WO2023162952A1 - 腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、腹膜線維化治療剤又は予防剤、及び腹膜透析液 - Google Patents

腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、腹膜線維化治療剤又は予防剤、及び腹膜透析液 Download PDF

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正敏 堀
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Definitions

  • the present invention relates to a marker detection method for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis, a kit for diagnosing peritoneal fibrosis or a kit for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis, an agent for treating or preventing peritoneal fibrosis, and a peritoneal dialysate.
  • hemodialysis has problems such as a burden on the circulatory system and a decrease in QOL due to time constraints.
  • peritoneal dialysis does not have these problems and can be treated at home.
  • peritoneal dialysis has a very low selectivity of 11%.
  • Peritoneal deterioration is characterized by fibrosis and hyperpermeability. Even if appropriate peritoneal dialysis is continued, it is a problem that peritoneal deterioration inevitably occurs.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a peritoneal dialysate with reduced damage to the peritoneum, a marker detection method for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis, a peritoneal fibrosis diagnostic kit, or Provided are a kit for diagnosing progression of peritoneal fibrosis and a therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for detecting a marker for diagnosing progression of peritoneal fibrosis associated with peritoneal deterioration comprising detecting the abundance of osteopontin from peritoneal dialysis effluent used for peritoneal dialysis of a subject.
  • Method. A diagnostic kit for peritoneal fibrosis or pathological progression of peritoneal fibrosis comprising a primer set for amplifying DNA or RNA encoding osteopontin or integrin, a probe that binds to the amplification product, or an anti-osteopontin antibody or an anti-integrin antibody diagnostic kit.
  • a therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis containing as an active ingredient an anti-osteopontin antibody that inhibits the binding of osteopontin and integrin, or an integrin antagonist.
  • a peritoneal dialysate containing, as an active ingredient, an anti-osteopontin antibody that inhibits binding between osteopontin and integrin, or an integrin antagonist.
  • a peritoneal dialysate with reduced damage to the peritoneum a method for detecting a marker for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis, a kit for diagnosing peritoneal fibrosis or a kit for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis, and A therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis can be provided.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the administration schedule of methylglyoxal in preparing peritoneal deterioration model mice.
  • A Masson's trichrome-stained image of the peritoneum 3 weeks after administration of methylglyoxal. Control indicates the untreated group, and MGO 3wk indicates the methylglyoxal administration group for 3 weeks.
  • B is a graph showing the results of measuring the thickness of the fibrous layer 1 week (1 wk), 2 weeks (2 wk), and 3 weeks (3 wk) after administration of methylglyoxal (MGO).
  • Fig. 1 is a graph showing the results of a hydroxyproline assay for measuring the amount of collagen in the peritoneum of mice 1 week (1 wk), 2 weeks (2 wk), and 3 weeks (3 wk) after administration of methylglyoxal (MGO).
  • Fig. 3 is a graph showing permeability in the peritoneum of mice 0.5 weeks (0.5 wk) and 2 weeks (2 wk) after administration of methylglyoxal (MGO).
  • Fig. 2 is a graph showing the results of quantifying the mRNA expression level of each factor in peritoneal cell groups collected from peritoneal deterioration model mice.
  • Fig. 1 is a graph showing the results of a hydroxyproline assay for measuring the amount of collagen in the peritoneum of mice 1 week (1 wk), 2 weeks (2 wk), and 3 weeks (3 wk) after administration of methylglyoxal (MGO).
  • Fig. 3 is a graph showing permeability
  • FIG. 2 is a graph showing the results of quantifying the mRNA expression level of each factor in peritoneal cell groups collected from peritoneal deterioration model mice.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an administration schedule for anti-mouse osteopontin-neutralizing antibody.
  • Fig. 3 shows Masson's trichrome-stained images of mouse peritoneum 3 weeks (3 wk) after intraperitoneal administration of dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with anti-mouse osteopontin-neutralizing antibody.
  • MGO methylglyoxal
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the thickness of the fibrous layer of the mouse peritoneum three weeks after intraperitoneal administration of a dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with an anti-mouse osteopontin antibody (3 wk).
  • Fig. 3 is a graph showing the results of a hydroxyproline assay in the peritoneum of mice three weeks after intraperitoneal administration of dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with an anti-mouse osteopontin antibody (3wk).
  • Schematic diagram showing the administration schedule of TFA, an ⁇ v ⁇ 1 integrin inhibitor.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the thickness of the fibrous layer of the mouse peritoneum three weeks after intraperitoneal administration of a dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with TFA, an ⁇ v ⁇ 1 integrin inhibitor, (3wk).
  • Fig. 3 is a graph showing the results of a hydroxyproline assay in the peritoneum of mice three weeks after intraperitoneal administration of dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with TFA, an ⁇ v ⁇ 1 integrin inhibitor, (3wk).
  • Fig. 3 is a graph showing the results of measuring the thickness of the fibrous layer of the mouse peritoneum three weeks after intraperitoneal administration of a dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with TFA, an ⁇ v ⁇ 1 integrin inhibitor, (3wk).
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results of peritoneal permeability of mice two weeks after intraperitoneal administration of dialysate containing methylglyoxal (MGO) mixed with TFA, an ⁇ v ⁇ 1 integrin inhibitor, (2wk).
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a schedule for collecting peritoneal lavage fluid from a methylglyoxal-induced peritoneal deterioration model mouse and measuring the osteopontin concentration by ELISA.
  • Fig. 3 is a graph showing the results of measuring the concentration of osteopontin in peritoneal lavage fluid collected from a methylglyoxal-induced peritoneal deterioration model mouse by ELISA.
  • 4 is a graph showing the results of evaluating osteopontin concentration using peritoneal dialysis effluent from patients undergoing peritoneal dialysis.
  • the present embodiment is a marker detection method for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis associated with peritoneal deterioration, wherein the abundance of osteopontin is detected from peritoneal dialysis effluent used for peritoneal dialysis of a subject. , to provide a detection method.
  • osteopontin serves as a marker for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis.
  • Subjects are not particularly limited, and include patients requiring peritoneal dialysis therapy such as renal disease patients.
  • Osteopontin is a secreted acidic phosphorylated protein that has an integrin-binding sequence and is suggested to regulate various physiological activities of cells by binding to integrins.
  • Methods for detecting osteopontin in peritoneal dialysis effluent used in peritoneal dialysis of a subject include a method for detecting osteopontin expression at the protein level and a method for detecting osteopontin expression at the gene level.
  • Methods for detecting the expression of osteopontin at the protein level include, for example, a method using ELISA, which will be described later.
  • an osteopontin nucleic acid fragment may be amplified by PCR using primers, the amplified product may be analyzed, and a probe complementary to the osteopontin DNA or osteopontin RNA gene sequence may be used. It may be analyzed by a method using hybridization.
  • NGS next-generation sequencer
  • RT-PCR real-time PCR
  • the analyzed DNA fragments are called reads, and the output data is the product of the number of reads and the number of bases determined per read (read length).
  • a region in DNA extracted from cells in peritoneal dialysis effluent is amplified by singleplex PCR or multiplex PCR, the base sequence of the amplified product is analyzed by a next-generation sequencer (NGS), and the region is Preferably, the quantification is by counting the number of reads.
  • NGS next-generation sequencer
  • Multiplex PCR is a method for simultaneously amplifying multiple gene regions by simultaneously using multiple primer pairs in one PCR reaction system.
  • an intercalator method, a probe method, a cycling probe method, or the like can be used to monitor the amount of amplification product produced by detecting fluorescence intensity.
  • a fluorescent dye-labeled probe complementary to the osteopontin DNA gene sequence it is preferable to use a fluorescent dye-labeled probe complementary to the osteopontin DNA gene sequence.
  • Quantitative methods include an absolute quantification method for determining the actual copy number of the target and a comparative quantification method for determining relative values between samples, which are used depending on the quality of the data to be obtained.
  • both the amount of osteopontin present in the peritoneal dialysis effluent used for peritoneal dialysis of the subject and the control expression amount of a control subject whose pathology of peritoneal fibrosis is known are used.
  • the expression levels are compared and the abundance of osteopontin in the sample is higher than the control expression level in the control, it can be predicted that peritoneal fibrosis in the subject is progressing.
  • peritoneal fibrosis diagnostic kit or peritoneal fibrosis pathology progression diagnostic kit includes a peritoneal fibrosis diagnostic kit or peritoneal fibrosis diagnostic kit comprising a primer set for amplifying DNA or RNA encoding osteopontin or integrin, a probe that binds to the amplification product, or an anti-osteopontin antibody or an anti-integrin antibody.
  • a kit for diagnosing disease progression is provided.
  • the diagnostic kit of the present embodiment is preferably used for the above-described ⁇ method for detecting a marker for diagnosing progression of peritoneal fibrosis pathology>, and the ⁇ method for detecting a marker for diagnosing progression of peritoneal fibrosis pathology>. including the configuration described in .
  • osteopontin regulates various physiological activities of cells through binding to integrins
  • the presence of integrins in addition to or instead of detecting the abundance of osteopontin quantity may be detected.
  • a kit for detecting the expression of osteopontin or integrin at the gene level includes a kit for extracting nucleic acid (for example, total RNA) from cells in peritoneal dialysis effluent, a fluorescent substance for labeling, a reagent for nucleic acid amplification, etc. You can
  • the antibody is not limited as long as it recognizes the antigen, monoclonal antibody, polyclonal antibody, multispecific antibody (e.g., bispecific antibody) , antibody fragments, and the like.
  • the kit of this embodiment preferably further comprises a solid phase or carrier bound to the anti-osteopontin antibody or anti-integrin antibody.
  • the solid phase include glass substrates, silicon substrates, plastic substrates, metal substrates, etc. Plastic substrates used for ELISA and the like are preferred.
  • Carriers include beads of silicon, titanium dioxide, aluminum oxide, glass, polystyrene, cellulose, polyamides, and the like.
  • osteopontin or integrin in peritoneal dialysis effluent of a subject is captured on a substrate, and then detected using a labeled antibody against osteopontin or integrin.
  • Substances used for labeling antibodies against osteopontin or integrin include labeling enzymes such as horseradish peroxidase and alkaline phosphatase.
  • the present embodiment provides a therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis containing an anti-osteopontin antibody that inhibits binding between osteopontin and integrin or an integrin antagonist as an active ingredient.
  • Anti-osteopontin antibodies are not particularly limited as long as they inhibit the binding of osteopontin to integrins, and include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, hybrid antibodies, modified antibodies, chimeric antibodies, and humanized antibodies.
  • Integrin antagonists are not particularly limited as long as they inhibit the biological activity of integrin molecules, and include proteins, peptides, antibodies, low-molecular-weight compounds, and the like. Integrin subtypes that bind to osteopontin include ⁇ 5 ⁇ 1, ⁇ v ⁇ 3, ⁇ v ⁇ 5, ⁇ v ⁇ 1, and the like. Preferred integrin antagonists are those that inhibit these subtypes.
  • the therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis of the present embodiment may contain an anti-osteopontin antibody or an integrin antagonist, or may contain both an anti-osteopontin antibody and an integrin antagonist.
  • the therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis of the present embodiment can be administered by being mixed in dialysate. Also, for example, orally in the form of tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, emulsions, etc., or in the form of injections, suppositories, external skin preparations, etc. It can also be administered parenterally.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, and gum arabic
  • excipients such as starch and crystalline cellulose
  • swelling agents such as alginic acid
  • solvents for injections such as water, ethanol, and glycerin
  • Adhesives such as rubber-based adhesives and silicone-based adhesives are included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used singly or in combination of two or more.
  • the therapeutic or preventive agent for peritoneal fibrosis of the present embodiment may further contain an additive.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; buffers such as salts and sodium acetate; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives and the like. Additives can be used singly or in combination of two or more.
  • the method of administering the peritoneal fibrosis therapeutic agent or preventive agent of the present embodiment is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the patient's symptoms, body weight, age, sex, and the like.
  • tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, emulsions and the like are orally administered.
  • Injections are administered intravenously alone or in combination with usual replacement fluids such as glucose and amino acids, and if necessary, intraarterially, intramuscularly, intracutaneously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the dosage of the agent for treating or preventing peritoneal fibrosis of the present embodiment varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., and cannot be generally determined. 10 g, eg 0.01 to 2000 mg of active ingredient per day may be administered. In the case of an injection, for example, 0.1 ⁇ g to 1 g per day, for example, 0.001 to 200 mg per day of the active ingredient may be administered. In the case of suppositories, for example, 1 ⁇ g to 10 g per day, for example 0.01 to 2000 mg per day of the active ingredient may be administered.
  • the present embodiment provides a peritoneal dialysate containing, as an active ingredient, an anti-osteopontin antibody that inhibits binding between osteopontin and integrin, or an integrin antagonist.
  • the anti-osteopontin antibody or integrin antagonist contained in the peritoneal dialysate of the present embodiment is the same as described in ⁇ peritoneal fibrosis therapeutic or preventive agent>>.
  • the peritoneal dialysate of this embodiment contains components commonly used for peritoneal dialysate.
  • it may contain suitable active ingredients, excipients, diluents such as electrolytes, water, physiologically acceptable acids, physiologically acceptable bases, amino acids, lipids and the like.
  • the dialysate was retained in the peritoneal cavity of the mouse for 2 hours, the glucose concentration was measured over time, and the rate of decrease was evaluated (see Figure 4).
  • the rate of decrease in glucose concentration was markedly increased in model mice administered for 2 weeks compared to untreated mice. As described above, since the characteristics seen in peritoneal deterioration were reproduced in mice, it was confirmed that this model mimics human peritoneal deterioration in a clinically similar manner.
  • peritoneal deterioration model mice were treated with an osteopontin-neutralizing antibody to verify whether peritoneal fibrosis was suppressed (see FIG. 7).
  • a dialysate containing methylglyoxal mixed with an anti-mouse osteopontin antibody (0.1 mg/kg; Anti-Osteopontin, Mouse, Goat-Poly; R & D systems) was administered intraperitoneally to mice three times a week. dosed.
  • TFA which is an ⁇ v ⁇ 1 inhibitor
  • TFA was administered to peritoneal deterioration model mice, and it was verified whether alleviation of pathological conditions was observed (see FIG. 11).
  • a methylglyoxal-containing dialysate mixed with TFA was intraperitoneally administered to mice three times a week.
  • Masson's trichrome staining and hydroxyproline assay it significantly suppressed the increase observed in peritoneal deterioration model mice (see FIGS. 12 and 13).
  • Peritoneal lavage fluid was collected from a methylglyoxal-induced peritoneal deterioration model mouse, and the osteopontin concentration was measured by ELISA (see FIG. 15).
  • osteopontin concentration was evaluated using peritoneal dialysis effluent from patients undergoing peritoneal dialysis at the University of Tokyo Hospital. It was confirmed that the amount of osteopontin in peritoneal dialysis effluent increases with the duration of dialysis (see FIG. 17).
  • a peritoneal dialysate with reduced damage to the peritoneum a marker detection method for diagnosing the progression of peritoneal fibrosis, a peritoneal fibrosis diagnostic kit or a diagnostic kit for the progression of peritoneal fibrosis, And peritoneal fibrosis therapeutic agent or preventive agent can be provided.

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Abstract

腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法であって、被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液から、オステオポンチンの存在量を検出する、検出方法。

Description

腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、腹膜線維化治療剤又は予防剤、及び腹膜透析液
　本発明は、腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、腹膜線維化治療剤又は予防剤、及び腹膜透析液に関する。
　末期腎不全患者では、本来腎臓が担う体液の恒常性維持や老廃物濾過が正常に行われないため、人工透析を行う必要がある。人工透析には血液透析と腹膜透析の２種類がある。血液透析は循環器系への負担や時間的拘束によるＱＯＬの低下などの問題がある。一方、腹膜透析はこれらの問題がなく、在宅療法も可能である。しかし、腹膜透析の選択率は１１％と非常に少ない。
　これは腹膜透析を続けることで合併症として腹膜劣化を生じることによる。腹膜劣化では線維化と透過性の異常亢進が特徴として見られる。適切な腹膜透析を続けても、腹膜劣化が必ず起こることが問題となっている。
　これまで腹膜への傷害性を抑えるために中性透析液やイコデキストリン透析液が開発されてきた（例えば、特許文献１参照。）。
国際公開第２０１８／１７９９７４号
　しかしながら、発症が数年伸びた程度で根本的解決には至らなかった。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、腹膜への傷害性が抑制された腹膜透析液、腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、及び腹膜線維化治療剤又は予防剤を提供する。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］腹膜劣化に伴う腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法であって、被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液から、オステオポンチンの存在量を検出する、検出方法。
［２］オステオポンチン若しくはインテグリンをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを増幅するためのプライマーセット、その増幅産物に結合するプローブ、又は抗オステオポンチン抗体又は抗インテグリン抗体を含む、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット。
［３］オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを有効成分として含有する、腹膜線維化治療剤又は予防剤。
［４］オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを有効成分として含有する、腹膜透析液。
　本発明によれば、腹膜への傷害性が抑制された腹膜透析液、腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、及び腹膜線維化治療剤又は予防剤を提供できる。
腹膜劣化モデルマウス作製にあたり、メチルグリオキサールの投与スケジュールを示した概略図である。 （Ａ）メチルグリオキサール投与３週間後の腹膜のマッソントリクローム染色像である。Ｃｏｎｔｒｏｌは、無処置群、ＭＧＯ ３ｗｋは、メチルグリオキサール３週間投与群を示す。（Ｂ）メチルグリオキサール（ＭＧＯ）投与１週間後（１ｗｋ）、２週間後（２ｗｋ）、３週間後（３ｗｋ）の線維層の厚さを測定した結果を示すグラフである。 メチルグリオキサール（ＭＧＯ）投与１週間後（１ｗｋ）、２週間後（２ｗｋ）、３週間後（３ｗｋ）のマウスの腹膜におけるコラーゲン量を測定するヒドロキシプロリンアッセイの測定結果を示すグラフである。 メチルグリオキサール（ＭＧＯ）投与０．５週間後（０．５ｗｋ）、２週間後（２ｗｋ）のマウスの腹膜における透過性を示すグラフである。 腹膜劣化モデルマウスから採取した腹腔細胞群における各因子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示すグラフである。 腹膜劣化モデルマウスから採取した腹腔細胞群における各因子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示すグラフである。 抗マウスオステオポンチン中和抗体の投与スケジュールを示した概略図である。 抗マウスオステオポンチン中和抗体を混和したメチルグリオキサール（ＭＧＯ）含有透析液腹腔内投与３週間後（３ｗｋ）のマウス腹膜のマッソントリクローム染色像である。 抗マウスオステオポンチン抗体を混和したメチルグリオキサール（ＭＧＯ）含有透析液腹腔内投与３週間後（３ｗｋ）のマウス腹膜の線維層の厚さを測定した結果を示すグラフである。 抗マウスオステオポンチン抗体を混和したメチルグリオキサール（ＭＧＯ）含有透析液腹腔内投与３週間後（３ｗｋ）のマウスの腹膜におけるヒドロキシプロリンアッセイの結果を示すグラフである。 αｖβ１インテグリン阻害薬であるＴＦＡの投与スケジュールを示した概略図である。 αｖβ１インテグリン阻害薬であるＴＦＡを混和したメチルグリオキサール（ＭＧＯ）含有透析液腹腔内投与３週間後（３ｗｋ）のマウス腹膜の線維層の厚さを測定した結果を示すグラフである。 αｖβ１インテグリン阻害薬であるＴＦＡを混和したメチルグリオキサール（ＭＧＯ）含有透析液腹腔内投与３週間後（３ｗｋ）のマウスの腹膜におけるヒドロキシプロリンアッセイの結果を示すグラフである。 αｖβ１インテグリン阻害薬であるＴＦＡを混和したメチルグリオキサール（ＭＧＯ）含有透析液腹腔内投与２週間後（２ｗｋ）のマウスの腹膜透過性の測定結果を示すグラフである。 メチルグリオキサール誘発性の腹膜劣化モデルマウスから腹腔洗浄液を回収し、オステオポンチン濃度をＥＬＩＳＡにて測定するスケジュールを示した概略図である。 メチルグリオキサール誘発性の腹膜劣化モデルマウスから腹腔洗浄液を回収し、オステオポンチン濃度をＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。 腹膜透析を受けている患者の腹膜透析排液を用いて、オステオポンチン濃度を評価した結果を示すグラフである。
≪腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法≫
　本実施形態は、腹膜劣化に伴う腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法であって、被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液から、オステオポンチンの存在量を検出する、検出方法を提供する。
　実施例において後述するように、本発明者は、オステオポンチンが腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーとなることを見出した。
　被検者としては、特に限定されず、腎疾患患者等、腹膜透析療法が必要な患者が挙げられる。
　オステオポンチンは、インテグリン結合配列を有し、インテグリンに結合することにより細胞の様々な生理活性を調節することが示唆されている分泌型酸性リン酸化タンパク質である。
　被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液中のオステオポンチンを検出する方法としては、オステオポンチンの発現をタンパク質レベルで検出する方法、遺伝子レベルで検出する方法が挙げられる。オステオポンチンの発現をタンパク質レベルで検出する方法としては、例えば後述するＥＬＩＳＡを用いた方法が挙げられる。
　オステオポンチンの発現を遺伝子レベルで検出する方法としては、プライマーを用いてＰＣＲによりオステオポンチンの核酸断片を増幅し、その増幅産物を解析してもよく、オステオポンチンＤＮＡ又はオステオポンチンＲＮＡ遺伝子配列に相補的なプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを用いた方法により、解析してもよい。
　定量性の観点から、ＰＣＲによりオステオポンチンＤＮＡ又はオステオポンチンＲＮＡの断片を増幅し、その増幅産物を解析することが好ましい。具体的な定量方法としては、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）法やリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法が挙げられる。
　次世代シークエンサーでは、解析されたＤＮＡ断片をリードと呼び、リード数と１リード当たりに決定される塩基数（リード長）の積が出力データとなる。本実施形態において、腹膜透析排液中の細胞から抽出されたＤＮＡ内の領域をｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ　ＰＣＲまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲで増幅し、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）でその増幅産物の塩基配列を解析し、当該領域のリード数を計数することにより定量することが好ましい。ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲは、一つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することで、複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法である。
　リアルタイムＰＣＲでは、インターカレータ－法、プローブ法、サイクリングプローブ法等を用いて、蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。また、リアルタイムＰＣＲにおいては、オステオポンチンＤＮＡ遺伝子配列に相補的な蛍光色素標識プローブを用いることが好ましい。
　定量方法としては、ターゲットの実際のコピー数を決定する絶対定量法とサンプル間の相対値を決定する比較定量法が挙げられ、取得したいデータの質に応じて使い分けられる。
　本実施形態の検出方法において、例えば、被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液中のオステオポンチン存在量と、腹膜線維化の病態が分かっている対照者の対照発現量とを用いて両発現量を比較して、検体中のオステオポンチン存在量が、対照者の対照発現量より多い場合、被検者の腹膜線維化が進行していると予測できる。
≪腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット≫
　本実施形態は、オステオポンチン若しくはインテグリンをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを増幅するためのプライマーセット、その増幅産物に結合するプローブ、又は抗オステオポンチン抗体又は抗インテグリン抗体を含む、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キットを提供する。
　本実施形態の診断キットは、上述した≪腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法≫に好適に用いられ、≪腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法≫に記載された構成を含む。
　オステオポンチンは、インテグリンとの結合を介して細胞の様々な生理活性を調節することから、オステオポンチンの存在量を検出することに加えて、又はオステオポンチンの存在量を検出することに代えて、インテグリンの存在量を検出してもよい。
　オステオポンチン又はインテグリンの発現を遺伝子レベルで検出するキットにおいては、腹膜透析排液中の細胞から核酸（例えば、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）を抽出するためのキット、標識用蛍光物質、核酸増幅用試薬等を含んでいてもよい。
　オステオポンチン又はインテグリンの発現をタンパク質レベルで検出するキットにおいては、抗体としては、抗原を認識するものであれば限定されず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片等が挙げられる。
　本実施形態のキットは、更に、抗オステオポンチン抗体又は抗インテグリン抗体と結合した固相又は担体を含むことが好ましい。固相としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられ、ＥＬＩＳＡ等に用いられるプラスチック基板が好ましい。
　担体としては、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等のビーズが挙げられる。
　本実施形態のキットの使用方法としては、被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液中のオステオポンチン又はインテグリンを、基板上に補足した後、オステオポンチン又はインテグリンに対する標識抗体を用いて検出する方法が挙げられる。オステオポンチン又はインテグリンに対する抗体の標識に用いられる物質としては、標識酵素が挙げられ、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼやアルカリ・フォスファターゼが挙げられる。
≪腹膜線維化治療剤又は予防剤≫
　本実施形態は、オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを有効成分として含有する、腹膜線維化治療剤又は予防剤を提供する。
　抗オステオポンチン抗体としては、オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗体であれば特に限定されず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体が挙げられる。
　インテグリンアンタゴニストとしては、インテグリン分子の生物学的活性を阻害するものであれば特に限定されず、タンパク質、ペプチド、抗体、低分子化合物等が挙げられる。オステオポンチンと結合するインテグリンのサブタイプとしては、α５β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ１等が挙げられる。インテグリンアンタゴニストとしては、これらのサブタイプを阻害するものが好ましい。
　本実施形態の腹膜線維化治療剤又は予防剤は、抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを含んでいてもよく、抗オステオポンチン抗体、及びインテグリンアンタゴニストの両方を含んでいてもよい。
　本実施形態の腹膜線維化治療剤又は予防剤は、透析液に混入させて投与することができる。また、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、又は、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することもできる。
　薬学的に許容される担体としては、通常の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　本実施形態の腹膜線維化治療剤又は予防剤は、更に添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
（投与方法）
　本実施形態の腹膜線維化治療剤又は予防剤の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。
（投与量）
　本実施形態の腹膜線維化治療剤又は予防剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
≪腹膜透析液≫
　本実施形態は、オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを有効成分として含有する、腹膜透析液を提供する。
　本実施形態の腹膜透析液が含有する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストは、≪腹膜線維化治療剤又は予防剤≫に記載したものと同様である。
　本実施形態の腹膜透析液は、通常腹膜透析液に用いられる成分を含む。例えば、電解質、水、生理学的に許容される酸、生理学的に許容される塩基、アミノ酸、脂質等、適当な活性成分、賦形剤、希釈剤を含んでいてよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［メチルグリオキサール誘発性の腹膜劣化モデルマウスの作製と腹膜機能テストの確立］
　まず、メチルグリオキサール誘発性の腹膜劣化モデルマウスを作製し、腹膜劣化での特徴である腹膜の線維化及び腹膜透過性の異常亢進を経時的に評価した（図１参照。）。メチルグリオキサール誘発性腹膜劣化モデルマウスの作製に際し、週３回、メチルグリオキサール含有透析液を腹腔内投与した。線維化の程度はマウスから採取した腹膜を用いたマッソントリクローム染色とヒドロキシプロリンアッセイにより評価した（図２及び図３参照。）。
　マッソントリクローム染色において、線維層の厚さは時間依存的に増加し、投与を３週間行ったモデルマウスでは無処置群マウスに比べて顕著に増加した（図２（Ａ）及び（Ｂ）参照。）。
　同様に、ヒドロキシプロリンアッセイにおいても、腹膜におけるコラーゲン量は時間依存的に増加し、投与を３週間行ったモデルマウスおいて無処置群マウスに比べて顕著に増加することが示された（図３参照。）。
　次に、腹膜透過性を定量するために、マウスの腹腔に透析液を２時間貯留し、グルコース濃度を経時的に測定し、その減少速度を評価した（図４参照。）。グルコース濃度の減少速度は、投与を２週間行ったモデルマウスにおいて無処置群マウスに比べて顕著に増加した。以上のように、腹膜劣化で見られる特徴がマウスで再現されていることから、本モデルがヒトの腹膜劣化を臨床に近い形で模倣しているモデルであることが確認された。
［腹膜劣化モデルマウスから得られる腹腔細胞群において、オステオポンチンをコードするＳｐｐ１のｍＲＮＡ発現量が増加した］
　腹腔内のあらゆる病態には、主に免疫細胞から構成される腹腔細胞群が深く関与する。そこで、腹膜劣化モデルマウスから腹腔細胞群を採取し、線維化や炎症に関連する様々な因子のｍＲＮＡ発現量を定量した（図５及び図６参照。）。多くの因子の内、Ｓｐｐ１のｍＲＮＡ発現量のみが腹膜劣化の進行に従って増加し、３週目において顕著な増加を示した（図５参照。）。また、腹膜劣化モデルマウスの腹腔洗浄液中のオステオポンチン量を定量したところ、健常マウスと比較して顕著な増加を示した。以上の結果から、腹膜劣化の進行にオステオポンチンが重要な役割を担っている可能性が示唆された。
［オステオポンチン中和抗体は腹膜劣化モデルマウスにおける線維化を抑制する］
　オステオポンチンが腹膜劣化の病態進行に関与することを検証するため、腹膜劣化モデルマウスに対しオステオポンチン中和抗体を処置し、腹膜線維化が抑制されるかを検証した（図７参照。）。詳細には、メチルグリオキサール含有透析液に、抗マウスオステオポンチン抗体（０．１ ｍｇ／ｋｇ；Ａｎｔｉ－Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ, Ｍｏｕｓｅ, Ｇｏａｔ－Ｐｏｌｙ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を混和したものを、週３回、マウスに腹腔内投与した。
　マッソントリクローム染色において、腹膜劣化モデルマウスで見られた線維層の肥厚は、オステオポンチン中和抗体処置により有意に抑制された（図８及び図９参照。）。またヒドロキシプロリンアッセイにおいても同様に、腹膜劣化モデルマウスで見られた増加はオステオポンチン中和抗体により有意に抑制された（図１０参照。）。以上の結果から、腹膜劣化の進行にオステオポンチンが関与すること、その治療標的としてオステオポンチンが挙げられることが示された
［オステオポンチンはαｖβ１インテグリンに結合し腹膜劣化を促進させる］
　腹膜劣化モデルマウスに対し、αｖβ１の阻害薬であるＴＦＡを投与し、病態の緩和がみられるかを検証した（図１１参照。）。詳細には、メチルグリオキサール含有透析液に、ＴＦＡを混和したものを、週３回、マウスに腹腔内投与した。マッソントリクローム染色とヒドロキシプロリンアッセイの両者において、腹膜劣化モデルマウスで見られた増加を有意に抑制した（図１２及び図１３参照。）。さらに腹膜劣化モデルマウスで見られた腹膜透過性の異常亢進も有意に抑制した（図１４参照。）。以上の結果からオステオポンチンがαｖβ１インテグリンに結合して腹膜劣化の進行を促進している可能性が考えられた。また、オステオポンチン中和抗体だけでなく、αｖβ１インテグリン阻害薬も腹膜劣化に対する治療薬として使用できる可能性も示唆された。
［腹膜透析廃液中のオステオポンチン量は透析期間にしたがって増加する］
　メチルグリオキサール誘発性の腹膜劣化モデルマウスから腹腔洗浄液を回収し、オステオポンチン濃度をＥＬＩＳＡにて測定した（図１５参照。）。腹膜劣化モデルマウス群と健常マウス群において、腹腔貯留液中のグルコース消失速度と、腹腔洗浄液中オステオポンチン濃度との相関を調べたところ、腹膜劣化モデルマウス群では、腹腔洗浄液中オステオポンチン濃度の増加とともに、腹腔貯留液中のグルコース消失速度の増加が確認された（図１６参照。）。
　次いで、東京大学附属病院で腹膜透析を受けている患者の腹膜透析排液を用いて、オステオポンチン濃度を評価した。腹膜透析廃液中のオステオポンチン量は、透析期間にしたがって増加することが確認された（図１７参照。）。
　本実施形態によれば、腹膜への傷害性が抑制された腹膜透析液、腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、及び腹膜線維化治療剤又は予防剤を提供できる。

Claims (4)

  1. 　腹膜劣化に伴う腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法であって、
    　被検者の腹膜透析に用いた腹膜透析排液から、オステオポンチンの存在量を検出する、検出方法。
  2. 　オステオポンチン若しくはインテグリンをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを増幅するためのプライマーセット、その増幅産物に結合するプローブ、又は抗オステオポンチン抗体又は抗インテグリン抗体を含む、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット。
  3. 　オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを有効成分として含有する、腹膜線維化治療剤又は予防剤。
  4. 　オステオポンチンとインテグリンの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体、又はインテグリンアンタゴニストを有効成分として含有する、腹膜透析液。
PCT/JP2023/006129 2022-02-24 2023-02-21 腹膜線維化の病態進行を診断するためのマーカーの検出方法、腹膜線維診断キット又は腹膜線維化の病態進行診断キット、腹膜線維化治療剤又は予防剤、及び腹膜透析液 WO2023162952A1 (ja)

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