WO2023165918A1 - Procédé d'extraction sur phase solide à l'aide d'un monolithe poreux - Google Patents

Procédé d'extraction sur phase solide à l'aide d'un monolithe poreux Download PDF

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WO2023165918A1
WO2023165918A1 PCT/EP2023/054787 EP2023054787W WO2023165918A1 WO 2023165918 A1 WO2023165918 A1 WO 2023165918A1 EP 2023054787 W EP2023054787 W EP 2023054787W WO 2023165918 A1 WO2023165918 A1 WO 2023165918A1
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porous
monolith
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conduit
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PCT/EP2023/054787
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Laurent Mugherli
Marc MALEVAL
François FENAILLE
Florent MALLOGGI
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Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Centre National De La Recherche Scientifique
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Definitions

  • the present invention relates to a method for the solid phase extraction of one or more compounds of interest using a porous monolith integrated in a fluid conduit.
  • the invention also relates to a method for integrating a porous monolith into a tube made of a heat-shrinkable material.
  • the extraction of one or more compounds of interest from a complex mixture is essential for subsequent use, in particular to allow their identification and/or their quantification.
  • the quality of the extraction of the compound(s) of interest greatly influences the quality of the results obtained subsequently.
  • a convenient and efficient way to perform an extraction is to circulate a solution containing the molecules of interest through a solid phase.
  • it is necessary to have a fluidic circuit incorporating a porous material with a cross-section perfectly adapted to the conduit in which it is integrated and fixed to guarantee that the solution circulating in the circuit inevitably passes through the porous material.
  • porous monoliths especially those with hierarchical porosity (HPM) have advantages such as good permeability, porosity and adjustable surface chemistry.
  • HPM hierarchical porosity
  • silica-based monolith as solid phase extraction cartridge for extracting polar compounds from urine, Ma, X., Zhao, M., Zhao, F et al.
  • silica-based monolith as solid-phase extraction sorbent for extracting toxaphene congeners in soil. J Sol-Gel Sci Technol 80, 87-95 (2016) and Jorge C.
  • International application WO 2005/072164 describes a monolith integrated into a polyethylene tube by inserting the monolith into the tube, then the assembly is heated until the tube is in a state of fusion and encapsulates the monolith, and finally the ends are cut to allow the circulation of fluid in the porous monolith.
  • International application WO 2008/112702 describes a system comprising a porous monolith integrated into a support by heating the support to retract it onto the porous substrate. This document more particularly describes a porous monolith 1.2 mm in diameter inserted into a borosilicate glass tube having an internal diameter of 1.8 mm and the heating of the assembly to a temperature of 850° C.
  • the invention meets this need with the aid of a solid phase extraction method of one or more compounds of interest from a liquid sample comprising: the integration of a self-supporting porous monolith in a fluidic conduit whereby the self-supporting porous monolith is fixed in the fluidic system during said process and forms a filter in the fluidic system, at least one passage of the sample through the porous monolith in the fluid conduit over at least a portion of the porous monolith, the self-supporting porous monolith having a greatest dimension transverse to the conduit less than or equal to 3 mm.
  • any liquid passing through the fluid conduit passes through the porous monolith over at least part of its length, in particular over its entire length, the length being defined as the largest dimension along the axis of the fluid conduit.
  • the fact that the porous monolith is of a dimension less than or equal to 3 mm makes it possible to be able to process samples of very small volumes, which is particularly interesting in certain fields but also allows for rapid and robust processing. This also optimizes the subsequent analysis of the extracted compounds of interest by reducing the need for preconcentration of the latter before their analysis.
  • porous monolith makes it possible to have a device with very good extraction efficiency and which is versatile. It is indeed easy to adapt the porosity characteristics and the surface chemistry of the porous monolith to the desired type of extraction.
  • the porous monolith is formed by a sol-gel process.
  • sol-gel process means a process implemented using as precursors alkoxy compounds of formula M(OR)n, R'-M(OR)nl or even sodium silicates or titanium colloids, M being a metal, a transition metal or a metalloid, in particular silicon, and R or R' being alkyl groups, n being the degree of oxidation of the metal.
  • M being a metal, a transition metal or a metalloid, in particular silicon
  • R or R' being alkyl groups
  • n being the degree of oxidation of the metal.
  • hydrolysis of the alkoxy (OR) groups occurs, forming small particles generally less than 1 nanometer in size. These particles aggregate and form clusters which remain in suspension without precipitating, and form the soil. The increase in the clusters and their condensation increases the viscosity of the medium and forms what is called the gel.
  • the gel can then continue to evolve during an aging phase during which the polymeric network present within the gel densifies.
  • the gel then retracts by evacuating the solvent outside the polymeric network formed, during a step called syneresis. Then the solvent evaporates, during a so-called drying step, which leads to a solid material of the porous glass type giving a porous monolith.
  • the syneresis and drying stages can be concomitant.
  • the self-supporting porous monolith is formed by a manufacturing process comprising: the formation of a sol comprising a sol-gel precursor in aqueous solution and, preferably, a pore-forming agent, the at least partial filling of an enclosure and at least one mold contained in the enclosure in soil previously formed, the mold comprising at least one opening opening in the ground after filling in soil, the formation of a sol-gel matrix in the enclosure from the sol, extracting the mold with the sol-gel matrix contained in the mold from the enclosure, and extracting the sol-gel matrix from the mold, forming a porous monolith from the sol-gel matrix extracted from the mould, the formation of the sol, the sol-gel matrix and the porous monolith being done by a sol-gel process.
  • the presence of at least one opening in the mold below the soil level after filling allows the filling of the mold by the soil during the filling step and the fluidic circulation of the soil between the soil contained in the mold and the soil contained in the enclosure during the rest of the process.
  • the fact of producing a large sol-gel matrix in the enclosure and of extracting a part of it included in a mold during the formation of the matrix makes it possible to overcome the edge effects which appear in the methods described previously by producing the sol-gel matrix in a container which is always the same size.
  • Such a process allows the manufacture of self-supporting porous monoliths with similar textural properties over a wide range of diameters without having to re-optimize, or even modify, the formulation of the initial mixture.
  • the sol can be formed by stirring a solution comprising the sol-gel precursor, preferably the sol-gel precursor and the pore-forming agent, in particular for a time greater than or equal to 5 min, better still greater than or equal to 10 min, even better greater than or equal to 15 min.
  • the duration of the agitation can be less than or equal to 3 hours, better still less than or equal to 2 hours.
  • the temperature can be controlled at a substantially constant predetermined value, in particular between 0°C and 90°C, better still between 0°C and 50°C.
  • Filling can be done without the presence of air bubbles and/or chemical composition and/or soil temperature gradients in the enclosure and the mould(s).
  • Formation of the sol-gel matrix may include condensation to form a gel and optionally at least partial aging to densify the gel.
  • the formation of the sol-gel matrix in the enclosure is devoid of drying of the sol-gel matrix.
  • the formation of the sol-gel matrix can be done in the same way in the enclosure and the mold.
  • the total porosity and the size of the pores are preferably substantially homogeneous in the enclosure and the mould(s).
  • the extraction of the mold with the matrix it contains from the enclosure may comprise an extraction of a block of the sol-gel matrix containing the mold from the enclosure and the extraction of the mold and of the sol-gel matrix it contains from the previously extracted block.
  • the extraction of the or each mold from the block can be done by cutting the sol-gel matrix flush with the corresponding mold or breaking the sol-gel matrix surrounding the mold(s).
  • the extraction of the or each mold with the matrix it contains can be done by removing the corresponding mold from the sol-gel matrix surrounding it after extraction of the block as described previously or directly in the enclosure without prior extraction of the block, in particular when the corresponding mold is only partially immersed in the sol-gel matrix.
  • the extraction of the sol-gel matrix contained in the or each mold can be done by means of controlled pressure on said sol-gel matrix, for example by direct pressure with a solid of smaller size than the mold or by pressure of a gas at a controlled rate or by opening the or each mold, in particular by cutting the or each mold or separating two parts of the or each mold from one another.
  • the mold(s) can be in the form of two parts that are movable together, in particular separable or movable relative to each other by a hinge.
  • the mold containing the sol-gel matrix can be immersed in a liquid during the step of extracting the sol-gel matrix contained in the mold. This facilitates the extraction of the sol-gel matrix.
  • the method of making the porous monolith may include controlled generation of mesoporosity in the sol-gel matrix to form a sol-gel matrix with hierarchical porosity after extraction of the mold from the enclosure, and prior to formation of the porous monolith from of the sol-gel matrix of the mould.
  • the controlled generation of mesoporosity can be done by immersing the sol-gel matrix extracted or not from the or each mold in an aqueous solution for generating mesoporosity comprising an agent for dissolving the sol-gel matrix and/or a precursor of agent for dissolving the sol-gel matrix.
  • the dissolving agent can be ammonium hydroxide, for example at an IM concentration, sodium hydroxide, or hydrofluoric acid or mixtures thereof.
  • the sol-gel matrix dissolution agent precursor may be urea or compounds bearing amide functions, in particular formamide, acetamide, N-methylformamide (NMF) and mixtures thereof.
  • concentration of dissolving agent and/or of dissolving agent precursor is such that it allows localized dissolution of the sol-gel matrix(es) so as to form mesopores in the latter(s) without globally dissolving the sol-gel matrix or matrices.
  • the formation of the porous monolith may include at least partial aging to densify the sol-gel matrix, especially when aging has not taken place completely before.
  • the formation of the porous monolith can comprise drying of the sol-gel matrix extracted or not from the mold to form a dried sol-gel matrix, after the generation of mesopores if necessary.
  • the drying step can be done under a flow of air or inert gas, in particular dinitrogen, argon or carbon dioxide, helium, or even dioxygen or dihydrogen.
  • the formation of the porous monolith may comprise a heat treatment of the sol-gel matrix or matrices extracted or not from the or each mold, in particular after drying.
  • the heat treatment can be done in a closed container under a flow of air or inert gas, in particular dinitrogen, argon or carbon dioxide, helium, or even dioxygen or dihydrogen and by gradual heating followed by maintaining the final temperature for a predetermined time.
  • Gradual heating can be an increase of 0.5° C./min until reaching a temperature greater than or equal to 300° C., better still greater than or equal to 340° C., for example substantially equal to 350° C., to obtain a porous monolith.
  • the final temperature can be maintained for more than Ih. This makes it possible to stabilize the structure of the monolith and to eliminate the organic residues resulting from the synthesis.
  • the porous monolith is formed directly in a mold in which the soil is inserted and is extracted from the latter, in particular by the method mentioned above.
  • the porous monolith may comprise macropores, in particular macropores with a dimension greater than or equal to 50 nm.
  • the macropores can have a dimension less than or equal to 30 ⁇ m.
  • the porous monolith may comprise mesopores, in particular of size less than or equal to 50 nm, better still between 2 and 50 nm.
  • the pores are interconnected in the porous monolith. This makes it possible to obtain porous monoliths with hierarchical porosity, that is to say having at least two orders of magnitude of pore sizes, preferably macropores formed during the formation of the sol-gel matrix and mesopores formed during the controlled generation of mesopores.
  • porous monoliths present a good exchange surface between the solution passing through it and its material and minimize the distances to be covered by diffusion.
  • this provides flexibility to the sol-gel matrix while reducing the risk of breakage.
  • it reduces the drying time of the sol-gel matrix.
  • the porous monolith may have a greater transverse dimension to the duct of less than or equal to 2 mm, better still less than or equal to 1.5 mm, even better still less than or equal to 1 mm.
  • the self-supporting porous monolith may have a greater dimension transverse to the duct greater than or equal to 20 ⁇ m.
  • the porous monolith may have a length greater than or equal to 0.5 mm, better still greater than or equal to 1 mm, even better greater than or equal to 2 mm.
  • the porous monolith may have a length, taken along the longitudinal axis of the conduit, greater than its greatest transverse dimension.
  • the porous monolith is embedded in the conduit and configured such that any liquid passing through the fluidic conduit passes through the porous monolith over a distance of at least 10% of its length, better still at least 50%, even better the whole length.
  • the porous monolith is cylindrical with a diameter less than or equal to 1.5 mm, better still less than or equal to 1 mm, and of length greater than or equal to 0.5 mm, better still greater than or equal to 1 mm, even better still greater or equal to 2 mm.
  • the porous monolith may have a substantially homogeneous structure throughout its volume.
  • the porous monolith may have an aspect ratio, defined as the ratio of its height to its largest transverse dimension, greater than or equal to 0.2, better still greater than or equal to 0.4, better still greater than or equal to 1 and/or less than or equal to 1000, better still less than or equal to 500, even better less than or equal to 100, better still less than or equal to 50, even better less than or equal to 20.
  • the porous monolith is cylindrical with a polygonal, oval or circular base, in particular cylindrical of revolution.
  • the method may include modifications of the porous monolith post-manufacturing, in particular the functionalization of the surface of the porous monolith, in particular before or after its integration into the duct.
  • the surface of the porous monolith can be coated with molecules such as hydrophobic hydrocarbon ligands (for example octadecyl ligands) or as hydrophilic ligands such as 2,3-dihydroxypropyl derivatives.
  • the ligands of such modified columns can be further modified using known procedures.
  • Porous catalysts or enzyme supports can be prepared by adding enzymes, eg, glucose isomerase, peptide-N-glycosidase F (PNGase F), or catalytic metals, eg, platinum and palladium.
  • the fluid conduit has at least one open end, better still two open ends.
  • the fluid conduit is through.
  • the fluid conduit is preferably open on either side of the porous monolith.
  • the fluid conduit is closed at its end downstream of the porous monolith so as to form a well.
  • the porous monolith can be at the closed end of the conduit or the fluidic conduit can have a space between its end closed and the porous monolith.
  • the sample can then cross the porous monolith from side to side during its passage through the porous monolith, in particular when a space is present downstream of the latter, or cross it over part of its height according to a round trip , especially in the case where the porous monolith is at the closed end of the conduit.
  • the fluid conduit is monolayer.
  • the fluid conduit may be made of a heat-shrinkable polymer, in particular polyolefin, such as polyethylene (PE) or polyvinyl chloride (PVC), polytetrafluoroethylene (PTFE), fluorinated ethylene-propylene (FEP), polyetheretherketone (PEEK) , or polyvinylidene fluoride (PVDF) or a mixture thereof.
  • polyolefin such as polyethylene (PE) or polyvinyl chloride (PVC), polytetrafluoroethylene (PTFE), fluorinated ethylene-propylene (FEP), polyetheretherketone (PEEK) , or polyvinylidene fluoride (PVDF) or a mixture thereof.
  • the fluid conduit may have a wall of constant thickness greater than or equal to 0.004 mm, better still greater than or equal to 0.15 mm, or even better still 0.2 mm.
  • the thickness of the wall of the duct is less than or equal to 1 mm, better still less than or equal to 0.9 mm, even better still less than or equal to 0.65 mm.
  • the fluid conduit can be rigid, flexible, or preferably semi-rigid.
  • the fluid conduit may have an elastic wall.
  • the fluid conduit may be transparent. This allows direct visualization of the passage of the solution, in particular when the latter is colored, which allows monitoring of the process.
  • the duct can be completely or at least partially opaque.
  • the conduit may include a transparent viewing window at the porous monolith.
  • the fluid conduit is configured to have, after integration of the porous monolith, a minimum diameter less than or equal to, better still strictly less than, the largest transverse dimension of the porous monolith, preferably the smallest transverse dimension of the porous monolith, in particular to its diameter, the transverse dimension being understood along a transverse plane of the duct after integration of the monolith in the duct.
  • the fluid conduit may have a minimum diameter strictly less than 100%, better still less than or equal to 98%, even better still less than or equal to 95%, of the smallest transverse dimension of the porous monolith, in particular of its diameter.
  • the minimum diameter of the conduit may be greater than or equal to 50%, better 60%, better 70%, better 80%, of the smallest transverse dimension of the porous monolith.
  • the fluid conduit may have a shrinkage coefficient, defined as the ratio between the initial diameter and the minimum diameter attainable after shrinkage, greater than or equal to 1.5:1, better still greater than or equal to 2:1.
  • the shrink factor is less than or equal to 6:1.
  • the fluid conduit can be configured to retract at a temperature greater than or equal to 70°C, better still greater than or equal to 100°C.
  • the fluidic conduit can be a pipette tip or a solid phase extraction cartridge.
  • the porous monolith can be force-fitted into the fluid conduit.
  • the fluid conduit may comprise an internal wall having a sealing layer coming into contact with the external wall of the porous monolith.
  • Such a layer can be an adhesive layer or a layer of an elastic material.
  • the fluid conduit may have an internal diameter less than or equal to that of the porous monolith.
  • the fluid conduit and the porous monolith can be of complementary conical shape.
  • at least a portion of the duct of length greater than or equal to the length of the porous monolith, better still the entire duct is in the form of a cylindrical tube, in particular with a circular base.
  • the duct of length greater than or equal to the length of the porous monolith is of truncated conical shape.
  • length of the porous monolith we understand its largest dimension along the longitudinal axis of the duct after integration.
  • the porous monolith has an outer surface of the same shape as said portion of the duct, except for the dimensions where applicable.
  • the fluid conduit has, after integration of the porous monolith, a fluid circulation length strictly greater than the length of the porous monolith.
  • the fluid conduit has at its or one of its open ends, after integration of the porous monolith, a non-zero length of conduit devoid of porous monolith. This facilitates the introduction of the sample into the tube upstream of the porous monolith by facilitating the integration of the assembly into the extraction device by the ease of fluid connection of the extended end.
  • the fluidic circulation length can be adapted according to the specific fluidic protocol of a particular use case.
  • the porous monolith is integrated into the fluid conduit without protruding from the fluid conduit.
  • This facilitates the integration of the fluid conduit in a fluidic device and facilitates the passage of the liquid sample in the fluidic conduit.
  • This also makes it possible to have a reserve of liquid in the fluid conduit, in particular upstream of the porous monolith, which can make it possible to prepare beforehand a quantity of a solution or a sequence of several solutions in predetermined quantities in the fluid conduit upstream porous monolith to pass through the porous monolith.
  • the fluid conduit has one or more open ends before integration of the porous monolith and the or at least one of the open ends of the fluid conduit before integration remains open during the integration of the porous monolith. This allows the passage of the sample through the porous monolith without it being necessary to open one end of the conduit after integration of the porous monolith.
  • the porous monolith retains its integrity during the step of integration into the fluid conduit.
  • the integration of the porous monolith in the fluid conduit is done so that it is not necessary to cut a part of the porous monolith, in particular one of its ends to allow the passage of the sample within it. This makes it possible to limit the risk of degradation of the porous monolith by limiting the actions on the latter and facilitates the integration of the entire fluidic conduit integrating the porous monolith into a sample circulation device.
  • the fluid conduit is not melted to encapsulate the porous monolith.
  • Such an integration would generate a local penetration of the material of the fluid conduit on the surface of the porous monolith, which would require, to allow the passage of the sample to cut, at least at one end of the porous monolith, the porous monolith on the thickness penetration, which could degrade the porous monolith, especially when it is of small diameter.
  • the integration of the porous monolith is done without it being necessary to amputate the fluid conduit of part of its length to allow the passage of the sample through the porous monolith.
  • the resulting device makes it possible to limit the steps necessary before the passage of one or more solutions, in particular of the sample, in the fluidic conduit.
  • the fluidic conduit is made of a heat-shrinkable polymer and the integration of the porous monolith into the fluidic conduit may comprise the insertion of the porous monolith in the fluidic conduit and heating the fluidic conduit to retract the conduit so as to encapsulate the porous monolith in said conduit.
  • the heating of the conduit is done at a temperature greater than or equal to the minimum temperature of retraction of the conduit, in particular at a temperature greater than or equal to 70° C., better still greater than or equal to 100° C., even better greater than or equal to at 300°C.
  • the pipe is heated to a temperature less than or equal to the melting or degradation temperature of the fluidic pipe, in particular less than or equal to 800° C., preferably less than or equal to 700° C., better still less than or equal to 500°C.
  • the retraction of the conduit is such that, after retraction, the inner wall of the conduit extends along the envelope surface of the porous monolith without merging into the surface pores of the porous monolith.
  • the retraction of the conduit is such that the porous monolith remains fixed in the conduit when a solution is introduced into the tube at a pressure of between 0.05 and 7 bars, preferentially between 0.1 and 5 bars, even better between 0.15 and 4 bar.
  • the heating of the duct is done by heating the duct for a time and at a temperature chosen so that the fluidic duct retracts until it comes into contact with the outer wall of the porous monolith over at least part of the length of the porous monolith, better over the entire length of the porous monolith, in particular until it matches the shape of the envelope surface of the porous monolith.
  • the portions of the conduit directly upstream and downstream of the porous monolith have respective diameters strictly less than 100%, better still less than or equal to 95%, better still 90% of the smallest transverse dimension of the section d end of the directly adjacent porous monolith.
  • the heating of the duct can be carried out using a heating gun moved manually along the duct.
  • the heating gun is moved along the duct in a substantially regular manner so as not to heat a portion of duct for more than 10 min, better still more than 2 min, even better still more than 1 min.
  • the heat gun can be adjusted to output a temperature of more than 450° C. during heating of the pipe and be positioned less than 15 cm, better still less than 4 cm, even better 2 cm from the pipe during heating.
  • the heating takes place in an oven.
  • the temperature of the oven is at least 70° C., better still greater than or equal to 150° C., even better still greater than or equal to 300° C., preferably less than or equal to 800° C., better still less than or equal to 700°C, more preferably less than or equal to 500°C.
  • it is chosen between the minimum shrinkage temperature and the melting or degradation temperature of the fluid conduit.
  • the heating can be maintained for a time depending on the temperature so that the heat-shrinkable polymer of the fluidic conduit does not degrade, in particular less than or equal to Ih for a temperature between 300 and 450° C. and less than or equal to 30 min, better 15 min for a temperature between 450°C and 650°C.
  • the assembly of the duct and of the porous monolith after integration is characterized in that it has no continuous fluidic path extending between the internal wall of the duct and the porous monolith connecting portions of duct over lengths at least 20 times greater than the average macropore size, better over lengths at least 10 times greater than the average macropore size.
  • the heating step can be done by a predetermined variable temperature profile.
  • the predetermined temperature profile may include temperature stages and/or a gradual temperature increase ramp.
  • the method may include the integration of a plurality of porous monoliths in a plurality of disjoint conduits and the passage of a plurality of samples, each through a porous monolith in one of the conduits.
  • the porous monolith can be integrated in such a way that, during the passage of the sample in the fluid conduit, any fraction of the sample circulates in the porous monolith over at least a portion of the length of the latter.
  • the fluidic conduit can be integrated into a fluidic device configured to introduce into the conduit and circulate in the conduit a solution, in particular the sample.
  • the fluidic device may include a solution supply member configured to be connected to one end of the fluidic conduit.
  • the liquid supply member can be configured to be connected at its other end to a reservoir of interchangeable liquid depending on the solution to be introduced into the conduit, in particular to a reservoir containing the sample.
  • the fluidic device may comprise a pressure controller or a syringe pump connected to the fluidic conduit upstream or downstream of the porous monolith, in particular via the fluid supply member of the conduit, configured to control the circulation of the fluid in the duct.
  • the device may comprise a centrifugation device for causing a solution, in particular the sample, to pass by centrifugal force through the porous monolith, in particular when the pipe has a closed end.
  • the duct may be open at both ends and the fluidic device may comprise a member for distributing the liquid at the outlet of the fluidic duct.
  • the liquid dispensing member may be a needle.
  • Such a liquid distribution member can make it possible to facilitate the precision of recovery of the liquid at the conduit outlet and the precision of distribution on or in one or more sampling organs.
  • the solution at the outlet of the duct is directly recovered without going through an additional distribution member at the outlet of the duct.
  • the sample passing through the porous monolith is less than 500 pL, better still less than 250 pL, even better less than 100 pL.
  • the sample can be formed from a blood sample, in particular plasma or serum, cerebrospinal fluid, urine or milk, in particular human.
  • a sample is modified before it passes through the porous monolith.
  • the process can be a solid phase extraction process of compounds of interest by adsorption of the latter on the surfaces of porous monoliths to separate them from the rest of the sample, then recovery by elution of the compounds of interest adsorbed on the surfaces of the porous monolith.
  • the method preferably comprises, before passing the sample, the conditioning of the porous monolith by passing one or more successive conditioning solutions into the fluid conduit through the porous monolith.
  • Such conditioning makes it possible to impregnate the porous monolith with solvent in order to improve the adsorption of the compounds of interest.
  • the conditioning of the porous monolith in the duct may comprise the passage of a polar solvent, in particular comprising water and/or acetonitrile.
  • the polar conditioning solvent is identical to the sample solvent.
  • the conditioning may include the passage of a first water solution, in particular pure, in the conduit through the porous monolith and the passage of an aqueous acetonitrile solution, in particular at 80% by volume.
  • the method may include, after the passage of the sample through the porous monolith, the washing of the porous monolith by passing one or more washing solutions in the fluid conduit through the porous monolith.
  • the wash solution may be of lower polarity than the sample solvent.
  • the washing solution may be an aqueous solution of acetonitrile at more than 50% by volume, better still 70%. Such washing removes impurities from the porous monolith without eluting compounds of interest to improve analyte purity.
  • the method may comprise, after passing the sample and if necessary after washing, the elution of the compounds of interest by passing an eluting solution or several fractions of eluting solution through the porous monolith in the conduit fluidics and the recovery of eluate(s) with a view in particular to their analysis in order to determine their composition of compounds of interest.
  • the elution can be done by passing several successive fractions, disjointed or not, of eluting solution through the porous monolith and by recovering each eluate after it has passed through the porous monolith in dissociated recovery systems.
  • the or each fraction of eluting solution may have a volume less than or equal to lOpL, better still less than or equal to 5 pL, even better less than or equal to IpL.
  • the recovery of eluates can be done on different areas of a plate, in particular a mass spectrometer plate using a matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) source coupled or not to a time-of-flight analyzer ( MALDI-TOF).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization
  • the method may include analysis of the eluate(s).
  • the eluting solution can be of higher polarity than the sample solvent, in particular be pure water.
  • the analysis can be done by mass spectrometry, in particular a mass spectrometer coupling a matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) source and a time-of-flight (TOF) analyzer, by liquid chromatography coupled with fluorescence detection (LC-Fluo) or by capillary electrophoresis coupled to fluorescence (CE-LIF).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization
  • TOF time-of-flight
  • CE-LIF capillary electrophoresis coupled to fluorescence
  • the extraction process is carried out in the absence of acid, in particular formic or trifluoroacetic acid.
  • an acid in particular a proportion greater than or equal to 0.1% by volume of an acid, in particular formic or trifluoroacetic acid, is added to the conditioning solution, the washing solution and/or the eluting solution .
  • a base can be added to the conditioning solution, the washing solution and/or the eluting solution.
  • the extraction process comprises a preliminary stage of preparation in the fluid conduit upstream of the porous monolith of a sequence of the various successive solutions which must pass through the porous monolith to allow the extraction, in particular of the solution of conditioning, of the sample, of the washing solution and of the eluting solution in the form of one or more successive fractions.
  • This allows precise control of the extraction by simply controlling the pressure in the fluidic conduit.
  • This also allows for precise control of the volumes of the different solutions and the times between the different steps.
  • the process may comprise a single passage of the sample and/or of the different solution(s) through the porous monolith.
  • the sample and/or the solution(s) preferentially crosses the porous monolith over its entire length.
  • the duct is then preferentially open on either side of the porous monolith or has a free space downstream of the porous monolith.
  • the method may include passing the sample and/or the different solution(s) through the porous monolith more than once over part of its length or over its entire length.
  • the sample and/or the different solution(s) can thus make one round trip or more through a portion or all of the porous monolith. This is particularly the case when the porous monolith is at the bottom of a closed conduit.
  • the passage of the sample and/or of the different solution(s) through the porous monolith is forced in particular by controlling the pressure in the fluid conduit or by any other means, in particular by applying a strength centrifugal.
  • the passage of the sample and/or of the different solution(s) through the porous monolith can be done by gravity.
  • the method may include agitation of the fluid conduit to allow the circulation of the solution and/or of the sample present in the porous monolith at each of the stages of passage of a solution through the porous monolith mentioned above.
  • the method can be a method of extracting free N-glycans or oligosaccharides from a biological sample.
  • the sample which passes through the porous monolith comprises free N-glycans or oligosaccharides and the porous monolith is configured to adsorb these species contained in the sample during the passage of the latter through the porous monolith.
  • the method may include the preparation of the sample prior to the extraction, in particular to release the N-glycans or the oligosaccharides into the sample.
  • the sample can be prepared prior to the extraction according to the method described in the article by Sophie Cholet, et al. N-glycomics and N-glycoproteomics of human cerebrospinal fluid. Current Proteomic Approaches Applied to Brain Function, 127, Humana Press, 360 p., 2017, Neuromethods, 978-1-4939-7119-0 978-1-4939-7118-3.
  • the preparation of the sample may include the following steps, in particular as described in the aforementioned article: the release of the N-glycans by denaturation of the glycoproteins followed by enzymatic deglycosylation of the proteins and the conversion into glycans of the residual glycosylamines in the solution obtained after protein deglycosylation, the derivation by permethylation as described in the aforementioned article by Sophie Cholet et al or better still by ethyl esterification of the sialic acids of the N-glycans of the solution obtained after deglycosylation, as described in the Reiding article and al, Anal. Chem. 86, 5784-5793 (2014) High-Throughput Profiling of Protein N Glycosylation by MALDI-TOF-MS Employing Linkage-Specific Sialic Acid Esterification.
  • the method may include the addition of a polar solvent to the sample, in particular an aqueous polar solvent of 80% acetonitrile, prior to passing the sample through the porous monolith.
  • the method may include recycling the porous material by heat treatment.
  • the heat treatment can be done while keeping the porous monolith in the fluid conduit.
  • the recycling heat treatment takes place after the extraction of the porous monolith from the fluid conduit.
  • the heat treatment can be done by heating the porous monolith to a temperature greater than or equal to 100°C, better still greater than or equal to 150°C, even better still greater than or equal to 200°C for a time greater than or equal to 0, 5h, better still greater than or equal to Ih.
  • the method may include the reuse after recycling of the porous monolith.
  • the invention also relates, according to another aspect, to a process for integrating a self-supporting porous monolith into a heat-shrinkable conduit, in particular made of polymer, comprising:
  • Such an encapsulation process makes it possible to encapsulate all sizes of porous monolith without damaging it, in particular porous monoliths less than 3 mm in diameter.
  • the porous monolith has a greater dimension transverse to the duct of less than or equal to 3 mm, better still 2 mm, even better still 1.5 mm.
  • a subject of the invention is also a process for the extraction on a solid phase of one or more compounds of interest from a liquid sample comprising: the integration of a self-supporting porous monolith in a fluid conduit such, according to the aspect of the previous invention, at least one passage of the sample through the porous monolith in the fluid conduit.
  • the invention also relates to a method for the glycomic analysis of a sample containing N-glycans comprising:
  • FIG 1 schematically represents an example of an extraction device making it possible to implement the extraction method according to the invention
  • FIG 2 is a section along II-II of the entire duct and the porous monolith integrated into the duct of figure 1,
  • FIG 3 is a view of a detail according to III of figure 2,
  • FIG 4 represents a process for manufacturing a porous monolith allowing the implementation of the process according to the invention
  • FIG 5 represents different steps of a solid phase extraction process according to the invention
  • FIG 6 represents the stage of recovery of the eluting solution at the outlet of the conduit after the implementation of the extraction process
  • FIG 7 represents a variant of the solid phase extraction process
  • FIG 8 represents a variant of an extraction device
  • FIG 9 represents a variant of the solid phase extraction process
  • FIG 10 represents a variant of an extraction device
  • FIG 11 represents a variant of an extraction device
  • FIG 12 represents the spectrum of the N-glycans obtained from a human plasma resulting from an elution fraction at the conduit outlet after implementation of the method according to the invention for mass to charge ratios (m/ z) identified molecules between 1000 and 5000 Da,
  • FIG 13 represents the spectrum of the N-glycans of figure 6 for m/z ratios between 1100 and 2000 Da,
  • FIG 14 represents the spectrum of the N-glycans of figure 6 for m/z ratios between 2000 and 3500 Da
  • FIG 15 represents the spectrum of the N-glycans of figure 6 for m/z ratios between 3400 and 4500 Da, and
  • FIG 16 represents two spectra obtained for the same extraction process according to the invention on the same sample before and after recycling of the porous monolith.
  • FIG. 1 a device 10 for the implementation of an extraction method according to the invention.
  • the device 10 comprises a porous monolith 20 integrated in a fluid conduit 30 so that any liquid passing through the fluid conduit right through the porous monolith 20 passes through the porous monolith 20, the latter acting as a filter in the conduit 30 .
  • the conduit is connected at one of its ends to a supply member 40 of the liquid conduit which can be removably connected to a liquid reservoir 50.
  • the supply member 40 can also be connected to a pressure controller allowing to control the pressure in the fluid conduit and to control the fluid circulation in the latter.
  • the other end of the duct can be free.
  • the invention is however not limited at one free end. The latter could be connected to a needle-type liquid dispensing member.
  • Such a free end makes it possible to deposit the circulating solution at the outlet on an extraction support 60, in particular in a container, an analysis well, or a MALDI plate, in particular in view of its analysis by an ancillary device such as a MALDI-TOF, or in a container 62, in particular an elimination container to recover the various solutions to be eliminated during the process.
  • the porous monolith 20 and conduit 30 are cylindrical in the illustrated embodiment. However, it could be otherwise.
  • the invention is not limited to a particular shape even if the cylindrical shape is preferred.
  • the porous monolith 20 has a hierarchical porosity exhibiting macropores and mesopores, and has a diameter less than or equal to 3 mm, here substantially equal to 1 mm.
  • Figure 4 illustrates the different steps of an example of the porous monolith manufacturing process.
  • the method comprises a first step, not illustrated, of forming an aqueous solution of a pore-forming agent and of a sol-gel precursor and of possible additives, in particular an acid and/or an agent for dissolving the matrix.
  • the pore-forming agent may be chosen from water-soluble polymers, in particular polyethylene glycol (PEG), poly(acrylic acid), sodium poly(styrene sulfonate) acid, poly(ethylene imine).
  • PEG polyethylene glycol
  • poly(acrylic acid) poly(acrylic acid)
  • sodium poly(styrene sulfonate) acid poly(ethylene imine).
  • the water-soluble polymer(s) may have a molecular weight of between 1,000 and 100,000 Dalton, preferably between 5,000 and 50,000 Dalton, even better between 5,000 and 30,000 Dalton.
  • the concentration of pore-forming agent, in particular of PEG can be between 0.015 g and 0.35 g per mL of sol, preferably between 0.02 and 0.2 g per mL of sol.
  • concentration of sol-gel precursor in particular of tetramethoxysilanes (TMOS)
  • TMOS tetramethoxysilanes
  • concentration of sol-gel precursor in particular of tetramethoxysilanes (TMOS)
  • TMOS tetramethoxys
  • the sol-gel precursor can be chosen from alkoxides, in particular hydrolyzable and condensable organometallics, in particular zirconium alkoxides, in particular zirconium butoxide (TBOZ), zirconium propoxide (TPOZ), alkoxides of titanium, niobium, vanadium, yttrium, cerium, aluminum or silicon, in particular tetramethoxysilane (TMOS), tetraethoxy silane (TEOS), tetrapropoxysilane (TPOS), tetrabutoxysilane (TBOS), trimethoxysilane, in particular methyltrimethoxysilane (MTMOS ), propyltrimethoxy silane (PTMOS,) and ethyltrimethoxy silane (ETMOS), triethoxysilanes, including methyltriethoxy silane (MTE), methyltrimethoxy silane (MTE), propyltrimethoxy
  • the proportion of pore-forming agent in the soil and the proportion of sol-gel precursor in the soil are predetermined according to the characteristics, in particular the total porosity and the average size of the macropores, of a sampling of known sol-gel matrices taken just after gelation.
  • the solution is then stirred for a predetermined period of between 5 min and 3 h, even better between 15 min and 2 h, at a controlled temperature that is substantially constant between 0° C. and 90° C., better still between 0° C. and 50° C. .
  • This agitation step initiates the sol-gel process to form a sol 5 before phase separation.
  • Soil 5 is then added in step 2 to a container 12 to at least partially fill said container 12 and at least one mold 15 contained in enclosure 12.
  • the mold 15 can be positioned in the enclosure which is gradually filled with the soil 5 in such a way that the mold 15 is gradually filled without the presence of air bubbles or chemical composition gradient.
  • the filling can be done until the mold is completely immersed 15. Partial immersion is also possible.
  • the addition of the mold in the soil 5 contained in the enclosure 12 is also possible.
  • the enclosure 12 can be configured to contain a plurality of identical or different molds 15 .
  • Enclosure 12 may be cylindrical as shown or have any other shape.
  • the enclosure 12 can be made of plastic, in particular PTFE, PP, PE, PC, PET, PVC, or glass or stainless steel.
  • the mold or molds 15 have two openings 17 and 18 on opposite surfaces of the mold 15, at least one of the two openings 17 extending below ground level after filling. Such openings allow the filling of the mold(s) 15 by filling the enclosure 12 containing the mold(s) 15 or by at least partial immersion of the mold(s) 15 in the soil 5 contained in the enclosure 12 and the circulation of the soil 5 between the inside and the outside of the mold or molds before total condensation of the latter.
  • the mold(s) 15 are in the form of tubes open at both ends and extend vertically into the enclosure 12, but it could be quite otherwise, the tube could be oriented in the enclosure differently. and/or the mold could have another shape.
  • the mold or molds 15 can be entirely contained in the enclosure 12, as illustrated, or protrude from the latter. In the first case, the mold(s) 15 may or may not be completely immersed in the ground 5 after filling.
  • the mold or molds 15 may be made of plastic, in particular of PTFE, PEEK, FEP, PE, PP, or polylactic acid or of glass or stainless steel, in particular of fused silica or borosilicate.
  • the mold(s) may be in a porous body.
  • the mold(s) can be formed by 3D printing or casting.
  • the largest transverse dimension of the cavity of the mold or molds 15, in particular the diameter d of this cavity, can be between 13 mm and 0.025 mm.
  • step 3 the condensation is carried out in step 3 in the whole of the enclosure and the mould.
  • This sol-gel transition can be followed by at least partial maturation (or aging) of the whole. This step ensures the formation of homogeneous macropores of a similar nature in the sol-gel matrix formed 22, regardless of its shape and size.
  • the temperature can be kept substantially constant, in particular between 15° and 90° C., preferably 25 and 70° C., for a period of between 10 min and 4 h.
  • the duration of the condensation and the predetermined temperature depend on the internal structure of the desired sol-gel matrix and the duration of the agitation of the initial solution in the step of formation of the sol.
  • At least partial aging can last between 30 minutes and 2 weeks, in particular less than 72 hours at room temperature.
  • the aging time is short enough to avoid the formation of mesopores and/or micropores.
  • a block 22 of sol-gel matrix containing the mold 15 is then extracted from the enclosure 12 in step 4.
  • this step can be optional as we will see by the following.
  • the mold 15 with the sol-gel matrix 25 that it contains is then extracted from the porous solid in step 5, for example by cutting flush with the mold the sol-gel matrix of the block 22 then by removing the mold 15 with the matrix sol-gel 25 that it contains, or else by breaking the sol-gel matrix of the block 22 around the mold 15.
  • the immersion was partial, it is possible to directly withdraw the mold 15 with the sol-gel matrix gel 25 that it contains from the block previously extracted or directly from enclosure 12.
  • the sol-gel matrix 25 is extracted from the mold 15 in step 6. This is achieved by means of a controlled pressure exerted on the sol-gel matrix 25 while maintaining the mold 15.
  • the pressure can be obtained either with a solid made of plastic, glass, such as a fused silica capillary for example, or any other material that is fairly robust and of smaller size than the mold 15, or with a gas at a controlled flow rate.
  • the extraction operation can be facilitated by immersing the mold 15 and sol-gel matrix 25 assembly in a liquid. It is possibly possible to generate a slight pressure difference by gently tapping the mold 15 and sol-gel matrix 25 assembly to extract the sol-gel matrix 25.
  • the method may include a step of controlled generation of the mesoporosity.
  • This step can be done by immersing the sol-gel matrix 25 or the mold-sol-gel matrix assembly in a basic solution, for example an IM ammonium hydroxide solution, or by heating the material in water in the presence of a precursor, for example urea to generate ammonia in situ.
  • a basic solution for example an IM ammonium hydroxide solution
  • a precursor for example urea to generate ammonia in situ.
  • ammonium hydroxide it is possible to add ammonium hydroxide.
  • This operation can last lasts between 0.5h and 50h at a substantially constant predetermined temperature of the sol-gel matrix comprised between 30°C and 150°C.
  • This step can be performed on several sol-gel matrices simultaneously, ie in the same bath, from the same block or not.
  • the size of the pores obtained is less than or equal to 50 nm, better still between 2 and 50 nm.
  • the sol-gel matrix obtained is then dried. To do this, it is placed in a closed container, in particular an autoclave, to be dried in critical or supercritical conditions, in particular under a flow of air or inert gas, in particular dinitrogen (N2) for a period of between 10 and 20 hours. . They are then subjected to a ramp of 0.5°C/min up to 350°C with a plateau of a few hours at this last temperature and under a flow of inert gas (other gases can be used).
  • the porous monolith obtained preferably comprises macropores, i.e. having a chosen dimension greater than or equal to 50 nm, and mesopores, i.e. having a chosen dimension comprised between 2 and 50 nm.
  • H is preferably of substantially homogeneous structure throughout its volume, as can be seen in Figure 3.
  • the porous monolith(s) may have an aspect ratio, defined as its height over its largest transverse dimension, of between 0.2 and 100.
  • the method may include modifications of the porous monolith post-manufacturing, in particular the functionalization of the internal surfaces of the porous monolith.
  • the functionalization can be carried out according to liquid-phase or gas-phase processes, using organosilanes, in particular chlorosilanes (e.g. octadecyltrichlorosilane) and alkoxysilanes (octadecyltriethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, propyltrimethoxysilane), or even hexadimethylsilazane.
  • organosilanes in particular chlorosilanes (e.g. octadecyltrichlorosilane) and alkoxysilanes (octadecyltriethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, propyltrimethoxysilane), or even hexadimethylsilazan
  • the mold(s) may have only one opening. The latter opens in the ground after filling to allow the circulation of the ground between the mold and the enclosure.
  • the initial solution can be an emulsion or a templating solution containing sol-gel precursors.
  • the porous monolith 20 obtained by this treatment is self-supporting and can be integrated into the heat-shrink pipe 30.
  • the fluid conduit is semi-rigid and heat-shrinkable. It has, before shrinkage, an internal diameter greater than the external diameter of the porous monolith and after shrinkage an internal diameter smaller than the external diameter of the porous monolith.
  • the minimum diameter of the conduit is strictly less than the diameter of the porous monolith. It can be between 95% and 85% of the diameter of the porous monolith.
  • the porous monolith is integrated into the duct by insertion into the duct before shrinking and then heating the duct to a temperature depending on the heat-shrinkable material, in particular greater than or equal to 70° C., so that the duct retracts on the porous monolith without the damage to a narrowing of its diameter such that the porous monolith is firmly encapsulated and any liquid solution which passes through the conduit passes through the porous monolith, that is to say without space between the internal wall of the conduit and the outer wall of the porous monolith, as seen in Figures 2 and 3.
  • the process involves the passage through the porous monolith of different successive solutions allowing the extraction of the compounds of interest. All of the successive solutions can be inserted beforehand at the head of the conduit, i.e. upstream of the porous monolith.
  • the extraction process may first comprise a conditioning step by passing a conditioning solution 200 through the porous monolith 20. It makes it possible to prepare the porous monolith for the adsorption of the compounds of interest by impregnating it of a solution of polarity close to that of the sample.
  • the conditioning solution 200 can be an aqueous solution of acetonitrile, for example at 80% by mass in acetonitrile. The conditioning solution is removed at the outlet.
  • the sample 300 is then passed through the porous monolith 20.
  • the compounds of interest present in the latter adsorb to the surfaces of the porous monolith due to their greater affinity for the surfaces than for the solvent of the sample.
  • Sample 300 can be passed once through the porous monolith. As a variant, it is possible to make it pass several times by making it go back and forth through the porous monolith 20. The sample liquid remaining at the outlet can be eliminated.
  • the porous monolith 20 is then washed with a washing solution 400 for which the compounds of interest have a lower affinity than for the walls of the porous monolith 20.
  • the washing solution 400 can be an aqueous solution of acetonitrile at 95% en masse. The washing solution 400 is eliminated at the outlet of the porous monolith.
  • a succession of successive eluting solution fractions 500 are driven through the porous monolith.
  • Each fraction of eluting solution is collected at the outlet of the porous monolith on spots or in different 520 wells of an analysis plate.
  • the eluting solution is a solution for which the compounds of interest have more affinities, in particular pure water, so that the compounds of interest are entrained in the fractions of eluting solution.
  • the different fractions of eluting solution are recovered at the outlet to be analyzed. Analysis of the composition of the different fractions of eluting solution makes it possible to deduce the proportion of compounds of interest in the initial sample.
  • the analysis is done for example by MALDI-TOF, LC-FLUO or CE-LIF, especially in the case of N-glycans.
  • the porous monolith 20 is encapsulated in a heat-shrink conduit 30 of non-cylindrical shape, in particular of conical shape.
  • the passage of the different solutions, in particular the conditioning solution 200, the sample 300, the washing solution 400 and the eluting solution 500 can be done through the porous monolith by one or more stages of suction then discharge, as is illustrated by the double arrow at each step in FIG. 7.
  • the different solutions therefore pass at least twice through the porous monolith 20 in one direction and then in the other.
  • the solutions to be eliminated are collected in disposal containers 62 and the solutions to be analyzed are collected in a container or analysis well or deposited directly on a MALDI 60 analysis plate.
  • the fluid conduit 30 after encapsulation of the porous monolith is inserted into a solid phase extraction cartridge 80, in particular of the syringe body type.
  • the different solutions are then recovered after passing through the porous monolith through the outlet nozzle 82 of the extraction cartridge 80.
  • Such an extraction cartridge can be used as described above or as described below.
  • the passage of the solutions 200, 300, 400 and 500 through the porous monolith 20 can be forced by centrifugation.
  • the porous monolith 20 can be integrated into an extraction cartridge, the upper end of which can be closed by a cap 84.
  • the conditioning solution 200 and added to the extraction cartridge 80 upstream of the porous monolith 20 and the cartridge 80 is closed with the cap 84.
  • the cartridge is placed above a disposal container 62.
  • the assembly formed by the container 62 and the cartridge 80 is centrifuged so as to pass the conditioning solution to the through porous monolith 20 and collecting it in container 62.
  • Sample 300 and wash solution are passed through porous monolith 20 and collected in the same container or another container 62 in the same manner.
  • the cartridge is then inserted into an extraction vessel 60 to recover the eluate by passing the eluent solution 500 through the porous monolith in the same manner.
  • a multi-well system 900 comprising a vacuum base 910, receiving a container or a multi-well plate 60, on which is mounted an extraction plate 920.
  • the extraction plate 920 comprises an array of extraction cartridges 80 in which the porous monoliths are embedded.
  • This plate 920 is placed, depending on the step of the process, on a disposal container 62 not shown to recover the solutions to be removed or on a multi-well plate 60 having one extraction well 520 per extraction cartridge to recover the eluate output from each cartridge.
  • the passage of the different solutions through the porous monolith can be forced using an air suction pump in the 910 vacuum base. Such a system allows several extractions to be carried out simultaneously.
  • the extraction can be carried out by solid phase extraction.
  • the porous monolith can be integrated into a fluid conduit closed at its end, here a container, in particular of the Eppendorf® tube type.
  • the porous monolith may extend to the bottom of the container and be fixed to the bottom of the container.
  • the various solutions are then added to the container containing the porous monolith.
  • the tube is stirred to accelerate the exchanges between the solutions and the porous monolith.
  • the solutions are then extracted from the container, in particular by turning the latter over or by pipetting.
  • N-glycomic analysis of a human plasma sample is detailed.
  • a self-supporting monolith of about 800 pm in diameter, having macropores of about 2 pm and mesopores of about 15 nm generated by immersion in a basic solution is fabricated.
  • a solution is prepared by mixing 0.33 g of PEG with 2 mL of TMOS in 4 mL of 0.01 M acetic acid. The solution is stirred at 0°C for 30 min to form a sol and then transferred to a glass container.
  • polypropylene (PP) in which a PTFE tube of about 1 mm in diameter has been previously positioned vertically. The filling is carried out by gradually adding the soil to the enclosure starting from the lowest point using a micropipette. The quantity of solution added is such that the mold is totally immersed.
  • the chamber is placed at a temperature of 40°C, and gelation occurs between 45 and 50 min after transfer to the chamber. After gelation has taken place, the gel is left to age for 24 hours at 40°C. Then, the sol-gel matrix resulting from gelation and maturation is extracted from the enclosure and broken with metal pliers to recover the mold that has been incorporated therein. The monolithic sol-gel matrix encapsulated in the mold is then extracted using manual pressure exerted by a tube with a diameter of less than 1 mm. For this protocol, this pressure by a solid tube is sufficient to carry out the extraction of the monolith and does not weaken the gel.
  • the sol-gel matrix obtained is quickly immersed in a solution of NH4OH IM, respecting a ratio of approximately 5 between the volumes of basic solution and the volume occupied by the sol-gel matrix.
  • the matrix obtained is then placed in an autoclave.
  • the latter is placed in an oven and connected by tubes that allow gas circulation.
  • the gel is then dried for 12 hours under N2. Finally, a heat treatment is carried out with a ramp of 0.5°C/min up to 350°C and a plateau of 2 hours at this last temperature.
  • the 0.8 mm diameter monolith is placed in a heat-shrinkable PTFE tube with an internal diameter before shrinkage of 1.27 mm.
  • the tube is at least 10 cm long.
  • the assembly is then subjected to a localized temperature increase at the point where the monolith is positioned, using a heating gun set to a temperature of 500°C.
  • the heat is manually distributed over the tube by a steady movement of the gun nozzle and shrinkage occurs as it goes to encapsulate the monolith. Tube shrinkage is checked visually.
  • the diameter of PTFE after removal is less than 0.7 mm. This step can also be carried out in an oven at a temperature of 350°C for at least 10 min.
  • the tube containing the encapsulated porous monolith is ready for use. It is then connected to a pressure controller via a reservoir connector in which four containers can be placed, one for each solution (conditioning / sample / washing / elution).
  • the fluids introduced into a garbage container are recovered (the first three stages) and the eluates (last stage) are, for their part, deposited directly on a MALDI plate.
  • 34 pL of diluted plasma (containing 5 pL of collected plasma) are added to 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.4 (10 pL) and 10 mM dithiothreitol (5 pL) before denaturing the plasma glycoproteins by heating to 95° C for 5 minutes. After cooling to room temperature, 2 ⁇ L of a PNGase F solution (1 U/ ⁇ L) are added and protein deglycosylation is carried out overnight (approximately 16 hours) at 37°C. Residual glycosylamines are converted into glycans by incubation with 5 ⁇ L of 1 mol/L hydrochloric acid for 45 minutes at 37°C.
  • a 0.25 M EDC/0.25 M HOBt mixture is prepared in ethanol as an activating agent to carry out ethyl esterification reactions, which induce the esterification of ⁇ 2,3-linked sialic acids and the lactonization of 2,6-linked sialic acids.
  • Derivation is performed by adding 3 pL of previously released N-glycan sample (equivalent to 0.3 pL of human plasma respectively) to 20 pL of esterification reagent respectively, followed by incubation with shaking at 350 rpm for 1h30 at 37°C. After that, 50 ⁇ L of 80% ACN is added to form the extraction sample, 10 minutes before proceeding to N-glycan extraction with the silica monolith and MALDI-TOF-MS analysis.
  • the solutions are loaded into a container and directed by positive pressure using a pressure controller into the PTFE tube containing the material. It is also possible to proceed in negative pressure with the pressure controller. Positive and negative pressures can also be applied with syringe pumps, or even manually. It is also possible with this device to carry out suction-discharge cycles to carry out the purification.
  • the PTFE-encapsulated monolith is conditioned and equilibrated with 3 x 1 mL of pure water followed by 3 x 1 mL of 80% aqueous ACN. Next, the 73 pL of the extraction sample is loaded, then washed with 20 pL of 95% ACN. Finally, the N-glycans are eluted in 10 successive fractions of 1 pL of pure water. Each fraction is deposited directly using the device on the MALDI plate. Note that in the protocol, no trifluoroacetic acid is used.
  • 1 pL of the 2,5-DHB matrix solution (2,5-dihydroxybenzoic acid, 10 mg/mL in 50% methanol) is added and mixed with each of the 1 pL fractions deposited during the direct elution on the plaque. After a first crystallization, 0.2 ⁇ l of ethanol are deposited to recrystallize and improve the reproducibility results during the analyses.
  • each spot of the MALDI plate is analyzed with a MALDI-TOF/TOF instrument, in particular the UltrafleXtreme from Bruker equipped with a laser, in particular the Smartbeam-II from Bruker.
  • the mass spectrometry spectra were acquired at a laser repetition frequency of 2 kHz in positive mode, with an acceleration voltage of 20 kV and an extraction delay of 130 ns. Spectra are obtained by accumulating 5,000 shots over mass windows of 1100 to 5000 Da for plasma N-glycans, and 500 to 5000 Da for samples of free human milk oligosaccharides (HMO, see Example 2).
  • N-glycan profiles on fractions 2 to 4 were obtained by mass spectrometry with an optimal spectrum obtained for the third fraction.
  • H5N4E2 (m/z 2301), H5N4E1 (m/z 1982), H5N4E1L1 (m/z 2255), H6N5E2L1 (m/z 2940), H5N4F1E1 (m/z 2128), H5N4F1E2 (m/z 2447), H6N5F1E2L1 (m/z 3086) or even H6N5E2L1 (m/z 2986).
  • a cylindrical self-supporting porous monolith with a diameter of 5 mm and a length of 9 mm was fabricated by the same process as described in Example 1. It was embedded in a PTFE heat-shrinkable tube of greater length than 9 mm by the integration method of Example 1 and then placed in an SPE-type cartridge, as shown in Figure 8.
  • the SPE cartridge containing the encapsulated porous monolith is ready to be used for extraction.
  • the SPE cartridge is placed under vacuum at -0.2 bar.
  • the SPE cartridge containing the monoliths is conditioned and equilibrated successively three times with 1 mL of water, then three times with 1 mL of 80% ACN. Then, the samples were loaded and washed 12 times with 200 ⁇ L of 95% ACN. Finally, the elution of the free milk oligosaccharides (HMO) is carried out with 200 pL of FLO in a 2 mL tube before being dried under a stream of nitrogen and analyzed by mass spectrometry. The spectrum obtained is shown in Figure 16, spectrum a.
  • the cartridge is removed.
  • the porous monolith and the PTFE are heat treated under a stream of nitrogen at an initial temperature of 40° C. followed by a ramp of 210 minutes up to a final temperature of 250° C. for two hours. Then, the treated part is recovered and replaced in the cartridge and then the previous extraction protocol is used again.
  • the conditioning and elution fractions were collected and analyzed by mass spectrometry.
  • the porous monolith has a shape other than those described.
  • the fluidic device can be other than as described, in particular the control of the pressure can be done differently.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'extraction et/ou de séparation sur phase solide d'un ou plusieurs composés d'intérêt d'un échantillon liquide comportant : • - l'intégration d'un monolithe poreux autoporté (20) dans un conduit fluidique (30) de sorte que le monolithe poreux autoporté (20) soit fixe dans le conduit fluidique (30) durant ledit procédé et forme un filtre dans le conduit fluidique, • - au moins un passage de l'échantillon (300) au travers du monolithe poreux dans le conduit fluidique (30) sur au moins une portion du monolithe poreux (20), le monolithe poreux autoporté (20) ayant une plus grande dimension transversale au conduit fluidique (20) inférieure ou égale à 3 mm, le conduit fluidique présentant une ou des extrémités ouvertes avant intégration, la ou au moins une des extrémités restant ouvertes durant l'étape d'intégration du monolithe poreux.

Description

Description
Titre : Procédé d’extraction sur phase solide à l’aide d’un monolithe poreux
La présente invention concerne un procédé d’extraction sur phase solide d’un ou plusieurs composés d’intérêt à l’aide d’un monolithe poreux intégré dans un conduit fluidique. L’invention a également trait à un procédé d’intégration d’un monolithe poreux dans un tube en un matériau thermorétractable.
Domaine technique
L’extraction d’un ou plusieurs composés d’intérêt à partir d’un mélange complexe est essentielle pour une utilisation ultérieure, notamment pour permettre leur identification et/ou leur quantification. La qualité de l’extraction du ou des composés d’intérêt influe beaucoup sur la qualité des résultats obtenus ultérieurement.
H existe actuellement plusieurs méthodes pour extraire les composés d’intérêt.
Un moyen pratique et efficace d’effectuer une extraction consiste à faire circuler une solution contenant les molécules d’intérêt au travers d’une phase solide. Pour cela il est nécessaire d’avoir un circuit fluidique incorporant un matériau poreux de section parfaitement adaptée au conduit dans lequel il est intégré et fixe pour garantir que la solution circulant dans le circuit traverse inévitablement le matériau poreux.
Parmi les matériaux pouvant être utilisés comme phase solide pour l’extraction, les monolithes poreux, notamment ceux à porosité hiérarchique (HPM), présentent des avantages tels qu’une bonne perméabilité, une porosité et une chimie de surface ajustable. La réalisation de dispositifs pour l’extraction d’un format miniaturisé est un défi.
Comme cela est décrit dans les articles de Nema et al, Talanta 82 (2010) 488- 494 Application of silica-based monolith as solid phase extraction cartridge for extracting polar compounds from urine, Ma, X., Zhao, M., Zhao, F. et al. Application of silica-based monolith as solid-phase extraction sorbent for extracting toxaphene congeners in soil. J Sol- Gel Sci Technol 80, 87-95 (2016) et Jorge C. Masini, et al., Porous monolithic materials for extraction and preconcentration of pollutants from environmental waters, Trends in Environmental Analytical Chemistry, Volume 29, 2021, e00112, ISSN 2214-1588, une méthode pour intégrer un HPM dans un circuit fluidique consiste à l’encastrer dans le corps d’une seringue, notamment par insertion en force. Ceci n’est réalisable que pour des HPM présentant une résistance suffisante aux contraintes d’encastrement manuel, notamment présentant plusieurs millimètres de large. Comme cela est décrit dans la demande JP2OO3166983, une autre méthode pour encapsuler un HPM en vue d’une utilisation de SPE ou de chromatographie consiste à utiliser un tube thermorétractable qui, lorsqu’on le chauffe à 100°C pendant 10 minutes, se rétracte sur le HPM pour l’encapsuler et le maintenir en position. Cette méthode est utilisée communément pour encapsuler des monolithes poreux de plusieurs mm de large. Cependant, pour des monolithes poreux de petit diamètre, notamment de diamètre inférieur ou égal à 2 mm, il est établi, notamment dans le brevet US 7 291 383, que l’encapsulation telle que décrit dans la demande de brevet japonaise précitée ne permet pas de garder à la fois l’intégrité du HPM et l’étanchéité de l’intégration.
De tels dispositifs d’extraction avec des HPM de grandes largeurs requièrent de faire circuler plusieurs fois plusieurs centaines de microlitres sur le HPM. Ils fonctionnent avec des débits obtenus par la création d’un vide d’air en sortie de dispositif ou bien par centrifugation. Ils sont donc peu modulables et difficiles à contrôler précisément. De plus, ils ne sont pas toujours compatibles avec les contraintes de certains domaines, notamment les domaines dits -omiques incluant la protéomique, la métabolomique ou la glycomique, en termes de quantité réduite des échantillons, de volume faible des échantillons à analyser et de rapidité requise.
Une solution proposée pour miniaturiser de tels systèmes, notamment par le brevet US 7 291 383 et l’article de Jorge C. Masini, et al., Porous monolithic materials for extraction and preconcentration of pollutants from environmental waters, Trends in Environmental Analytical Chemistry, Volume 29, 2021, e00112, ISSN 2214-1588 est de former in situ l’HPM dans un capillaire de moins de 1 mm de diamètre interne. Dans les capillaires obtenus, des gradients de porosité existent, comme montré notamment dans l’article de Bruns, S., Milliner, T., Kollmann, M., Schachtner, J., Hôltzel, A., & Tallarek, U. (2010). Confocal laser scanning microscopy method for quantitative characterization of silica monolith morphology. Analytical chemistry, 82(15), 6569-6575, ce qui nuit à la reproductibilité, et les images en microscopie électronique à balayage montrent d’une part bien souvent que l’ancrage des HPM dans les capillaires est incomplet, libérant des espaces interstitiels qui peuvent nuire à la reproductibilité, voire à la qualité de l’extraction en créant des chemins préférentiels et d’autre part, que pour une même formulation, la structure n’est pas similaire lorsque le diamètre du capillaire varie, ce qui implique que des modifications majeures soient faites sur les compositions initiales mais également sur les étapes du procédé par rapport à ce qui se fait pour les monolithes autoportés plus grands pour limiter notamment les effets de bords au niveau de la paroi du capillaire, ce qui rend longue et complexe la préparation de tels capillaires et entraîne des variations de structure.
La demande internationale WO 2005/072164 décrit un monolithe intégré dans un tube en polyéthylène par insertion du monolithe dans le tube, puis l’ensemble est chauffé jusqu’à ce que le tube soit dans un état de fusion et vienne encapsuler le monolithe, et enfin les extrémités sont découpées pour permettre la circulation de fluide dans le monolithe poreux. La demande internationale WO 2008/112702 décrit un système comportant un monolithe poreux intégré dans un support par chauffage du support pour le rétracter sur le substrat poreux. Ce document décrit plus particulièrement un monolithe poreux de 1.2 mm de diamètre inséré dans un tube de verre borosilicate ayant un diamètre interne de 1.8 mm et le chauffage de l’ensemble à une température de 850°C pour faire fondre le verre et le rétracter sur le monolithe, puis la découpe de l’ensemble pour obtenir des pièces utilisables en chromatographie. Le fait de mettre les tubes en état de fusion induit que le matériau en fusion va pénétrer dans les pores du monolithe poreux sur toute la surface de ce dernier. Il est donc nécessaire de recouper l’ensemble pour permettre l’accès à la partie poreuse du monolithe. Une telle découpe rend l’utilisation de l’ensemble plus complexe, notamment en termes de connexion et peut endommager le monolithe poreux, notamment dans le cas d’un monolithe de faible diamètre. De plus, la pénétration du matériau du tube dans les pores du monolithe rend l’utilisation de monolithe de diamètre faible compliqué au risque de remplir l’ensemble des pores du monolithe lors de la fusion du matériau du tube et de boucher ainsi le monolithe poreux.
H existe donc un besoin de disposer d’un procédé d’extraction de composés d’intérêt d’échantillons de volumes réduits qui soit à la fois simple, rapide, efficace et reproductible.
Exposé de l’invention
L’invention répond à ce besoin à l’aide d’un procédé d’extraction sur phase solide d’un ou plusieurs composés d’intérêt d’un échantillon liquide comportant : l’intégration d’un monolithe poreux autoporté dans un conduit fluidique de sorte que le monolithe poreux autoporté soit fixe dans le système fluidique durant ledit procédé et forme un filtre dans le système fluidique, au moins un passage de l’échantillon au travers du monolithe poreux dans le conduit fluidique sur au moins une portion du monolithe poreux, le monolithe poreux autoporté ayant une plus grande dimension transversale au conduit inférieure ou égale à 3 mm.
Par «forme un filtre », on comprend que tout liquide traversant le conduit fluidique passe au travers du monolithe poreux sur au moins une partie de sa longueur, notamment sur toute sa longueur, la longueur étant définie comme la plus grande dimension selon l’axe du conduit fluidique. Le fait que le monolithe poreux soit d’une dimension inférieure ou égale à 3 mm permet de pouvoir traiter des échantillons de très faibles volumes, ce qui est particulièrement intéressant dans certains domaines mais également permet d’avoir un traitement rapide et robuste. Cela permet également d’optimiser l’analyse ultérieure des composés d’intérêt extraits en réduisant la nécessité d’une préconcentration de ces derniers avant leur analyse.
L’utilisation d’un monolithe poreux permet d’avoir un dispositif ayant une très bonne efficacité d’extraction et qui soit polyvalent . Il est en effet facile d’adapter les caractéristiques de porosité et la chimie de surface du monolithe poreux au type d’extraction voulu.
Procédé de formation du monolithe
De préférence, le monolithe poreux est formé par un procédé sol-gel. Par « procédé sol- gel », on comprend un procédé mis en œuvre en utilisant comme précurseurs des alcoxy des de formule M(OR)n, R'-M(OR)n-l ou encore des silicates de sodium ou des colloïdes de titane, M étant un métal, un métal de transition ou un métalloïde, notamment le silicium, et R ou R' des groupements alkyles, n étant le degré d'oxydation du métal. En présence d'eau, l'hydrolyse des groupements alkoxy (OR) intervient, formant de petites particules de taille généralement inférieure à 1 nanomètre. Ces particules s'agrègent et forment des amas qui restent en suspension sans précipiter, et forment le sol. L'augmentation des amas et leur condensation augmente la viscosité du milieu et forme ce qui est appelé le gel. Le gel peut alors continuer à évoluer pendant une phase de vieillissement pendant laquelle le réseau polymérique présent au sein du gel se densifie. Le gel se rétracte ensuite en évacuant le solvant en dehors du réseau polymérique formé, lors d’une étape appelée la synérèse. Puis le solvant s’évapore, lors d’une étape dite de séchage, ce qui conduit à un matériau solide de type verre poreux donnant un monolithe poreux. Les étapes de synérèse et de séchage peuvent être concomitantes. De préférence, le monolithe poreux autoporté est formé par un procédé de fabrication comportant : la formation d’un sol comportant un précurseur sol-gel en solution aqueuse et, de préférence, un agent porogène, le remplissage au moins partiel d’une enceinte et d’au moins un moule contenu dans l’enceinte en sol formé précédemment, le moule comportant au moins une ouverture s’ouvrant dans le sol après remplissage en sol, la formation d’une matrice sol-gel dans l’enceinte à partir du sol, l’extraction du moule avec la matrice sol-gel contenue dans le moule de l’enceinte, et l’extraction de la matrice sol-gel du moule, la formation d’un monolithe poreux à partir de la matrice sol-gel extraite du moule, la formation du sol, de la matrice sol-gel et du monolithe poreux se faisant par un procédé sol-gel.
La présence d’au moins une ouverture dans le moule sous le niveau de sol après remplissage permet le remplissage du moule par le sol durant l’étape de remplissage et la circulation fluidique du sol entre le sol contenu dans le moule et le sol contenu dans l’enceinte durant la suite du procédé. Le fait de réaliser une grande matrice sol-gel dans l’enceinte et d’en extraire une partie incluse dans un moule lors de la formation de la matrice permet de s’affranchir des effets de bord qui apparaissent dans les procédés décrits précédemment en réalisant la matrice sol-gel dans un récipient qui est toujours de même taille. Un tel procédé permet la fabrication de monolithes poreux autoportés aux propriétés texturales similaires sur une gamme étendue de diamètres sans avoir à réoptimiser, voire modifier, la formulation du mélange initial. Il permet également d’accéder à une grande variété de formes et rapports d’aspects des monolithes, mais également à des structures internes contrôlées variées et reproductibles. Les structures obtenues sont particulièrement uniformes et garantissent donc une homogénéité de résistance aux contraintes mécaniques. Ceci peut s’avérer utile par exemple pour éviter des cassures lorsqu’une pression est exercée sur le monolithe lors de son intégration dans le conduit fluidique, notamment lors de son encapsulation dans un conduit fluidique thermo-rétractable. Le sol peut être formé par agitation d’une solution comportant le précurseur sol- gel, de préférence le précurseur sol-gel et l’agent porogène, notamment pendant une durée supérieure ou égale à 5 min, mieux supérieure ou égale à 10 min, encore mieux supérieure ou égale à 15 min. La durée de l’agitation peut être inférieure ou égale à 3h, mieux inférieure ou égale à 2h. Durant l’agitation, la température peut être contrôlée à une valeur prédéterminée sensiblement constante, notamment comprise entre 0°C et 90°C, mieux entre 0°C et 50°C.
Le remplissage peut se faire sans présence de bulles d’air et/ou de gradients de composition chimique et/ou de température du sol dans l’enceinte et le ou les moules.
La formation de la matrice sol-gel peut comporter la condensation pour former un gel et optionnellement le vieillissement au moins partiel pour densifier le gel.
De préférence, la formation de la matrice sol-gel dans l’enceinte est dépourvue de séchage de la matrice sol-gel.
La formation de la matrice sol-gel peut se faire de la même manière dans l’enceinte et le moule. La porosité totale et la taille des pores sont préférentiellement sensiblement homogènes dans l’enceinte et le ou les moules.
L’extraction du moule avec la matrice qu’il contient de l’enceinte peut comporter une extraction d’un bloc de la matrice sol-gel contenant le moule de l’enceinte et l’extraction du moule et de la matrice sol-gel qu’il contient du bloc extrait précédemment. L’extraction du ou de chaque moule du bloc peut se faire par coupure de la matrice sol-gel à fleur du moule correspondant ou casse de la matrice sol-gel entourant le ou les moules. En variante, l’extraction du ou de chaque moule avec la matrice qu’il contient peut se faire par retrait du moule correspondant de la matrice sol-gel l’entourant après extraction du bloc tel que décrit précédemment ou directement dans l’enceinte sans extraction préalable du bloc, notamment lorsque le moule correspondant n’est que partiellement immergé dans la matrice sol-gel.
L’extraction de la matrice sol-gel contenue dans le ou chaque moule peut se faire au moyen d’une pression contrôlée sur ladite matrice sol-gel, par exemple par pression directe avec un solide de dimension inférieure au moule ou par pression d’un gaz à débit contrôlé ou par ouverture du ou de chaque moule, notamment par découpe du ou de chaque moule ou séparation de deux parties du ou de chaque moule entre elles. Le ou les moules peuvent être sous forme de deux parties mobiles entre elles, notamment séparables ou mobile l’une par rapport à l’autre par une charnière. Le moule contenant la matrice sol-gel peut être immergé dans un liquide lors de l’étape d’extraction de la matrice sol-gel contenue dans le moule. Ceci facilite l’extraction de la matrice sol-gel.
Le procédé de fabrication du monolithe poreux peut comporter une génération contrôlée de mésoporosité dans la matrice sol-gel pour former une matrice sol-gel à porosité hiérarchique après l’extraction du moule de l’enceinte, et avant la formation du monolithe poreux à partir de la matrice sol-gel du moule. La génération contrôlée de mésoporosité peut se faire par immersion de la matrice sol-gel extraite ou non du ou de chaque moule dans une solution aqueuse de génération de la mésoporosité comportant un agent de dissolution de la matrice sol-gel et/ou un précurseur d’agent de dissolution de la matrice sol-gel. L’agent de dissolution peut être de l’hydroxyde d’ammonium, par exemple à une concentration IM, de l’hydroxyde de sodium, ou de l’acide fluorhydrique ou leurs mélanges. Le précurseur d’agent de dissolution de la matrice sol-gel peut être de l’urée ou des composés portant des fonctions amides, notamment du formamide, de l’acétamide, du N-méthylformamide (NMF) et leurs mélanges. De préférence, la concentration en agent de dissolution et/ou en précurseur d’agent de dissolution est telle qu’elle permet la dissolution localisée de la ou des matrices sol-gel de sorte à former des mésopores dans cette ou ces dernières sans dissoudre globalement la ou les matrices sol-gel.
La formation du monolithe poreux peut comporter le vieillissement au moins partiel pour densifier la matrice sol-gel, notamment lorsque le vieillissement n’a pas eu lieu totalement avant.
La formation du monolithe poreux peut comporter un séchage de la matrice sol- gel extraite ou non du moule pour former une matrice sol-gel séchée, après la génération de mésopores le cas échéant. L’étape de séchage peut se faire sous flux d’air ou de gaz inerte, notamment de diazote, argon ou dioxyde de carbone, hélium, voire du dioxygène ou du dihydrogène.
La formation du monolithe poreux peut comporter un traitement thermique de la ou des matrice sol-gel extraite ou non du ou de chaque moule, notamment après le séchage. Le traitement thermique peut se faire dans un contenant fermé sous flux d’air ou de gaz inerte, notamment de diazote, argon ou dioxyde de carbone, hélium, voire du dioxygène ou du dihydrogène et par chauffage progressif suivi du maintien de la température finale pendant un temps prédéterminé. Le chauffage progressif peut être une augmentation de 0,5°C/min jusqu’à atteindre une température supérieure ou égale à 300°C, mieux supérieure ou égale à 340°C, par exemple sensiblement égale à 350°C, pour obtenir un monolithe poreux. La température finale peut être maintenue pendant plus de Ih. Ceci permet de stabiliser la structure du monolithe et d’éliminer les résidus organiques issus de la synthèse.
En variante, le monolithe poreux est formé directement dans un moule dans lequel le sol est inséré et est extrait de ce dernier, notamment par la méthode mentionnée précédemment.
Monolithe poreux
Le monolithe poreux peut comporter des macropores, notamment des macropores de dimension supérieure ou égale à 50 nm. Les macropores peuvent présenter une dimension inférieure ou égale à 30 pm. Le monolithe poreux peut comporter des mésopores, notamment de dimension inférieure ou égale à 50 nm, mieux comprise entre 2 et 50 nm. De préférence, les pores sont connectés entre eux dans le monolithe poreux. Ceci permet d’obtenir des monolithes poreux à porosité hiérarchique, c’est-à-dire présentant au moins deux ordres de grandeur de tailles de pores, de préférence des macropores formés durant la formation de la matrice sol-gel et des mésopores formés durant la génération contrôlée de mésopores. De tels monolithes poreux présentent une bonne surface d’échange entre la solution le traversant et sa matière et minimise les distances à parcourir par diffusion. De plus, ceci permet d’apporter une flexibilité à la matrice sol-gel tout en réduisant les risques de casse. De plus, cela permet de réduire le temps de séchage de la matrice sol-gel.
Le monolithe poreux peut présenter une plus grande dimension transversale au conduit inférieure ou égale à 2 mm, mieux inférieure ou égale à 1,5 mm, encore mieux inférieure ou égale à 1 mm.
Le monolithe poreux autoporté peut présenter une plus grande dimension transversale au conduit supérieure ou égale à 20 pm.
De préférence, le monolithe poreux peut présenter une longueur supérieure ou égale à 0,5 mm, mieux supérieure ou égale à 1 mm, encore mieux supérieure ou égale à 2 mm.
De préférence, le monolithe poreux peut présenter une longueur, prise selon l’axe longitudinal du conduit, supérieur à sa plus grande dimension transversale.
De préférence, le monolithe poreux est intégré dans le conduit et configuré de sorte que tout liquide traversant le conduit fluidique traverse le monolithe poreux sur une distance d’au moins 10% de sa longueur, mieux d’au moins 50%, encore mieux la totalité de la longueur.
De préférence, le monolithe poreux est cylindrique de diamètre inférieur ou égal à 1,5 mm, mieux inférieur ou égal à 1 mm, et de longueur supérieure ou égale à 0,5 mm, mieux supérieure ou égale à 1 mm, encore mieux supérieure ou égale à 2 mm.
Le monolithe poreux peut être de structure sensiblement homogène dans tout son volume.
Le monolithe poreux peut présenter un rapport de forme, défini comme le rapport de sa hauteur sur sa plus grande dimension transversale, supérieur ou égal à 0,2, mieux supérieur ou égal à 0,4, mieux supérieur ou égal à 1 et/ou inférieur ou égal à 1000, mieux inférieur ou égal à 500, encore mieux inférieur ou égal à 100, mieux inférieur ou égal à 50, encore mieux inférieur ou égal à 20.
De préférence, le monolithe poreux est cylindrique à base polygonale, ovale ou circulaire, notamment cylindrique de révolution.
Le procédé peut comporter des modifications du monolithe poreux post fabrication, notamment la fonctionnalisation de la surface du monolithe poreux, notamment avant ou après son intégration dans le conduit. La surface du monolithe poreux peut être recouverte de molécules comme des ligands hydrocarbonés hydrophobes (par exemple des ligands octadécylique) ou comme des ligands hydrophiles comme des dérivés 2,3- dihydroxypropyle. Les ligands de telles colonnes modifiées peuvent être encore modifiés en utilisant des procédures connues. Des catalyseurs poreux ou des supports d'enzymes peuvent être préparés en ajoutant des enzymes, par exemple de la glucose isomérase, de la peptide- N-glycosidase F (PNGase F), ou des éléments métalliques catalytiques, par exemple platine et palladium.
Conduit fluidique
De préférence, le conduit fluidique présente au moins une extrémité ouverte, mieux deux extrémités ouvertes.
De préférence, le conduit fluidique est traversant. Le conduit fluidique est de préférence ouvert de part et d’autre du monolithe poreux.
En variante, le conduit fluidique est fermé à son extrémité en aval du monolithe poreux de sorte à former un puit. Dans ce cas, le monolithe poreux peut être à l’extrémité fermée du conduit ou le conduit fluidique peut comporter un espace entre son extrémité fermée et le monolithe poreux. L’échantillon peut alors traverser le monolithe poreux de part en part lors de son passage au travers du monolithe poreux, notamment lorsqu’un espace est présent en aval de ce dernier, ou le traverser sur une partie de sa hauteur selon un aller-retour, notamment dans le cas où le monolithe poreux est à l’extrémité fermée du conduit.
De préférence, le conduit fluidique est monocouche.
Le conduit fluidique peut être en un polymère thermorétractable, notamment en polyoléfine, tel que le polyéthylène (PE) ou le poly chlorure de vinyle (PVC), en polytétrafluoroéthylène (PTFE), en éthylène-propylène fluoré (FEP) en polyétheréthercétone (PEEK), ou en polyfluorure de vinylidène (PVDF) ou leur mélange.
Le conduit fluidique peut présenter une paroi d’épaisseur constante supérieure ou égale à 0,004 mm, mieux supérieure ou égale à 0,15 mm, ou encore mieux 0,2 mm. De préférence, l’épaisseur de la paroi du conduit est inférieure ou égale à 1 mm, mieux inférieure ou égale 0,9 mm, encore mieux inférieure ou égale 0,65 mm.
Le conduit fluidique peut être rigide, flexible, ou de préférence semi-rigide.
Le conduit fluidique peut être de paroi élastique.
Le conduit fluidique peut être transparent. Ceci permet une visualisation directe du passage de la solution, notamment lorsque ce dernier est coloré, ce qui permet un suivi du procédé.
En variante, le conduit peut être opaque totalement ou au moins partiellement. Le conduit peut comporter une fenêtre de visualisation transparente au niveau du monolithe poreux.
De préférence, le conduit fluidique est configuré pour présenter, après intégration du monolithe poreux, un diamètre minimal inférieur ou égal, mieux strictement inférieur, à la plus grande dimension transversale du monolithe poreux, de préférence à la plus petite dimension transversale du monolithe poreux, notamment à son diamètre, la dimension transversale étant entendu selon un plan transversal du conduit après intégration du monolithe dans le conduit. Le conduit fluidique peut comporter un diamètre minimal strictement inférieur à 100%, mieux inférieur ou égal à 98%, encore mieux inférieur ou égal à 95%, de la plus petite dimension transversale du monolithe poreux, notamment de son diamètre. Le diamètre minimal du conduit peut être supérieure ou égal à 50%, mieux 60%, mieux 70%, mieux 80%, de la plus petite dimension transversale du monolithe poreux. Le conduit fluidique peut présenter un coefficient de rétreint, défini comme le rapport entre le diamètre initial et le diamètre minimum atteignable après rétractation, supérieur ou égal à 1,5:1, mieux supérieure ou égal à 2:1. De préférence, le coefficient de rétreint est inférieur ou égal à 6:1.
Le conduit fluidique peut être configuré pour se rétracter à une température supérieure ou égale à 70°C, mieux supérieure ou égale à 100°C.
En variante, le conduit fluidique peut être un embout de pipette ou une cartouche d’extraction en phase solide. Dans ce cas, le monolithe poreux peut être inséré en force dans le conduit fluidique. Le conduit fluidique peut comporter une paroi interne présentant une couche d’étanchéité venant au contact de la paroi extérieure du monolithe poreux. Une telle couche peut être en une couche adhésive ou une couche en un matériau élastique. Le conduit fluidique peut présenter un diamètre interne inférieur ou égal à celui du monolithe poreux. Dans ce cas, le conduit fluidique et le monolithe poreux peuvent être de forme conique complémentaire. De préférence, au moins une portion du conduit de longueur supérieure ou égale à la longueur du monolithe poreux, mieux tout le conduit, est sous forme de tube cylindrique, notamment à base circulaire. En variante, au moins une portion du conduit de longueur supérieure ou égale à la longueur du monolithe poreux, mieux tout le conduit, est de forme conique tronqué. Par « longueur du monolithe poreux », on comprend sa plus grande dimension selon l’axe longitudinal du conduit après intégration. De préférence, le monolithe poreux a une surface externe de même forme que ladite portion du conduit aux dimensions près le cas échéant.
De préférence, le conduit fluidique présente après intégration du monolithe poreux une longueur de circulation fluidique strictement supérieure à la longueur du monolithe poreux. De préférence, le conduit fluidique présente à son ou une de ses extrémités ouvertes, après intégration du monolithe poreux, une longueur non nulle de conduit dépourvu de monolithe poreux. Cela permet de faciliter l’introduction de l’échantillon dans le tube en amont du monolithe poreux en facilitant l’intégration de l’ensemble dans le dispositif d’extraction par la facilité de connexion fluidique de l’extrémité rallongé. De plus, la longueur de circulation fluidique peut être adapté en fonction du protocole fluidique spécifique d’un cas d’usage particulier.
De préférence, le monolithe poreux est intégré dans le conduit fluidique sans dépasser du conduit fluidique. Ceci permet de faciliter l’intégration du conduit fluidique dans un dispositif fluidique et facilite le passage de l’échantillon liquide dans le conduit fluidique. Ceci permet également d’avoir une réserve de liquide dans le conduit fluidique, notamment en amont du monolithe poreux, ce qui peut permettre de préparer préalablement une quantité d’une solution ou une séquence de plusieurs solutions en quantités prédéterminées dans le conduit fluidique en amont du monolithe poreux à faire passer au travers du monolithe poreux.
Etape d’intégration
De préférence, le conduit fluidique présente une ou plusieurs extrémités ouvertes avant intégration du monolithe poreux et la ou au moins une des extrémités ouvertes du conduit fluidique avant intégration restent ouvertes durant l’intégration du monolithe poreux. Cela permet le passage de l’échantillon au travers du monolithe poreux sans qu’il ne soit nécessaire d’ouvrir une extrémité du conduit après intégration du monolithe poreux.
De préférence, le monolithe poreux conserve son intégrité lors de l’étape d’intégration dans le conduit fluidique. En particulier, l’intégration du monolithe poreux dans le conduit fluidique se fait de sorte qu’il ne soit pas nécessaire de couper une partie du monolithe poreux, notamment une de ses extrémités pour permettre le passage de l’échantillon en son sein. Cela permet de limiter le risque de dégradation du monolithe poreux en limitant les actions sur ce dernier et facilite l’intégration de l’ensemble du conduit fluidique intégrant le monolithe poreux dans un dispositif de circulation de l’échantillon. En particulier, lors de l’étape d’intégration, le conduit fluidique n’est pas fondu pour encapsuler le monolithe poreux. Une telle intégration générerait une pénétration locale de la matière du conduit fluidique en surface du monolithe poreux, ce qui nécessiterait, pour permettre le passage de l’échantillon de couper, au moins à une extrémité du monolithe poreux, le monolithe poreux sur l’épaisseur de pénétration, ce qui pourrait dégrader le monolithe poreux, notamment lorsqu’il est de faible diamètre.
De préférence, l’intégration du monolithe poreux se fait sans qu’il ne soit nécessaire d’amputer le conduit fluidique d’une partie de sa longueur pour permettre le passage de l’échantillon au travers du monolithe poreux. Le dispositif résultant permet de limiter les étapes nécessaires avant le passage d’une ou plusieurs solutions, notamment de l’échantillon, dans le conduit fluidique.
De préférence, le conduit fluidique est en un polymère thermorétractable et l’intégration du monolithe poreux dans le conduit fluidique peut comporter l’insertion du monolithe poreux dans le conduit fluidique et le chauffage du conduit fluidique pour rétracter le conduit de sorte à encapsuler le monolithe poreux dans ledit conduit.
De préférence, le chauffage du conduit se fait à une température supérieure ou égale à la température minimale de rétractation du conduit, notamment à une température supérieure ou égale à 70°C, mieux supérieure ou égale à 100°C, encore mieux supérieure ou égale à 300°C. De préférence, le chauffage du conduit se fait à une température inférieure ou égale à la température de fusion ou de dégradation du conduit fluidique, notamment inférieure ou égale 800°C, de préférence inférieure ou égale à 700°C, mieux inférieure ou égale à 500°C.
De préférence, la rétractation du conduit est telle que, après rétractation la paroi interne du conduit s’étend selon la surface enveloppe du monolithe poreux sans se fondre dans les pores de surface du monolithe poreux.
De préférence, la rétractation du conduit est telle que le monolithe poreux reste fixe dans le conduit lorsqu’une solution est introduite dans le tube à une pression comprise entre 0,05 et 7 bars, préférentiellement entre 0,1 et 5 bars, encore mieux entre 0,15 et 4 bars.
De préférence, le chauffage du conduit se fait par chauffe du conduit pendant une durée et à une température choisie pour que le conduit fluidique se rétracte jusqu’à venir au contact de la paroi externe du monolithe poreux sur au moins une partie de la longueur du monolithe poreux, mieux sur toute la longueur du monolithe poreux, notamment jusqu’à épouser la forme de la surface enveloppe du monolithe poreux. De préférence, après chauffage, les portions du conduit directement en amont et en aval du monolithe poreux présentent des diamètres respectifs strictement inférieurs à 100%, mieux inférieurs ou égaux à 95%, mieux 90% de la plus petite dimension transversale de la section d’extrémité du monolithe poreux directement adjacente.
Le chauffage du conduit peut être réalisé à l’aide d’un pistolet chauffant déplacé manuellement le long du conduit. De préférence, le pistolet chauffant est déplacé le long du conduit de façon sensiblement régulière de sorte à ne pas chauffer une portion de conduit plus de 10 min, mieux plus de 2 min, encore mieux plus de 1 min. Le pistolet chauffant peut être réglé pour émettre en sortie une température de plus de 450°C durant le chauffage du conduit et être positionné à moins de 15 cm, mieux moins de 4 cm, encore mieux 2 cm du conduit durant le chauffage. En variante, le chauffage se fait dans un four. Dans ce cas la température du four est d’au moins 70°C, mieux supérieure ou égale à 150°C, encore mieux supérieure ou égale à 300°C, de préférence inférieure ou égale à 800°C, mieux inférieure ou égale à 700°C, encore mieux inférieure ou égale à 500°C. De préférence, elle est choisie entre la température minimale de rétractation et la température de fusion ou dégradation du conduit fluidique. Le chauffage peut être maintenu pendant une durée dépendante de la température de sorte que le polymère thermorétractable du conduit fluidique ne se dégrade pas, notamment inférieure ou égal à Ih pour une température comprise entre 300 et 450°C et inférieure ou égale à 30 min, mieux 15 min pour une température comprise entre 450°C et 650°C.
De préférence, l’ensemble du conduit et du monolithe poreux après intégration est caractérisé en ce qu’il est dépourvu de chemin fluidique continu s’étendant entre la paroi interne du conduit et le monolithe poreux reliant des portions de conduit sur des longueurs au moins 20 fois supérieures à la taille moyenne des macropores, mieux sur des longueurs au moins 10 fois supérieures à la taille moyenne des macropores.
En variante, l’étape de chauffage peut se faire par un profil de température variable prédéterminé. Le profil de température prédéterminé peut comporter des paliers de température et/ou une rampe d’augmentation progressive de la température.
Le procédé peut comporter l’intégration d’une pluralité de monolithe poreux dans une pluralité de conduit disjoints et le passage d’une pluralité d’échantillon, chacun au travers d’un monolithe poreux dans un des conduits.
Le monolithe poreux peut être intégré de telle sorte que, durant le passage de l’échantillon dans le conduit fluidique, toute fraction de l’échantillon circule dans le monolithe poreux sur au moins une portion de la longueur de ce dernier.
Après intégration du monolithe poreux dans le conduit fluidique, le conduit fluidique peut-être intégré dans un dispositif fluidique configuré pour introduire dans le conduit et faire circuler dans le conduit une solution, notamment l’échantillon.
Le dispositif fluidique peut comporter un organe d’alimentation en solution configuré pour être relié à une extrémité du conduit fluidique. L’organe d’alimentation de liquide peut être configuré pour être relié à son autre extrémité à un réservoir de liquide interchangeable selon la solution à introduire dans le conduit, notamment à un réservoir contenant l’échantillon. Le dispositif fluidique peut comporter un contrôleur de pression ou un pousse seringue relié au conduit fluidique en amont ou en aval du monolithe poreux, notamment par l’intermédiaire de l’organe d’alimentation en liquide du conduit, configuré pour contrôler la circulation du fluide dans le conduit.
En variante, le dispositif peut comporter un dispositif de centrifugation pour faire passer par force centrifuge une solution, notamment l’échantillon, au travers du monolithe poreux, notamment lorsque le conduit présente une extrémité fermée.
Le conduit peut être ouvert à ses deux extrémités et le dispositif fluidique peut comporter un organe de distribution du liquide en sortie du conduit fluidique. L’organe de distribution du liquide peut être une aiguille. Un tel organe de distribution du liquide peut permettre de faciliter la précision de récupération du liquide en sortie de conduit et la précision de distribution sur ou dans un ou plusieurs organes de prélèvement. En variante, la solution en sortie du conduit est directement récupérée sans passer par l’intermédiaire d’un organe de distribution additionnel en sortie du conduit.
Echantillon
De préférence, l’échantillon qui passe au travers du monolithe poreux fait moins de 500pL, mieux moins de 250pL, encore mieux moins delOOpL.
L’échantillon peut être formé à partir d’un prélèvement sanguin, notamment du plasma ou du sérum, de liquide céphalorachidien, d’urine ou de lait, notamment humain. De préférence, un tel prélèvement est modifié avant son passage au travers du monolithe poreux.
Extraction sur phase solide
Le procédé peut être un procédé d’extraction sur phase solide de composés d’intérêt par adsorption de ces derniers sur les surfaces de monolithes poreux pour les séparer du reste de l’échantillon, puis récupération par élution des composés d’intérêt adsorbés sur les surfaces du monolithe poreux. Le procédé comporte préférentiellement, avant le passage de l’échantillon, le conditionnement du monolithe poreux par passage d’une ou plusieurs solutions successives de conditionnement dans le conduit fluidique au travers du monolithe poreux. Un tel conditionnement permet d’imprégner le monolithe poreux de solvant afin d’améliorer F adsorption des composés d’intérêt. Le conditionnement du monolithe poreux dans le conduit peut comporter le passage d’un solvant polaire, notamment comportant de l’eau et/ou de l’acétonitrile. De préférence, le solvant polaire de conditionnement est identique au solvant de l’échantillon. Le conditionnement peut comporter le passage d’une première solution d’eau, notamment pure, dans le conduit au travers du monolithe poreux et le passage d’une solution d’acétonitrile aqueux, notamment à 80% en volume.
Le procédé peut comporter, après le passage de l’échantillon au travers du monolithe poreux, le lavage du monolithe poreux par passage d’une ou plusieurs solutions de lavage dans le conduit fluidique au travers du monolithe poreux. La solution de lavage peut être de polarité plus faible que le solvant de l’échantillon. La solution de lavage peut être une solution aqueuse d’acétonitrile à plus de 50% en volume, mieux 70%. Un tel lavage permet d’éliminer les impuretés du monolithe poreux sans éluer les composés d’intérêt afin d’améliorer la pureté des analytes.
Le procédé peut comporter, après le passage de l’échantillon et le cas échéant après le lavage, l’élution des composés d’intérêt par passage d’une solution éluante ou de plusieurs fractions de solution éluante au travers du monolithe poreux dans le conduit fluidique et la récupération de ou des éluats en vue notamment de leur analyse pour en déterminer la composition en composés d’intérêt. L’élution peut se faire par passage de plusieurs fractions successives, disjointes ou non, de solution éluante au travers du monolithe poreux et par récupération de chaque éluat après son passage au travers du monolithe poreux dans des systèmes de récupération dissociés. La ou chaque fraction de solution éluante peut présenter un volume inférieur ou égal à lOpL, mieux inférieur ou égal à 5pL, encore mieux inférieur ou égal à IpL. La récupération des éluats peut se faire sur des zones différentes d’une plaque, notamment d’une plaque de spectromètre de masse utilisant une source de désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) couplée ou non à un analyseur à temps de vol (MALDI-TOF).
Le procédé peut comporter l’analyse du ou des éluats. La solution éluante peut être de polarité plus élevée que le solvant de l’échantillon, notamment être de l’eau pure.
L’analyse peut se faire par spectrométrie de masse, notamment un spectromètre de masse couplant une source de désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) et un analyseur à temps de vol (TOF), par chromatographie liquide couplée à une détection par fluorescence (LC-Fluo) ou par électrophorèse capillaire couplée à la fluorescence (CE- LIF). L’analyse se fait, de préférence, après récupération de la solution éluante, éventuellement après ajout d’une substance matricielle adaptée au procédé d’analyse notamment au MALDI-TOF, notamment une solution comportant de l’acide 2,5- dihydroxybenzoïque dans du méthanol à 50% en volume, sans étape préalable de séchage de la solution éluante.
De préférence, le procédé d’extraction se fait en l’absence d’acide, notamment d’acide formique ou trifluoroacétique. En variante, un acide, notamment une proportion supérieure ou égale à 0,1% en volume d’un acide, notamment d’acide formique ou trifluoroacétique, est ajouté dans la solution de conditionnement, la solution de lavage et/ou la solution éluante.
Une base peut être ajoutée à la solution de conditionnement, la solution de lavage et/ou la solution éluante.
De préférence, le procédé d’extraction comporte une étape préalable de préparation dans le conduit fluidique en amont du monolithe poreux d’une séquence des différentes solutions successives qui doivent passer au travers du monolithe poreux pour permettre l’extraction, notamment de la solution de conditionnement, de l’échantillon, de la solution de lavage et de la solution éluante sous forme d’une ou de plusieurs fractions successives. Cela permet un contrôle précis de l’extraction par le simple contrôle de la pression dans le conduit fluidique. Cela permet également d’avoir un contrôle précis des volumes des différentes solutions et des temps entre les différentes étapes.
Le procédé peut comporter un unique passage de l’échantillon et/ou de la ou des différentes solutions au travers du monolithe poreux. Dans ce cas, l’échantillon et/ou la ou les solutions traverse préférentiellement le monolithe poreux sur toute sa longueur. Le conduit est alors préférentiellement ouvert de part et d’autre du monolithe poreux ou présente un espace libre en aval du monolithe poreux.
En variante, le procédé peut comporter le passage de l’échantillon et/ou de la ou des différentes solutions au travers du monolithe poreux plus d’une fois sur une partie de sa longueur ou sur toute sa longueur. L’échantillon et/ou de la ou des différentes solutions peuvent ainsi faire un aller-retour ou plus au travers d’une portion ou de la totalité du monolithe poreux. Ceci est en particulier le cas lorsque le monolithe poreux est au fond d’un conduit fermé.
De préférence, le passage de l’échantillon et/ou de la ou des différentes solutions au travers du monolithe poreux est forcé notamment par un contrôle de la pression dans le conduit fluidique ou par tout autre moyen, notamment par l’application d’une force centrifuge. En variante, le passage de l’échantillon et/ou de la ou des différentes solutions au travers du monolithe poreux peut se faire par gravité.
Notamment dans le cas d’un monolithe poreux intégré au fond d’un conduit fluidique fermé à une de ses extrémités, le procédé peut comporter l’agitation du conduit fluidique pour permettre la circulation de la solution et/ou de l’échantillon présente dans le monolithe poreux à chacune des étapes de passage d’une solution au travers du monolithe poreux mentionnées précédemment.
Le procédé peut être un procédé d’extraction des N-glycanes ou des oligosaccharides libres dans un échantillon biologique.
De préférence, l’échantillon qui passe au travers du monolithe poreux comporte des N-glycanes ou des oligosaccharides libres et le monolithe poreux est configuré pour adsorber ces espèces contenues dans l’échantillon lors du passage de ce dernier au travers du monolithe poreux.
Le procédé peut comporter la préparation de l’échantillon préalablement à l’extraction, notamment pour libérer dans l’échantillon les N-glycanes ou les oligosaccharides. Dans le cas de l’extraction des N-glycanes, l’échantillon peut être préparé préalablement à l’extraction selon la méthode décrite dans l’article de Sophie Cholet, et al. N-glycomics and N-glycoproteomics of human cerebrospinal fluid. Current Proteomic Approaches Applied to Brain Function, 127, Humana Press, 360 p., 2017, Neuromethods, 978-1-4939-7119-0 978-1-4939-7118-3. La préparation de l’échantillon peut comporter les étapes suivantes, notamment telles que décrites dans l’article précité : la libération des N-glycanes par dénaturation des glycoprotéines suivi d’une déglycosylation enzymatique des protéines et de la conversion en glycanes des glycosylamines résiduelles dans la solution obtenue après déglycosylation des protéines, la dérivation par perméthylation comme décrit dans l’article de Sophie Cholet et al susmentionné ou mieux par estérification éthylique des acides sialiques des N-glycanes de la solution obtenue après déglycosylation, comme décrit dans F article Reiding et al, Anal. Chem. 86, 5784-5793 (2014) High-Throughput Profiling of Protein N Glycosylation by MALDI-TOF-MS Employing Linkage-Specific Sialic Acid Esterification .
Le procédé peut comporter l’ajout d’un solvant polaire à l’échantillon, notamment d’un solvant polaire aqueux d’acétonitrile à 80%, préalablement au passage de l’échantillon au travers du monolithe poreux. Recyclabilité
Le procédé peut comporter le recyclage du matériau poreux par traitement thermique. Le traitement thermique peut se faire en conservant le monolithe poreux dans le conduit fluidique. En variante, le traitement thermique de recyclage se fait après l’extraction du monolithe poreux du conduit fluidique. Le traitement thermique peut se faire par la chauffe du monolithe poreux à une température supérieure ou égal à 100°C, mieux supérieure ou égal à 150°C, encore mieux supérieure ou égal à 200°C pendant une durée supérieure ou égale à 0,5h, mieux encore supérieure ou égale à Ih.
Le procédé peut comporter la réutilisation après recyclage du monolithe poreux.
Procédé d’encapsulation
L’invention a également pour objet, selon un autre aspect, un procédé d’intégration d’un monolithe poreux autoporté dans un conduit thermorétractable, notamment en polymère, comportant :
L’intégration du monolithe poreux dans le conduit,
La rétractation du conduit par chauffage de ce dernier selon un profil de température dans le temps prédéterminé, le profil de température dans le temps étant configuré de sorte que le monolithe poreux soit maintenu fixement dans le conduit et que la force appliquée sur le monolithe poreux autoporté soit inférieure à la force limite de résistance qu’aurait un monolithe poreux test fabriqué par le même procédé que ledit monolithe poreux autoporté, de même longueur que ledit monolithe poreux autoporté et de plus grande dimension transversale inférieure ou égale à 3 mm.
Par «force de résistance limite qu’aurait un monolithe poreux », on comprend la force à ne pas dépasser pour ne pas endommager le monolithe poreux.
Un tel procédé d’encapsulation permet d’encapsuler toutes les tailles de monolithe poreux sans l’endommager, notamment les monolithes poreux de moins de 3 mm de diamètre.
De préférence, le monolithe poreux présente une plus grande dimension transversale au conduit inférieure ou égale à 3 mm, mieux à 2 mm, encore mieux à 1,5 mm.
Les caractéristiques du monolithe poreux, du conduit fluidique et du procédé d’intégration du monolithe poreux décrites précédemment s’appliquent indépendamment du procédé d’extraction. L’invention a également pour objet un procédé d’extraction sur phase solide d’un ou plusieurs composés d’intérêt d’un échantillon liquide comportant : l’intégration d’un monolithe poreux autoporté dans un conduit fluidique tel selon l’aspect de l’invention précédent, au moins un passage de l’échantillon au travers du monolithe poreux dans le conduit fluidique.
Les caractéristiques décrites précédemment en relation avec le procédé d’extraction précédent s’appliquent indépendamment dudit procédé d’extraction.
Procédé d’analyse gly comique
L’invention a également trait à un procédé d’analyse glycomique d’un échantillon contenant des N-glycanes comportant :
Au moins un passage de l’échantillon au travers d’un monolithe poreux préconditionné pour adsorber les N-glycanes de l’échantillon, le monolithe poreux étant intégré dans un conduit d’un dispositif fluidique,
Le lavage du monolithe poreux par passage d’une solution de lavage au travers du monolithe poreux,
L’élution des N-glycanes par passage d’une solution éluante dans le monolithe poreux,
Le prélèvement de la solution éluante en sortie du monolithe poreux, L’analyse glycomique de la solution éluante prélevée.
Les caractéristiques décrites précédemment en relation avec le procédé d’extraction précédent s’appliquent indépendamment dudit procédé d’extraction quand elles sont compatibles.
Brève description des dessins
[Fig 1] représente schématiquement un exemple de dispositif d’extraction permettant de mettre en œuvre le procédé d’extraction selon l’invention,
[Fig 2] est une coupe selon II-II de l’ensemble du conduit et du monolithe poreux intégré dans le conduit de la figure 1,
[Fig 3] est une vue d’un détail selon III de la figure 2,
[Fig 4] représente un procédé de fabrication d’un monolithe poreux permettant la mise en œuvre du procédé selon l’invention, [Fig 5] représente différentes étapes d’un procédé d’extraction sur phase solide selon l’invention,
[Fig 6] représente l’étape de récupération de la solution éluante en sortie du conduit après la mise en œuvre du procédé d’extraction,
[Fig 7] représente une variante de procédé d’extraction sur phase solide,
[Fig 8] représente une variante de dispositif d’extraction,
[Fig 9] représente une variante de procédé d’extraction sur phase solide,
[Fig 10] représente une variante de dispositif d’extraction,
[Fig 11] représente une variante de dispositif d’extraction,
[Fig 12] représente le spectre des N-glycanes obtenus à partir d’un plasma humain issu d’une fraction d’élution en sortie du conduit après mise en œuvre du procédé selon l’invention pour des rapports masse sur charge (m/z) des molécules identifiées compris entre 1000 et 5000 Da,
[Fig 13] représente le spectre des N-glycanes de la figure 6 pour des rapports m/z compris entre 1100 et 2000 Da,
[Fig 14] représente le spectre des N-glycanes de la figure 6 pour des rapports m/z entre 2000 et 3500 Da,
[Fig 15] représente le spectre des N-glycanes de la figure 6 pour des rapports m/z entre 3400 et 4500 Da, et
[Fig 16] représente deux spectres obtenus pour un même procédé d’extraction selon l’invention sur un même échantillon avant et après recyclage du monolithe poreux.
Description détaillée
On a illustré à la figure 1 un dispositif 10 pour la mise en œuvre d’un procédé d’extraction selon l’invention. Le dispositif 10 comporte un monolithe poreux 20 intégré dans un conduit fluidique 30 de sorte que tout liquide traversant le conduit fluidique de part en part du monolithe poreux 20 passe au travers du monolithe poreux 20, ce dernier jouant le rôle de filtre dans le conduit 30.
Le conduit est relié à une de ses extrémités à un organe d’alimentation 40 du conduit en liquide pouvant être relié de façon amovible à un réservoir de liquide 50. L’organe d’alimentation 40 peut également être relié à un contrôleur de pression permettant de contrôler la pression dans le conduit fluidique et de contrôler la circulation fluidique dans ce dernier. L’autre extrémité du conduit peut être libre. L’invention n’est cependant pas limitée à une extrémité libre. Cette dernière pourrait être relié à un organe de distribution du liquide de type aiguille. Une telle extrémité libre permet de déposer la solution circulante en sortie sur un support d’extraction 60, notamment dans un récipient, un puit d’analyse, ou une plaque MALDI, notamment au vu de son analyse par un dispositif annexe tel qu’un MALDI- TOF, ou dans un récipient 62, notamment un récipient d’élimination pour récupérer les différentes solutions à éliminer durant le procédé.
Le monolithe poreux 20 et le conduit 30 sont cylindriques dans le mode de réalisation illustré. Cependant il pourrait en être autrement. L’invention ne se limite pas à une forme particulière même si la forme cylindrique est préférée.
Le monolithe poreux 20 est à porosité hiérarchique présentant des macropores et des mesopores, et présente un diamètre inférieur ou égal à 3 mm, ici sensiblement égal à 1 mm.
On a illustré à la figure 4 les différentes étapes d’un exemple de procédé de fabrication du monolithe poreux.
Le procédé comporte une première étape non illustrée de formation d’une solution aqueuse d’un agent porogène et d’un précurseur sol-gel et d’éventuels additifs, notamment un acide et/ou un agent de dissolution de la matrice.
L’agent porogène peut être choisi parmi les polymère soluble dans l’eau, notamment le polyéthylène glycol (PEG), le poly(acide acrylique), l’acide poly(styrène sulfonate) de sodium, le poly (éthylène imine).
Le ou les polymères solubles dans l’eau peuvent présenter un poids moléculaire compris entre 1 000 et 100 000 Dalton, de préférence entre 5 000 et 50000 Dalton, encore mieux entre 5 000 et 30 000 Dalton.
La concentration en agent porogène, notamment en PEG, peut être comprise entre 0,015 g et 0,35 g par mL de sol, préférentiellement entre 0,02 et 0,2 g par mL de sol. Ces valeurs sont reliées à la concentration de précurseur sol-gel, notamment de tétraméthoxysilanes (TMOS), selon des valeurs de 0,03 à 1 g d’agent porogène, notamment de PEG par mL de précurseur sol-gel, notamment de tétraméthoxysilanes (TMOS), préférentiellement selon des valeurs de 0,06 à 0,6 g d’agent porogène, notamment de PEG par mL de précurseur sol-gel, notamment de tétraméthoxysilanes (TMOS). Elle est choisie en fonction de la taille des macropores voulue pour le monolithe poreux final. Le précurseur sol-gel peut être choisi parmi les alcoxydes, notamment les organométalliques hydrolysable et condensables, notamment les alcoxydes de zirconium, notamment le butoxyde de zirconium (TBOZ), le propoxide de zirconium (TPOZ) les alcoxydes de titane, de niobium, de vanadium, d’yttrium, de cérium, d’aluminium ou de silicium, notamment le tétraméthoxysilane (TMOS), le tétraéthoxy silane (TEOS), le tétrapropoxysilane (TPOS), le tétrabutoxysilane (TBOS), les triméthoxysilane, notamment le méthyltriméthoxysilane (MTMOS), le propyltriméthoxy silane (PTMOS,) et l’éthyltriméthoxy silane (ETMOS), les triéthoxysilanes, notamment le méthyltriéthoxy silane (MTEOS), l’éthyltriéthoxy silane (ETEOS), le propyltriéthoxysilane (PTEOS), l’aminopropyltriethoxy silane (APTES) et leurs mélanges, par exemple le TMOS. Il est aussi possible d’utiliser des précurseurs tels que les silicates de sodium, ou les colloïdes de titanes, notamment si les exigences de pureté le permettent, c’est à dire ne sont pas trop élevées.
La proportion d’agent porogène dans le sol et la proportion de précurseur sol-gel dans le sol sont prédéterminées en fonction des caractéristiques, notamment la porosité totale et la taille moyenne des macropores, d’un échantillonnage de matrices sol-gel connues pris juste après gélification.
La solution est ensuite agitée pendant une durée prédéterminée comprise entre 5 min et 3h, encore mieux comprise entre 15 min et 2h, à une température contrôlée sensiblement constante comprise entre 0°C et 90°C, mieux entre 0°C et 50°C. Cette étape d’agitation permet d’initier le procédé sol gel pour former un sol 5 avant la séparation de phase.
Le sol 5 est alors ajouté dans l’étape 2 dans un récipient 12 pour remplir au moins partiellement ledit récipient 12 et au moins un moule 15 contenu dans l’enceinte 12.
Le moule 15 peut être positionné dans l’enceinte que l’on remplit progressivement avec le sol 5 de telle manière à ce que le moule 15 se remplisse progressivement sans présence de bulle d’air ou de gradient de composition chimique. Le remplissage peut se faire jusqu’à immersion totale du moule 15. L’immersion partielle est aussi possible. L’ajout du moule dans le sol 5 contenu dans l’enceinte 12 est aussi possible.
L’enceinte 12 peut être configurée pour contenir une pluralité de moules 15 identique ou non. L’enceinte 12 peut être cylindrique comme illustré ou avoir une tout autre forme. L’enceinte 12 peut être en plastique, notamment en PTFE, PP, PE, PC, PET, PVC, ou verre ou inox. Le ou les moules 15 comportent deux ouvertures 17 et 18 sur des surfaces opposées du moule 15, l’une au moins des deux ouvertures 17 s’étendant sous le niveau de sol après remplissage. De telles ouvertures permettent le remplissage du ou des moules 15 par remplissage de l’enceinte 12 contenant le ou les moules 15 ou par immersion au moins partielle du ou des moules 15 dans le sol 5 contenu dans l’enceinte 12 et la circulation du sol 5 entre l’intérieur et l’extérieur du ou des moules avant condensation totale de ce dernier. Dans l’exemple illustré, le ou les moules 15 sont sous forme de tubes ouverts à leurs deux extrémités et s’étendent verticalement dans l’enceinte 12, mais il pourrait en être tout autrement, le tube pourrait être orienté dans l’enceinte différemment et/ou le moule pourrait avoir une autre forme.
Le ou les moules 15 peuvent être entièrement contenus dans l’enceinte 12, comme cela est illustré, ou dépasser de ce dernier. Dans le premier cas, le ou les moules 15 peuvent être immergés entièrement ou non dans le sol 5 après remplissage.
Le ou les moules 15 peuvent être en plastique, notamment en PTFE, PEEK, FEP, PE, PP, ou acide polylactique ou en verre ou en inox, notamment en silice fondue ou borosilicate.
Le ou les moules peuvent être en un corps poreux.
Le ou les moules peuvent être formés par impression 3D ou par moulage.
La plus grande dimension transversale de la cavité du ou des moules 15, notamment le diamètre d de cette cavité, peut être compris entre 13 mm et 0,025 mm.
Une fois le sol 5 introduit dans l’enceinte 12 et le ou les moules 15, la condensation est réalisée en étape 3 dans l’ensemble de l’enceinte et du moule. Cette transition sol-gel peut être suivi d’une maturation (ou vieillissement) au moins partielle de l’ensemble. Cette étape permet d’assurer la formation de macropores homogènes de nature similaire dans la matrice sol-gel formé 22, et cela quelle que soit sa forme et sa taille.
Pendant la condensation, la température peut être maintenue sensiblement constante, notamment entre 15° et 90°C, préférentiellement 25 et 70°C, pendant une durée comprise entre 10 min et 4h. La durée de la condensation et la température prédéterminée dépendent de la structure interne de la matrice sol-gel recherchée et de la durée de l’agitation de la solution initiale dans l’étape de formation du sol. Le vieillissement au moins partiel peut durer entre 30 min et 2 semaines, notamment moins de 72h à température ambiante. De préférence, la durée de vieillissement est suffisamment faible pour éviter la formation de mésopores et/ou micropores.
Un bloc 22 de matrice sol-gel contenant le moule 15 est alors extraite de l’enceinte 12 à l’étape 4. Dans le cas où le moule 15 n’est que partiellement immergé, cette étape peut être facultative comme nous le verrons par la suite.
Le moule 15 avec la matrice sol-gel 25 qu’il contient est ensuite extrait du solide poreux à l’étape 5, par exemple coupant à fleur de moule la matrice sol-gel du bloc 22 puis en retirant le moule 15 avec la matrice sol-gel 25 qu’il contient, ou bien en cassant la matrice sol-gel du bloc 22 autour du moule 15. Dans le cas où l’immersion était partielle, il est possible de retirer directement le moule 15 avec la matrice sol-gel 25 qu’il contient du bloc préalablement extrait ou directement de l’enceinte 12.
Puis, la matrice sol gel 25 est extraite du moule 15 à l’étape 6. Ceci est réalisé au moyen d’une pression contrôlée exercée sur la matrice sol-gel 25 tout en en maintenant le moule 15. La pression peut être obtenue soit avec un solide en plastique, en verre, tel qu’un capillaire en silice fondue par exemple, ou tout autre matière assez robuste et de dimension inférieure au moule 15, soit avec un gaz à débit contrôlé. L’opération d’extraction peut être facilitée par immersion de l’ensemble moule 15 et matrice sol-gel 25 dans un liquide. Il est éventuellement possible de générer une légère différence de pression en tapotant gentiment l’ensemble moule 15 et matrice sol-gel 25 pour extraire la matrice sol- gel 25.
Une fois la matrice sol-gel 25 extraite du moule 15, le procédé peut comporter une étape de génération contrôlée de la mésoporosité. Cette étape peut se faire par immersion de la matrice sol-gel 25 ou de l’ensemble moule-matrice sol-gel dans une solution basique, par exemple une solution d’hydroxyde d’ammonium IM, soit par chauffage du matériau dans de l’eau en présence d’un précurseur, par exemple de l’urée pour générer de l’ammoniac in situ. A noter que dans la deuxième méthode, il est possible de rajouter de l’hydroxyde d’ammonium. Cette opération peut durer dure entre 0,5h et 50h à une température prédéterminée sensiblement constante de la matrice sol-gel comprise entre 30°C et 150°C. Cette étape peut être faite sur plusieurs matrices sol-gel simultanément, i.e. dans un même bain, issus d’un même bloc ou non. De préférence, la taille des pores obtenue est inférieure ou égale à 50 nm, mieux comprise entre 2 et 50 nm.
La matrice sol-gel obtenues est ensuite séchée. Pour ce faire, elle est placée dans un contenant fermé, notamment un autoclave, pour être séchée en condition critique ou supercritique, notamment sous flux d’air ou de gaz inerte, notamment du diazote (N2) pour une durée comprise entre 10 et 20h. Ils sont ensuite soumis à une rampe de 0.5°C/min jusqu’à 350°C avec un palier de quelques heures à cette dernière température et sous flux de gaz inerte (d’autres gaz peuvent être employés).
On obtient alors un monolithe autoporté prêt à l’emploi.
Le monolithe poreux obtenu comporte de préférence des macropores, i.e. présentant une dimension choisie supérieure ou égale à 50 nm, et des mésopores, i.e. présentant une dimension choisie comprise entre 2 et 50 nm.
H est préférentiellement de structure sensiblement homogène dans tous son volume, comme cela est visible sur la figure 3.
Le ou les monolithes poreux peuvent présenter un rapport de forme, définie comme sa hauteur sur sa plus grande dimension transversale, compris entre 0,2 et 100.
Le procédé peut comporter des modifications du monolithe poreux post fabrication, notamment la fonctionnalisation des surfaces interne du monolithe poreux. La fonctionnalisation pourra être réalisée selon des procédés en phase liquide ou bien en phase gaz, utilisant des organo- silanes, notamment des chlorosilanes (e.g. octadecyltrichlorosilane) et les alkoxysilanes (octadecyltriethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, propyltriméthoxysilane), ou bien encore l’hexadimethylsilazane.
En variante, le ou les moules peuvent n'avoir qu’une ouverture. Cette dernière s’ouvre dans le sol après remplissage pour permettre la circulation du sol entre le moule et l’enceinte.
En variante, la solution initiale peut être une émulsion ou une solution de matriçage (« templating ») contenant des précurseurs sol-gel.
Le monolithe poreux 20 obtenu par ce traitement est autoporté et peut être intégré dans le conduit thermorétractable 30.
Le conduit fluidique est semi-rigide et thermorétractable. Il présente, avant rétractation, un diamètre interne supérieur au diamètre externe du monolithe poreux et après rétractation un diamètre interne inférieur au diamètre externe du monolithe poreux. De préférence, le diamètre minimal du conduit est strictement inférieur au diamètre du monolithe poreux. Il peut être compris entre 95% et 85% du diamètre du monolithe poreux.
Le monolithe poreux est intégré dans le conduit par insertion dans le conduit avant rétractation puis chauffe du conduit à une température fonction du matériau thermorétractable, notamment supérieure ou égale à 70°C, de sorte que le conduit se rétracte sur le monolithe poreux sans l’endommager jusqu’à un rétrécissement de son diamètre tel que le monolithe poreux est encapsulé fixement et que toute solution liquide qui traverse le conduit passe au travers du monolithe poreux, c’est-à-dire sans espace entre la paroi interne du conduit et la paroi externe du monolithe poreux, comme cela est visible sur les figures 2 et 3.
Il est également possible d’intégrer plusieurs monolithes poreux en parallèle pour traiter plusieurs échantillons ou plusieurs fractions d’un échantillon.
Nous allons maintenant décrire un procédé d’extraction sur phase solide (SPE) de composés d’intérêt d’un échantillon.
Le procédé comporte le passage au travers du monolithe poreux de différentes solutions successives permettant l’extraction des composés d’intérêt. L’ensemble des solutions successives peuvent être insérés préalablement en tête de conduit, c’est-à-dire en amont du monolithe poreux.
Le procédé d’extraction peut d’abord comporter une étape de conditionnement par passage d’une solution de conditionnement 200 au travers du monolithe poreux 20. Elle permet de préparer le monolithe poreux à l’adsorption des composés d’intérêt en l’imprégnant d’une solution de polarité proche de celle de l’échantillon. La solution de conditionnement 200 peut être une solution aqueuse d’acétonitrile, par exemple à 80% en masse en acétonitrile. La solution de conditionnement est éliminée en sortie.
L’échantillon 300 est alors passé au travers du monolithe poreux 20. Lors de son passage, les composés d’intérêt présents dans ce dernier s’adsorbent aux surfaces du monolithe poreux de par leur plus grande affinité pour les surfaces que pour le solvant de l’échantillon. L’échantillon 300 peut être passé une unique fois au travers du monolithe poreux. En variante, il est possible de le faire passer plusieurs fois en lui faisant faire des allers-retours au travers du monolithe poreux 20. Le liquide de l’échantillon restant en sortie peut être éliminé. Le monolithe poreux 20 est ensuite lavé par une solution de lavage 400 pour laquelle les composés d’intérêt présentent une affinité plus faible que pour les parois du monolithe poreux 20. La solution de lavage 400 peut être une solution aqueuse d’acétonitrile à 95% en masse. La solution de lavage 400 est éliminée en sortie du monolithe poreux.
Enfin, comme cela est illustré sur la figure 6, une succession de fractions de solution éluante successives 500 sont entrainées au travers du monolithe poreux. Chaque fraction de solution éluante est récupérée en sortie du monolithe poreux sur des spots ou dans des puits 520 différents d’une plaque d’analyse. La solution éluante est une solution pour laquelle les composés d’intérêt ont plus d’affinités, notamment de l’eau pure, de sorte que les composés d’intérêt sont entrainés dans les fractions de solution éluante. Les différentes fractions de solution éluante sont récupérés en sortie pour être analysé. L’analyse de la composition des différentes fractions de solution éluante permettent d’en déduire la proportion des composés d’intérêt de l’échantillon initial. L’analyse se fait par exemple par MALDI-TOF, LC-FLUO ou CE-LIF notamment dans le cas de N-glycanes.
Dans une variante illustrée sur la figure 7, le monolithe poreux 20 est encapsulé dans un conduit thermorétractable 30 de forme non cylindrique, notamment de forme conique.
Le passage des différentes solutions, notamment la solution de conditionnement 200, l’échantillon 300, la solution de lavage 400 et la solution éluante 500 peuvent se faire au travers du monolithe poreux par une ou plusieurs étapes d’aspiration puis de refoulement, comme cela est illustré par la double flèche à chaque étape de la figure 7. Les différentes solutions passent donc au moins deux fois au travers du monolithe poreux 20 dans un sens puis dans l’autre. Après passage dans le monolithe poreux, les solutions à éliminer sont récupérées dans des récipients 62 d’élimination et les solutions à analyser sont récupérées dans un récipient ou puit d’analyse ou déposées directement sur une plaque d’analyse MALDI 60.
Dans une variante illustrée sur la figure 8, le conduit fluidique 30 après encapsulation du monolithe poreux est inséré dans une cartouche d’extraction sur phase solide 80, notamment de type corps de seringue. Les différentes solutions sont alors récupérées après passage au travers du monolithe poreux par la buse de sortie 82 de la cartouche d’extraction 80. Une telle cartouche d’extraction peut être utilisée comme décrit précédemment ou comme décrit ci-dessous. En variante illustré sur la figure 9, le passage des solutions 200, 300, 400 et 500 au travers du monolithe poreux 20 peut être forcé par centrifugation. Le monolithe poreux 20 peut être intégré dans une cartouche d’extraction dont l’extrémité supérieure peut être fermée par un bouchon 84. La solution de conditionnement 200 et ajoutée dans la cartouche d’extraction 80 en amont du monolithe poreux 20 et la cartouche 80 est fermée à l’aide du bouchon 84. La cartouche est disposée au-dessus d’un récipient d’élimination 62. L’ensemble formé du récipient 62 et de la cartouche 80 est centrifugé de sorte à faire passer la solution de conditionnement au travers du monolithe poreux 20 et à la récupérer dans le récipient 62. L’échantillon 300 et la solution de lavage sont passés dans le monolithe poreux 20 et récupérés dans le même récipient ou un autre récipient 62 de la même manière. La cartouche est ensuite insérée dans un récipient d’extraction 60 pour récupérer l’éluat par passage de la solution éluante 500 au travers du monolithe poreux de la même manière.
En variante illustré sur la figure 10, l’ensemble des étapes du procédé peut se faire à l’aide d’un système multi-puits 900 comportant une base de mise sous vide 910, recevant un récipient ou une plaque multi-puits 60, sur laquelle est montée une plaque d’extraction 920. La plaque d’extraction 920 comporte une matrice de cartouches d’extraction 80 dans lesquelles les monolithes poreux sont intégrés. Cette plaque 920 est placée, selon l’étape du procédé, sur un récipient d’élimination 62 non illustré pour récupérer les solutions à éliminer ou sur une plaque multi-puits 60 présentant un puit d’extraction 520 par cartouche d’extraction pour récupérer l’éluat en sortie de chaque cartouche. Le passage des différentes solutions au travers du monolithe poreux peut être forcé à l’aide d’une pompe d’aspiration de l’air dans la base de mise sous vide 910. Un tel système permet d’effectuer plusieurs extractions simultanément.
En variante illustrée sur la figure 11, l’extraction peut se faire par extraction sur phase solide. Dans ce cas, le monolithe poreux peut être intégré dans un conduit fluidique fermé à son extrémité, ici un récipient, notamment du type tube Eppendorf®. Le monolithe poreux peut s’étendre au fond du récipient et être fixe au fond du récipient. Les différentes solutions sont alors ajoutées dans le récipient contenant le monolithe poreux. Le tube est agité pour accélérer les échanges entre les solutions et le monolithe poreux . Les solutions sont alors extraites du récipient, notamment en retournant ce dernier ou par pipetage.
Figure imgf000031_0001
Ci-dessous est détaillé l’analyse N-glycomique d’un échantillon plasmatique humain.
Un monolithe autoporté d’environ 800 pm de diamètre, ayant des macropores d’environ 2 pm et des mésopores d’environ 15 nm générés par immersion dans une solution basique est fabriqué.
Une solution est préparée en mélangeant 0,33 g de PEG avec 2 mL de TMOS dans 4 mL d’acide acétique 0,01 M. La solution est agitée à 0°C pendant 30 min pour former un sol puis transférée dans un récipient en polypropylène (PP) dans lesquels un tube en PTFE d’environ 1 mm de diamètre a été préalablement positionné verticalement. Le remplissage est réalisé en ajoutant progressivement le sol dans l’enceinte à partir du point le plus bas à l’aide d’une micropipette. La quantité de solution ajoutée est telle que le moule est totalement immergé.
L’enceinte est placée à une température de 40°C, et la gélification se produit entre 45 et 50 min après le transfert dans l’enceinte. Après que la gélification a eu lieu, le gel est laissé à vieillir pendant 24h à 40°C. Puis, la matrice sol-gel issue de la gélification et de la maturation est extraite de l’enceinte et cassée avec une pince métallique pour récupérer le moule qui y a été incorporés. On extrait ensuite la matrice sol-gel monolithique encapsulée dans le moule à l’aide d’une pression manuelle exercée par un tube d’un diamètre inférieur 1 mm. Pour ce protocole, cette pression par un tube solide est suffisante pour réaliser l’extraction du monolithe et ne fragilise pas le gel.
La matrice sol-gel obtenue est rapidement immergée dans une solution de NH4OH IM, en respectant un rapport d’environ 5 entre les volumes de solution basique et le volume occupé par la matrice sol-gel.
La matrice obtenue est ensuite disposée dans un autoclave. Ce dernier est placé dans un four et connecté par des tubes qui permettent une circulation de gaz. Le gel est alors séché pendant 12H sous N2. Finalement, un traitement thermique est réalisé avec une rampe de 0.5°C/min jusqu’à 350°C et un palier de 2h à cette dernière température.
Le monolithe de 0,8 mm de diamètre est placé dans un tube thermorétractable en PTFE d’un diamètre interne avant retrait de 1,27 mm. Le tube fait une longueur d’au moins 10 cm.
L’ensemble est alors soumis à une augmentation de température localisée à l’endroit où le monolithe est positionné, à l’aide d’un pistolet chauffant réglé sur une température de 500°C. La chaleur est manuellement répartie sur le tube par un déplacement régulier de la buse du pistolet et le rétrécissement se produit au fur et à mesure pour encapsuler le monolithe. Le rétrécissement du tube est contrôlé visuellement. Le diamètre du PTFE après retrait est inférieur à 0,7 mm. Cette étape peut également être effectuée dans un four à une température de 350 °C pendant au moins 10 min.
Le tube contenant le monolithe poreux encapsulé est prêt à être employé. Il est alors relié à un contrôleur de pression via un connecteur de réservoir dans lequel on peut placer quatre contenants, un pour chaque solution (conditionnement / échantillon / lavage / élution).
En sortie du dispositif on récupère les fluides introduits dans un contenant poubelle (les trois premières étapes) et les éluats (dernière étape) sont, quant à eux, déposés directement sur une plaque MALDI.
34 pL de plasma dilué (contenant 5 pL de plasma prélevé) sont ajoutés à un tampon phosphate de sodium 100 mM pH 7.4 (10 pL) et à du dithiothréitol 10 mM (5 pL) avant de dénaturer les glycoprotéines plasmatiques par chauffage à 95 °C pendant 5 minutes. Après refroidissement à température ambiante, 2 pL d'une solution de PNGase F (1 U/pL) sont ajoutés et la déglycosylation des protéines est effectuée sur une nuit (environ 16 heures) à 37 °C. Les glycosylamines résiduelles sont converties en glycanes par incubation avec 5 pL d’acide chlorhydrique à 1 mol/L pendant 45 minutes à 37°C.
Un mélange EDC 0,25 M/ HOBt 0,25 M est préparé dans l'éthanol comme agent d'activation pour effectuer des réactions d'estérification éthylique, qui induisent l'estérification des acides sialiques liés en a2,3 et la lactonisation des acides sialiques liés en a2,6.
La dérivation est réalisée en ajoutant 3 pL d'échantillon de N-glycanes libérés précédemment (équivalent respectivement à 0,3 pL de plasma humain) à 20 pL de réactif d'estérification respectivement, suivi d'une incubation sous agitation à 350 rpm pendant lh30 à 37 °C. Après cela, 50 pL d'ACN 80% sont ajoutés pour former l’échantillon d’extraction, 10 minutes avant de procéder à l’extraction des N-glycanes avec le monolithe de silice et à l'analyse MALDI-TOF-MS.
Pour chaque étape, les solutions sont chargées dans un contenant et dirigées par une pression positive à l’aide d’un contrôleur de pression dans le tube en PTFE contenant le matériau. On peut également procéder en pression négative avec le contrôleur de pression. Les pressions positives et négatives peuvent aussi être appliquées avec des pousses seringues, voire manuellement. On peut également avec ce dispositif procéder à des cycles d’aspirations-refoulements pour réaliser la purification.
Le monolithe encapsulé dans le PTFE est conditionné et équilibré avec 3 x 1 mL d’eau pure suivie de 3 x 1 mL d’ACN aqueux à 80%. Ensuite, les 73 pL de l’échantillon d’extraction est chargé, puis lavés avec 20 pL d'ACN 95%. Enfin, les N-glycanes sont élués en 10 fractions successives de 1 pL d’eau pure. Chaque fraction est déposée directement à l’aide du dispositif sur la plaque MALDI. A noter que dans le protocole, aucun acide trifluoroacétique n’est utilisé.
1 pL de la solution de matrice 2,5-DHB (acide 2,5-dihydroxybenzoique, 10 mg/mL dans du méthanol à 50%) est ajouté et mélangé avec chacune des fractions de 1 pL déposés lors de l’élution directe sur la plaque. Après une première cristallisation, 0,2 pL d'éthanol sont déposés pour recristalliser et améliorer les résultats de reproductibilité lors des analyses.
Enfin, chaque spot de la plaque MALDI est analysé avec un instrument MALDI- TOF/TOF, notamment le UltrafleXtreme de Bruker équipé d'un laser, notamment le Smartbeam-II de Bruker. Concernant les conditions d'acquisition, les spectres de spectrométrie de masse ont été acquis à une fréquence de répétition du laser de 2 kHz en mode positif, avec une tension d'accélération de 20 kV et un délai d'extraction de 130 ns. Les spectres sont obtenus en accumulant 5 000 tirs sur des fenêtres de masses de 1100 à 5000 Da pour les N-glycanes plasmatiques, et de 500 à 5000 Da pour les échantillons d’oligosaccharides libres du lait maternel (HMO, voir Exemple 2).
Après la mise en œuvre du protocole de purification pour le plasma humain, des profils de N-glycanes sur les fractions 2 à 4 ont été obtenus par spectrométrie de masse avec un spectre optimal obtenu pour la troisième fraction.
Une calibration a été effectuée et les pics identifiés par le logiciel de l’appareil de spectrométrie de masse.
Le spectre obtenu est illustré sur les figures 12 à 15. L’analyse a permis de différencier plus de 58 N-glycanes plasmatiques de compositions différentes dont certains sont illustrés qui correspondent à plus de 81 espèces de N-glycanes en raison de la variation de la liaison de l’acide sialique. Les 8 structures majoritaires ont été retrouvées à savoir H5N4E2 (m/z 2301), H5N4E1 (m/z 1982), H5N4E1L1 (m/z 2255), H6N5E2L1 (m/z 2940), H5N4F1E1 (m/z 2128), H5N4F1E2 (m/z 2447), H6N5F1E2L1 (m/z 3086) ou encore H6N5E2L1 (m/z 2986). Les proportions des glycanes biantennés mono- et bi-sialylés, H5N4E1 (m/z 1982) et H5N4E2 (m/z 2301) qui sont les deux structures majoritaires habituellement retrouvées, présentent des proportions 1 : 3.
Exemple 2
Un monolithe poreux autoporté cylindrique d’un diamètre de 5 mm et d’une longueur de 9 mm a été fabriqué par le même procédé que celui décrit dans l’exemple 1. Il a été intégré dans un tube thermorétractable en PTFE de longueur plus grande que 9 mm par le procédé d’intégration de l’exemple 1 puis placé dans une cartouche de type SPE, comme cela est illustré sur la figure 8.
La cartouche SPE contenant le monolithe poreux encapsulé est prête à être employée pour une extraction. La cartouche SPE est placée sous vide à -0.2 bar.
50 pL de lait humain ont été dilués, vortexés et ensuite centrifugés à 15 kG à 2°C pendant 30 minutes. Après cela, les surnageants ont été retirés et 200 pL d'acétonitrile (ACN) ont été ajoutés aux échantillons avant d’être passés au vortex.
La cartouche SPE contenant les monolithes est conditionnée et équilibrée successivement trois fois avec 1 mL d'eau, puis trois fois avec 1 mL d'ACN à 80%. Ensuite, les échantillons ont été chargés et lavés 12 fois avec 200 pL d'ACN 95%. Enfin, l'élution des oligosaccharides libres du lait (HMO) est réalisée avec 200 pL d'FLO dans un tube de 2 mL avant d'être séchée sous un flux d'azote et d'être analysée par spectrométrie de masse. Le spectre obtenu est illustré sur la figure 16, spectre a.
Après cette première extraction, la cartouche est retirée. Le monolithe poreux et le PTFE sont traités thermiquement sous flux d'azote à une température initiale de 40°C suivie d'une rampe de 210 minutes jusqu'à une température finale de 250°C pendant deux heures. Ensuite, la partie traitée est récupérée et replacée dans la cartouche puis le protocole d’extraction précédent est de nouveau employé. Les fractions de conditionnement et d’élution ont été récupérées et analysées par spectrométrie de masse.
Dans les fractions de conditionnement de cette deuxième extraction, aucun oligosaccharide ou autres composés résiduels n’a été détecté témoignant de la bonne régénération du monolithe poreux. S’agissant des fractions d’ éludons, des profils de oligosaccharides libres ont été obtenus. Un exemple spectre de masse obtenu est illustré sur la figure 16, spectre b. On peut constater que les spectres de la figure 16 obtenus respectivement par la première et la deuxième extraction sont similaires, ce qui indique bien que le monolithe poreux peut être utilisé plusieurs fois.
L’invention n’est pas limitée aux exemples qui viennent d’être décrit. Par exemple, le monolithe poreux a une forme autre que celles décrites. Le dispositif fluidique peut être autre que tel que décrit, notamment le contrôle de la pression peut se faire autrement.

Claims

Revendications
1. Procédé d’extraction sur phase solide d’un ou plusieurs composés d’intérêt d’un échantillon liquide comportant : l’intégration d’un monolithe poreux autoporté (20) dans un conduit fluidique (30) de sorte que le monolithe poreux autoporté (20) soit fixe dans le conduit fluidique (30) durant ledit procédé et forme un filtre dans le conduit fluidique, au moins un passage de l’échantillon (300) au travers du monolithe poreux dans le conduit fluidique (30) sur au moins une portion du monolithe poreux (20), le monolithe poreux autoporté (20) ayant une plus grande dimension transversale au conduit fluidique (20) inférieure ou égale à 3 mm, le conduit fluidique présentant une ou des extrémités ouvertes avant intégration, la ou au moins une des extrémités restant ouvertes durant l’étape d’intégration du monolithe poreux.
2. Procédé selon la revendication 1, le monolithe poreux autoporté (20) étant formé par un procédé de fabrication comportant : la formation d’un sol (5) comportant un précurseur sol-gel en solution aqueuse et, de préférence, un agent porogène, le remplissage au moins partiel d’une enceinte (12) et d’au moins un moule (15) contenu dans l’enceinte (12) en sol formé précédemment, le moule (15) comportant au moins une ouverture (17) s’ouvrant dans le sol après remplissage en sol, la formation d’une matrice sol-gel (22) dans l’enceinte à partir du sol, l’extraction du moule (15) avec la matrice sol-gel contenue dans le moule (25) de l’enceinte, et l’extraction de la matrice sol-gel (25) du moule (15), la formation d’un monolithe poreux (20) à partir de la matrice sol-gel extraite du moule (25), la formation du sol, de la matrice sol-gel et du monolithe poreux se faisant par un procédé sol-gel.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, le monolithe poreux étant à porosité hiérarchique, notamment comportant des macropores, notamment des macropores de dimension supérieure ou égale à 50 nm, et des mésopores, notamment de dimension inférieure ou égale à 50 nm, mieux comprise entre 2 et 50 nm.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le monolithe poreux présente une plus grande dimension transversale au conduit inférieure ou égale à 2 mm, mieux inférieure ou égale à 1,5 mm, encore mieux inférieure ou égale à 1 mm.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant des modifications du monolithe poreux (20) post fabrication, notamment la fonctionnalisation de la surface du monolithe poreux, notamment avant ou après son intégration dans le conduit fluidique (30).
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le conduit fluidique est en un polymère thermorétractable, notamment en polyoléfine, tel que le polyéthylène (PE) ou le polychlorure de vinyle (PVC), en polytétrafluoroéthylène (PTFE), en polyétheréthercétone (PEEK), en ethylène-propylène fluoré (FEP) ou en polyfluorure de vinylidène (PVDF) ou leur mélange et l’intégration du monolithe poreux (20) dans le conduit fluidique (30) comporte l’insertion du monolithe poreux (20) dans le conduit fluidique (30) et le chauffage du conduit fluidique (30) pour rétracter le conduit de sorte à encapsuler le monolithe poreux dans ledit conduit, notamment pendant une durée et à une température choisie pour que le conduit fluidique se rétracte jusqu’à venir au contact de la paroi externe du monolithe poreux sur au moins une partie de la longueur du monolithe poreux, mieux sur toute la longueur du monolithe poreux.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le monolithe poreux conserve son intégrité lors de l’étape d’intégration dans le conduit fluidique.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le chauffage du conduit se fait à une température supérieure ou égale à la température minimale de rétractation du conduit et inférieure ou égale à la température de fusion ou de dégradation du conduit fluidique.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le conduit fluidique présente à son ou une de ses extrémités ouvertes, après intégration du monolithe poreux, une longueur non nulle de conduit dépourvu de monolithe poreux
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, le procédé étant un procédé d’extraction sur phase solide de composés d’intérêt par adsorption de ces derniers sur les surfaces de monolithes poreux pour les séparer du reste de l’échantillon, puis récupération par élution des composés d’intérêt adsorbés sur les surfaces du monolithe poreux.
11. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant, avant le passage de l’échantillon, le conditionnement du monolithe poreux par passage d’une ou plusieurs solutions successives de conditionnement dans le conduit fluidique au travers du monolithe poreux et/ou, après le passage de l’échantillon dans le conduit fluidique, le lavage du monolithe poreux par passage d’une ou plusieurs solutions de lavage dans le conduit fluidique au travers du monolithe poreux.
12. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant, après le passage de l’échantillon et le cas échéant après le lavage, l’élution des composés d’intérêt par passage d’une solution éluante ou de plusieurs fractions de solution éluante au travers du monolithe poreux dans le conduit fluidique et la récupération de la solution éluante ou de chaque fraction de solution éluante après son passage dans le monolithe poreux en vue notamment de son analyse pour en déterminer la composition en composés d’intérêt, notamment dans des systèmes de récupération dissociés, par exemple sur des zones différentes d’une plaque, notamment d’une plaque de spectromètre de masse utilisant une source de désorption/ionisation laser assistée par matrice couplée ou non à un analyseur à temps de vol .
13. Procédé selon la revendication précédente, comportant l’analyse par spectrométrie de masse, notamment un spectromètre de masse couplant une source de type désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) à un analyseur à temps de vol (TOF), par chromatographie liquide couplée à une détection par fluorescence (LC-Fluo) ou par électrophorèse capillaire couplée à la fluorescence (CE-LIF), après récupération de la solution éluante sans étape préalable de séchage ou de concentration de la solution éluante.
14. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant le recyclage du matériau poreux par traitement thermique.
15. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’échantillon (300) qui passe au travers du monolithe poreux (20) comporte des N-glycanes ou des oligosaccharides libres et le monolithe poreux est configuré pour adsorber ces espèces contenues dans l’échantillon lors du passage de ce dernier au travers du monolithe poreux, préférentiellement le procédé comportant additionnellement : le lavage du monolithe poreux (20) par passage d’une solution de lavage (400) au travers du monolithe poreux, l’élution des N-glycanes par passage d’une solution éluante (500) dans le monolithe poreux, le prélèvement de la solution éluante en sortie du monolithe poreux, - l’analyse glycomique de la solution éluante prélevée.
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