した公知の測定手法を用いることが出来る。さらに、双性イオンポリマーの場合は、双性イオンの種類によりｐＨやＮａＣｌなどの電解質濃度により主鎖のコンフォメーションが変化することが知られている。
　本発明の双性イオンポリマーの主鎖の構造は、星形、櫛形、架橋構造などが考えられ、いずれの構造のものであっても本発明の目的に用いることが可能であるが、主鎖のコンフォメーションは側鎖の種類によって異なる。主鎖が直鎖状のポリマーの場合には、ＮａＣｌなどの電解質等の添加によりポリマーを広げることで、水への分散性を高めることができる。また、本発明の双性イオンポリマーは、側鎖に存在する双性イオン構造により、細胞膜の構造や細胞透過性の観点から、および細胞外における氷晶の形成、難溶性物質の溶解性に関係することから、その分子量は、一定程度の大きさであることが好ましい。分子鎖を電解質により広げた状態において、ポリエチレンオキサイド換算で、Ｍｗが１万以上、Ｍｎが５０００以上が好ましく、Ｍｗが１万以上２００万以下、Ｍｎが５０００以上１５０万以下がより好ましい。さらに、ポリマーの分子量分布も考慮される。双性イオンポリマーを生体試料の凍結保存剤に使用した場合、氷晶が細胞外で形成することを促進することから、本発明の双性イオン性ポリマーは、細胞膜浸透性でないのが好ましい。

　本発明の双性イオンポリマーは、冷凍保存効果に優れている。本発明のポリマーは、従来冷凍保存に用いられるＤＭＳＯなどと異なるメカニズムにより冷凍保存効果を上げている。考えられるメカニズムの一つとして、ＤＭＳＯは、細胞浸透性があると考えられるが、本発明の双性イオンポリマーは細胞内に侵入しないため細胞の外側でマトリックスを形成し細胞の外側の細胞膜周辺に集積する。その理由の一つとして双性イオン分子がベタイン構造を有することから電荷を有し、双性イオンポリマーとして細胞膜に侵入することができないことが考えられる。そして、ポリマー側鎖に細胞膜と親和性が高い疎水性の官能基が存在し、その官能基が細胞膜に細胞の外側から差し込まれた形になると、親水性ポリマーが細胞の外側で細胞膜に繋留され、ポリマーが細胞の外側の細胞膜周辺に集積されることになることが考えられる。このような集積に寄与する官能基としては、一般式（１）中のカチオンとアニオンとの間にアルキレン基を有することが挙げられる。また、ＺがＣ１～Ｃ２２のアルキル基、さらにＣ３～Ｃ１８のアルキル基を有する場合も好ましい。また、そのような置換基の存在比は、ポリマー全体対して０．００１から１０モル％、０．０１～１モル％、より好ましくは０．１～０．５モル％であることが好ましい。

（双性イオンポリマーの製法）
　本発明の双性イオンポリマーは、前記繰り返し単位に相当するα－オレフィンであるモノマーを用いる。重合には、ラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合などをさせることによって製造でき、モノマーの特性や製造するポリマーの目的や性質などによって適宜使い分けることもできる。ベタイン構造を有するα－オレフィンを１種類のみ用いて重合反応させる場合には、同じ側鎖をもつ双性イオンポリマーのホモ重合体（一般式（１）においてｌ＝１，ｍ＝ｎ＝０、またはｍ＝１、ｌ＝ｎ＝０）を製造することができる。また、２種類のベタイン構造を有するα－オレフィンを用いて重合反応させる場合には、２種類のベタイン構造の側鎖を有する双性イオンポリマーの共重合体（０＜ｌ＜１、０＜ｍ＜１、ｎ＝０）を製造することができる。１種類のベタイン構造のα－オレフィンと一般のαオレフィンを用いて重合反応させる場合には、ベタイン構造を側鎖に含むポリオレフィンの双性イオンポリマー（ｌ＝０、０＜ｍ＜１、０＜ｎ＜１、または０＜ｌ＜１、ｍ＝０、０＜ｎ＜１）を製造することができる。また、ベタイン構造を側鎖に含むポリオレフィンの双性イオンポリマー（ｌ＝０、０＜ｍ＜１、０＜ｎ＜１、または０＜ｌ＜１、ｍ＝０、０＜ｎ＜１）を製造する場合においては、前記一般式（１）中の（ＣＨ₂）rＹ¹及び（ＣＨ₂）sＹ²を有しない構造のポリマーに対して側鎖中の窒素原子にＹ¹及びＹ²中のアニオン基を導入して、窒素原子をカチオン化して側鎖に後からベタイン構造を構築する方法（「後修飾」ともいう）で製造してもよい。前記一般式（１）中の（ＣＨ₂）rＹ¹及び（ＣＨ₂）sＹ²を有しない構造のポリマーは、公知のポリマーを用いてよいし、そのようなポリマーが知られていない場合には、前記一般式（１）中の（ＣＨ₂）rＹ¹及び（ＣＨ₂）sＹ²を有しない構造のポリマーを重合により製造してもよい。
　本発明の双性イオンポリマーのラジカル重合は、高温高圧で製造する方法もあるが、適切な重合開始剤を用いれば常圧で製造することが出来る。重合開始剤としては２，２’－アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ化合物、過酸化ベンゾイルなどの過酸化物などを開始剤として用いることができる。重合開始剤はベタイン構造を有するα-オレフィンに対して、０．００１モル％以上、好ましくは０．０１モル％、より好ましくは０．１モル％以上であり、かつ、１０モル％以下、好ましくは５モル％以下、より好ましくは１モル％の割合の範囲で用いられる。重合開始剤の使用量のほかには溶媒使用の性質や有無や温度、圧力などにより生成するポリマーの分子量を調節することが出来る。
　また、窒素原子をカチオン化しベタイン構造を構成するアニオン基の導入方法としては、側鎖部分に窒素原子を有するポリマーに、ハロゲン化脂肪酸エステル、アルキルスルトンなどを反応させる方法が挙げられる。側鎖部分に窒素原子を有するポリマーとしては、ポリピリジン、ポリイミダゾリンなどを挙げることができる。

（浸透圧の調節）
　後記実施例に示すように、本発明の双性イオンポリマーは、水溶性であるが、分子量が大きいためにその水溶液は浸透圧が低い場合がある。しかし、本発明の双性イオンポリマー水溶液に浸透圧に寄与する化合物を添加すると、浸透圧は向上し、生体試料の凍結保存後の生存率を顕著に向上させる作用を有している。

　本発明の双性イオンポリマーは、細胞などの生体試料を含有する分散液に用いる場合は、分散液に浸透圧を調節するために、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を添加するのが好ましい。浸透圧を調節することにより、当該生体試料を凍結保存した場合の生体試料の生存、機能を維持する作用をさらに向上させることができる。従って、本発明の双性イオンポリマーを含有する組成物は、生体試料の保存剤組成物として、特に生体試料の凍結保存剤組成物として有用である。また、本発明の生体試料の保存剤組成物の形態としては、生体試料の培地組成物であってもよい。このうち、生体試料の凍結保存効果の観点から、浸透圧の調節には、電解質がより好ましい。さらに、生体試料に対する毒性を考慮すると、電解質としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムが好ましい。

　本発明の双性イオンポリマーを含む水溶液や培地、凍結保存液等に電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を添加した培地を用いることで、より顕著な効果を有する。これらの水溶性化合物は、双性イオンポリマーの双性イオン側鎖に作用することでポリマー全体のコンフォメーションを変化させることができる。双性イオンポリマーの側鎖に作用する電解質等の水溶性化合物等は、側鎖と塩を作るなどして双性イオンポリマーに組み入れられると浸透圧上昇に寄与する濃度が得られなくなる場合が考えられるので、添加する水溶性化合物の種類や量は双性イオンポリマーの構造との関係で考慮されなければならない。
　ここで電解質とは、溶媒中に溶解したときに陽イオンと陰イオンに電離する物質である。
　好ましい陽イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどが挙げられ、陰イオンとしては、塩化物イオン、リン酸イオン、炭酸水素イオンなどが挙げられる。従って、好ましい電解質としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンから選ばれる陽イオンと、塩化物イオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンから選ばれる陰イオンとを組み合わせた化合物である。具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどが挙げられる。
　また、アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの炭素数１～６のアルコールが挙げられる。多価アルコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコールなどの水溶性多価アルコールが挙げられる。糖類としては、グルコース、スクロースなどの単糖類、二糖類が挙げられる。ベタインとしては、カルニチンなどが挙げられる。双性イオンとしては、ＷＯ２０２０／２３０７２１に記載の双性イオンが挙げられる。

（ポリマーの凝集性）
　また、本発明の双性イオンポリマー水溶液は、動的光散乱法（ＤＬＳ）による粒度測定で１００～１０００ｎｍのところに粒子が多く存在していることが観測された。電解質を添加するとその凝集の程度は弱くなり、なかには凝集がほとんど観察されなくなるものもあった。電解質添加後は、１０ｎｍ付近に多くの粒子が存在していることが観測された（図１９）。
　本発明の双性イオンポリマーは、水溶液中においては、側鎖の密集具合によって凝集するが、電解質と側鎖が相互作用することで凝集していたポリマーが電解質とイオン対を形成して、ポリマー主鎖のコンフォメーションが変化して凝集していたポリマーの形状が広がり、分散状態となる。電解質を添加しているため浸透圧の上昇もあるが、それだけではなく双性イオンモノマーとしての双性イオン側鎖がより分散状態となり、保存性に寄与するものと考えられる。
　ＤＬＳによる観測から、本発明の双性イオンポリマーは電解質を含有する水溶液中で、凝集されていたポリマーがより分散状態となることで保存性に寄与する。ポリマーが分散状態になることでポリマー主鎖が生体表面を覆うように広く分散し、側鎖が生体膜と相互作用したり、細胞膜に入り込んだりすることで生体膜との親和性が高まると考えられる。その結果、双性イオンポリマーと保存する生体試料、特に細胞膜との関係で、細胞膜と相互作用し、細胞周辺にマトリックス様のものが形成される。このような双性イオンポリマーと細胞膜の相互作用は、細胞同士の関係においても影響を与えており、細胞同士の凝集状態になっていることが観察される（図２７）。本発明の双性イオンポリマーが添加された培地において観察される細胞は、いくつかの細胞が集まっている様子が観察され、ＰＢＳ中の細胞が一細胞ずつ分離して観察されるのに対して、対照的である。このことから、本発明の双性イオンの添加によって何らかの効果を引き起こし細胞同士の接着効果を期待することができる。接着効果の大きさは明らかではないが、将来的には、臓器移植など手術などにより臓器を定着させる場合、組織や臓器を三次元プリンターなどで製造する場合などに有用になることが期待される。
　ＤＳＣにより、急速凍結後室温まで戻す昇温工程における氷が溶解する温度の測定により、氷の溶解温度を高める作用を観測した。これらの結果から、双性イオンポリマーが電解質により分散状態になることにより細胞膜と相互作用をして何らかの構造変化が起こることで細胞を保護する作用が期待される。たとえば、そのような保護作用により細胞内への氷の流入を抑制し細胞の生存を維持しているものと考えられる。さらに、双性イオンポリマーの細胞外における保護作用により、動物細胞を培地中で浮遊細胞として１個１個を独立して培養することも可能である。

（保存剤組成物）
　本発明の生体材料の保存剤組成物は、前記生体材料の凍結保存剤として機能するだけでなく、生体材料の保存維持用組成物としても機能する。具体的には、生体材料の凍結保存剤組成物、生体材料の培養用組成物、生体材料の培地組成物、生体材料の保存用組成物、生体材料の機能維持用組成物、生体材料の機能試験用組成物などが挙げられる。
　本発明の生体試料の保存剤組成物の媒体は、水、水と有機溶媒との混合物が挙げられる。選択する媒体としては、電解質が陽イオンと陰イオンに電離する物質であるのが好ましい。ここで、有機溶媒としては、メタノール、エタノールなどの低級アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが挙げられる。

　本発明の双性イオンポリマー又はその標識体を生体試料の保存剤として使用する際の双性イオンポリマーの濃度は、特に限定されないが、２質量％以上３０質量％以下が好ましく、５質量％以上３０質量％以下がより好ましく、１０質量％以上２０質量％以下がさらに好ましい。
　電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物の濃度は、生体試料の生存に影響しない濃度であるのが好ましく、０．２質量％以上５質量％以下が好ましく、０．５質量％以上３質量％以下がより好ましく、０．５質量％以上２質量％以下がさらに好ましい。

　また、本発明の保存剤組成物には、非プロトン性双性イオンと水とを含む組成物、又は非プロトン性双性イオンと水からなる組成物（非プロトン性双性イオン水溶液ともいう）１００重量部に対して、細胞浸透性物質を添加剤として追加して用いることができる。細胞浸透性物質は、非プロトン性双性イオン水溶液１００重量部に対して、通常は少なくとも１重量部、好ましくは１０重量部以上、上限は、通常３０重量部以下、好ましくは２０重量部以下、より好ましくは１５重量部以下を添加して用いることができる。なお、本明細書において、非プロトン性双性イオンの水溶液１００重量部に対して１重量部添加した場合を、非プロトン性イオンの水溶液に対して１％と記載する場合がある。そのような細胞浸透性物質としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどが挙げられる。このような細胞浸透性物質は、凍結保存性をさらに向上させることができる。
　これらの細胞浸透性物質の添加量は、通常使用される量よりも低減することも増大させることもできる。例えば、ＤＭＳＯの場合は、３質量％以上２５質量％以下とすることができる。グリセロールの場合は、３質量％以上２５質量％以下とすることができる。

　なお、本発明の保存剤組成物には、生体試料培養用培地成分を含有させることもできる。この場合、本発明の保存剤組成物は、培地組成物又は培養用組成物として機能する。生体試料培養用培地成分としては、細胞培養用の培地成分が挙げられ、具体的には、無機塩、バッファー、炭水化物、ビタミン、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、微量元素、血清、ホルモン、成長因子、シグナル伝達物質、抗生物質などが挙げられる。本発明の組成物を、培地組成物として使用する場合は、これらの培地成分を含むのが好ましい。

　本発明の保存剤組成物は、細胞などの分散液における凍結保存性を向上させるので、細胞などの培地への添加剤としても有用である。従って、本発明の保存剤及び細胞の培地成分を含む組成物は、細胞などの凍結保存用培地として使用することができる。ここで、細胞の培地成分としては、本発明の双性イオンポリマー、電解質、細胞浸透性物質以外に、栄養素（例えば細胞を増殖するための糖類など）、ペプチドやタンパク質（例えば、血清、血清から精製したタンパク質、ペプチドなど）などが挙げられる。

　本発明の保存剤組成物を用いれば、細胞などの生体試料分散液を緩慢凍結法又は急速凍結法で凍結し、その後解凍した細胞の生存率を向上させることができる。ここで、緩慢凍結法における細胞の凍結条件は、従来の条件に準じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、－０．１～－１５℃／分の冷却速度で、０～－２００℃まで冷却することができる。急速凍結法では、例えば、冷却速度を－１５～－２００００℃／分、冷却温度を０～－２００℃の範囲として行うことが好ましい。
　凍結保存された細胞の解凍手段は、例えば凍結細胞を含むアンプルを速やかに３７℃のウォーターバスに移して解凍するのが好ましい。アンプルの内容物をピペットで滅菌チューブに移す。その後、適切なサプリメントを添加済みの予熱した培地を徐々に添加する。トリパンブルーを使用して生細胞密度を測定する。適切な量の細胞懸濁液をフラスコに移し、細胞株のデータシート上で推奨される細胞密度で播種する。

（難溶性物質の溶解）
　本発明において、「難溶性物質」とは、水にわずかしか溶けないという性質を有している物質をいい、水に対する溶解度（２５℃）が、１重量％以下の物質であり、好ましくは、０．５重量％以下であり、特に好ましくは０．１重量％以下である。このような難溶性物質は、例えば、医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧料、農薬の有効成分である物質（有効成分となり得る候補物質も含む）、食品添加物、生物由来物質や植物由来物質であり、低分子物質、及びオリゴペプチド、ポリペプチド、多糖類、ＤＮＡ、ＲＮＡ等のオリゴマー及び高分子物質を含む。
　「難溶性の医薬品」とは、日本薬局方に規定される「やや溶けにくい」「溶けにくい」「極めて溶けにくい」「ほとんど溶けない」薬物が該当し、具体的には、抗腫瘍剤、抗生物質、抗高脂血症剤、抗菌剤、アレルギー性疾患治療剤、高血圧治療剤、動脈硬化治療剤、血行促進剤、ホルモン剤、脂溶性ビタミン剤、糖尿病治療剤、抗アンドロゲン剤、強心用薬剤、不整脈用薬剤、消炎剤、催眠鎮静剤、精神安定剤、抗てんかん剤、抗うつ剤、消化器系疾患治療剤、利尿用薬剤、局所麻酔剤、抗凝固剤、抗ヒスタミン剤、抗ムスカリン剤、抗マイコバクテリア剤、免疫抑制剤、抗甲状腺薬、抗ウイルス剤、不安緩和性鎮静薬、収れん薬、β－アドレナリン受容体遮断薬、心筋変力作用剤、造影剤、コルチコステロイド、咳抑制剤、診断剤、診断用イメージング剤、利尿剤、ドパミン作用剤、脂質調整剤、筋肉弛緩薬、副交感神経作用薬、甲状腺カルシトニン、プロスタグラジン、放射性医薬、性ホルモン、刺激剤、食欲抑制剤、交感神経作用薬、甲状腺剤、血管拡張剤、イソフラボン、キサンテン等を例示することができる。
　難溶性の物質としては、より具体的には、グリチルレチン酸およびその塩、グリチルリチン酸およびその塩、クマリン、オノニン、リクイリチン、ペプチド、コラーゲンなどのポリプチド、キシランなどの多糖類、リグニン、クロラムフェニコールなどを挙げることができる。
　本発明の双性イオンポリマーを添加することで、これらの難溶性物質の溶解性を向上させることができる。さらに、本発明の双性イオンポリマーと、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物とを含有する溶液に難溶性物質を溶解すれば、当該難溶性物質の溶解度が顕著に向上する。

　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。

（純水）
　実施例において、水はザルトリウスの超純水製造装置を通したものを使用した。
（細胞）
　マウス線維芽細胞（ｍＮＦ）（Ｍｏｕｓｅ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｆｉｂｒｏｂｌａａｓｔ）は、Ｃ５７ＢＬ／６－ＥＧＦＰマウスより樹立したものを用いた。ヒト腎臓細胞（ＢＯＳＣ）、ラットグリア細胞腫（Ｃ６細胞）は、金沢大学　平田研究室から入手した。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）およびマウスグリア・神経細胞形質共発現細胞（Ｖｎ１９１９細胞）は、金沢大学　Ｗｏｎｇ研究室から入手した。ＯＶＭＡＮＡ細胞は、医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクで購入した。
（¹Ｈ－ＮＭＲ）
　¹Ｈ―ＮＭＲは日本電子株式会社製ＥＣＡ４００（外部磁場４００ＭＨｚ）を用いて測定した。
（ＧＰＣ）
　固定相は、ＴＳＫｇｅｌ　α－Ｍカラム（東ソー）を用いた。移動相に純水を用い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、測定温度は４０℃とし、屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ）により検出し、各種分子量はポリエチレンオキシドに換算して求めた。
（ＤＳＣ）
　島津製作所のＤＳＣ装置を用いた。
　－１５０℃まで１℃／ｍｉｎで冷やし、その後、５℃／ｍｉｎで室温まで戻す昇温工程において氷が溶解する温度を測定した。
（ＤＬＳ）
　粒度分布は、堀場製作所製ＤＬＳ装置を用いた。
　３μｍのフィルターに通した溶液をディスポセルに入れて、設定温度２５℃で粒子径を測定した。
（浸透圧）
　蒸気圧タイプの浸透圧計（ＶＡＰＲＯ　５６００；　Ｗｅｓｃｏｒ，　Ｉｎｃ．，　Ｌｏｇａｎ，　ＵＴ，　ＵＳＡ）を利用し、１０ｍＬ標準チャンバーで測定した（室温：２５℃、装置のセンサー温度：３３℃、サンプル量：１０μＬ）。

（凍結保存試験）
（ａ）細胞の凍結保存
　接着細胞の場合は、凍結対象とする細胞をトリプシン処理にて遠沈回収した。浮遊細胞の場合は、凍結対象とする細胞を遠沈回収した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて希釈して細胞濃度をそれぞれ計測した。ＤＭＥＭ溶液を本明細書では単にmediumと記載する場合がある。
　続いて、１．５ｍＬチューブに１ｍＬずつ分注して遠沈し、１００μＬの双性イオンポリマー溶液を含む凍結保存液にそれぞれ懸濁し、細胞凍結容器Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（登録商標）を用いて、冷却速度－１℃／分、冷却温度－８５℃で凍結した。なお、本実施例において市販の凍結保存液としてはことわりの無い限り、ＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ（登録商標　富士フイルム和光純薬製）を用いた。凍結保存時間は４８時間とした後、チューブの温度を３７℃で解凍して生細胞数のカウントに用いた。
（ｂ）細胞の解凍と生細胞数の計測
　凍結保存バイアルに３７℃、１ｍＬの培地を加えて融解し、遠沈して上清を除いた。続いて、遠沈により得られた細胞を培地に再懸濁し、生細胞数を計測した。
（細胞毒性試験）
　細胞を、ポリマー溶液中で室温下にて６０分間静置したのち、細胞中の死細胞割合をトリパンブルー染色によって測定した。
（細胞増殖試験）
　細胞を前記凍結保存試験に従い凍結保存したのち、培地（１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ）で一定期間培養し、培養前からの細胞増殖数を計測した。

（実施例１）
（１）ＶｉｍＣ₃Ｃの製造
　１００ｍＬのテトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬株式会社）に、１５．６９ｇ（０．１６７ｍｍｏｌ）のビニルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を添加し、３２．４８ｇ（０．１６７ｍｍｏｌ）の４－ブロモ酪酸エチルエステル（東京化成工業株式会社）を加え、７０℃で２４時間環流した。酢酸エチルで洗浄後、アニオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ　７８Ａ）のカラムに付した。溶出液を減圧留去することでＶｉｍＣ₃Ｃを得た。ＶｉｍＣ₃Ｃ（ＤＭＳＯ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを図１に示す。

（２）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）の製造

　１０ｍＬの純水に、３ｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）のＶｉｍＣ₃Ｃを添加し、重合開始剤として２２．８３ｇ（０．００１４ｍｍｏｌ）の２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（東京化成工業株式会社）を加え、８０℃で１６時間撹拌した。純水で透析、減圧乾燥することでＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）を得た。
　Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）（ｍｅｔｈａｎｏｌ）の¹Ｈ－ＮＭＲを図２に示す。ポリマーのＤ₂Ｏ溶液にＮａＣｌを添加した溶液の¹Ｈ－ＮＭＲを図３に示す。
　重合開始剤の量について、モノマー比で０．０１～１０ｍｏｌ％を加えて反応を行った。本明細書の実施例において、たとえば、本実施例のように重合開始剤をモノマー比で１０ｍｏｌ％を加えて製造したポリマーを溶液全体に対し１０質量％加えた溶液を、１０％１０ｍｏｌ％Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）と記載する。なお、重合開始剤の量について特に断りの無い場合は、モノマー比で１ｍｏｌ％の重合開始剤を加えて製造したポリマーが使用されているものとする。

（実施例２）
Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）の製造法

　２０ｍＬのジメチルスルホキシド（関東化学株式会社）に、４．９５ｇ（０．００３３ｍｍｏｌ）のポリ（４－ビニルピリジン）（メルク株式会社）を添加し、３．２ｇ（０．００３３ｍｍｏｌ）の４－ブロモ酪酸エチルエステル（東京化成工業株式会社）を加え、室温で２４時間撹拌した。酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥することでＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）を得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）（ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ６）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを図４に示す。Ｍｗ＝３４３２１、Ｍｎ＝１９９８１、融点（Ｔｍ）＝１４９℃。

（実施例３）
Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）の製造法

　１０ｍＬのジクロロメタン（関東化学株式会社）に、０．９２ｇ（０．００１８ｍｍｏｌ）のポリ（４－ビニルピリジン）（メルク株式会社）を添加し、１．１ｇ（０．００１８ｍｍｏｌ）の１，３－プロパンスルトン（東京化成工業株式会社）を加え、室温で２４時間撹拌した。酢酸エチルで洗浄、減圧乾燥することでＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）を得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）（Ｄ₂Ｏ、５０℃）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを図５に示す。

（実施例４）
（１）ＶｉｍＣ₃Ｓの製造
　１５０ｍＬのテトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬株式会社）に、２１．７６ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）のビニルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を添加し、２８．２４ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）の１，３－プロパンスルトン（東京化成工業株式会社）を加え、室温で２４時間撹拌した。酢酸エチルで洗浄、減圧乾燥することでＶｉｍＣ₃Ｓを得た。得られたＶｉｍＣ₃Ｓ（Ｄ₂Ｏ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを図６に示す。

（２）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｓ）の製造

　１０ｍＬの２％ＮａＣｌ水溶液（ナカライテスク株式会社）に、３ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＶｉｍＣ₃Ｓを添加し、２７．４２ｇ（０．０００１７ｍｍｏｌ）の２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（東京化成工業株式会社）を加え、８０℃で１６時間撹拌した。純水で再沈殿、減圧乾燥することでＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｓ）を得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｓ）（Ｄ₂Ｏ）の¹Ｈ－ＮＭＲチャートを図７に示す。

（実施例５-１）
Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）５０の製造

　ポリ（４－ビニルビリジン）（Ｍｗ：１６００００、メルク株式会社）（５．５３ｇ、０．０１ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、４－ブロモ酪酸エチルエステル（２．３１ｇ　０．０１ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）を加え、５０℃で１７時間還流した。還流後、酢酸エチルで洗浄し、イオン交換樹脂（名称Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ７８　ｈｙｄｒｏｙｉｄｅ　ｄｓｍ）により精製後、Ｓｐｗｃｔｒａ／ｐｏｒ　７　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄ　ＲＣ　Ｔｕｂｉｎｇ　ＭＷＣＯ　１　ｋＤを用いて透析して、４．８８ｇのＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）５０を得た。¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）チャートを図８に示す。¹Ｈ－ＮＭＲのシグナルによりｍ：ｎ＝１：１であった。Ｍｗ＝２４９０８６、Ｍｎ＝２０４９１４。

（実施例５－２）Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）４０
　実施例５－１で、４－ブロモ酪酸エチルエステル（２．３１ｇ　０．０１ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）の代わりに、４－ブロモ酪酸エチルエステル（１．９１ｇ　０．００８ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）とした以外は、実施例５―１と同様に操作を行い、Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）４０を３．５９ｇ得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）４０の¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＨ₃ＯＨ－ｄ）チャートを図９に示す。ＮＭＲのシグナルより、ｍ：ｎ＝３：２であった。

（実施例５－３）Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）３０
　実施例５－１で、４－ブロモ酪酸エチルエステル（２．３１ｇ　０．０１ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）の代わりに４－ブロモ酪酸エチルエステル（０．９７ｇ　０．００５ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）とした以外は、実施例５－１と同様に操作を行い、Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）３０を２．７９ｇ得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）３０の¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＨ３ＯＨ－ｄ）チャートを図１０に示す。ＮＭＲのシグナルよりｍ：ｎ＝３．３：１であった。

（実施例５－４）Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）２０
　実施例５－１で、４－ブロモ酪酸エチルエステル（２．３１ｇ　０．０１ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）の代わりに４－ブロモ酪酸エチルエステル（０．７７ｇ　０．００３ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）とした以外は、実施例５―１と同様に操作を行い、Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）２０を２．３２ｇ得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）２０の¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＨ３ＯＨ－ｄ）チャートを図１１に示す。¹Ｈ－ＮＭＲのシグナルよりｍ：ｎ＝４：１であった。

（実施例５－５）Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）１０
　実施例５－１で、４－ブロモ酪酸エチルエステル（２．３１ｇ　０．０１ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）の代わりに４－ブロモ酪酸エチルエステル（０．４８ｇ　０．００１ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）とした以外は、実施例５－１と同様に操作を行い、Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）２０を１．９５ｇ得た。得られたＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｃ）１０の¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＨ３ＯＨ－ｄ）チャートを図１２に示す。¹Ｈ－ＮＭＲのシグナルよりｍ：ｎ＝９：１であった。

（実施例６－１）
Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）４０の製造

　水：メタノール（１０ｍＬ：１０ｍＬ）の２％ＮａＣｌ溶液にポリ（４－ビニルビリジン）（Ｍｗ：１６００００、メルク株式会社）（１．９７ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、１,３－プロパンスルトン（０．８４ｇ　０．００６ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）を加え、２５℃で２４時間反応させた。反応液を大量の水で処理をして再沈殿させた。沈殿物を凍結乾燥し、Ｐｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）４０（２．０５ｇ）を得た。生成物の¹Ｈ－ＮＭＲ（メタノール－ＮａＣｌ）チャートを図１３に示す。ピリジンに結合しているメチレン基のプロトン（図１３中の１３のシグナル）のシグナルが水のシグナルと重なり確認出来なかったので５０℃に加温して測定した結果、４．９ｐｐｍにシグナルが現れた。¹Ｈ－ＮＭＲのシグナルより、ｍ：ｎ＝３：２であった。

（実施例６－２）
　実施例６－１において、１,３－プロパンスルトン（０．８４ｇ　０．００６ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）の代わりに１,３－プロパンスルトン（０．２３ｇ　０．００２ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）を用いた以外は実施例６－１と同様に反応してＰｏｌｙ（ＶｐｙＣ₃Ｓ）１５を得た。¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＨ₃ＯＨ－ＮａＣｌ）のシグナルからｍ：ｎ＝１７：３であった。

（実施例７）
Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－ｃｏ－Ｃ８Ｖｉｍ）の製造

　ＶｉｍＣ₃Ｃ及び［Ｃ₃Ｖｉｍ］Ｃｌ（仕込み比ｍ：ｎ＝１：１）（１．３７５Ｍ）１ｇに対して４ｍＬのメタノールを加えて、これらのモノマーを溶解した。２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩１０ｍｏｌ％を加えて、超音波処理１８０分、次いで窒素置換を行い、６０℃オイルルバスで１７時間攪拌した。
　ＤＭＳＯ（貧溶媒）１００ｍＬを冷水に冷やしながら攪拌させ、そこにメタノールに溶かした前記重合反応液を１滴ずつ滴下した。前記重合反応液が貧溶媒中で固化するまで攪拌した。メンブレンフィルターを用いて減圧ろ過、最後アセトンでコポリマー中のＤＭＳＯ、モノマーを洗い流し、メンブレンフィルターからコポリマーを回収した。回収したコポリマーを多量のクロロホルムにて攪拌することでＤＭＳＯを除去した。
　得られたＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－ｃｏ－Ｃ８Ｖｉｍ）の¹Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）チャートを図１４に示す。

（実施例８）

　１－ビニル－イミダゾールに塩化ペンタデカン、７０℃で無溶媒で還流させ、［Ｃ１６Ｖｉｍ］Ｃｌを得た。

（イ）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－ｃｏ－Ｃ１６Ｖｉｍ）－１.０の製造
　ＶｉｍＣ₃Ｃ及び［Ｃ１６Ｖｉｍ］Ｃｌ（仕込み比ｍ：ｎ＝１：１）（１．３７５Ｍ）１ｇに対して４ｍＬのメタノールを加えて、これらのモノマーを溶解した。２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩１０ｍｏｌ％を加えて、超音波処理１８０分、次いで窒素置換を行い、７５℃オイルルバスで１７時間還流した。その後３日間の透析を行い精製し、ｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）（これを、「（イ）Ｃ１６Ｐ」と略す。）を得た。¹Ｈ－ＮＭＲにより求めた精製したポリマーのＣ１６Ｖｉｍ単位の占める割合は０．３４モル％であり、分子量は８４ｋＤａだった。結果を表５に示す。

（ロ）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－ｃｏ－Ｃ１６Ｖｉｍ）－０.５の製造
　前記（イ）Ｃ１６Ｐの合成において、仕込み比１を１：０．５とした以外は同様に操作を行い、ｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）（これを（ロ）Ｃ１６Ｐと略す。）を得た。¹Ｈ－ＮＭＲにより求めた精製したポリマーのＣ１６Ｖｉｍ単位の占める割合は０．２１モル％であり、分子量は３７４ｋＤａだった。結果を表５に示す。

（ハ）Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－ｃｏ－Ｃ１６Ｖｉｍ）－０.１の製造
　前記（イ）Ｃ１６Ｐの合成において、仕込み比１を１：０．１とした以外は同様に操作を行い、ｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）（これを（ハ）Ｃ１６Ｐと略す。）を得た。¹Ｈ－ＮＭＲにより求めた精製したポリマーのＣ１６Ｖｉｍ単位の占める割合は０．０５モル％であり、分子量は１７８ｋＤａだった。結果を表５に、¹Ｈ－ＮＭＲチャートを図２８示す。

（実施例９）
　実施例１で製造したＶｉｍＣ₃Ｃ（双性イオンモノマー）とＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）（双性イオンポリマー）を水に溶解してそれぞれの１０質量％の保存液を作製し、ＢＯＳＣ細胞を用いて生存率を求めた。合わせてポリマーの浸透圧と凍結保存後の細胞の生存率を求め、結果を表１に示す。
　双性イオンポリマー水溶液は双性イオンモノマー水溶液と比較して、生存率が悪かった。双性イオンポリマー水溶液で保存した細胞は水を吸って膨らんで死んでしまったことが観察された。このことは、ポリマー水溶液だけで細胞を凍結保存しようとしたところ、同じ重量であっても分子量が増大したことによって浸透圧が低く低張液になってしまったためだと考えられた。そこで、浸透圧を調節するためにポリマー水溶液にＮａＣｌを添加して浸透圧を測定した。結果を表２に示す。２％ＮａＣｌを添加すると浸透圧は１０質量％双性イオンモノマーと同程度の浸透圧が実現できることが分かった。後の実施例１０に示すように、浸透圧を改善した培地を用いることで高い細胞生存率を得た。

（実施例１０）
　ポリマーの濃度と細胞凍結保存後の生存率の関係を検討するため、Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ）ポリマーＤＭＥＭ溶液（１質量％、５質量％、１０質量％、２０質量％、３０質量％）を凍結保存液として用いたときの細胞（ＢＯＳＣ、ｍＮＦ）の凍結保存後の生存率を測定した。結果を図１５に示す。
　ポリマーの濃度が上昇にするにつれて細胞生存率が上昇し、１０～２０質量％で最大値を得た。このことは、ポリマー濃度の最適値があることを示している。

（実施例１１）
　ポリマーにＮａＣｌを添加して浸透圧を調整したときの細胞凍結保存後の生存率を検討するため、１０％Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ）ポリマー水溶液にＮａＣｌ（０．１質量％、０．５質量％、０．８質量％、１質量％、２質量％）をそれぞれ添加した溶液を細胞凍結保存液として用い、細胞（ＢＯＳＣ、ｍＮＦ）の凍結保存後の生存率を測定した。その結果を、図１６に示す。
　ＮａＣｌ濃度は１質量％付近が最適値であり、細胞にとって等張の溶液がもっとも効果が高いことを示す。このことは細胞の培養液と保存液を兼ねられる可能性を示唆している。

（実施例１２）
　浸透圧を調整するための溶質の種類を検討するため、スクロース（６％水溶液）、トリメチルグリシン（２％水溶液）、ＶｉｍＣ₃Ｃ（モノマーの３％水溶液）および［Ｃ₂ｍｉｍ］ＯＡｃ（モノマーの３％水溶液）を用意し、１０％Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）溶液に所定量を添加した凍結保存液を作成し、細胞（ＢＯＳＣ、ｍＮＦ）の凍結保存後の生存率を測定した。浸透圧と細胞の生存率の関係を表３および図１７に示した。双性イオンモノマーを添加した凍結保存液は添加量が少ないためか浸透圧が低く、細胞生存率を上げることはできなかった。

（実施例１３）
　ポリマーの細胞毒性を検討するため、細胞（ＢＯＳＣ）を、ポリマーを含む培地で静置した。結果を図１８に示す。本発明の双性イオンポリマー含有溶液は、他の物質を含有する溶液と比較して細胞毒性が低いことが判明した。このことから、このポリマー含有培地中で細胞が培養できることが示唆された。さらにその死細胞率は、ポリマーを混ぜていない培地中よりも低く、接着細胞を浮遊状態で培養できる可能性も示唆された。また、ポリマー溶液中で死細胞率が低かったのは、細胞が電解質により分散状態となったポリマーのマトリックスに覆われたこと、あるいはマトリックスを介して細胞同士が接着したことにより、凍結融解時の細胞の死滅が防がれたものと考えられる。また、この結果は、本ポリマーが電解質により分散状態となったポリマーによって形成されるマトリックスにより、それが細胞の接着剤としても作用する可能性を示唆している。

（実施例１４）
　ポリマーへの電解質の添加による溶液の氷晶の形成への影響について検討するため、ポリマー溶液をＤＳＣで測定した。ポリマーのＮａＣｌ溶液のＤＳＣと凍結保存時の氷晶の割合を表４に示す。その結果、ポリマーのＮａＣｌ溶液は、水と相互作用していることが判明した。

（実施例１５）
　ポリマーへの電解質の添加による凝集への影響を検討するため、ポリマー溶液をＤＬＳで測定した。
　ポリマーのＮａＣｌ溶液のＤＬＳチャートを図１９に示す。図１９より、ポリマーは、電解質濃度が高まると、ピークが左にシフトし、電解質の添加によりポリマーの凝集が妨げられることが判明した。
　表４と図１９の結果より、本発明の双性イオンポリマーは、電解質により分散状態となり細胞膜と相互作用をすることで、細胞が凍結融解によって死滅することを防止しているものと考えられる。細胞が電解質により分散状態となったポリマーのマトリックスに覆われたこと、あるいはマトリックスを介して細胞同士が接着したことによって、凍結融解時の細胞の死滅が防がれたものと考えられる。

（実施例１６）
　ポリマーの分子量の相違による細胞の凍結保存後の生存率への影響を検討するため、分子量の異なる１０％Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）溶液を凍結保存液として用いたときの細胞（ＢＯＳＣ、ｍＮＦ）の凍結保存後の生存率を測定した。
　ポリマーのＧＰＣ結果を図２０に、ポリマーと細胞の生存率の関係を図２１に示す。図２０の通り、重合開始剤の量を増加させると、ポリマーの分子量が小さくなる傾向が認められた。
　また、図２１に示すように、重合開始剤の量がモノマー比０．１ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％の間においては、細胞の凍結保存後の生存率に影響なく、ポリマーの分子量が少なくともＭｗが１０万～２５万、Ｍｎが５万～２０万の範囲であれば凍結保存液として使用できることが分かった。

（実施例１７）
　ポリマー溶液を凍結保存液として用いたときの他の細胞の凍結保存後の生存率への影響を検討するため、３種類の細胞（Ｋ５６２細胞、Ｃ６細胞、ＯＶＭＡＮＡ細胞）を用いて凍結保存後の生存率を測定した。結果を図２２、図２３、及び図２４に示す。本発明ポリマーを凍結保存液として用いると、市販品とそん色ない凍結保存後の細胞生存率が得られることが分かった。特に、凍結保存に弱いとされているＫ５６２細胞、ＯＶＭＡＮＡ細胞では、市販の凍結保存液を用いた場合よりも高い生存率が得られた。

（実施例１８）
　ポリマー溶液が細胞の増殖速度に与える影響を検討するため、細胞（Ｃ６細胞、ＯＶＭＡＮＡ細胞）を凍結保存後、Ｃ６細胞は４８時間、ＯＶＭＡＮＡ細胞は１８日間培養し細胞増殖数を計測した。結果を図２５、及び図２６に示す。本発明の双性イオンポリマー含有溶液を用いた凍結保存後の細胞については、増殖が確認された。ＯＶＭＡＮＡ細胞に対しては、市販品よりも多い細胞数が確認された。Ｃ６細胞に対しては市販品にやや劣る結果となったものの増殖した。

（実施例１９）
　ポリマー溶液中の細胞を観察するため、ＰＢＳ又は、１０％Ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ₃Ｃ）１％ＮａＣｌ溶液中に細胞を常温で６０分間静置した。顕微鏡で様子を観察した結果を図２７に示す。その結果、（ａ）ＰＢＳ中の細胞は均等に分散していたが、（ｂ）ポリマー溶液中の細胞は細胞同士が接着していた。このことから、ポリマーは細胞周辺にマトリックスを形成していることが示唆された。

（実施例２０）
　実施例８で合成したｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－Ｃ１６Ｖｉｍ）の冷凍保存効果を調べた。
　Ｃ１６モノマー由来の単位の含量がモル比で０．０５ｍｏｌ％（実施例８（ハ）），０．２１ｍｏｌ％（実施例８（ロ））、０．３４ｍｏｌ％（実施例８(イ）)のｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）のポリマーの１０ｗｔ％により凍結保存を行い、ＢＯＳＣ細胞、Ｋ５６２細胞、ＯＶＭＡＮＡ細胞の生存率を調べた。なお、Ｃ１６モノマー由来の単位の含量が０ｍｏｌ％のポリマーとしては実施例１で合成したポリマーを用いた。結果を図２９に示す。いずれの細胞系においてもＣ１６由来のユニットの含量が０．０５ｍｏｌ％の効果が良好であった。

（実施例２１）
　実施例８で合成したｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）のＢＯＳＣ細胞に対する毒性を調べた。Ｃ１６モノマー由来の単位の含量がモル比で０．０５ｍｏｌ％（実施例８（ハ）），０．２１ｍｏｌ％（実施例８（ロ））、０．３４ｍｏｌ％（実施例８(イ）)のｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）のポリマーの１０ｗｔ％の培地を用い、１×１０⁶のＢＯＳＣ細胞を、３７℃で１時間インキュベートし、その後、生細胞をカウントし、生存率を求めた。なお、Ｃ１６モノマー由来の単位の含量が０ｍｏｌ％のポリマーとしては実施例１で合成したポリマーを用いた。結果を図３０に示した。（イ）～（ハ）のＣ１６の含量依存的な毒性は示さなかった。

（実施例２２）
　実施例８で合成したｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６）冷凍保存効果に対する塩分濃度の影響を調べた。
　ＮａＣｌが０．５ｗｔ％、１ｗｔ％、２ｗｔ％の濃度で、実施例８（ハ）の１０ｗｔ％の培地を作製し、Ｋ５６２細胞を冷凍保存し、保存率を調べた。結果を図３１に示す。１ｗｔ％ＮａＣｌとしたとき最も良好な溶液であった。

（実施例２３）
（蛍光ラベル化合物ｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの合成）

　ＶｉｍＣ３Ｃ、［Ｃ１６Ｖｉｍ］Ｃｌ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｏ－ａｃｒｙｌａｔｅをそれぞれモル比１：１：１でＭｅＯＨに添加し、ＡＩＢＮを加えて７５℃、１７時間反応させ、冷却後３日間の透析を行い、ｐｏｌｙ（ＺＩ－Ｃ１６－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを蛍光ラベル化合物として得た。

（メカニズムの考察）
　ＢＯＳＣ細胞の培地に合成した蛍光ラベルを添加し、２０分後、ＰＢＳで洗浄し共焦点顕微鏡で観察した。その結果を図３２に示す。図３２より、ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－Ｃ１６Ｖｉｍ）が細胞周辺、特に細胞膜に集積していることが明らかとなった。これは、ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－Ｃ１６Ｖｉｍ）が細胞外でマトリックスを形成し、特に細胞膜上において細胞外からの氷晶の流入を防いでいることを示すものと考えることが出来る。さらに、ｐｏｌｙ（ＶｉｍＣ３Ｃ－Ｃ１６Ｖｉｍ）のアルキル側鎖が細胞膜に差し込まれて細胞膜の外側に繋留され、その結果、細胞膜を保護する形で氷晶の流入を防いでいることも考察することができたので、そのことを図３３に模式的に説明した。

Claims

　次の一般式（１）で表される双性イオンポリマー又はその標識体。

（式中、
　Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示し；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
　ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
　Ｙ¹及びＹ²が、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-及び－ＳＯ₃ ^-から選ばれるアニオンである請求項１記載の双性イオンポリマー又はその標識体。
　Ｚが、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド及びＣ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミドから選ばれる基である請求項１又は２記載の双性イオンポリマー又はその標識体。
　次の一般式（１）で表される双性イオンポリマー又はその標識体を含有する生体試料の保存剤組成物。

（式中、
　Ｘ¹及びＸ²は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ¹及びＹ²は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-、－ＳＯ₃ ^-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ^-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ₃）Ｏ^-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ¹）Ｏ^-から選ばれるアニオンを示し；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
　ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
　Ｙ¹及びＹ²が、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ^-及び－ＳＯ₃ ^-から選ばれるアニオンである請求項４記載の生体試料の保存剤組成物。
　Ｚが、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド及びＣ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミドから選ばれる基である請求項４又は５記載の生体試料の保存剤組成物。
　さらに、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を含有する請求項４～６のいずれか１項に記載の生体試料の保存剤組成物。
　さらに、細胞浸透性物質を含有する請求項４～７のいずれか１項に記載の生体試料の保存剤組成物。
　生体試料の凍結保存剤組成物、生体試料の培養用組成物、生体試料の培地組成物、生体試料の保存用組成物、生体試料の機能維持用組成物、又は生体試料の機能試験用組成物である請求項４～８のいずれか１項に記載の生体試料の保存剤組成物。
　請求項１～３のいずれか1項に記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含む難溶性物質溶解剤。
　生体試料に、請求項１～３のいずれか1項に記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物を接触させることを特徴とする、生体試料の保存方法。
　請求項１～３のいずれか１項に記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物がさらに、電解質、ベタイン、双性イオン、アルコール、多価アルコール及び糖類から選ばれる１種以上の水溶性化合物を含有する請求項１１記載の生体試料の保存方法。
　請求項１～３のいずれか１項に記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物がさらに、細胞浸透性物質を含有する請求項１１又は１２記載の生体試料の保存方法。
　生体試料の保存が、生体試料の凍結保存、生体試料の培養、生体試料の培地、生体試料の機能維持、又は生体試料の機能試験である請求項１１～１３のいずれか１項に記載の生体試料の保存方法。
　難溶性物質を、請求項１～３のいずれか１項に記載の双性イオンポリマー又はその標識体を含有する組成物に溶解することを特徴とする、難溶解性物質の溶解方法。