WO2023195633A1 - 초임계 유체 추출 공정을 이용하여 제조된 무세포 진피조직 및 이의 용도 - Google Patents

초임계 유체 추출 공정을 이용하여 제조된 무세포 진피조직 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023195633A1
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dermal tissue
tissue
supercritical fluid
acellular dermal
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PCT/KR2023/002604
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신용우
한정훈
노성래
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주식회사 도프
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    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents

Definitions

  • the present invention relates to acellular dermal tissue produced using a supercritical fluid extraction process. More specifically, it relates to acellular dermal tissue with improved extracellular matrix preservation and optimized mechanical properties such as critical load and elastic recovery force using a supercritical fluid extraction process.
  • the human skin tissue consists of the outermost epidermis layer, the dermis layer below it, and the subcutaneous tissue.
  • the epidermal layer is composed of epithelial cells differentiated into several layers from the basement membrane, which allows the epidermal layer and dermal layer to be tightly combined, as well as melanocytes and immune cells.
  • the dermis layer below the epidermis layer is mainly composed of fibroblasts and an extracellular matrix composed of collagen and elastin.
  • Part of the skin tissue or internal organ tissue may be damaged due to burns, trauma, ulcers, etc.
  • transplantation from the own skin tissue or internal organ tissue is performed for the purpose of healing the damaged tissue or for reconstructive plastic surgery.
  • Use the method In this case, there is the surgical burden of additionally removing the transplant recipient's own skin tissue or organ tissue, which can be dangerous if the recipient's health is not good.
  • there is a method of transplantation using xenogeneic tissue or synthetic biomaterial but in this case, an immune rejection reaction may occur, resulting in an inflammatory reaction during long-term transplantation, which may result in reoperation.
  • a method of manufacturing an acellular dermal layer for transplantation from skin tissue extracted from a donor is disclosed in Korean Patent No. 10-0469661 and No. 10-0791502, but this method is a surfactant treatment process.
  • Surfactant treatment may cause problems such as denaturation of proteins such as collagen and destruction of growth factors.
  • it is difficult to maintain the structural and histological form, and mechanical properties such as critical load and elasticity may be weakened.
  • acellular dermis In addition, to prepare acellular dermis, methods such as removal of immunogenic cells using proteolytic enzymes such as trypsin or dispase, repeated freeze-thaw, and NaCl and SDS treatment methods have been used. However, the acellular dermis produced through this process contains many antigenic components, causing immune rejection when transplanted into the recipient site, resulting in a low engraftment rate (RJ Walter et.al , Burns , 24: 104-113, 1998) .
  • the present inventors conducted research to develop an acellular dermal transplant material that improves the problems of transplant rejection and cost, and at the same time improves the problem of weakening mechanical properties caused by decellularization by chemical treatment methods.
  • the present invention was completed by establishing an optimized supercritical fluid treatment process without surfactant treatment and obtaining acellular dermal tissue with improved mechanical properties and extracellular matrix preservation.
  • one aspect of the present invention provides an acellular dermal tissue implant having a critical load of 11 to 19 N and a Young's modulus of 0.5 to 1.2 MPa.
  • Another aspect of the present invention includes the steps of: a) separating skin tissue separated from an individual into an epidermal layer and a dermal layer; b) extracting the separated dermis layer with a supercritical fluid; and c) washing the dermal layer extracted with the supercritical fluid with a phosphate buffer solution.
  • the acellular dermal tissue according to the present invention is decellularized without surfactant treatment, maintaining mechanical properties such as critical load and elasticity, and at the same time, there is no toxicity due to residual surfactant, so it is suitable for patients with skin tissue damage such as burns or trauma. Suitable for transplantation. Therefore, the acellular dermal tissue of the present invention obtained through an optimized supercritical fluid treatment process is free of toxicity and transplant rejection, and can be usefully used to treat patients with skin tissue damage.
  • Figure 1 is a photograph observing the appearance of an acellular dermal sample according to an embodiment of the present invention.
  • the RTU Ready-To-Use
  • the FD Freeze-Drying
  • Native is an unprocessed natural skin tissue sample in which the epidermis has not been removed, and SCR, SCF, A, B, C, D, E, and F are as shown in Table 1 below.
  • the dermis sample size is 1 ⁇ 1 cm 2 .
  • Figure 2 is a micrograph (100 ⁇ magnification) showing the results of H&E (Hematoxyline & Eosin) staining of an acellular dermal sample obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • H&E Hematoxyline & Eosin
  • Figure 3 shows dermal tissue (Native) without the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention, decellularized dermal tissue (SCR, SCF) after the supercritical fluid extraction process, and conventionally known tissue according to the detailed specifications in Table 1.
  • SCR, SCF decellularized dermal tissue
  • Table 1 This is a 1% agarose gel electrophoresis image confirming the remaining amount of DNA in acellular dermal tissues (A, B, C, D, E, F) prepared according to the method.
  • SCR, A, B, and C are RTU (Ready-To-Use) type samples
  • SCF, D, E, and F are FD (Feeze-Drying) type samples.
  • Figure 4a is a diagram showing the results of quantitative analysis of residual DNA of an acellular dermal sample obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention. At this time, the results of quantitative analysis of residual DNA are expressed based on the dry weight of acellular dermal tissue.
  • Native refers to the original tissue as an untreated group
  • SCR and SCF refer to the dermal tissue test group decellularized by treatment with supercritical fluid
  • A, B, C, D, E, and F refer to the detailed specifications in Table 1. This is a positive control group of decellularized dermal tissue.
  • Figure 4b is a diagram showing the results of quantitative analysis of residual DNA of an acellular dermal sample obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention. At this time, the results of quantitative analysis of residual DNA are expressed based on the original tissue without removing the epidermal layer.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of Western blot analysis confirming the expression level of the immunogenic protein MHC1 in acellular dermal samples (SCR, SCF) obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a is a diagram showing the results of collagen content analysis of acellular dermal samples (SCR, SCF) obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention. At this time, the collagen content analysis results are expressed based on the dry weight of acellular dermal tissue.
  • Figure 6b is a graph showing quantitative analysis of the collagen content of acellular dermal samples (SCR, SCF) obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention based on the original tissue.
  • SCR acellular dermal samples
  • Figure 7a is a diagram showing the results of elastin content analysis of acellular dermal samples (SCR, SCF) obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention. At this time, the elastin content analysis results are expressed based on the dry weight of acellular dermal tissue.
  • Figure 7b is a graph showing quantitative analysis of the elastin content of acellular dermal samples (SCR, SCF) obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention based on the original tissue.
  • Figure 8a is a diagram showing the results of a cytokine array confirming the degree of growth factor preservation in an acellular dermal sample obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8b is a diagram showing the spot coordinates of the cytokine array confirming the degree of growth factor preservation in the acellular dermal sample obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 8c to 8f are graphs showing the cytokine array results confirming the degree of preservation of growth factors in acellular dermal samples obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention, quantified by average spot pixel density.
  • Figure 9 is a diagram showing the results of cytotoxicity evaluation of an acellular dermal sample obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10a is a graph showing the results of measuring the critical load of an acellular dermal sample obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention using a universal tensile tester (UTM).
  • UPM universal tensile tester
  • Figure 10b is a graph showing quantitative analysis of the critical load of an acellular dermal sample obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention based on the original tissue.
  • Figure 11a is a graph showing the results of Young's modulus (Young's moulus) measurement of an acellular dermal sample obtained after a supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11b is a graph showing quantitative analysis of the Young's modulus of an acellular dermal sample obtained after the supercritical fluid extraction process according to an embodiment of the present invention based on the original tissue.
  • the critical load of the acellular dermal tissue is 11 to 19 N, and Young's modulus is 0.5 to 1.2 MPa.
  • the term "dermis” is mainly composed of collagen fibers made of collagen protein, and elastic fibers made of elastin protein are woven in a net shape between them.
  • the dermis makes up most of the skin, supports the epidermis by supplying nutrients to it, and protects the body from external damage. It also has the ability to store moisture and regulate body temperature, acts as a receptor for sensation, and also functions to regenerate the skin by interacting with the epidermis.
  • ADM acellular dermal matrix
  • ECM extracellular matrix
  • the acellular dermis is a biomaterial obtained by removing cells that can cause an immune response from skin separated from an individual, and can be used to restore skin by transplanting it to patients with skin defects caused by burns, traffic accidents, ulcers, etc.
  • acellular dermis a skin tissue for human transplantation, can be expanded and used not only for reconstruction of full-thickness skin, nasal septum, and cerebrospinal dural defects, but also for depression scar correction, hemifacial atrophy correction, nipple reconstruction, reconstructive plastic surgery for lip augmentation, and cosmetic surgery.
  • the acellular dermis must selectively remove only cellular antigens that are the target of an immune response while maintaining various structural proteins and components without damaging the three-dimensional structure of the dermal layer within the skin tissue.
  • acellular dermis must have appropriate elasticity and critical load so that it can remain stable despite movement of the applied treatment area while being applied to damaged tissue or damaged skin to restore the damaged area.
  • Acellular dermis must be a material that does not damage normal tissues around the treatment area and must be easy to operate.
  • the acellular dermis may be used interchangeably with acellular dermal tissue transplant, acellular dermal tissue, decellularized dermis, decellularized dermal tissue, or acellular dermal tissue.
  • the term “decellularization” is a new method of producing an artificial scaffold by removing cells from an entire organ while maintaining the original structure of the intended transplant tissue or organ.
  • cellular components are removed from the tissue, but the extracellular matrix and some growth factor proteins are preserved. Therefore, various extracellular matrix components, including collagen, fibronectin, and elastin, preserved in decellularized tissue can enhance the survival, proliferation, and differentiation of cultured cells by providing a three-dimensional microenvironment similar to that in intact tissue. there is.
  • decellularization is not limited thereto, but may be performed by supercritical fluid extraction without surfactant treatment.
  • the term "supercritical fluid extraction” or “supercritical extraction” refers to a fluid having an intermediate character between gas and liquid that exists above the critical point, i.e., critical temperature and critical pressure. This is a method of separating substances using a critical fluid.
  • the supercritical fluid extraction is based on the solvent extraction principle in which the soluble components contained in the raw material are dissolved into the supercritical fluid due to the difference in solubility between the extraction raw material and the supercritical fluid, and the supercritical solute molecules contained in the raw material are from a high-density condensed phase to a low-density expanded phase. It is a complex use of the principle of distillation, which is an evaporation phenomenon that transitions to a fluid.
  • supercritical fluid refers to something that is in a gaseous state under normal conditions but is a fluid above a critical temperature and critical pressure.
  • Supercritical fluids suitable for use in the present invention are not particularly limited, but include, for example, carbon dioxide, nitrogen, nitrous oxide, methane, ethylene, propane, and propylene.
  • carbon dioxide with a critical temperature of 31°C and a critical pressure of 72.8 atm can be used.
  • decellularization can be performed by adding a 'co-solvent' in addition to the supercritical fluid during supercritical fluid extraction.
  • the co-solvent may be added for the purpose of increasing the extractability and solubility of the supercritical fluid, but is not limited to this, and ethanol, methanol, petroleum ether, acetonitrile, hexane, etc. may be used as the co-solvent.
  • the co-solvent may preferably be ethanol.
  • the decellularized dermal tissue of the present invention may be derived from skin tissue isolated from an individual.
  • the object may be an individual belonging to the same or different species as the object to which the dermal tissue is to be transplanted, and specifically, human, mouse, rat, rat, monkey, chimpanzee, orangutan, horse, cow, pig, cat, dog, and rabbit. It may be a mammal including, but is not limited to.
  • the acellular dermal tissue of the present invention has more than 90%, more than 91%, more than 92%, more than 93%, more than 94% of cells compared to the original tissue isolated from the above object, that is, compared to tissue that has not been decellularized. , 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% may be removed.
  • critical load refers to the limit load at which a structure or member undergoes a state such as failure or excessive deformation.
  • critical load refers to the load at the starting point where deformation or cracking of the sample piece occurs. This is the maximum stress until deformation or cracking of the specimen occurs due to the critical load, meaning the maximum load until rupture divided by the original cross-sectional area of the specimen.
  • the greater the critical load the greater the force required to fracture the support, which can also mean that the dermal tissue can maintain its shape well not only when applied to damaged skin or damaged tissue, but also during distribution and storage.
  • the critical load measured in the present invention can be measured using a universal tensile machine.
  • the critical load of acellular dermal tissue may be a wet critical load measured under wet state conditions, that is, while wet in sterilized distilled water, but is not limited thereto.
  • the decellularized dermal tissue may have a critical load of 11 to 19 N under wet conditions, based on a size of 1 ⁇ 1 cm 2 of the dermal tissue sample.
  • the RTU (Ready-To-Use) type dermal tissue sample that was not freeze-dried was 11.0 N, 11.1 N, 11.2 N, 11.3 N, 11.4 N, 11.5 N, 11.6 N, 11.7 N, It may have a critical load of 11.8 N, 11.9 N, or 12.0 N, but is not limited thereto.
  • the critical load measurement is based on the size of the dermal tissue sample of 1 ⁇ 1 cm 2 .
  • the freeze-dried FD (Freeze-Drying) type dermal tissue sample has a weight of 16.0 to 19.0 N, 16.5 to 19.0 N, 17.0 to 19.0 N, 17.5 to 19.0 N, 18.0 to 19.0 N, 18.1 It may have a critical load of N, 18.2 N, 18.3 N, 18.4 N, 18.5 N, 18.6 N, 18.7 N, and 18.8 N, but is not limited thereto.
  • the critical load measurement is based on the size of the dermal tissue sample of 1 ⁇ 1 cm 2 .
  • Young's modulus used in this specification, also referred to as 'elastic modulus' or 'elastic modulus', refers to the ratio of the pressure (stress) of an object to the deformation of the object. Young's modulus is an elastic modulus that indicates the degree to which an object is deformed when pressure is applied.
  • the basic principle of measuring Young's modulus is that an object undergoes elastic deformation when compressed or expanded and returns to its original shape when the load is removed. For example, more deformation occurs in a flexible object compared to a stiff object, and a high Young's modulus value means that it is inelastic or stiff.
  • the Young's modulus measured in the present invention can be measured using a universal tensile machine. Additionally, in the present invention, the Young's modulus of dermal tissue is not limited thereto, but can be measured under wet conditions.
  • the decellularized dermal tissue may have a Young's modulus of 0.5 to 1.2 MPa under wet conditions, based on a size of 1 ⁇ 1 cm 2 of the dermal tissue sample.
  • the RTU (Ready-To-Use) type dermal tissue sample that was not freeze-dried was 0.50 MPa, 0.51 MPa, 0.52 MPa, 0.53 MPa, 0.54 MPa, 0.55 MPa, 0.56 MPa, 0.57 MPa, It may have a Young's modulus of 0.58 MPa, 0.59 MPa, or 0.60 MPa, but is not limited thereto. At this time, Young's modulus measurement is based on the size of the dermal tissue sample, which is 1 ⁇ 1 cm 2 .
  • the freeze-dried FD (Freeze-Drying) type dermal tissue sample is 1.00 MPa, 1.01 MPa, 1.02 MPa, 1.03 MPa, 1.04 MPa, 1.05 MPa, 1.06 MPa, 1.07 MPa, 1.08 MPa.
  • acellular dermal tissue according to the present invention is not limited thereto, but may have any one characteristic selected from the following group based on dry weight:
  • DNA residual amount is 80 to 110 ng/mg
  • Elastin content between 13 and 19 ⁇ g/mg.
  • the dermal tissue may contain a residual amount of DNA of 110 ng/mg or less based on dry weight.
  • the dermal tissue may contain a collagen content of 400 ⁇ g/mg or more based on dry weight.
  • the dermal tissue may contain an elastin content of 13 ⁇ g/mg or more based on dry weight.
  • elastin content Preferably 13.0 to 19.0 ⁇ g/mg, 13.1 to 18.9 ⁇ g/mg, 13.2 to 18.8 ⁇ g/mg, 13.3 to 18.7 ⁇ g/mg, 13.4 to 18.6 ⁇ g/mg, 13.5 to 18.5 ⁇ g/mg, 13.6 to 18.4 ⁇ g/ mg, 13.7 to 18.3 ⁇ g/mg, 13.8 to 18.2 ⁇ g/mg, or 13.9 to 18.1 ⁇ g/mg, but is not limited thereto.
  • acellular dermal tissue according to the present invention is not limited thereto, but may have any one characteristic selected from the following group compared to the original tissue:
  • DNA remaining amount is 5 to 8%
  • Young's modulus is 80 to 200%.
  • the dermal tissue may contain a residual amount of DNA of 8% or less compared to the original tissue, that is, compared to the dermal tissue before decellularization or without decellularization.
  • 5 It may contain from 8%, 5.1 to 7.8%, 5.2 to 7.6%, 5.3 to 7.6%, 5.4 to 7.4%, 5.5 to 7.4%, 5.6 to 7.2%, 5.7 to 7.0%, or 5.8 to 6.8%, It is not limited to this.
  • the dermal tissue may have had more than 93% of its cells removed compared to the original tissue.
  • 93 to 98%, 94 to 98%, 95 to 98%, 96 to 98%, or 97 to 98% may be removed, but is not limited thereto.
  • the dermal tissue according to the present invention may have extracellular matrix components, such as collagen and elastin, maintained at a predetermined content compared to the original tissue.
  • the dermal tissue may contain 55% or more of collagen content compared to the original tissue. Preferably, it may contain 55 to 99%, 56 to 98%, 57 to 97%, or 58 to 96%, but is not limited thereto.
  • the dermal tissue may contain 65% or more of elastin content compared to the original tissue. Preferably, it may contain 65 to 95%, 66 to 94%, 67 to 93%, 68 to 92%, 69 to 91%, or 70 to 90%, but is not limited thereto.
  • the dermal tissue may have a critical load of 90 to 165% of the original tissue, but is not limited thereto.
  • the dermal tissue may have a Young's modulus of 80 to 200% compared to the original tissue, but is not limited thereto.
  • acellular dermal tissue according to the present invention is not limited thereto, but may have any one characteristic selected from the following group compared to the original tissue:
  • Adiponectin content is 22 to 44%
  • Apolipoprotein A1 content is 84 to 94%
  • Angiogenin content is 19 to 38%
  • Angiopoietin-2 content 90 to 99%
  • Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) content is 73. to 99%;
  • Complement component C5/C5a content is 9 to 19%
  • CD30 content is 59 to 99%
  • CD40 ligand content is 6 to 28%
  • CD26 content is 2 to 5%
  • Emprin content is 36 to 44%
  • CD105 content is 41 to 99%
  • Fas ligand content is 2 to 45%
  • FGF-2 content is 15 to 64%
  • FGF19 content is 56 to 98%
  • IFN- ⁇ content is 63 to 99%
  • IL-1A(alpha) content is 65 to 99%
  • IL-1RA(alpha) content is 12 to 43%
  • IL-17 content is 82 to 99%
  • Kallikrein (KLK) 3 content is 92 to 99%
  • MIF Macrophage Migration Inhibitory Factor
  • MMP Microx Metalloproteinase Protein 9 content is 83 to 99%
  • Pentracin (PTX) 3 content is 44 to 91%
  • Retinol binding protein (RBP) 4 content is 8 to 36%
  • VDBP Vitamin D binding protein
  • CD31 content is 67 to 99%.
  • the dermal tissue does not include a surfactant.
  • a surfactant In the case of dermal tissue decellularized by conventional surfactant treatment, there were problems such as denaturation of proteins such as collagen and destruction of growth factors due to surfactant treatment. In addition, it was not easy to remove the remaining surfactant, and there was a problem that it could be toxic if it was not completely removed.
  • the mechanical properties such as critical load and elasticity of the dermal tissue are weakened due to the surfactant, and if the surfactant remains in the dermal tissue, there is a difficulty in causing transplant rejection due to toxic substances.
  • the decellularized dermal tissue obtained according to the supercritical fluid process according to the present invention is decellularized to the same level as the dermal tissue decellularized by treatment with a conventional surfactant, and the histological shape and mechanical properties are maintained. It has characteristics.
  • acellular dermal tissue obtained through the supercritical fluid process has the advantage of significantly superior preservation of extracellular matrix (ECM), such as collagen and elastin, within the dermal tissue compared to dermal tissue treated with surfactant.
  • ECM extracellular matrix
  • the acellular dermal tissue according to the present invention can be used as a transplant material by being decellularized without loss of extracellular matrix while maintaining histological shape and mechanical properties.
  • the acellular dermal tissue transplant according to the present invention can be manufactured by a manufacturing method including the step of extracting dermal tissue isolated from an individual with a supercritical fluid.
  • the supercritical fluid can produce decellularized dermal tissue by extracting and decellularizing lipid components, specifically phospholipid components, the main component of the cell membrane, in dermal tissue isolated from an individual based on solubility.
  • the supercritical fluid is carbon dioxide gas, ammonia gas, nitrogen gas, nitrogen monoxide (NO) gas, nitrogen dioxide (NO 2 ) gas, nitrous oxide (N 2 O) gas, sulfur dioxide gas, hydrogen gas, water vapor, saturated hydrocarbons, and unsaturated hydrocarbons. It may be selected from the group consisting of aromatic compounds, and mixed gases thereof. Specifically, it may be carbon dioxide gas, but the type is not limited thereto as long as it is a supercritical fluid that can efficiently manufacture dermal tissue by removing most of the cells of the dermal tissue while maintaining the structural shape as well as the mechanical properties of the dermal tissue. .
  • carbon dioxide When carbon dioxide gas is used as the supercritical fluid, carbon dioxide has a low critical temperature (31°C) and critical pressure (73 bar), so it can be easily adjusted to supercritical conditions. It exists widely in nature, is colorless, odorless, and is human body. It has the advantage of being harmless and chemically stable.
  • the supercritical extraction step is performed under pressure conditions of 0 to 1000 bar, 30 to 900 bar, 60 to 800 bar, 90 to 700 bar, 120 to 600 bar, 150 to 500 bar, or 200 to 400 bar. It can be done.
  • the pressure of the supercritical extraction step is not limited to this, but is 0 bar or more, 50 bar or more, 100 bar or more, 150 bar or more, 200 bar or more, 250 bar or more, 300 bar or more, 350 bar or more, 400 bar or more. It may be above 450 bar, above 500 bar, above 550 bar, above 600 bar, above 650 bar, above 700 bar, above 750 bar, above 800 bar, above 850 bar, above 900 bar or above 950 bar.
  • the pressure of the supercritical extraction step is not limited to this, but is 1000 bar or less, 950 bar or less, 900 bar or less, 850 bar or less, 800 bar or less, 750 bar or less, 700 bar or less, 650 bar or less, 600 bar or less. , 550 bar or less, 500 bar or less, 450 bar or less, 400 bar or less, 350 bar or less, 300 bar or less, 250 bar or less, 200 bar or less, 150 bar or less, 100 bar or less, or 50 bar or less.
  • the pressure conditions of the supercritical extraction step are not limited to the range as long as they can efficiently produce dermal tissue by removing most of the cells of the dermal tissue while preserving the mechanical properties of the dermal tissue and the structural form of the tissue. .
  • a co-solvent may be further included in addition to the supercritical fluid.
  • the co-solvent may be one or more solvents selected from the group consisting of ethanol, water, methanol, hexane, petroleum ether, acetonitrile, acetone, ethyl acetate, and methylene chloride.
  • ethanol may be further included as a co-solvent.
  • the co-solvent is added for the purpose of increasing the extraction ability and solubility of the supercritical fluid, extracting lipids in the separated dermal tissue, specifically phospholipids of the cell membrane, and removing most of the cells of the dermal tissue, but also removing the mechanical properties of the dermal tissue and
  • the type is not particularly limited as long as the structural form of the tissue is preserved.
  • the supercritical extraction step is not limited thereto, but is performed at 31°C to 40°C, 31°C to 39°C, 32°C to 38°C, 33°C to 37°C, 34°C to 36°C, or 35°C. It can be performed under temperature conditions.
  • the supercritical extraction step is not limited thereto, but may be performed for less than 3 hours. Preferably, it may be performed for 60 minutes to 180 minutes, 70 minutes to 170 minutes, 80 minutes to 160 minutes, 90 minutes to 150 minutes, 100 minutes to 140 minutes, 110 minutes to 130 minutes, or 120 minutes. It is not limited.
  • the acellular dermal tissue according to the present invention is not limited thereto, but may be prepared including the step of separating the epidermal layer and the dermal layer before extracting with the supercritical fluid.
  • Separation of the epidermal layer and dermal layer can be performed using methods known in the art. In general, separation of the epidermal layer and the dermal layer can be performed using various proteolytic enzymes, such as dispase, termolysin, trypsin, etc.
  • the epidermal layer and dermal layer can be separated by changing the ionic strength of the solution. Specifically, the epidermal layer and the dermal layer can be separated by treatment with a 1 M or more sodium chloride (NaCl) solution or a 20 mM EDTA solution at 37°C for 14 to 32 hours.
  • NaCl sodium chloride
  • the separation of the epidermal layer and the dermal layer is not limited thereto, but may be performed by treating 1M NaCl for 24 hours under a temperature condition of 37°C.
  • acellular dermal tissue according to the present invention is not limited thereto, but may be prepared by further comprising any one of the following steps after the step of extracting with the supercritical fluid:
  • the decellularized dermal tissue was washed with phosphate buffered saline (PBS) at room temperature for 16 hours to remove residual solution and impurities.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the dermal tissue obtained after the supercritical fluid extraction can be preserved until use through freeze-drying.
  • cryoprotectant When freeze-drying, a cryoprotectant may be additionally included, but is not limited thereto. Cryoprotectants can prevent physical and chemical damage to dermal tissue, including preventing structural changes in dermal tissue.
  • the cryoprotectant may be any cryoprotectant known in the art.
  • Exemplary cryoprotectants can be sugars and corresponding sugar alcohols. Examples of specific sugars and corresponding sugar alcohols include sucrose, maltitol, glucitol, lactitol, and iso-maltulose.
  • currently widely used cryoprotectants include DMSO, dextran, propylene glycol, glycerol, trehalose, polyethylene glycol, and serum albumin.
  • the cryoprotectant is not limited to this, but can be treated so that it can sufficiently penetrate into the dermal tissue before freeze-drying.
  • the tissue treated with the cryoprotectant may be stored under ultra-low temperature freezing conditions of about -70°C or lower, preferably -40°C to -70°C.
  • tissue treated with a cryoprotectant can be stored for more than 4 hours, preferably 4 to 48 hours.
  • the freeze drying is not limited to this, but may be performed for 24 to 48 hours using a freeze dryer.
  • the dermal tissue obtained after supercritical fluid extraction was treated with maltitol for freeze-drying, infiltrated, and stored frozen at a temperature of about -70°C or lower for at least 4 hours. After freezing, it was freeze-dried in a freeze dryer for about 24 to 48 hours and stored until use.
  • the dermal tissue obtained after the supercritical fluid extraction can be sterilized by irradiating radiation.
  • the irradiation range of radiation is not limited thereto, but may be 10 to 30 kGy.
  • the dermal tissue obtained after supercritical fluid extraction was sterilized by irradiating 10 to 30 kGy of gamma rays after packaging was completed.
  • the acellular dermal tissue according to the present invention is decellularized without surfactant treatment, maintaining mechanical properties such as critical load and elasticity, and at the same time, there is no toxicity due to residual surfactant. Therefore, the dermal tissue of the present invention obtained through an optimized supercritical fluid treatment process is free of toxicity and transplant rejection, and is used for serious burns and trauma, correction of depressed scars, correction of hemifacial atrophy, nipple reconstruction, and lip augmentation reconstruction. It can be useful in plastic surgery and cosmetic surgery.
  • Another aspect of the present invention includes the steps of: a) separating skin tissue separated from an individual into an epidermal layer and a dermal layer; b) extracting the separated dermis layer with a supercritical fluid; and c) washing the dermal layer extracted with the supercritical fluid with a phosphate buffer solution.
  • Step a) is a step of separating the skin tissue separated from the subject into an epidermal layer and a dermal layer.
  • separation of the epidermal layer and the dermal layer can be performed through methods known in the art. In general, separation of the epidermal layer and the dermal layer can be performed using various proteolytic enzymes, such as dispase, termolysin, trypsin, etc. Additionally, the epidermal layer and dermal layer can be separated by changing the ionic strength of the solution. Specifically, the epidermal layer and the dermal layer can be separated by treatment with a 1 M or more sodium chloride (NaCl) solution or a 20 mM EDTA solution at 37°C for 14 to 32 hours.
  • NaCl sodium chloride
  • Step b) is a step of extracting the dermal layer from which the epidermal layer is separated with a supercritical fluid.
  • cell components other than the extracellular matrix for example, phospholipid components, which are the main component of the cell membrane that induces an immune response, can be decellularized by extracting them with a supercritical fluid from the dermal layer.
  • the supercritical fluid is not limited thereto, but may further include a co-solvent.
  • the co-solvent is added for the purpose of increasing the extraction ability and solubility of the supercritical fluid, and can remove most of the cells of the dermal tissue by extracting other cell components except the extracellular matrix from the separated dermal layer.
  • the type of the co-solvent is not particularly limited as long as it preserves the mechanical properties of the dermal tissue and the structural form of the tissue, for example, ethanol, water, methanol, hexane, petroleum ether, acetonitrile, acetone, ethyl acetate and methylene. It may be one or more solvents selected from the group consisting of chloride. Preferably, ethanol may be further included as a co-solvent.
  • Step c) is a step of washing the dermal layer extracted with the supercritical fluid with a phosphate buffer. By washing with the phosphate buffer, the residual solution and impurities present in the dermal tissue after the extraction of the supercritical fluid can be washed.
  • washed dermal tissue may be additionally subjected to any one of freeze-drying, sterilization, and sealed packaging, but is not limited thereto.
  • a supercritical fluid extraction process was performed to decellularize skin tissue.
  • the fat layer was removed from the donated patient's human skin tissue (IRB No. 20201305, Asan Medical Center, Seoul). After removing the fat layer, the epidermis was removed by treatment with 1M NaCl (Sigma Aldrich, Cat No. S9888) for 24 hours at a temperature of 37°C. After removing the epidermis, the separated dermal layer was washed with sterilized PBS (biowest, Cat No. L0615-500) for 1 hour.
  • 1M NaCl Sigma Aldrich, Cat No. S9888
  • the obtained dermal tissue was put into the extraction tank of a supercritical extraction system (SES), and the supercritical fluid carbon dioxide and co-solvent ethanol were injected into the extraction tank together. Thereafter, the dermal tissue was decellularized by supercritical treatment for 1 to 3 hours under a pressure condition of 72.8 bar and a temperature condition of 31°C.
  • SES supercritical extraction system
  • the decellularized dermal tissue was washed with sterilized PBS at room temperature for 24 hours.
  • the washed RTU (Ready-To-Use) type acellular dermal tissue was sealed and packaged with sterile saline solution.
  • FD (Freeze-Drying) type acellular dermal tissue was treated and penetrated with maltitol and frozen at -80°C for more than 4 hours. Afterwards, it was freeze-dried for 24 hours using a freeze dryer and then sealed and packaged.
  • the packaged acellular dermal tissue was sterilized by gamma sterilization (Greenpia, 15 kGy), and after sterilization, it was stored at room temperature until use.
  • a human dermal ADM sample prepared according to a conventionally known method according to the detailed specifications in Table 1 below was prepared.
  • the RTU type was prepared by double packaging dermal samples including normal saline and sterilizing them.
  • the FD type was prepared by freeze-drying the dermal sample and then double-packing and sterilizing it.
  • FD type acellular dermal samples were hydrated by immersion in normal saline solution for about 100 minutes and the appearance was observed ( Figure 1).
  • H&E staining was performed to analyze the histological form and degree of decellularization of the tissue.
  • the presence or absence of cell nuclei was confirmed through Hematoxylin (blue) and Eosin (red) staining, which are one of the decellularization performance indicators.
  • Hematoxylin which binds to cell DNA, is related to DNA quantification results, so analysis of the degree of decellularization is possible.
  • a native tissue sample that had not been treated with supercritical fluid and did not remove the epidermis was used as a negative control.
  • acellular dermal samples SCR, SCF
  • human dermal ADM samples A, B, C, D, E, F according to the detailed specifications in Table 1 were used as the comparison group.
  • samples A and D were the best in terms of preservation of the internal structure of the tissue.
  • the degree of preservation of the internal structure of the tissue was excellent in the following order: A>SCR (supercritical fluid process sample)>C>B.
  • the DNA content in the decellularized dermal sample was measured.
  • a negative control native tissue without supercritical fluid treatment was used, and as a positive control, an acellular dermal tissue sample of Table 1 prepared according to a conventional method was used.
  • DNA content measurements were performed on acellular dermal samples of RTU (Ready-To-Use) type and FD (Feeze-Drying) type.
  • gDNA of each dermal tissue was extracted from each sample using the Dneasy Blood & tissue kit (QIAGEN, Cat#69506). Afterwards, electrophoresis was performed using a 1% agarose gel ( Figure 3). During electrophoresis, ExcelBandTM 1KB Plus (0.1-10 kb) DNA Ladder (SMOBIO, Cat#DM3200) was used as a size marker.
  • the residual dsDNA content of acellular dermal samples was used using the Qubit dsDNA BR assay kit (Thermo, Cat#Q32853), which employs a method of measuring the fluorescence intensity by adding a fluorescent dye that directly binds to a specific region of dsDNA to the extracted DNA. was quantitatively analyzed ( Figures 4a and 4b). At this time, all samples were freeze-dried and analyzed based on solid mass.
  • the DNA quantitative value was measured to be similar to the sum of fragmented DNA in electrophoresis. That is, similar to the electrophoresis results, the amount of residual dsDNA in decellularized dermal samples (SCR, SCF) following the supercritical fluid treatment process for both types of RTU and FD was compared to that in acellular dermal samples (A, B) prepared according to the conventional method. , C, D, E, F) was confirmed to be low.
  • acellular dermal tissue samples (A, B, C, D, E, F) prepared by conventional chemical or enzymatic treatment processes were used as positive controls, and the test was performed on acellular dermal tissue samples of RTU type and FD type. This was performed on dermal samples.
  • the immunogenic protein MHC1 a cell membrane protein, was confirmed to be negative in all acellular dermal samples.
  • Example 1 The degree of preservation of extracellular matrix components, such as collagen, elastin, and sGAG, in the decellularized dermal tissue (SCR, SCF) prepared in Example 1 was confirmed.
  • the collagen content was measured using the Sircol insoluble Collagen assay kit (Biocolor, Cat#S2000). At this time, native tissue without supercritical fluid treatment was used as a negative control. Dermal tissue samples (A, B, C, D, E, F) that had been subjected to chemical or enzymatic treatment using surfactants were used as positive controls. Each sample was freeze-dried and approximately 5 mg was used to measure the collagen content.
  • the collagen preservation rate in the dermal tissue decellularized according to the supercritical fluid process was the best in both types of samples, RTU and FD, compared to the acellular dermal tissue sample prepared according to the conventional method based on the original tissue.
  • the collagen content was confirmed to be 418 ⁇ g/mg for the RTU type sample and 677 ⁇ g/mg for the FD type sample based on the dry weight of the sample. This was at the level of 58.8% and 95.2%, respectively, compared to the original tissue, and it was found that protein loss in the dermal tissue decellularized according to the supercritical fluid process was minimized ( Figures 6a and 6b).
  • the collagen content in dermal tissue decellularized by conventional chemical or enzymatic treatment processes was 16 ⁇ g/mg, 23 ⁇ g/mg for RTU type A, B, and C samples, respectively, based on the dry weight of the sample. It was found to be 164 ⁇ g/mg, and for FD type D, E, and F samples, it was confirmed to be 317 ⁇ g/mg, 370 ⁇ g/mg, and 375 ⁇ g/mg, respectively. Compared to the original tissue, this was only 2.25%, 3.23%, and 23.1% for RTU type A, B, and C samples, respectively, and only 44.6%, 52.0%, and 52.7% for FD type D, E, and F samples, respectively. In other words, it was found that in the case of decellularization by conventional chemical or enzymatic treatment processes, even though the decellularization effect was excellent, protein loss in the dermal tissue occurred significantly.
  • the dermal tissue decellularized by the supercritical fluid process maintained its histological shape and effectively decellularized the tissue while minimizing protein loss. Accordingly, it was found that it has excellent effects that can be used as a transplant material.
  • elastin analysis was performed using a Fastin Elastin assay kit (Biocolor, Cat#F2000). At this time, native tissue without supercritical fluid treatment was used as a negative control. Dermal tissue samples (A, B, C, D, E, F) that had been subjected to chemical or enzymatic treatment using surfactants were used as positive controls. Each sample was freeze-dried and approximately 5 mg was used to measure the elastin content.
  • the elastin retention rate in the dermal tissue decellularized according to the supercritical fluid process was maintained at an equal or higher level in both RTU and FD products compared to the acellular dermal tissue sample manufactured according to the conventional method based on the original tissue. did. Specifically, the elastin content was confirmed to be 18 ⁇ g/mg for the RTU type sample and 14 ⁇ g/mg for the FD type sample based on the dry weight of the sample. This was at a level of 90% and 70%, respectively, compared to the original tissue, and it was found that elastin loss did not occur in the dermal tissue decellularized according to the supercritical fluid process (FIGS. 7A and 7B).
  • the elastin content in dermal tissue decellularized by conventional chemical or enzymatic treatment processes was 10 ⁇ g/mg, 19 ⁇ g/mg for RTU type A, B, and C samples, respectively, based on the dry weight of the sample. It was found to be 9 ⁇ g/mg, and for FD type D, E, and F samples, it was found to be 15 ⁇ g/mg, 11 ⁇ g/mg, and 8 ⁇ g/mg, respectively.
  • the dermal tissue decellularized by the supercritical fluid process maintains its histological shape and minimizes elastin loss, making it excellent for use as a transplant material.
  • proteins for each sample were extracted, separated, and purified from acellular dermal tissue samples using RIPA lysis buffer. Afterwards, protein quantification was performed using the Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo, Cat#23225) employing the BCA method. 100 mg of protein per sample was loaded equally onto each array membrane [Proteome Profiler Array, Human XL Cytokine Array Kit (ARY022B), R&D Systems USA] and analyzed.
  • the analysis results were obtained by measuring the dot intensity value using ImageJ software, counting the number of cytokines with an arbitrary intensity of 20 or more, and organizing them in Tables 3 and 4 below.
  • Cytokines Mean spot pixel intensity value for each sample Cytokines Mean spot pixel intensity value for each sample Native SCR SCF Native SCR SCF Acrp30 205.2 44.8 89.1 IL18 0.7 2.9 4.5 ApoA1 104.6 87.0 97.5 IL19 0.0 0.0 2.0 Angiogenin 190.4 36.1 71.4 IL22 0.0 0.0 2.6 Ang1 0.8 0.1 3.8 IL23 0.0 0.0 2.0 Ang2 8.6 7.7 14.0 IL24 0.0 0.0 2.1 BAFF 0.3 0.4 3.5 IL27 0.1 0.0 2.4 BDNF 6.1 4.4 10.9 IL31 0.1 0.6 2.4 C5/C5a 95.4 18.2 8.9 IL32 0.6 0.5 3.0 CD14 1.6 3.4 4.4 IL33 0.1 0.8 2.5 CD30 8.1 4.9 12.0 IL34 0.0 1.5 2.9 CD40L 22.7 1.3 6.5 CXCL10 0.1 1.6 3.5 CHI3L1 86.1 1.1 5.8 CXCL11 1.4 3.
  • the growth factor retention rate was equivalent to that of the acellular dermal tissue D sample prepared according to the conventional method.
  • the growth factor retention rate of acellular dermal sample (SCR) according to the supercritical fluid process of the present invention was the best.
  • the cytotoxicity of the decellularized dermal tissue (SCR, SCF) prepared in Example 1 was evaluated. Specifically, cytotoxicity evaluation was performed using the L929 mouse fibroblast cell line known in the art, with a cell count of 1 ⁇ 10 4 cells/well. In addition, cytotoxicity evaluation was performed according to the tissue elution method (applied to the KCL certified testing laboratory protocol) in which the tissue was immersed in a cell culture medium at 37°C for 24 hours and the substances inside the tissue were eluted into the culture medium. At this time, if the survival rate decreased to less than 70% of the blank test solution according to the above-mentioned official testing agency standards, it was evaluated as potentially cytotoxic.
  • acellular dermal tissue samples (A, B, C, D, E, F) prepared by conventional chemical or enzymatic treatment processes were compared to acellular dermal tissue samples (SCR) prepared by the supercritical fluid process of the present invention.
  • SCR acellular dermal tissue samples
  • the dermal tissue decellularized by the supercritical fluid process has an excellent effect that can be used as a transplant material without cytotoxicity while maintaining its histological shape.
  • the critical load was 11.6 N for dermal tissue (SCR) decellularized according to the RTU type supercritical fluid process, 9.8 N for acellular dermal tissue sample A, 8.9 N for sample B, and sample B prepared according to the conventional method. Unlike C 6.8 N, it was confirmed that the critical load was maintained almost perfectly compared to the original structure.
  • the critical load is 18.8 N, which is about 1.6 times higher than the original tissue of 11.6 N, and the acellular dermal tissue sample D prepared according to the conventional method It was confirmed that the critical load level was equal to or higher than 15.6 N, Sample E 8.5 N, and Sample F 17.4 N (FIGS. 10a and 10b).
  • the Young's modulus of the RTU type SCR sample according to the present invention was also measured to be 0.6 MPa, which is the same as the original tissue sample, confirming that the elasticity is almost perfectly maintained compared to the original tissue sample.
  • the Young's modulus is 1.1 MPa, which is about 1.8 times higher than the Young's modulus of 0.6 MPa for the original tissue sample, and the acellular dermal tissue sample D 1.0 MPa, sample E 0.2 MPa and It was confirmed that the Young's modulus level was equal or higher compared to Sample F of 1.1 MPa (FIGS. 11a and 11b).

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Abstract

본 발명은 초임계 유체 추출 공정을 이용하여 제조된 탈세포화된 무세포 진피조직에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 초임계 유체 추출 공정을 이용하여 세포외기질 보존 정도 개선 및 임계하중, 탄성 복원력 등 최적화된 기계적 물성을 갖는 무세포 진피조직에 관한 것이다. 본 발명에 따른 무세포 진피조직은 계면활성제 처리 없이 탈세포화되어 기계적 물성이 유지될 뿐 아니라, 잔존 계면활성제에 따른 독성이 존재하지 않고, 이식거부반응을 최소화하여 피부조직 손상 환자 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

초임계 유체 추출 공정을 이용하여 제조된 무세포 진피조직 및 이의 용도
본 발명은 초임계 유체 추출 공정을 이용하여 제조된 무세포 진피조직에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 초임계 유체 추출 공정을 이용하여 세포외기질 보존 정도 개선 및 임계하중, 탄성 복원력 등 최적화된 기계적 물성을 갖는 무세포 진피조직에 관한 것이다.
인체의 피부조직은 가장 바깥쪽을 이루는 표피층과 그 아래층의 진피층, 그리고 피하조직으로 이루어진다. 이 중 표피층은 표피층과 진피층이 단단하게 결합할 수 있도록 하는 기저막으로부터 여러 층으로 분화된 상피세포와 그 밖에 멜라닌세포, 면역세포로 이루어진다. 표피층 아래의 진피층은 주로 섬유아세포와 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular matrix)로 이루어진다.
피부조직 또는 내부 장기조직은 화상, 외상, 궤양 등으로 인해 조직의 일부가 손상될 수 있는데, 이 경우 손상된 조직의 치유를 목적으로 하거나 또는 재건성형을 목적으로 본인 피부조직 또는 내부 장기조직으로부터 이식하는 방법을 사용한다. 이러한 경우에는 이식받는 자가 자신의 피부조직 혹은 장기조직을 추가적으로 적출하는 수술적 부담이 있어 이식받는 사람의 건강상태가 양호하지 않은 경우에는 위험할 수가 있다. 그 외에 이종조직이나 합성 생체재료(Synthetic biomaterial)를 사용하여 이식하는 방법이 있는데, 이 경우에는 면역거부 반응이 발생하여 장기간 이식시 염증반응을 초래하여 재수술하는 결과를 초래할 수도 있다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 공여자로부터 적출된 피부조직으로부터 이식용 무세포 진피층을 제조하는 방법이 한국등록특허 제10-0469661호 및 제10-0791502호에 개시되어 있으나, 이러한 방법은 계면활성제 처리 공정을 따르고 있다. 계면활성제 처리에 의해 콜라겐과 같은 단백질의 변성, 성장인자의 파괴 등의 문제가 야기될 수 있다. 또한, 구조적 형태, 조직학적 형태의 유지가 어렵고, 임계하중, 탄력도와 같은 기계적 물성이 약화될 수 있다. 더욱이, 잔존 계면활성제의 제거가 쉽지 않고, 이의 제거가 완전히 되지 않는 경우 독성이 있을 수 있다.
또한, 무세포 진피를 제조하기 위해 면역원성 세포 제거 방법으로 트립신 또는 디스파제 같은 단백질 분해 효소를 사용하거나, 반복적인 동결-해동, NaCl과 SDS 처리 방법 등이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 공정으로 만들어진 무세포 진피는 많은 항원 성분을 지니고 있어 수여부에 이식시 면역거부반응을 일으켜 결과적으로 낮은 생착률을 초래하였다(R.J. Walter et.al, Burns, 24: 104-113, 1998).
이에 본 발명자들은 이식거부반응 및 비용적 측면의 문제점을 개선함과 동시에 화학적 처리 방법에 의한 탈세포화로 인해 야기된 기계적 물성 약화 문제점이 개선된 무세포 진피 이식소재를 개발하고자 연구하였다. 그 결과, 계면활성제 처리 없이 최적화된 초임계 유체 처리 공정을 구축하고, 이에 따른 기계적 물성 및 세포외기질 보존 정도가 개선된 무세포 진피조직을 수득함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, 임계하중(Critical load)이 11 내지 19 N이고, 영률(Young's modulus)은 0.5 내지 1.2 MPa인, 무세포 진피조직 이식체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, a) 개체로부터 분리된 피부조직을 표피층 및 진피층으로 분리하는 단계; b) 상기 분리된 진피층을 초임계 유체로 추출하는 단계; 및 c) 초임계 유체로 추출된 진피층을 인산염 완충액으로 세척하는 단계;를 포함하는, 무세포 진피조직 이식체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 무세포 진피조직은 계면활성제 처리 없이 탈세포화되어 임계하중, 탄력도 등과 같은 기계적 물성이 유지되면서, 동시에 잔존 계면활성제에 따른 독성이 존재하지 않으므로, 화상, 외상 등의 피부조직 손상 환자에게 이식하기에 적합하다. 따라서, 최적화된 초임계 유체 처리 공정을 통해 수득한 본 발명의 무세포 진피조직은 독성 및 이식거부반응이 제거되어 피부조직 손상 환자 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 무세포 진피 시료의 외형을 관찰한 사진이다. 여기에서, RTU(Ready-To-Use) 타입은 일반 식염수를 포함하여 진피 시료를 이중 포장 후 멸균하여 준비한 것이다. FD(Feeze-Drying) 타입은 진피 시료를 동결건조 후 이중 포장하여 멸균하여 준비한 것이다. 또한, Native는 표피를 제거하지 않은 미가공 천연 피부조직 시료이며, SCR, SCF, A, B, C, D, E, F는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 진피 시료 크기는 1×1 cm2이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 H&E(Hematoxyline & Eosin) 염색 결과를 나타낸 현미경 사진(100×확대)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 미실시 진피조직(Native), 초임계 유체 추출 공정 후 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF) 및 표 1의 세부사양에 따른 종래 공지된 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직(A, B, C, D, E, F)의 DNA 잔존량을 확인한 1% 아가로스 젤 전기영동 이미지이다. 여기서, SCR, A, B, C는 RTU(Ready-To-Use) 타입의 시료이고, SCF, D, E, F는 FD(Feeze-Drying) 타입의 시료이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 잔존 DNA 정량 분석 결과를 나타낸 도면이다. 이때, 잔존 DNA 정량분석 결과는 무세포 진피조직의 건조 중량을 기준으로 나타낸 것이다. 여기서, Native는 무처리군으로서 원조직을 지시하고, SCR, SCF는 초임계 유체를 처리하여 탈세포한 진피조직 시험군, A, B, C, D, E, F는 표 1의 세부사양에 따른 탈세포한 진피조직 양성 대조군이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 잔존 DNA 정량 분석 결과를 나타낸 도면이다. 이때, 잔존 DNA 정량분석 결과는 표피층을 제거하지 않은 원조직을 기준으로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)에서 면역원성 단백질 MHC1의 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)의 콜라겐 함량 분석 결과를 나타낸 도면이다. 이때, 콜라겐 함량 분석 결과는 무세포 진피조직의 건조 중량을 기준으로 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)의 콜라겐 함량을 원조직 기준으로 정량 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)의 엘라스틴 함량 분석 결과를 나타낸 도면이다. 이때, 엘라스틴 함량 분석 결과는 무세포 진피조직의 건조 중량을 기준으로 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)의 엘라스틴 함량을 원조직 기준으로 정량 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 성장인자 보존 정도를 확인한 사이토카인 어레이 결과를 나타낸 도면이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 성장인자 보존 정도를 확인한 사이토카인 어레이의 스팟 좌표를 나타낸 도면이다.
도 8c 내지 도 8f는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 성장인자 보존 정도를 확인한 사이토카인 어레이 결과를 평균 스팟 픽셀 밀도로 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 임계하중을 만능 인장 시험기(UTM)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 임계하중을 원조직 기준으로 정량 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 영률(Young's moulus) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계 유체 추출 공정 후 수득한 무세포 진피 시료의 영률을 원조직 기준으로 정량 분석하여 나타낸 그래프이다.
무세포 진피조직 이식체
본 발명의 일 측면은, 하기 특징을 갖는 무세포 진피조직 이식체를 제공한다:
상기 무세포 진피조직의 임계하중은 11 내지 19 N이고, 영률(Young's modulus)은 0.5 내지 1.2 MPa이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진피(dermis)"는 콜라겐 단백질로 만들어진 교원섬유가 주요 구성 성분이고, 그 사이에 엘라스틴 단백질로 이루어진 탄성섬유가 그물 모양으로 짜여 있다. 진피는 피부의 대부분을 차지하며, 표피에 영양분을 공급하여 표피를 지지하고, 외부의 손상으로부터 몸을 보호한다. 또한 수분을 저장하는 능력과 체온 조절의 기능이 있으며, 감각에 대한 수용체 역할을 하고, 표피와 상호작용에 의해 피부를 재생하는 기능도 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "무세포 진피(Acellular dermal matrix, ADM)"는 인간 또는 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질로서, 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM) 형태의 생체유래 피부대체재를 의미한다.
상기 무세포 진피는 개체로부터 분리된 피부에서 면역반응을 일으킬 수 있는 세포들을 제거한 생체소재로서, 화상, 교통사고, 궤양 등으로 인한 피부결손 환자에게 이식해 피부를 복원시키는 데 이용될 수 있다. 또한, 인체이식용 피부조직인 무세포 진피는 전층 피부, 비중격, 뇌척수 경막결손창의 재건뿐만 아니라 함몰 반흔 교정, 반안면 위축 교정, 유두 재건, 입술 확대의 재건성형 및 미용성형에도 확대되어 이용될 수 있다.
상기 무세포 진피는 피부조직 내 진피층의 3차원적 구조를 손상시키지 않고, 다양한 구조 단백질 및 성분들을 유지한 상태에서 면역반응의 대상인 세포성 항원만을 선별적으로 제거되어야 한다.
또한, 무세포 진피는 손상 조직 또는 손상 피부에 적용되어 손상 부위를 복원시키는 동안, 적용된 시술 부위의 움직임에도 안정적으로 유지될 수 있도록 적절한 신축성과 임계하중을 가져야 한다. 무세포 진피는 시술 부위 주변 정상 조직이 손상되지 않는 재료이어야 하고 시술 용이성을 가져야 한다.
본 명세서에서 상기 무세포 진피는 무세포 진피조직 이식체, 무세포 진피조직, 탈세포화된 진피, 탈세포화된 진피조직 또는 무세포 진피조직으로 혼용하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "탈세포화(decellularization)"는 목적으로 하는 이식 조직 또는 기관의 원래의 구조를 유지하면서 전체 장기로부터 세포를 제거하여 인공 지지체를 생산하는 새로운 방법이다. 탈세포화 과정에서, 조직으로부터 세포 성분들이 제거되지만, 세포외기질 및 일부 성장인자 단백질들은 보존된다. 따라서, 탈세포화 조직 내 보존된 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 및 엘라스틴을 포함하는 다양한 세포외기질 성분들은 온전한 조직 내와 유사한 삼차원적인 미세환경을 제공함으로써 배양된 세포의 생존, 증식 및 분화를 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 탈세포화는 이에 제한되지는 않으나, 계면활성제 처리 없이, 초임계 유체 추출에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "초임계 유체 추출(supercritical fluid extraction)" 또는 "초임계 추출(supercritical extraction)"은 임계점 즉, 임계 온도 및 임계 압력 이상에 존재하는 기체와 액체의 중간 성격을 갖는 초임계 유체를 사용하여 물질을 분리하는 방법이다. 상기 초임계 유체 추출은 추출 원료와 초임계 유체의 용해도 차이에 의해 원료 중에 함유된 가용 성분이 초임계 유체로 용해되는 용매 추출 원리와 원료 중에 함유된 용질 분자가 고밀도 응축상으로부터 저밀도 팽창상인 초임계 유체로 이행하는 증발 현상인 증류 원리를 복합적으로 이용한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "초임계 유체"는 일반적인 조건에서는 기체 상태이나 임계 온도와 임계 압력 이상에서는 유체인 것을 말한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 초임계 유체로는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 이산화탄소, 질소, 아산화질소, 메탄, 에틸렌, 프로판 및 프로필렌이 있다. 바람직하게는 임계온도가 31℃이고 임계 압력이 72.8기압인 이산화탄소를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 탈세포화는 초임계 유체 추출 시 초임계 유체 이외에 '공용매(co-solvent)'를 첨가할 수 있다. 상기 공용매는 초임계 유체의 추출능 증가 및 용해도 향상 등의 목적으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 에탄올, 메탄올, 석유 에테르, 아세토니트릴, 헥산 등을 공용매로서 사용할 수 있다. 이때, 바람직하게는 공용매는 에탄올 일 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 진피조직은 개체로부터 분리된 피부조직으로부터 유래할 수 있다. 상기 개체는 상기 진피조직을 이식하려는 대상인 개체와 동종 또는 이종에 속하는 개체일 수 있고, 구체적으로 인간, 마우스, 래트, 쥐, 원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 말, 소, 돼지, 고양이, 개, 및 토끼 등을 포함하는 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 무세포 진피조직은 상기 개체로부터 분리된 원조직과 비교, 즉 탈세포화를 수행하지 않은 조직과 비교하여 세포가 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 제거된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "임계하중(Critical load)"은 구조물이나 부재가 파괴 또는 과도한 변형과 같은 상태가 되는 한계 하중을 의미한다. 즉, 인덴터를 통해 하중을 가하여 이루어지는 압입 평가시, 시료편의 변형이나 균열이 발생하는 시작점의 하중을 의미한다. 임계하중에 의해서 시료편의 변형이나 균열이 발생할 때까지의 최대응력으로, 파단(rupture)까지의 최대하중을 시험편의 원래의 단면적으로 나눈 값을 의미한다. 임계하중이 클수록 지지체의 파단까지 큰 힘이 필요함을 의미하며, 이는 진피조직이 손상 피부 또는 손상 조직에 적용될 때는 물론 유통 및 보관 중에도 형태 유지가 잘 될 수 있음을 아울러 의미할 수 있다.
본 발명에서 측정하는 임계하중은 만능 인장 시험기(Universal Tensile Machine)를 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 본 발명에서 무세포 진피조직의 임계하중은 멸균 증류수에 젖어 있는 상태, 즉 습윤 상태의 조건하에서 측정되는 습윤 임계하중일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 탈세포화된 진피조직은 습윤 상태의 조건하에서, 진피조직 시료의 크기가 1×1 cm2를 기준으로 11 내지 19 N의 임계하중을 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 동결건조를 실시하지 않은 RTU(Ready-To-Use) 타입의 진피조직 시료는 11.0 N, 11.1 N, 11.2 N, 11.3 N, 11.4 N, 11.5 N, 11.6 N, 11.7 N, 11.8 N, 11.9 N, 또는 12.0 N의 임계하중을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이때, 임계하중 측정은 진피조직 시료의 크기 1×1 cm2를 기준으로 한다.
또한, 일 구체예에 있어서, 동결건조를 실시한 FD(Freeze-Drying) 타입의 진피조직 시료는 16.0 내지 19.0 N, 16.5 내지 19.0 N, 17.0 내지 19.0 N, 17.5 내지 19.0 N, 18.0 내지 19.0 N, 18.1 N, 18.2 N, 18.3 N, 18.4 N, 18.5 N, 18.6 N, 18.7 N, 18.8 N의 임계하중을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이때, 임계하중 측정은 진피조직 시료의 크기 1×1 cm2를 기준으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "영률(Young's modulus)"은 '탄성률' 또는 '탄성계수'로도 일컬어지며, 물체의 변형에 대한 물체의 압력(응력)의 비율을 의미한다. 영률은 압력을 가할 때, 물체의 변형되는 정도를 나타내는 탄성률로, 영률 측정의 기본 원리는 물체가 압축되거나 확장될 때 탄성 변형을 겪고 하중이 제거되면 원래 모양으로 되돌아가는 성질을 이용한 것이다. 일례로, 뻣뻣한 물체에 비해 유연한 물체에서 더 많은 변형이 발생하게 되며, 영률 값이 높음은 비탄성이거나 뻣뻣함을 의미한다.
본 발명에서 측정하는 영률은 만능 인장 시험기(Universal Tensile Machine)를 사용하여 측정될 수 있다. 또한, 본 발명에서 진피조직의 영률은 이에 제한되지는 않으나, 습윤 조건하에서 측정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탈세포화된 진피조직은 습윤 상태의 조건하에서, 진피조직 시료의 크기가 1×1 cm2를 기준으로 0.5 내지 1.2 MPa의 영률을 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 동결건조를 실시하지 않은 RTU(Ready-To-Use) 타입의 진피조직 시료는 0.50 MPa, 0.51 MPa, 0.52 MPa, 0.53 MPa, 0.54 MPa, 0.55 MPa, 0.56 MPa, 0.57 MPa, 0.58 MPa, 0.59 MPa, 또는 0.60 MPa의 영률을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이때, 영률 측정은 진피조직 시료의 크기 1×1 cm2를 기준으로 한다.
또한, 일 구체예에 있어서, 동결건조를 실시한 FD(Freeze-Drying) 타입의 진피조직 시료는 1.00 MPa, 1.01 MPa, 1.02 MPa, 1.03 MPa, 1.04 MPa, 1.05 MPa, 1.06 MPa, 1.07 MPa, 1.08 MPa, 1.09 MPa, 또는 1.10 MPa의 영률을 가질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이때, 영률 측정은 진피조직 시료의 크기 1×1 cm2를 기준으로 한다.
본 발명에 따른 무세포 진피조직은 이에 제한되지는 않으나, 건조중량을 기준으로 하기 그룹에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가질 수 있다:
DNA 잔존량이 80 내지 110 ng/mg;
콜라겐 함량이 400 내지 700 μg/mg; 및
엘라스틴 함량이 13 내지 19 μg/mg.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 건조중량을 기준으로 DNA 잔존량이 110 ng/mg 이하 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는, 80 내지 110 ng/mg, 81 내지 109 ng/mg, 82 내지 108 ng/mg, 83 내지 107 ng/mg, 84 내지 106 ng/mg, 85 내지 105 ng/mg, 86 내지 104 ng/mg, 또는 87 내지 103 ng/mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 건조중량을 기준으로 콜라겐 함량이 400 μg/mg 이상 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 400 내지 700 μg/mg, 402 내지 698 μg/mg, 404 내지 696 μg/mg, 406 내지 694 μg/mg, 408 내지 692 μg/mg, 410 내지 690 μg/mg, 411 내지 688 μg/mg, 412 내지 686 μg/mg, 413 내지 684 μg/mg, 414 내지 682 μg/mg, 415 내지 680 μg/mg, 416 내지 679 μg/mg, 417 내지 678 μg/mg, 또는 418 내지 677 μg/mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 건조중량을 기준으로 엘라스틴 함량이 13 μg/mg 이상 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 13.0 내지 19.0 μg/mg, 13.1 내지 18.9 μg/mg, 13.2 내지 18.8 μg/mg, 13.3 내지 18.7 μg/mg, 13.4 내지 18.6 μg/mg, 13.5 내지 18.5 μg/mg, 13.6 내지 18.4 μg/mg, 13.7 내지 18.3 μg/mg, 13.8 내지 18.2 μg/mg, 또는 13.9 내지 18.1 μg/mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 무세포 진피조직은 이에 제한되지는 않으나, 원조직 대비 하기 그룹에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가질 수 있다:
DNA 잔존량이 5 내지 8%;
콜라겐 함량이 55 내지 99%;
엘라스틴 함량이 65 내지 95%;
임계하중은 90 내지 165%; 및
영률(Young's modulus)은 80 내지 200%.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 원조직 대비, 즉 탈세포화 전 또는 탈세포화를 수행하지 않은 진피조직 대비 DNA 잔존량이 8% 이하 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는, 5 내지 8%, 5.1 내지 7.8%, 5.2 내지 7.6%, 5.3 내지 7.6%, 5.4 내지 7.4%, 5.5 내지 7.4%, 5.6 내지 7.2%, 5.7 내지 7.0%, 또는 5.8 내지 6.8% 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
즉, 상기 진피조직은 원조직 대비 세포가 93% 이상 제거된 것일 수 있다. 바람직하게는, 93 내지 98%, 94 내지 98%, 95 내지 98%, 96 내지 98%, 또는 97 내지 98% 제거된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 진피조직은 세포외기질 성분, 예를 들어 콜라겐, 엘라스틴 등이 원조직 대비 소정의 함량으로 유지되어 있는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 원조직 대비, 콜라겐 함량이 55% 이상 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 55 내지 99%, 56 내지 98%, 57 내지 97%, 또는 58 내지 96% 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 원조직 대비, 엘라스틴 함량이 65% 이상 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 65 내지 95%, 66 내지 94%, 67 내지 93%, 68 내지 92%, 69 내지 91%, 또는 70 내지 90% 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 원조직 대비, 임계하중이 90 내지 165% 수준을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 진피조직은 원조직 대비, 영률(Young's modulus)이 80 내지 200% 수준을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 무세포 진피조직은 이에 제한되지는 않으나, 원조직 대비 하기 그룹에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가질 수 있다:
아디포넥틴 함량이 22 내지 44%;
아포리포단백질 A1 함량이 84 내지 94%;
안지오제닌 함량이 19 내지 38%;
안지오포이에틴-2 함량이 90 내지 99%;
뇌유래 신경영양인자(BDNF) 함량이 73 내지 99%;
보체 성분 C5/C5a 함량이 9 내지 19%;
CD30 함량이 59 내지 99%;
CD40 리간드 함량이 6 내지 28%;
CD26 함량이 2 내지 5%;
엠프린(Emmprin) 함량이 36 내지 44%;
CD105 함량이 41 내지 99%;
Fas 리간드 함량이 2 내지 45%;
FGF-2 함량이 15 내지 64%;
FGF19 함량이 56 내지 98%;
IFN-γ 함량이 63 내지 99%;
IL-1A(alpha) 함량이 65 내지 99%;
IL-1RA(alpha) 함량이 12 내지 43%;
IL-17 함량이 82 내지 99%;
칼리크레인(KLK) 3 함량이 92 내지 99%;
MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 함량이 2 내지 9%;
MMP(Matrix Metalloproteinase Protein) 9 함량이 83 내지 99%;
펜트라신(PTX) 3 함량이 44 내지 91%;
레티놀 결합 단백질(RBP) 4 함량이 8 내지 36%;
비타민 D 결합 단백질(VDBP) 함량이 6 내지 16%; 및
CD31 함량이 67 내지 99%.
본 발명의 예시적인 구현예들에서, 진피조직은 계면활성제를 포함하지 않는다. 종래 계면활성제 처리에 의해 탈세포화된 진피조직의 경우, 계면활성제의 처리에 따른 콜라겐과 같은 단백질의 변성과 성장인자의 파괴 등의 문제가 있었다. 또한, 잔존 계면활성제의 제거가 쉽지 않았으며, 이의 제거가 완전히 되지 않는 경우 독성이 있을 수 있는 문제가 있었다.
아울러, 계면활성제로 인해 진피조직의 임계하중, 탄력도와 같은 기계적 특성이 약화되고, 계면활성제가 진피조직에 잔존하는 경우 독성물질로 인해 이식거부반응을 초래하는 어려움이 있었다.
그러나, 본 발명에 따른 초임계 유체 공정에 따라 수득한 탈세포화된 진피조직은 종래 계면활성제를 처리하여 탈세포화된 진피조직과 동등한 수준으로 탈세포화가 이루어지고, 조직학적 형태 및 기계적 물성이 유지되는 특성을 지닌다. 특히, 초임계 유체 공정에 따른 무세포 진피조직은 계면활성제를 처리한 진피조직에 비해 세포외기질(ECM)인 콜라겐, 엘라스틴 등의 진피조직 내 보존 정도가 현저하게 우수한 이점을 지니고 있다.
따라서, 본 발명에 따른 무세포 진피조직은 조직학적 형태 및 기계적 특성을 유지하면서, 세포외기질 손실 없이 탈세포화되어 이식재로서 활용 가능하다.
무세포 진피조직 이식체의 제조
본 발명에 따른 무세포 진피조직 이식체는, 개체로부터 분리된 진피조직을 초임계 유체로 추출하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 "탈세포화", "개체", "진피조직" 및 "초임계 유체"는 상술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, 초임계 유체는 용해도를 바탕으로 개체로부터 분리된 진피조직 내 지질 성분, 구체적으로 세포막의 주성분인 인지질 성분을 추출하여 탈세포화시킴으로써 탈세포화된 진피조직을 제조할 수 있다.
상기 초임계 유체는 이산화탄소 가스, 암모니아 가스, 질소 가스, 일산화질소(NO) 가스, 이산화질소(NO2) 가스, 아산화질소(N2O) 가스, 이산화황 가스, 수소 가스, 수증기, 포화탄화수소, 불포화탄화수소, 방향족 화합물 및 이들의 혼합 가스로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 구체적으로, 이산화탄소 가스일 수 있으나, 진피조직의 기계적 특성뿐만 아니라 구조적 형태를 유지하면서, 진피조직의 세포를 대부분 제거하여 효율적으로 진피조직을 제조할 수 있는 초임계 유체라면 그 종류는 이에 제한되지 않는다. 상기 초임계 유체로 이산화탄소 가스를 이용 시, 이산화탄소는 낮은 임계 온도(31℃)와 임계 압력(73 bar)을 가지고 있어 쉽게 초임계 조건으로 조정이 가능하며, 자연계에 널리 존재하고 무색, 무취하며 인체에 무해하고 화학적으로 안정한 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 초임계 추출 단계는 0 내지 1000 bar, 30 내지 900 bar, 60 내지 800 bar, 90 내지 700 bar, 120 내지 600 bar, 150 내지 500 bar, 또는 200 내지 400 bar의 압력 조건 하에서 수행될 수 있다.
구체적으로, 초임계 추출 단계의 압력은 이에 제한되지는 않으나, 0 bar 이상, 50 bar 이상, 100 bar 이상, 150 bar 이상, 200 bar 이상, 250 bar 이상, 300 bar 이상, 350 bar 이상, 400 bar 이상, 450 bar 이상, 500 bar 이상, 550 bar 이상, 600 bar 이상, 650 bar 이상, 700 bar 이상, 750 bar 이상, 800 bar 이상, 850 bar 이상, 900 bar 이상 또는 950 bar 이상일 수 있다.
또한, 초임계 추출 단계의 압력은 이에 제한되지는 않으나, 1000 bar 이하, 950 bar 이하, 900 bar 이하, 850 bar 이하, 800 bar 이하, 750 bar 이하, 700 bar 이하, 650 bar 이하, 600 bar 이하, 550 bar 이하, 500 bar 이하, 450 bar 이하, 400 bar 이하, 350 bar 이하, 300 bar 이하, 250 bar 이하, 200 bar 이하, 150 bar 이하, 100 bar 이하 또는 50 bar 이하일 수 있다.
상기 초임계 추출 단계의 압력 조건은, 진피조직의 기계적 특성 및 조직의 구조적 형태를 보존하면서, 진피조직의 세포를 대부분 제거하여 효율적으로 진피조직을 제조할 수 있는 조건이라면 그 범위는 이에 제한되지 않는다.
상기 초임계 추출 단계에 있어서, 초임계 유체 이외에 공용매를 더 포함할 수 있다. 상기 공용매는 에탄올, 물, 메탄올, 헥산, 석유 에테르, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매일 수 있다. 바람직하게는, 공용매로서 에탄올을 더 포함할 수 있다.
상기 공용매는 초임계 유체의 추출능 증가 및 용해도 향상 등의 목적으로 첨가되어 분리된 진피조직 내의 지질, 구체적으로 세포막의 인지질을 추출하여 진피조직의 세포를 대부분을 제거하되, 진피조직의 기계적 특성 및 조직의 구조적 형태를 보존하는 한, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 초임계 추출 단계는 이에 제한되지는 않으나, 31℃ 내지 40℃, 31℃ 내지 39℃, 32℃ 내지 38℃, 33℃ 내지 37℃, 34℃ 내지 36℃, 또는 35℃의 온도 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 초임계 추출 단계는 이에 제한되지는 않으나, 3시간 이내 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 60분 내지 180분, 70분 내지 170분, 80분 내지 160분, 90분 내지 150분, 100분 내지 140분, 110분 내지 130분, 또는 120분 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 무세포 진피조직은, 이에 제한되지는 않으나, 상기 초임계 유체로 추출하는 단계 전에 표피층과 진피층을 분리하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
상기 표피층과 진피층의 분리는 당업계에 공지된 방법을 통해 수행될 수 있다. 일반적으로, 표피층과 진피층의 분리는 여러가지 단백질 분해 효소, 예컨대, 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 용액의 이온 강도를 변화시켜 표피층과 진피층을 분리할 수 있다. 구체적으로, 1 M 이상의 염화나트륨(NaCl) 용액 또는 20 mM의 EDTA 용액으로 37℃에서 14시간 내지 32시간 동안 처리하면 표피층과 진피층을 분리할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표피층 및 진피층의 분리는 이에 제한되지는 않으나, 37℃의 온도 조건하에서, 1M NaCl을 24시간 동안 처리하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 무세포 진피조직은, 이에 제한되지는 않으나, 상기 초임계 유체로 추출하는 단계 후에 하기 단계 중 어느 하나의 단계를 더 포함하여 제조될 수 있다:
인산염 완충액으로 진피조직을 세척하는 단계;
진피조직을 동결건조하는 단계; 및
진피조직을 멸균하는 단계.
상기 인산염 완충액을 이용한 세척을 통해 초임계 유체 추출 이후 진피조직에 존재하는 잔존 용액 및 불순물을 세척할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 초임계 유체 추출 후에 PBS(phosphate bufferd saline)로 탈세포화된 진피조직을 16시간 동안 상온에서 세척하여 잔존 용액 및 불순물을 제거하였다.
상기 초임계 유체 추출 이후 수득된 진피조직은 동결건조를 통해 사용시까지 보존될 수 있다.
상기 동결건조시, 이에 제한되지는 않으나, 동결보호제가 추가로 포함될 수 있다. 동결보호제는 진피층 조직의 구조 변화 방지를 비롯하여, 진피층 조직의 물리, 화학적 손상을 막을 수 있다.
상기 동결보호제는 당업계에 공지된 동결보호제를 채택할 수 있다. 예시적인 동결보호제는 당 및 이에 상응하는 당 알콜일 수 있다. 구체적인 당 및 이에 상응하는 당 알콜의 일례로서 수크로스, 말티톨, 글루시톨, 락티톨 및 이소-말툴로스 등이 있다. 이외에, 현재 많이 사용되는 동결보호제로는 DMSO, 덱스트란, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 트레할로스, 폴리에틸렌글리콜, 혈청알부민 등이 있다.
상기 동결보호제는 이에 제한되지는 않으나, 동결건조 전에 진피조직 내 충분히 침투될 수 있도록 처리할 수 있다. 구체적으로, 상기 동결보호제가 처리된 조직은 약 -70℃ 이하, 바람직하게는 -40℃ 내지 -70℃의 초저온 냉동 조건하에서 보관될 수 있다. 또한, 동결보호제가 처리된 조직은 4시간 이상, 바람직하게는 4 내지 48시간 동안 보관될 수 있다.
상기 동결건조는 이에 제한되지는 않으나, 동결건조기를 이용하여 24시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 초임계 유체 추출 후에 수득된 진피조직은 동결건조를 위해 말티톨을 처리하여 침투시키고, 약 -70℃ 이하의 온도에서 최소 4시간 이상 냉동 보관하였다. 냉동 후, 동결건조기로 약 24시간 내지 48시간 동결 건조시키고, 사용시까지 보존하였다.
상기 초임계 유체 추출 이후 수득된 진피조직은 방사선을 조사하여 멸균을 수행할 수 있다. 방사선의 조사 범위는 이에 제한되지는 않으나 10 내지 30 kGy일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 초임계 유체 추출 후에 수득된 진피조직은 포장이 완료된 후 감마선 10 내지 30 kGy를 조사하여 멸균을 진행하였다.
무세포 진피조직 이식체의 용도
본 발명에 따른 무세포 진피조직은 계면활성제 처리 없이 탈세포화되어 임계하중, 탄력도 등과 같은 기계적 물성이 유지되면서, 동시에 잔존 계면활성제에 따른 독성이 존재하지 않는다. 따라서, 최적화된 초임계 유체 처리 공정을 통해 수득한 본 발명의 진피조직은 독성 및 이식거부반응이 제거되어 심각한 화상, 외상을 비롯하여, 함몰 반흔 교정, 반안면 위축 교정, 유두 재건, 입술 확대의 재건성형 및 미용성형 등에 유용하게 활용될 수 있다.
무세포 진피조직 이식체를 제조하는 방법
본 발명의 다른 측면은, a) 개체로부터 분리된 피부조직을 표피층 및 진피층으로 분리하는 단계; b) 상기 분리된 진피층을 초임계 유체로 추출하는 단계; 및 c) 초임계 유체로 추출된 진피층을 인산염 완충액으로 세척하는 단계;를 포함하는, 무세포 진피조직 이식체의 제조 방법을 제공한다.
상기 "개체" 및 "초임계 유체"는 상술한 바와 같다.
상기 a) 단계는 개체로부터 분리된 피부조직을 표피층 및 진피층으로 분리하는 단계이다. 구체적으로, 표피층과 진피층의 분리는 당업계에 공지된 방법을 통해 수행될 수 있다. 일반적으로, 표피층과 진피층의 분리는 여러가지 단백질 분해 효소, 예컨대, 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 용액의 이온 강도를 변화시켜 표피층과 진피층을 분리할 수 있다. 구체적으로, 1 M 이상의 염화나트륨(NaCl) 용액 또는 20 mM의 EDTA 용액으로 37℃에서 14시간 내지 32시간 동안 처리하면 표피층과 진피층을 분리할 수 있다.
상기 b) 단계는 표피층이 분리된 진피층을 초임계 유체로 추출하는 단계이다. 구체적으로, 진피층으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들어, 면역반응을 유발하는 세포막의 주성분인 인지질 성분을 초임계 유체로 추출함으로써 탈세포화시킬 수 있다.
상기 초임계 유체의 종류, 초임계 유체 추출의 압력 조건, 온도 조건, 및 수행 시간은 '무세포 진피조직 이식체의 제조'에서 상술한 바와 같다.
또한, 상기 b) 단계에서 초임계 유체는 이에 제한되지는 않으나, 공용매를 더 포함할 수 있다. 상기 공용매는 초임계 유체의 추출능 증가 및 용해도 향상 등의 목적으로 첨가되어 분리된 진피층으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분을 추출하여 진피조직의 세포를 대부분 제거할 수 있다.
상기 공용매는 진피조직의 기계적 특성 및 조직의 구조적 형태를 보존하는 한, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 에탄올, 물, 메탄올, 헥산, 석유 에테르, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매일 수 있다. 바람직하게는, 공용매로서 에탄올을 더 포함할 수 있다.
상기 c) 단계는 초임계 유체로 추출된 진피층을 인산염 완충액으로 세척하는 단계로, 상기 인산염 완충액을 이용한 세척을 통해 초임계 유체 추출 이후 진피조직에 존재하는 잔존 용액 및 불순물을 세척할 수 있다.
또한, 상기 세척이 완료된 진피조직은 동결건조, 멸균 및 밀봉 포장 중 어느 하나가 추가로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본원 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 초임계 유체 추출 공정을 이용한 무세포 진피의 제조
실시예 1. 초임계 유체 추출 공정을 이용한 무세포 진피의 제조
피부조직의 탈세포화를 위해 초임계 유체 추출 공정을 수행하였다.
먼저, 기증받은 환자의 인체 피부조직(IRB No. 20201305, 서울아산병원)에서 지방층을 제거하였다. 지방층 제거 후, 37℃의 온도 조건 하에서 1M NaCl(Sigma Aldrich, Cat No. S9888)을 24시간 동안 처리하여, 표피를 제거하였다. 표피 제거 후, 분리된 진피층을 멸균된 PBS(biowest, Cat No. L0615-500)로 1시간 동안 세척하였다.
세척 후, 수득한 진피조직을 초임계 추출 장치(Supercritical Extraction System, SES)의 추출조에 투입하고, 초임계 유체 이산화탄소와 공용매 에탄올을 함께 추출조 내부로 주입하였다. 이후, 72.8 기압(bar)의 압력 조건 및 31℃의 온도 조건 하에서 1~3시간 초임계 처리하여 진피조직을 탈세포화시켰다.
이후, 탈세포화된 진피조직을 멸균된 PBS로 상온에서 24시간 동안 세척하였다. 세척이 완료된 RTU(Ready-To-Use) 타입의 무세포 진피조직은 멸균 생리식염수와 함께 밀봉 포장하였다. 또한, FD(Freeze-Drying) 타입의 무세포 진피조직은 말티톨을 처리 및 침투하도록 하고, -80℃에서 4시간 이상 동결시켰다. 이후, 동결건조기를 이용하여 24시간 동안 동결건조 후 밀봉 포장하였다. 포장이 완료된 무세포 진피조직은 감마 멸균(그린피아, 15 kGy)을 수행하여 멸균하고, 멸균 후 실온에서 사용시까지 보관하였다.
준비예 1. 무세포 진피 시료의 준비 및 외형 관찰
상기 실시예 1에서 제조한 무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM) 시료에 대한 비교군으로서 하기 표 1의 세부사양에 따른 종래 공지된 방법에 따라 제조된 인체 진피 ADM 시료를 준비하였다.
상기 준비된 각 시료에 대해 두께를 측정하고(표 2), 외형을 관찰하였다(도 1). 이때, 두께 측정은 버니어 캘리퍼스를 사용하여 경쟁사 제품의 서로 다른 세 부분의 두께를 측정하였다.
번호 시료명 규격 및 세부사양 비고
1 Native RTU, g-15kGy Native
2 SCR RTU, g-15kGy(실시예 1 참조) 초임계 유체 처리 공정 적용
3 SCF Freeze-drying, γ-15 kGy(실시예 1 참조)
4 A 4×12 cm2, RTU, E-Beam 화학적 처리(계면활성제 처리) 또는 효소적 처리 공정 적용
5 B 4×10 cm2, RTU, γ-15 kGy
6 C 4×5 cm2, RTU, E-Beam
7 D 4×7 cm2, Freeze-drying, Aceptic
8 E 1×5 cm2, Freeze-drying, E-Beam
9 F 4×5 cm2, Freeze-drying, EO Gas
번호 시료명 두께 (mm)
1 Native 3.0
2 SCR 3.0
3 SCF 2.8
4 A 3.0
5 B 2.0
6 C 3.0
7 D 3.0
8 E 1.0
9 F 3.0
구체적으로, Native 조직을 포함한 모든 진피조직은 감마선 멸균(15kGy) 처리하였다. 이때, FD(Freeze-Drying) 타입의 Native 시료는 포함되지 않았으며, RTU 타입의 Native 조직을 모든 분석의 미처리 대조군(control) 시료로 이용하였다. 또한, FD 타입 시료의 분석 결과에 포함된 Native 값은 RTU(Ready-To-Use) 타입의 Native 시료의 값으로 표시하였다.
RTU 타입은 일반 식염수(Normal saline)를 포함하여 진피 시료를 이중 포장 후 멸균하여 준비하였다. 또한, FD 타입은 진피 시료를 동결건조 후 이중 포장하여 멸균하여 준비하였다. FD 타입 무세포 진피 시료들은 일반 식염수에서 약 100분간 침지하여 수화시켜 외형 관찰을 수행하였다(도 1).
도 1에 나타낸 바와 같이, 외형상 상기 실시예 1에서 제조한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)의 색상은 종래 공지된 방법에 따라 제조된 인체 진피 ADM 제품과 유사함을 확인하였다.
II. 초임계 유체 추출 공정에 따른 무세포 진피의 생화학적 특성 평가
실험예 1. 탈세포화된 진피조직의 조직학적 분석
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직의 조직학적 분석을 위해, H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 수행하여 조직의 조직학적 형태 및 탈세포 정도를 분석하였다. 즉, 탈세포 성능 지표 중 하나인 Hematoxylin(파란색) & Eosin(붉은색) 염색 수행을 통해 세포핵의 유무를 확인하였다. 세포의 DNA에 결합되는 Hematoxylin은 DNA 정량 결과와 연관이 있으므로, 탈세포 정도의 분석이 가능하다.
H&E 염색 시, 음성 대조군으로는 표피를 제거하지 않은 초임계 유체 처리를 미실시한 원조직 시료(Native)를 사용하였다. 시험군으로는 표피를 제거한 초임계 유체 처리를 실시한 무세포 진피 시료(SCR, SCF)를 사용하였다. 한편, 비교군으로는 표 1의 세부사양에 따른 인체 진피 ADM 시료(A, B, C, D, E, F)를 사용하였다.
염색 결과, 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피 시료 SCR, SCF의 경우 핵이 완전히 제거됨을 확인하였다(도 2). 또한, 인체 진피 ADM 시료 중 C 및 F 시료에서 핵이 관찰되지 않았다. 이에 반해, A, B, D, E 시료에서는 Hematoxylin 염색 부분이 확인되어 탈세포화가 완전히 이루어지지 않음을 확인하였다.
한편, 조직 내부 구조 보존 정도는 A 및 D 시료가 가장 우수함을 확인하였다. 구체적으로, RTU 타입의 경우, A>SCR(초임계 유체 공정 처리 시료)>C>B 순으로 조직 내부 구조 보존 정도가 우수하였다. 또한, FD 타입의 경우, D>SCF(초임계 유체 공정 처리 시료)>E=F 순으로 조직 내부 구조 보존 정도가 우수하였다.
실험예 2. 탈세포화된 진피조직 내 잔존 DNA 함량 확인
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF)에 대해 탈세포화 정도를 확인하기 위해, 탈세포화된 진피 시료 내 DNA 함량을 측정하였다. 이때, 음성 대조군으로는 초임계 유체 처리를 미실시한 원조직(Native)을, 양성 대조군으로는 종래 방법에 따라 제조된 표 1의 무세포 진피조직 시료를 사용하였다. DNA 함량 측정은 RTU(Ready-To-Use) 타입 및 FD(Feeze-Drying) 타입의 무세포 진피 시료에 대해 수행하였다.
구체적으로, 각 시료는 Dneasy Blood & tissue kit(QIAGEN, Cat#69506)를 사용하여 각 진피조직의 gDNA를 추출하였다. 이후, 이를 1% 아가로스(agarose) 젤을 이용하여 전기영동을 실시하였다(도 3). 전기영동 시, ExcelBand™ 1KB Plus(0.1-10 kb) DNA Ladder(SMOBIO사, Cat#DM3200)를 사이즈 마커로 사용하였다.
전기영동 수행 결과, RTU 및 FD 두 타입 모두 초임계 유체 처리 공정에 따른 탈세포화된 진피 시료(SCR, SCF)에서 잔존 dsDNA 양이 시판 무세포 진피 시료(A, B, C, D, E, F) 대비 낮음을 확인하였다. 종래 방법에 따라 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정에 따라 제조된 무세포 진피 시료 중 B에서 DNA 밴드가 약하게 나타났으나, 나머지 A, D, E 무세포 진피 시료에서는 명확한 DNA 밴드가 확인되었다. 이에 반해, SCR, SCF에서는 DNA 밴드가 전혀 관찰되지 않음을 확인하였다(도 3).
또한, dsDNA의 특정 부위에 직접 결합하는 형광 Dye를 추출된 DNA에 넣어 형광 강도를 측정하는 방법을 채용하는 Qubit dsDNA BR assay kit(Thermo, Cat#Q32853)를 사용하여 무세포 진피 시료의 잔존 dsDNA 함량을 정량 분석하였다(도 4a 및 도 4b). 이때, 모든 시료는 동결건조하여 고형분 질량 기준으로 분석하였다.
분석 결과, DNA 정량 값은 전기영동의 단편화된 DNA의 합과 유사한 결과로 측정되었다. 즉, 전기영동 결과와 마찬가지로, RTU 및 FD 두 타입 모두 초임계 유체 처리 공정에 따른 탈세포화된 진피 시료(SCR, SCF)에서 잔존 dsDNA 양이 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피 시료(A, B, C, D, E, F) 대비 낮음을 확인하였다.
이를 통해, 종래 무세포 진피 제조에 적용되는 계면활성제를 사용하는 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정에 비해 초임계 유체 처리시 DNA 제거 효과가 우수함을 알 수 있었다. 이와 더불어, 원조직 90% 이상의 탈세포화가 확인된 바, 이식 거부반응 없이 이식재로서 활용 가능한 우수한 효과를 지님을 알 수 있었다.
실험예 3. 탈세포화된 진피조직 내 면역원성 단백질의 발현 정도 확인
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF)에 대해 이식 거부반응 정도를 확인하기 위해, 무세포 진피 시료 내 면역원성 단백질 MHC1의 발현 정도를 확인하였다. 이때, 양성 대조군으로는 종래 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정에 의해 제조된 무세포 진피조직 시료(A, B, C, D, E, F)를 사용하였으며, 시험은 RTU 타입 및 FD 타입의 무세포 진피 시료에 대해 수행하였다.
구체적으로, 각 시료는 RIPA 용해 버퍼(lysis buffer)를 사용하여 각 진피조직의 단백질을 추출하였다. 이후, BCA(bicinchoninic acid) 방법을 채용한 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo, Cat#23225)를 사용하여 단백질 정량을 수행하였다. 단백질 정량 후, MHC1(SANTA CRUZ Biotechnology, Inc., Cat#sc-55582) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다(도 5).
실험 결과, 세포막 단백질로서 면역원성 단백질 MHC1은 모든 무세포 진피 시료에서 음성인 것으로 확인되었다.
이를 통해, 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 시료와 마찬가지로 초임계 유체 처리시 면역원성 단백질 MHC1의 발현이 음성임을 확인한 바, 이식 거부반응 없이 이식재로서 활용 가능한 우수한 효과를 지님을 알 수 있었다.
실험예 4. 탈세포화된 진피조직의 세포외기질(ECM) 보존 정도 확인
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF) 내 세포외기질 성분, 즉, 콜라겐, 엘라스틴 및 sGAG 등의 보존 정도를 확인하였다.
실험예 4.1. 탈세포화된 진피조직 내 콜라겐 함량 확인
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF) 내 단백질의 손실이 없음을 확인하기 위해, Sircol insoluble Collagen assay kit(Biocolor, Cat#S2000)를 사용하여 콜라겐 함량을 측정하였다. 이때, 음성 대조군으로는 초임계 유체 처리를 미실시한 원조직(Native)을 사용하였다. 양성 대조군으로 계면활성제를 사용하는 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정이 적용된 진피조직 시료(A, B, C, D, E, F)를 사용하였다. 각 시료는 동결건조하여 약 5 mg을 사용하여 콜라겐 함량을 측정하였다.
측정 결과, 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피조직 내 콜라겐 보존율은 원조직 기준으로 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 시료 대비 RTU, FD 두 타입 시료 모두에서 가장 우수함을 확인하였다. 구체적으로, 콜라겐 함량은 시료의 건조 중량을 기준으로 RTU 타입 시료의 경우 418 μg/mg이고, FD 타입 시료의 경우 677 μg/mg인 것으로 확인되었다. 이는 원조직 대비 각각 58.8% 및 95.2% 수준으로, 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피조직 내 단백질 손실을 최소화함을 알 수 있었다(도 6a 및 도 6b).
이에 반해, 종래 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정에 의해 탈세포화된 진피조직 내 콜라겐 함량은 시료의 건조 중량을 기준으로 RTU 타입 A, B 및 C 시료의 경우 각각 16 μg/mg, 23 μg/mg, 164 μg/mg이고, FD 타입 D, E 및 F 시료의 경우 각각 317 μg/mg, 370 μg/mg, 375 μg/mg인 것으로 확인되었다. 이는 원조직 대비 RTU 타입 A, B 및 C 시료의 경우 각각 2.25%, 3.23% 및 23.1% 수준이고, FD 타입 D, E 및 F 시료의 경우 각각 44.6%, 52.0% 및 52.7% 수준에 불과하였다. 즉, 종래 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정에 의해 탈세포화하는 경우, 탈세포화 효과는 우수하더라도 진피조직 내 단백질의 손실이 현저하게 발생함을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 초임계 유체 공정 처리에 의해 탈세포화시킨 진피조직은 조직학적 형태를 유지하고, 단백질 손실을 최소화하면서 탈세포화가 효과적으로 이루어짐을 알 수 있었다. 이에 따라, 이식재로서 활용 가능한 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 4.2. 탈세포화된 진피조직 내 엘라스틴 함량 확인
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF) 내 엘라스틴의 손실이 없음을 확인하기 위해, Fastin Elastin assay kit(Biocolor, Cat#F2000)를 사용하여 엘라스틴 분석을 수행하였다. 이때, 음성 대조군으로는 초임계 유체 처리를 미실시한 원조직(Native)을 사용하였다. 양성 대조군으로 계면활성제를 사용하는 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정이 적용된 진피조직 시료(A, B, C, D, E, F)를 사용하였다. 각 시료는 동결건조하여 약 5 mg을 사용하여 엘라스틴 함량을 측정하였다.
분석 결과, 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피조직 내 엘라스틴 보존율은 원조직 기준으로 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 시료 대비 RTU, FD 두 타입 제품 모두에서 동등 이상 수준으로 유지 보존됨을 확인하였다. 구체적으로, 엘라스틴 함량은 시료의 건조 중량을 기준으로 RTU 타입 시료의 경우 18 μg/mg이고, FD 타입 시료의 경우 14 μg/mg인 것으로 확인되었다. 이는 원조직 대비 각각 90% 및 70% 수준으로, 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피조직 내 엘라스틴 손실이 일어나지 않음을 알 수 있었다(도 7a 및 도 7b).
이에 반해, 종래 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정에 의해 탈세포화된 진피조직 내 엘라스틴 함량은 시료의 건조 중량을 기준으로 RTU 타입 A, B 및 C 시료의 경우 각각 10 μg/mg, 19 μg/mg, 9 μg/mg이고, FD 타입 D, E 및 F 시료의 경우 각각 15 μg/mg, 11 μg/mg, 8 μg/mg인 것으로 확인되었다. 이는 원조직 대비 RTU 타입 A, B 및 C 시료의 경우 각각 50%, 95% 및 45% 수준이고, FD 타입 D, E 및 F 시료의 경우 각각 75%, 55% 및 40% 수준으로, B 및 D 시료 제외 엘라스틴 손실이 현저하게 발생함을 알 수 있었다.
상기 결과를 통해, 초임계 유체 공정 처리에 의해 탈세포화시킨 진피조직은 조직학적 형태를 유지하면서, 엘라스틴 손실이 최소화되어, 이식재로서 활용 가능한 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. 탈세포화된 진피조직의 성장인자 보존 정도 확인
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF)의 성장인자 보존 정도를 확인하기 위해, Proteome Profiler Array, Human XL Cytokine Array Kit, 105 Human Cytokine Array(ARY022B; R&D Systems USA)를 사용하여 두드러지게 발현되는 사이토카인 수 및 발현 정도를 확인하였다(도 8a 내지 도 8f). 이때, 음성 대조군으로는 초임계 유체 처리를 미실시한 원조직(Native)을 사용하였다. 양성 대조군으로 계면활성제를 사용하는 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정이 적용된 진피조직 시료(A, B, C, D)를 사용하였다.
구체적으로, 무세포 진피조직 시료를 RIPA 용해 버퍼를 사용하여 각 시료에 대한 단백질을 추출 분리 정제하였다. 이후, BCA 방법이 채용된 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo, Cat#23225)를 사용하여 단백질 정량을 실시하였다. 각 시료 당 100 mg의 단백질을 각각의 어레이 멤브레인[Proteome Profiler Array, Human XL Cytokine Array Kit(ARY022B), R&D Systems USA]에 동일하게 로딩하여 분석하였다.
분석 결과는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 Dot intensity 값을 측정한 후, Arbitrary intensity 20 이상의 사이토카인 수를 카운팅하고, 이를 하기 표 3 및 표 4에 정리하여 나타내었다.
시료명 cytokine # (intensity>20*)
Native 13
SCR 5
SCF 7
A 2
B 4
C 3
D 6
* Mean spot pixel intensity
Cytokine 각 시료에 대한 Mean spot pixel intensity 값 Cytokine 각 시료에 대한 Mean spot pixel intensity 값
Native SCR SCF Native SCR SCF
Acrp30 205.2 44.8 89.1 IL18 0.7 2.9 4.5
ApoA1 104.6 87.0 97.5 IL19 0.0 0.0 2.0
Angiogenin 190.4 36.1 71.4 IL22 0.0 0.0 2.6
Ang1 0.8 0.1 3.8 IL23 0.0 0.0 2.0
Ang2 8.6 7.7 14.0 IL24 0.0 0.0 2.1
BAFF 0.3 0.4 3.5 IL27 0.1 0.0 2.4
BDNF 6.1 4.4 10.9 IL31 0.1 0.6 2.4
C5/C5a 95.4 18.2 8.9 IL32 0.6 0.5 3.0
CD14 1.6 3.4 4.4 IL33 0.1 0.8 2.5
CD30 8.1 4.9 12.0 IL34 0.0 1.5 2.9
CD40L 22.7 1.3 6.5 CXCL10 0.1 1.6 3.5
CHI3L1 86.1 1.1 5.8 CXCL11 1.4 3.0 5.1
Adipsin 103.1 4.4 7.0 KLK3 12.3 11.3 16.5
CRP 4.4 0.7 4.2 Leptin 0.0 0.0 2.2
Cripto1 0.1 0.7 4.1 LIF 0.0 0.0 2.5
Cystatin C 1.5 0.9 4.4 Lipocalin2 2.6 0.4 4.1
Dkk1 1.1 1.5 5.4 CCL2 0.1 0.0 3.1
CD26 94.4 2.2 4.6 CCL7 0.1 0.0 2.2
EGF 0.7 1.4 3.2 CSF1 1.5 1.9 5.3
Emmprin 89.8 31.9 39.7 MIF 50.9 1.0 4.6
CXCL5 3.1 0.0 3.4 CXCL9 0.2 1.0 3.7
CD105 7.6 3.0 38.1 CCL3/CCL4 0.0 1.2 3.2
FasL 6.9 0.1 3.1 CCL20 0.2 1.7 3.8
FGF2 5.0 0.8 3.2 CCL19 0.6 2.8 4.1
FGF7 0.2 0.5 2.9 MMP9 5.5 4.6 7.3
FGF19 8.3 4.7 8.2 MPO 1.0 0.2 3.0
FLT3L 0.3 0.9 3.4 OPN 1.8 10.6 9.0
GCSF 1.0 0.5 3.4 PDGFAA 0.9 0.5 3.6
GDF15 0.3 1.5 4.4 PDGFAB/BB 0.3 0.0 2.2
GMCSF 4.2 3.7 7.0 PTX3 24.7 10.8 22.4
CXCL1 0.1 0.0 2.0 CXCL4 0.4 0.8 3.7
GH 0.0 0.0 2.7 RAGE 0.2 0.3 2.3
HGF 0.1 0.0 3.3 CCL5 0.1 0.5 3.3
CD54 0.2 0.2 3.4 RBP4 10.1 0.8 3.7
IFNG 5.1 3.1 7.8 RLN2 0.2 1.4 4.1
IGFBP2 0.1 0.7 3.2 Resistin 2.0 3.6 5.9
IGFBP3 0.1 0.5 2.6 SDF1A 3.4 4.0 8.0
IL1A 9.5 6.1 12.4 SerpinE1 1.2 0.0 2.9
IL1B 0.3 1.5 3.7 SHBG 0.3 2.1 5.0
IL1RA 10.7 1.3 4.6 IL1RL1 0.2 0.0 2.4
IL2 0.6 3.1 4.8 CCL17 0.6 0.8 3.7
IL3 0.3 2.8 4.2 TFF3 0.9 0.4 4.6
IL4 0.0 0.0 2.2 CD71 4.3 2.9 6.4
IL5 0.2 0.0 3.8 TGFA 0.1 0.1 2.5
IL6 0.3 0.2 3.4 TSP1 1.4 1.5 6.1
IL8 1.3 2.8 4.0 TNFA 0.1 0.4 3.7
IL10 0.1 0.0 2.5 uPAR 1.3 1.9 7.2
IL11 0.6 1.5 4.0 VEGF 0.8 1.8 4.3
IL12 0.4 0.8 3.1 VDBP 65.3 3.9 10.3
IL13 0.1 0.4 2.7 CD31 68.1 45.6 67.5
IL15 0.1 1.6 3.4 TIM3 0.4 0.1 4.3
IL16 0.3 1.4 3.7 VCAM1 3.2 1.2 5.4
IL17 7.5 6.2 8.4
사이토카인 어레이 수행 결과, 성장인자 보존율이 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 D 시료와 동등한 수준임을 확인하였다. 특히, RTU 타입 시료 중에서 본 발명의 초임계 유체 공정에 따른 무세포 진피 시료(SCR)의 성장인자 보존율이 가장 우수함을 알 수 있었다.
한편, 감마 멸균 수행 여부에 차이가 있으나, 동결건조 타입의 종래 방법에 따라 제조된 D 시료와 본 발명에 따른 SCF 시료 간의 성장인자 보존율을 비교해 본 결과, 동일한 동결건조 타입의 시료일지라도, 초임계 유체 처리 공정에 의해 탈세포화된 본 발명의 SCF 무세포 진피의 성장인자 보존율이 보다 우수함을 알 수 있었다.
실험예 6. 세포 독성 평가
상기 실시예 1에서 제조한 탈세포화된 진피조직(SCR, SCF)의 세포 독성을 평가하였다. 구체적으로, 세포 독성 평가는 당업계에 공지된 L929 마우스 섬유아세포주를 사용하고, 1×104 cells/well의 세포 수로 실시하였다. 또한, 세포 독성 평가는 조직을 37℃에서 세포 배양액에 24시간 담궈 조직 내부 물질을 배양액으로 용출시키는 조직용출법(KCL 공인시험기관 프로토콜 적용)에 따라 수행하였다. 이때, 상기 공인시험기관 기준에 따라 생존율이 공시험액의 70% 미만으로 감소되는 경우, 이는 잠재적으로 세포독성이 있는 것으로 평가하였다.
세포 독성 평가 결과, 종래 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정으로 제조된 무세포 진피조직 시료(A, B, C, D, E, F) 대비 본 발명의 초임계 유체 공정에 따른 무세포 진피 시료(SCR, SCF)의 세포 독성이 현저히 낮음을 알 수 있었다(도 9).
상기 결과를 통해, 초임계 유체 공정 처리에 의해 탈세포화시킨 진피조직은 조직학적 형태를 유지하면서, 세포 독성 없이 이식재로서 활용 가능한 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.
III. 초임계 유체 추출 공정에 따른 무세포 진피의 물리화학적 특성 평가
실험예 7. 초임계 유체 추출 공정을 통해 탈세포화된 진피조직의 임계하중 및 탄성 측정
상기 실시예 1에서 제조한 무세포 진피조직(SCR, SCF)에 대해 임계하중 및 탄성을 측정하였다. 초임계 유체 추출 공정을 통해 탈세포화된 진피조직의 임계하중 및 탄성은 만능 인장 시험기(Universal Tensile Machine; EZ-x 모델 (Shimadzu co.))를 사용하여 측정하였다. 이때, 1×1 cm2 크기의 시료를 대상으로 시험하였다. 시험 시료는 음성 대조군으로 초임계 유체 처리를 미실시한 원조직(Native)을 사용하였다. 양성 대조군으로는 계면활성제를 사용하는 화학적 처리 또는 효소적 처리 공정이 적용된 진피조직 시료(A, B, C, D, E, F)를 사용하였다. 한편, 임계하중 및 탄성 측정에 앞서 각 시료는 PBS로 100분 동안 재수화하고, 측정 직전에 조직 표면의 수분을 거즈로 제거하여 측정하였다.
결과적으로, RTU 타입의 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피조직(SCR)의 경우 임계하중이 11.6 N로, 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 시료 A 9.8 N, 시료 B 8.9 N 및 시료 C 6.8 N과 달리 임계하중이 원조직 대비 거의 완벽하게 유지됨을 확인하였다. 특히, FD 타입의 초임계 유체 공정에 따라 탈세포화된 진피조직(SCF)의 경우에는 임계하중이 18.8 N로 원조직 11.6 N 기준 약 1.6배 높으며, 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 시료 D 15.6 N, 시료 E 8.5 N 및 시료 F 17.4 N과 동등 이상의 임계하중 수준을 나타냄을 확인하였다(도 10a 및 도 10b).
본 발명에 따른 RTU 타입의 SCR 시료의 영률 또한 원조직 시료와 동일한 영률 0.6 MPa로 측정되어, 원조직 대비 탄성이 거의 완벽하게 유지됨을 확인하였다. 아울러, FD 타입의 SCF 시료의 경우에도 영률이 1.1 MPa로 원조직 시료의 영률 0.6 MPa 대비 영률이 약 1.8배 높으며, 종래 방법에 따라 제조된 무세포 진피조직 시료 D 1.0 MPa, 시료 E 0.2 MPa 및 시료 F 1.1 MPa와 비교하여 동등 이상의 영률 수준을 나타냄을 확인하였다(도 11a 및 도 11b).

Claims (14)

  1. 무세포 진피조직 이식체에 있어서,
    상기 무세포 진피조직의 임계하중(Critical load)은 11 내지 19 N이고,
    영률(Young's modulus)은 0.5 내지 1.2 MPa인, 무세포 진피조직 이식체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 무세포 진피조직은 건조중량을 기준으로 하기 그룹에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가지는 것인, 무세포 진피조직 이식체:
    DNA 잔존량이 80 내지 110 ng/mg;
    콜라겐 함량이 400 내지 700 μg/mg; 및
    엘라스틴 함량이 13 내지 19 μg/mg.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 무세포 진피조직은 원조직 대비 하기 그룹에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가지는 것인, 무세포 진피조직 이식체:
    DNA 잔존량이 5 내지 8%;
    콜라겐 함량이 55 내지 99%;
    엘라스틴 함량이 65 내지 95%;
    임계하중은 90 내지 165%; 및
    영률(Young's modulus)은 80 내지 200%.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 무세포 진피조직은 원조직 대비 하기 그룹에서 선택되는 어느 하나의 특징을 가지는 것인, 무세포 진피조직 이식체:
    아디포넥틴 함량이 22 내지 44%;
    아포리포단백질 A1 함량이 84 내지 94%;
    안지오제닌 함량이 19 내지 38%;
    안지오포이에틴-2 함량이 90 내지 99%;
    뇌유래 신경영양인자(BDNF) 함량이 73 내지 99%;
    보체 성분 C5/C5a 함량이 9 내지 19%;
    CD30 함량이 59 내지 99%;
    CD40 리간드 함량이 6 내지 28%;
    CD26 함량이 2 내지 5%;
    엠프린(Emmprin) 함량이 36 내지 44%;
    CD105 함량이 41 내지 99%;
    Fas 리간드 함량이 2 내지 45%;
    FGF-2 함량이 15 내지 64%;
    FGF19 함량이 56 내지 98%;
    IFN-γ 함량이 63 내지 99%;
    IL-1A(alpha) 함량이 65 내지 99%;
    IL-1RA(alpha) 함량이 12 내지 43%;
    IL-17 함량이 82 내지 99%;
    칼리크레인(KLK) 3 함량이 92 내지 99%;
    MIF(Macrophage Migration Inhibitory Factor) 함량이 2 내지 9%;
    MMP(Matrix Metalloproteinase Protein) 9 함량이 83 내지 99%;
    펜트라신(PTX) 3 함량이 44 내지 91%;
    레티놀 결합 단백질(RBP) 4 함량이 8 내지 36%;
    비타민 D 결합 단백질(VDBP) 함량이 6 내지 16%; 및
    CD31 함량이 67 내지 99%.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 무세포 진피조직은,
    초임계 유체로 추출하는 단계를 포함하는 제조 방법으로 제조된 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 초임계 유체로 사용되는 용매는 이산화탄소인 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 초임계 유체는 공용매로서 에탄올이 더 포함되는 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 추출은 30℃내지 40℃의 온도 조건하에서 수행되는 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 추출은 50 bar 내지 400 bar의 압력 조건하에서 수행되는 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 추출은 1 내지 3시간 동안 수행되는 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 초임계 유체로 추출하는 단계 전에 표피층과 진피층을 분리하는 단계를 포함하는 것인, 무세포 진피조직 이식체.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 초임계 유체로 추출하는 단계 후에 하기 단계 중 어느 하나의 단계를 더 포함하는 것인, 무세포 진피조직 이식체:
    인산염 완충액으로 진피조직을 세척하는 단계;
    진피조직을 동결건조하는 단계; 및
    진피조직을 멸균하는 단계.
  13. a) 개체로부터 분리된 피부조직을 표피층 및 진피층으로 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 진피층을 초임계 유체로 추출하는 단계; 및
    c) 초임계 유체로 추출된 진피층을 인산염 완충액으로 세척하는 단계;를 포함하는, 무세포 진피조직 이식체의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 b) 단계에서 초임계 유체는 공용매를 더 포함하는 것인, 제조 방법.
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