WO2023158178A1 - 항균, 항염증 또는 조직재생능을 구비하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항균, 항염증 또는 조직재생능을 구비하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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박윤정
정종평
이주연
조범수
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주식회사 나이벡
서울대학교산학협력단
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses

Definitions

  • the present disclosure relates to peptides having antibacterial, anti-inflammatory, or tissue regenerative properties and uses thereof.
  • transplant materials for the purpose of tissue regeneration can exert a regenerative function only in areas without inflammation, and cannot exert a regenerative function if inflammation occurs after transplantation. Therefore, when a substance having antibacterial and anti-inflammatory action is applied together with a transplant material, it is possible to achieve regeneration of damaged tissue by suppressing inflammation that may occur in the initial stage. For example, periodontal tissue damaged by periodontitis can easily obtain an alveolar tissue regeneration effect if a substance having antibacterial and anti-inflammatory action is used in combination with the transplant material.
  • the present disclosure is to provide a peptide having anti-inflammatory activity.
  • the present disclosure is intended to provide peptides having antibacterial activity at the cellular level and in biofilms.
  • the present disclosure is to provide a peptide having cell penetrating ability.
  • the present disclosure is to provide a pharmaceutical composition comprising a peptide having anti-inflammatory or antibacterial activity.
  • the present disclosure is to provide a transplant material containing a peptide having anti-inflammatory or antibacterial activity.
  • the peptide according to the embodiment is a peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the pharmaceutical composition according to the embodiment includes the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the transplant material according to the embodiment includes the peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the peptide according to the embodiment has anti-inflammatory or antibacterial activity, and can be used for the treatment of inflammatory diseases or bacterial diseases or conditions.
  • the peptide according to the embodiment has cell penetrating ability, so there is no need to attach a separate peptide or add other agents for cell penetration of the peptide.
  • cell penetration of other peptides can be assisted through conjugation with other peptides having low cell-penetrating ability.
  • the graft material according to the embodiment has anti-inflammatory or antibacterial activity, so that it can be effectively applied to areas of periodontal disease such as periimplantitis and periodontitis, and tissue regeneration effects can be obtained.
  • Figure 3 shows the results of enzyme immunoassay (ELISA) of IL-6 and TNF- ⁇ .
  • Figure 5 shows the results of measuring the antibacterial activity of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Figure 10 shows the results of measuring the antibacterial activity of the collagen sponge block containing the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • 11 and 12 show the result of confirming periodontal tissue regeneration by radiography by treating the adult dog periodontitis model with the collagen gel containing the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and numerically showing the degree of alveolar bone regeneration.
  • the square represents the alveolar bone regenerated by the graft material.
  • the present disclosure relates to a peptide having anti-inflammatory or antibacterial activity.
  • the peptide is a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below.
  • SEQ ID NO: 1 GKCSTRGRKSSSRRKK
  • the amount of IL-6 and TNF- ⁇ , which are inflammatory markers was measured using enzyme immunoassay (ELISA), and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It was confirmed that the eggplant peptide exhibited anti-inflammatory activity almost similar to that of IL-4, a cytokine with anti-inflammatory effect. In addition, the effect of suppressing the expression of pNF- ⁇ B, an inflammation-related enzyme, by the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was confirmed by Western blotting. As a result, it was confirmed that the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 inhibits the expression of pNF- ⁇ B induced by LPS.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has excellent antibacterial activity against Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis , which are periodontitis-causing bacteria, and has equal or similar antibacterial activity compared to minocycline, which is widely used in the treatment of periodontitis. It was confirmed that indicated In addition, as a result of treating the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 on the artificial biofilm produced using the periodontitis-inducing bacteria, it was confirmed that it had antibacterial activity and further cell penetration ability.
  • the present disclosure relates to a peptide having cell penetrating ability.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 penetrates into cells.
  • mouse macrophages RAW264.7
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 penetrated into the cell.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was permeated not only at the cellular level but also at the tissue level.
  • periodontitis or peri-implantitis various types of periodontitis-causing bacteria colonize to form a thick biofilm. Since these biofilms increase resistance to antibiotics, it is difficult to remove them only by administering antibiotics. Therefore, antibacterial activity against periodontitis-causing bacteria constituting the biofilm while passing through such a biofilm is required. Since the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is permeable into cells by itself, there is no need to use an additional carrier. Therefore, it can penetrate the biofilm formed on the tooth to exhibit antibacterial activity or easily penetrate the gingival tissue. Furthermore, by using such cell/tissue penetrating ability, a desired anti-inflammatory effect can be increased by imparting cell penetrating ability by chemically conjugating with a peptide having anti-inflammatory function without cell penetrating ability.
  • the present disclosure relates to a pharmaceutical composition containing a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition can be effectively applied for treatment of dental infectious diseases, and the dental infectious diseases can be selected from the group consisting of periodontitis, gingivitis and peri-implantitis.
  • the peptide may be contained in 10 -3 to 10 parts by weight, more preferably 10 -2 to 10 -1 parts by weight. This is because when the peptide is contained in less than 10 -3 parts by weight, the antibacterial or anti-inflammatory effect is not great, and when it is contained in more than 10 parts by weight, the effect does not increase proportionally, so there is no practical benefit due to the increased content.
  • composition for treating dental infections may further contain at least one selected from the group consisting of propolis, xylitol, and proteolytic enzymes, and may further include propolis or xylitol to improve sensory properties and proteolysis.
  • propolis xylitol
  • proteolytic enzymes may further include propolis or xylitol to improve sensory properties and proteolysis.
  • the antibacterial effect and lipopolysaccharide removal effect can be enhanced by adding an enzyme.
  • compositions for treating dental infections include excipients such as starch, lactose, calcium carbonate and calcium phosphate, starch, gum arabic, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, crystalline cellulose and the like, and magnesium stearate. It may be characterized in that it is selected from the group consisting of lubricants such as latex and talc, disintegrants such as carboxymethylcellulose calcium and talc synthetic aluminum silicate, diluents such as water and vegetable oil, and mixtures thereof.
  • excipients such as starch, lactose, calcium carbonate and calcium phosphate, starch, gum arabic, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, crystalline cellulose and the like, and magnesium stearate. It may be characterized in that it is selected from the group consisting of lubricants such as latex and talc, disintegrants such as carboxymethylcellulose calcium and talc synthetic aluminum silicate, diluents such as water and vegetable oil, and mixtures thereof
  • the formulation of the composition for treatment of dental infectious diseases is not particularly limited, but may be formulated into powders, microgranules, liquids, powders, sprays, ointments and gel preparations, most preferably formulated into gel preparations.
  • the peptide of the present invention is formulated into a composition for treating inflammation
  • it is formulated by conventional ingredients and methods, for example, lotion, cream, ointment, emulsion, foundation, oil, pack, soap including medicinal soap , body soap, lip rouge, nail cosmetics, eye cosmetics, perfume, face wash, toothpaste, mouthwash, deodorant, bath solvent, shampoo, rinse, hair spray, hair dye, etc.
  • the form of various compositions in which the components according to the present invention are blended can be optionally used in the form of a solution, cream, paste, gel, gel, foam, solid, and powder.
  • the present disclosure relates to a graft material containing a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • Transplantation materials may encompass transplantation materials in various fields, such as skin grafting materials, bone grafting materials, musculoskeletal regeneration materials, nerve regeneration materials, and blood vessel regeneration materials.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be used in combination with various implant matrices such as extracellular matrix protein, bone mineral, chitosan, and biodegradable synthetic polymer.
  • the extracellular matrix protein may be at least one selected from the group consisting of collagen, hyaluronic acid, elastin, chondroitin sulfate, and fibroin.
  • collagen may be most suitable. Collagen is produced by fibroblasts in the human body and is the main component of the most commonly found connective tissue in the body. It is a fibrous protein in In addition, many collagens exist around the axons of the central and peripheral nerves.
  • collagen hydrogel Since the function and role of the collagen hydrogel present in the body differs slightly depending on the tissue site, the collagen concentration and degree of orientation of the collagen hydrogel for each site are different.
  • bone is characterized by having a structure in which micro/nanocrystalline minerals are located between oriented collagen fibers.
  • Collagen is an absorbable material in the body that is easily decomposed and, when transplanted into the body, can be gradually decomposed and replaced with regenerated bone, so it is suitable as a graft material matrix.
  • type 1 or type 3 isolated from pig skin In the case of collagen, it is preferable to use type 1 or type 3 isolated from pig skin.
  • Bone mineral components include bio-derived bone mineral powder derived from allogeneic or xenogeneic bone, synthetic hydroxyapatite and calcium phosphate including tetracalcium phosphate (TTCP), dicalcium phosphate anhydrous (DCPA), and monocalcium phosphate monohydrate (MCPM). It may be one or more selected from the group consisting of cement (CPC) powder.
  • TTCP tetracalcium phosphate
  • DCPA dicalcium phosphate anhydrous
  • MCPM monocalcium phosphate monohydrate
  • the biodegradable synthetic polymer may be at least one selected from the group consisting of polyglycolide, polylactide, polyglycolide lactide, and polycatrolactone.
  • Implant matrices include paste, powder, putty, gel, hydrogel, matrix, granule, particle, lyophilized powder, lyophilized bone, demineralized lyophilized bone, fresh or fresh frozen bone, cortical spongy bone mix, pellet, strip, plug , membranes, lyophilized powders, spheres, sponges, blocks, mocelles, sticks, wedges, cements, or amorphous particles that are returned to water to form a dough.
  • the transplant material may be present as a combination of a first agent containing collagen as a main component and a second agent including a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 formulated to soak the first agent, which are mixed prior to transplantation. and can be used
  • the first agent containing collagen as a main component may include a 6X5X7mm or 8X7X9mm collagen sponge block, 6X6X3mm, 6X6X6mm, 7X8X9mm, or 9X10X11mm collagen and bone mineral complex.
  • the first agent and the second agent may be mixed and used before implantation. There is an advantage in that collagen and peptides can be maintained in an aseptic state when mixed and used immediately before transplantation.
  • the peptide 10 -4 ⁇ 0.5 It may be contained in parts by weight, more preferably 10 -3 to 10 -1 parts by weight. This is because the regenerative effect is not great when the peptide is contained in less than 10 -3 parts by weight, and it is difficult to contain it in the transplant material when it is contained in excess of 0.5 parts by weight.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 was synthesized by F-moc solid-state chemical synthesis from the C-terminus using a synthesizer. That is, it was synthesized using Rink resin (0.075 mmol/g, 100 ⁇ 200 mesh, 1% DVB crosslinking) to which Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl) was bound as a blocking group, and 50 mg of Rink Amide was added to the synthesizer. After adding the MBHA resin, the resin was swelled with DMF, and then a 20% piperidine/DMF solution was used to remove the Fmoc-group.
  • the synthesized peptide has a purity of 98.2% and a molecular weight of 1733.99, consisting of a 15mer amino acid sequence.
  • the anti-inflammatory ability was verified using human monocytic cell lines (THP-1, ATCC, TIB-202).
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate, Merck, P1585
  • LPS lipopolysaccharide, Merck, L3024
  • 200 ⁇ M of the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1 and 20 ng/ml of IL-4 (R&D system, 204-IL-010/CF) as a positive control were inoculated, and after 24 hours, the cell culture medium was obtained.
  • IL-6 R&D system, D6050
  • TNF- ⁇ R&D system, DTA00D
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Raw264.7 cells were distributed from ATCC (American Type Culture Collection) and used in the experiment.
  • Raw264.7 cells were cultured in a CO2 incubator at 37°C supplied with 5% CO2 and 95% air using DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) medium supplemented with 10% FBS and 100 units/ml antibiotics (penicillin-streptomycin).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS penicillin-streptomycin
  • Raw264.7 cells were treated with 200 ⁇ M of the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 for 30 minutes, and then treated with 1 ⁇ g/ml LPS (lipopolysaccharide, Merck, L3024). After 8 hours, the treated cells were collected, protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor cocktail were added to Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer solution, Thermo Fisher, 89900), and the cells were then treated and the cells were lysed.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the polyacrylamide gel was transferred to a nitrocellulose membrane, and the membrane was blocked with a blocking solution (5% skim milk in Tris-buffered saline with 0.1% Tween®20), and the blocking solution and 1:1000 ratio
  • a blocking solution 5% skim milk in Tris-buffered saline with 0.1% Tween®20
  • Primary antibodies phosphorylated NF- ⁇ B (Signaling Technology, 3033), NF- ⁇ B (Signaling Technology, 8242), phosphorylated I ⁇ B ⁇ (Cell Signaling Technology, 9246), I ⁇ B ⁇ (Cell Signaling Technology, 4812), ⁇ -actin (Santa Cruz Biotechnology, sc-47778) was reacted overnight in the refrigerator.
  • the secondary antibody for each primary antibody was reacted with a blocking solution of 1:2000 at room temperature for 1 hour, and then reacted with an ECL (enhanced chemiluminescence, Thermo Fisher, 34094) solution, and then the membrane was filmed using ChemiDoc Imaging Systems (Bio-Rad). developed.
  • Phosphorylated NF- ⁇ B and phosphorylated plkBa are indicators that can confirm the degree of inflammatory response at the cellular level, and the higher the inflammatory response, the more phosphorylated NF- ⁇ B and phosphorylated plkBa expression can be confirmed.
  • minocycline (Merck, M9511) 500ng/ml was inoculated, and 24 hours later, the absorbance was measured at a wavelength of 600nm using a spectrophotometer to confirm the degree of bacterial growth.
  • the survival rate of the bacteria was less than 50% at 250 ⁇ M or more for Aa (Aggregatibacter actinomycetemcomitans), Pg (Porphyromonas gingivalis) For , the survival rate of bacteria was less than 50% at 100 ⁇ M or more.
  • Minocycline has only antibacterial activity, whereas the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has both antibacterial activity and anti-inflammatory activity, so even if there is a slight difference in antibacterial activity, this part can be supplemented.
  • Pg it showed better effects than minocycline in all concentration ranges.
  • A. a. Aggregatibacter actinomycetemcomitans
  • P. g. Porphyromonas gingivalis
  • the N-terminus of the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 1 was fluorescently labeled with Rhodamine B (Tokyo chemical industry Co., LTD., A5102).
  • Rhodamine B Tokyo chemical industry Co., LTD., A5102
  • Raw264.7 cells were dispensed in 3X104 each in a 4-well chamber, and cultured for 24 hours in DMEM medium for cell stabilization. After 24 hours, fluorescently labeled peptides were added to the medium at concentrations of 50, 100, and 200 ⁇ M. After 1 hour of peptide treatment, the degree of intracellular peptide permeation was observed with a confocal scanning fluorescence microscope (model name, company name).
  • DIC represents the case of observation under a general microscope
  • Nuceli represents the nucleus of a cell
  • Peptide represents the degree of permeation of peptides combined with rhodamine B
  • MERGE represents an image of DIC, Nuclei, and permeated peptides superimposed.
  • the amine group of the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1 was labeled with fluorescence using Alexa Fluor TM 680 NHS Ester (Thermo Fisher, A20008).
  • the fluorescent labeling method followed the method provided by the manufacturer.
  • a fluorescently labeled peptide was dissolved in water for injection at a concentration of 250 mg/ml, and 10 ⁇ L was injected into the gingival sulcus of the premolars of adult dogs and the anterior gingival sulcus of rabbits.
  • the animal was sacrificed, and the gingival tissue was collected and the tissue was embedded using Tissue-Tek® OCT Compound (Sakura Finetek, 4583). After the embedded tissue was sectioned to a thickness of 10 ⁇ m, fluorescently labeled peptides were confirmed using a confocal scanning fluorescence microscope. Nuclei of tissue cells were stained using DAPI.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 penetrated not only at the cellular level but also at the tissue level.
  • Collagen gel was dissolved in 0.1M PBS at a concentration of 4%. 125 mg of the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1 was dissolved in 1 g of collagen gel. As a positive control, 20 mg of minocycline was dissolved in 1 g of the same collagen gel.
  • a collagen sponge block containing the peptide was implanted after inducing periodontitis in a beagle dog.
  • dental wire was wound around the cervical area of the 2nd, 3rd and 4th mandibular premolars in several layers to induce periodontitis. After winding the wire, the wire was removed 3 months later, and scaling and root planning were performed. 15 ⁇ l of the collagen gel containing the peptide having the amino acid of SEQ ID NO: 1 and the collagen gel containing minocycline were respectively applied to the gingival sulcus twice a week for 5 weeks.
  • It can be used as a pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory diseases or bacterial diseases or conditions. It can be used as a pharmaceutical composition for the treatment of periodontal diseases such as periimplantitis and periodontitis.
  • SEQ ID NO: 1 GKCSTRGRKS SRRKK

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Abstract

항균, 항염증 또는 조직재생능을 구비하는 펩타이드 및 이의 용도가 개시된다. 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.

Description

항균, 항염증 또는 조직재생능을 구비하는 펩타이드 및 이의 용도
본 기재는 항균, 항염증, 또는 조직재생능을 구비하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
많은 질환 및 상태는 다양한 박테리아 등에 의한 세균성 감염 뿐만 아니라 염증성 질환을 동반한다. 특히, 구강 질환 등의 경우에는 세균성 감염과 염증성 질환이 동반되는 경우가 대다수이다. 예를 들면, 임플란트 주위염(periimplantitis), 치주염(periodontitis), 치은염(gingivitis) 등의 치주 질환(periodontal disease)의 치료가 정상적으로 진행되기 위해서는 항균 및 항염 치료가 동시에 진행되어야 한다. 치주 질환 이외에도 치아의 스케일링 후의 손상 부위나 발치를 한 후의 발치와 상태 또한 동일하게 항균 및 항염 치료를 필요로 한다. 따라서, 이들 질환 및 상태에 효과적으로 적용할 수 있는 물질의 개발이 요구된다.
또한, 구강에는 700여 종의 미생물이 서식하며, 여러종류의 세균이 치아 표면에 부착하여 바이오필름(biofilms)을 형성하게 되고, 이러한 바이오필름에 의해 치은염, 치주염, 임플란트 주위염이 유발된다. 바이오필름이 형성되면 바이오필름은 물리적으로 두꺼운 층을 이루고 있기 때문에 외부 물질의 침투가 어렵고, 바이오필름 내 세포간 상호작용을 통해 유전자 변이가 일어나기 때문에 부유성 세균보다 항생제에 대한 저항성이 1,000배 정도 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 바이오필름 형성을 억제하거나 제거하면 보다 효과적으로 세균 감염에 의한 치은염, 치주염 또는 임플란트 주위염을 예방하거나 치료할 수 있을 것이다.
기존에 조직재생을 목적으로 하는 이식재는 염증이 없는 부위에서만 재생 기능을 발휘할 수 있으며, 이식 후에 염증이 발생하면 재생 기능을 발휘할 수 없다. 따라서, 항균 및 항염작용이 있는 물질을 이식재와 같이 적용하면 초기에 발생할 수 있는 염증을 억제함으로써 손상된 조직의 재생을 달성할 수 있다. 예를 들면, 치주염에 의해 손상된 치주조직은 이식재에 항균 및 항염작용이 있는 물질을 병용한다면 치조조직 재생효과를 용이하게 얻을 수 있다.
본 개시는 항염능을 구비하는 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 개시는 세포수준과 바이오필름에서의 항균능을 구비하는 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 개시는 세포 투과능을 구비하는 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 개시는 항염능 또는 항균능을 구비하는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 개시는 항염능 또는 항균능을 구비하는 펩타이드를 포함하는 이식재를 제공하고자 한다.
실시예에 따른 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드이다.
실시예에 따른 약제학적 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
실시예에 따른 이식재는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 포함한다.
기타 본 발명의 측면들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
실시예에 따른 펩타이드는 항염능 또는 항균능이 있어, 염증성 질환 또는 세균성 질환 또는 상태의 치료 목적으로 사용될 수 있다.
실시예에 따른 펩타이드는 세포투과능이 있어 펩타이드의 세포 투과를 위해 별도의 펩타이드를 부착하거나 기타 제제를 첨가할 필요가 없다. 또한 세포 투과능이 낮은 다른 펩타이드와 컨쥬게이션을 통해 다른 펩타이드의 세포 투과를 보조할 수 있다.
실시예에 따른 이식재는 항염능 또는 항균능이 있어, 임플란트 주위염(periimplantitis), 치주염(periodontitis) 등의 치주 질환 부위에 효과적으로 적용될 수 있으며, 조직재생 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 합성한 후 액상 크로마토그래피(Liquid Chromatography)를 이용하여 순도를 분석한 결과이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 합성한 후 질량 스펙트럼(Mass Spectrum)을 이용하여 분자량을 분석한 결과이다.
도 3은 IL-6 및 TNF-α의 효소면역분석법(ELISA) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 pNFkB 및 plkBa의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 항균능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 바이오 필름에 처리한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 세포 내 투과 정도를 공초점 현미경(Confocal Microscope)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 가토 치은 조직에 대한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 세포 내 투과 정도를 나타낸 것이다.
도 9는 성견 치은 조직에 대한 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 세포 내 투과 정도를 나타낸 것이다.
도 10은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 함유된 콜라겐 스펀지 블록의 항균능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11 및 도 12는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 함유된 콜라겐 젤을 성견 치주염 모델에 처리하여 치주조직재생을 방사선 촬영으로 확인한 결과와 치조골이 재생된 정도를 수치로 나타낸 것이다. 사각형은 이식재에 의해 재생된 치조골을 나타낸다.
이하 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 실시예들에 대하여 상세히 설명한다. 실시예는 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구체적인 실시예로만 한정되지 않는다.
본 개시에서 사용되는 일부 용어들의 정의가 아래에 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다.
본 개시에서 기술된 기법 및 공정들은 일반적으로 통례적인 방법에 따라 수행되며, 이는 본원 전체에 제시된다. 일반적으로, 본 개시에 사용된 명명 및 분자 생물학, 생화학, 분석 화학 및 세포 배양에서의 실험 절차들은 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 바와 동일하다.
일 관점에서 본 개시는 항염능 또는 항균능을 가지는 펩타이드에 관한 것이다. 펩타이드는 아래 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드이다.
서열번호 1 : GKCSTRGRKSSRRKK
일 양태에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리한 후에 염증 마커인 IL-6 및 TNF-α의 세포내 방출량을 효소면역분석법(ELISA)을 이용하여 측정하였으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 항염효과를 가진 사이토카인인 IL-4와 거의 유사한 항염능을 나타냄을 확인하였다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드에 의한 염증 관련 효소인 pNF-κB 의 발현 억제 효과를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 그 결과 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 LPS에 의해 유도된 pNF-κB 의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다.
또 다른 양태에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 치주염 유발균인 Aggregatibacter actinomycetemcomitans와 Porphyromonas gingivalis에 대해 우수한 항균능이 있음을 확인하였으며, 치주염 치료에 많이 사용되는 미노사이클린 (minocycline) 대비 동등 또는 유사한 항균능을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 치주염 유발균을 이용하여 제작한 인공 바이오필름에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리한 결과 항균능이 있으며 나아가 세포 투과능도 있음을 확인하였다.
다른 관점에서 본 개시는 세포 투과능을 가지는 펩타이드에 관한 것이다.
일 양태에서는 in vitro와 in vivo 실험을 통해 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 세포 내로 투과되는 것을 확인하였다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 마우스 대식세포 (RAW264.7)에 처리하고 세포내로 투과되는 지를 확인한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 세포 내로 투과되는 것을 확인하였다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 세포 수준 뿐만 아니라, 조직 수준에서도 투과되는 것을 확인하였다. 살아있는 가토의 치은 조직과 성견의 치은 조직에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리하였을 때, 가토의 치은 조직과 성견의 치은 조직 내부로 투과되는 것을 확인하였다.
치주염이나 임플란트 주위염의 경우, 여러 종류의 치주염 유발균들이 군집을 이루어 두꺼운 바이오필름 (biofilm)을 형성한다. 이러한 바이오필름은 항생제에 대한 내성이 증가하기 때문에, 항생제 투여만으로는 제거하기가 어렵다. 따라서, 이러한 바이오필름을 통과하는 동시에 바이오필름을 구성하는 치주염 유발균에 대한 항균능이 필요하다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 자체적으로 세포 내로 투과 가능하기 때문에 부가적인 전달체를 사용할 필요가 없다. 따라서, 치아에 형성되는 바이오필름을 투과하여 항균능을 나타내거나 치은 조직에 쉽게 침투할 수 있다. 나아가 이와 같은 세포/조직 투과능을 이용하여, 세포 투과능이 없으면서 항염증 기능을 가지는 펩타이드와 화학적으로 컨쥬게이션 (conjugation)해서 세포 투과능을 부여함으로써, 원하는 항염증 효과를 증대시킬 수 있다.
또 다른 관점에서 본 개시는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은 치과 감염 질환 치료용으로 효과적으로 적용될 수 있으며, 치과감염 질환은 치주염, 치은염 및 임플란트 주위염으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
치과 감염 질환 치료용 조성물 전체 100중량부에 대하여, 상기 펩타이드 10-3~10중량부 함유될 수 있고, 보다 바람직하게는 10-2~10-1중량부를 함유할 수 있다. 이는 펩타이드가 10-3　중량부 미만으로 함유되면 항균 또는 항염증 효과가 크지 않고, 10중량부를 초과하여 함유되면 효과가 비례적으로 증가하지 않아, 함유 증가에 따른 실익이 없기 때문이다.
치과감염 질환 치료용 조성물은 프로폴리스, 자일리톨 및 단백질 분해효소로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 함유할 수 있는데, 프로폴리스 또는 자일리톨을 추가로 포함하여 관능특성을 향상시킬 수도 있고, 단백질 분해효소를 첨가하여 항균효과 및 리포다당류 제거 효과를 높일 수 있다.
치과감염 질환 치료용 조성물의 약제학적으로 허용되는 담체는 녹말, 락토오스, 탄산칼슘, 인산칼슘 등과 같은 부형제, 녹말, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로오즈, 히드록시메틸셀룰로오즈, 결정성셀룰로오즈 등과 같은 결합체, 마그네슘스테아레이트, 활석 등과 같은 윤활제, 카르복시메틸셀룰로오즈 칼슘, 활석 합성알루미늄 실리케이트 등과 같은 분해제, 물, 식물유 등과 같은 희석제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
치과감염 질환 치료용 조성물의 제형은 특별히 제한되지는 않으나, 분말, 미세과립, 액제, 산제, 분무제, 연고제 및 겔상제제로 제형화될 수 있으며, 겔상제제로 제형화되는 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 펩타이드를 염증 치료용 조성물에 배합한 경우의 제형에 대해서는 통상적인 성분과 방법에 의해 배합되고, 예컨대, 화장수, 크림, 연고, 유액, 파운데이션, 오일, 팩, 약용비누를 포함한 비누, 보디비누, 입술연지, 손톱 화장품, 눈 화장품, 향수, 세안료, 치약 마우스 원시 등과 같은 구강용류, 방취제, 목욕 용제, 샴푸, 린스, 헤어 토익, 헤어 스프레이 및 염모료 등의 제형으로 할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 성분을 배합한 각종 조성물의 형태는 임의적으로서, 용액형, 크림형, 페이스트형, 겔형, 젤형, 거품형, 고형상 및 분말형으로서 이용할 수 있다.
또 다른 관점에서 본 개시는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 이식재(graft)에 관한 것이다. 이식재는 피부이식재, 뼈이식재, 근골격재생재, 신경재생재, 혈관재생재 등 다양한 분야의 이식재를 포괄할 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 세포외기질 단백질, 골미네랄, 키토산, 생분해성 합성 고분자 등과 같은 다양한 이식재 매트릭스와 조합하여 사용할 수 있다.
세포외기질 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 및 피브로인으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 이들 세포외기질은 사람, 동물에서 유래한 것과 미생물에서 생산된 재조합 단백질 모두를 사용할 수 있다. 세포외기질 단백질 중에서는 콜라겐이 가장 적합할 수 있다. 콜라겐은 인체내에서는 섬유아세포(fibroblast)에 의해 만들어지며, 체내에서 가장 흔하게 발견되는 결합 조직(connective tissue)의 주성분으로, 뼈, 피부, 관절, 각종 장기의 막, 모발 등 우리 몸 전체에 분포하고 있는 섬유상 단백질이다. 아울러, 중추 및 말초신경의 액손 주위에도 많은 콜라겐이 존재한다. 체내에 존재하는 콜라겐 하이드로겔은 조직 부위에 따라 그 기능과 역할이 조금씩 다르므로, 부위별 콜라겐 하이드로겔의 콜라겐 농도와 배향 정도는 차이가 있다. 예를 들면, 뼈는 배향된 콜라겐 섬유 사이에 마이크로/나노결정의 미네랄이 자리하는 구조를 가지고 있는 것이 특징이다. 콜라겐은 체내 흡수성 소재로 분해가 잘 되어 체내에 이식할 경우 점차 분해되어 재생되는 뼈로 대체되도록 할 수 있기 때문에 이식재 매트릭스로 적합하다.　콜라겐의 경우, 돼지 피부에서 분리한 타입 1, 또는 타입 3를 사용하는 것이 바람직하다.
골미네랄 성분은 동종골 또는 이종골에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말, 합성 수산화아파타이트 및 테트라칼슘 포스페이트(TTCP), 디칼슘포스페이트 무수물(DCPA), 및 모노칼슘 포스페이트 모노하이드레이트(MCPM)를 포함하는 인산칼슘 시멘트(CPC) 분말로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
생분해성 합성 고분자는 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드락티이드, 폴리카트로락톤으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
이식재 매트릭스는 페이스트, 분말, 퍼티, 겔, 하이드로겔, 매트릭스, 과립, 입자, 동결 건조 분말, 동결건조골, 탈미네랄화 동결건조골, 신선 또는 신선 동결골, 피질 해면골 믹스, 펠릿, 스트립, 플러그, 멤브레인, 습떡을 형성하기 위해 물로 되돌려지는 동결 건조 분말, 구형체,　스펀지, 블록, 모셀, 스틱, 웨지, 시멘트, 또는 비정질 입자로 이루어진 제제 상태일 수 있다.
일 양태에서는 이식재는 콜라겐을 주성분으로 하는 제1 제와 제1 제를 침지할 수 있도록 제제화된 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 제2 제의 조합으로서 존재할 수 있으며, 이들은 이식 전에 혼합되어 사용될 수 있다.
콜라겐을 주성분으로 하는 제1 제는 크기 6X5X7mm 또는 8X7X9mm 콜라겐 스펀지 블록, 6X6X3mm, 6X6X6mm, 7X8X9mm, 9X10X11mm 크기의 콜라겐과 골미네랄 복합체를 포함할 수 있다. 제1 제와 제2 제는 이식 전에 혼합되어 사용될 수 있다. 이식 직전에 혼합하여 사용할 경우 콜라겐 및 펩타이드를 무균 상태로 유지할 수 있다는 장점이 있다.
이식재(graft)의 전체 100중량부에 대하여, 상기 펩타이드 10-4~0.5 중량부 함유될 수 있고, 보다 바람직하게는 10-3~10-1중량부를 함유할 수 있다. 이는 펩타이드가 10-3　중량부 미만으로 함유되면 재생 효과가 크지 않고, 0.5 중량부를 초과하여 함유되면 이식재에 함유하기가 어렵기 때문이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예들을 제시하나, 하기 실험예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예들에 한정되는 것은 아니다.
펩타이드 합성
서열번호 1의 펩타이드를 합성장치를 이용하여 C 말단으로부터 F-moc 고체상 화학합성방법으로 합성하였다. 즉, 블로킹 그룹(Blocking group)으로 Fmoc-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)이 결합된 Rink resin (0.075 mmol/g, 100 ~ 200 mesh, 1% DVB crosslinking)을 사용하여 합성하였으며, 합성기에 50 mg의 Rink Amide MBHA resin을 넣은 뒤 DMF로 resin을 스웰링(swelling) 시킨 후 Fmoc-group의 제거를 위해 20% piperidine/DMF 용액을 사용하였다. C 말단부터 서열대로 0.5M amino acid 용액(용매: DMF), 1.0M DIPEA(용매: DMF&NMP), 0.5M HBTU (용매: DMF)를 각각 5, 10, 5 당량씩 넣어 질소 기류 하에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상기 디프로텍션(deprotection)과 커플링(coupling) 단계가 끝날 때마다 DMF와 Methanol로 두 번씩 세척하는 과정을 거쳤다. 마지막 아미노산을 커플링(coupling) 시킨 후에도 디프로텍션(deprotection)을 해주어 Fmoc-group을 제거하였다.
합성의 확인은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test) 방법을 이용하였고, 테스트를 거치고 합성이 완료된 resin은 건조시킨 후 Reagent K cleavage cocktail을 resin 1g 당 20ml의 비율로 넣어 3시간 shaking 시킨 후 필터링을 통해 resin과 펩타이드가 녹아 있는 cocktail을 분리하였다. 필터로 걸러진 용액을 콜드 에테르(cold ether)를 넣어주어 펩타이드를 고체상으로 결정화시키고 이를 원심분리하여 분리했다. 이때 에테르로 여러 번 세척과 원심분리 과정을 거쳐 Reagent K cleavage cocktail을 완전히 제거하였다. 이렇게 해서 얻어진 crude를 증류수에 녹여 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하였다. 정제된 펩타이드는 동결건조를 진행한다. 액상 크로마토그래피로 순도를 분석하고 질량 스펙트럼을 측정한 결과가 도 1 및 도 2에 예시되어 있다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 합성된 펩타이드는 순도가 98.2% 인 것을 확인할 수 있으며 분자량이 1733.99로 15mer의 아미노산 서열로 이루어져 있음을 확인할 수 있다.
항염능 평가
1) 염증유발 사이토카인 (IL-6 및 TNF-α) 생성량 측정
사람의 단핵구세포주(THP-1, ATCC, TIB-202)을 이용하여 항염능을 검증하였다. 단핵구세포주의 경우 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate, Merck, P1585)를 접종하여 단핵구세포에서 대식세포로 분화 시킨 후 염증 유도물질인 1μg/ml LPS (lipopolysaccharide, Merck, L3024)를 처리하였다. 16시간 뒤 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드 200μM 및 양성 대조군으로 IL-4(R&D system, 204-IL-010/CF) 20ng/ml을 접종하고 24시간 뒤 세포의 배양액을 수득하였다. 배지에 존재하는 세포가 분비하는 염증 유발 사이토카인인 IL-6(R&D system, D6050), TNF-α(R&D system, DTA00D)의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 3에 도시되어 있는 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리한 경우(LPS+S3)에 IL-6 및 TNF-α 값이 IL-4를 처리한 경우와 비슷한 수준으로 낮아짐을 확인하였다. LPS만 처리하였을 경우, IL-6와 TNF-α 값이 증가하였다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 항염증 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
2) pNFkB 및 plkBa의 웨스턴 블랏
Raw264.7 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 실험에 사용하였다. Raw264.7 세포는 10% FBS와 100unit/ml 항생제(페니실린-스트렙토마이신)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)배지를 사용하여 5% CO2, 95% air가 공급되는 37℃의 CO2　배양기에서 배양하였다.
Raw264.7 세포에 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 200μM을 30분 동안 처리한 뒤, 1μg/ml LPS (lipopolysaccharide, Merck, L3024)를 처리하였다. 8시간후 처리된 세포를 모은 후 Radioimmunoprecipitation assay buffer(RIPA 완충용액, Thermo Fisher, 89900)에 protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor cocktail을 첨가한 후 세포에 처리하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액을 원심분리한 후 상층액을 회수한 후 Bicinchoninic acid assay(BCA assay, Thermo Fisher, 23227)를 통하여 세포 용해액의 농도를 측정하였고, RIPA 완충용액을 첨가하여 세포 용해액을 최종 5mg/ml로 제작하였다. 그리고 1M Tris-HCl(pH 6.8), 50% glycerol, 10% SDS 조성의 완충용액과 4:1 비율로 섞은 후 sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)을 진행하였다. 이후 폴리아크릴아마이드 젤을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 전이 시킨 후 블로킹 용액 (5% skim milk in Tris-buffered saline with 0.1% Tween®20)로 막을 블록한 뒤, 상기 블로킹 용액과 1:1000 비율로 1차 항체(인산화 NF-κB(Signaling Technology, 3033), NF-κB(Signaling Technology, 8242), 인산화 IκBα(Cell Signaling Technology, 9246), IκBα(Cell Signaling Technology, 4812), β-actin(Santa Cruz Biotechnology, sc-47778))를 하룻밤 동안 냉장에서 반응시켰다. 이후 각 1차 항체에 대한 2차 항체를 블로킹 용액 1:2000으로 상온에서 1시간 반응 후 ECL (enhanced chemiluminescence, Thermo Fisher, 34094) 용액으로 반응시킨 후 ChemiDoc Imaging Systems(Bio-Rad)를 이용하여 막을 현상하였다. 인산화 NF-κB, 인산화 plkBa는 세포 수준에서 염증 반응 정도를 확인할 수 있는 지표로 염증반응이 높을수록 더 많은 인산화 NF-κB, 인산화 plkBa발현을 확인할 수 있다.
그 결과,　도 4에 나타난 바와 같이, LPS만 처리하였을 때는 pNFκB 및 plkBa의 발현이 증가하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리한 후, LPS를 처리하였을 경우, pNFκB 및 plkBa의 발현을 억제하였음을 확인하였다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 항염증 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
그러나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드만 처리하였을 때는, 세포의 pNFκB 및 plkBa의 발현에 영향을 주지 않았으므로, 이는 펩타이드가 안전하다는 것을 간접적으로 증명하는 것이다.
항균능 평가
1) 치주염 원인균 성장 억제
항균능을 평가하기 위하여 대표적인 치주염 원인균인　Aggregatibacter actinomycetemcomitans와 Porphyromonas gingivalis를 이용하였다. BHI(brain heart infusion) 액상 배지에 각 균을 접종한 후 37℃, 120rpm 조건으로 혐기성 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 100μM, 250μM, 500μM로 처리하였다. 양성 대조군으로 minocycline(Merck, M9511)500ng/ml을 접종한 후 24시간 뒤 분광광도계를 이용하여 600nm 파장으로 흡광도를 측정하여 균의 생장 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리하였을 경우 Aa(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)에 대해서는 250μM이상에서 균의 생존률이 50% 이하로 나타났으며, Pg(Porphyromonas gingivalis)에 대해서는 100 μM 이상에서 균의 생존률이 50% 이하로 나타났다.
한편, 미노사이클린의 효과와 비교시 Aa에 대해서는 500 μM 농도로 처리시 미노사이클린 500ng/ml 처리시 보다는 생존율이 높지만 유사한 효과를 나타내었다. 미노사이클린의 경우에는 항균능만 있는 반면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 경우에는 항균능과 함께 항염능이 있기 때문에 항균능이 약간 차이가 있더라도 이 부분을 보완할 수 있다. Pg에 대해서는 모든 농도 범위에서 미노사이클린보다 우수한 효과를 나타내었다.
2) 바이오필름에서 항균능 평가
구강내에서 치주염 유발균이 바이오필름(biofilm)형태로 존재하고 있어 이를 모방하기 위해 A. a.(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)와 P. g.(Porphyromonas gingivalis) 균을 이용하여 인공 biofilm을 티타늄 원판 표면에 제작하였다. 티타늄 원판에 타액과 균을 섞은 후 BHI 액상 배지에 넣은 후 37℃ 조건으로 혐기성 배양기에서 배양하였다. 72시간 후, 50μg/ml (=29μM), 100μg/ml(=58μM), 250μg/ml(=144μM), 500μg/ml(=288μM) 펩타이드 및 양성 대조군으로 1 μg/ml minocycline을 접종하였다. 접종 24시간 후, 표면에 biofilm이 형성된 티타늄 원판을 얻어서 Filmtracer쪠 LIVE/DEAD쪠 Biofilm Viability Kit (Thermo Fisher, L10316)을 이용하여 biofilm을 염색하였다. 살아있는 균은 녹색으로 사멸된 균은 빨간색으로 염색된다. 공초점 주사형광 현미경 (모델명, 회사명)을 이용하여 티타늄 원판을 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타나 바와 같이, 양성 대조군으로 사용된 minocycline의 경우 biofilm을 뚫고 균을 사멸시킬 수 없기 때문에, 사멸된 균 (붉은색)이 거의 관찰되지 않았다. 반면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 처리한 경우, 농도 50μg/ml(=29μM) 부터 사멸된 균 (붉은색)이 관찰되었다. 따라서 biofilm 형태로 존재하는 균의 경우 기존의 항생제로는 사멸시키지 못하지만 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드의 경우, 바이오필름까지 투과하여 항균능을 가지는 것을 확인할 수 있다.
세포/조직 투과능 평가
1) 세포수준에서 세포투과능 평가
실시예 1에서 제조된 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드의 N 말단에 Rhodamine B(Tokyo chemical industry Co., LTD., A5102)로 형광 표지하였다. Raw264.7세포를 4-웰 챔버(chamber)에 3X104 개씩 분주하고, 세포 안정화를 위해 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 형광 표지된 펩타이드를 50, 100, 200 μM 농도로 배지에 가하였다. 펩타이드 처리 1시간 후, 세포 내 펩타이드의 투과정도를 공초점 주사형광 현미경(모델명, 회사명)로 관찰하였다. 세포의 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Fisher, D1306)를 이용하여 염색하였다. DIC는 일반 현미경으로 관찰한 경우를, Nuceli는 세포의 핵, Peptide는 rhodamine B와 결합된 펩타이드의 투과정도, MERGE는 DIC, Nuclei 및 투과된 펩타이드의 이미지를 중첩한 이미지를 나타낸다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 처리된 세포에서는 rhodamine B (붉은색)의 형광을 확인할 수 있었으나, 처리하지 않은 실험군에서는 붉은색을 확인할 수 없었다. 또한, 펩타이드의 농도가 높아질 수록 형광의 세기 또한 증가함을 알 수 있었다.
2) 동물 조직에서 조직투과능 평가
서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드의 아민기에 Alexa FluorTM 680 NHS Ester (Thermo Fisher, A20008)을 이용하여 형광을 표지를 하였다. 형광 표지 방법은 제조사에서 제공하는 방법을 따랐다. 형광이 표지된 펩타이드를 주사용수에 250mg/ml 농도로 녹여서, 성견 (beagle dog) 소구치의 치은열구 및 가토 (rabbit)의 전치 치은열구에 10μL를 주입하였다. 2시간 후, 조직 내 펩타이드의 투과도를 확인하기 위해, 동물을 희생한 후 치은 조직을 채취하여 Tissue-Tek® O.C.T. Compound(Sakura Finetek, 4583)를 이용하여 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 10μm 두께로 절편 제작한 후, 공초점 주사형광 현미경으로 형광으로 표지된 펩타이드를 확인하였다. 조직세포의 핵은 DAPI를 이용하여 염색하였다.
그 결과, 도 8은 가토의 치은 조직, 도 9는 성견의 치은 조직의 결과로부터 형광 표지된 펩타이드가 치은 조직 세포를 투과하여 약 500 (440-459) μm 까지 도달함을 확인할 수 있었다.
따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 세포 수준 뿐만 아니라, 조직까지 투과하는 것을 확인할 수 있었다.
이식재의 항균능 평가
크기 6X5X7mm의 콜라겐 스펀지 블록에 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드 500μg/0.5 ml을 침지하고, 4℃에서 8시간 동안 방치한 후, 동결건조하였다. 양성 대조군으로 미노싸이클린 (minocycline, Merck, M9511) 250ng/0.5ml을 크기 6X5X7mm의 콜라겐 스펀지 블록에 침지하고, 4℃에서 8시간 동안 방치한 후, 동결건조하였다.서열번호1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 함유된 이식재의 항균능을 평가하기 위하여 대표적인 치주염 원인균인　Aggregatibacter actinomycetemcomitans와 Porphyromonas gingivalis를 이용하였다. BHI(brain heart infusion) 액상 배지에 각 균을 접종한 후 37℃, 120rpm 조건으로 혐기성 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 실시예 2의 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 함유된 콜라겐 스펀지 블럭을 배지에 가하였다. 24시간 후 600nm 파장에서 흡광도를 측정하여 균의 생장 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 함유된 콜라겐 스펀지 블록을 처리하였을 경우 Aa(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)과 Pg(Porphyromonas gingivalis)에 대해서는 균의 생존률이 40% 이하로 나타났다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 콜라겐 스펀지 블록에 적용했을 때도, 항균 효과가 존재하는 것을 증명하였다.
이식재의 치주조직재생능 평가
콜라겐 젤은 4% 농도로 0.1M PBS에 용해하였다. 콜라겐 젤 1g에 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드 125mg을 용해하였다. 양성 대조군으로 미노싸이클린 20mg을 동일한 콜라겐 젤 1g에 용해하였다.
서열번호1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 함유된 이식재에 의한 치주조직 재생능을 평가하기 위해, beagle dog에서 치주염을 유발한 후에 펩타이드가 함유된 콜라겐 스펀지 블록을 이식하였다. 치주염 유발은 치과용 철사를 이용하여 하악 소구치 2, 3, 4번의 치경부에 여러 겹으로 감아 치주염을 유발시켰다. 철사를 감은 후 3개월 뒤에 철사를 제거하고, 스케일링(scaling)과 치근활택술 (root planning)을 진행하였다. 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 함유된 콜라겐 젤과 미노싸이클린이 함유된 콜라겐 젤 15μl를 각각 치은열구에 주 2회씩 5주 동안 적용하였다. 12주 동안 치주 상태를 관찰하고, 방사선 (X-ray) 촬영을 하여, 치조골 재생을 관찰하였다. 그 결과, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 아무것도 적용하지 않은 군 (NT)은 12주 후에 치조골이 생성되지 않았다. 미노싸이클린을 함유한 콜라겐 젤을 이식한 군은 NT 군과 유사한 치조골 재생 정도를 보였다. 그러나, 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 적용된 콜라겐 젤을 이식한 경우, 치조골의 재생(사각형 내 흰색부분)이 미노싸이클린을 함유한 콜라겐 젤을 이식한 군에 비해 10배 이상 증가하였다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산을 가지는 펩타이드가 적용된 콜라겐 젤은 치주조직재생 효과가 우수한 것을 증명하였다.
상기에서는 실험예에 대하여 설명하였지만, 권리범위는 이에 의해 한정되는 것이 아니다. 구현되는 형태는 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 권리 범위에 속하는 것은 당연하다.
염증성 질환 또는 세균성 질환 또는 상태의 치료를 위한 약제학적 조성물로 사용될 수 있다. 임플란트 주위염(periimplantitis), 치주염(periodontitis) 등의 치주 질환 치료를 위한 약제학적 조성물로 활용이 가능하다.
서열번호 1 : GKCSTRGRKS SRRKK

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항염능을 가지는 펩타이드.
  2. 제1 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항염성 약제학적 조성물.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 항염성 약제학적 조성물은 치과감염 질환 치료용인 항염성 약제학적 조성물.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 세균 및 바이오필름에 대한 항균능을 가지는 펩타이드.
  5. 제4 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균성 약제학적 조성물.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 항균성 약제학적 조성물은 치과감염 질환 치료용인 항염성 약제학적 조성물
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항염능 및 항균능을 가지는 펩타이드.
  8. 제7 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항염성 및 항균성 약제학적 조성물.
  9. 제5 항에 있어서,
    상기 항염성 및 항균성 약제학적 조성물은 치과감염 질환 치료용인 항염성 및 항균성 약제학적 조성물.
  10. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 세포투과능과 조직투과능을 가지는 펩타이드.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 치과감염 질환 치료용인 약제학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 치과감염 질환은 치은염, 치주염 또는 임플란트 주위염인 약제학적 조성물.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 이식재.
  15. 제14 항에 있어서,
    상기 이식재는 세포외기질 단백질, 골미네랄, 키토산 또는 생분해성 합성 고분자를 포함하는 이식재.
  16. 제14 항에 있어서,
    상기 이식재는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 10-4~0.5 중량부로 포함하는 이식재.
  17. 상기 14항에 있어서,
    상기 이식재는 항균, 항염증 또는 치주조직재생능이 있는 이식재.
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