WO2023229114A1 - 핵산증폭 검사시스템 - Google Patents

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WO2023229114A1
WO2023229114A1 PCT/KR2022/016409 KR2022016409W WO2023229114A1 WO 2023229114 A1 WO2023229114 A1 WO 2023229114A1 KR 2022016409 W KR2022016409 W KR 2022016409W WO 2023229114 A1 WO2023229114 A1 WO 2023229114A1
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reaction tube
optical
unit
nucleic acid
acid amplification
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PCT/KR2022/016409
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원병연
임욱빈
임윤태
민재홍
김병철
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바디텍메드 주식회사
주식회사 유진셀
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification test system that amplifies and tests DNA in large quantities in a reaction tube.
  • PCR stands for Polymerase Chain Reaction and is a technology that amplifies the amount of DNA using DNA polymerase.
  • PCR mixes the template DNA to be amplified, a primer that binds to a specific position to be amplified, DNA polymerase, and dNTP (Deoxynucleotide triphosphate), a material for making new DNA, 94 Heat is applied to ⁇ 96°C to separate one DNA strand into two strands. Afterwards, when the temperature is cooled to about 50-64°C, the primer and DNA polymerase bind to a specific site on the single-stranded DNA, and are then synthesized to form two DNAs. If this process is repeated, the desired amount of DNA increases through an explosive chain reaction, such as 4, 8, or 16.
  • an explosive chain reaction such as 4, 8, or 16.
  • a heating module including a heater that generates heat to heat the tube and a heating block connected to the heater;
  • a driving module that moves the heating module up and down to vary the distance between the heating module and the holder;
  • a cooling module that cools the tube fixed to the holder,
  • the cooling module is,
  • It includes a blowing fan that generates cooling wind, and a blowing nozzle that delivers the cooling wind generated by the blowing fan to a tube fixed to the holder,
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2081480 (announced on April 24, 2020)
  • the existing high-speed nucleic acid amplification device is
  • the heating block 220 is coupled to the module base and has a mounting wall so that the light trapping part and the emission filter 330 are each mounted, and the mounting wall corresponds to the position of the light transmitting part 224 of the heating block 220.
  • a through hole communicating with the light transmitting unit 224 is formed to allow light to pass through.
  • the light capture unit is composed of a member in which a predetermined sensor unit 324 is mounted on a predetermined PCB 322, and the sensor unit 324 has a number corresponding to the number of light transmitting units 224 and the arrangement of the tubes, and It has an array.
  • a plurality of light transmitting units 224 are formed according to the number of the plurality of depressions 222 of the heating block 220, and a plurality of light capturing units are provided corresponding to each light transmitting unit 224.
  • the existing nucleic acid amplification device using a fixed single-wavelength optical unit requires a cumbersome calibration setting process to maintain the same performance of a plurality of optical units, and all reaction tubes must be set to one standard.
  • this patented invention proposes an inspection system that is equipped with a scanning type and a reflective optical module, and can measure a plurality of optical units, each with different detection wavelengths, while moving to the position of the reaction tube.
  • an optical system that detects a plurality of different wavelengths moves linearly back and forth to the position of the reaction tube, and the same optical system for each wavelength measures the fluorescent substance of the sample in the reaction tube, thereby providing the same optical system performance.
  • Figure 1 is an example of an existing inspection device.
  • Figure 2 shows the main configuration of the nucleic acid amplification testing system according to the present invention.
  • Figure 3 is a temperature circulation unit according to the present invention.
  • Figure 4 shows an optical inspection unit according to the present invention.
  • Figure 5 is a diagram showing the appearance of the nucleic acid amplification testing system according to the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the operation of the optical inspection unit according to the present invention.
  • 7(a) to 7(d) are examples of optical measurement according to the present invention.
  • Figure 8 is an exploded view of the optical module according to the present invention.
  • Figure 9 is a configuration diagram of the first body of the optical module according to the present invention.
  • Figure 10 is a coupling relationship diagram of two optical modules according to the present invention.
  • Figure 11 is an analysis algorithm of the central operation processing unit according to the present invention.
  • Figure 12 is a data correction diagram according to the present invention.
  • Figure 13 is a diagram showing the amplification start point determination and Ct value calculation according to the present invention.
  • Figure 14 is a diagram of baseline adjustment and graph output according to the present invention.
  • Figure 15 is a quantitative value calculation algorithm according to the present invention.
  • Figure 2 is a block diagram showing the main configuration of the nucleic acid amplification testing system according to the present patented invention.
  • a power supply unit 100 that receives commercial alternating current power from the outside, converts it into direct current power, and supplies it;
  • a central processing unit 200 that controls heating and cooling of the reaction tube, and analyzes and stores data measured in the reaction tube;
  • a temperature circulation unit 300 that amplifies the genetic sample in the reaction tube by heating and cooling the reaction tube;
  • An optical inspection unit 400 that optically analyzes the reaction solution in the reaction tube
  • An optical drive unit 500 that drives the optical inspection unit 400 by operation control of the central operation processing unit 200;
  • a high-concentration control sample In the reaction tube, in addition to the sample to be analyzed, a high-concentration control sample, a low-concentration control sample, and an internal control material whose quantitative value is already known are added to the reaction solution.
  • the power supply unit 100 converts it into direct current power and supplies it to the central arithmetic processing unit 200, and the central arithmetic processing unit 200 delivers direct current power to each connected component device.
  • an operation control command is input through the interface unit 600, and the nucleic acid amplification test system is input.
  • the inspection process is carried out by amplification and optical measurement.
  • the process of nucleic acid amplification proceeds in three stages, with DNA denaturing, annealing, and DNA synthesis steps maintained at a specific temperature for a certain period of time.
  • the central processing unit 200 drives the temperature circulation unit 300 to heat and cool the reaction tube to a specific temperature.
  • the temperature circulation unit 300 includes a peltier 310, a thermistor 320, and a fan 330, as shown in FIG. 3.
  • the Peltier 310 in the temperature circulation unit 300 heats the reaction tube.
  • the central processing unit 200 detects the temperature of the heated reaction tube through the thermistor 320.
  • the temperature of the Peltier 310 is kept constant.
  • the reaction tube is heated to 90-95°C.
  • the fan 330 in the temperature circulation unit 300 is driven to cool the heated reaction tube to lower the temperature to 50-60°C.
  • the temperature of the reaction tube is maintained at 60-70°C, and the amount of fluorescence expression of the gene sample in the reaction tube amplified as a result of DNA synthesis is measured using the optical inspection unit 400. .
  • the optical inspection unit 400 irradiates light from the LED light source 420 to the reaction tube through the optical module 410, and the light expressed by fluorescence by the fluorescent material in the reaction tube again passes through the optical module 410 to the detection sensor. Receive light at (430).
  • the amount of light detected by the detection sensor 430 is proportional to the amount of fluorescent material in the reaction tube, that is, the amount of synthesized DNA.
  • the detection sensor 430 outputs an electrical signal proportional to the intensity of the detected light, and is transmitted to the central processing unit 200.
  • the central processing unit 200 records and stores the received data for each reaction tube.
  • the above process of nucleic acid amplification and optical measurement of fluorescent material is repeated several times, and the number of repetitions may vary depending on the type of amplification target nucleic acid.
  • the central processing unit 200 analyzes and processes data recorded and stored as the result of optical measurement of fluorescent substances using analysis algorithm software, outputs and displays the analysis results on the interface unit 600, and performs operation control of the system by user input. Runs the software (GUI).
  • the temperature circulation unit 300 is equipped with a Peltier 310 for heating and a fan 330 for cooling, and the reaction tube alternately blows wind generated from the Peltier 310 and the fan 330 to maintain high temperature. Contact induces a temperature change in the reaction tube.
  • the optimal temperature change range according to the nucleic acid to be amplified is adjusted by varying the contact time.
  • the temperature of the sample is driven to rapidly repeat a specific section within the range of 50 to 100°C to amplify the target nucleic acid.
  • the optical drive unit 500 moves the optical inspection unit 400 in a straight line back and forth to a position corresponding to the reaction tube in the direction of the arrow, and DNA is measured optically.
  • the optical inspection unit 400 is provided with a plurality of optical modules 410 of different wavelength bands, and according to the embodiment disclosed in FIGS. 6 and 7, there are four optical modules 410 (1) of different wavelength bands. ⁇ (4) is included in the optical inspection unit 400.
  • the optical inspection unit 400 includes optical modules 410 (1) to (4) that detect four different wavelengths, and each optical module moves to the position of a plurality of reaction tubes. It operates by using the same optical system for each wavelength to measure the fluorescent material of the test sample in the reaction tube, and the optical inspection unit 400, which is a combination of a plurality of optical modules, can move back and forth in a straight line along the position of the reaction tube. Adopting a structure is advantageous in terms of production, use and maintenance.
  • reaction tube there is a reaction solution in which four things are mixed: a high-concentration control sample whose quantitative value is already known, a low-concentration control sample, an internal control material, and a sample to be analyzed.
  • optical modules 410 (1) to (4) sequentially irradiate LED light source light in four different wavelength bands and emit light emitted from the mixed reaction solution. sense each.
  • the optical module 410 (1) irradiates LED optical light in the 450nm to 490nm wavelength band to reaction tube No. 1 as shown in the figure.
  • reaction tube No. 1 When light reception by the detection sensor is completed for reaction tube No. 1, the optical module 410 (1) moves to reaction tube No. 2 by the operation of the optical drive unit 500, and the 450 nm to 490 nm band for reaction tube No. 2 irradiates LED optical light.
  • the optical module 410 (1) sequentially moves from reaction tube No. 1 to reaction tube No. 8 to conduct optical analysis of the sample in the reaction tube.
  • the optical module 410 (2) radiates LED optical light in the 515 nm to 535 nm wavelength band and receives light in the 560 nm to 590 nm band emitted from the fluorescent material of the sample in the reaction tube with a detection sensor.
  • the optical module 410 (3) moves sequentially from reaction tube 1 to reaction tube 8, as shown in FIG. 7 (c). Perform optical analysis of the sample in the reaction tube.
  • the optical module 410 (3) irradiates LED optical light in the 560nm to 590nm wavelength band and receives light in the 610nm to 650nm band emitted from the fluorescent material of the sample in the reaction tube with a detection sensor.
  • reaction tube 1 When the optical measurement by the optical module 410 (3) is completed, it sequentially moves from reaction tube 1 to reaction tube 8, as shown in FIG. 7 (d), to the optical module 410 (4). Perform optical analysis of the sample in the reaction tube.
  • the optical module 410 (4) radiates LED optical light in the 620nm to 650nm wavelength band and receives light in the 660nm to 690nm band emitted from the fluorescent material of the sample in the reaction tube with a detection sensor.
  • the present invention is not limited to the excitation wavelength bands for each channel for the four channels from the optical module 410 (1) to the optical module 410 (4), and allows excitation wavelengths different from the four wavelength bands.
  • Channels can be added, and depending on the number of channels added, the number of optical modules increases from 4 to the number added.
  • the types of genetic samples that can be optically inspected within the reaction tube can be added.
  • the electrical signal received by the detection sensor from the optical module 410 (1) to the optical module 410 (4) is transmitted to the central processing unit.
  • the optical system that detects a plurality of different wavelengths moves to individual positions in the eight reaction tubes and measures them, the same optical system measures each wavelength. Therefore, the condition that the performance of the optical system must be the same is always satisfied.
  • control and sample becomes the same.
  • PCR inhibitors may be present, and even if the same amplification reagent is used, the amplification efficiency of the reaction solution with the control added and the reaction solution with the sample added may be different.
  • multiple signals (high-concentration control sample, low-concentration control sample, internal control material, sample to be analyzed, etc.) can be generated in one reaction tube.
  • the control sample and the analysis target satisfy the same amplification efficiency conditions, and since the control sample is added to the reaction solution, a separate control material reaction tube is not required.
  • reaction tubes can be used for optical measurement of the sample to be analyzed.
  • the central processing unit 200 drives the temperature circulation unit 300 to heat and cool the reaction tube.
  • the light from the LED light source 420 is irradiated to the reaction tube through the optical module 410, and the light emitted by the fluorescent substance in the reaction tube passes through the optical module 410 again to the detection sensor 430. Light is collected and the second cycle of optical analysis proceeds.
  • the number of times the cycle of temperature cycling and optical analysis is repeated may vary depending on the type of nucleic acid being targeted.
  • Figure 8 is an exploded view of the optical module 410.
  • the optical module 410 consists of a first body 410(a) and a second body 410(b), and the first body 410(a) on the left is equipped with devices necessary for optical measurement. It is a frame, and the second body 410(b) on the right is a frame cover that fixes and supports the devices mounted on the first body 410(a).
  • the first body of the optical module includes a module incident lens 411, an input optical filter 412, a dichroic mirror 413 that reflects only light of a specific wavelength, a reaction tube incident lens 414, and an output side.
  • An optical filter 415 and a sensor output lens 416 are installed.
  • Figure 10 is a diagram showing the combination of two optical modules.
  • the two optical modules are joined by snapping at corresponding positions.
  • a plurality of optical modules 410 are coupled to the optical inspection unit 400 using the coupling protrusion-coupling groove fitting method described above.
  • the electrical signal measured by the detection sensor is analyzed and processed by software built into the central processing unit.
  • the raw data of each reaction tube is corrected using a 5-section moving average (see Figure 12).
  • the data is rotated based on the straight line connecting the start point and the end point, the X value with the minimum Y value is determined as the amplification start point, and the Ct value (Cycle Threshold Value) is calculated (see Figure 13).
  • the range from the starting point to before the amplification start point is set as the baseline section, and the slope and Y-intercept of this section are adjusted to ‘0’ to output a graph (see Figure 14).
  • Figure 15 is an algorithm for calculating quantitative values for each reaction through quantitative lines created with control values.
  • Specify reaction tubes and fluorescence channels containing high and low control samples if high and low control samples are used in separate tubes, or specify fluorescence channels for high and low control samples in a single tube (if high and low control samples are used in separate tubes). (when applying the included reaction tube) and call the Ct value of the specified signal, respectively.
  • a quantitative line is created using the concentration and Ct values of the high- and low-concentration controls.

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Abstract

핵산증폭 검사시스템에 있어서, 외부로부터 공급받은 상용 교류전원을 직류전원으로 변환하여 공급하는 전원공급부(100); 반응튜브를 가열, 냉각 제어하고, 반응튜브에서 광학 측정된 데이터를 분석 저장하는 중앙 연산 처리부(200); 반응튜브를 가열, 냉각 처리하여 반응튜브에 담긴 물질의 유전자를 증폭시키는 온도순환부(300); 반응튜브에 담긴 물질을 광학 분석하는 광학검사부(400); 중앙 연산 처리부(200)의 작동 제어에 의해 광학검사부(400)을 구동하는 광학구동부(500); 및 검사시스템의 작동 명령을 입력하고 검사결과를 출력하는 인터페이스부(600);를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템.

Description

핵산증폭 검사시스템
본 발명은 DNA를 반응튜브 내에서 대량으로 증폭하여 검사하는 핵산증폭 검사시스템에 관한 것이다.
PCR은 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)의 약자로서 DNA 중합 효소를 이용하여 DNA의 양을 증폭시키는 기술이다.
PCR에 의하면 DNA가 아주 적은 양이더라도, 우리가 원하는 부분을 엄청난 양과 높은 정확도로 크게 늘릴 수 있다. 또한 증폭에 걸리는 시간도 매우 짧아서, 현대 생물학에서 가장 중요한 기반 기술로 이용되고 있다.
PCR은 증폭시키려 하는 주형(template) DNA와 함께 증폭시키고자 하는 특정 위치에 결합하는 프라이머(primer)와 DNA 중합 효소(polymerase), 새로운 DNA를 만들기 위한 재료인 dNTP(Deoxynucleotide triphosphate)를 혼합하고, 94~96 ℃ 정도로 열을 가해 한 개의 DNA를 두 가닥으로 분리한다. 이후 온도를 50~64 ℃ 정도로 냉각하면 프라이머(primer)와 DNA 중합 효소가 외가닥 DNA의 특정 부위에 결합하고, 다음에 합성되어 2개의 DNA가 된다. 이 과정을 반복하면 4개, 8개, 16개가 되는 식으로 폭발적인 연쇄 작용을 통해 원하는 DNA의 양이 늘어나게 된다.
한편, 본 출원인이 이전에 출원하여 등록받은 선행 특허인 고속 핵산증폭 장치(국내등록특허 10-2081480)에 따르면,
고속 핵산증폭 반응에 사용되는 장치에 있어서,
상기 반응이 이루어지는 튜브를 위치 고정시키는 홀더;
상기 튜브를 가열시키도록 열을 생성하는 히터 및 상기 히터와 연결되는 가열 블록을 포함하는 가열 모듈;
상기 가열 모듈을 상하 방향으로 이동시켜서 상기 가열 모듈과 상기 홀더 사이의 거리가 가변하도록 하는 구동 모듈; 및 상기 홀더에 고정된 튜브를 냉각시키는 냉각 모듈;을 포함하며,
상기 냉각 모듈은,
냉각용 바람을 생성하는 송풍 팬, 및 상기 송풍 팬에서 생성된 냉각용 바람을 상기 홀더에 고정된 튜브로 전달하는 송풍 노즐을 포함하며,
상기 송풍 노즐은 상기 가열 모듈이 상기 홀더에 인접하면 밀폐되고 상기 가열 모듈이 상기 홀더로부터 이격되면 개방되는 고속 핵산증폭 장치가 있다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허공보 제10-2081480호(2020. 4. 24 공고)
기존의 고속 핵산증폭 장치는 <도 1>에 개시한 바와 같이,
모듈 베이스에 가열 블록(220)이 결합되고 광 포착부, 방출 필터(330)가 각각 탑재되도록 탑재벽을 갖되, 상기 탑재벽에는 상기 가열 블록(220)의 광 전달부(224)의 위치에 대응하여 광 전달부(224)와 연통하는 관통공이 형성되어 광이 통과하도록 구성된다.
그리고 광 포착부는 소정의 PCB(322)에 소정의 센서부(324)가 실장된 부재로 구성되며, 상기 센서부(324)는 광 전달부(224)의 개수 및 튜브의 배열에 대응하는 개수 및 배열을 갖는다.
즉, 가열 블록(220)의 복수개의 함몰부(222)의 수에 따라 복수개의 광 전달부(224)가 형성되며, 각각의 광 전달부(224)에 대응하여 복수개의 광 포착부가 마련된다.
그러나, 기존의 단일 파장의 고정형 광학 유닛을 사용하는 핵산증폭장치는 복수개의 광학 유닛의 성능을 동일하게 유지하기 위하여 캘리브레이션 세팅의 번거로운 과정이 필요하며, 하나의 표준으로 모든 반응 튜브를 세팅하여야 한다.
또한 고정형 광학 유닛으로는 구조상 단일 파장만 적용이 가능하므로 멀티 플렉스 PCR 검사에 한계가 있으며, 검출 가능한 파장의 수에도 제한이 따른다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 본 특허 발명은 스캔형, 반사식 광학모듈을 구비하여, 각각 검출 파장이 다른 복수 개의 광학 유닛이 반응 튜브의 위치로 이동하며 측정할 수 있는 검사시스템을 제안한다.
본 발명에 따른 핵산증폭 검사시스템은 복수 개의 각각 다른 파장을 검출하는 광학계가 반응 튜브의 위치로 왕복 직선 이동하며, 각 파장에 대하여 동일한 광학계가 반응 튜브 내의 시료에 대한 형광 물질을 측정함으로써 동일한 광학계 성능이 보장이 되며, 복수 개의 광학계의 직선 이동이 가능한 단순한 결합 구조를 채택함으로써 제작, 사용 및 유지 보수의 다방면에서 매우 유리하다.
도 1 은 기존의 검사장치의 실시예이다.
도 2 는 본 발명에 따른 핵산증폭 검사시스템의 주요 구성이다.
도 3 은 본 발명에 따른 온도순환부이다.
도 4 는 본 발명에 따른 광학검사부이다.
도 5 는 본 발명에 따른 핵산증폭 검사시스템의 외관을 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 광학검사부의 작동을 보여주는 도면이다.
도 7(a) 내지 7(d)은 본 발명에 따른 광학 측정의 실시예이다.
도 8은 본 발명에 따른 광학모듈의 분해도이다.
도 9는 본 발명에 따른 광학 모듈의 제1 몸체의 구성도이다.
도 10은 본 발명에 따른 2개의 광학 모듈의 결합 관계도이다.
도 11는 본 발명에 따른 중앙 연산 처리부의 분석 알고리즘이다.
도 12은 본 발명에 따른 데이터 보정 도면이다.
도 13는 본 발명에 따른 증폭 시작점 판정 및 Ct 값 계산 도면이다.
도 14는 본 발명에 따른 베이스라인 조정 및 그래프 출력 도면이다.
도 15은 본 발명에 따른 정량값 계산 알고리즘이다.
도 2는 본 특허 발명에 따른 핵산증폭 검사시스템의 주요 구성을 보여주는 블록다이아 그램이다.
도 2에 개시된 바와 같이 본 특허 발명은,
핵산증폭 검사시스템에 있어서,
상용 교류전원을 외부로부터 공급받아 직류전원으로 변환하여 공급하는 전원공급부(100);
반응튜브를 가열, 냉각 제어하고, 반응튜브에서 측정된 데이터를 분석 저장하는 중앙 연산 처리부(200);
반응튜브를 가열, 냉각 처리하여 반응튜브 내의 유전자 시료를 증폭시키는 온도순환부(300);
반응튜브 내의 반응 용액을 광학 분석하는 광학검사부(400);
중앙 연산 처리부(200)의 작동 제어에 의해 광학검사부(400)을 구동하는 광학구동부(500);
검사시스템의 작동 명령을 입력하고 검사결과를 출력하는 인터페이스부(600);를 포함한다.
상기에서 반응 튜브 내에는 분석 대상 시료 외에도, 이미 정량 값을 알고 있는 고농도 컨트롤 시료와 저농도 컨트롤 시료, 내부 대조 물질 등이 반응 용액에 첨가된다.
상용 교류 전원을 본 시스템에 공급하면 전원공급부(100)는 직류 전원으로 변환하여 중앙 연산 처리부(200)에 공급하고, 중앙 연산 처리부(200)는 연결된 각 구성 장치에 직류 전원을 전달한다.
후술하는 도면에 개시하는 바와 같이 분석 대상 및 컨트롤 시료 등의 혼합 용액이 담긴 반응 튜브를 본 특허 발명의 핵산증폭 검사 시스템에 투입한 후에, 상기 인터페이스부(600)를 통하여 작동 제어 명령을 입력하면 핵산 증폭 및 광학 측정에 의한 검사 과정이 진행된다.
핵산 증폭의 과정은 DNA 변성(denaturing), 어닐링(annealing), 및 DNA 합성(synthesizing) 단계가 특정 온도에서 일정시간 유지되면서 3단계로 진행된다.
핵산 증폭 과정에서, 중앙 연산 처리부(200)는 온도순환부(300)를 구동하여 반응 튜브를 특정 온도로 가열하고 냉각 처리한다.
온도순환부(300)는 도 3에 개시된 바와 같이 펠티어(310), 서미스터(320) 및 팬(330)을 구비한다.
DNA 변성(denaturing) 단계에는 온도순환부(300) 내의 펠티어(310)가 반응튜브를 가열시킨다.
중앙연산처리부(200)는 서미스터(320)를 통하여 가열된 반응튜브의 온도를 감지한다.
서미스터(320)로 감지한 온도가 제어 입력을 추종하도록 그 차이를 보상하여 펠티어(310)에 구동 전류를 인가함으로써, 펠티어(310)의 온도를 일정하게 유지한다.
DNA 변성(denaturing) 단계에는 반응 튜브를 90~95℃까지 가열한다.
어닐링(annealing) 단계에는 온도순환부(300) 내의 팬(330)을 구동하여 가열된 반응튜브의 온도가 50~60℃까지 하강하도록 냉각 처리한다.
또한 DNA 합성(synthesizing) 단계에서는 반응 튜브의 온도를 60~70℃를 유지하고, DNA 합성(synthesizing)의 결과로 증폭된 반응튜브 내의 유전자 시료에 대하여 형광 발현량을 광학검사부(400)로 측정한다.
광학검사부(400)은 광학모듈(410)을 통하여 엘이디광원(420)의 빛을 반응튜브에 조사하고, 반응튜브 내의 형광물질에 의해 형광 발현되는 빛이 다시 광학모듈(410)을 통과하여 감지센서(430)로 수광한다.
CCD, 포토다이오드와 같은 감지센서(430)에 감지된 빛의 양은 반응튜브 내의 형광물질의 양, 즉 합성된 DNA의 양과 비례한다.
감지센서(430)는 감지된 빛의 세기에 비례하는 전기 신호를 출력하고, 중앙 연산 처리부(200)로 전달된다.
중앙연산처리부(200)는 수신한 데이터를 반응 튜브별로 기록 저장한다.
바람직하게는 상기의 핵산 증폭 및 형광 물질의 광학 측정 과정은 수회 반복하며, 반복 횟수는 증폭 표적 핵산의 종류에 따라 달라질 수 있다.
중앙연산처리부(200)는 형광 물질의 광학 측정 결과로 기록 저장한 데이터를 분석 알고리즘 소프트웨어로 분석 처리하고, 분석 결과를 인터페이스부(600)에 출력 표시하고, 사용자 입력에 의한 시스템의 동작 제어를 수행하는 소프트웨어(GUI)를 수행한다.
이제 도 5에 개시된 본 발명에 따른 핵산 증폭 검사 시스템의 실시 예를 살펴 본다.
온도순환부(300)는 가열을 담당하는 펠티어(310)와 냉각을 담당하는 팬(330)을 구비하며, 반응튜브가 고온을 유지하는 펠티어(310)와 팬(330)으로부터 발생된 바람을 번갈아 접촉하여 반응 튜브의 온도 변화를 유도한다.
증폭 대상 핵산에 따른 최적의 온도 변화 구간은 접촉 시간을 달리하여 조절한다.
이에 따라 시료의 온도가 50~100℃ 범위 내의 특정 구간을 빠르게 반복하도록 구동하여 표적 핵산을 증폭한다.
도 6에 개시된 바와 같이 중앙 연산 처리부(200)의 작동 제어에 의해 광학구동부(500)는 광학검사부(400)을 화살표의 방향으로 반응 튜브에 대응하는 위치로 왕복 직선 이동하면서, 반응 튜브 내의 합성된 DNA를 광학 측정한다.
본 발명에 따른 광학검사부(400)는 서로 다른 파장대의 복수 개의 광학모듈(410)을 구비하며, 도 6 및 도 7에 개시된 실시예에 따르면 4개의 서로 다른 파장대의 광학모듈(410)(1)~(4)이 광학검사부(400)에 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 광학검사부(400)는 4개의 각각 다른 파장을 검출하는 광학모듈(410)(1)~(4)을 구비하고, 각 광학모듈은 복수개의 반응 튜브의 위치로 이동하여 동작하며, 각 파장에 대하여 동일한 광학계가 반응 튜브 내의 검사 시료에 대한 형광 물질을 측정하며, 복수개의 광학모듈이 결합된 광학검사부(400)는 반응 튜브의 위치를 따라서 왕복 직선 이동 할 수 있는 결합 구조를 채택함으로써 제작, 사용 및 유지 보수의 측면에서 유리하다.
상기 실시예에 따른 반응 튜브 내에는 이미 정량값을 알고 있는 고농도 컨트롤 시료와 저농도 컨트롤 시료, 내부 대조 물질, 그리고 분석 대상 시료의 4가지가 혼합된 반응 용액이 있다.
도 7 (a) 에서부터 7 (d) 까지는 4개의 광학모듈(410) (1)~(4)이 순차적으로 서로 다른 4개의 파장대의 엘이디 광원 빛을 조사하고, 혼합된 반응 용액으로부터 방출되는 빛을 각각 감지한다.
도 7 (a) 에서 광학모듈(410) (1)은 도면에 개시한 바와 같이 1번 반응 튜브에 대하여 450nm~490nm 파장대역의 엘이디 광학 빛을 조사한다.
그리고 1번 반응 튜브 내 혼합된 반응 용액으로부터 방출되는 520nm~540nm 대역의 빛을 감지센서로 수광한다.
1번 반응 튜브에 대하여 감지센서의 수광이 완료되면, 광학구동부(500)의 작동에 의해 광학모듈(410) (1)은 2번 반응 튜브로 이동하며, 2번 반응 튜브에 대하여 450nm~490nm 대역의 엘이디 광학 빛을 조사한다.
그리고 2번 반응 튜브 내 혼합된 반응 용액으로부터 방출되는 520nm~540nm 대역의 빛을 감지센서로 수광한다.
이와 같이 도면에 개시한 바와 같이 1번 반응 튜브에서 8번 반응 튜브로 순차적으로 광학모듈(410) (1)이 이동하면서 반응 튜브 내의 시료의 광학 분석을 실시한다.
광학모듈(410) (1)에 의한 광학 측정이 완료되면, 도 7 (b)에 개시한 바와 같이 처음의 원위치로 돌아와서, 다시 1번 반응 튜브에서 8번 반응 튜브로 순차적으로 이동하면서 광학모듈(410) (2)에 의하여 반응 튜브 내의 시료의 광학 분석을 실시한다.
이 때 광학모듈(410) (2)는 515nm~535nm 파장대역의 엘이디 광학 빛을 조사하고, 반응 튜브 내 시료의 형광 물질로부터 방출되는 560nm~590nm 대역의 빛을 감지센서로 수광한다.
광학모듈(410) (2)에 의한 광학 측정이 완료되면, 도 7 (c)에 개시한 바와 같이 다시 1번 반응 튜브에서 8번 반응 튜브로 순차적으로 이동하면서 광학모듈(410) (3)에 의하여 반응 튜브 내의 시료의 광학 분석을 실시한다.
이 때 광학모듈(410) (3)는 560nm~590nm 파장대역의 엘이디 광학 빛을 조사하고, 반응 튜브 내 시료의 형광 물질로부터 방출되는 610nm~650nm 대역의 빛을 감지센서로 수광한다.
광학모듈(410) (3)에 의한 광학 측정이 완결되면, 도 7 (d)에 개시한 바와 같이 다시 1번 반응 튜브에서 8번 반응 튜브로 순차적으로 이동하면서 광학모듈(410) (4)에 의하여 반응 튜브 내의 시료의 광학 분석을 실시한다.
이 때 광학모듈(410) (4)는 620nm~650nm 파장대역의 엘이디 광학 빛을 조사하고, 반응 튜브 내 시료의 형광 물질로부터 방출되는 660nm~690nm 대역의 빛을 감지센서로 수광한다.
본 발명은 상기의 광학모듈(410) (1)에서부터 광학모듈(410) (4)까지의 4개의 채널에 대한 채널별 excitation 파장 대역에 제한을 받지 않고, 상기 4개의 파장대역과 다른 excitation 파장을 갖는 채널을 추가할 수 있으며, 채널이 추가되는 갯수에 따라 광학 모듈의 개수도 4 개에서 추가되는 갯수 만큼 증가 된다.
광학모듈이 추가되면 반응 튜브 내에서 광학 검사할 수 있는 유전자 시료의 종류를 추가할 수 있다.
상기의 실시예에서 개시된 바와 같이 광학모듈(410) (1)에서부터 광학모듈(410) (4)까지 감지센서로 수광된 전기 신호는 중앙 연산 처리부로 전송된다.
복수개의 각각 다른 파장을 검출하는 광학계가 반응 튜브 8개의 개별 위치로 이동하며 측정을 하므로, 각 파장에 대하여 동일 광학계가 측정을 하게 된다. 따라서 광학계의 성능이 동일해야 하는 조건을 항상 만족한다.
또한 컨트롤과 시료의 증폭 효율이 동일해진다.
검체에 따라서는 PCR inhibitor 가 존재할 수 있으며, 동일한 증폭 시약을 사용하더라도 컨트롤을 첨가한 반응 용액과 검체를 첨가한 반응 용액의 증폭 효율이 상이할 수 있다.
이를 개선하기 위해, 이미 값을 알고 있는 고농도 컨트롤 시료와 저농도 컨트롤 시료, 내부 대조 물질 등을 분석 대상 시료의 반응 용액에 첨가한다.
그렇게 되면, 한개의 반응 튜브에서 복수개의 신호(고농도 컨트롤 시료, 저농도 컨트롤 시료, 내부 대조 물질, 분석 대상 시료 등)가 발생할 수 있다.
반응 튜브 내는 반응 용액 환경이 동일하므로, 컨트롤 시료와 분석 대상은 동일한 증폭 효율 조건을 만족하게 되며, 컨트롤 시료를 반응 용액에 첨가하기 때문에 컨트롤 물질 반응 튜브가 별도로 필요하지 않다.
따라서 8개의 반응 튜브가 모두 분석 대상 시료의 광학 측정에 사용될 수 있다.
상기의 실시예에서 개시된 바와 같이 광학모듈(410) (1)에서부터 광학모듈(410) (4)까지의 광학 측정 과정이 완료되면,
다시 중앙 연산 처리부(200)는 온도순환부(300)를 구동하여 반응 튜브를 가열하고 냉각 처리한다.
그리고 다시 광학모듈(410)을 통하여 엘이디광원(420)의 빛을 반응튜브에 조사하고, 반응튜브 내의 형광물질에 의해 형광 발현되는 빛이 다시 광학모듈(410)을 통과하여 감지센서(430)로 수광하여 광학 분석의 2번째 싸이클이 진행된다.
이후 온도 순환 및 광학 분석의 싸이클이 반복하여 진행되며, 증폭 핵산에 대한 검사가 진행 된다.
온도 순환 및 광학 분석의 싸이클이 반복되는 횟수는 표적하는 핵산의 종류에 따라 달라질 수 있다.
도 8은 광학 모듈(410)을 분해한 도면이다.
광학 모듈(410)은 제1 몸체(410(a))와 제2 몸체(410(b))로 구성되며, 좌측의 제1 몸체(410(a))는 광학 측정에 필요한 장치들이 내부에 장착되는 프레임이며, 우측의 제2 몸체(410(b))는 상기 제1 몸체(410(a))에 장착된 장치들을 고정 지지해 주는 프레임 커버이다.
도 9에 개시된 바와 같이 광학 모듈의 제1 몸체에는 모듈 입사렌즈(411), 입력측 광학필터(412), 특정 파장의 빛만 반사하는 다이크로익 미러(413), 반응튜브 입사렌즈(414), 출력측 광학필터(415), 센서 출력렌즈(416)가 장착된다.
도 10에는 2개의 광학 모듈의 결합을 보여주는 도면이다.
좌측 광학 모듈의 제2 몸체(410(b))에 구비된 한 쌍의 결합돌기(417)와 우측 광학 모듈의 제1 몸체(410(a))에 구비된 한 쌍의 결합홈(418)이 대응 위치에서 끼움 결합되어 2개의 광학 모듈이 결합된다.
상기와 같은 결합돌기-결합홈의 끼움 결합 방식으로 광학검사부(400)에 복수 개의 광학 모듈(410)들이 결합되어 구비된다.
도 11에 개시된 바와 같이 감지 센서에 의해 측정된 전기 신호는 중앙 연산 처리부에 내장된 소프트웨어에 의해 분석 처리 된다.
<데이터 베이스 작성 단계>
각 반응 튜브별로, 각 형광 채널에 대해 전기 신호의 raw 데이터의 데이터 베이스를 기록 저장한다.
< Smoothing 단계>
5구간 이동 평균을 사용하여 각 반응 튜브의 raw 데이터를 보정한다.(도 12 참조)
< 증폭 시작점 판정 및 Ct 값 계산 단계>
시작점과 끝점을 이은 직선을 기준으로 데이터 회전하여 최소 Y값을 가지는 X값을 증폭 시작점으로 판정하고 Ct값(Cycle Threshold Value)을 계산한다.(도 13 참조)
< 베이스라인 조정 및 그래프 출력 단계>
시작점부터 증폭 시작점 이전까지 범위를 baseline 구간으로 설정하여, 이 구간의 기울기와 Y절편을 ‘0’로 전체 값을 조정하여 그래프를 출력한다.(도 14 참조)
도 15는 컨트롤 값으로 작성한 정량선을 통해 각 반응에 대한 정량값을 계산하는 알고리즘이다.
< 컨트롤 Ct값 호출 단계>
고농도와 저농도 컨트롤 시료가 담긴 반응 튜브 및 형광 채널을 지정하고, 지정된 신호의 Ct값을 각각 호출한다.
고농도와 저농도 컨트롤 시료가 담긴 반응 튜브 및 형광 채널을 지정(별도의 튜브에 고농도와 저농도 컨트롤 시료를 사용하는 경우), 또는 단일 튜브에 담긴 고농도와 저농도 컨트롤의 형광 채널을 지정(고농도와 저농도 컨트롤이 포함된 반응튜브를 적용하는 경우)하고, 지정된 신호의 Ct 값을 각각 호출한다.
< 컨트롤 농도 호출 단계>
고농도와 저농도 컨트롤 시료의 농도값을 입력 또는 저장된 값을 호출한다.
< 정량선 작성 단계>
고농도와 저농도 컨트롤의 농도값과 Ct값으로 정량선을 작성한다.
< 정량값 계산 단계>
반응 시료의 Ct값을 정량선에 대입하여 시료의 농도값을 계산한다.

Claims (11)

  1. 핵산증폭 검사시스템에 있어서,
    외부로부터 공급받은 상용 교류전원을 직류전원으로 변환하여 공급하는 전원공급부(100);
    반응튜브를 가열, 냉각 제어하고, 반응튜브에서 광학 측정된 데이터를 분석 저장하는 중앙 연산 처리부(200);
    반응튜브를 가열, 냉각 처리하여 반응튜브에 담긴 물질의 유전자를 증폭시키는 온도순환부(300);
    반응튜브에 담긴 물질을 광학 분석하는 광학검사부(400);
    중앙 연산 처리부(200)의 작동 제어에 의해 광학검사부(400)을 구동하는 광학구동부(500); 및
    검사시스템의 작동 명령을 입력하고 검사결과를 출력하는 인터페이스부(600);를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 온도순환부(300)가,
    반응 튜브를 90~95℃ 범위에서 가열하는 DNA 변성(denaturing) 단계;
    반응 튜브를 50~60℃ 범위로 하강 냉각시키는 어닐링(annealing) 단계; 및
    반응 튜브의 온도를 60~70℃ 범위에서 유지하는 DNA 합성(synthesizing) 단계를 포함하여,
    반응 튜브에 담긴 물질의 유전자를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 온도순환부(300)는 반응 튜브 가열 수단인 펠티어(310)와 냉각 수단인 팬(330)을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 온도순환부(300)는 가열된 반응 튜브의 온도를 감지하여, 감지한 온도가 제어 입력을 추종하도록 구동 전류가 인가되는 서미스터(320)를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 광학검사부(400)는
    반응 튜브에 담긴 용액에 빛을 조사하는 엘이디광원(420); 및
    반응 튜브에 담긴 용액 내의 형광물질에 의해 발현되는 빛을 감지하는 감지센서(430);를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 광학검사부(400)는 복수의 채널에 대한 서로 다른 excitation 파장 대역을 갖는 복수개의 광학모듈(410)을 구비하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 excitation 파장 대역은 450nm~490nm, 515nm~535nm, 560nm~590nm 및 620nm~650nm을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 광학구동부(500)는 광학모듈(410)이 모든 반응 튜브에 담긴 용액에 대하여 광학 측정을 할 수 있도록 반응 튜브의 대응 위치로 광학검사부(400)를 순차적으로 직선 이동하며, 하나의 광학모듈(410)에 의한 광학 측정이 종료되면 다른 광학모듈(410)에 의해 반응 튜브를 광학 측정 할 수 있도록 광학검사부(400)를 이동 전 위치로 복귀한 이후에 다시 반응 튜브의 대응 위치로 순차적으로 직선 이동하도록 제어함으로써, 모든 반응 튜브에 담긴 용액을 동일 광학계가 측정함으로써 광학계의 성능이 동일한 조건을 항상 만족할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  9. 청구항 6에 있어서,
    상기 광학모듈(410)은 제1 몸체(410(a))와 제2 몸체(410(b))로 구성되며, 상기 제1 몸체(410(a))는 광학 측정에 필요한 장치들이 내부에 장착되는 프레임이며, 상기 제2 몸체(410(b))는 상기 제1 몸체(410(a))에 장착된 장치들을 고정 지지해 주는 프레임 커버인 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 중앙 연산 처리부(200)의 분석 알고리즘은,
    (Ⅰ) 각 반응 튜브 별로, 각 형광 채널에 대해 전기 신호의 raw 데이터를 기록 저장하는 단계;
    (Ⅱ) 5구간 이동 평균을 사용하여 각 반응 튜브의 raw 데이터를 보정하는 단계;
    (Ⅲ) 시작점과 끝점을 이은 직선을 기준으로 데이터 회전하여 최소 Y값을 가지는 X값을 증폭 시작점으로 판정하고 Ct 값(Cycle Threshold Value)을 계산하는 단계;
    (Ⅳ) 시작점부터 증폭 시작점 이전까지 범위를 baseline 구간으로 설정하여, 이 구간의 기울기와 Y절편을 ‘0’로 전체 값을 조정하여 그래프를 출력하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 중앙 연산 처리부(200)의 정량값을 계산하는 알고리즘은,
    (Ⅰ) 고농도와 저농도 컨트롤 시료가 담긴 반응 튜브 및 형광 채널을 지정하고, 지정된 신호의 Ct 값을 각각 호출하는 단계;
    (Ⅱ) 고농도와 저농도 컨트롤 시료의 농도값으로 입력 또는 저장된 값을 호출하는 단계;
    (Ⅲ) 고농도와 저농도 컨트롤의 농도값과 Ct 값으로 정량선을 작성하는 단계;
    (Ⅳ) 반응 시료의 Ct 값을 정량선에 대입하여 시료의 농도값을 계산하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산증폭 검사시스템
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