WO2023163497A1 - Ednra 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Ednra 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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ednra
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preventing
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정은선
반현승
한태수
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한국생명공학연구원
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    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer.
  • Cancer has a high mortality rate worldwide and is the second most common cause of death in Western societies after cardiovascular disease.
  • colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, etc. are continuously increasing due to the aging of the population, the generalization of high-fat diet intake due to westernization of diet, a rapid increase in environmental pollutants, and an increase in alcohol consumption.
  • colorectal cancer refers to a malignant tumor that occurs in the colon or rectum and is the fourth most common cancer in Korea.
  • symptoms such as bloody stool, residual stool, and anemia appear, resulting in a low initial survival rate.
  • the mortality rate is high. For every 100,000 people, 17.5 people die of colorectal cancer, which is the third highest figure after lung cancer (36.2 people) and liver cancer (20.6 people).
  • Colorectal cancer is generally treated with surgery and chemotherapy, but there are not many drugs that can be used to treat colorectal cancer.
  • cytotoxic anticancer drugs such as 5-Fluorouracil (5-FU), oxaliplatin, and irinotecan, and cetuximab or bevacizumab
  • cetuximab or bevacizumab Although antibody treatment such as bevacizumab is used in combination, it is fatal to normal cells as well as cancer cells, and the recurrence rate is high due to anticancer drug resistance, and the 5-year survival rate is only 65%.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating colorectal cancer.
  • an object of the present invention is to provide a method for screening a new therapeutic agent for colorectal cancer.
  • one aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer comprising an EDNRA (Endothelin receptor type A) inhibitor as an active ingredient.
  • EDNRA Endothelin receptor type A
  • compositions for screening a therapeutic agent for colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level or activity level of EDNRA.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of treating isolated colorectal cancer cells overexpressing EDNRA with a candidate for colorectal cancer treatment and measuring the expression level or activity of EDNRA in the isolated colorectal cancer cells treated with the candidate material. It provides a method for screening a therapeutic agent for colorectal cancer, comprising:
  • the EDNRA gene overexpressed in colorectal cancer can be a target gene for colorectal cancer treatment by increasing the proliferation and migration of cancer cells and inhibiting apoptosis. It was confirmed that the inhibition of EDNRA could be a treatment mechanism for colorectal cancer by confirming that cell proliferation was reduced and cell death was increased.
  • APY29 and CGP60474 were selected through EDNRA inhibitor drug screening and caused apoptosis when treated in colorectal cancer cells.
  • FIG. 1 shows normal tissue and colorectal cancer patient tissue samples stained with H&E (upper part) and EDNRA antibody-stained pictures (lower part) to show the expression level of EDNRA.
  • Figure 2 shows the EDNRA staining level in normal tissue and colorectal cancer patient tissue samples.
  • FIG. 3 shows the survival period and survival rate of colorectal cancer patients expressing high levels of EDNRA and colorectal cancer patients expressing low levels of EDNRA.
  • Figure 4 shows the mRNA expression levels of EDNRA in the control group (siNC) and in the case of inhibiting the expression of EDNRA (siEDNRA) in HCT116 colorectal cancer cell line.
  • FIG. 5 shows the protein expression levels of EDNRA in the control group (siNC) and in the case of inhibiting the expression of EDNRA (siEDNRA) in the HCT116 colorectal cancer cell line.
  • Figure 6 shows the cell proliferation ability of the control group (siNC) and the case of inhibiting the expression of EDNRA (siEDNRA) in HCT116 colorectal cancer cell line.
  • FIG 7 shows the cell migration ability in the control group (siNC) and in the case of inhibiting the expression of EDNRA (siEDNRA) in HCT116 colorectal cancer cell line.
  • FIG. 8 shows the ratio of apoptotic cells in the control group (siNC), the case where EDNRA expression was suppressed (EDNRA), and the case where EDN1 expression was suppressed (siEDN1) in the HCT116 colorectal cancer cell line.
  • FIG 9 shows the expression of caspase 3 and caspase 7, which are proteins involved in cell death, in the control (siNC), EDNRA expression suppression (EDNRA), and EDN1 expression suppression (siEDN1) in HCT116 colorectal cancer cell line. showed activity.
  • FIG 10 shows the expression of caspase 3 and caspase 7, which are proteins involved in cell death, in the control (siNC), EDNRA expression suppression (EDNRA), and EDN1 expression suppression (siEDN1) in HCT116 colorectal cancer cell line. indicates the expression level.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of a cell line for screening EDNRA inhibitors for screening drugs capable of effectively inhibiting EDNRA in a compound library.
  • Figure 12 shows the change in EDNRA activity measured by luciferase activity when the cell line for screening is treated with EDN1, the ligand of EDNRA.
  • Figure 13 shows cell shape changes observed when cells for EDNRA inhibitor screening were treated with APY29 and CGP60474 compounds.
  • EDNRA protein shows the expression level of EDNRA protein at a high temperature at which protein denaturation occurs when the cell line for screening is treated with macitentan, known as an EDNRA inhibitor, and the EDNRA inhibitory activity is measured.
  • EDNRA protein 15 shows the expression level of EDNRA protein at a high temperature where protein denaturation occurs when the cell line for screening is treated with APY29 selected as an EDNRA inhibitor, and the EDNRA inhibitory activity is measured.
  • FIG. 16 shows the expression level of EDNRA protein at a high temperature where protein denaturation occurs when CGP60474 selected as an EDNRA inhibitor is treated in a cell line for screening, and EDNRA inhibitory activity is measured.
  • FIG. 18 shows cell viability after treatment of colorectal cancer cell line SW480 with APY29 at different concentrations.
  • irinotecan and APY29 which are conventional anticancer drugs, were administered individually or in combination to colon cancer cell lines HCT116 and SW480.
  • 25 shows the activities of caspase 3 and caspase 7, proteins involved in apoptosis, when irinotecan and APY29, which are conventional anticancer drugs, were administered separately or in combination to colon cancer cell lines HCT116 and SW480.
  • Figure 26 confirms whether or not a synergistic effect is exhibited when APY29 is administered in combination with an existing colorectal cancer anticancer agent such as irinotecan.
  • FIG. 27 shows the activities of caspase 3 and caspase 7, which are proteins involved in apoptosis, when irinotecan and CGP60474, which are conventional anticancer drugs, are administered individually or in combination to the colorectal cancer cell line SW480.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer of the present invention contains an EDNRA (Endothelin receptor type A) inhibitor as an active ingredient.
  • EDNRA Endothelin receptor type A
  • EDNRA Endothelin receptor type A
  • G protein-coupled receptor also known as ETA
  • EDNRA guanine-nucleotide-binding
  • EDNRA inhibitors are used as a generic term for all agents that reduce the expression or activity of EDNRA, and specifically, affect the reduction of EDNRA expression, act directly on EDNRA, or indirectly act on its ligands.
  • an expression inhibitor that reduces the expression level of EDNRA at the transcription, mRNA level, or translation level, and directly binds to the EDNRA protein or EDNRA-binding ligand to interfere with the activity, thereby inhibiting the activity of EDNRA. It may include all active inhibitors that decrease.
  • the EDNRA expression inhibitor may be any one selected from the group consisting of siRNA, shRNA, or miRNA that complementarily binds to mRNA of the EDNRA gene to degrade mRNA, and antisense nucleotides that reduce the expression of the protein of the EDNRA gene.
  • shRNA is nucleic acid molecules that can mediate RNA interference or gene silencing, and are used as efficient gene knockdown methods or gene therapy methods because they can suppress the expression of target genes.
  • shRNA is a hairpin structure formed by binding between complementary sequences within a single-stranded oligonucleotide, and in vivo, the shRNA is cleaved by dicer to form small RNA fragments of 21 to 25 nucleotides in size siRNA, which is a double-stranded oligonucleotide, can specifically bind to mRNA with a complementary sequence to inhibit its expression.
  • EDNRA can be inhibited by specifically acting on EDNRA to cleave EDNRA mRNA molecules to induce RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. The method for preparing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art may be used.
  • a method for chemically synthesizing siRNA directly a method for synthesizing siRNA using in vitro transcription, a method for cutting long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using an enzyme, Expression methods through intracellular delivery of shRNA expression plasmids or viral vectors, and expression methods through intracellular delivery of polymerase chain reaction (PCR)-induced siRNA expression cassettes, are not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the miRNA refers to a small non-coding RNA molecule, generally about 15 to about 50 nucleotides in length, preferably 17 to 23 nucleotides in length, that regulates the post-transcriptional expression of a target gene. Biogenesis of miRNAs can be accomplished by a multi-step process that occurs in the cell nucleus and cytoplasm. Mature miRNAs can be integrated into RNA-induced silencing complexes and bind to the untranslated region (UTR) of the 3' end of mRNA, which can induce mRNA degradation or translational repression. The miRNA can be processed from a hairpin precursor (pre-miRNA) of about 70 or more nucleotides derived from a primary transcript (pri-miRNA) through continuous cleavage by RNAse III enzyme in a cell.
  • pre-miRNA hairpin precursor
  • pri-miRNA primary transcript
  • antisense nucleotide as defined in Watson-Crick base pairing, interferes with the flow of genetic information from DNA to protein by binding (hybridizing) to complementary nucleotide sequences of DNA, immature-mRNA or mature mRNA.
  • the specific nature of antisense nucleotides for target sequences makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units, they can be easily synthesized against the target RNA sequence. Since many recent advances have been made in the field of oligonucleotide chemistry and the synthesis of nucleotides that exhibit improved cell adhesion, target binding affinity and nuclease resistance, the use of antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor.
  • the activity inhibitor of EDNRA is selected from the group consisting of aptamers, antibodies, small molecule compounds, peptides, peptide mimetics and substrate analogs that bind complementary to EDNRA protein capable of targeting and inhibiting EDNRA activity It can be any one.
  • the aptamer is a single-stranded DNA or RNA molecule, which can be obtained by isolating an oligomer that binds to a specific chemical or biological molecule with high affinity and selectivity by an evolutionary method using an oligonucleotide library.
  • An aptamer can specifically bind to a target and modulate the activity of the target, such as blocking the target's ability to function through binding.
  • the antibody can specifically and directly bind to EDNRA to effectively inhibit the activity of EDNRA. It is preferable to use a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as the antibody specifically binding to the EDNRA.
  • Antibodies that specifically bind to the EDNRA may be produced by known methods known to those skilled in the art, and commercially known EDNRA antibodies may be purchased and used.
  • the antibody may be prepared by injecting EDNRA protein as an immunogen into an external host according to a conventional method known to those skilled in the art. Exogenous hosts include mammals such as mice, rats, sheep, and rabbits. Immunogens are injected intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, and can be administered together with an adjuvant to increase antigenicity.
  • Antibodies can be isolated by collecting blood from an external host on a regular basis and collecting serum showing an established titer and specificity for the antigen.
  • the small molecule is an organic compound having a molecular weight of 1000 Da or less, which often acts as a regulator in biological processes, and refers to a molecule that binds to a biopolymer such as a protein or nucleic acid to regulate the function of the biopolymer.
  • Small-molecular-weight compounds inhibit protein functions or interfere with protein-protein interactions, and can be artificially synthesized.
  • the small molecule compound may be one capable of inhibiting the activity of EDNRA by binding to EDNRA or a ligand protein of EDNRA.
  • the siRNA which is an agent that inhibits EDNRA expression by complementarily binding to mRNA of the EDNRA gene, may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the compound that binds to the EDNRA protein and inhibits EDNRA expression may be APY29 or CGP60474.
  • the APY29 may have a structure shown in Formula 1 below, and as an ATP competition inhibitor It is known to function as an allosteric modulator of IRE1 ⁇ that binds to the ATP binding pocket and inhibits IRE1 ⁇ autophosphorylation. APY29 acts as a ligand that allosterically activates the IRE1 ⁇ adjacent RNase domain.
  • the CGP60474 may have a structure shown in Formula 2 below, is a potent antitoxemia agent, and functions as a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor and a selective ATP-competitive PKC inhibitor.
  • CDK cyclin-dependent kinase
  • colonal cancer refers to a disease caused by excessive proliferation of cells in the colon. These abnormal hyperproliferating cells, in some cases, invade surrounding tissues and organs to form masses, destroying or transforming the normal structure of the large intestine, and this condition is called colorectal cancer.
  • a tumor refers to a mass that grows abnormally due to autonomous overgrowth of body tissue, and can be divided into benign tumors and malignant tumors. Malignant tumors proliferate very quickly compared to benign tumors, and metastasis occurs while infiltrating surrounding tissues, threatening life.
  • colorectal cancer refers to colorectal cancer in which EDNRA is overexpressed in the transcriptional stage or overactivated after transcription.
  • prevention refers to all activities that inhibit or delay the onset of colon cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the term "treatment” refers to clinically intervening to alter the natural process of an individual or cell to be treated, which can be performed during the course of a clinical pathological condition or to prevent it. Desired therapeutic effects include preventing occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, and alleviating the disease state. or providing temporary relief, remission or improving prognosis.
  • the present invention includes all activities that improve the course of colorectal cancer by administering a composition containing a substance that inhibits EDNRA.
  • prevention refers to all activities that inhibit or delay the onset of colorectal cancer by administering a composition containing an EDNRA-inhibiting substance according to the present invention.
  • metastasis refers to a state in which a malignant tumor spreads from an organ to another tissue away from it. As a malignant tumor that started in one organ progresses, it spreads from an organ, which is the primary site where it first occurred, to other tissues, and spreading from the primary site to other tissues can be referred to as metastasis. Metastasis can be said to be a phenomenon accompanying the progression of malignant tumors, and metastasis may occur while acquiring new genetic traits as malignant tumor cells proliferate and cancer progresses. Metastasis can occur when tumor cells that have acquired new genetic traits invade blood vessels and lymph glands, circulate along the blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues.
  • composition of the present invention can prevent and treat the spread of cancer by inhibiting metastasis.
  • the term “inhibition” refers to any activity that suppresses the cancer metastasis by administration of the composition according to the present invention.
  • the EDNRA gene which has been shown to be overexpressed or overactivated in colorectal cancer patients, increases the proliferation and migration of cancer cells and inhibits apoptosis, suggesting that it can be a target gene for colorectal cancer treatment. It was confirmed that when EDNRA expression was inhibited, the proliferation of colorectal cancer cells decreased and apoptosis increased, confirming that inhibition of EDNRA could be a treatment mechanism for colorectal cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "administration" refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a subject by any suitable method, and the route of administration may be administered through various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue. .
  • the pharmaceutical composition may be appropriately administered to a subject according to a conventional method, administration route, and dosage used in the art according to purpose or necessity.
  • routes of administration include oral, parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal administration
  • parenteral injection includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration.
  • an appropriate dose and frequency of administration may be selected according to a method known in the art, and the amount and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention actually administered depend on the type of symptom to be treated, route of administration, gender, and health condition. , diet, the age and weight of the individual, and the severity of the disease can be appropriately determined by various factors.
  • a pharmaceutically effective amount in the present invention means an amount sufficient to suppress or alleviate a disease at a reasonable rate applicable to medical use, and the effective dose level depends on the type and severity of the subject, age, sex, and activity of the drug. , sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be single or multiple administrations. It is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • a pharmaceutically effective amount is 0.5 to 1000 mg/day/kg of body weight, preferably 0.5 to 500 mg/day/kg of body weight.
  • Another aspect of the present invention provides a kit for preventing or treating colorectal cancer.
  • the kit for preventing or treating colorectal cancer of the present invention includes a pharmaceutical composition containing the EDNRA (Endothelin receptor type A) inhibitor as an active ingredient and an additional colorectal cancer therapeutic agent.
  • EDNRA Endothelin receptor type A
  • the EDNRA inhibitor is an agent that reduces the expression or activity of EDNRA as described above.
  • the additional colorectal cancer therapeutic agent is an existing anticancer agent that has been clinically approved and used and has been proven to have a therapeutic effect on colorectal cancer, and may be an anticancer agent that does not specifically target EDNRA.
  • the additional colorectal cancer therapeutic agent may be at least one selected from the group consisting of metabolic process inhibitors, topotransferase inhibitors, cytokines, mitotic inhibitors, nucleic acid-interacting compounds, anti-hormones, and antibodies.
  • the compound that interacts with the nucleic acid may be a DNA topoisomerase inhibitor, and the DNA topoisomerase inhibitor may be a DNA topoisomerase type 1 inhibitor and a DNA topoisomerase type 2 inhibitor.
  • the DNA rotase serves to relax the twisting of DNA strands in the process of DNA transcription and replication.
  • DNA is transcribed and replicated as the double strands are unwound in the form of a superhelical helix, and normal transcription and replication are difficult when DNA strands are twisted due to covalent bonds between helices.
  • rotenase which plays an important role in resolving the twist phenomenon, plays an important role in cell survival. It exists in eukaryotes, archaea and fungi, human cells encode 6 genes and bacteria encode 4 genes, and they are used as targets for many anticancer and antibacterial drugs.
  • the DNA rotase inhibitor is an inhibitor that targets DNA rotase type 1 or DNA rotase type 2 to interfere with DNA transcription and replication. It exhibits anticancer effects by inhibiting rotase through four major mechanisms.
  • the first is a substrate competition inhibition mechanism in which an inhibitor binds to the active site of rotase and prevents DNA substrate binding.
  • the second is to form 'topoisomerase poison', which is composed of a ternary protein-DNA-drug complex according to the binding of topoisomerase, prevents recombination of DNA and activates the enzyme at the cleavage site. It fixes to the enzyme and blocks the conversion of the enzyme, resulting in toxicity such as inhibition of DNA replication, double-strand break and subsequent cell death.
  • the third is to block the enzyme activity through a catalyst inhibitor, and there is a possibility that it can be a powerful anti-cancer drug when a large amount of rotase is inhibited in cancer cells.
  • this inactivates the rotenase type 2 by binding the rotenase to the ATP binding site shown in the rotenase type 2.
  • the DNA rotase type 1 inhibitor binds to the DNA rotase type 1-DNA covalent complex and converts DNA rotase type 1 into a covalently bound cytotoxic addition protein.
  • the complex shows drug molecules inserted between DNA ends, inhibits DNA replication and production, and causes double-strand breaks.
  • the DNA rotase type 1 inhibitor may be any one selected from the group consisting of irinotecan, topotecan and belotecan.
  • DNA turnase type 2 inhibitors include formation of topoisomerase poison and catalytic inhibition of DNA rotase type 2. Similar to DNA rotase type 1 inhibitors, DNA rotase poison formation binds to broken DNA strands and prevents DNA repair.
  • DNA turnase type 2 inhibitors include doxorubicin, daunorubicin, etoposide, amsacrine, mitoxantrone, idarubicin, teniposide ( teniposide), valrubicin, moxifloxacin, epirubicin, dexrazoxane, and pixantrone.
  • the DNA topoisomerase inhibitor may be at least one selected from the group consisting of irinotecan, topotecan, and daunorubicin.
  • kit for preventing or treating colorectal cancer may include a pharmaceutically effective dose of an EDNRA inhibitor in the form of tablets, capsules or injections, additional colorectal cancer therapeutic agents in the form of tablets, capsules or injections, and treatment
  • instructions describing the administration method and administration order may be further included.
  • APY29 selected as an EDNRA inhibitor and irinotecan which inhibits DNA rotase and exhibits an anticancer effect
  • the effect of inhibiting viability of colorectal cancer cells is superior to that of each drug alone. and showed a cell killing effect, confirming the synergistic effect of the combined administration.
  • APY29 selected as an EDNRA inhibitor and topotecan which inhibits DNA rotase and exhibits an anticancer effect
  • colon cancer cells that are superior to those when each drug is treated alone It showed a viability inhibitory effect and a cell death effect, confirming the synergistic effect of the combined administration.
  • compositions for screening a therapeutic agent for colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level or activity level of EDNRA (Endothelin receptor type A).
  • Measuring the expression level of EDNRA in the present invention may be measuring the mRNA expression level of EDNRA.
  • measuring the level of EDNRA activity may be measuring the level of EDNRA protein expression.
  • the "mRNA expression level measurement” is a process of confirming the presence and expression level of EDNRA mRNA in order to screen for a treatment for colorectal cancer, and can be known by measuring the amount of mRNA. Analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting blotting), DNA chips, etc., but are not limited thereto.
  • the "protein expression level measurement” is a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed in a sample collected and isolated from a cell line or patient in order to screen a therapeutic agent for colorectal cancer, and specifically binds to the protein of the gene.
  • the amount of protein is confirmed using an antibody that Analysis methods for this include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion method, and rocket immunoelectrophoresis , tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, etc., but are not limited thereto.
  • the agent for measuring the mRNA level may be a primer pair, a probe, or an anti-sense nucleotide for the mRNA of EDNRA of the present invention, and the polynucleotide of EDNRA of the present invention
  • the sequence allows one skilled in the art to easily design primers, probes, or antisense nucleotide sequences.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of treating the isolated colorectal cancer cells expressing EDNRA with a candidate for colorectal cancer treatment; and measuring the expression level or activity level of EDNRA in the isolated colon cancer cells treated with the candidate substance;
  • the candidate substance may be any one selected from the group consisting of peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, or animal tissue extracts, but is not limited thereto.
  • the expression level measurement is RT-PCR, competitive RT-PCR (competitive RT-PCR), real-time RT-PCR (real-time RT-PCR), RNase protection assay (RPA; RNase protection assay), Northern blotting ) And may be measured by any one method selected from the group consisting of a DNA chip, but is not limited thereto.
  • the activity level measurement is any one selected from the group consisting of western blotting, immunoprecipitation, dual luciferase reporter assay, enzyme immunoassay (ELISA), and immunohistochemistry It may be measured by the method of, but is not limited thereto.
  • the method determines that the candidate substance can be used as an agent for treating colorectal cancer when the EDNRA expression level measured in step (b) is lower than that of the isolated colorectal cancer cells that are not treated with the candidate substance. Further steps may be included.
  • the expression level of the gene of the present invention or the level of the protein encoded by the gene in cells in the absence of a candidate substance capable of treating colon cancer is measured, and the expression level of the gene of the present invention in the presence of the candidate substance Or, after measuring the level of the protein encoded by the gene and comparing both, the expression level of the gene of the present invention when the candidate substance is present or the level of the protein encoded by the gene is the level in the absence of the candidate substance. Substances that reduce more can be predicted as agents for the treatment of colorectal cancer.
  • the screening method may be performed in vivo or in vitro, and is not particularly limited.
  • Candidate substances may be known substances or new substances, and screening may be performed on a large scale through, for example, plant extracts or chemical libraries. Through this, it is possible to discover an agent capable of inhibiting colorectal cancer by suppressing the expression or activity of EDNRA.
  • EDNRA is determined as a target for colorectal cancer treatment, and a cell line for screening a compound capable of inhibiting EDNRA was constructed.
  • a compound capable of inhibiting EDNRA was constructed.
  • APY29 and CGP60474 which have excellent EDNRA inhibitory effects without changing cell shape, were selected.
  • EDNRA is determined as a target for colorectal cancer treatment, and a cell line for screening a compound capable of inhibiting EDNRA was constructed.
  • APY29 and CGP60474 were selected, and it was confirmed that APY29 and CGP60474 effectively inhibit the growth of colon cancer cells and cause apoptosis of colon cancer cells.
  • Endothelin receptor type A (EDNRA) is a gene involved in vasoconstriction and is found in the smooth muscle tissue of blood vessels. It rises EDNRA binds to guanine-nucleotide-binding (G) protein, and this binding activates the phosphatidylinositol-calcium second messenger system. In order to confirm the change in the expression level of EDNRA in colorectal cancer patient samples, the following experiment was performed.
  • the human EDNRA antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) was diluted 1:3000, reacted overnight at 4°C, washed with TBS-T, and then incubated with EnVision anti-mouse polymer for 30 minutes. reacted during It was visualized by reacting with diaminobenzidine (DAB) and a substrate-chromogen solution for 5 minutes.
  • DAB diaminobenzidine
  • Immunohistochemical staining results were evaluated independently by two pathologists who did not know the detailed clinicopathological conditions of the patients, and staining results were divided into four levels according to staining conditions (score 1: negative staining, score 2: weak staining). , score 3: moderate staining, and score 4: strong staining).
  • EDNRA can be a target gene for colorectal cancer treatment.
  • EDNRA can be a target gene for colorectal cancer treatment.
  • EDNRA can be a target gene for colorectal cancer treatment. Since the possibility that EDNRA can be a target gene for colorectal cancer treatment was confirmed through Experimental Example 1, when the expression of the EDNRA gene is inhibited through siRNA that can specifically bind to EDNRA, the proliferation of colorectal cancer cell lines, The effect on migration and death was confirmed.
  • HCT116 cells were cultured in a 96-well image plate at a density of 3000/well in an environment of 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours, and as a control, siNC containing random sequences (AccuTarget TM Negative Control siRNA, Bioneer Corp.) and siEDNRA (SEQ ID NOs: 1 and 2, Table 1) were transfected using Lipofectamine 2000. After culturing the transfected HCT116 cells for 24 hours, the relative mRNA expression level of EDNRA was measured by quantitative RT-PCR and the expression level of EDNRA protein was measured by Western blotting, and the CCK-8 kit (Dojindo Molecular Technologies, Inc.
  • wound healing scratch assay was used for control colon cancer cells or EDNRA-inhibited colon cancer cells cultured on days 1, 2, 3, and 4.
  • the cell migratory ability was observed by evaluating the change in the number of cells that migrated and the area in which no cells were present. Cell migration was measured as a percentage of a remaining cell free area after a certain period of time relative to a cell free area immediately after scratching. The number of migrated cells was measured using an Image J cell counter.
  • Endothelin 1 (hereinafter referred to as 'EDN1'), a ligand that EDNRA binds to, was inhibited, to determine the effect on apoptosis of colorectal cancer cells, the percentage of apoptotic cells and the core of mitochondria in apoptosis mechanism
  • HCT116 cells were cultured in a 6-well image plate at a density of 10,000/well in an environment of 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours, and random sequences siNC and siEDNRA (SEQ ID NOs: 1 and 2, Table 1) were used as controls. 1) or siEDN1 (SEQ ID NOs: 3 and 4, Table 2) were transfected using Lipofectamine 2000. Transfected HCT116 cells were cultured for 48 hours and used for flow cytometry, measurement of caspase activity, and measurement of cleaved caspase 3 expression levels.
  • Flow cytometry was performed based on the instructions of the Annexin V FITC Apoptosis kit (BD Biosciences) and the percentage of dead cells was measured with BD FACS Verse.
  • caspase activity 30 ⁇ l/well of caspase 3/7-Glo solution was added to a 96 white-well image plate using the Caspase 3/7 kit (Promega Corp.) according to the manufacturer's instructions, and room temperature, dark conditions. After waiting for 30 minutes, the change in cell death rate was measured by measuring the luminescence rate.
  • EDNRA-IRES-GFP a nucleotide sequence encoding EDNRA was subcloned into a pcDNA3.1 plasmid vector expressed with a CMV promoter, and then an IRES-GFP sequence was added to simultaneously express GFP fluorescent protein.
  • EDNRA-IRES-GFP expression of the subcloned EDNRA-IRES-GFP in the PRESTO-TANGO HTLA cell line (HEK293 cell line stably expressing a tTA-dependent luciferase reporter and a ⁇ -arrestin2-TEV fusion gene) that expresses luciferase in a ⁇ -Arrestin signaling activity-dependent manner Vectors were transduced.
  • HTLA_EDNRA-IRES-GFP expressing cell line was treated with EDN1, a ligand of EDNRA, and 6 hours later, luciferase activity was measured.
  • the cell line constructed in Experimental Example 3 was screened for a compound library.
  • the cell line constructed in Experimental Example 3 was cultured in a 96-well plate at 50,000 cells per well for 24 hours, then treated with 6331 drugs and further treated with the ligand EDN1 within 15 minutes.
  • Each 96-well plate was treated with Macitentan, a known EDNRA antagonist, as a control, and 51 EDNRA inhibitors were measured based on the degree of signal transduction inhibition by measuring luciferase activity when Macitentan was treated. Candidates were selected. When the selected 51 candidates were treated, cell shape changes were observed and cell proliferative ability was confirmed by CCK-8 analysis.
  • the EDNRA inhibitory effect was verified by repeatedly measuring the luciferase activity three or more times for the finally selected drug.
  • APY29 and CGP60474 showed no change in cell shape and cell proliferative capacity even after 6 hours of treatment (FIG. 13), and even when luciferase activity was repeatedly measured three or more times, EDNRA activity was continuously significant. It was confirmed that it suppressed (Table 3). In particular, in the case of APY29, it was confirmed that the inhibitory effect of cell signaling only by the drug was exhibited with a high efficiency of 70%-80% without changing the shape of the cell.
  • EDNRA-specific inhibitory activity was verified by CETSA (cellular thermal shift assay).
  • the cell line constructed in Experimental Example 3 was cultured in a 10 cm culture container for 24 hours, and then treated with EDNRA antagonist Macitentan and candidate drugs APY29 and CGP60474 at a concentration of 30 ⁇ M for 1 hour. Thereafter, the cell culture medium was removed and the cell pellet obtained by washing three times with cold PBS was resuspended using a lysis buffer. After reacting at temperatures of 45°C, 50°C, 54°C, 58°C, and 61°C, the freezing and thawing process was repeated three times using LN2 liquid nitrogen, and a protein sample was obtained by centrifugation. Protein samples were quantified at the same concentration and Western blotting was performed to measure the protein expression level.
  • Colorectal cancer cell lines HCT116 and SW480 were treated with APY29 and CGP60474 selected as EDNRA inhibitors in Experimental Example 4 at different concentrations to measure the viability and apoptosis of colorectal cancer cells.
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480 were cultured for 24 hours at 300 each in a 96-well plate and treated with APY29 at each concentration for 48 hours to measure cell viability and calculate IC50 values.
  • the HCT116 cell line and the SW480 cell line were cultured in a 96-well image plate at a density of 3000/well in an environment of 37°C and 5% CO 2 for 24 hours, and the APY29 compound was diluted in DPBS to obtain final concentrations of 0 and 0.01. , 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 ⁇ M.
  • the IC50 value representing the concentration of the drug required for 50% inhibition of the viability of the HCT116 cell line was 0.29 ⁇ M
  • the IC50 value of the SW480 cell line was 0.27 ⁇ M, indicating that the growth of colon cancer cells was effectively inhibited (FIG. 17 and Figure 18).
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480 were cultured for 24 hours at 300 each in a 96-well plate, and APY29 was treated at concentrations of 0.25, 0.5, and 1 ⁇ M, and CGP60474 at concentrations of 0.25 and 0.5 ⁇ M for 48 hours, and the Experimental Example 2-3 Caspase 3 and caspase 7 activities were measured in the same manner as above.
  • 5000 each of the colorectal cancer cell line HCT116 were cultured in a 6-well plate, treated with APY29 at a concentration of 1 ⁇ M for 48 hours, and the degree of cell death was measured in the same manner as in Experimental Example 2-3.
  • colorectal cancer cell lines HCT116 and SW480 when APY29 selected as an EDNCRA inhibitor and irinotecan, which inhibits DNA rotase and exhibits anticancer effects, were treated alone or in combination, the viability, apoptosis rate, and synergistic effect of colorectal cancer cells were confirmed.
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480 were cultured in 96-well plate at 3,000 each for 24 hours, and irinotecan at a concentration of 10 ⁇ M and APY29 at a concentration of 0.5 ⁇ M were treated individually or in combination, and after 48 hours, the same cells as in Experimental Example 2-1 were obtained.
  • CCK8 assay was performed using the method to measure cell growth rate.
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480, were cultured in 96-well plate at 3,000 each for 24 hours, and irinotecan at a concentration of 10 ⁇ M and APY29 at a concentration of 0.5 ⁇ M were treated separately or in combination, and after 48 hours, the same as in Experimental Example 2-3 The degree of cell death was measured by analyzing caspase 3/7 activity using the method.
  • HCT116 and SW480 colorectal cancer cell lines exhibited superior colorectal cancer cell killing effects than irinotecan, an existing anticancer drug, and showed the best colorectal cancer cell killing effects when administered in combination with irinotecan (FIG. 25).
  • APY29 exhibits a significant colorectal cancer cell killing effect alone, and furthermore, can exhibit a further improved anticancer effect when administered in combination with an existing colorectal cancer anticancer drug such as irinotecan.
  • CI Combination Index
  • CI Combination Index
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480, were cultured in 96-well plate at 3,000 each for 24 hours, Topotecan at a concentration of 2 ⁇ M, and APY29 at a concentration of 0.5 ⁇ M, respectively or in combination, and 48 hours later, the experimental example 2-1 and CCK8 assay was performed in the same manner to measure the cell growth rate.
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480, were cultured in 96-well plate at 3,000 each for 24 hours, Topotecan at a concentration of 2 ⁇ M and APY29 at a concentration of 0.5 ⁇ M, respectively or in combination, and 48 hours later, the experimental example 2-3 and The degree of cell death was measured by analyzing caspase 3/7 activity in the same manner.
  • HCT116 and SW480 colorectal cancer cell lines exhibited superior colorectal cancer cell killing effect than Topotecan, an existing anticancer drug, and showed the best colorectal cancer cell killing effect when administered in combination with Topotecan (FIG. 30).
  • APY29 alone exhibits a significant colorectal cancer cell killing effect, and furthermore, it can exhibit a further improved anticancer effect when administered in combination with an existing colorectal cancer anticancer drug such as topotecan.
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480, were cultured in 96-well plate at 3,000 each for 24 hours, and then treated with daunorubicin at a concentration of 0.2 ⁇ M and APY29 at a concentration of 0.5 ⁇ M, respectively or in combination, and 48 hours later, the experimental example 2- CCK8 assay was performed in the same manner as in 1 to measure the cell growth rate.
  • HCT116 and SW480 colorectal cancer cell lines exhibited superior colorectal cancer cell viability inhibitory effect than daunorubicin, an existing anticancer drug, and showed the best colorectal cancer cell viability inhibitory effect when administered in combination with daunorubicin ( Figure 31).
  • APY29 alone exhibits a significant effect of suppressing the viability of colorectal cancer cells, and furthermore, it can exhibit a further improved anticancer effect when administered in combination with an existing colorectal cancer anticancer drug such as daunorubicin.
  • Colon cancer cell lines HCT116 and SW480, were cultured in 96-well plate at 3,000 each for 24 hours, and then treated with daunorubicin at a concentration of 0.2 ⁇ M and APY29 at a concentration of 0.5 ⁇ M, respectively or in combination, and 48 hours later, the experimental example 2- The degree of cell death was measured by analyzing caspase 3/7 activity in the same manner as in 3.
  • HCT116 and SW480 colorectal cancer cell lines exhibited superior colorectal cancer cell killing effect than daunorubicin, an existing anticancer drug, and showed the best colorectal cancer cell killing effect when administered in combination with daunorubicin (FIG. 32 ).
  • the above results suggest that APY29 alone exhibits a significant colorectal cancer cell killing effect, and furthermore, it can exhibit a further improved anticancer effect when administered in combination with an existing colorectal cancer anticancer drug such as daunorubicin.

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Abstract

본 발명은 EDNRA 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, EDNRA 발현을 억제하였을 때 대장암 세포의 증식이 감소하고 세포 사멸이 증가하는 것을 확인하여 EDNRA의 억제가 대장암 치료 기전이 될 수 있음을 확인하고, EDNRA 억제제 약물 스크리닝으로 APY29, CGP60474를 선별하여 대장암 세포에 처리하였을 때 세포 사멸을 일으키는 것을 확인하였다. 아울러, EDNRA 억제제로 선별한 APY29, CGP60474 화합물이 대장암 치료법에 많이 쓰이는 세포독성항암제인 이리노테칸, 토포테칸 또는 다우노루비신과 동시에 투여하였을 때, 암 세포 사멸 효과가 상승하는 것을 확인하여 내성이 생긴 기존 항암제와 병용 투여 되어 암 치료 효과를 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

Description

EDNRA 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
[관련 출원과의 상호 인용]
본 출원은 2022년 02월 24일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0024543호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국특허출원 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
[기술분야]
본 발명은 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화, 식생활의 서구화로 인한 고지방식의 섭취의 일반화, 환경 오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.
그 중에서도 대장암은 결장 또는 직장에 생기는 악성 종양을 의미하며 국내에서 4번째로 많이 발생하는 암이지만 초기 단계에서는 아무 증상이 없다가 어느 정도 진행되면 혈변, 잔변감, 빈혈 등의 증상이 나타나 초기 생존율이 90%에 달함에도 불구하고 사망률이 높다. 인구 10만 명당 17.5명이 대장암으로 사망하는데 폐암(36.2명), 간암(20.6명)에 이어 세 번째로 높은 수치이다.
대장암은 주로 수술과 항암제 투여로 치료하는 것이 일반적이나, 대장암 치료에 사용할 수 있는 약제의 수가 많지 않다. 현재 대장암치료에 사용되는 약제로는 5-플루오로우라실(5-Fluorouracil, 5-FU), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 이리노테칸(irinotecan) 같은 세포 독성 항암제와 세툭시맙(cetuximab)이나 베바시주맙(bevacizumab) 같은 항체 치료제를 병용하여 사용하고 있으나 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 치명적이고 항암제 내성으로 재발률이 높아 5년 생존율이 65%에 불과하다.
이에, 대장암 치료를 위해 대장암에서 특이적으로 발현 수준이 높은 표적 유전자를 발굴하고 표적 유전자를 억제하는 물질의 스크리닝을 통하여 단독 항암제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 항암제와 병용 투여되어 항암제에 내성을 나타내는 환자들에게도 효과적인 치료 전략이 될 수 있는 항암제에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다.
본 발명은 대장암을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 신규의 대장암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 EDNRA(Endothelin receptor type A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 EDNRA의 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 EDNRA를 과발현하는 분리된 대장암 세포에 대장암 치료제 후보 물질을 처리하는 단계 및 상기 후보 물질이 처리된 분리된 대장암 세포에서 EDNRA 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 대장암에서 과발현된 EDNRA 유전자가 암 세포의 증식 및 이동을 증가시키고 세포 사멸을 억제하는 역할을 하여 대장암 치료의 표적 유전자가 될 수 있음을 확인하였고, EDNRA 발현을 억제하였을 때 대장암 세포의 증식이 감소하고 세포 사멸이 증가하는 것을 확인하여 EDNRA의 억제가 대장암 치료 기전이 될 수 있음을 확인하였다.
또한 본 발명에서는, EDNRA 억제제 약물 스크리닝을 통하여 APY29, CGP60474를 선별하여 대장암 세포에 처리하였을 때 세포 사멸을 일으키는 것을 확인하였다
아울러, 대장암 치료법에 많이 쓰이는 세포독성항암제인 이리노테칸, 토포테칸 또는 다우노루비신과 동시에 투여하였을 때, 암 세포 사멸 효과가 상승하는 것을 확인하여 내성이 생긴 기존 항암제와 병용 투여 되어 암 치료 효과를 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 정상 조직과 대장암 환자 조직 시료를 H&E 염색한 사진(상단) 및 EDNRA의 발현 정도를 나타내기 위해 EDNRA 항체로 염색한 사진(하단)을 나타낸 것이다.
도 2는 정상 조직과 대장암 환자 조직 시료에서 EDNRA 염색 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 EDNRA를 높은 수준으로 발현하는 대장암 환자 및 EDNRA를 낮은 수준으로 발현하는 대장암 환자의 생존 기간 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 4는 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC) 및 EDNRA의 발현을 억제한 경우(siEDNRA)에 EDNRA의 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC) 및 EDNRA의 발현을 억제한 경우(siEDNRA)에 EDNRA의 단백질 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 6은 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC) 및 EDNRA의 발현을 억제한 경우(siEDNRA)에 세포 증식능을 나타낸 것이다.
도 7은 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC) 및 EDNRA의 발현을 억제한 경우(siEDNRA)에 세포 이동능을 나타낸 것이다.
도 8은 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC), EDNRA의 발현을 억제한 경우(EDNRA), EDN1의 발현을 억제한 경우(siEDN1)에 사멸된 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 9는 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC), EDNRA의 발현을 억제한 경우(EDNRA), EDN1의 발현을 억제한 경우(siEDN1)에 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 10은 HCT116 대장암 세포주에서 대조군(siNC), EDNRA의 발현을 억제한 경우(EDNRA), EDN1의 발현을 억제한 경우(siEDN1)에 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 11은 화합물 라이브러리에서 EDNRA를 효과적으로 억제할 수 있는 약물을 스크리닝하기 위한 EDNRA 억제제 스크리닝용 세포주의 모식도를 나타낸 것이다.
도 12는 스크리닝용 세포주에 EDNRA의 리간드인 EDN1 처리시 EDNRA의 활성 변화를 루시퍼라제 활성으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 13은 APY29 및 CGP60474 화합물을 EDNRA 억제제 스크리닝용 세포주에 처리하였을 때, 세포 모양 변화를 관찰한 것이다.
도 14는 스크리닝용 세포주에 EDNRA 억제제로 알려진 마시텐탄을 처리하였을 때, 단백질의 변성이 일어나는 높은 온도에서 EDNRA 단백질의 발현 수준을 나타낸 것으로 EDNRA 억제 활성을 측정한 것이다.
도 15는 스크리닝용 세포주에 EDNRA 억제제로 선별된 APY29를 처리하였을 때, 단백질의 변성이 일어나는 높은 온도에서 EDNRA 단백질의 발현 수준을 나타낸 것으로 EDNRA 억제 활성을 측정한 것이다.
도 16은 스크리닝용 세포주에 EDNRA 억제제로 선별된 CGP60474를 처리하였을 때, 단백질의 변성이 일어나는 높은 온도에서 EDNRA 단백질의 발현 수준을 나타낸 것으로 EDNRA 억제 활성을 측정한 것이다.
도 17은 대장암 세포주 HCT116에 APY29를 농도별로 처리한 후 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 18은 대장암 세포주 SW480에 APY29를 농도별로 처리한 후 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 19는 대장암 세포주 HCT116에 APY29를 농도별로 처리한 후 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 20은 대장암 세포주 SW480에 APY29를 농도별로 처리한 후 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 21은 대장암 세포주 HCT116에 CGP60474를 농도별로 처리한 후 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 22는 대장암 세포주 SW480에 CGP60474를 농도별로 처리한 후 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 23은 대장암 세포주 HCT116에 APY29를 농도별로 처리한 후 사멸된 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 24는 대장암 세포주 HCT116 및 SW480에 기존 항암제인 이리노테칸과 APY29를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 25는 대장암 세포주 HCT116 및 SW480에 기존 항암제인 이리노테칸과 APY29를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 26은 APY29를 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여하였을 때 상승 효과를 나타내는지 여부를 확인한 것이다.
도 27은 대장암 세포주 SW480에 기존 항암제인 이리노테칸과 CGP60474를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 28은 CGP60474를 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여하였을 때 상승 효과를 나타내는지 여부를 확인한 것이다.
도 29는 대장암 세포주 HCT116 및 SW480에 기존 항암제인 토포테칸과 APY29를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 30은 대장암 세포주 HCT116 및 SW480에 기존 항암제인 토포테칸과 APY29를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
도 31는 대장암 세포주 HCT116 및 SW480에 기존 항암제인 다우노루비신과 APY29를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 32은 대장암 세포주 HCT116 및 SW480에 기존 항암제인 다우노루비신과 APY29를 각각 또는 병용 투여하였을 때, 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명의 일 측면은 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 EDNRA(Endothelin receptor type A) 억제제를 유효성분으로 포함한다.
상기 "EDNRA(Endothelin receptor type A)"는 ETA로도 알려진 인간 G 단백질 결합 수용체로, 혈관 수축에 관여하는 단백질이다. 혈관의 평활근 조직에서 발견되며 EDNRA에 이의 리간드인 엔도테린이 결합하면 혈관 수축(혈관벽 수축)과 나트륨 저류가 증가하여 혈압이 상승한다. EDNRA는 구아닌-뉴클레오티드-결합(G) 단백질(guanine-nucleotide-binding (G) protein)과 결합하고, 이러한 결합은 포스파티딜이노시톨-칼슘 2차 메신저 시스템을 활성화한다.
본 발명에서 EDNRA 억제제는 EDNRA의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 EDNRA의 발현 감소에 영향을 주거나 EDNRA에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, EDNRA의 발현양을 전사(transcription), mRNA 수준, 또는 이행 (translation) 수준에서 감소시키는 발현 억제제와, EDNRA 단백질 또는 EDNRA에 결합하는 리간드에 직접적으로 결합하여 활성을 방해함으로써, EDNRA의 활성을 감소시키는 활성 억제제를 모두 포함할 수 있다.
상기 EDNRA의 발현 억제제는 EDNRA 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 mRNA를 분해시키는 siRNA, shRNA 또는 miRNA 및 EDNRA 유전자의 단백질의 발현을 감소시키는 안티센스 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 siRNA 및 shRNA는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knock down) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 EDNRA에 특이적으로 작용하여 EDNRA mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 EDNRA를 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 miRNA는 표적 유전자의 전사 후 발현을 조절하는, 일반적으로 약 15 내지 약 50 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 17 내지 23 뉴클레오티드 길이의 작은 비-암호화 RNA 분자를 지칭한다. miRNA의 생물발생은 세포핵 및 세포질에서 발생하는 다단계의 과정에 의해 이루어질 수 있다. 성숙한 miRNA는 RNA-유도된 침묵화 복합체에 통합되어 mRNA의 3' 말단의 비번역 영역 (UTR)에 결합할 수 있고, 이는 mRNA 분해 또는 번역 억제를 유도할 수 있다. 상기 miRNA는 세포 내에서 RNAse III 효소에 의한 연속 절단을 통해 1차 전사물 (pri-miRNA)로부터 유래되는 약 70 개 이상 뉴클레오티드의 헤어핀 전구체 (pre-miRNA)로부터 가공될 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 EDNRA의 활성 억제제는 EDNRA을 표적으로 하여 활성을 억제할 수 있는 EDNRA 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 항체, 저분자 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics) 및 기질 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 앱타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.
상기 항체는 EDNRA에 특이적이고 직접적으로 결합하여 EDNRA의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 EDNRA에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 EDNRA에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 EDNRA 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 EDNRA 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
상기 저분자 화합물(small molecule)은 분자량이 1000Da 이하인 유기 화합물로, 생물학적 과정에서 조절자로 작용하는 경우가 많으며, 단백질이나 핵산과 같은 생체고분자에 결합하여 생체고분자의 기능을 조절하는 분자를 의미한다. 저분자 화합물을 단백질의 기능을 저해하거나 단백질-단백질 상호작용을 방해하기도 하며, 인공적으로 합성될 수 있다. 본 발명에서 저분자 화합물은 EDNRA 또는 EDNRA의 리간드 단백질과 결합하여 EDNRA의 활성을 억제할 수 있는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 EDNRA 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 EDNRA 발현을 억제하는 제제인 siRNA는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현 예에서, 상기 EDNRA 단백질에 결합하여 EDNRA 발현을 억제하는 제제인 화합물은 APY29 또는 CGP60474일 수 있다.
상기 APY29는 아래 화학식 1과 같은 구조를 가질 수 있고, ATP 경쟁 억제제로 ATP 결합 포켓에 결합하여 IRE1α 자가인산화를 억제하는 IRE1α의 알로스테릭 조절제로 기능함이 알려져 있다. APY29는 IRE1α 인접 RNase 도메인을 알로스테릭하게 활성화하는 리간드로 작용한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023002511-appb-img-000001
상기 CGP60474는 아래 화학식 2와 같은 구조를 가질 수 있고, 강력한 항독소혈증제로 사이클린 의존성 키나제(CDK) 억제제이며 선택적 ATP 경쟁 PKC 억제제로 기능한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023002511-appb-img-000002
본 발명에서 용어 "대장암"은 대장에서 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 대장의 정상적인 구조를 파괴 하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 대장암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 증식에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 증식속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 특히, 본 발명에서 대장암은 EDNRA가 전사 단계에서 과발현되거나 전사 후 과활성화되는 대장암을 의미한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 EDNRA을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 대장암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 EDNRA을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 대장암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 "전이 (metastasis)"는 악성 종양이 발병한 장기에서 떨어진 다른 조직으로 전파한 상태를 말한다. 하나의 장기에서 시작한 악성 종양이 진행함에 따라 처음 발생한 원발 부위인 장기로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는데, 이렇게 원발 부위로부터 다른 조직으로 퍼져 나가는 것을 전이라 할 수 있다. 전이는 악성 종양의 진행에 수반되는 현상이라고 할 수 있는데, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 전이가 일어날 수 있다. 새로운 유전 형질을 획득한 종양 세포가 혈관과 림프선으로 침입하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어날 수 있다.
전이가 발생하는 조직에 따라, 간암, 신장암, 폐암, 위암, 직장암, 췌장암 등 각종 암질환이 유발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 전이를 억제하여 암이 퍼지는 것을 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "억제"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 암 전이를 억제시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 대장암 환자에서 과발현 또는 과활성화된 것으로 나타난 EDNRA 유전자가 암 세포의 증식 및 이동을 증가시키고 세포 사멸을 억제하는 역할을 하여 대장암 치료의 표적 유전자가 될 수 있음을 확인하였고, EDNRA 발현을 억제하였을 때 대장암 세포의 증식이 감소하고 세포 사멸이 증가하는 것을 확인하여 EDNRA의 억제가 대장암 치료 기전이 될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 구체적인 일실시예에서는 선별된 APY29와 CGP60474가 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제하고, 대장암 세포의 사멸을 일으키는 것을 확인하였다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 비율로 질환을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 유효한 양은 0.5∼1000 ㎎/day/체중㎏, 바람직하게는 0.5∼500 ㎎/day/체중㎏이다.
2. 대장암의 예방 또는 치료용 키트
본 발명의 다른 측면은 대장암의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 대장암의 예방 또는 치료용 키트는, 상기 EDNRA(Endothelin receptor type A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 추가적인 대장암 치료제를 포함한다.
상기 EDNRA 억제제는 EDNRA의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제로 상술한바와 같다.
상기 추가의 대장암 치료제는 임상적으로 승인되어 사용되고 있는 기존의 항암제로 대장암에 치료 효과가 있다고 입증된 항암제이고, 특히 EDNRA를 표적으로 하지 않는 항암제일 수 있다.
상기 추가의 대장암 치료제는 구체적으로 대사과정 억제제, 국소이송화효소 억제제, 사이토카인, 유사분열 억제제, 핵산과 상호작용하는 화합물, 항호르몬 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 핵산과 상호작용하는 화합물은 DNA 회전효소 억제제(DNA topoisomerase inhibitor)일 수 있고, 상기 DNA 회전효소 억제제는 DNA 회전효소 타입 1 억제제와 DNA 회전효소 타입 2 억제제일 수 있다.
상기 DNA 회전효소는 DNA 전사 및 복제 과정에서 DNA 가닥의 꼬임 현상을 이완시키는 역할을 한다. DNA는 초나선 형태로 이중 가닥이 풀리면서 전사 및 복제가 진행되는데, 나선 간의 공유 결합으로 인한 DNA 가닥의 꼬임 현상이 나타나면 정상적인 전사 및 복제가 어렵게 된다. 이때 꼬임 현상을 해결에 중요한 역할을 하는 회전효소는 세포의 생존에 중요한 역할을 한다. 진핵생물, 고세균 및 진균에 존재하며, 인간 세포는 6개의 유전자가 암호화되어 있고 박테리아는 4개의 유전자가 암호화되어 있으며, 많은 항암 및 항균 약물의 표적으로 활용되고 있다.
상기 DNA 회전효소 억제제는 DNA 회전효소 타입 1 또는 DNA 회전효소 타입 2를 표적으로 하여 DNA의 전사 및 복제 과정을 방해하는 억제제이다. 크게 4가지 기전을 통해 회전효소를 억제하여 항암 효과를 나타낸다. 첫 번째는 회전효소의 활성 부위에 억제제가 결합하여 DNA 기질이 결합하는 것을 방해하는 기질 경쟁 억제 기전이다. 두 번째는 '회전효소 포이즌(topoisomerase poison)'을 형성하는 것으로 회전효소의 결합에 따라 삼원 단백질-DNA 약물 복합체(Ternary protein-DNA-drug complex)로 구성되며 DNA의 재결합을 방지하고 효소를 절단 부위에 고정해 효소의 전환을 막아 DNA 복제 억제, 이중 가닥 절단 및 후속 세포 사멸 등의 독성을 주게 된다. 세 번째는 촉매 억제제를 통해 효소 활성을 막는 것으로, 암세포에서 다량의 회전효소를 억제할 경우 강력한 항암제가 될 수 있는 가능성이 있다. 마지막으로 ATP 결합 부위를 억제하는 것으로, 이것은 회전효소 타입 2에서 나타나는 ATP 결합 부위에 회전효소가 결합하여 회전효소 타입 2를 불활성화시킨다.
상기 DNA 회전효소 타입 1 억제제는 DNA 회전효소 타입 1-DNA 공유결합 복합체에 결합하여 DNA 회전효소 타입 1을 공유결합 세포독성 부가 단백질로 변환시킨다. 상기 복합체는 DNA 말단 사이에 약물 분자가 삽입된 모습을 보이며, DNA 복제 및 생성을 억제하고 이중 가닥 절단을 발생시킨다. DNA 회전효소 타입 1 억제제는 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan) 및 벨로테칸(belotecan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 DNA 회전효소 타입 2 억제제의 대표적인 기전으로 회전효소 포이즌(topoisomerase poison) 형성과 DNA 회전효소 타입 2의 촉매적 억제가 있다. DNA 회전효소 포이즌 형성은 DNA 회전효소 타입 1 억제제와 유사하게 끊어진 DNA 가닥에 결합하여 DNA의 복원을 방해한다. DNA 회전효소 타입 2 억제제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에토포시드(etoposide), 암사크린(amsacrine), 미톡산트론(mitoxantrone), 이다루비신(idarubicin), 테니포시드(teniposide), 발루비신(valrubicin), 목시플록사신(moxifloxacin), 에피루비신(epirubicin), 덱스라족산(dexrazoxane) 및 픽산트론(pixantrone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 DNA 회전효소 억제제(DNA topoisomerase inhibitor)는 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan) 및 다우노루비신(daunorubicin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 대장암의 예방 또는 치료용 키트는 정제, 캡슐 또는 주사 형태로서 약학적으로 유효한 투여량의 EDNRA 억제제, 정제, 캡슐 또는 주사 형태로서 약학적으로 유효한 투여량의 추가적인 대장암 치료제와 치료용 키트 성분들의 동시 투여를 위하여 투여 방법, 투여 순서를 기재한 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 EDNRA 억제제로 선별된 APY29와 DNA 회전효소를 억제하여 항암 효과를 나타내는 이리노테칸을 병용으로 처리하였을 때, 각 약물을 단독으로 처리하였을 때보다 우수한 대장암 세포의 생존능 억제 효과와 세포 사멸 효과를 나타내어 병용 투여에 따른 상승 효과를 확인하였다.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 EDNRA 억제제로 선별된 CGP60474와 DNA 회전효소를 억제하여 항암 효과를 나타내는 이리노테칸을 병용으로 처리하였을 때, 각 약물을 단독으로 처리하였을 때보다 우수한 대장암 세포의 생존능 억제 효과와 세포 사멸 효과를 나타내어 병용 투여에 따른 상승 효과를 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는 EDNRA 억제제로 선별된 APY29와 DNA 회전효소를 억제하여 항암 효과를 나타내는 토포테칸을 병용으로 처리하였을 때, 각 약물을 단독으로 처리하였을 때보다 우수한 대장암 세포의 생존능 억제 효과와 세포 사멸 효과를 나타내어 병용 투여에 따른 상승 효과를 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구체적인 일 실시예에서는 EDNRA 억제제로 선별된 APY29와 DNA 회전효소를 억제하여 항암 효과를 나타내는 다우노루비신을 병용으로 처리하였을 때, 각 약물을 단독으로 처리하였을 때보다 우수한 대장암 세포의 생존능 억제 효과와 세포 사멸 효과를 나타내어 병용 투여에 따른 상승 효과를 확인하였다.
3. 대장암 치료제 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 측면은 EDNRA(Endothelin receptor type A)의 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 EDNRA 발현 수준을 측정하는 것은 EDNRA의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에서 EDNRA 활성 수준을 측정하는 것은 EDNRA 단백질 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 "mRNA 발현 수준 측정"이란 대장암 치료제를 스크리닝하기 위하여 EDNRA의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 "단백질 발현 수준 측정"이란 대장암 치료제를 스크리닝하기 위하여 세포주 또는 환자로부터 채취되어 분리된 시료에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (complement fixation assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 EDNRA의 mRNA에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브(probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)일 수 있으며, 본 발명의 EDNRA의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 항체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 EDNRA를 발현하는 분리된 대장암 세포에 대장암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보 물질이 처리된 분리된 대장암 세포에서 EDNRA 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 또는 동물 조직 추출액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발현 수준 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 활성 수준 측정은 웨스턴 블랏팅(western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라아제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 상기 (b) 단계에서 측정된 EDNRA 발현 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 대장암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 대장암 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
대장암을 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포에서의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하고 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료용 제제로 예측할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)에서 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 후보 물질은 공지된 물질 또는 신규 물질일 수 있으며, 예를 들어 식물 추출물 또는 케미컬 라이브러리(chemical library)를 통하여 대규모로 스크리닝을 수행할 수 있다. 이를 통해 EDNRA의 발현 또는 활성을 억제하여 대장암을 억제할 수 있는 제제를 발굴할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서는 대장암 환자에서 EDNRA가 특이적으로 과발현한다는 점에 비추어 EDNRA를 대장암 치료의 표적으로 판단하고, EDNRA를 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하기 위한 세포주를 구축하였다. 화합물의 스크리닝 결과 51개의 EDNRA 억제제 후보물질 중에 세포의 모양의 변화 없이 EDNRA 억제 효과가 우수한 APY29와 CGP60474를 선별하였다.
따라서, 대장암 환자에서 EDNRA가 특이적으로 과발현한다는 점에 비추어 EDNRA를 대장암 치료의 표적으로 판단하고, EDNRA를 억제할 수 있는 화합물을 스크리닝하기 위한 세포주를 구축하였다. 그 결과 APY29와 CGP60474가 선별되었으며, APY29와 CGP60474가 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제하고, 대장암 세포의 사멸을 일으키는 것을 확인하여 EDNRA를 표적으로 하여 대장암 치료제를 발굴할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되지 아니한다.
[실시예 1]
대장암 환자에서 엔토테린 수용체 A(Endothelin receptor type A, EDNRA)의 발현 수준 확인
[1-1] 대장암 환자에서 채취한 조직에서 엔도테린 수용체 A의 발현 수준 확인
엔도테린 수용체 A(Endothelin receptor type A, 이하 'EDNRA')는 혈관 수축에 관여하는 유전자로 혈관의 평활근 조직에서 발견되며 EDNRA에 엔도테린이 결합하면 혈관 수축(혈관벽 수축)과 나트륨 저류가 증가하여 혈압이 상승한다. EDNRA는 구아닌-뉴클레오티드-결합(G) 단백질(guanine-nucleotide-binding (G) protein)과 결합하고, 이러한 결합은 포스파티딜이노시톨-칼슘 2차 메신저 시스템을 활성화한다. 대장암 환자 시료에서 EDNRA의 발현 수준 변화를 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 파라핀에 포매된 조직 어레이(Colon Tumor Matched Pair Tissue Array, Biochain, USA)를 이용하여 29명의 대장암 환자의 대장암 조직과 주변 정상 조직을 3 ㎛ 두께로 자르고, 쌍을 이루어 슬라이드 글라스에 보존하였다. 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거하였으며, 단계별 알코올을 이용하여 재수화시킨 후, 10 mM 시트르산 나트륨 버퍼에서 97℃, 20분 동안 세척하였다. 시료 안에 존재하는 페록시다아제(peroxidase)를 제거하기 위해 3% 과산화수소(hydogen peroxide)를 처리하고, 백그라운드 염색을 무혈청(serum-free) 단백질 블로킹 용액과 반응시켜 제거하였다. 그 후, 인간 EDNRA 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 1:3000으로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시키고, TBS-T로 세척한 후 인비전 항-마우스(EnVision anti-mouse) 폴리머와 30분 동안 반응시켰다. 5분 동안 디아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAB) 및 기질-크로모젠(substrate-chromogen) 용액과 반응시켜 가시화시켰다.
면역조직학적 염색 결과는 환자들의 상세한 임상병리학적 상태를 모르는 두 명의 병리학자에 의해 독립적으로 평가되었으며, 염색 결과는 염색 상태에 따라 네 단계로 구분하였다(점수 1: 음성 염색, 점수 2: 약한 염색, 점수 3: 중간 염색, 및 점수 4: 강한 염색).
그 결과, 정상 조직에 비하여 대장암 환자에서 채취한 종양 조직에서 EDNRA 항체로 염색된 면적이 넓은 것을 나타내 EDNRA의 발현 수준이 높아져 있음을 확인할 수 있었다(도 1). 그리고, 정상 조직에 비하여 대장암 환자에서 채취한 종양 조직에서 강한 EDNRA 염색 수준을 나타내어 EDNRA의 발현 수준이 높아져 있음을 확인할 수 있었다(도 2).
따라서, 위와 같은 결과는 EDNRA가 대장암 치료를 위한 표적 유전자가 될 수 있는 가능성을 제시한다.
[1-2] EDNRA의 발현과 대장암 환자 생존 기간과의 상관관계 확인
EDNRA의 발현과 대장암 환자 생존 기간과의 상관관계를 확인하기 위하여 대장암 환자의 데이터베이스에서 외과적 절제술을 받은 날로부터 대장암으로 인한 사망까지의 기간을 조사하였다. 생존 곡선은 카플란-메이어 방법(Kaplan-Meier method)으로 로그-랭크 테스트(log-rank test)를 이용하여 분석하였으며, SPSS version 17.0 소프트웨어 프로그램(SPSS, Chicago, 미국)을 사용하였다.
그 결과, EDNRA를 높은 수준으로 발현하는 대장암 환자는 대장암 발병 80일 이후의 생존율이 약 40% 정도로 나타났고, 140일 이상 생존한 환자는 없었으나, EDNRA를 낮은 수준으로 발현하는 대장암 환자는 대장암 발병 60일 이후 생존율이 약 60% 정도를 유지하였고, 140일 이후까지 생존한 것을 확인하였다. 따라서, EDNRA를 낮게 발현하는 환자들이 유의적으로 짧은 생존 기간 및 생존율을 가지는 것을 확인하였다(P=0.011, 도 3). 위와 같은 결과는 EDNRA가 대장암 치료를 위한 표적 유전자가 될 수 있는 가능성을 제시한다.
[실시예 2]
EDNRA의 발현 억제가 대장암 세포에 미치는 영향 확인
상기 실험예 1을 통해 EDNRA가 대장암 치료를 위한 표적 유전자가 될 수 있는 가능성을 확인하였으므로, EDNRA에 특이적으로 결합할 수 있는 siRNA를 통하여 EDNRA 유전자의 발현을 억제하였을 때 대장암 세포주의 증식, 이동, 사멸에 미치는 영향을 확인하였다.
[2-1] 대장암 세포주에서 EDNRA 억제에 의한 세포의 증식 억제 확인
EDNRA 억제에 의한 대장암 세포 증식능 억제를 확인하기 위하여 대장암 세포주인 HCT116를 사용하여 실험을 수행하였다.
구체적으로, HCT116 세포를 96 웰 이미지 플레이트에 3000개/웰의 밀도로 37℃, 5% CO2의 환경에서 24시간 동안 배양하고, 대조군으로 무작위 서열을 포함하는 siNC(AccuTargetTM Negative Control siRNA, Bioneer Corp.)와 siEDNRA(서열번호 1 및 2, 표 1)를 리포펙타민 2000을 이용하여 형질감염 시켰다. 형질감염 된 HCT116 세포를 24시간 동안 배양한 후, 상대적인 EDNRA의 mRNA 발현 수준은 정량적 RT-PCR로, EDNRA 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블랏팅으로 측정하고, CCK-8 키트(Dojindo Molecular Technologies, Inc.)를 이용하여 제조사의 지침에 따라, 96 웰 이미지 플레이트에 10㎕/웰의 세포를 넣어 37℃, 5% CO2의 환경에서 1시간 동안 배양한 다음, 450nm에서의 흡광도를 측정하여 24시간 간격으로 세포의 증식능을 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비하여 EDNRA의 발현을 억제한 대장암 세포주에서 EDNRA의 mRNA 발현 및 단백질의 발현이 유의하게 억제된 것을 확인하였다(도 4 및 도 5). 또한, 대조군에 비하여 EDNRA의 발현을 억제한 대장암 세포주에서 세포의 증식이 유의하게 억제된 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 위와 같은 결과는 EDNRA 발현의 억제가 대장암 세포의 증식능을 억제할 수 있음을 제시한다.
명칭 서열(5'→3') 서열번호
siEDNRA sense GCACUGGUUGGAUGUGUAA 서열번호 1
siEDNRA
antisense 		UUACACAUCCAACCAGUGC 서열번호 2
[2-2] 대장암 세포주에서 EDNRA 억제에 의한 세포의 이동 억제 확인
EDNRA 억제에 의한 대장암 세포 이동능 억제를 확인하기 위하여 wound healing scratch assay를 이용하여 1일, 2일, 3일 및 4일에 배양한 대조군 대장암 세포 또는 EDNRA를 억제한 대장암 세포에 대하여 세포가 존재하지 않는 면적 및 이동한 세포의 수의 변화를 평가하여 세포의 이동능을 관찰하였다. 세포 이동은 스크래치를 만든 직후 세포가 존재하지 않는 면적(cell free area)에 대한 일정 시간이 경과한 후 잔존하는 세포가 존재하지 않는 면적(remaining cell free area)의 백분율로서 측정되었다. 이동한 세포의 수는 이미지 J 세포 계수기를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비하여 EDNRA의 발현을 억제한 대장암 세포주에서 대장암 세포의 이동 능력이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 7). 따라서, 위와 같은 결과는 EDNRA 발현의 억제가 대장암 세포의 이동을 억제하여 암의 전이를 억제할 수 있는 가능성을 제시한다.
[2-3] 대장암 세포주에서 EDNRA 억제에 의한 세포 사멸 증가 확인
EDNRA가 결합하는 리간드인 엔도테린 1(Endothelin 1, 이하 'EDN1')의 발현을 억제하였을 때, 대장암 세포의 사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 사멸한 세포의 비율과 세포 사멸 기전에서 미토콘드리아의 핵심 매개 인자로 작용하여 세포 사멸을 촉발시키는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성, 세포 사멸 인자로 기능하는 절단된 카스파아제 3의 발현 수준을 측정하였다.
구체적으로, HCT116 세포를 6 웰 이미지 플레이트에 10000개/웰의 밀도로 37℃, 5% CO2의 환경에서 24시간 동안 배양하고, 대조군으로 무작위 서열인 siNC와 siEDNRA(서열번호 1 및 2, 표 1) 또는 siEDN1(서열번호 3 및 4, 표 2)을 리포펙타민 2000을 이용하여 형질감염 시켰다. 형질감염 된 HCT116 세포를 48시간 동안 배양하여 유세포 분석, 카스파아제 활성 측정 및 절단된 카스파아제 3 발현 수준 측정에 사용하였다.
명칭 서열(5'→3') 서열번호
siEDN1 sense CUCGUAGAAGUCUGGUCUA 서열번호 3
siEDN1 antisense UAGACCAGACUUCUACGAG 서열번호 4
유세포 분석은 Annexin V FITC Apoptosis 키트(BD Biosciences)의 지침을 기반으로 BD FACS Verse로 사멸된 세포의 비율을 측정하였다.
카스파아제 활성 측정은 카스파아제 3/7 키트(Promega Corp.)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 카스파아제 3/7-Glo 용액을 96 화이트-웰 이미지 플레이트에 30㎕/웰을 넣고 실온, 암 조건에서 30분간 대기한 후 발광율을 측정하여 세포 사멸율의 변화를 측정하였다.
세포 사멸이 일어나면 카스파아제가 절단되면서 활성화되므로, 절단된 카스파아제 3은 세포 사멸 인자로 기능한다. 이에, 절단된 Caspase 3을 확인할 수 있는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 형질 감염된 HCT116 세포 배양액과 세포에 RIPA 용해 완충액을 처리하여 단백질을 용해시킨 뒤, SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 액틴과 카스파아제 3 단백질 발현 대비 절단된 카스파아제 3 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, EDNRA의 발현을 억제한 경우 및 EDN1의 발현을 억제한 경우 모두 사멸하는 세포의 비율이 대조군에 비하여(25.9%) 각각 26.8% 및 36%로 증가하는 것을 확인하였다(도 8). 또한, 세포 사멸에 관여하는 단백질인 카스파아제 3 및 카스파아제 7의 활성과 절단된 카스파아제 3의 발현 수준도 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(도 9 및 도 10). 위와 같은 결과는 EDNRA의 발현 또는 EDNRA의 리간드인 EDN1의 발현을 억제하는 경우 대장암 세포의 사멸이 증가함을 제시한다.
[실시예 3]
EDNRA 억제제 스크리닝을 위한 세포주 구축
EDNRA를 억제하는 화합물 라이브러리에서 EDNRA를 효과적으로 억제할 수 있는 약물을 스크리닝하기 위하여 EDNRA 억제제 스크리닝용 세포주를 구축하였다.
구체적으로, CMV 프로모터로 발현되는 pcDNA3.1 플라스미드 벡터에 EDNRA를 코딩하는 염기 서열을 서브클로닝한 뒤, GFP 형광 단백질을 동시에 발현하도록 IRES-GFP 시퀀스를 추가하여 서브클로닝하였다. β-Arrestin 신호 활성 의존적으로 루시퍼라제를 발현하는 PRESTO-TANGO HTLA 세포주(HEK293 cell line stably expressing a tTA-dependent luciferase reporter and a β-arrestin2-TEV fusion gene)에 상기 서브클로닝 된 EDNRA-IRES-GFP 발현 벡터를 형질 도입하였다. 도입 이후, GFP 형광 단백질을 발현하는 단일 클론을 유세포 분석기(FACS)를 활용하여 선별한 후(도 11), HTLA_EDNRA-IRES-GFP 발현 세포주에 EDNRA의 리간드인 EDN1을 처리하고 6시간 후에 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, EDNRA의 리간드인 EDN1 처리 시 루시퍼라아제의 활성이 유의미하게 증가하여 EDN1에 의한 EDNRA 수용체의 활성이 β-Arrestin 신호를 유도함을 확인하였다(도 12). 위와 같은 결과는 스크리닝용 세포주가 루시퍼라아제 활성 측정에 따라 EDNRA의 활성 변화를 측정할 수 있으므로 효과적인 EDNRA 억제제를 스크리닝할 수 있음을 제시한다.
[실시예 4]
EDNRA 억제제 스크리닝
EDNRA 억제제를 도출하기 위하여 상기 실험예 3에서 구축한 세포주에 화합물 라이브러리에 대한 스크리닝을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 3에서 구축한 세포주를 96 웰 플레이트에 웰당 50,000개의 세포를 24시간 동안 배양한 뒤, 6331개의 약물을 처리하고 15분 이내에 리간드인 EDN1을 추가 처리하였다. 각 96 웰 플레이트마다 이미 알려진 EDNRA의 길항제(antagonist)인 마시텐탄(Macitentan)을 대조군으로 처리하여, 마시텐탄을 처리하였을 때 루시퍼라제 활성을 측정하여 신호 전달이 억제되는 정도를 기준으로 51개의 EDNRA 억제제 후보물질을 선별하였다. 선별된 51개의 후보물질을 처리하였을 때, 세포 모양 변화를 관찰하고 CCK-8 분석으로 세포의 증식능을 확인하였다. 또한, 최종적으로 선별된 약물에 대해 3번 이상 반복적으로 루시퍼라제 활성을 측정하여 EDNRA 억제 효과를 검증하였다.
그 결과, APY29 및 CGP60474는 세포에 처리 후 6시간이 경과되어도 세포 모양 변화 및 세포 증식능에 변화가 없었고(도 13), 3번 이상 반복적으로 루시퍼라제 활성을 측정하여도 지속적으로 EDNRA의 활성을 유의하게 억제하는 것을 확인하였다(표 3). 특히, APY29의 경우 세포의 모양의 변화 없이 오직 약물에 의한 세포 신호의 억제 효과가 70%-80%의 높은 효율로 나타나는 것을 확인하였다.
APY29 (%억제) CGP60474 (%억제)
1차 78.05643 74.30781
2차 80.79331 67.56338
3차 74.26088 77.06715
[실시예 5]
선별된 EDNRA 억제제의 EDNRA 억제 활성 검증
상기 실험예 4에서 EDNRA 억제제로 선별된 APY29 및 CGP60474에 대하여 EDNRA 특이적 억제 활성을 CETSA(cellular thermal shift assay)로 검증하였다.
세포 막 수용체 단백질은 길항제를 처리하였을 때 세포 내로 내재화(internalization) 되지 않아 일시적으로 단백질 안정성 증가에 따른 발현이 높아진다. 따라서 세포 막 수용체 단백질인 EDNRA를 특이적으로 억제하는 물질은 EDNRA의 단백질 안정성을 증가시켜 열 저항성을 나타나게 한다. 따라서, 효과적인 EDNRA 억제제의 경우 단백질의 변성이 일어나는 온도에서도 EDNRA의 발현이 안정적일 것으로 예측하여 APY29 및 CGP60474의 EDNRA 억제 활성을 검증하였다.
구체적으로, 상기 실험예 3에서 구축한 세포주를 10cm 배양용기에 24시간 배양한 뒤, EDNRA 길항제인 마시텐탄(Macitentan)과 후보 약물인 APY29 및 CGP60474를 30μM의 농도로 1시간 동안 처리하였다. 그 후 세포배양액을 제거하고 차가운 PBS로 3번 세척하여 얻은 세포 펠렛을 용해 완충액(lysis buffer)를 이용하여 재현탁하였다. 45℃, 50℃, 54℃, 58℃, 61℃의 온도로 반응시킨 후, LN2 액체 질소를 이용하여 얼렸다 녹이는 과정을 3번 반복하고 원심분리기로 단백질 샘플을 확보하였다. 단백질 샘플을 같은 농도로 정량하고 웨스턴 블랏팅을 수행하여 단백질 발현도를 측정하였다.
그 결과, 양성 대조군인 마시텐탄을 처리하였을 때(도 14)와 유사하게 APY29 및 CGP60474를 처리하였을 때 50℃ 이상의 높은 온도에서도 EDNRA 단백질의 안정성이 확보되어 발현이 높은 것을 확인하였다(도 15 및 도 16). 위와 같은 결과는 APY29 및 CGP60474가 EDNRA의 길항제로 알려진 마시텐탄과 유사하게 EDNRA에 직접 결합하여 활성을 조절하는 약물임을 제시한다.
[실시예 6]
선별된 EDNRA 억제제가 대장암 세포에 미치는 영향 확인
대장암 세포주 HCT116과 SW480에 상기 실험예 4에서 EDNRA 억제제로 선별된 APY29 및 CGP60474를 농도별로 처리하여 대장암 세포의 생존능 및 세포 사멸 정도를 측정하였다.
[6-1] 대장암 세포주에서 EDNRA 억제제에 의한 세포의 생존능 억제 확인
대장암 세포주 HCT116과 SW480를 96 웰 플레이트에 각각 300개씩 24시간 동안 배양하고 APY29를 농도별로 48시간 동안 처리하여 세포 생존능을 측정하고 IC50 값을 계산하였다.
구체적으로, 96 웰 이미지 플레이트에 HCT116 세포주와 SW480 세포주를 3000개/웰의 밀도로 37℃, 5% CO2의 환경에서 24시간 동안 배양하고, APY29 화합물을 DPBS에 희석하여 최종 농도가 0, 0.01, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 μM 이 되도록 처리하였다. 약물 처리 후 48시간이 경과한 시점에서 CCK-8 키트(Dojindo Molecular Technologies, Inc.)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 96 웰 이미지 플레이트에 10㎕/웰의 세포를 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 배양한 다음, 450nm에서의 흡광도를 측정하여 이를 기반으로 IC50값을 도출하였다.
그 결과, HCT116 세포주 생존능의 50% 저해에 필요한 약물의 농도를 나타내는 IC50 값이 0.29μM, SW480 세포주의 경우 IC50 값이 0.27μM을 나타내어 대장암 세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 17 및 도 18).
[6-2] 대장암 세포주에서 EDNRA 억제제에 의한 세포 사멸 증가 확인
대장암 세포주 HCT116과 SW480를 96 웰 플레이트에 각각 300개씩 24시간 동안 배양하고 APY29는 0.25, 0.5, 1μM의 농도로, CGP60474는 0.25, 0.5μM의 농도로 48시간 동안 처리하여 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 카스파아제 3, 카스파아제 7 활성을 측정하였다. 또한, 대장암 세포주 HCT116 각 5000개를 6 웰 플레이트에 배양하고, APY29를 1μM의 농도로 48시간 동안 처리하여 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 세포 사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, HCT116 세포주에 APY29를 0.5μM의 농도로 처리한 경우부터 대조군에 비하여 유의하게 카스파아제 3/7 활성이 증가하였으며(도 19), SW480 세포주에서는 APY29를 0.25μM의 농도로 처리한 경우부터 대조군에 비하여 유의하게 카스파아제 3/7 활성이 증가하였다(도 20).
또한, HCT116 세포주에 CGP60474를 0.5μM의 농도로 처리한 경우 대조군에 비하여 유의하게 카스파아제 3/7 활성이 증가하였으며(도 21), SW480 세포주에서는 CGP60474를 0.5μM의 농도로 처리한 경우 대조군에 비하여 유의하게 카스파아제 3/7 활성이 증가하였다(도 22).
아울러, HCT116 세포주에 APY29를 처리한 경우 사멸하는 세포의 비율이 14.43%인 대조군에 비하여 39.4%로 증가하는 것을 확인하였다(도 23).
위와 같은 결과는 APY29 및 CGP60474의 처리가 유의하게 대장암 세포의 사멸을 일으켜 대장암에 대한 항암제로 사용될 수 있음을 제시한다.
[실시예 7]
대장암 세포주에서 APY29와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 효과 확인
대장암 세포주 HCT116 및 SW480에서 EDNCRA 억제제로 선별된 APY29와 DNA 회전효소를 억제하여 항암 효과를 나타내는 이리노테칸을 단독으로 혹은 병용으로 처리하였을 때 대장암 세포의 생존능, 세포 사멸율 및 상승 효과를 확인하였다.
[7-1] 대장암 세포주에서 APY29와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 세포 생존능 억제 효과 확인
대장암 세포주인 HCT116 과 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 이리노테칸을 10μM의 농도로, APY29는 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 CCK8 분석을 수행하여 세포 성장율을 측정하였다.
그 결과, HCT116 과 SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 이리노테칸 보다 우수한 대장암 세포 생존능 억제 효과를 나타내었고, 이리노테칸과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 생존능 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 24). 위와 같은 결과는 APY29는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 생존능 억제 효과를 나타내고, 나아가 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[7-2] 대장암 세포주에서 APY29와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 세포 사멸 효과 확인
대장암 세포주인 HCT116 과 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 이리노테칸을 10μM의 농도로, APY29는 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 카스파아제 3/7 활성을 분석하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, HCT116 과 SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 이리노테칸 보다 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내었고, 이리노테칸과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 25). 위와 같은 결과는 APY29는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 사멸 효과를 나타내고, 나아가 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[7-3] 대장암 세포주에서 APY29와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 상승 효과 확인
대장암 세포주인 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 이리노테칸과 APY29를 농도별로 희석하여 처리하였을 때 서로에게 영향을 주는 정도를 Combination Index (CI) 값으로 계산하여 측정하였다. CI 값이 1 미만일 경우 두 약물에 의한 상승 효과(synergistic effect)가 있는 것으로 판단한다.
그 결과, APY29와 이리노테칸의 병용 처리시, CI 값이 1 미만인 0.47을 나타내 의미 있는 상승 효과를 나타냄을 확인하였다(도 26). 위와 같은 결과는 APY29는 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[실시예 8]
대장암 세포주에서 CGP60474와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 효과 확인
[8-1] 대장암 세포주에서 CGP60474와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 세포 사멸 효과 확인
대장암 세포주인 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 이리노테칸을 10μM의 농도로, CGP60474를 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 카스파아제3/7 활성을 분석하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 이리노테칸보다 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내었고, 이리노테칸과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 27). 위와 같은 결과는 CGP60474는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 사멸 효과를 나타내고, 나아가 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[8-2] 대장암 세포주에서 CGP60474와 이리노테칸(irinotecan)의 병용 처리에 의한 상승 효과 확인
대장암 세포주인 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 이리노테칸과 CGP60474를 농도별로 희석하여 처리하였을 때 서로에게 영향을 주는 정도를 Combination Index (CI) 값으로 계산하여 측정하였다. CI 값이 1 미만일 경우 두 약물에 의한 상승 효과(synergistic effect)가 있는 것으로 판단한다.
그 결과, CGP60474와 이리노테칸의 병용 처리시, CI 값이 1 미만인 0.47을 나타내 의미 있는 상승 효과를 나타냄을 확인하였다(도 28). 위와 같은 결과는 CGP60474는 이리노테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[실시예 9]
대장암 세포주에서 APY29와 토포테칸(topotecan)의 병용 처리에 의한 효과 확인
[9-1] 대장암 세포주에서 APY29와 토포테칸(topotecan)의 병용 처리에 의한 세포 생존능 억제 효과 확인
대장암 세포주인 HCT116 과 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 토포테칸을 2μM의 농도로, APY29는 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 CCK8 분석을 수행하여 세포 성장율을 측정하였다.
그 결과, HCT116 과 SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 토포테칸 보다 우수한 대장암 세포 생존능 억제 효과를 나타내었고, 토포테칸과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 생존능 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 29). 위와 같은 결과는 APY29는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 생존능 억제 효과를 나타내고, 나아가 토포테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[9-2] 대장암 세포주에서 APY29와 토포테칸(topotecan)의 병용 처리에 의한 세포 사멸 효과 확인
대장암 세포주인 HCT116 과 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 토포테칸을 2μM의 농도로, APY29는 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 카스파아제3/7 활성을 분석하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, HCT116 과 SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 토포테칸 보다 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내었고, 토포테칸과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 30). 위와 같은 결과는 APY29는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 사멸 효과를 나타내고, 나아가 토포테칸과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[실시예 10]
대장암 세포주에서 APY29와 다우노루비신(daunorubicin)의 병용 처리에 의한 효과 확인
[10-1] 대장암 세포주에서 APY29와 다우노루비신(daunorubicin)의 병용 처리에 의한 세포 생존능 억제 효과 확인
대장암 세포주인 HCT116 과 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 다우노루비신을 0.2μM의 농도로, APY29는 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 CCK8 분석을 수행하여 세포 성장율을 측정하였다.
그 결과, HCT116 과 SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 다우노루비신 보다 우수한 대장암 세포 생존능 억제 효과를 나타내었고, 다우노루비신과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 생존능 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 31). 위와 같은 결과는 APY29는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 생존능 억제 효과를 나타내고, 나아가 다우노루비신과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
[10-2] 대장암 세포주에서 APY29와 다우노루비신(daunorubicin)의 병용 처리에 의한 세포 사멸 효과 확인
대장암 세포주인 HCT116 과 SW480을 96 웰 플레이트에 3000개씩 24시간 배양한 뒤, 다우노루비신을 0.2μM의 농도로, APY29는 0.5μM의 농도로 각각 혹은 병용 처리하고 48시간 후에 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 카스파아제3/7 활성을 분석하여 세포 사멸 정도를 측정하였다.
그 결과, HCT116 과 SW480 대장암 세포주에서 기존 항암제인 다우노루비신 보다 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내었고, 다우노루비신과 병용 투여되는 경우 가장 우수한 대장암 세포 사멸 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 32). 위와 같은 결과는 APY29는 단독으로도 유의한 대장암 세포의 사멸 효과를 나타내고, 나아가 다우노루비신과 같은 기존 대장암 항암제와 병용 투여되어 한층 향상된 항암 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (16)

  1. EDNRA(Endothelin receptor type A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 EDNRA 억제제는 EDNRA 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 siRNA는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 EDNRA 억제제는 EDNRA 단백질에 상보적으로 결합하는 저분자 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 화합물은 APY29 또는 CGP60474인 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. EDNRA(Endothelin receptor type A) 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 추가적인 대장암 치료제를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 EDNRA 억제제는 EDNRA 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체(peptide mimetics), 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 화합물은 APY29 또는 CGP60474인 것인 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  9. 청구항 6에 있어서,
    상기 추가적인 대장암 치료제는 대사과정 억제제, 국소이송화효소 억제제, 사이토카인, 유사분열 억제제, 핵산과 상호작용하는 화합물, 항호르몬 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상인 것인 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 핵산과 상호작용하는 화합물은 DNA 회전효소 억제제(DNA topoisomerase inhibitor)인 것인 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 DNA 회전효소 억제제는 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan) 및 다우노루비신(daunorubicin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  12. 청구항 6에 있어서,
    상기 대장암의 예방 또는 치료용 키트는 설명서를 추가로 포함하는 것인 대장암의 예방 또는 치료용 키트.
  13. EDNRA(Endothelin receptor type A)의 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물.
  14. (a) EDNRA를 발현하는 분리된 대장암 세포에 대장암 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 분리된 대장암 세포에서 EDNRA의 발현 수준 또는 활성 수준을 측정하는 단계;
    를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 방법은 상기 (b) 단계에서 측정된 EDNRA 발현 수준 또는 활성 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 분리된 대장암 세포에 비해 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보 물질을 대장암 치료용 제제로서 사용할 수 있을 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것인 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 또는 동물 조직 추출액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 스크리닝 방법.
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