WO2023242495A1 - Dispositif de culture cellulaire - Google Patents

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WO2023242495A1
WO2023242495A1 PCT/FR2023/050791 FR2023050791W WO2023242495A1 WO 2023242495 A1 WO2023242495 A1 WO 2023242495A1 FR 2023050791 W FR2023050791 W FR 2023050791W WO 2023242495 A1 WO2023242495 A1 WO 2023242495A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
groove
face
cavity
central pillar
Prior art date
Application number
PCT/FR2023/050791
Other languages
English (en)
Inventor
Maël LE BERRE
Ana Rita DA SILVA RODRIGUES RIBEIRO
Patricia Marie Lyne Hazel DAVIDSON
Original Assignee
4Dcell
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 4Dcell filed Critical 4Dcell
Publication of WO2023242495A1 publication Critical patent/WO2023242495A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/22—Settling tanks; Sedimentation by gravity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional cell culture device allowing self-organization of cells in the form of a three-dimensional circular ring.
  • Spheroids are a promising three-dimensional cell culture model for reflecting the in vivo environment of cells. These multicellular aggregates are unorganized self-assemblies of cells. It has been considered for several years that tumor cell spheroids are capable of approaching the complexity of tumors in vitro and of being used for the characterization of new treatments. However, we see that these structures have a certain number of disadvantages. First, spheroids are difficult to manipulate and characterize without disrupting their self-assembly. It is difficult to acquire images of cells at inside the spheroid without manipulating it. Furthermore, for many organs, the natural organization of the cells of this organ in a simple spheroid does not make it possible to reproduce the organization observed in vivo. The cells at the heart of the spheroid also experience an oxygen deficit which may not be desirable for the intended experiment.
  • EP 3425043 describes a screening method using spheroids organized in a multi-well culture plate.
  • the spheroids are formed in U-shaped wells whose walls are non-adherent for the cells.
  • the effect of the tested drugs is evaluated by validating whether a spheroid is self-assembled or not.
  • Patent application US2017-0089887 describes an in vitro model for measuring cellular contractility.
  • the cells are first magnetized (by adding magnetic nano-beads) and placed in wells above ring-shaped magnetic fields which impose a ring-like organization on the cells.
  • the magnetic field is removed after 3D self-assembly of cells.
  • the compounds to be tested are added to the wells and the images acquired make it possible to quantify the contractility of these rings of cells.
  • the images are compared before and after the addition of the compounds to be tested.
  • WO 2017-008699 entitled “cell traction force measuring device, measuring method and preparation method” describes a measuring device using a layer of nano-pillars of known Young's modulus at the top of which the cells are cultivated. Analysis of the images reveals the deformation of the nano-pillars, and thus a map of the forces applied by each cell can be established.
  • This method is compatible with high-resolution imaging, allowing us to understand what happens at the cellular and subcellular level.
  • this method measures the forces exerted by individual cells which are not necessarily representative of the pathology and/or the organ that we wish to study.
  • manufacturing nanopillars is expensive and complex. This prevents the adaptation of these methods to multi-well plates which are standard for drug screening.
  • US 9250241 describes the use of deformable substrates covered with micro-patterns, which are themselves covered with fluorescent adhesive proteins and are surrounded by non-adhesive polymer to the cells. Cells are cultured on these substrates and are located exclusively in adhesive areas. Traction is quantified by comparing images of the micropatterns with and without cells on the patterns. The analysis can then be carried out by comparing the shape of the fluorescent patterns.
  • This method based on micro-patterns is oriented towards measurements of individual cells. This does not make it possible to reproduce the natural environment of cells composed of multiple cells favoring their natural communication and organization. Furthermore, this process does not make it possible to create 3D cell assemblies since the cells adhere to a substrate. The organizations obtained are therefore poorly representative of the 3D organization of cells in vivo.
  • the main disadvantage of this technology relates to the ease of use of the process.
  • the rings of heart tissue must be removed from the molds while this manipulation is difficult. Additionally, imaging of individual cells is not possible because the rings are too thick, while ring imaging and force assessment cannot be performed simultaneously, leading to a time-consuming process. time-consuming and very expensive.
  • - Cells may need to be modified before being cultured (e.g. magnetization of cells with nano beads)
  • the invention improves the situation.
  • the invention makes it possible to avoid the drawbacks of currently known 3D systems by proposing a three-dimensional cell culture device, preferably made of an optically transparent material such as a hydrogel or a biocompatible polymer material, this device allowing the spontaneous assembly of cells into aggregates.
  • the subject of the invention is a cell culture device comprising a receptacle for cells which rests on a base, the receptacle being made in one piece and having a first face which rests on the base and a second face substantially opposite the first face, as well as a cavity having an opening at the level of the second face and a bottom near the first face, which cavity comprises at least one groove disposed in the bottom and forming a culture portion arranged to receive cells and allow their culture, and a guide which comprises at least one inclined plane which connects the second face to the groove, which inclined plane has a state surface arranged to guide cells deposited on the second face substantially at the level of the groove in said culture portion by gravity in the manner of a funnel.
  • the inclined plane can surround the groove
  • the groove can be arranged along a closed path in the cavity
  • the groove can be arranged in an annular shape in the cavity
  • the device may further comprise a central pillar disposed in the center of the groove;
  • the central pillar can be surrounded by the groove and at least part of the perimeter of said central pillar can define the internal perimeter of the groove;
  • the central pillar can be arranged in a general S shape (i.e. have a narrowed circumference below a certain height);
  • the device can be made at least partially, preferably completely, in a transparent material
  • the material of the device may have a refractive index of between 1.32 and 1.45, preferably equal to 1.33, so as to allow the acquisition of in situ images of individual cells or an aggregate of cells;
  • the device can be made at least partially, preferably completely, in a material based on a flexible or soft biocompatible hydrogel making it possible to measure the force of contraction of the aggregate of cells forming the annular-shaped tissue;
  • the cell culture device described here is three-dimensional. It presents a structured substrate, comprising a hollow cavity having a shape that can be described as a crater, the bottom of which has a groove taking the shape of a path in which the cells can spontaneously organize themselves into a continuous tissue in three dimensions shape following the path.
  • the path can be of any shape, provided that the groove it defines has an aspect ratio (length of the groove path divided by the width of the groove) greater than or equal to 2, which will lead to the formation of an aggregate of cells taking the shape of the groove defined by the path.
  • the path can be open (straight or irregular line, a network, a grid, a tree shape) to mimic the organization of slender organs such as vessels, or glandular organs.
  • the path can be closed (ring, polygon or any other closed irregular path) if the cells are contractile.
  • the path can advantageously take the form of a ring forming a groove of annular shape in which the cells can spontaneously organize themselves into a continuous three-dimensional tissue of annular shape.
  • the groove is flanked on at least one of its sides and all along the path by inclined sides whose slope points towards the groove and whose width is at least equal to the width of the groove.
  • these sides have an angle greater than 30° relative to the horizontal.
  • the sides are of the same width all around the path.
  • the cells When the cells are seeded on top of this substrate, the cells fall to the bottom of the substrate under the effect of gravity or an artificially applied force such as a centrifugal force so that they are guided along the flanks towards the groove, leading to the formation of a cellular aggregate or tissue whose shape corresponds to that of the groove.
  • the structured culture substrate is preferably composed of a flat support on which the grooves have been formed (preferably molded) in which the cells spontaneously organize themselves into a tissue.
  • the opening of the cavity is circular and has a diameter greater than the diameter of the annular groove.
  • the walls of the cavity completely surround the annular-shaped groove.
  • the device has a central pillar disposed in the center of the groove when the latter is of annular shape.
  • the central pillar is completely surrounded by the annular groove and preferably delimits the internal perimeter of the annular groove.
  • the central pillar comprises a local reduction of its perimeter to an intermediate height in order to allow reliable and constant maintenance of the position of the cell ring around the pillar, in particular when the cells contract or if an external force comes. Apply to the cell ring, for example if the culture medium is replaced. This local reduction in the perimeter prevents the ring from sliding along the pillar if it contracts around it.
  • the local reduction in perimeter is less than 20% of the average perimeter of the central pillar to facilitate the unmolding of the structure.
  • the central pillar can take a general s shape. This s-shape allows reliable and constant maintenance of the position of the cell ring around the pillar, and particularly when the cells contract. As explained above, this local reduction in the perimeter prevents the ring from sliding along the pillar, Fortunately, maintaining the ring allows reliable and reproducible observations and measurements to be made over time.
  • the local reduction in perimeter is less than 20% of the average perimeter of the central pillar to facilitate the unmolding of the structure.
  • the device according to the invention is characterized in that the base of the central pillar is integral with the structured substrate and in that the other end of the central pillar is preferably conical in shape to guide the seeded cells towards the groove.
  • the device is made at least partially, preferably completely, of transparent material, preferably with an optical refractive index of between 1.32 and 1.45, preferably equal to 1. ,33, so as to allow the acquisition of in situ images of individual cells or an aggregate of cells.
  • the device is made at least partially, preferably completely, of a flexible or soft material making it possible to measure the force of contraction of the aggregate of cells forming the annular-shaped tissue.
  • the behavior of the central pillar can be compared to an elastic solid.
  • the contraction force, (F), exerted by the 3D cellular structure is proportional to the variation in the radius of the pillar (A r) multiplied by a constant (a) which depends on the mechanical properties of the material, such as its modulus of elasticity or Young's modulus (F « and A r).
  • the flexible or soft material is a biocompatible material or a hydrogel allowing the diffusion of nutritional elements and/or oxygen and/or allowing the measurement of the force of contraction of the aggregate of cells in ring shape.
  • the device is made partially or totally of a photo-polymerizable polymer material in order to reduce its manufacturing time.
  • the walls of the cavity are made of non-adherent material for the cells in order to let the cells freely exert their own force on the aggregate.
  • the lower part of the groove (bottom), to which the cells adhere can be adherent to provide support for the formation of the aggregate, which makes it possible to stabilize its shape and prevent the aggregate
  • the cell contracts on itself and takes the shape of a simple spheroid.
  • the device according to the invention makes it possible to produce stable ring-shaped organoids after a single cell seeding step.
  • the invention also relates to a multi-well support, which comprises a plurality of cell culture devices according to one of the shapes and/or variants indicated in the present application, preferably distributed regularly on the surface of the support.
  • the invention also relates to a method of manufacturing a device as described above, characterized in that it comprises in particular the following steps:
  • a substrate preferably made of a transparent material (for example glass or plastic, for example in the format of a petri dish, multi-well plate or glass slide)
  • a transparent material for example glass or plastic, for example in the format of a petri dish, multi-well plate or glass slide
  • the culture device according to the invention, the multi-well support and the method can be used for producing cell cultures, in particular cells derived from human cells.
  • the device of the invention makes it possible to maintain autonomous organoids on a structured substrate while allowing flows in the culture medium above and on the annular groove without Need to use some sort of adhesive between the cells and the substrate to avoid disrupting the cells.
  • the operation of the device according to the invention makes it possible to optimize the number of cells necessary to form the three-dimensional ring structure. Few cells are lost because the vast majority of them are guided towards the zone of formation of the ring (groove) due to the presence of the sides (preferably inclined) of the cavity which ensure the guidance and sliding of the cells in the groove.
  • Such a device therefore has a structure that generates a robust and reproducible technique for assembling cells into 3D structures.
  • the invention can also be used to measure contractility forces when the material constituting the structured substrate is flexible or soft.
  • the measurement can be performed by analyzing the deformation of the central pillar (contraction) created by the contraction of the 3D cell ring or organoid.
  • This makes it possible, for example, to measure the contractility force of contractile cells such as striated muscle cells (skeletal muscle cells or cardiac cells), smooth muscle cells (pericytes, vascular smooth muscle cells, visceral smooth muscle cells). or bladder, etc.), mesenchymal contractile cells (fibroblasts) or any other cells having contractile behavior and also measure changes due to the effect of specific compounds, to the environment of chemical cells or to the modification of cells.
  • the invention can also be used to measure the contractility induced by its tension of the surface of the cell aggregate, in particular for cells not -contractile. For example to indirectly measure the surface tension of an aggregate of epithelial cells.
  • measuring the variation in diameter is used to evaluate the variation in the contraction force applied by the cellular structure on the central pillar.
  • the dimensional analysis shows us that the force applied by the organoid can be determined as follows:
  • dF is the variation of force in Newton
  • dD the variation of the measured diameter of the central pillar
  • E the modulus of elasticity of the pillar in N/m 2
  • dO a characteristic length which depends on the precise geometry of the central pillar .
  • an active ingredient or a drug such as Latrunculin A can be used to inhibit cell contraction and thus deduce the force of contraction before application of the drug.
  • the device can also be used to measure contraction force profiles over time by producing films or time-lapses of the organoid.
  • the device can be used to measure the contraction profile of muscle fibers, spontaneous or under the effect of a stimulus, in the presence or absence of the molecules whose effect we seek to measure. For example to study the effect of molecules acting on the contractility of cardiac muscle, skeletal muscles or smooth muscles.
  • Another use of the device according to the invention is to produce 3D cell aggregates like spheroids, but having a higher surface/volume ratio which have the advantage of improving the diffusion of nutrients and oxygen. in organoids compared to spheroids.
  • Yet another use of the device according to the invention consists of making 3D cell aggregates in a single step of seeding cells which remain stuck on the device, due to the contraction of the annular-shaped organoid around the pillar it surrounds. This allows the culture medium around the organoid to be replaced without disturbing it.
  • the structured substrate of the device according to the invention can be manufactured using any type of material which has the capacity to polymerize and which is biocompatible.
  • the monomer molecules react so as to form a three-dimensional network or polymer chain by polymerization and forming polymers which may be synthetic or natural in nature.
  • the polymer will be a hydrogel allowing the diffusion of nutritional molecules and the oxygenation of the organoid and therefore its well-being.
  • -Polymers based on peptides which are not hydrogels can also be used or elastomers such as silicones (for example polydimethyl siloxane) with which it is easy to mold such shapes.
  • silicones for example polydimethyl siloxane
  • this polymer will be photopolymerizable to accelerate the manufacturing process.
  • the polymer will be optically transparent (refractive index close to that of water 1.33) after polymerization, which allows optical microscopic imaging (for example by fluorescence, by high resolution imaging, etc.) .
  • optical microscopic imaging for example by fluorescence, by high resolution imaging, etc.
  • the rigidity of the material can be adjusted to adapt to the environment of the cells. We will therefore choose materials whose rigidity will be between (or adapted) between 0.1 KPa and 1 MPa, preferably between 1 and 20 KPa.
  • the material constituting the structured substrate 1 (at least the walls of the cavity) will preferably be a non-adherent material to help guide the cells towards the annular groove and/or to prevent adhesion of the organoid to the substrate. .
  • a material allowing cell adhesion will be used. This can be further improved by the presence on the surface of a specific extra cellular matrix such as collagen, fibronectin, etc.
  • the dimensions of the annular groove can be adapted to the size of the organoids used in the process within the limits described above.
  • FIG.l shows a sectional view of a device according to the invention
  • FIG.2 shows a top view of a device according to the invention
  • FIG.3 shows a sectional view of a device according to the invention with respective dimensions
  • FIG.4 shows the steps of molding a device according to the invention
  • FIG.5 shows photographs of molds for manufacturing the device according to the invention
  • FIG.6 shows a photograph of fibroblast cells after centrifugation
  • FIG.7 shows a photograph of the cells in [Fig.6] one hour after centrifugation and polymerization of the collagen;
  • FIG.8 shows a sectional view of a variant embodiment of the device according to the invention.
  • FIG.9 shows a sectional view of a variant of the device according to the invention with respective dimensions
  • FIG.10 shows a photograph of the MEFs cells 22 hours after culture in the ring and 12 days later;
  • FIG.11 shows a diagram of the contraction and relaxation of a central pillar caused by cells under tension arranged around the pillar.
  • FIG.l a vertical sectional view of the structured cell culture substrate 1 according to the invention.
  • the substrate comprises a receptacle 2 which rests on a base 10.
  • the substrate further comprises a groove 4 having an annular shape.
  • a central pillar 6 surrounded by the groove 4, this central pillar 6 having a top 5 of preferably conical shape.
  • Above the annular groove 4 is arranged a wall structure having the shape of a funnel (preferably conical). More particularly, the receptacle is made in one piece (or in one piece) and has a first face 30 resting on the base 10.
  • the receptacle further comprises a second face 40 substantially facing the first face 30.
  • the assembly of the structure of walls and the annular groove 4 form a cavity 9 having an opening 8 at the level of the second face 40.
  • the funnel-shaped wall structure of the cavity 9 connects the internal edge of the opening 8 located at the top of the cavity 9 to the external edge of the annular groove 4 located at the base of the cavity 9.
  • the cavity 9 comprises the groove 4 which is arranged in a bottom 50 of the cavity.
  • the groove 4 forms a culture portion arranged to receive cells 7 and allow their culture.
  • the cavity 9 further comprises a guide 60 which comprises at least one inclined plane 3.
  • the inclined plane 3 connects the second face 40 to the groove 4.
  • the inclined plane 3 has a surface condition arranged to guide cells deposited on the second face 40 substantially to the level of the groove 4. The cells thus migrate into the culture portion by gravity in the manner of a funnel.
  • the funnel-shaped wall structure guides the cells towards the groove 4 of annular shape, which leads to the spontaneous formation of a three-dimensional aggregate of ring-shaped cells.
  • the guide 60 includes an inclined plane 3.
  • the conical tip of the central pillar 5 helps the cells to slide downwards towards the groove 4 and prevents them from clinging to the wall structure, especially when this is made of material with a low coefficient of friction.
  • the tip 5 is conical and preferably has an apex angle equal to or substantially equal to the apex angle of the funnel.
  • the dimensions of the annular groove can vary in large proportions in order to facilitate the formation of cell aggregates according to the invention.
  • the depth hl of the annular groove may vary between 0 and 3000 microns, preferably between 50 and 200 microns, the external diameter of the groove dl between 10 and 10000 microns, preferably between 200 and 700 microns, the width of the annular groove W 1 between 3 and 3000 microns, preferably between 50 and 200 microns.
  • the cavity 9 preferably having the shape of a conical funnel along its walls will have a height h2 between the opening 8 and the outer edge of the ring of between 0 and 2000 microns, preferably between 100 and 300 microns.
  • h2 is equal to 0 the device has a configuration limited to the annular groove which allows the formation of the cell ring, but without directing the cells towards groove 4, which reduces the number of cells in the device.
  • the angle at the top Alpha 1 can vary between 0 and 90 degrees, preferably between 40 and 50 degrees so as to allow the cells introduced into the cavity 9 to slide into the annular groove.
  • the central pillar preferably defining a vertical axis of symmetry of the device according to the invention, will have a height h3 between 1 and 4000 microns, preferably between 150 and 550 microns, a diameter d2 between 1 and 5000 microns, preferably between 100 and 350 microns, a vertical part of height h4 between 1 and 3000 microns, preferably between 60 and 150 microns, and an Alpha 2 vertex angle between 0 and 180 degrees, preferably between 80 and 100 degrees, (an angle zero or 180 corresponding to a pillar with a flat top), height hl.
  • the device can also take the form described in Figures 8 and 9.
  • the wall structure of the conical cavity 9 has an inclined plane 13 which ends at the edge of the annular groove 4; the central pillar 6 has two side faces 15 extending to the groove 4 which, unlike those of the pillar 6 shown in [Fig.l], are not straight but have an S shape, giving the groove 4 a greater width at its lower part than that of this groove at the base of pillar 6 (in this figure).
  • this particular shape allows the formation of an organoid which can slide upwards under the action of the cells, while remaining fixed on the central pillar thanks to its geometric shape forming a protuberance 16 in [Fig.8].
  • Alpha 3 can vary between 0 and 90 degrees, preferably between 40 and 50 degrees, rl and r2 can vary between 0.01 mm and 0.9 mm, preferably between 0.05 and 0.1 mm.
  • the cells can be cultured in two ways: either simply suspended in a cell culture medium, or mixed with an extracellular matrix, either natural or synthetic, such as for example type I, II, III, IV and V collagen.
  • an extracellular matrix either natural or synthetic, such as for example type I, II, III, IV and V collagen.
  • Collagen is the main compound of the natural extracellular matrix in the human body, this protein is present between cells in many connecting tissues. It can also be a matrigel, a hydrogel or other extracellular matrices.
  • the concentration or quantity of cells which must be seeded on the substrate depends on the type of cells and the diameter of the cavity compared to the surface of the ring.
  • the manufacture of the structured substrate can be carried out simply by molding using a mold making it possible to print the desired structure (see for example below [Fig.4]) in the material used.
  • This molding process being simple, it is easy to mold a plurality of devices in a single step to produce multi-well plates.
  • FIG.4 illustrates a method of manufacturing the device according to the invention.
  • a preferably flat support 23 glass plate petri dish, multi-well plate, etc.
  • a layer 24 of the chosen polymer in the unpolymerized state
  • the coated layer 24 takes the desired form of positive structure of the micro-structured substrate 1.
  • demolding [Fig.4]
  • the final 3D micro-structured substrate 1 is obtained.
  • the surface of the mold will preferably be very smooth with a roughness of less than one micron.
  • the molds will preferably be manufactured by high-resolution processes (digital milling, 3D printing using two-photon lithography.)
  • the device according to the invention makes it possible to use any type of biological cells which can adhere to each other, such as endothelial cells, cardiac cells, smooth muscle cells, epithelial cells, chondrocytes, fibroblasts...
  • the structured substrate of the device according to the invention can be manufactured using any type of material which has the capacity to polymerize and which is biocompatible.
  • the monomer molecules react so as to form a three-dimensional network or polymer chain by polymerization and forming polymers which can be synthetic or natural in nature.
  • the cells can be cultured in two ways: either simply suspended in a cell culture medium, or mixed with an extracellular matrix, either natural or synthetic, such as for example type I, II, III, IV and V collagen.
  • an extracellular matrix either natural or synthetic, such as for example type I, II, III, IV and V collagen.
  • Collagen is the main compound of the natural extracellular matrix in the human body, this protein is present between cells in many connecting tissues. It can also be a matrigel, a hydrogel or other extracellular matrices.
  • the concentration or quantity of cells which must be seeded on the substrate depends on the type of cells and the diameter of the cavity compared to the surface of the ring.
  • FIG.5 represents a mold making it possible to produce a plurality of devices according to the invention.
  • Microfabrication or micromachining plays a major role in the manufacture of the device of the invention.
  • miniaturization has seen technological advances in recent years.
  • the transposition of this miniaturization into the field of the invention is generally infeasible or even incompatible.
  • the Applicant thus first turned towards photolithography which is a technique used to transfer a certain shape or pattern onto a material or surface, by selectively exposing light-sensitive polymers using a photomask. Dry etching or wet etching methods can then be used to remove the material from the previously selected areas.
  • Etching by “wet etching” is a chemical procedure which is relatively simple and quick to implement.
  • the material can be etched isotropically (orientation-independent) or anisotropically (orientation-dependent). Isotropic etching is the most common. In this method the material is removed evenly in all directions, which can result in material being removed from under areas that should not be etched. Anisotropic etching (when using substrates that are crystalline) results in less material under the mask, allowing better control of wall geometry. Dry etching techniques use ion bombardment towards the surface to selectively remove material. This method can be used to manufacture smaller structures than wet etching, which allows high aspect ratio structures to be obtained with very good surface quality. Both of these techniques are commonly used, but are heavily limited to simple designs, such as straight or vertical walls.
  • CNC machining is a subtractive technique. It starts from a block of material, for example plastic or metal, which is sculpted using specific tools such as forests. It has high dimensional precision and makes it possible to manufacture mechanically robust parts, with a high reproducibility rate from the very small to the very large scale.
  • the minimum size and complexity of the structures are influenced by the size and shape of the drilling head (all machined points must be accessible), the adaptability of the stage (degree of freedom - in particular, 5 axes), as well as the speed and sensitivity of response or maneuver. It can also be used as a post-processing tool, when the base has primarily been 3D printed or manufactured in any other way and needs to be adjusted precisely.
  • the cell culture device described in the present invention is manufactured by molding. This means that the mold has the negative shape of the final cell culture device.
  • the mold of the invention is thus made of stainless steel having a surface having a roughness Ra of between 0.2 and 0.3 pm. It thus makes it possible to obtain a device of the invention having a roughness Ra of between 0.2 and 0.3 pm.
  • the interior cavity is produced in two stages: a first stage during which a drill bit with a diameter less than that of the central pillar is used to dig a cylindrical hole, and a second stage during which a drill with a spherical profile is used to finely adjust the profile of the walls, allowing the manufacture of "S" shaped or curved profiles and a sharp conical hole which gives the conical profile of the central pillar.
  • CNC computer numerical control
  • the example below uses a substrate based on polyacrylamide.
  • the starting support consists of glass strips 16 mm in diameter which are cleaned and silanized to promote adhesion.
  • UV radiation of appropriate wavelength for example, 365 nm
  • 365 nm UV radiation of appropriate wavelength
  • the following reagents are used in the formulation of these types of gels: C3H5O Acrylamide 40%; C7H10O2N2 N,N’-Methylenebisacrylamide 2%; Irgacure 2959 (1% v/v) - UV sensitive (wavelength 365 nm);
  • the polymerization was carried out by UV photopolymerization.
  • the gel formulation was based on an aqueous solution containing 30% of C3H5O- Acrylamide 40% + 12.5% C7H10O2N2 N,N’-Methylenebisacrylamide 2%; 0.5% Irgacure 2959 (1% v/v).
  • the mold is placed above the lamellae, on the drop of pre-hydrogel solution, and directly irradiated with a UV source of wavelength 365 nm (90 mW, 3 minutes).
  • the gel is unmolded then stored in water.
  • the glass slides thus prepared are assembled on a multi-well plate.
  • the mold used included 23 microstructures allowing the manufacture of 23 cavities comprising annular grooves, and therefore to carry out several tests in the same well.
  • the width (wl) of the rings is 100 pm and the diameter of the central pillars is 240 pm.
  • Fibroblasts derived from human cells from abdominal skin were resuspended in an extracellular matrix of purified type 1 collagen with a collagen concentration of 160,000 cells/ml.
  • a 15 microliter drop of the mixture of cells was deposited on the upper face of the structured substrate previously incubated in cell culture medium.
  • the substrate was then centrifuged for 2 min at 100 G. The cells are naturally guided towards the annular groove under the effect of centrifugal acceleration. Then the collagen mixture polymerizes at 37 degrees for 1 hour, then cell culture medium is added to the wells.
  • FIG.7 is an image of the fibroblast cells after centrifugation while [Fig.8] is an image of the same cells after collagen polymerization (1 hour, 37 degrees) showing that the individual fibroblast cells form a perfect ring around of the central pillar.
  • This example shows the rapid and spontaneous assembly of a 3D organoid in an annular shape using the device of the invention.
  • MEF cells are first dissociated from their substrate using trypsin, then centrifuged. The cell pellet is then resuspended in a new cell culture medium at a concentration of 160,000 cells per ml. 15 microliters of this cell suspension are spiked on top of the gel structure (the structures are incubated in cell culture medium for 15 minutes beforehand). The substrate containing the cells is then incubated at 37°C, 5% CO2. After 22 hours, the ring-shaped organoids are observed by conventional optical microscopy. A self-assembled organoid is visible at this stage, as shown in [Fig.10]. The organoids are maintained in culture for 12 days and the medium is changed every two days. After 12 days, the MEF cell aggregate formed a more compact ring-shaped structure, as shown in [Fig.10].
  • This example demonstrates the rapid self-assembly of ring-shaped organoids. As no extracellular matrix was used in this case, the cells sedimented on the ring-shaped cavity by themselves and no centrifugation step was necessary. In this case, the funnel-shaped structure helps guide the cells towards the ring-shaped cavity.
  • This example also demonstrates that the organoid can be preserved in structured substrates for a long period.
  • the "s" shaped mold plays an important role, as it allows the ring-shaped organoid to stay in place even when the cells contract and could possibly slide down the central pillar, or when fluid is agitated, for example when changing the environment. Maintaining the organoid in place allows stable observation over a long period while allowing the surrounding environment to be easily changed.
  • Measuring the variation in the diameter of the pillar (in other words the internal diameter of the ring) is used to evaluate the variation in the contraction force applied by the cellular structure on the central pillar.
  • a drug such as Latrunculin A (actin depolymerization inducer) can be used to inhibit cell contraction and thus deduce the force of contraction before application of the drug.
  • Latrunculin A actin depolymerization inducer
  • the C2C12 cells are dissociated with trypsin, then centrifuged. The cell pellet is then resuspended in a new culture medium at a concentration of 500,000 cells per ml. 200 ⁇ l of this cell suspension are pipetted on top of the gel structure (previously incubated in culture medium for 15 minutes). The plate is then centrifuged and incubated at 37°C, 5% CO2. [0163] After 6 hours, the structures are imaged and the diameter of the central pillars measured. To evaluate the force applied by the organoid on the central pillar, the cells are exposed to medium containing Latrunculin A (1:1000). After 30 minutes of incubation, the structures are imaged again and the diameter of the central pillars measured.
  • the diameter of the central pillar increases by approximately 1.5% in the presence of Latrunculin A compared to the control experiment without the drug. This is demonstrated in [Fig. He],
  • the groove has a bottom and two sides; the groove is arranged in a rectilinear, open or closed curvilinear, ovoid or circular shape; the groove is closed type.
  • the receptacle comprises a central pillar surrounded by said groove (this is a so-called annular groove). In a particular mode, the central pillar has a constriction at its lower part.

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Abstract

L'invention vise un dispositif de culture cellulaire comprenant un réceptacle (2) pour des cellules qui repose sur une base (10). Le réceptacle (2) est réalisé d'un seul tenant et présente une première face (30) qui repose sur la base (10) et une deuxième face (40) sensiblement en regard de la première face (30), ainsi qu'une cavité (9) présentant une ouverture (8) au niveau de la deuxième face (40) et un fond (50) à proximité de la première face (30), laquelle cavité (9) comprend au moins une rainure (4) disposée dans le fond (50) et formant une portion de culture agencée pour recevoir des cellules (7) et permettre leur culture, et un guide (60) qui comprend au moins un plan incliné (3) qui relie la deuxième face (40) à la rainure (4), lequel plan incliné (3) présente un état de surface agencé pour guider des cellules déposées sur la deuxième face (40) sensiblement au niveau de la rainure (4) dans ladite portion de culture par gravité à la manière d'un entonnoir.

Description

Description
Titre de l’invention : Dispositif de culture cellulaire
[0001] La présente invention concerne un dispositif de culture en trois dimensions de cellules permettant F auto-organisation des cellules sous forme d’un anneau circulaire en trois dimensions.
[0002] Les procédures in vitro faisant appel à des cellules sont de plus en plus présentes dans la recherche, notamment dans les phases initiales de recherche de nouvelles molécules ou médicaments (tests précliniques). Leur utilisation est indispensable pour éviter un recours massif aux tests sur les animaux (tests in vivo) d’autant plus que l’utilisation de telles techniques présente en outre de nombreux avantages tels que simplicité d’utilisation, faibles coûts, et leur rapidité de mise en œuvre.
[0003] L’aspect critique de ces procédures in vitro est constitué par les cellules et leur réponse aux molécules testées, aux médicaments ou à des stimuli externes. Bien que très utiles, la plupart des procédures utilisées aujourd’hui reposent sur l’utilisation de monocouches de cellules en deux dimensions. Dans ces situations, les cellules sont cultivées sur des substrats plats et rigides, par exemple les plaques multi-puits de culture de cellules (de type plaques pour ELISA). Lorsque l’on compare l’environnement in vitro 2-D des cellules avec l’environnement in vivo, on arrive à la conclusion que les résultats obtenus ne correspondent pas à ce qui se passe réellement dans le corps humain. Ces conditions inadaptées de culture cellulaire sont probablement la cause du faible taux de réussite des tests cliniques de nouveaux médicaments.
[0004] C’est pour cela qu’il existe aujourd’hui un besoin de modèles in vitro qui copient de façon exacte l’environnement naturel des cellules, permettant ainsi un criblage fiable des médicaments. Pour éviter les inconvénients des modèles existants, des procédures de tests in vitro se sont développées pour reproduire un environnement en trois dimensions qui soit plus fidèle au microenvironnement in vivo des cellules, avec un contrôle plus précis des propriétés physiques et biochimiques, ce qui permet aux cellules testées de répondre d’une manière plus proche de la réalité.
[0005] Les sphéroïdes sont un modèle de culture cellulaire en trois dimensions prometteur pour refléter l’environnement in vivo des cellules. Ces agrégats multicellulaires sont des auto- assemblages de cellules non-organisés. On considère depuis quelques années que les sphéroïdes de cellules tumorales sont capables de se rapprocher in vitro de la complexité des tumeurs et d’être utilisés pour la caractérisation de nouveaux traitements. Toutefois, on constate que ces structures ont un certain nombre de désavantages. Tout d’abord, les sphéroïdes sont difficiles à manipuler et à caractériser sans perturber leur auto-assemblage. Il est difficile d’acquérir des images des cellules à l’intérieur du sphéroïde sans le manipuler. De plus, pour de nombreux organes, l’organisation naturel des cellules de cet organe dans un simple sphéroïde ne permet pas de reproduire l’organisation observéein vivo. Les cellules au coeur du sphéroïde subissent un également déficit en oxygène qui peut ne pas être souhaitable pour l’expérimentation visée.
[0006] Il est décrit dans EP 3425043 une méthode de criblage utilisant des sphéroïdes organisés dans une plaque de culture multi puits. Les sphéroïdes sont formés dans des puits en forme de U dont les parois sont non- adhérentes pour les cellules. L’effet des médicaments testés est évalué en validant si un sphéroïde est auto-assemblé ou non.
[0007] Malgré la compatibilité de ce procédé avec les plaques multi puits couramment utilisées dans les plateformes de criblage, il présente un certain nombre d’inconvénients. La forme en U des puits dégrade la qualité de l’imagerie des sphéroïdes. De plus, la réponse obtenue (l’effet des molécules) est seulement évaluée de manière qualitative par la formation ou l’absence de formation du sphéroïde. Un autre inconvénient de ce type de dispositif est qu’il ne permet pas de maintenir l’organoïde en place si bien qu’il est difficile de changer le milieu de culture environnant sans déplacer le sphéroïde.
[0008] Un autre aspect important des modèles de culture de cellules in vitro sont les paramètres qui peuvent être mesurés et la facilité avec laquelle ces mesures sont effectuées. De plus, l’adaptabilité de ces procédures aux plateformes de criblage rapide à grande échelle des médicaments est d’une très grande importance.
[0009] Il est décrit dans la demande de brevet US2017-0089887 un modèle in vitro permettant de mesurer la contractilité cellulaire. Les cellules sont d’abord magnétisées (par addition de nano-billes magnétiques) et placées dans des puits au-dessus de champs magnétiques en forme d’anneau qui imposent une organisation en anneau aux cellules. Le champ magnétique est supprimé après F auto-assemblage 3D des cellules. Les composés à tester sont ajoutés dans les puits et les images acquises permettent de quantifier la contractilité de ces anneaux de cellules. Les images sont comparées avant et après l’addition des composés à tester.
[0010] Si la contractilité ou relaxation de l’anneau peut être observée, cette méthode ne permet pas de mesurer la force exercée par les cellules. De plus les cellules doivent être modifiées (ajout de billes magnétiques) avant d’être cultivées.
[0011] WO 2017-008699 intitulé « dispositif de mesure de la force de traction de cellule, procédé de mesure et procédé de préparation » décrit un dispositif de mesure utilisant une couche de nano-piliers de module de Young connu au sommet desquels les cellules sont cultivées. L’analyse des images révèle la déformation des nano-piliers, et ainsi une carte des forces appliquées par chaque cellule peut être établie. Cette méthode est compatible avec l’imagerie à haute résolution, permettant de comprendre ce qui se passe au niveau cellulaire et subcellulaire. Cependant, cette méthode mesure les forces exercées par des cellules individuelles qui ne sont pas nécessairement représentatives de la pathologie et/ou l’organe que l’on souhaite étudier. De plus, la fabrication de nano-piliers est coûteuse et complexe. Ceci empêche l’adaptation de ces méthodes aux plaques multi-puits qui sont standards pour le criblage des médicaments. [0012] US 9250241 décrit l’utilisation de substrats déformables recouverts de micro-motifs, qui sont eux-mêmes recouverts avec de protéines adhérentes fluorescentes et sont entourés de polymère non-adhésifs aux cellules. Les cellules sont cultivées sur ces substrats et sont situées exclusivement dans les zones adhésives. La traction est quantifiée en comparant les images des micro-motifs avec et sans cellules sur les motifs. L’analyse peut ensuite être réalisée en comparant la forme des motifs fluorescents.
[0013] Ce procédé basé sur des micro-motifs est orienté sur des mesures de cellules individuelles. Ceci ne permet pas de reproduire l’environnement naturel des cellules composé de cellules multiples favorisant leur communication et leur organisation naturelles. Par ailleurs, ce procédé ne permet pas de créer des assemblages de cellules en 3D puisque les cellules adhèrent sur un substrat. Les organisation obtenus sont donc faiblement représentatif de l’organisation 3D des cellules in vivo.
[0014] Il a récemment été décrit dans I.Goldfracht et al., Acta Biomaterialia (2019) 145-159, un procédé 3D combinant des cellules cardiomyocytes (dérivées de cellules pluripotentes induites) et une matrice hydrogel extra cellulaire dérivée de cœurs de porc dé- cellularisés. Les cardiomyocytes combinés à cette matrice sont disposés dans des moules annulaires, démontrant une contractilité spontanée et synchronisée qui débute dans les 24/48 heures et continue jusqu’à 6 mois. Une analyse de l’expression génique a démontré un signal de maturation adéquate sur cette échelle de temps.
[0015] Les propriétés fonctionnelles du micro-cœur ainsi réalisé ont été évaluées en étudiant du calcium génétiquement encodé et des indicateurs fluorescents sensibles à la tension électrique avec des techniques d’imagerie optique et de mesure de force.
[0016] Le principal inconvénient de cette technologie est relatif à la facilité d’utilisation du procédé. Les anneaux de tissu cardiaque doivent être retirés des moules alors que cette manipulation est difficile. De plus, l’imagerie de cellules individuelles n’est pas possible car les anneaux sont trop épais, tandis que l’imagerie de l’anneau et l’évaluation de la force ne peuvent être réalisés simultanément, ce qui conduit à un procédé prenant beaucoup de temps et s’avérant très coûteux.
[0017] La manière dont les cellules s’organisent, la géométrie 3D des cellules et la géométrie de leur microenvironnement sont des facteurs importants d’un point de vue biologique car ils peuvent impacter la maturation des cellules, leur physiologie et leur comportement fonctionnel. Par exemple, la vitesse et la nature de la différenciation des cellules souches pluripotentes induites peuvent dépendre de ces facteurs et a un impacte sur le comportement des cellules et donc de la représentativité des résultats expérimentaux. Par ailleurs, la mesure représentative de certaines quantités physiques comme la force de contraction des cellules nécessite que ces cellules soient organisées de manière similaire à ce qui est trouvé dans un organisme vivant, par exemple en fibre pour les cellules musculaires.
[0018] La culture des cellules 3D dans les systèmes actuellement connus, notamment la culture des cellules ayant une activité contractile, est limitée pour les raisons suivantes :
[0019] - Les cellules peuvent prendre beaucoup de temps à s’organiser en structures 3D, et leur organisation n’est généralement pas représentative de celle observée in vivo.
- Il y a souvent un grand nombre de cellules qui sont perdues pendant le procédé
- Les cellules doivent éventuellement être modifiées avant d’être cultivées (par exemple, la magnétisation des cellules avec des nano billes)
- L’organoïde produit n’est pas toujours maintenu ce qui rend difficile le remplacement du milieu environnant.
- La compatibilité des procédés avec les plateformes de criblage de médicaments n’est pas toujours possible, notamment avec les plaques multi-puits sur lesquelles l’automatisation industrielle du criblage de médicaments est couramment basée.
- L’acquisition d’images avec une résolution adéquate n’est pas toujours possible et nécessite la manipulation des structures 3D.
- Les résultats sont limités ou difficilement exploitables (observations qualitatives ou de cellules uniques)
- La mesure de paramètres telle que la force contractile des cellules n’est pas toujours mesurable.
[0020] L’invention vient améliorer la situation. En particulier, l’invention permet d’éviter les inconvénients des systèmes 3D actuellement connus en proposant un dispositif de culture de cellules en trois dimensions, réalisé de préférence en un matériau optiquement transparent tel qu’un hydrogel ou un matériau polymère biocompatible, ce dispositif permettant l’assemblage spontané des cellules en agrégats.
[0021] Ainsi, l’invention a pour objet un dispositif de culture cellulaire comprenant un réceptacle pour des cellules qui repose sur une base, le réceptacle étant réalisé d'un seul tenant et présentant une première face qui repose sur la base et une deuxième face sensiblement en regard de la première face, ainsi qu'une cavité présentant une ouverture au niveau de la deuxième face et un fond à proximité de la première face, laquelle cavité comprend au moins une rainure disposée dans le fond et formant une portion de culture agencée pour recevoir des cellules et permettre leur culture, et un guide qui comprend au moins un plan incliné qui relie la deuxième face à la rainure, lequel plan incliné présente un état de surface agencé pour guider des cellules déposées sur la deuxième face sensiblement au niveau de la rainure dans ladite portion de culture par gravité à la manière d'un entonnoir.
[0022] Dans des modes de réalisation particuliers :
[0023] - le plan incliné peut entourer la rainure ;
- la rainure peut être agencée selon un chemin fermé dans la cavité ;
- la rainure peut être agencée selon une forme annulaire dans la cavité ;
- le dispositif peut comporter en outre un pilier central disposé au centre de la rainure ;
- le pilier central peut être entouré par la rainure et au moins une partie du pourtour dudit pilier central peut définir le périmètre interne de la rainure ;
- le pilier central peut être agencé selon une forme générale en S (c’est-à-dire possédé une circonférence rétrécie en dessous d’une certaine hauteur) ;
- le dispositif peut être réalisé au moins partiellement, de préférence totalement, en un matériau transparent ;
- le matériau du dispositif peut présenter un indice de réfraction compris entre 1,32 et 1,45, de préférence égale à 1,33, de sorte à permettre l’acquisition d’images in situ des cellules individuelles ou d’un agrégat de cellules ;
- le dispositif peut être réalisé au moins partiellement, de préférence totalement, en un matériau à base d’hydrogel biocompatible souple ou mou permettant de mesurer la force de contraction de l’agrégat de cellules formant le tissu de forme annulaire ; et
- la rugosité Ra de surface du dispositif peut être comprise entre 0,2 et 0,3 pm. [0024] En termes générales, le dispositif de culture de cellules décrit ici est en en trois dimensions. Il présente un substrat structuré, comportant une cavité creuse ayant une forme que l’on peut qualifier de cratère dont le fond comporte une rainure prenant la forme d’un chemin dans laquelle les cellules peuvent s’organiser spontanément en un tissu continu en trois dimensions de forme suivant le chemin. Le chemin peut être de n'importe quelle forme, pourvu que la rainure qu’il définit aie un rapport d’aspect (longueur de la rainure chemin divisé par la largeur de la rainure) supérieur ou égal à 2, ce qui conduira à la formation d'un agrégat de cellules prenant la forme de la rainure définie par le chemin.
[0025] Le chemin peut être ouvert (ligne droite ou irrégulière, un réseau, une grille, une forme d'arbre) pour mimer l’organisation des organes longilignes tels que des vaisseaux, ou des organes glandulaires. [0026] De préférence, le chemin peut être fermé (anneau, polygone ou tout autre chemin irrégulier fermé) si les cellules sont contractiles. Pour faciliter l’analyse, le chemin peu avantageusement prendre la forme d’un anneau formant une rainure de forme annulaire dans laquelle les cellules peuvent s’organiser spontanément en un tissu continu en trois dimensions de forme annulaire.
[0027] La rainure est flanquée sur au moins un de ses côtés et tout le long du chemin de flancs inclinés dont la pente pointe vers la rainure et dont la largeur est au moins égale à la largeur de la rainure. Préférentiellement, ces flancs ont un angle supérieur à 30° par rapport à l’horizontal. De préférence, les flancs sont de même largeur sur tout le pourtour du chemin.
[0028] Lorsque les cellules sont ensemencées sur le dessus de ce substrat, les cellules tombent au fond du substrat sous l’effet de la gravité ou d’un force appliquée artificiellement comme une force centrifuge si bien qu’elles sont guidées le long des flancs vers la rainure, conduisant à la formation d'un agrégat cellulaire ou d'un tissu dont la forme correspond à celle de la rainure.
[0029] Le substrat structuré de culture est de préférence composé d’un support plat sur lequel on a formé (de préférence moulé) les rainures dans lesquelles les cellules s’organisent spontanément en un tissu.
[0030] Selon un mode préférentiel, l’ouverture de la cavité est circulaire et présente un diamètre supérieur au diamètre de la rainure annulaire.
[0031] De préférence, les parois de la cavité entourent complètement la rainure de forme annulaire.
[0032] Selon un mode préférentiel de réalisation le dispositif présente un pilier central disposé au centre de la rainure lorsque celle-ci est de forme annulaire.
[0033] Selon une variante de réalisation, le pilier central est totalement entouré par la rainure de forme annulaire et délimite de préférence le périmètre interne de la rainure annulaire. Avantageusement, le pilier central comporte une réduction local de son périmètre à une hauteur intermédiaire afin de permettre un maintien fiable et constant de la position de l’anneau de cellule autour du pilier, notamment lorsque les cellules se contractent ou si une force extérieure vient s’appliquer sur l’anneau de cellule, par exemple si le milieu de culture est remplacé. Cette réduction locale du périmètre évite que l’anneau glisse le long du pilier s’il se contracte autour de celui-ci.
[0034] Selon un mode préférentiel, la réduction locale de périmètre est inférieur à 20% du périmètre moyen du pilier central pour faciliter le démoulage de la structure.
[0035] Ainsi, le pilier central peut prendre un forme générale en s. Cette forme en s permet un maintien fiable et constant de la position de l’anneau de cellule autour du pilier, et particulièrement lorsque les cellules se contractent. Comme expliqué ci-dessus, cette réduction locale du périmètre évite que l’anneau glisse le long du pilier, avanta- geusement, le maintien de l’anneau permet de réaliser des observations et des mesures fiables et reproductibles dans le temps.
[0036] Selon un mode préférentiel, la réduction locale de périmètre est inférieur à 20% du périmètre moyen du pilier central pour faciliter le démoulage de la structure. Selon un mode préférentiel le dispositif selon l’invention est caractérisé en ce que la base du pilier central est solidaire du substrat structuré et en ce que l’autre extrémité du pilier central est de préférence en pointe de forme conique pour guider les cellules ensemencées vers la rainure.
[0037] Selon un autre mode préférentiel de réalisation, le dispositif est réalisé au moins partiellement, de préférence totalement, en matériau transparent, de préférence avec un indice optique de réfraction compris entre 1,32 et 1,45, de préférence égale à 1,33, de manière à permettre l’acquisition d’images in situ des cellules individuelles ou d’un agrégat de cellules.
[0038] Selon un mode préférentiel de réalisation, le dispositif est réalisé au moins partiellement, de préférence totalement, en un matériau souple ou mou permettant de mesurer la force de contraction de l’agrégat de cellules formant le tissu de forme annulaire. Le comportement du pilier central peut être rapproché d'un solide élastique. Ainsi la force de contraction, (F), exercée par la structure cellulaire 3D est proportionnelle à la variation du rayon du pilier ( A r) multipliée par une constante (a) qui dépend des propriétés mécaniques du matériau, comme son module d’élasticité ou module de Young(F « et A r).
[0039] Avantageusement, le module de Young du matériau est dans la gamme de 500 Pa à 100 kPa et du même ordre de grandeur que la pression exercé par l’anneau exprimé approximativement par l’expression P=T/(R.h) ou T est la force contractile exercé par les cellule le long de l’anneau (en Newton), R est le rayon du pilier à l’endroit où l’anneau l’enserre (en mètre) et h et la hauteur de contact entre l’anneau et le pilier (en mètre)
[0040] De préférence le matériau souple ou mou est un matériau bio-compatible ou un hydrogel permettant la diffusion d’éléments nutritionnels et/ou d’oxygène et/ou permettant la mesure de la force de contraction de l’agrégat de cellules en forme d’anneau.
[0041] Selon une variante de réalisation, le dispositif est réalisé partiellement ou totalement en un matériau polymère photo-polymérisable afin de réduire sa durée de fabrication.
[0042] Afin de permettre aux cellules de se concentrer dans la rainure de forme annulaire, les parois de la cavité sont en matériau non adhérent pour les cellules afin de laisser les cellules exercer librement leur propre force sur l'agrégat.
[0043] Selon un autre mode de réalisation préféré, la partie inférieure de la rainure (fond), à laquelle les cellules adhèrent, peut être adhérente pour assurer un support à la formation de l'agrégat, ce qui permet de stabiliser sa forme et éviter que l’agrégat cellulaire se contracte sur lui-même et prenne la forme d’un simple sphéroïde.
[0044] Par rapport aux dispositifs de l’art antérieur, le dispositif selon l’invention permet de produire des organoïdes stables en forme d’anneau après une seule étape d’ensemencement de cellules.
[0045] L’invention concerne également un support multi-puits, lequel comporte une pluralité de dispositifs de culture de cellules selon l’une des formes et/ou variantes indiquées dans la présente demande, de préférence répartis régulièrement à la surface du support.
[0046] Selon un autre aspect, l’invention concerne également un procédé de fabrication d’un dispositif tel que décrit ci-avant, caractérisé en ce qu’il comporte notamment les étapes suivantes :
[0047] - Préparer un substrat de préférence en un matériau transparent (par exemple du verre ou du plastique, par exemple en format de boite de pétri, plaque multi- puits ou lamelle de verre)
- Déposer une couche d’une solution monomère non polymérisée sur le substrat
- Créer une empreinte à l’aide d’un moule dans la couche non polymérisée ayant la forme du dispositif selon l’une des variantes décrites ci-avant de manière à créer un substrat structuré
- Polymériser la solution monomère de ladite couche de manière à durcir le substrat structuré
- Démouler le substrat structuré durci.
[0048] Enfin le dispositif de culture selon l’invention, le support multi-puits et le procédé peuvent être utilisés pour la réalisation de culture de cellules, notamment de cellules dérivées de cellules humaines.
[0049] Parmi les nombreux avantages de l’invention, on notera que le dispositif de l’invention permet de maintenir des organoïdes autonomes sur un substrat structuré tout en permettant des flux dans le milieu de culture au-dessus et sur la rainure annulaire sans besoin d’utiliser un quelconque adhésif entre les cellules et le substrat pour éviter de perturber les cellules.
[0050] Le fonctionnement du dispositif selon l’invention permet d’optimiser le nombre de cellules nécessaires pour former la structure d’anneau en trois dimensions. Peu de cellules sont perdues car la grande majorité d’entre elles sont guidées vers la zone de formation de l’anneau (rainure) du fait de la présence des flancs (de préférence inclinées) de la cavité qui assurent le guidage et le glissement des cellules dans la rainure. Un tel dispositif a donc une structure qui engendre une technique robuste et reproductible pour assembler les cellules en structures 3D.
[0051] L’invention permet aussi d’être utilisé pour mesurer les forces de contractilité lorsque le matériau constituant le substrat structuré est souple ou mou. La mesure peut être réalisée en analysant la déformation du pilier central (contraction) créée par la contraction de l’anneau de cellules 3D ou de l’organoïde. Ceci permet par exemple de mesurer la force de contractilité de cellules contractiles telles que les cellules de muscles striés (cellules de muscles liés au squelette ou cellules cardiaques), cellules de muscles lisses (péricytes, cellules de muscles lisses vasculaires, cellules de muscles lisses viscéraux ou de la vessie, etc....), les cellules contractiles mésenchymateuses (fibroblastes) ou toutes autres cellules ayant un comportement contractile et de mesurer également les changements dus à l’effet de composés spécifiques, à l’environnement de cellules chimiques ou à la modification de cellules.
[0052] En plus de la contractilité interne de la fibre formée par l’anneau de cellule, l’invention peut aussi être utilisée pour mesurer la contractilité induite par sa tension de la surface de l’agrégat de cellule, notamment pour les cellules non-contractiles. Par exemple pour mesurer indirectement la tension de surface d’un agrégat de cellules épithéliales.
[0053] Pour mesurer la force de contraction des cellules dans l’organoïde, la mesure de la variation du diamètre est utilisée pour évaluer la variation de la force de contraction appliquée par la structure cellulaire sur le pilier central.
[0054] Pour de petites déformations, l’analyse dimensionnelle nous montre que la force appliquée par l’organoïde peut être déterminée de la manière suivante :
[0055] dF = dO.E.dD
[0056] ou dF est la variation de force en Newton, dD la variation du diamètre mesuré du pilier central, E le module d'élasticité du pilier en N/m2 et dO une longueur caractéristique qui dépend de la géométrie précise du pilier central.
[0057] Avantageusement, un principe actif ou une drogue telle que la Latrunculine A peut être utilisée pour inhiber la contraction cellulaire et ainsi en déduire la force de contraction avant application de la drogue.
[0058] Le dispositif peut également être utilisé pour mesurer des profils de force de contraction dans le temps en réalisant des films ou time-laps de l’organoïde. Dans ce cas, le dispositif peut être utilisé pour mesurer le profil de contraction de fibres musculaires, spontanées ou sous l’effet d’un stimulus, en présence ou non des molécules dont on cherche à mesurer l’effet. Par exemple pour étudier l’effet de molécules agissant sur la contractilité du muscle cardiaque, des muscles squelettiques ou des muscles lisses.
[0059] Une autre utilisation du dispositif selon l’invention est de réaliser des agrégats de cellules 3D comme les sphéroïdes, mais ayant un rapport surface/volume plus élevé qui ont l’avantage d’améliorer la diffusion de substances nutritives et d’oxygène dans les organoïdes par rapport aux sphéroïdes.
[0060] Encore une autre utilisation du dispositif selon l’invention consiste à faire des agrégats de cellules 3D en une seule étape d’ensemencement de cellules qui restent bloquées sur le dispositif, du fait de la contraction de l’organoïde de forme annulaire autour du pilier qu’il entoure. Cela permet de remplacer le milieu de culture autour de l’organoïde sans le perturber.
[0061] Le substrat structuré du dispositif selon l’invention peut être fabriqué en utilisant n’importe quel type de matériau qui a la capacité de polymériser et qui est biocompatible.
[0062] Les molécules monomères réagissent de façon à former un réseau tridimensionnel ou chaîne polymère par polymérisation et formant des polymères qui peuvent être de nature synthétique ou naturelle.
[0063] De préférence, le polymère sera un hydrogel permettant la diffusion de molécules nutritionnelles et l’oxygénation de l’organoïde et donc son bien-être.
[0064] Ci-après, un certain nombre de monomères utilisés pour engendrer des matériaux polymères (gels et notamment hydrogels)
[0065] -Poly (2-Hydroxyethyl méthacrylate)- PHEMA
[0066] -2-Hydroxyethyl méthacrylate - HEMA
[0067] -Polyéthylène glycol (PEG)
[0068] -Acide méthacrylique (MA A)
[0069] -Copolymère acrylamide/acide acrylique
[0070] -Poly(N-isopropylacrylamide)
[0071] -Polymères à base de peptides qui ne sont pas des hydrogels peuvent aussi être utilisés ou alors des élastomères tels que des silicones (par exemple le polydiméthyl siloxane) avec lesquels il est facile de mouler de telles formes.
[0072] De préférence ce polymère sera photo-polymérisable pour accélérer le procédé de fabrication.
[0073] Idéalement le polymère sera optiquement transparent (indice de réfraction proche de celui de l’eau 1,33) après polymérisation, ce qui permet une imagerie microscopique optique (par exemple par fluorescence, par imagerie à haute résolution, ...). On peut ainsi obtenir des résultats basés sur une analyse d’images.
[0074] La rigidité du matériau peut être ajustée pour s’adapter à l’environnement des cellules. On choisira donc des matériaux dont la rigidité sera comprise (ou adaptée) entre 0.1 KPa et 1 MPa, de préférence comprise entre 1 et 20 KPa.
[0075] Le matériau constituant le substrat structuré 1 (au moins les parois de la cavité) sera de préférence un matériau non adhérent pour aider au guidage des cellules vers la rainure annulaire et/ou pour empêcher l’adhésion de l’organoïde au substrat. Dans les cas où une adhésion est souhaitée on utilisera un matériau permettant une adhésion des cellules. Celle-ci peut être encore améliorée par la présence sur la surface d’une matrice spécifique extra cellulaire telle que du collagène, de la fibronectine, etc... [0076] Les dimensions de la rainure annulaire peuvent être adaptées à la taille des or- ganoïdes utilisés dans le procédé dans les limites décrites ci-dessus.
[0077] L’invention sera mieux comprise à l’aide des exemples de réalisation suivants conjointement avec les figures qui représentent :
[0078] [Fig.l] montre une vue en coupe d’un dispositif selon l’invention ;
[0079] [Fig.2] montre une vue de dessus d’un dispositif selon l’invention ;
[0080] [Fig.3] montre une vue en coupe d’un dispositif selon l’invention avec des dimensions respectives ;
[0081] [Fig.4] montre des étapes de moulage d’un dispositif selon l’invention ;
[0082] [Fig.5] montre des photographies de moules pour la fabrication du dispositif selon l’invention ;
[0083] [Fig.6] montre une photographie de cellules fibroblastes après centrifugation ;
[0084] [Fig.7] montre une photographie des cellules de la [Fig.6] une heure après centrifugation et polymérisation du collagène ;
[0085] [Fig.8] montre une vue en coupe d’une variante de réalisation du dispositif selon l’invention ;
[0086] [Fig.9] montre une vue en coupe d’une variante du dispositif selon l’invention avec des dimensions respectives ;
[0087] [Fig.10] montre une photographie des cellules MEFs 22 heures après la culture dans l’anneau et 12 jours après ; et
[0088] [Fig.11] montre un diagramme de la contraction et du relâchement d’un pilier central provoqué par des cellules sous tension disposées autour du pilier.
[0089] Les figures, tableaux et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Les figures et tableaux font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.
[0090] L’invention est décrite maintenant en références aux figures 1 à 11. Sur les figures, les mêmes éléments portent les mêmes références.
[0091] Sur la [Fig.l] est représentée une vue en coupe verticale du substrat structuré 1 de culture de cellules selon l’invention. Le substrat comporte un réceptacle 2 qui repose sur une base 10. Le substrat comporte en outre une rainure 4 ayant une forme annulaire. Afin de donner cette forme annulaire à la rainure 4, on dispose un pilier central 6 entouré par la rainure 4, ce pilier central 6 ayant un sommet 5 de forme de préférence conique. Au-dessus de la rainure annulaire 4 est disposée une structure de parois ayant la forme d’un entonnoir (de préférence conique). Plus particulièrement, le réceptacle est réalisé d’un seul tenant (ou monobloc) et présente une première face 30 reposant sur la base 10. Le réceptacle comporte en outre une deuxième face 40 sensiblement en regard de la première face 30. L’ensemble de la structure de parois et de la rainure annulaire 4 forment une cavité 9 présentant une ouverture 8 au niveau de la deuxième face 40. La structure de parois de la cavité 9 en forme d’entonnoir relie le bord interne de l’ouverture 8 située au sommet de la cavité 9 au rebord externe de la rainure annulaire 4 située à la base de la cavité 9. Plus particulièrement, la cavité 9 comprend la rainure 4 qui est disposée dans un fond 50 de la cavité. La rainure 4 forme une portion de culture agencée pour recevoir des cellules 7 et permettre leur culture. Pour cela, la cavité 9 comporte en outre un guide 60 qui comprend au moins un plan incliné 3. Le plan incliné 3 relie la deuxième face 40 à la rainure 4. Selon l’invention, le plan incliné 3 présente un état de surface agencé pour guider des cellules déposées sur la deuxième face 40 sensiblement jusqu’au niveau de la rainure 4. Les cellules migrent ainsi dans la portion de culture par gravité à la manière d'un entonnoir.
[0092] Lorsqu’on dispose des cellules sur le substrat structuré 1, ou plus précisément sur la deuxième face au niveau d’un guide 60, la structure de parois en forme d’entonnoir guident les cellules vers la rainure 4 de forme annulaire, ce qui conduit à la formation spontanée d’un agrégat tridimensionnel de cellules de forme annulaire. Pour cela, le guide 60 comporte un plan incliné 3. Le cas échéant, la pointe conique du pilier central 5 aide les cellules à glisser vers le bas vers la rainure 4 et évite qu’elles s’accrochent à la structure de paroi surtout lorsque celle-ci est en matériau à faible coefficient de frottement. Dans ce mode de réalisation préférentielle, la pointe 5 est conique et a de préférence un angle au sommet égal ou sensiblement égal à l’angle au sommet de l’entonnoir.
[0093] Sur la [Fig.1], on peut voir les cellules 7 représentées schématiquement qui se recouvrent partiellement pour former l’agrégat annulaire.
[0094] Les dimensions de la rainure annulaire peuvent varier dans de larges proportions afin de faciliter la formation d’agrégats de cellules selon l’invention. En se référant à la [Fig.3], la profondeur hl de la rainure annulaire pourra varier entre 0 et 3000 microns, de préférence entre 50 et 200 microns, le diamètre extérieur de la rainure dl entre 10 et 10000 microns, de préférence entre 200 et 700 microns, la largeur de la rainure annulaire W 1 entre 3 et 3000 microns, de préférence entre 50 et 200 microns.
[0095] La cavité 9 ayant de préférence une forme d’entonnoir conique le long de ses parois aura une hauteur h2 entre l’ouverture 8 et le bord extérieur de l’anneau comprise entre 0 et 2000 microns, de préférence entre 100 et 300 microns. Lorsque h2 est égale à 0 le dispositif a une configuration limitée à la rainure annulaire ce qui permet la formation de l’anneau de cellule, mais sans diriger les cellules vers la rainure 4, ce qui réduit le nombre de cellules dans le dispositif. L’angle au sommet Alpha 1 peut varier entre 0 et 90 degrés, de préférence entre 40 and 50 dégrées de manière à permettre aux cellules introduites dans la cavité 9 de glisser dans la rainure annulaire.
[0096] Le pilier central définissant de préférence un axe de symétrie vertical du dispositif selon l’invention, aura une hauteur h3 comprise entre 1 et 4000 microns, de préférence compris entre 150 et 550 microns, un diamètre d2 compris entre 1 et 5000 microns, de préférence compris entre 100 et 350 microns, une partie verticale de hauteur h4 comprise entre 1 et 3000 microns, de préférence comprise entre 60 et 150 microns, et un angle au sommet Alpha 2 compris entre 0 et 180 degrés, de préférence compris entre 80 et 100 degrés, (un angle zero ou 180 correspondant à un pilier avec un sommet plat), de hauteur hl.
[0097] Le dispositif peut aussi prendre la forme décrite sur les figures 8 et 9. La structure de parois de la cavité conique 9 présente un plan incliné 13 qui se termine au bord de la rainure annulaire 4; le pilier central 6 comporte deux faces latérales 15 s’étendant jusqu’à la rainure 4 qui contrairement à celles du pilier 6 représenté sur la [Fig.l], ne sont pas droites mais ont une forme de S, donnant à la rainure 4 une plus grande largeur à sa partie inférieure que celle de cette rainure à la base du pilier 6 (sur cette figure). Ainsi cette forme particulière permet la formation d’un organoïde qui peut glisser vers le haut sous l’action des cellules, tout en restant fixé sur le pilier central grâce à sa forme géométrique formant une protubérance 16 sur la [Fig.8].
[0098] Alpha 3 peut varier entre 0 et 90 degrés, de préférence entre 40 and 50 dégrées, rl et r2 peuvent varier entre 0.01 mm et 0.9 mm, de préférence entre 0.05 et 0.1 mm.
[0099] Les cellules peuvent être cultivées de deux manières : soit simplement suspendues dans un milieu de culture cellulaire, soit mélangées avec une matrice extracellulaire soit naturelle soit synthétique, tels que par exemple un collagène de type I, II, III, IV et V. Le collagène est le composé principal de la matrice extracellulaire naturelle dans le corps humain, cette protéine est présente entre les cellules dans de nombreux tissus de connexion. Ce peut être également un matrigel, un hydrogel ou d’autres matrices extracellulaires.
[0100] La concentration ou la quantité de cellules qui doivent être ensemencées sur le substrat dépend du type de cellules et du diamètre de la cavité comparée à la surface de l’anneau.
[0101] La fabrication du substrat structuré peut être réalisée simplement par moulage à l’aide d’un moule permettant d’imprimer la structure souhaitée (voir par exemple ci- après la [Fig.4]) dans le matériau utilisé.
[0102] Ce procédé de moulage étant simple, on peut facilement mouler une pluralité de dispositifs en une seule étape pour réaliser des plaques multi-puits.
[0103] La [Fig.4] illustre un procédé de fabrication du dispositif selon l’invention. Un support 23 plat de préférence (boite de pétri plaquette en verre, plaque multi puits, etc...) est enduit avec une couche 24 du polymère choisi (à l’état non polymérisé) sous forme liquide ou molle, sur lequel on imprime le substrat micro structuré 1 à l’aide d’un moule 20 ayant la forme négative du substrat structuré 1. Puis la réaction de poly- mérisation démarre, et la couche enduite 24 prend la forme désirée de structure positive du substrat micro structuré 1. Après démoulage ([Fig.4]) on obtient le substrat 1 final micro structuré 3D.
[0104] Idéalement, la surface du moule sera de préférence très lisse avec une rugosité inférieure au micron. De ce fait les moules seront de préférence fabriqués par des procédés à haute résolution (fraisage numérique, impression 3D utilisant la lithographie à deux photons.)
[0105] Le dispositif selon l’invention permet d’utiliser n’importe quel type de cellules biologiques qui peuvent adhérer les unes aux autres, telles que les cellules endothéliales, les cellules cardiaques, les cellules de muscles lisses, les cellules épithéliales, les condrocytes, les fibroblastes...
[0106] Le substrat structuré du dispositif selon l’invention peut être fabriqué en utilisant n’importe quel type de matériau qui a la capacité de polymériser et qui est biocompatible.
[0107] Les molécules monomères réagissent de façon à former un réseau tridimensionnel ou chaine polymère par polymérisation et formant des polymères qui peuvent être de nature synthétique ou naturelle.
[0108] Les cellules peuvent être cultivées de deux manières : soit simplement suspendues dans un milieu de culture cellulaire, soit mélangées avec une matrice extracellulaire soit naturelle soit synthétique, tels que par exemple un collagène de type I, II, III, IV et V. Le collagène est le composé principal de la matrice extracellulaire naturelle dans le corps humain, cette protéine est présente entre les cellules dans de nombreux tissus de connexion. Ce peut être également un matrigel, un hydrogel ou d’autres matrices extracellulaires.
[0109] La concentration ou la quantité de cellules qui doivent être ensemencées sur le substrat dépend du type de cellules et du diamètre de la cavité comparée à la surface de l’anneau.
[0110] La [Fig.5] représente un moule permettant de réaliser une pluralité de dispositifs selon l’invention.
[0111] La fabrication d’un moule de l’invention est toutefois accompagnée de nombreux problèmes techniques que la Demanderesse a dû surmonter.
[0112] La microfabrication ou du micro-usinage joue un rôle majeur dans la fabrication du dispositif de l’invention. Dans des domaines techniques éloignés de l’invention tels que l'industrie des semi-conducteurs ou la recherche microfluidique la miniaturisation a connu des avancées technologiques ces dernières années. Toutefois, la transposition de cette miniaturisation dans le domaine de l’invention est généralement infaisable voire incompatible.
[0113] La Demanderesse c’est ainsi d’abord tournée vers la photolithographie qui est un technique utilisée pour transférer une certaine forme ou un certain motif sur un matériau ou une surface, en exposant sélectivement des polymères sensibles à la lumière à l'aide d'un masque photographique. Des méthodes de type « dry etching » ou « wet etching » peuvent ensuite être utilisées pour enlever le matériau des zones sélectionnées précédemment.
[0114] La gravure par « wet etching » est une procédure chimique qui est relativement simple et rapide à mettre en œuvre. Le matériau peut être gravé de manière isotrope (indépendante de l'orientation) ou anisotrope (dépendante de l'orientation). La gravure isotrope est la plus courante. Dans cette méthode le matériau est enlevé uniformément dans toutes les directions, ce qui peut entraîner l'enlèvement de matériau sous les zones qui ne doivent pas être gravées. La gravure anisotrope (lorsqu'on utilise des substrats qui sont cristallins) entraîne moins de matériau sous le masque, ce qui permet un meilleur contrôle de la géométrie des parois. Les techniques de « dry etching » utilisent le bombardement d'ions vers la surface pour enlever sélectivement du matériau. Cette méthode peut être utilisé pour fabriquer des structures plus petites que le « wet etching », ce qui permet d'obtenir des structures à haut rapport d'aspect avec une très bonne qualité de surface. Ces deux techniques sont couramment utilisées, mais sont fortement limitées à des conceptions simples, comme des parois droites ou verticales.
[0115] Il existe en outre, des techniques de fabrication additive. Ces techniques jouent un rôle dans le prototypage rapide de formes complexes. Les structures sont créées par impression couche par couche, sur la base d'un dessin généré par un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD). Il existe des techniques particulières, comme l'extrusion de matériaux, le frittage laser, le jet de matériaux, etc. Toutes ces techniques sont attrayantes car elles ne nécessitent pas d'outils spéciaux ou de modifications du processus, de sorte que les coûts initiaux peuvent être relativement faibles. En outre, elles peuvent être utilisées pour fabriquer des formes et des caractéristiques plutôt complexes, mais il ne faut pas oublier que la qualité de la surface est toujours affectée par le processus d'impression couche par couche. Les techniques de plus haute résolution, capables d'atteindre des caractéristiques su micrométriques avec une excellente qualité de surface (échelle nanométrique) basées sur la polymérisation à deux photons, défient les limites des méthodes additives conventionnelles. Cependant, ils ne sont adaptés qu'à la fabrication de très petites structures. Ces structures sont inférieures aux dimensions nécessaires pour fabriquer un moule qui maximise la surface utilisée dans les substrats de culture cellulaire standard, comme les plaques à 96 puits typiques (un puits d'une plaque à 96 puits typique a une largeur d'environ 6 mm). Ces plaques sont couramment utilisées par les entreprises pharmaceutiques pour le criblage à haut débit de médicaments. Par ailleurs, il s'agit d'une technique utilisée principalement au niveau de la recherche, avec des coûts très élevés et des temps de fabrication longs. Les méthodes additives ne sont donc pas adaptées à la fabrication des moules qui donneront naissance aux dispositifs de culture cellulaire décrits dans la présente invention. Il est difficile avec l’utilisation de méthodes additives de réaliser en un temps raisonnable des structures avec un état de surface de bonne qualité, donc à très haute résolution qui aient un volume important, ce qui est nécessaire pour réaliser le dispositif selon l’invention permettant de réaliser un nombre important d’organoïde simultanément.
[0116] L'usinage à commande numérique par ordinateur (CNC) est une technique soustractive. Elle part d'un bloc de matériau, par exemple du plastique ou du métal, qui est sculpté à l'aide d'outils spécifiques comme des forêts. Elle présente une grande précision dimensionnelle et permet de fabriquer des pièces mécaniquement robustes, avec un taux de reproductibilité élevé de la très petite à la très grande échelle. La taille minimale et la complexité des structures sont influencées par la taille et la forme de la tête foreuse (tous les points usinés doivent être accessibles), l'adaptabilité de la platine (degré de liberté - notamment, 5 axes), ainsi que la vitesse et sensibilité de réponse ou de manœuvre. Il peut également être utilisé comme un outil de post-traitement, lorsque la base a été principalement imprimée en 3D ou fabriquée de toute autre manière et qu'elle doit être ajustée avec précision.
[0117] Toutes ces techniques proviennent de domaines techniques éloignés de la présente invention.
EXEMPLE DE RÉALISATION DE L’INVENTION
[0118] Le dispositif de culture cellulaire décrit dans la présente invention est fabriqué par moulage. Cela signifie que le moule a la forme négative du dispositif de culture cellulaire final.
[0119] Pour sélectionner une méthode susceptible pour la fabrication des moules de l’invention, la Demanderesse a considéré de nombreux paramètres et de contraintes, dont on peut citer en particulier :
[0120] - L’utilisation d'un matériau robuste qui peut être utilisé plusieurs fois pour mouler les polymères choisis comme les hydrogels de polyacrylamide ou de polyéthylène glycol. Le matériau doit également résister aux procédures de nettoyage difficiles, qui pourraient être nécessaires pour éliminer les résidus des matériaux moulés ;
[0121] - Un matériau qui ne réagit pas et/ou qui est adhérent aux polymères en cause ;
[0122] - Une méthode qui permet la fabrication à l'échelle du micron et qui n'est pas limitée aux caractéristiques droites, mais qui peut s'adapter à des formes complexes telles que des profils en "s" ou courbes, des parois inclinées notamment ;
[0123] - Le besoin de surfaces avec une finition très lisse, nécessaire à la fois pour faciliter le démoulage et pour ne pas reproduire une surface rugueuse dans le dispositif de culture cellulaire final. Ceci est requis pour que les cellules ne soient pas piégées par des micro-rugosités à la surface du polymère, mais plutôt guidées par les parois inclinées vers la zone d'assemblage des cellules.
[0124] Compte tenu de ce qui précède, un procédé basé sur la soustraction de matière s'est avéré, non sans surprise, être le plus approprié pour fabriquer un moule tel que celui présenté sur la [Fig.5]. Le procédé de fabrication comprenait notamment les étapes suivantes :
[0125] - La sélection d’un matériau en acier inoxydable (grade 1.4305), afin de répondre à certaines exigences au moins des exigences susmentionnées ;
[0126] - Un usinage en deux phases, une première phase dans laquelle une machine laser de la société KLM Microlaser GmbH - ( KLM Microlaser - KLM El) (laser à impulsions ultracourtes 3 axes) est utilisée pour fraiser le matériau en vrac autour des structures coniques (voir [Fig.5]), et une deuxième dans laquelle une machine CNC Kern Micro à 5 axes de la société Kern Microtechnik GmbH - (KERN Microtechnik - MICRO) a été utilisé pour lisser la surface autour des structures coniques, ainsi que pour réaliser la cavité qui donnera naissance au pilier central ;
[0127] - Un usinage au laser d’enlèvement de matériau, suivi d’un balayage au micro-foret.
En effet, l’usinage au laser ne permet pas d’obtenir une qualité de surface satisfaisante (la rugosité était supérieure à l'échelle du micromètre). Ce n’est qu’après le balayage au micro-foret sur l’entièreté ou la quasi entièreté de la surface que des fines couches de matériau supplémentaire sont supprimées, jusqu'à ce que la surface soit suffisamment lisse, c’est-à-dire avec une rugosité Ra comprise entre 0,2 pm et 0,3 pm. La technique mis en œuvre permet l’obtention de bords ayant une courbure d'environ 0,1 mm.
[0128] Le moule de l’invention est ainsi réalisé en acier inoxydable présentant une surface ayant une rugosité Ra comprise entre 0,2 et 0,3 pm. Il permet ainsi d’obtenir un dispositif de l’invention ayant une rugosité Ra comprise entre 0,2 et 0,3 pm.
[0129] - La cavité intérieure est réalisée en deux étapes : une première étape durant laquelle une mèche d'un diamètre inférieur à celui du pilier central est utilisée pour creuser un trou cylindrique, et une deuxième étape durant laquelle un foret à profil sphérique est utilisé pour ajuster finement le profil des parois, ce qui permet de fabriquer des profils en forme de "S" ou courbés et un trou conique pointu qui donne le profil conique du pilier central.
[0130] L'usinage par commande numérique par ordinateur (CNC) haute résolution est une technique flexible. Pour mettre en place le procédé de fabrication ci-dessus, de nombreux détails sont pris en compte et doivent être gardés à l'esprit lors de la fabrication d’un dispositifs de culture cellulaire de l’invention.
[0131] L’exemple ci-après utilise un substrat à base de polyacrylamide.
[0132] -Fabrication du moule : [0133] La fabrication du moule pour réaliser le dispositif selon l’invention est représentée sur la figure 5a (vue en coupe) et la figure 5b (vue de dessus). Un moule de forme interne qui est le négatif du substrat structuré est utilisé pour mouler une structure telle que représentée sur la [Fig.l], Le moule est en acier inoxydable (grade 1.4305 dans le présent exemple) réalisé par fraisage numérique à haute résolution avec une rugosité moyenne de surface Ra comprise entre 0,2 et 0,3 microns (plus la surface interne du moule est lisse, plus il est facile de démouler les dispositifs. Sur la [Fig.5] on notera la forme négative des moules par rapport à la forme du dispositif, la rainure annulaire (en négatif) étant située au-dessus de la structure conique des parois : au centre du moule de la rainure annulaire on retrouve une cavité plus profonde correspondant au pilier central après moulage.
[0134] On a utilisé ensuite un hydrogel à base d’ acrylamide pour mouler les dispositifs, en milieu stérile.
[0135] -Préparation du support :
[0136] Le support de départ est constitué de lamelles de verre de 16 mm de diamètre qui sont nettoyées et silanisé pour promouvoir l’adhésion.
[0137] -Solution pré-hydrogel :
[0138] Après enduction de la solution pré-hydrogel (solution d’ acrylamide), deux mécanismes différents peuvent être utilisés pour déclencher (comme agents catalytiques) la polymérisation de cet hydrogel :
[0139] -en utilisant un rayonnement UV de longueur d’onde appropriée (par exemple, 365 nm) qui catalyse la polymérisation du radical libre d’ acrylamide et de bis- acrylamide en transformant des molécules d’irgacure 2959 en radicaux libres. Les réactifs suivants sont utilisés dans la formulation de ces types de gels : C3H5O Acrylamide 40%; C7H10O2N2 N,N’-Methylènebisacrylamide 2%; Irgacure 2959 (1% v/v) - UV sensitive (longueur d’onde 365 nm) ;
[0140] -en utilisant du persulfate d’ammonium (APS) pour engendrer la polymérisation (en se décomposant il forme des radicaux libres) de monomères d’ acrylamide et de bis- acrylamide et en utilisant un stabilisant de radicaux libre (TEMED) qui est un promoteur de polymérisation.
[0141] Les réactifs suivants sont utilisés dans la formulation de ces types de gels :C3H5O Acrylamide 40%; C7H10O2N2 N,N’-Methylènebisacrylamide 2%; (NH4)2S2O8 APS (10%); C6H15N2TEMED .
[0142] Dans ce cas particulier, on a réalisé la polymérisation par photopolymérisation UV. La formulation du gel était basée sur une solution aqueuse contenant 30% of C3H5O- Acrylamide 40% + 12.5% C7H10O2N2 N,N’-Methylènebisacrylamide 2%; 0.5% Irgacure 2959 (1% v/v).
[0143] -Moulage (polyacrylamide): [0144] Les lamelles de verre traitées sont recouvertes avec une goutte de 15 microlitres de solution pré -hydrogel.
[0145] Le moule est placé au-dessus des lamelles, sur la goutte de solution pre-hydrogel, et directement irradiées avec une source UV de longueur d’onde 365 nm (90 mW, 3 minutes). Le gel est démoulé puis stocké dans l’eau. Les lamelles de verre ainsi préparées sont assemblées sur une plaque multi puits.
[0146] Le moule utilisé comportait 23 microstructures permettant la fabrication de 23 cavités comportant des rainures annulaires, et donc de faire plusieurs tests dans le même puit. La largeur (wl) des anneaux est de 100 pm et le diamètre des piliers centraux est de 240 pm.
[0147] Culture de cellules utilisant des fibroblastes dérivés de cellules humaines de la peau abdominale :
[0148] L’étude de la contractilité des fibroblastes est un sujet actuellement important pour la compréhension des phénomènes d’inflammation et de cicatrisation.
[0149] -Protocole cellules fibroblastes :
[0150] Des fibroblastes dérivés de cellules humaines provenant de la peau abdominale ont été suspendues à nouveau dans une matrice extra cellulaire de collagène purifié de type 1 avec une concentration en collagène de 160000 cellules/ml. On a déposé une goutte de 15 microlitres du mélange de cellules sur la face supérieure du substrat structuré préalablement incubé dans du milieu de culture cellulaire. Le substrat a ensuite été centrifugé pendant 2 mn à 100 G. Les cellules sont guidées naturellement vers la rainure annulaire sous l’effet de l’accélération centrifuge. Ensuite le mélange de collagène polymérise à 37 degrés pendant 1 heure, puis du milieu de culture cellulaire est ajouté dans les puits. La [Fig.7] est une image des cellules fibroblastes après centrifugation tandis que la [Fig.8] est une image des mêmes cellules après polymérisation du collagène (1 heure, 37 degrés) montrant que les cellules fibroblastes individuelles forment un anneau parfait autour du pilier central.
[0151] Cet exemple montre l’assemblage rapide et spontané d’un organoïde 3D en forme annulaire en utilisant le dispositif de l’invention.
[0152] -Protocole cellules MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts):
[0153] Des substrats structurés à base d'hydrogel, avec un pilier central en forme de " s ", ont été fabriqués à l'aide de moules en acier inoxydable. Fa largeur de l'anneau (wl) était de 70 um et le diamètre du pilier central était de 360 um. E'hydrogel utilisé est à base de polyéthylène glycol à une concentration de 6,4% photopolymérisé au UV.
[0154] Ees cellules MEFs sont d'abord dissociées de leur substrat à l’aide de trypsin, puis centrifugées. Ee culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans un nouveau milieu de culture cellulaire à une concentration de 160 000 cellules par ml. 15 microlitres de cette suspension cellulaire sont piquetés sur le dessus de la structure en gel (les structures sont incubées dans du milieu de culture cellulaire pendant 15 minutes au préalable). Le substrat contenant les cellules est ensuite incubé à 37°C, 5% de CO2. Après 22 heures, les organoïdes en forme d'anneau sont observés par microscopie optique conventionnelle. Un organoïde auto-assemblé est visible à ce stade, comme le montre la [Fig.10]. Les organoïdes sont maintenus en culture pendant 12 jours et le milieu est changé tous les deux jours. Après 12 jours, l'agrégat de cellules MEF formé une structure annulaire plus compacte, comme le montre la [Fig.10].
[0155] Cet exemple démontre l'auto-assemblage rapide d'organoïdes en forme d'anneau. Comme aucune matrice extracellulaire n'a été utilisée dans ce cas, les cellules sé- dimentent d'elles-mêmes sur la cavité en forme d'anneau et aucune étape de centrifugation n'a été nécessaire. Dans ce cas, la structure en forme d'entonnoir permet de guider les cellules vers la cavité en forme d'anneau.
[0156] Cet exemple démontre également que l'organoïde peut être conservé dans les substrats structurés pendant une longue période. Le moule en forme de "s" joue un rôle important, car il permet à l'organoïde en forme d'anneau de rester en place même lorsque les cellules se contractent et pourraient éventuellement glisser le long du pilier central, ou lorsque le liquide est agité, par exemple lorsque l’on change le milieu. Le bon maintien de l’organoïde en place permet une observation stable sur de longue période tout en permettant de facilement changer le milieu environnant.
[0157] Dans un autre exemple, nous cultivons des cellules de muscle squelettique de la lignée cellulaire C2C12 sous la forme d’organoïdes en forme d’anneau et mesurons leur force de contraction.
[0158] Pour mesurer la force de contraction des cellules dans l’organoïde, nous mesurons la déformation du pilier central élastique sous l’effet de la force.
[0159] La mesure de la variation du diamètre du pilier (autrement dit du diamètre intérieur de l’anneau) est utilisée pour évaluer la variation de la force de contraction appliquée par la structure cellulaire sur le pilier central.
[0160] Avantageusement, une drogue telle que la Latrunculine A (inducteur de la dépolyme- risation de l’actine) peut être utilisée pour inhiber la contraction cellulaire et ainsi en déduire la force de contraction avant application de la drogue.
[0161] Les gels utilisés dans cet exemple suivent le même protocole de fabrication que l'exemple précédent avec les MEFs.
[0162] Les cellules C2C12 sont dissociées avec de la trypsine, puis centrifugées. Le culot cellulaire est ensuite remis en suspension dans un nouveau milieu de culture à une concentration de 500 000 cellules par ml. 200 pl de cette suspension cellulaire sont pipetés sur le dessus de la structure de gel (préalablement incubées dans du milieu de culture pendant 15 minutes). La plaque est ensuite centrifugée puis incubée à 37°C, 5% de CO2. [0163] Après 6 heures, les structures sont imagées et le diamètre des piliers centraux mesuré. Pour évaluer la force appliquée par l’organoïde sur le pilier central, les cellules sont exposées à du milieu contenant de la Latrunculine A (1:1000). Après 30 minutes d’incubation, les structures sont à nouveau imagées et le diamètre des piliers centraux mesurés.
[0164] Dans notre exemple, le diamètre du pilier central augmente d'environ 1,5 % en présence de Latrunculine A en comparaison de l’expérience contrôle sans la drogue. Ceci est démontré dans la [Fig. I l],
[0165] Dans des mode de réalisation particuliers: la rainure comporte un fond et deux flancs ; la rainure est agencée selon une forme rectiligne, curviligne ouverte ou fermé, ovoïde ou circulaire ; la rainure est de type fermée. En outre dans des modes de réalisation, le réceptacle comporte un pilier central entouré par ladite rainure, (il s’agit d’un rainure dite annulaire). Dans un mode particulier le pilier central présente un étranglement au niveau de sa partie inférieure.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Dispositif de culture cellulaire comprenant un réceptacle (2) pour des cellules qui repose sur une base (10), caractérisé en ce que le réceptacle (2) est réalisé d'un seul tenant et présente une première face (30) qui repose sur la base (10) et une deuxième face (40) sensiblement en regard de la première face (30), ainsi qu'une cavité (9) présentant une ouverture (8) au niveau de la deuxième face (40) et un fond (50) à proximité de la première face (30), laquelle cavité (9) comprend au moins une rainure (4) disposée dans le fond (50) et formant une portion de culture agencée pour recevoir des cellules (7) et permettre leur culture, et un guide (60) qui comprend au moins un plan incliné (3) qui relie la deuxième face (40) à la rainure (4), lequel plan incliné (3) présente un état de surface agencé pour guider des cellules déposées sur la deuxième face (40) sensiblement au niveau de la rainure (4) dans ladite portion de culture par gravité à la manière d'un entonnoir.
[Revendication 2] Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le plan incliné 3 entoure la rainure 4.
[Revendication 3] Dispositif selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la rainure (4) est agencée selon un chemin fermé dans la cavité (9).
[Revendication 4] Dispositif selon l’une des revendications précédentes, dans lequel la rainure (4) est agencée selon une forme annulaire dans la cavité (9).
[Revendication 5] Dispositif selon l’une des revendications 3 et 4, comprenant en outre un pilier central (6) disposé au centre de la rainure (4).
[Revendication 6] Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le pilier central (6) est entouré par la rainure (4) et dans lequel au moins une partie du pourtour dudit pilier central (6) définit le périmètre interne de la rainure (4).
[Revendication 7] Dispositif selon l’une des revendications 5 et 6, dans lequel le pilier central (6) est agencé selon une forme générale en S.
[Revendication 8] Dispositif selon l’une des revendications précédentes, réalisé au moins partiellement, de préférence totalement, en un matériau transparent.
[Revendication 9] Dispositif selon la revendication 8, dans lequel le matériau présente un indice de réfraction compris entre 1,32 et 1,45, de préférence égale à 1,33, de sorte à permettre l’acquisition d’images in situ des cellules individuelles ou d’un agrégat de cellules.
[Revendication 10] Dispositif selon l’une des revendications précédentes, réalisé au moins partiellement, de préférence totalement, en un matériau à base d’hydrogel biocompatible souple ou mou permettant de mesurer la force de contraction de l’agrégat de cellules formant le tissu de forme annulaire.
[Revendication 11] Dispositif selon l’une des revendications précédentes, présentant une rugosité Ra de surface comprise entre 0,2 pm et 0,3 pm.
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