WO2023149787A1 - 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치 - Google Patents

감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치 Download PDF

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WO2023149787A1
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chamber
central chamber
reagent
nucleic acid
central
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PCT/KR2023/001741
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나훈종
장지성
스베드버그 구스타프에릭
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주식회사 퀀타매트릭스
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid analysis device that includes functions of separating and concentrating infectious agents, and more particularly, to identify bacteria or strains causing infectious diseases and multiplex detection of antibiotic resistance gene information to select antibiotics suitable for patients at an early stage. It relates to a nucleic acid analysis device that includes an infectious agent separation and concentration function.
  • Sepsis is an infectious disease with a very high mortality rate, accounting for about 25 to 30% of patients in intensive care units, and one person dies of sepsis every 3 seconds. Rapid diagnosis, in which the survival rate decreases by 9% for every 1 hour delay in treatment, is a very important field. In the case of initial prescription, 42% of patients have no effect at all, and 21% of patients are prescribed antibiotics more than necessary. Therefore, it is necessary to eliminate drug misuse and abuse that occurs in this process.
  • apolipoprotein is used to isolate sepsis-causing bacteria.
  • Apolipoprotein H (ApoH) or beta2-glycoprotein I is an acute phase protein circulating in human plasma. It has been found that ApoH can bind with high affinity to lipopolysaccharide (LPS), which is a major component of the outer wall of Gram-negative bacteria, and specific proteins of Gram-positive pathogens.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the broad specificity of ApoH can be used as a marker for the capture of bacterial and fungal pathogens in blood samples.
  • ApoH can be coated on magnetic beads, and the capture of pathogens using these beads can also act on fungi.
  • the magnetic beads are mixed with blood and reacted, only the infectious agent (causative bacteria of sepsis) in the blood can be attached to the magnetic beads, and if the magnetic beads are separated with a magnet, the infectious agents in the blood can be separated and concentrated.
  • Nested PCR nested polymerase chain reaction
  • Conventional PCR requires a complementary primer at the end of the nucleotide sequence of the target gene and PCR products are amplified according to the cycle, but Nested PCR specifically binds to the nucleotide sequence of the target gene to increase the efficiency. Primers from the set are used for two consecutive PCRs.
  • the first PCR amplification product may include the amplification of a non-specific nucleotide sequence, but the first PCR amplification product can be used as a target gene of the second PCR.
  • the second PCR can increase the amplification accuracy of the base sequence of the final target gene by using an inner primer that can be attached to the base sequence nested in the first PCR amplification product or by the ‘hemi,semi-nesting’ method.
  • nested PCR can be used to increase the accuracy and reliability of multiple gene amplification of multispecies pathogens that can cause sepsis.
  • the present invention is a nucleic acid analysis that includes the function of separating and concentrating the infectious agent to enable early selection of an antibiotic suitable for the patient by identifying the causative bacteria or strains of the infection and multiple detection of antibiotic resistance gene information. We want to provide you with a device.
  • the present invention is a first body in which a plurality of side chambers with upper portions are closed and arranged outside the central chamber; a second body coupled to a lower portion of the first body to form a lower portion of the side chamber; a third body coupled to the lower portion of the second body and having a central chamber extending upward through the center of the first body; and a lower reagent transfer unit rotating at a lower end of the central chamber to connect the central chamber and the side chambers, and providing an infectious agent separation and concentration function.
  • one side of the PCR channel is connected to one side of the first body, and a lower end of one side of the PCR channel may be in communication with the connection chamber.
  • a lid for closing the upper portion of the central chamber is coupled to the upper portion of the first body, and a pump connection portion to which a pump capable of pressurizing or depressurizing the inside of the central chamber is connected is formed at the center of the lid. It can be.
  • the lower reagent moving means includes a moving channel therein, one side of the moving channel is fixed to the center of the central chamber, and the other side moves along the plurality of sides according to the rotation of the lower reagent moving means. It can be selectively connected to the chamber.
  • the lower reagent transfer unit may move the sample, reagent, and magnetic beads between the central chamber and the side chamber through the pressurization or depressurization of the central chamber.
  • a third body is coupled to a lower portion of the second body, and the third body includes: a transfer hole formed at a position corresponding to a lower portion of the side chamber of the second body; and a connecting portion for independently rotatably connecting the third body to the second body, and the transfer hole may be a lower portion to which the other side of the lower reagent moving means is fixed.
  • the lower reagent transfer means rotates integrally with the third body, and the chamber connected to the upper part of the transfer hole communicates with the central chamber through the lower reagent transfer means by rotation of the third body. It can be.
  • the first packing rubber located between the first body and the second body; and a second packing rubber positioned between the second body and the third body, wherein the second packing rubber is in close contact with the second body even when the third body rotates, so as to load objects inside the side chamber. This may be to prevent leakage.
  • the second packing rubber has an outlet hole formed at the center of the side chamber, and the side chamber may be connected to the lower reagent transfer unit through the outlet hole and the transfer hole.
  • a part or all of the central chamber may have a shape in which a diameter becomes narrower toward the bottom.
  • the present invention also provides a first body in which a plurality of side chambers with upper ends are arranged outside the central chamber; a second body coupled to a lower portion of the first body to form a lower portion of the side chamber; a third body coupled to the lower portion of the second body and having a central chamber passing through the center of the first body; and a lower reagent moving means rotating at the lower end of the central chamber to connect the central chamber and the side chamber.
  • the step (b) may include: (i) rotating the lower reagent moving means to connect the collecting reagent chamber and depressurizing the central chamber to move the bacteria-collecting reagent into the central chamber; (ii) rotating the lower reagent transfer means to connect the magnetic bead chamber and depressurizing the central chamber to transfer the magnetic beads to the central chamber; (iii) rotating the lower reagent transfer means to connect the injection chamber connected to the sample tube and depressurizing the central chamber to transfer the sample in the sample tube to the central chamber; (iv) mixing the sample, the reagent, and the magnetic beads in the central chamber by rotating the lower reagent moving means to connect the collection reagent chamber and depressurizing and pressurizing the central chamber; (v) fixing the magnetic beads by contacting a magnetic material to a lower portion of the cartridge, and pressurizing the central chamber to discharge excess reagent; (vi) rotating the lower reagent transfer means to connect to the cleaning chamber and depressurizing and pressurizing the central chamber to clean
  • the magnetic beads may be fixed to the inside of the lower reagent moving means by the magnetic material.
  • step (vi) may be performed repeatedly 2 to 10 times.
  • a nucleic acid analysis device including an infectious agent separation and concentration function according to the present invention can provide a more convenient and highly sensitive cartridge by introducing a technology for collecting and concentrating microbes present in a small amount in a sample.
  • the cartridge design and production efficiency can be improved by simplifying the structure of the cartridge itself.
  • the structure of the cartridge can be further simplified, and the overall size of the cartridge can be made smaller compared to the amount of solution to be handled.
  • the nucleic acid analysis device including the function of separating and concentrating infectious agents according to the present invention is capable of directly separating/concentrating sepsis-causing agents from whole blood without a separate culturing process and detecting fluorescence of multiplex nested PCR amplification products of multiple genes. It is possible to derive the causative bacteria and resistance gene information of sepsis within 4 hours from whole blood by implementing it in an automated way in a sealed cartridge using the existing technology, and it is possible to improve the problem of misuse and abuse of antibiotics due to the existing diagnosis method.
  • the nucleic acid analysis device including infectious agent separation and concentration functions according to the present invention sequentially proceeds the steps of separation, concentration, washing, elution, and PCR
  • the existing analysis method proceeds in the steps of elution, DNA collection, washing, and PCR.
  • nucleic acid analysis device including the function of isolating and concentrating infectious agents according to the present invention can separate bacteria and perform PCR automatically through a single cartridge, it is possible to isolate causative bacteria and antibiotics according to resistance without expert manipulation. selection can be facilitated.
  • Figure 1 shows the structure of a nucleic acid fractionation device including an infectious agent separation and concentration function according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the structure of a first body according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 3 shows the structure of a first pad according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the structure of the second body according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 5 shows the structure of a second pad according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows the structure of a third body according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 7 shows the structure of an extraction channel according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the connection structure between each chamber according to the rotation of the lower reagent moving means according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 9 shows the structure of a lid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 10 shows the structure of a PCR channel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of a nucleic acid fractionation device including an infectious agent separation and concentration function according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the combination and operation principle of a nucleic acid fractionation device including an infectious agent separation and concentration function according to an embodiment of the present invention.
  • 'and/or' includes a combination of a plurality of recited items or any one of a plurality of recited items.
  • 'A or B' may include 'A', 'B', or 'both A and B'.
  • the present invention includes a first body in which a plurality of side chambers with upper portions closed are arranged outside the central chamber; a second body coupled to a lower portion of the first body to form a lower portion of the side chamber; a third body coupled to the lower portion of the second body and having a central chamber extending upward through the center of the first body; and a lower reagent transfer means rotating at a lower end of the central chamber to connect the central chamber and the side chambers, and a nucleic acid analysis device having an infectious agent separation and concentration function.
  • the first body 100 may be manufactured in a shape in which a plurality of side chambers are arranged outside the central chamber 310, and in the case of the side chamber, for convenience in manufacturing and assembly, the first body ( 100) can be manufactured in such a way that the upper part is connected. That is, in the case of the side chamber of the present invention, the upper part is manufactured to be closed and the lower part is manufactured to be open, and the lower part can be sealed by coupling with the second body 200 to be described later.
  • the upper part of the chamber is connected or integrated with the inner surface of the first body to form a donut shape, and is manufactured in a cylinder type extending downward, so that the inner surface can serve as a chamber.
  • the side chamber is a chamber for loading reagents and magnetic beads for gene extraction, which will be described later, and a large number of chambers are sequentially arranged so that each reagent can be used sequentially.
  • the positions of the chambers are expressed as sequentially arranged for convenience in FIG. 2 and later described, the positions of each chamber may be changed or changed depending on circumstances.
  • the plurality of side chambers an injection chamber 111 to which a sample tube is coupled; a collecting reagent chamber 112 loaded with a solution for collecting bacteria; A magnetic bead chamber 113 loaded with a magnetic bead light buffer solution; a washing chamber 114 loaded with a washing solution; a nucleic acid extraction chamber 115 loaded with a buffer for nucleic acid elution; And it may include a connection chamber 116 to which the PCR channel 500 is connected (see FIG. 2).
  • the injection chamber 111 is a portion to which a sample tube loaded with a sample is coupled, and unlike the other side chambers and the central chamber 310 that are sealed, the top of the injection chamber 111 is open to allow the sample tube to be coupled thereto. That is, other side chambers may be located inside the first bar, but in the case of the injection chamber 111, it is manufactured to be exposed to the outside, so that it can be easily combined with the sample tube. At this time, it is preferable that the upper end of the injection chamber 111 is cut obliquely so that it can pass through the upper end of the sample tube when coupled with the sample tube.
  • the sample tube may be used without limitation as long as it can collect and store a sample, and preferably, a tube or test tube container having an inlet sealed with a polymer film may be used.
  • the sample is collected from a patient suspected of having an infection and may include blood, urine, tears, nasal mucus, saliva, sweat, exudates, tissues, or feces.
  • samples collected directly from the patient as described above may also be collected from objects around the patient.
  • the collection reagent chamber 112 is a part loaded with a solution for collecting bacteria, and the volume of the collection reagent chamber 112 may be the largest in the side chamber due to the nature of the bacteria collection step requiring the largest amount of solution (Fig. 2).
  • forming a donut shape around the central chamber 310 is easy to store and move, so in the case of the collection reagent chamber 112, along the outer circumferential surface of the central chamber 310 It can be formed to form an arc.
  • the collected reagent chamber 112 can be used as a waste chamber to store used reagents.
  • the internal volume of the collection reagent chamber 112 is made larger than the sum of the other side chambers, so it can have a volume sufficient to store reagents after use, and since the solution for collecting bacteria is moved to the central chamber 310 first, it is easy to use. Easy to store finished reagents.
  • the overall volume of the cartridge can be reduced by not allocating a separate waste chamber for used reagents.
  • the internal volume of the collection reagent chamber 112 is preferably 1.1 to 2 times the volume of the bacteria collection solution. Through this, it is possible to load not only the used bacteria collection solution but also other used reagents.
  • the magnetic bead chamber 113 is a chamber for loading magnetic beads and a buffer solution.
  • the magnetic beads are bead-shaped particles having a magnetic core therein, and magnetic beads having a shell portion coated with apolipoprotein H (ApoH) may be used.
  • ApoH apolipoprotein H
  • ApoH can bind with high affinity to lipopolysaccharide (LPS), which is a major component of the outer wall of gram-negative bacteria, and specific proteins of gram-positive pathogens. It is possible to selectively isolate Gram-positive or Gram-negative bacteria and fungi from whole blood.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the buffer solution is used to store and transport the magnetic beads, and serves to prevent breakage of magnetic beads in the form of particles during storage and to facilitate movement when the central chamber 310 is moved by reduced pressure, which will be described later. can do.
  • the buffer solution may be used without limitation as long as it can satisfy these conditions, but water or physiological saline may be preferably used.
  • the washing chamber 114 is a chamber loaded with a washing solution. Although one washing chamber 114 may be used, 1 to 10, preferably 2 to 5 washing chambers 114 are used for smooth washing. can be configured.
  • washing solution used for the washing any washing solution capable of removing excess blood or human secretions may be used without limitation, and preferably, water, physiological saline, PBS, Tris-EDTA, or the like may be used.
  • washing can be repeated 1 to 10 times as will be described later, and through this, other foreign substances other than bacteria can be washed smoothly.
  • 10 or more washing chambers 114 it is uneconomical because a lot of time is required for washing and the size of the cartridge becomes excessively large.
  • the nucleic acid extraction chamber 115 is a chamber loaded with a buffer for nucleic acid extraction.
  • a buffer for nucleic acid extraction When washing is completed as described above, magnetic beads combined with the causative bacteria may remain in the central chamber 310 .
  • the nucleic acid extraction buffer can be supplied to lyse the causative bacteria and simultaneously extract the nucleic acid.
  • any buffer capable of lysing the causative bacteria may be used as the buffer for nucleic acid extraction without limitation.
  • connection chamber 116 is installed to connect the PCR channels 500, and is a chamber for transferring the extracted nucleic acid to the PCR channel 500. Unlike other side chambers, the connection chamber 116 does not load a specific drug and is used as a simple passage, so it is preferable to have a smaller inner diameter than other side chambers.
  • the PCR channel (500) is a channel for performing PCR and is manufactured in the form of a lab-on-a-chip unlike conventional PCR devices, and may include a plurality of channels inside. That is, the PCR channel 500 is supplied with The nucleic acid can enter the inside of the PCR tunnel and PCR can be performed, and thus the nucleic acid can be amplified and analyzed at the same time. can be confirmed, and since nucleic acids appear differently depending on each causative bacteria, it is possible to select an antibiotic optimized for each causative bacteria (see FIGS. 1 and 10).
  • the PCR channel 500 it is possible to be manufactured in a form fixed to the connection chamber 116, but it is preferably manufactured in a separate form to select and use an appropriate PCR channel 500 according to each causative bacteria
  • one side of the PCR channel 500 is connected to one side of the upper part of the first body, and the lower end of one side of the PCR channel 500 penetrates the upper part of the first body and connects to the connection chamber 116. It can be produced in a connected form.
  • the PCR channel 500 can be stored separately from the cartridge and can be combined when used to facilitate storage of the cartridge (see FIG. 10).
  • PCR channel 500 may be manufactured in an integral or combined type as described above, it is also possible to manufacture in a form in which the PCR channel 500 and the connection chamber 116 are connected with a pipe. In this case, the PCR channel 500 can be installed and operated independently of the cartridge.
  • the first body 100 may be composed of a plurality of side chambers. However, for convenience in manufacturing, since the first body 100 is manufactured with an open lower portion, it is preferable to use the second body 200 capable of closing the lower portion of the side chamber.
  • the second body 200 may be connected to the lower portions of the plurality of side chambers to seal the lower portions of the four or several side chambers. At this time, since the center of the second body 200 passes through and is coupled to a central chamber to be described later, the second body 200 can be manufactured in a donut shape as a whole (see FIG. 4 ).
  • Lower chambers 211 to 216 are formed in the upper part of the second body 200 in a shape corresponding to the plurality of side chambers, and the lower chambers 211 to 216 may have an outlet at the center (Fig. see 4). At this time, the medicine loaded in the chamber may be circulated with the outside through the outlet.
  • the lower portion of the chamber may be inclined in the direction of the outlet to further facilitate such distribution. That is, when the outlet is located in the center, the lower portion of the chamber may have a concave central portion, and when the outlet is located on one side, the lower portion of the chamber may be inclined in one direction.
  • the injection chamber 111, the magnetic bead chamber 113, the washing chamber 114, and the nucleic acid extraction chamber 115 are made in a cylindrical shape, and since the fluid moves therein, an outlet is made at the center of the lower part ( 213 to 215 in FIG. 4), and since the collection reagent chamber is bulky and manufactured in an arc shape, it is preferable that the outlet be positioned on one side (see 212 in FIG. 4).
  • the connection chamber since it simply serves to move the fluid injected from the bottom to the PCR channel, it is okay to manufacture it in a simple cylindrical shape (see 216 in FIG. 4).
  • a first packing rubber 120 may be positioned between the first body 100 and the second body 200 (see FIG. 3 ).
  • the packing rubber may be made of a polymer and may have elasticity, and may be positioned between the first body and the second body 200 to prevent leakage of fluid through the wall of the side chamber.
  • the first body is made of a resin having high hardness, and this is the same for the second body 200 as well.
  • fluid may flow out to a coupling surface between the first body and the second body 200 .
  • Such outflow of fluid may occur in a gap caused by a step between the first body and the second body 200, but may also occur due to capillary action between the coupling parts. Therefore, it is preferable to use the first packing rubber 120 between the first body and the second body 200 to prevent such outflow.
  • the first packing rubber 120 has a plurality of through holes formed at positions corresponding to the plurality of side chambers, and inner circumferential surfaces of these through holes may coincide with inner circumferential surfaces of the side chambers (see FIG. 3 ).
  • the first packing rubber 120 can be inserted, and the first body and the second body 200 connect the first packing rubber Since 120 is coupled in the form of pressing from the top and bottom, the outflow of fluid can be prevented.
  • a protrusion is installed on the upper portion of the inner circumferential surface of the through hole to further enhance the leakage prevention effect.
  • a third body 300 may be coupled to a lower portion of the second body 200 .
  • the third body 300 is coupled to the lower portion of the second body 200 and is a part connecting the lower portion of the second body 200 and the lower reagent transfer unit 320 .
  • the central chamber 310 may be connected to the center of the third body 300, and as described above, since the central chamber 310 is fixed to the third body 300, the third body 300 It can be rotated together by the rotation of (see FIGS. 1 and 8).
  • the third body 300 may be formed by extending a central chamber passing through the center of the first body upwardly. Therefore, in the case of the third body 300, the lower part of the central chamber 310 may be manufactured in a shape in which the lower part of the central chamber 310 is connected to the central part of a donut-shaped body similar to the second body 200. In addition, since the fluid loaded in the side chamber can be moved through the lower portion of the second body 200 to the lower reagent transfer means 320 connected to the lower portion of the third body 300, the third In the case of the body 300, a transfer hole may be formed on one side.
  • a transfer hole 321 may be formed in the third body 300 .
  • the side chambers they are arranged along the outer circumferential surface of the central chamber 310, and in this case, they may be arranged to have the same distance from the center of the central chamber 310. Therefore, when the transfer hole 321 is formed at a position corresponding to the side chamber, it is possible for the transfer hole 321 to be located at the lower part of each side chamber according to the rotation of the third body 300. Accordingly, the lower portion of each side chamber may be in communication with the lower reagent moving means 320 (see FIGS. 6 and 8).
  • a second packing rubber 220 may be installed between the second body 200 and the third body 300 (see FIG. 5).
  • the lower portion of the chamber may be installed in the second body 200, and since the lower portion of the chamber has an outlet, a kind of open chamber is configured.
  • the third body 300 is simply rotatably connected to the lower part of the side chamber, fluid may flow out through a gap between the second body 200 and the third body 300 . Therefore, it is preferable to prevent fluid leakage by installing the second packing rubber 220 between the second body 200 and the third body 300 (see FIGS. 5 and 11).
  • the second packing rubber 220 may be fixed to the third body 300 and move in conjunction with the rotation of the third body 300 .
  • it is fixed to the second body 200 so that it does not rotate even when the third body 300 rotates. Therefore, in this case, an outlet hole 221 may be formed in the second packing rubber at a position corresponding to the outlet of the second body 200 . That is, in the case of the present invention, the fluid located in the side chamber is discharged through the outlet formed in the second body 200, the outlet hole 221 formed in the second packing rubber 220, and the third body 300. ) It can flow out to the outside through the transfer hole 321 formed in.
  • the other side of the lower reagent moving means 320 may be connected to the lower portion of the transfer hole 321 . That is, the lower reagent transfer means rotates integrally with the third body 300, and the chamber connected to the upper part of the transfer hole and the central chamber 310 move the lower reagent by the rotation of the third body 300. It can be communicated through means 320 .
  • the central chamber 310 some or all of them may have a shape in which the diameter becomes narrower toward the bottom (see FIG. 11).
  • a supply hole 322 connected to the lower reagent transfer unit 320 may be formed at a lower central portion of the central chamber 310 .
  • this supply hole 322 it serves not only to supply the reagent in the direction of the central chamber 310, but also to transfer the reaction completion reagent in the central chamber 310 to the outside. Therefore, in order to facilitate such transfer, it is preferable that part or all of the central chamber 310 be manufactured in a shape in which the diameter becomes narrower toward the bottom. That is, the lower part of the central chamber 310 is made in a funnel shape so that the fluid therein can be smoothly discharged in the direction of the supply hole 322 .
  • a lid 400 may be coupled to an upper portion of the central chamber 310 (see FIGS. 1 and 11).
  • the side chamber is located inside the first body 100 with a closed top, but in the case of the central chamber 310, the third body 300 has an open top, as seen above. can be made integrally with
  • the central chamber 310 is coupled in a form penetrating the center of the second body 200 and the first body 100 (see FIG. 1), and the central chamber at the upper center of the first body ( 310) may be located.
  • a lid 400 for closing the upper part of the central chamber is coupled to the upper part of the first body, and the pump connection part 410 to which the pump is connected is connected to the center of the lid 400. ) can be formed (see FIG. 9).
  • the third body 300 and the integral body can be rotated.
  • the third body 300 is located below the second body 200 and is integrally rotated with the lower reagent moving means 320, and as a result is used to close the upper end of the central chamber 310
  • the lid 400 also rotates like the lower reagent moving means 320. At this time, if the marking 420 is marked on the lid 400 and a certain scale 117 is engraved on the upper part of the first body, it is possible to easily observe the position of the lower reagent moving means 320 from the upper part.
  • the position of the lower reagent moving means 320 may indicate the reagent currently being used, it is possible to easily and visually check the current progress using only such a simple label.
  • a pump connection part 410 to which the pump is connected may be formed at the center of the lid 400 (see FIG. 9).
  • the pump is a part that moves the fluid by reducing or pressurizing the inside of the central chamber 310 . Therefore, the pump may be connected to the central chamber 310 through the pump connection part 410 formed in the lid 400, and for this purpose, the pump connection part ( 410) may be formed.
  • the lid 400 it is combined with the central chamber 310 to seal the upper part of the central chamber 310.
  • the central chamber 310 is connected to the side chamber connected through the lower reagent transfer unit 320, when the central chamber 310 is depressurized using the pump, the reagent loaded in the side chamber It may be moved to the central chamber 310 .
  • the reagent inside the central chamber 310 it is possible to move the reagent inside the central chamber 310 toward the side chamber (see FIG. 12).
  • pressurization or decompression may be used to move reagents as described above, it is also possible to perform mixing of reagents by repeating the pressurization or decompression.
  • Any pump that can depressurize or pressurize the inside of the central chamber 310 may be used without limitation, but a syringe pump, a reciprocating pump, a rotary pump, and the like may be used, and preferably a syringe pump may be used.
  • a syringe pump capable of pressurizing and depressurizing using only internal air.
  • the lower reagent moving means 320 selectively connects the side chamber and the lower part of the central chamber 310 to serve as a passage for reagent movement.
  • a moving channel may be formed inside the lower reagent moving means 320, and one side of the channel may be fixed to a central lower portion of the central chamber 310. Also, the other side of the moving channel may be connected to one or more of the plurality of side chambers.
  • the lower reagent moving means 320 since it can be integrated with the third body 300 and rotated as described above, it is rotated so that the desired side chamber is located at the upper end of the other side, and the central chamber 310 and Any desired side chamber can be connected (see Fig. 8).
  • the central chamber 310 rotates integrally with the third body 300, the connection can be maintained regardless of whether or not the lower reagent moving means 320 rotates.
  • One side may be connected to the center of the central chamber 310 . Through this, the reagent supplied from the side chamber can be evenly supplied to the central chamber 310, and through this, a certain reaction can be performed.
  • the lower reagent moving means 320 may include a moving channel therein (see FIG. 7).
  • the moving channel it may be a passage through which the reagent moves.
  • the reagents can be moved and mixed simultaneously, and the amount of movement can be limited when valves are installed in some of the channels. Apart from this, when additional reagents are loaded in some channels, it is also possible to mix and supply reagents with additional reagents.
  • the present invention also provides a first body in which a plurality of side chambers with upper ends are arranged outside the central chamber; a second body 200 coupled to a lower portion of the first body to form a lower portion of the side chamber; a third body 300 coupled to the lower portion of the second body 200 and having a central chamber passing through the center of the first body; a lower reagent moving unit 320 rotating at a lower end of the central chamber to connect the central chamber and the side chamber; and a pump connected to the upper part of the central chamber to pressurize or depressurize the inside of the central chamber.
  • a nucleic acid analysis method using a nucleic acid analysis device having a function of separating and concentrating an infectious agent, (a) a sample tube containing a sample.
  • the step (a) is a step of connecting a sample tube containing a sample to one of the side chambers of the cartridge, taking a sample, injecting it into the sample tube, and injecting the sample tube containing the sample into one of the side chambers.
  • This is a step of connecting to the chamber 111.
  • one side of the sample tube is sealed with a film made of polymer resin, it can be inserted from the top to the bottom of the injection chamber 111 with the polymer film as the bottom.
  • the step (b) is a step of reacting the samples and reagents loaded in each side chamber by moving them to the central chamber 310.
  • step (b) at least one of the side chambers is connected to the central chamber 310 by rotating the lower reagent moving unit, and then the central chamber 310 is depressurized so that samples, reagents, or magnets in the side chambers are depressurized. Transferring the beads to the central chamber 310 for reaction, and after the reaction is completed, pressurizing the central chamber 310 to discharge excess reagents into the side chambers, which can be performed several times as in step (c) above. Steps such as reaction, washing and hemolysis can be performed sequentially by repetition.
  • step (b) in the step (b), (i) rotating the lower reagent moving unit to connect it to the collecting reagent chamber 112 and depressurizing the central chamber 310 to release the reagent for collecting bacteria moving to the central chamber 310; (ii) rotating the lower reagent transfer unit to connect it to the magnetic bead chamber 113 and depressurizing the central chamber 310 to transfer the magnetic beads to the central chamber 310; (iii) rotating the lower reagent moving unit to connect it to the injection chamber 111 connected to the sample tube and depressurizing the central chamber 310 to move the sample in the sample tube into the central chamber 310; (iv) mixing the sample, the reagent, and the magnetic beads in the central chamber 310 by depressurizing and pressurizing the central chamber 310; (v) fixing the magnetic beads by contacting a magnet to the lower portion of the cartridge, and then pressurizing the central chamber 310 to discharge excess reagent into the collecting reagent chamber 112; (vi) rotating the lower reagent transfer unit
  • Step (i) is a step of rotating the lower reagent transfer unit to connect it to the collection reagent chamber 112 and depressurizing the central chamber 310 to transfer the reagent for collecting bacteria to the central chamber 310 .
  • reagents may be initially supplied in a state in which no reagents are loaded. Accordingly, by supplying the collection reagent first as described above, adhesion of magnetic beads and samples to be supplied later to the surface of the central chamber 310 can be prevented.
  • the movement of the collection reagent may be performed by using a pump connected to the upper part of the central chamber 310 to depressurize the inside of the central chamber 310, and as described above, the central chamber ( 310) When the inside is reduced in pressure, the collecting reagent may be moved from the collecting reagent chamber 112 to the central chamber 310 through the lower reagent moving means 320.
  • Step (ii) is a step of rotating the lower reagent transfer unit to connect it to the magnetic bead chamber 113 and depressurizing the central chamber 310 to transfer the magnetic beads to the central chamber 310 .
  • the third body 300 is rotated so that the other side of the lower reagent moving means 320 is placed at the lower end of the magnetic bead chamber 113. (113) can be connected. Thereafter, the magnetic beads in the magnetic bead chamber 113 may be transferred to the central chamber 310 by depressurizing the central chamber 310 in the same manner as in step (i).
  • the magnetic beads have a particle form, they can be aggregated and can sink in the lower part of the magnetic bead chamber 113, so the central chamber 310 is pressurized and decompressed to aggregate the magnetic beads. can solve
  • the central chamber 310 is pressurized to supply a portion of the collection reagent to the magnetic bead chamber 113. there is. At this time, since the collection reagent is supplied to the magnetic bead chamber 113 at a constant flow rate, aggregation of the magnetic beads can be eliminated by the flow rate of the collection reagent. Thereafter, when the inside of the central chamber 310 is depressurized, even the capture reagent mixed with the magnetic beads may be moved to the central chamber 310 .
  • the collection reagent may be supplied and sucked into the magnetic bead chamber 113 2 to 5 times repeatedly, and aggregation of the magnetic beads may be resolved by the flow of the collection reagent.
  • the step (iii) is a step of rotating the lower reagent moving unit to connect it to the injection chamber 111 connected to the sample tube and moving the sample in the sample tube to the central chamber 310 by depressurizing the central chamber 310. am.
  • the collecting reagent and the magnetic beads may be mixed and present in the central chamber 310 . Then, when the sample in the sample tube is supplied to the central chamber 310 as described above, the causative bacteria in the sample may adhere to the surface of the magnetic beads due to the collection reagent. Also, as described above, since the surface of the magnetic beads is coated with ApoH, it is possible for Gram-positive or Gram-negative bacteria and fungi to selectively attach to the surface of the magnetic beads.
  • the step (iv) is a step of rotating the lower reagent transfer unit to connect to the collection reagent chamber and decompressing and pressurizing the central chamber to mix the sample, the reagent, and the magnetic beads in the central chamber.
  • the inside of the central chamber 310 is stirred so that the causative bacteria are smoothly attached to the magnetic beads, and this may be performed by pressurizing or depressurizing the inside of the chamber.
  • the third body 300 can be rotated to connect the other side of the lower reagent moving means 320 to the collecting reagent chamber 112 .
  • the collecting reagent chamber 112 is made larger than other side chambers, it is preferable to use the collecting reagent chamber 112 for mixing.
  • the central chamber 310 is pressurized to move some or all of the samples, reagents, and magnetic beads in the central chamber 310 to the collection reagent chamber 112, Afterwards, the central chamber 310 is depressurized to move the sample, reagent, and magnetic beads in the collection reagent chamber 112 to the central chamber 310 .
  • the central chamber 310 is depressurized to move the sample, reagent, and magnetic beads in the collection reagent chamber 112 to the central chamber 310 .
  • mixing of the sample, reagent, and magnetic beads can be performed uniformly. It is also possible to repeat the above movement several times to make this mixing more uniform and to increase the probability that causative organisms such as bacteria and fungi can meet the ApoH-coated magnetic beads.
  • the mixing of the sample, the reagent, and the magnetic beads as described above is preferably performed for 15 to 60 minutes, and may be performed at 30 to 50° C., preferably 33 to 40° C. If it is less than the above range, the reaction is not completed and the number of causative bacteria collected on the magnetic particles may decrease, and if it exceeds the above range, the protein may be denatured and the amount attached to the magnetic particles may decrease.
  • the step (v) is a step of fixing the magnetic beads by contacting a magnet to the lower portion of the cartridge, and pressurizing the central chamber 310 to discharge excess reagent.
  • the causative bacteria present in the sample may be attached to the surface of the magnetic beads.
  • the central chamber 310 is pressurized to discharge the reacted reagent, the magnetic beads may be discharged as well. Therefore, a magnet may be brought into contact with the lower part of the central chamber to fix the magnetic bead.
  • the magnetic beads may be fixed inside the lower reagent moving means by the magnetic material.
  • the central chamber 310 is pressurized, most of the magnetic beads are fixed by the magnet while passing through the lower reagent moving means 320, and only the reagents that have been reacted can be discharged to the outside.
  • Step (vi) is a step of rotating the lower reagent moving means to connect to the cleaning chamber 114 and decompressing and pressurizing the central chamber 310 to clean the magnetic beads inside the lower reagent moving means 320.
  • the third body 300 is rotated to connect the lower reagent moving means 320 to the washing chamber 114, and then the cleaning solution in the washing chamber 114 is moved to the central chamber 310.
  • the washing efficiency can be increased by repeating the movement of the washing liquid 2 to 5 times in the same way as in the mixing step, and the cleaning liquid used in the last discharge step is discharged to the cleaning chamber 114 or the collection chamber ( 112) can also be discharged. After this step, the collection chamber 112 can be operated as a waste chamber.
  • washing as described above may be repeated 2 to 10 times.
  • the washing chamber 114 may be composed of 2 to 10, preferably 2 to 5.
  • the step (vii) is a step of extracting genes by rotating the lower reagent moving means to connect to the nucleic acid eluting chamber, depressurizing the central chamber, and moving the nucleic acid eluting buffer to the lower reagent moving means.
  • the causative bacteria attached to the magnetic particles may remain inside the lower reagent moving means 320 . Therefore, by supplying the buffer for nucleic acid elution as described above, the causative bacteria can be lysed and the nucleic acid can be leaked out.
  • the buffer for nucleic acid elution can act as a solution for transferring nucleic acids in a step to be described later, it may not be moved to a waste chamber (collection chamber) unlike the above collection solution or washing solution.
  • elution of the nucleic acid as described above may be performed at a temperature of 60 to 120 ° C, preferably 85 to 100 ° C for 1 to 15 minutes. If the range is less than the above range, the amount of nucleic acid elution may decrease due to insufficient hemolysis of the causative bacteria.
  • RNA or DNA mixed with a buffer for nucleic acid elution may exist inside the central chamber 310 .
  • PCR can be performed by pressurizing the central chamber 310 and transferring the extracted gene to the PCR channel 500 (step (d)).
  • the third body 300 is rotated to remove the lower reagent
  • the moving means 320 can be connected to the connection chamber 116, and since the magnetic particles still remain in the lower reagent moving means 320, a magnet is attached to the lower part of the cartridge to move the magnetic particles to the lower part. It is preferable to fix the reagent inside the moving means 320 .
  • RNA and DNA are compared in the case of the PCR chamber, if foreign matter other than RNA or DNA is introduced, the sensitivity may be lowered.
  • a filter through which RNA and DNA can pass is installed in the connection chamber 116 to prevent the inflow of magnetic particles and non-hemolyzed cells. It is desirable to block
  • RNA and DNA are supplied to the PCR chamber, PCR can be performed, and each gene is analyzed to determine the type of causative bacteria and the presence or absence of antibiotic resistance genes.

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Abstract

본 발명은 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치에 관한 것이다. 본 발명은 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디; 상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디; 상기 제2바디의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 상측으로 연장되어 형성된 제3 바디; 및 상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단을 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치를 제공한다.

Description

감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치
본 발명은 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감염증의 원인 세균 또는 균주에 대한 동정 및 항생제 내성 유전자 정보를 다중 검출하여 환자에게 알맞은 항생제를 조기에 선택할 수 있도록 하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치에 관한 것이다.
패혈증은 사망률이 매우 높은 감염성 질환으로, 중환자실 환자의 약 25~30%를 차지하고 있으며, 3초에 한명이 패혈증으로 사망하고 있다. 치료가 1시간 늦어질 때마다 생존율이 9% 감소하는 신속 진단이 매우 중요한 분야이지만, 임의의 초기 처방 후, 3~5일의 긴 배양 과정과 항생제 감수성 검사 이후에야 정확한 처방을 내릴 수 있다. 초기 처방의 경우 42%의 환자에게는 전혀 효과가 없으며, 21%의 환자에게는 필요 이상의 항생제가 처방되고 있다. 따라서 이 과정에서 발생하는 약물 오남용의 해소가 필요하다.
이러한 패혈증의 진단 및 항생제 감수성 검사를 위하여 다양한 기술이 사용되고 있는데, 현존하는 대부분의 기술에서는 혈액 내 극소량 존재하는 세균 및 균류를 직접 분리(정제)가 불가능하여 일정 시간 이상의 배양과정을 필요로 한다. 이 배양 시간을 줄이기 위한 많은 시도가 진행되고 있으며, 그중 혈액내의 세균 및 균류 포획기술과 유전자 다중 증폭기술을 이용하여 패혈증의 원인균을 분리하는 방향에 대한 시도 또한 이루어지고 있다.
이중 혈액내의 세균 및 균류 포획기술은 특정 단백질을 이용하여 원하는 세균을 포획하는 방법으로 본 발명에서는 패혈증 원인균의 분리를 위하여 아폴리포단백질을 사용하고 있다. 아폴리포단백질 H(ApoH) 또는 베타2-글리코단백질 I은 인간 혈장에서 순환하는 급성 상 단백질이다. ApoH는 그람 음성 박테리아의 외벽의 주요 구성성분인 리포폴리사카라이드 (LPS)와 그람 양성 병원체의 특이 단백질에 높은 친화력으로 결합할 수 있음이 밝혀져 있다. ApoH의 광범위한 특이성은 혈액 샘플에서 세균 및 균류 병원체의 포획을 위한 마커로 사용될 수 있다. ApoH는 자성비드에 코팅 될 수 있고, 이 비드를 이용한 병원체 포획은 균류에도 작용할 수 있다. 자성 비드를 혈액과 섞어서 반응 하면 혈액내의 감염원(패혈증 원인균)이 있을 경우 감염원만 자성 비드에 붙을 수 있게 되고, 자성비드를 자석으로 분리하면 혈액 내 감염원을 분리 및 농축 할 수 있다.
또한 유전자 다중 증폭기술(Nested polymerase chain reaction, Nested PCR)은 PCR의 변형으로 타겟 유전자의 염기서열 이외의 비 특이적으로 결합한 염기서열에서 비 특이적인 증폭이 되는 것을 줄이기 위한 방법이다. 기존의 PCR은 타겟 유전자의 염기서열 끝에 상보적인 프리이머를 필요로 하며 PCR 산물들은 cycle에 따라 증폭이 되지만, Nested PCR은 타겟 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합하여 증폭이 되도록 효율성을 높이기 위해 두 세트의 프라이머가 두 번의 연속적인 PCR에 사용된다. 이때 first PCR 증폭산물은 비 특이적인 염기서열의 증폭을 포함할 수도 있지만 first PCR 증폭산물은 second PCR의 타겟 유전자로 사용될 수 있다. 또한 second PCR은 first PCR 증폭산물 내에 위치하는(nested) 염기서열에 부착할 수 있는 inner 프라이머를 사용하거나 ‘hemi,semi-nesting’ 방법으로 최종 타겟 유전자의 염기서열의 증폭 정확성을 높일 수 있다. 즉 패혈증 원인균이 될 수 있는 다종 병원체의 다중 유전자 증폭의 정확도와 신뢰도를 높이기 위해 nested PCR을 사용할 수 있다.
하지만 혈액내의 세균 및 균류 포획기술 및 유전자 다중 증폭 기술은 장치의 구성 및 각 단계에 따른 작업 과정이 복잡하다. 그에 따라 별도의 교육을 받은 전문적인 작업자를 필요로 하며, 검사 과정에서 누출로 인한 사고나 검체 오염의 위험성이 있고, 바쁜 진단 현장에서 검사를 수행하기에 너무 많은 작업 시간을 요구하는 문제가 있다. 따라서 이러한 균의 분리 및 유전자의 증폭을 자동화하여 패혈증 원인균의 동정을 빠르게 함과 동시에 항생제 내성유전자를 빠르게 확인하여 환자에게 적합한 항생제를 조기에 선택할 수 있도록 하는 새로운 검사장치가 필요한 실정이다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 감염증의 원인 세균 또는 균주에 대한 동정 및 항생제 내성 유전자 정보를 다중 검출하여 환자에게 알맞은 항생제를 조기에 선택할 수 있도록 하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치를 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디; 상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디; 상기 제2바디의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 상측으로 연장되어 형성된 제3 바디; 및 상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단을 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 다수개의 사이드 챔버는; 샘플 튜브가 결합되는 주입 챔버; 균 포집용 용액이 적재되어 있는 포집시약 챔버; 자성 비드 빛 버퍼용액이 적재된 자성 비드 챔버; 세척용액이 적재된 세척 챔버; 핵산 용출용 버퍼가 적재된 핵산 추출 챔버; 및 상부에 PCR채널이 연결된 연결 챔버를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1바디의 일측에는 PCR 채널의 일측이 연결되며, 상기 PCR 채널의 일측 하단은 연결 챔버와 연통될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 바디의 상부에는 상기 중앙 챔버의 상부를 폐쇄하는 뚜껑이 결합되며, 상기 뚜껑의 중앙에는 상기 중앙챔버 내부를 가압 또는 감압할 수 있는 펌프가 연결되는 펌프 연결부가 형성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 하부 시약 이동수단은 내부에 이동채널을 포함하며, 상기 이동채널은 일측이 상기 중앙 챔버의 중앙에 고정되며, 상기 하부 시약이동 수단의 회전에 따라 타측이 상기 다수개의 사이드 챔버와 선택적으로 연결될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 하부 시약 이동수단은, 상기 중앙 챔버가 가압 또는 감압 되는 압력을 통하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버 사이에 샘플, 시약 및 자성 비드를 이동시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2 바디의 하부에는 제3 바디가 결합되며, 상기 제3 바디는, 상기 제2바디의 상기 사이드 챔버 하부와 대응되는 위치에 형성되는 이송홀; 및 상기 제3 바디가 상기 제2 바디와 독립적으로 회전가능하게 연결하는 연결부를 포함하며, 상기 이송홀은 하부에 상기 하부 시약 이동수단의 타측이 고정되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 하부 시약 이송수단은 상기 제3 바디와 일체화되어 회전하며, 상기 제3 바디의 회전에 의하여 상기 이송홀의 상부에 연결된 챔버와 상기 중앙 챔버가 상기 하부 시약 이동수단을 통하여 연통될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제1 바디와 상기 제2 바디의 사이에 위치하는 제1 패킹고무; 및 상기 제2 바디와 상기 제3 바디의 사이에 위치하는 제2 패킹고무를 포함하며, 상기 제2 패킹 고무는 상기 제3 바디의 회전 시에도 상기 제2 바디에 밀착되어 상기 사이드 챔버 내부의 적재물이 유출되지 않도록 하는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제2 패킹 고무는, 상기 사이드 챔버의 중앙 위치에 유출홀이 형성되어 있으며, 상기 사이드 챔버는 상기 유출홀 및 상기 이송홀을 통하여 상기 하부 시약 이동수단과 연결될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 중앙 챔버는 일부 또는 전부가 하부로 갈수록 직경이 좁아지는 형상을 가지는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디; 상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디; 상기 제2바디의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 형성된 제3 바디; 및 상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단을 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치를 사용한 핵산분석방법이며, (a) 샘플을 포함하는 샘플튜브를 상기 카트리지의 사이드 챔버 중 하나와 연결하는 단계; (b) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 상기 사이드 챔버 중 하나 이상을 상기 중앙 챔버와 연결한 다음, 상기 중앙 챔버를 감압하여 상기 사이드 챔버 내의 샘플, 시약 또는 자성 비드를 중앙 챔버로 이송하여 반응시키고, 반응이 완료된 이후 중앙 챔버를 가압하여 여분의 시약을 사이드 챔버로 배출시키는 단계; (c) 상기 (b)단계를 반복하여 유전자를 추출하는 단계; 및 (d) 상기 중앙 챔버를 가압하여 상기 추출된 유전자를 PCR 채널로 이송하는 단계를 포함하는 핵산분석방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계는, (i) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 균 포집용 시약을 상기 중앙 챔버로 이동시키는 단계; (ii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 자성 비드 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 상기 자성 비드를 상기 중앙 챔버로 이송시키는 단계; (iii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 샘플 튜브와 연결된 주입 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 샘플 튜브 내의 샘플을 상기 중앙 챔버로 이동시키는 단계; (iv) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압 및 가압하여 상기 중앙 챔버 내의 상기 샘플, 상기 시약 및 상기 자성 비드를 혼합하는 단계;; (v) 상기 카트리지의 하부에 자성체를 접촉시켜 상기 자성비드를 고정하고, 상기 중앙 챔버를 가압하여 여분의 시약을 배출시키는 단계; (vi) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 세척 챔버에 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압 및 가압 하여 상기 자성 비드를 세척하는 단계; 및 (vii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 핵산 용출 챔버에 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 핵산 용출용 버퍼를 상기 하부 시약 이동수단으로 이동시켜 유전자를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (v) 단계 및 (vi)단계에서 상기 자성 비드는 상기 자성체에 의하여 상기 하부 시약 이동수단의 내부에 고정되는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 (vi)단계는 2~10회 반복하여 수행되는 단계일 수 있다.
본 발명에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치는 샘플 내에 미량 존재하는 미생물을 포집 및 농축하는 기술을 도입하여 보다 편리하면서도 민감도가 높은 카트리지를 제공할 수 있다.
또한 작업자의 손을 많이 필요로 하는 공정을 단일 카트리지에 도입하여 hands-on-time을 줄임으로써 진단 현장에서 사용하기에 적합한 효과를 제공한다.
또한 일부 복잡한 공정을 자성나노입자에 맡김으로써 카트리지 자체의 구조를 단순화 하여 카트리지 설계 및 생산 효율성을 향상시킬 수 있다.
또한 카트리지에 피스톤을 포함시키는 대신 구동 장비에 펌프를 포함시킴으로써 카트리지의 구조를 더 단순화 하고, 다루는 용액량 대비 카트리지 전체 크기를 더 작게 만들 수 있다.
또한 O-ring 및 고무 패드를 활용하여 완벽에 가까운 방수 구조를 설계함으로써 다루는 용액의 물성 및 용량에 따른 누수 걱정으로부터 자유로울 수 있다.
또한 본 발명에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치는 패혈증 원인 감염원을 별도의 배양과정을 생략하고 전혈에서 직접 분리/농축 하는 기술과 다중 유전자의 multiplex nested PCR 증폭산물을 형광 검출 할 수 있는 기술을 이용하여 밀폐형 카트리지에서 자동화 방식으로 구현함으로써 전혈로부터 4시간 이내에 패혈증의 원인균과 내성 유전자 정보를 도출할 수 있고, 기존의 진단 방식으로 인한 항생제 오남용에 대한 문제를 개선할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치는 분리, 농축, 세척, 용출 및 PCR의 단계를 순차적으로 진행하므로 용출, DNA포집, 세척 및 PCR의 단계로 진행되는 기존의 분석방법에 비하여 다른 종류의 세포(예를 들어 사람의 세포)에 포함되는 DNA로 인한 감도저하를 최소화 할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치는 균의 분리와 PCR의 수행을 하나의 카트리지를 통하여 자동으로 수행할 수 있으므로, 전문가의 조작 없이도 원인균의 분리와 내성에 따른 항생제의 선택을 용이하게 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분장치의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 제1 바디의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 제1패드의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 제2바디의 구조는 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 제2패드의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 제3바디의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 추출채널의 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 하부 시약 이동수단의 회전에 따른 각 챔버사이의 연결구조를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 뚜껑의 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 PCR채널의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분장치의 단면을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분장치의 결합모습과 작동원리를 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 발명은 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디; 상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디; 상기 제2바디의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 상측으로 연장되어 형성된 제3 바디; 및 상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단을 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치에 관한 것이다.
상기 제1 바디(100)는 상기 중앙 챔버(310)의 외측에 상기 사이드 챔버가 다수개 배열되어 있는 형상으로 제조될 수 있으며, 상기 사이드 챔버의 경우 제작 및 조립상의 편의를 위하여 상기 제1 바디(100)에 상부가 연결되는 방식으로 제작될 수 있다. 즉 본 발명의 상기 사이드 챔버의 경우 상부가 폐쇄형으로 제작되며, 하부가 개방되도록 제작되며, 후술할 제2 바디(200)와의 결합에 의하여 하부가 밀폐될 수 있는 형상이 될 수 있다.
상기 사이드 챔버의 경우 상기 제1 바디의 내면에 챔버의 상부가 연결 또는 일체화되어 도넛형을 이루고 있으며, 하부로 연장되는 실린더 형식으로 제작되는 것으로 내면이 챔버의 역할을 수행할 수 있다.
상기 사이드 챔버는 후술할 유전자 추출을 위한 시약 및 자성 비드를 적재하는 챔버로서, 대수개의 챔버가 순차적으로 배열되어 각 시약을 순차적으로 사용할 수 있다. 도 2 및 후술할 부분에서 챔버의 위치는 편의상 순차적으로 배열되는 것으로 표현하였지만, 각 챔버의 위치는 상황에 따라 변경되거나 바뀔 수 있다.
이를 상세히 살펴보면 상기 다수개의 사이드 챔버는; 샘플 튜브가 결합되는 주입 챔버(111); 균포집용 용액이 적재되어 있는 포집시약 챔버(112); 자성 비드 빛 버퍼용액이 적재된 자성 비드 챔버(113); 세척용액이 적재된 세척 챔버(114); 핵산 용출용 버퍼가 적재된 핵산 추출 챔버(115); 및 상부에 PCR 채널(500이 연결된 연결 챔버(116)를 포함할 수 있다(도 2 참조).
상기 주입 챔버(111)는 샘플이 적재되어 있는 샘플 튜브가 결합되는 부분으로 다른 사이드 챔버 및 중앙 챔버(310)가 밀폐되어 있는 것과는 달리 상부가 개방되어 샘플 튜브가 결합될 수 있다. 즉 다른 사이드 챔버는 상기 제1 바대의 내측에 위치할 수 있지만, 상기 주입챔버(111)의 경우 외측에 노출되도록 제작되어 샘플튜브와의 결합이 용이할 수 있다. 이때 상기 주입 챔버(111)의 상단은 사선으로 절단되어 상기 샘플 튜브와의 결합시 샘플 튜브의 상단을 관통하며 결합될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
단일 주입구를 통해 샘플을 흡입하는 경우, 샘플 용기 내부에 음압이 걸리게 되면서 샘플이 용기 밖으로 잘 나오지 않게 되고 원하는 양의 샘플을 확보하지 못할 수 있다. 따라서 상기 주입 챔버(111)의 측면에 추가 주입구를 형성하는 것으로 샘플 내부에 걸리는 음압을 해소함으로써 샘플을 최대한 흡입하는 것이 가능하다.
상기 샘플 튜브는 샘플을 채취하여 보관할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 입구가 고분자막으로 밀봉된 튜브형 또는 시험관형 용기가 사용될 수 있다.
상기 샘플은 감염이 의심되는 환자에서 채취되는 것으로 혈액, 뇨, 눈물, 콧물, 침, 땀, 삼출물, 조직 또는 변을 포함할 수 있다. 아울러 상기와 같이 환자에게 직접 채취되는 샘플뿐만 아니라 환자 주변의 물건에서 채취된 것일 수도 있다.
상기 포집시약 챔버(112)는 균 포집용 용액이 적재되어 있는 부분으로 가장 많은 양의 용액이 필요한 균 포집 단계의 특성상 상기 포집시약 챔버(112)의 용적이 상기 사이드 챔버에서 가장 클 수 있다(도 2 참조). 다만 상기 제1 바디(100)의 경우 상기 중앙 챔버(310)를 중심으로 도넛형을 이루는 것이 보관 및 이동에 용이하므로, 상기 포집시약 챔버(112)의 경우 상기 중앙 챔버(310)의 외주면을 따라 호형을 이루도록 형성될 수 있다.
또한 후술할 사이드 챔버의 경우 사용이 완료된 시약을 각각의 챔버에 재주입하는 방식으로 재거할 수도 있지만, 상기 포집시약 챔버(112)를 폐기 챔버로 활용하여 사용이 완료된 시약을 보관하는 것도 가능하다. 이는 상기 포집시약 챔버(112)의 내용적이 다른 사이드 챔버의 총합보다 크게 제작되므로 사용이후 시약을 보관하기 충분한 용적을 가질 수 있으며, 균 포집용 용액이 가장 먼저 중앙 챔버(310)로 이동되므로 사용이 완료된 시약을 보관하기 용이하다. 또한 사용이 완료된 시약을 위한 별도의 폐기 챔버를 할당하지 않는 것으로 카트리지 전체의 용적을 줄일 수 있다. 상기와 같이 포집시약 챔버(112)를 폐기 챔버로 사용하는 경우 상기 포집시약 챔버(112)의 내용적은 균 포집용 용액 부피의 1.1~2배로 제작하는 것이 바람직하다. 이를 통하여 사용이 완료된 균 포집용 용액뿐만 아니라 사용이 완료된 다른 시약을 적재하는 것이 가능하다.
상기 자성 비드 챔버(113)는 자성 비드 및 버퍼용액을 적재하는 챔버이다. 상기 자성 비드는 내부에 자성코어를 가지는 비드형의 입자로 쉘 부분에 아폴리포단백질 H(ApoH)이 코팅되어 있는 자성 비드를 사용할 수 있다. 상기 아폴리포단백질의 경우 ApoH는 그람 음성 박테리아의 외벽의 주요 구성성분인 리포폴리사카라이드 (LPS)와 그람 양성 병원체의 특이 단백질에 높은 친화력으로 결합할 수 있으므로 상기와 같은 자성 비드를 사용하는 경우 전혈로부터 그람양성균 또는 그람음성균 및 진균을 선택적으로 분리하는 것이 가능하다.
상기 버퍼용액은 상기 자성 비드를 보관 및 이송시키기 위하여 사용되는 것으로 입자형태의 자성 비드의 보관 시 파손을 방지하고 후술할 중앙 챔버(310)의 감압에 의한 이동시 용이하게 이동될 수 있도록 하는 역할을 수행할 수 있다. 상기 버퍼용액은 이러한 조건을 만족시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있지만, 바람직하게는 물 또는 생리식염수가 사용될 수 있다.
상기 세척 챔버(114)는 세척용액이 적재되어 있는 챔버로, 하나의 세척 챔버(114)가 사용될 수 있지만, 원활한 세척을 위하여 1~10개, 바람직하게는 2~5개의 세척 챔버(114)로 구성될 수 있다.
상기 세척에 사용되는 세척용액은 여분의 혈액이나 인체 분비물을 제거할 수 있는 세척액이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 물, 생리식염수, PBS, Tris-EDTA 등이 사용될 수 있다.
또한 상기와 같이 1~10개의 세척 챔버(114)로 구성되는 경우 후술할 바와 같이 1~10회의 세척을 반복하여 수행할 수 있으며, 이를 통하여 균을 제외한 기타 이물질의 세척이 원활하게 수행될 수 있다. 다만 10개이상의 세척 챔버(114)를 사용하는 경우 세척에 많은 시간이 필요로 하며 상기 카트리지의 크기가 지나치게 커지게 되므로 비경제적이다.
상기 핵산 추출 챔버(115)는 핵산 추출용 버퍼가 적재되어 있는 챔버이다. 상기와 같이 세척이 완료되면 상기 중앙 챔버(310)에는 원인균과 결합된 자성 비드가 남아 있을 수 있다. 본 발명의 경우 원인균에 존재하는 RNA 또는 DNA를 분석하여 원인균의 종류 및 항생제 내성 여부를 확인하고 있으므로, 상기 원인균을 용혈시켜 헥산을 추출하는 것이 바람직하다. 따라서 상기와 같이 세척이 완료된 이후에는 상기 핵산 추출용 버퍼를 공급하여 원인균을 용혈시킴과 동시에 핵산을 추출할 수 있다. 이때 상기 핵산 추출용 버퍼는 상기 원인균을 용혈시킬 수 있는 버퍼라면 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 연결 챔버(116)는 PCR 채널(500)을 연결하기 위하여 설치되는 것으로 상기와 같이 추출된 핵산을 상기 PCR 채널(500)로 이동시키는 챔버이다. 다른 사이드 챔버와는 달리 상기 연결 챔버(116)는 특정 약품을 적재하지 않으며, 단순한 이동통로로 사용되므로 내경이 다른 사이드 챔버에 비하여 작게 형성되는 것이 바람직하다.
상기 PCR 채널(500은 PCR을 수행하기 위한 채널로서 기존의 PCR기기와는 달리 랩온어 칩의 형태로 제작되며, 내부에 다수개의 채널을 포함할 수 있다. 즉 상기 PCR 채널(500)로 공급되는 핵산은 상기 PCR태널 내부로 진입하여 PCR이 진행될 수 있으며, 이에 따라 상기 핵산이 증폭됨과 동시에 분석될 수 있다. 특히 본 발명의 경우 항생제 내성유전자를 탐지할 수 있는 수단을 구비하여 원인균의 항생제 내성여부를 확인할 수 있으며, 또한 각 원인균에 따라 핵산이 달리 나타나게 되므로 가가 원인균에 최적화된 항생제의 선택이 가능하다(도 1 및 도 10 참조).
또한 상기 PCR 채널(500)의 경우 상기 연결 챔버(116)에 고정되는 형태로 제작되는 것도 가능하지만, 바람직하게는 분리되는 형식으로 제작하여 각 원인균에 따라 적절한 PCR 채널(500)을 선택하여 사용하는 것이 바람직하며, 특히 상기 제1바디의 상부 일측에는 PCR 채널(500)의 일측이 연결되며, 상기 PCR 채널(500)의 일측 하단은 상기 제1 바디의 상부를 관통하여 상기 연결 챔버(116)와 연결되는 형식으로 제작될 수 있다. 이를 통하여 상기 PCR 채널(500)은 상기 카트리지와 분리되어 보관될 수 있고 사용시 결합되는 것으로 상기 카트리지의 보관을 용이하게 할 수 있다(도 10 참조). 아울러 상기 PCR 채널(500)은 위와 같이 일체형 또는 결합형으로 제작될 수도 있지만 상기 PCR 채널(500)과 상기 연결 챔버(116)를 파이프로 연결하는 형태로 제작하는 것도 가능하다. 이 경우 상기 PCR 채널(500)은 상기 카트리지와는 독립적으로 설치 및 운전될 수 있다.
상기 제1 바디(100)는 위에서 살펴본 바와 같이 다수개의 사이드 챔버로 구성될 수 있다. 다만 제작상의 편의를 위하여 상기 제1 바디(100)는 하부가 개방된 상태로 제작되므로 상기 사이드 챔버의 하부를 폐쇄할 수 있는 제2 바디(200)를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제2 바디(200)는 상기 다수개의 사이드 챔버 하부와 연결되어 상기 사수개의 사이드 챔버 하부를 밀폐시키는 역할을 수행할 수 있다. 이때 상기 제2 바디(200)의 중앙은 후술할 중앙챔버가 관통하여 결합되므로 상기 제2 바디(200)는 전체적으로 도넛형으로 제작될 수 있다(도 4 참조).
상기 제2 바디(200)의 상부에는 상기 다수개의 사이드 챔버와 대응되는 형상으로 챔버 하부(211~216)가 형성되어 있으며, 상기 챔버 하부(211~216)는 중앙부에 배출구를 가질 수 있다(도 4참조). 이때 상기 챔버 내부에 적재되는 약품은 상기 배출구를 통하여 외부와 유통될 수 있다. 또한 이러한 유통을 더욱 용이하게 하도록 상기 챔버 하부는 상기 배출구 방향으로 경사지도록 제작될 수 있다. 즉 상기 배출구가 중앙에 위치하는 경우 상기 챔버 하부는 중앙부가 오목한 형태로 제작될 수 있으며, 상기 배출구가 일측에 위치하는 경우에는 상기 챔버 하부는 일측방향으로 경사지도록 형성되는 것이 가능하다.
이때 상기 주입 챔버(111), 자성 비드 챔버(113), 세척 챔버(114) 및 핵산 추출 챔버(115)의 경우 원통형으로 제작되며, 내부에 유체가 이동하게 되므로, 하부의 중앙에 배출구를 제작(도 4의 213~215 참조)할 수 있으며, 상기 포집시약 챔버의 경우 부피가 크며, 호형으로 제작되므로 상기 배출구가 일측에 위치하도록 제작(도 4의 212 참조)되는 것이 바람직하다. 아울러 상기 연결챔버의 경우 단순히 하부에서 주입되는 유체를 상기 PCR체널로 이동시키는 역할이므로 단순 원통형으로 제작하여도 무방(도 4의 216참조)하다.
또한 상기 제1 바디(100) 및 상기 제2 바디(200)의 사이에는 제1 패킹고무(120)가 위치할 수 있다(도 3 참조). 상기 패킹고무는 고분자로 제작되어 탄성을 가질 수 있으며, 상기 제1 바디와 상기 제2 바디(200)사이에 위치하여 사이드 챔버의 벽을 통한 유체의 유출을 방지할 수 있다. 이를 상세히 살펴보면 상기 제1 바디의 경우 경도가 높은 수지로 제작되며, 이는 제2 바디(200)의 경우도 동일하다. 이러한 제1 바디 및 제2 바디(200)를 결합하는 경우 상기 제1 바디와 상기 제2 바디(200)의 결합면으로 유체가 유출될 수 있다. 이러한 유체의 유출은 상기 제1 바디와 상기 제2 바디(200)의 단차에 의한 틈에서 나타날 수도 있지만, 결합부 사이에 모세관 현상으로 인하여 나타날 수도 있다. 따라서 이러한 유출을 방지하기 위하여 상기 제1 바디와 상기 제2 바디(200)의 사이에는 제1 패킹고무(120)를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제1 패킹고무(120)는 상기 다수개의 사이드 챔버와 대응되는 위치에 다수개의 통공이 형성되어 있으며, 이러한 통공의 내주면은 상기 사이드 챔버의 내주면과 일치될 수 있다(도 3 참조). 이를 통하여 상기 제1 바디와 상기 제2 바디(200)의 결합시 상기 제1 패킹고무(120)를 삽입할 수 있으며, 또한 상기 제1 바디 및 상기 제2 바디(200)가 상기 제1 패킹고무(120)를 상하에서 압박하는 형태로 결합되므로, 유체의 유출이 방지될 수 있다. 아울러 상기 통공의 내주면의 상부에는 돌출부가 설치되어 이러한 유출방지효과를 더욱 높일 수 있다.
상기 제2 바디(200)의 하부에는 제3 바디(300)가 결합될 수 있다.
상기 제3 바디(300)는 상기 제2 바디(200)에 하부에 결합되며, 상기 제2 바디(200)의 하부와 상기 하부 시약 이동수단(320)을 연결하는 부분이다. 이때 상기 제3 바디(300)의 중앙에는 상기 중앙 챔버(310)가 연결될 수 있으며, 위에서 살펴본 바와 같이 상기 중앙 챔버(310)는 상기 제3 바디(300)에 고정되므로 상기 제3 바디(300)의 회전에 의하여 같이 회전될 수 있다(도 1 및 도 8 참조).
즉 상기 제3 바디(300)는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 상측으로 연장되어 형성될 수 있다. 따라서 상기 제3 바디(300)의 경우 상기 제2 바디(200)와 유사한 형태의 도넛형의 몸체의 중앙부에 상기 중앙챔버(310)의 하부가 연결되어 있는 형상으로 제작될 수 있다. 또한 상기 사이드 챔버에 적재되어 있는 유체는 상기 제2 바디(200)의 하부를 통하여 상기 제3 바디(300)의 하부에 연결되어 있는 하부 시약이동수단(320)으로 이동될 수 있으므로, 상기 제3 바디(300)의 경우 일측에 이송홀이 형성될 수 있다.
상기 제3 바디(300)에는 이송홀(321)이 형성될 수 있다. 상기 사이드 챔버의 경우 상기 중앙 챔버(310)의 외주면을 따라 배열되며, 이 경우 상기 중앙 챔버(310)의 중심에서 동일한 거리를 가지도록 배열될 수 있다. 따라서 상기 사이드 챔버와 대응되는 위치에 상기 이송홀(321)을 형성하는 경우 상기 제3 바디(300)의 회전에 따라 상기 이송홀(321)이 각 사이드 챔버의 하부에 위치하는 것이 가능하며, 이에 따라 각 사이드 챔버의 하부가 상기 하부 시약 이동수단(320)과 연통될 수 있다(도 6 및 도 8참조).
상기 제2 바디(200)와 상기 제3 바디(300)의 사이에는 제2 패킹고무(220)가 설치될 수 있다(도 5 참조). 위에서 살펴본 바와 같이 상기 제2 바디(200)에는 상기 챔버 하부가 설치될 수 있으며, 상기 챔버 하부의 경우 배출구를 가지고 있으므로, 일종의 개방식 챔버를 구성하게 된다. 이러한 사이드 챔버의 하부에 상기 제3 바디(300)를 단순히 회전 가능하도록 연결하게 되면, 상기 제2 바디(200)와 상기 제3 바디(300) 사이의 틈으로 유체가 유출될 수 있다. 따라서 상기 제2 바디(200)와 상기 제3 바디(300)의 사이에는 상기 제2 패킹고무(220)를 설치하여 유체의 유출을 방지하는 것이 바람직하다(도 5 및 도 11참조).
이때 상기 제2 패킹고무(220)는 상기 제3 바디(300)에 고정되어 상기 제3 바디(300)의 회전에 연동되어 움직이는 것도 가능하지만. 바람직하게는 상기 제2 바디(200)에 고정되어 상기 제3 바디(300)가 회전하더라도 회전하지 않는 것이 바람직하다. 따라서 이 경우 상기 제2 패킹 고무에는 상기 제2 바디(200)의 배출구와 대응되는 위치에 유출홀(221)이 형성될 수 있다. 즉 본 발명의 경우 상기 사이드 챔버에 위치하는 유체는 상기 제2 바디(200)에 형성되어 있는 배출구, 상기 제2 패킹고무(220)에 형성되어 있는 유출홀(221) 및 상기 제3 바디(300)에 형성되어 있는 이송홀(321)을 통하여 외부로 유출될 수 있다.
아울러 상기 이송홀(321)의 하부에는 상기 하부 시약 이동수단(320)의 타측이 연결될 수 있다. 즉 상기 하부 시약 이송수단은 상기 제3 바디(300)와 일체화되어 회전하며, 상기 제3 바디(300)의 회전에 의하여 상기 이송홀의 상부에 연결된 챔버와 상기 중앙 챔버(310)가 상기 하부 시약 이동수단(320)을 통하여 연통될 수 있다.
상기 중앙 챔버(310)의 경우 일부 또는 전부가 하부로 갈수록 직경이 좁아지는 형상을 가질 수 있다(도 11 참조). 위에서 살펴본 바와 같이 상기 중앙 챔버(310)의 하단 중앙부에는 상기 하부 시약 이동수단(320)과 연결된 공급홀(322)이 형성될 수 있다. 하지만 이 공급홀(322)의 경우 상기 시약을 상기 중앙 챔버(310)의 방향으로 공급하는 역할을 할 뿐만 아니라 상기 중앙 챔버(310)내의 반응완료시약을 외부로 이송할 수도 있다. 따라서 이러한 이송을 원활하게 할 수 있도록 상기 중앙 챔버(310)의 경우 일부 또는 전부가 하부로 갈수록 직경이 좁아지는 형상으로 제작되는 것이 바람직하다. 즉 상기 중앙 챔버(310)의 하부는 깔대기 형상으로 제작되어 내부의 유체가 상기 공급홀(322) 방향으로 원활하게 배출될 수 있도록 할 수 있다.
상기 중앙챔버(310)의 상부에는 뚜껑(400)이 결합될 수 있다(도 1 및 도 11참조). 본 발명의 경우 상기 사이드 챔버는 상부가 폐쇄되는 형태로 상기 제1 바디(100)의 내측에 위치하지만 상기 중앙챔버(310)의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 상부가 개방된 형태로 제3 바디(300)에 일체형으로 제작될 수 있다. 이때 상기 중앙챔버(310)는 상기 제2 바디(200) 및 상기 제1 바디(100)의 중앙을 관통하는 형태로 결합되며(도 1 참조), 상기 제1 바디의 중앙 상부에 상기 중앙챔버(310)의 상부가 위치할 수 있다. 따라서 상기 중앙 챔버의 상부를 밀폐하기 위하여 상기 제1 바디의 상부에는 상기 중앙 챔버의 상부를 폐쇄하는 뚜껑(400)이 결합되며, 상기 뚜껑(400)의 중앙에는 상기 펌프가 연결되는 펌프 연결부(410)가 형성될 수 있다(도 9참조).
또한 상기 중앙 챔버(310)의 경우 제3 바디(300)와 일체형이 되어 회전될 수 있다. 상기 제3 바디(300)는 상기 제2 바디(200)의 하부에 위치하여, 상기 하부 시약 이동수단(320)과 일체형으로 회전되기 때문에 결과적으로 상기 중앙 챔버(310) 상단을 폐쇄하기 위하여 사용되는 뚜껑(400) 역시 상기 하부 시약 이동수단(320)과 같이 회전하게 된다. 이때 상기 뚜껑(400)에 마킹(420)을 하고 상기 제1바디의 상부에 일정한 눈금(117)을 새기는 경우 상기 하부 시약 이동수단(320)의 위치를 상부에서 용이하게 관찰하는 것이 가능하다.
상기 하부 시약 이동수단(320)의 위치는 현재 사용되고 있는 시약을 나타낼 수 있으므로 이러한 간단한 표지만으로도 현재 진행상황을 간편하게 시각적으로 확인하는 것이 가능하다.
또한 상기 뚜껑(400)의 중앙에는 상기 펌프가 연결되는 펌프 연결부(410)가 형성될 수 있다(도 9참조). 상기 펌프는 상기 중앙 챔버(310) 내부를 감압 또는 가압하여 유체의 이동을 수행하는 부분이다. 따라서 상기 펌프는 상기 뚜껑(400)에 형성되는 펌프 연결부(410를 통하여 상기 중앙 챔버(310)와 연결될 수 있으며, 이를 위하여 상기 뚜껑(400)의 중앙 특히 뚜껑(400)의 중앙에 상기 펌프 연결부(410)가 형성될 수 있다.
이를 상세히 살펴보면 상기 뚜껑(400)의 경우 상기 중앙 챔버(310)와 결합되어 중앙 챔버(310)의 상부를 밀폐할 수 있다. 이때 상기 중앙 챔버(310)와 하부 시약 이동수단(320)을 통하여 연결되어 있는 사이드 챔버와 연결되어 있으므로, 상기 펌프를 사용하여 중앙 챔버(310)를 감압하게 되면 상기 사이드 챔버에 적재되어 있는 시약이 상기 중앙 챔버(310)로 이동될 수 있다. 이와는 반대로 상기 중앙 챔버(310) 내부를 가압하는 경우 상기 중앙 챔버(310) 내부에 있는 시약을 상기 사이드 챔버 방향으로 이동시키는 것이 가능하다(도 12 참조). 이러한 가압 또는 감압은 상기와 같이 시약을 이동시키는 것에 사용될 수도 있지만 상기 가압 또는 감압을 반복하는 것으로 시약의 혼합을 수행하는 것도 가능하다.
상기 펌프는 상기 중앙 챔버(310)의 내부를 감압 또는 가압할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있지만, 시린지 펌프, 왕복식 펌프, 회전식 펌프 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 시린지 펌프를 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 경우 상기 중앙 챔버(310)의 내부에 이물질이 유입되는 것을 방지해야 하므로 내부의 공기만을 이용하여 가압 및 감압할 수 있는 시린지 펌프를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 하부 시약 이동수단(320)은 상기 사이드 챔버와 상기 중앙 챔버(310)의 하부를 선택적으로 연결하여 시약의 이동통로가 되는 부분이다.
이를 상세히 살펴보면, 상기 하부 시약 이동수단(320)의 내부에는 이동 채널이 형성될 수 있으며, 상기 채널의 일측은 상기 중앙 챔버(310)의 중앙 하부에 고정될 수 있다. 또한 상기 이동채널의 타측은 상기 다수개의 사이드 챔버 중 하나이상과 연결될 수 있다. 이때 상기 하부 시약 이동수단(320)의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 상기 제3 바디(300)와 일체화되어 회전할 수 있으므로, 타측의 상단에 원하는 사이드 챔버가 위치하도록 회전하는 것으로 상기 중앙 챔버(310)와 원하는 사이드 챔버를 연결할 수 있다(도 8 참조). 또한 상기 중앙 챔버(310)의 경우 상기 제3 바디(300)와 일체화되어 회전하게 되므로 상기 하부 시약 이동수단(320)의 회전 여부와 관계없이 연결이 유지될 수 있지만, 바람직하게는 상기 이동채널의 일측은 상기 중앙 챔버(310)의 중심에 연결될 수 있다. 이를 통하여 상기 중앙 챔버(310)에는 상기 사이드 챔버에서 공급되는 시약이 고르게 공급될 수 있으며, 이를 통하여 일정한 반응을 수행할 수 있다.
아울러 상기 하부 시약 이동수단(320)의 위치는 위에 나타난 바와 같이 상기 뚜껑(400)에 표기된 표식에 의하여 상부에서 용이하게 관찰할 수 있으므로 이를 이용하여 반응의 완결여부 또는 진행상황을 용이하게 관찰할 수 있다.
또한 상기 하부 시약 이동수단(320)은 내부에 이동채널을 포함할 수 있다(도 7참조). 상기 이동채널의 경우 상기 시약이 이동하는 통로가 될 수 있다. 아울러 상기 채널내부에 혼합구조를 가져 상기 시약의 이동과 혼합을 동시에 수행할 수 있으며, 또한 상기 채널 중 일부에 밸브를 설치하는 경우 이동량을 제한할 수도 있다. 이와는 별도로 일부 채널에 추가시약을 적재하는 경우 시약에 추가적인 약품을 혼합하여 공급하는 것도 가능하다.
이하 본 발명을 유전자 추출 및 검출방법을 통하여 상세히 설명한다.
본 발명은 또한 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디; 상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디(200); 상기 제2 바디(200)의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 형성된 제3 바디(300); 상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단(320); 및 상기 중앙 챔버의 상부에 연결되어 상기 중앙 챔버의 내부를 가압 또는 감압하는 펌프를 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치를 사용한 핵산분석방법이며, (a) 샘플을 포함하는 샘플튜브를 상기 카트리지의 사이드 챔버 중 하나와 연결하는 단계; (b) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 상기 사이드 챔버 중 하나 이상을 상기 중앙 챔버와 연결한 다음, 상기 중앙 챔버를 감압하여 상기 사이드 챔버 내의 샘플, 시약 또는 자성 비드를 중앙 챔버로 이송하여 반응시키고, 반응이 완료된 이후 중앙 챔버를 가압하여 여분의 시약을 사이드 챔버로 배출시키는 단계; (c) 상기 (b)단계를 반복하여 유전자를 추출하는 단계; 및 (d) 상기 중앙 챔버를 가압하여 상기 추출된 유전자를 PCR 채널로 이송하는 단계를 포함하는 핵산분석방법에 관한 것이다.
상기 (a)단계는 샘플을 포함하는 샘플튜브를 상기 카트리지의 사이드 챔버중 하나와 연결하는 단계로 샘플을 채취한 다음, 샘플 튜브에 주입하고 샘플을 포함하는 샘플 튜브를 상기 사이드 챔버중 하나인 주입 챔버(111)에 연결하는 단계이다. 이때 상기 샘플튜브는 일측이 고분자 수지로 된 막으로 밀봉되어 있으므로, 상기 고분자 막을 하단으로 하여 상기 주입 챔버(111)의 상부에서 하부로 삽입할 수 있다.
상기 (b)단계는 각 사이드 챔버에 적재되어 있는 샘플 및 시약을 상기 중앙 챔버(310)로 이동시켜 반응시키는 단계이다. 상기 (b) 단계는 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 상기 사이드 챔버 중 하나 이상을 상기 중앙 챔버(310)와 연결한 다음, 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 상기 사이드 챔버 내의 샘플, 시약 또는 자성 비드를 중앙 챔버(310)로 이송하여 반응시키고, 반응이 완료된 이후 중앙 챔버(310)를 가압하여 여분의 시약을 사이드 챔버로 배출시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 (c)단계와 같이 이를 수회 반복하여 반응, 세척 및 용혈 등의 단계를 순차적으로 수행할 수 있다.
상기 (b)단계를 상세히 살펴보면, 상기 (b) 단계는, (i) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버(112)와 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 균 포집용 시약을 상기 중앙 챔버(310)로 이동시키는 단계; (ii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 자성 비드 챔버(113)와 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 상기 자성 비드를 상기 중앙 챔버(310)로 이송시키는 단계; (iii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 샘플 튜브와 연결된 주입 챔버(111)와 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 샘플 튜브 내의 샘플을 상기 중앙 챔버(310)로 이동시키는 단계; (iv) 상기 중앙 챔버(310)를 감압 및 가압하여 상기 중앙 챔버(310) 내의 상기 샘플, 상기 시약 및 상기 자성 비드를 혼합하는 단계; (v) 상기 카트리지의 하부에 자석을 접촉시켜 상기 자성 비드를 고정한 다음, 상기 중앙 챔버(310)를 가압하여 여분의 시약을 포집시약 챔버(112)로 배출시키는 단계; (vi) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 세척 챔버(114)에 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압 및 가압 하여 상기 중앙 챔버(310) 내부의 자성 비드를 세척하는 단계; 및 (vii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 핵산 용출 챔버(115)에 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 핵산 용출용 버퍼를 상기 중앙 챔버(310)로 이동시켜 유전자를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (i)단계는 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버(112)와 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 균포집용 시약을 상기 중앙 챔버(310)로 이동시키는 단계이다. 상기 중앙 챔버(310)의 경우 초기에는 아무런 시약이 적재되어 있지 않은 상태로 공급될 수 있다. 따라서 상기와 같이 포집시약을 먼저 공급하는 것으로 상기 중앙 챔버(310)의 표면에 뒤에 공급될 자성 비드 및 샘플이 유착되는 것을 방지할 수 있다. 이때 상기 포집시약의 이동은 위에서 살펴본 바와 같이 상기 중앙 챔버(310)의 상부에 연결되는 펌프를 이용하여 상기 중앙 챔버(310)의 내부를 감압하는 방법으로 수행될 수 있으며, 상기와 같이 중앙 챔버(310) 내부를 감압하는 경우 상기 포집시약은 상기 포집시약 챔버(112)에서 상기 하부 시약 이동수단(320)을 통하여 상기 중앙 챔버(310)로 이동될 수 있다.
상기 (ii)단계는 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 자성 비드 챔버(113)와 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 상기 자성 비드를 상기 중앙 챔버(310)로 이송시키는 단계이다.
상기와 같이 중앙 챔버(310)에 포집시약이 공급된 이후 상기 제3 바디(300)를 회전시켜 상기 자성 비드 챔버(113)의 하단에 상기 하부 시약 이동수단(320)의 타측이 상기 자성 비드 챔버(113)와 연결되도록 할 수 있다. 이후 상기 (i)단계와 동일하게 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 상기 자성 비드 챔버(113)내의 자성 비드를 상기 중앙 챔버(310)로 이송시킬 수 있다.
다만 상기 자성 비드의 경우 입자형태를 가지고 있으므로, 응집될 수 있으며, 상기 자성 비드 챔버(113)의 하부에 가라 앉아 있을 수 있으므로, 상기 중앙 챔버(310)를 가압 및 감압하는 것으로 상기 자성 비드의 응집을 해소할 수 있다.
이를 상세히 살펴보면, 상기 하부 시약 이동수단(320)의 타측이 상기 자성 비드 챔버(113)와 연결된 이후 상기 중앙 챔버(310)를 가압하여 상기 포집시약의 일부를 상기 자성 비드 챔버(113)로 공급할 수 있다. 이때 상기 포집시약의 경우 일정한 유속을 가지고 상기 자성 비드 챔버(113)로 공급되므로 상기 포집시약의 유속에 의하여 상기 자성 비드의 응집이 해소될 수 있다. 이후 상기 중앙 챔버(310)의 내부를 감압하게 되면 상기 자성 비드와 혼합되어 있는 포집시약까지 상기 중앙 챔버(310)로 이동될 수 있다. 또한 상기 자성 비드의 응집이 심하거나 상기 포집시약의 공급으로 응집이 해소되지 않은 경우 상기 중앙 챔버(310)의 가압과 감압을 2~5회 반복하는 것이 바람직하다. 이를 통하여 상기 포집시약은 상기 자성 비드 챔버(113)의 내부로 2~5회 공급과 흡입을 반복할 수 있으며, 이러한 포집시약의 유동에 의하여 상기 자성 비드의 응집이 해소될 수 있다.
상기 (iii)단계는 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 샘플 튜브와 연결된 주입 챔버(111)와 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 샘플 튜브 내의 샘플을 상기 중앙 챔버(310)로 이동시키는 단계이다.
상기 (ii)단계가 완료되면 상기 중앙 챔버(310)의 내부에는 상기 포집시약 및 상기 자성 비드가 혼합되어 존재할 수 있다. 이후 상기와 같이 샘플튜브 내의 샘플을 상기 중앙 챔버(310)에 공급하게 되면 상기 포집시약으로 인하여 상기 샘플 내의 원인균이 상기 자성 비드의 표면에 부착될 수 있다. 또한 위에서 살펴본 바와 같이 상기 자성 비드의 표면에는 ApoH가 코팅되어 있으므로 그람양성균 또는 그람음성균 및 진균은 상기 자성 비드의 표면에 선택적으로 부착되는 것이 가능하다.
상기 (iv)단계는, 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압 및 가압하여 상기 중앙 챔버 내의 상기 샘플, 상기 시약 및 상기 자성 비드를 혼합하는 단계이다.
상기와 같이 상기 자성 비드에 상기 원인균의 부착이 원활하도록 상기 중앙 챔버(310)의 내부는 교반되는 것이 바람직하며, 이는 상기 챔버 내부를 가압 또는 감압하는 방식으로 수행될 수 있다. 이를 상세히 살펴보면 상기와 같이 샘플이 공급된 이후 상기 제3 바디(300)를 회전시켜 상기 하부 시약 이동수단(320)의 타측을 상기 포집시약 챔버(112)에 연결할 수 있다. 위에서 살펴본 바와 같이 상기 포집시약 챔버(112)의 경우 다른 사이드 챔버에 비하여 크게 제작되므로 상기 포집시약 챔버(112)를 이용하여 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 포집시약 챔버(112)가 연결된 이후 상기 중앙 챔버(310)를 가압하여 상기 중앙 챔버(310)내의 샘플, 시약 및 자성 비드의 일부 또는 전부를 상기 포집시약 챔버(112)로 이동시킬 수 있으며, 이루 상기 중앙 챔버(310)를 감압하여 상기 포집시약 챔버(112) 내의 샘플, 시약 및 자성 비드를 중앙 챔버(310)로 이동시킬 수 있다. 이러한 이동을 통하여 상기 샘플, 시약 및 자성 비드의 혼합이 균일하게 수행될 수 있다. 또한 이러한 혼합이 더욱 균일해지도록 하고 박테리아 및 진균 등 원인균이 ApoH가 코팅된 자성 비드와 만날 수 있는 확률을 높이기 위해 상기와 같은 이동을 수차례 반복하는 것도 가능하다.
아울러 상기와 같은 상기 샘플, 상기 시약 및 상기 자성 비드의 혼합은 15~60분에 걸쳐 수행되는 것이 바람직하며, 30~50℃ 바람직하게는 33~40℃에서 수행될 수 있다. 상기 범위 미만인 경우 반응이 완결되지 않아 상기 자성입자에 포집되는 원인균이 줄어들 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 단백질이 변성되어 오히려 부착되는 양이 줄어들 수 있다.
상기 (v)단계는 상기 카트리지의 하부에 자석을 접촉시켜 상기 자성 비드를 고정하고, 상기 중앙 챔버(310)를 가압하여 여분의 시약을 배출시키는 단계이다.
상기와 같이 교반이 완료되면 상기 샘플 내에 존재하는 원인균이 상기 자성 비드의 표면에 부착될 수 있다. 이때 위에 나타난 바와 같이 상기 중앙 챔버(310)를 가압하여 반응이 완료된 시약을 배출하게 되면 상기 자성 비드까지 배출될 수 있다. 따라서 상기 자성 비드를 고정하기 위하여 상기 중앙챔버의 하부에 자석을 접촉시킬 수 있다.
즉, 상기 (v) 단계 및 (vi)단계에서 상기 자성 비드는 상기 자성체에 의하여 상기 하부 시약 이동수단의 내부에 고정될 수 있다. 상기 중앙 챔버(310)를 가압하게 되면 대부분의 자성 비드는 하부 시약 이동수단(320)을 통과하는 과정에서 자석에 의해 고정되고 반응이 완료된 시약만 외부로 배출될 수 있다.
또한 상기와 같은 사용 완료 시약의 배출은 상기 포집시약 챔버(112) 방향으로 하는 것이 바람직하다.
상기 (vi)단계는 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 세척 챔버(114)에 연결하고 상기 중앙 챔버(310)를 감압 및 가압 하여 하부 시약 이동수단(320) 내부의 자성 비드를 세척하는 단계이다.
상기와 같이 반응 완료 시약이 배출된 이후에도 하부 시약 이동수단(320)에는 원인균이 붙어있는 자성 비드 외에 불필요한 반응완료 시약의 일부와 샘플의 일부가 남아 있을 수 있다. 따라서 이를 세척하여 제거하는 것으로 후에 수행될 PCR의 효율을 높일 수 있다. 이를 위하여 상기 제3 바디(300)를 회전시켜 상기 하부 시약 이동수단(320)을 상기 세척 챔버(114)에 연결한 다음, 상기 세척 챔버(114)내의 새척액을 상기 중앙 챔버(310)로 이동시킬 수 있다. 또한 이 경우에도 상기 혼합단계와 동일하게 상게 세척액의 이동을 2~5회 반복하여 세척효율을 높일 수 있으며, 도한 최후배출 단계에서 사용된 새척액을 새척 챔버(114)로 배출하거나 상기 포집챔버(112)로 배출할 수도 있다. 이 단계 이후에서는 상기 포집 챔버(112)는 폐기 챔버로서 작동될 수 있다.
아울러 상기와 같은 세척은 2~10회 반복될 수 있다. 이를 위하여 상기 세척 챔버(114)는 2~10개로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 2~5개 일 수 있다.
상기 (vii)단계는 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 핵산 용출 챔버에 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 핵산 용출용 버퍼를 상기 하부 시약 이동수단으로 이동시켜 유전자를 추출하는 단계이다.
상기와 같이 세척이 완료된 이후 하부 시약 이동수단(320) 내부에는 자성입자에 부착된 원인균만이 남아 있을 수 있다. 따라서 상기와 같이 핵산 용출용 버퍼를 공급하는 것으로 상기 원인균을 용혈시킬 수 있으며, 또한 핵산을 외부로 유출시킬 수 있다. 아울러 상기 핵산 용출용 버퍼의 경우 후술할 단계에서 핵산을 이동시키는 용액으로 작용할 수 있으므로, 위의 포집용액 또는 세척 용액과는 달리 폐기 챔버(포집 챔버)로 이동시키지 않을 수 있다.
또한 상기와 같은 핵산의 용출은 60~120℃, 바람직하게는 85~100℃온도에서 1~15분간 수행될 수 있다. 상기 범위 미만에서는 원인균의 용혈이 미진하여 핵산의 용출량이 줄어들 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우에는 용출된 핵산이 열 변형되어 위음성이 커질 수 있다.
상기와 같이 (b)단계가 완료되면 상기 중앙 챔버(310)의 내부에는 핵산용출용 버퍼와 혼합된 RNA 또는 DNA가 존재할 수 있다. 이때 상기 중앙 챔버(310)를 가압하여 상기 추출된 유전자를 PCR 채널(500로 이송하는 것으로((d)단계) PCR을 수행할 수 있다. 이때 상기 제3 바디(300)를 회전시켜 상기 하부 시약 이동수단(320)을 상기 연결 챔버(116)와 연결시킬 수 있으며, 또한 하부 시약 이동수단(320)에는 아직까지 자성입자가 남아 있는 상태이므로 자석을 상기 카트리지의 하부에 부착하여 상기 자성입자를 하부 시약 이동수단(320) 내부에 고정하는 것이 바람직하다.
아울러 상기 PCR챔버의 경우 RNA 또는 DNA와를 다른 이물질이 유입되면 감도가 떨어질 수 있으며, 상기 연결 챔버(116)에는 RNA 및 DNA가 통과할 수 있는 필터를 설치하여 자성입자 및 용혈되지 않은 세포의 유입을 막는 것이 바람직하다.
상기와 같이 PCR챔버에 상기 핵산(RNA 및 DNA)이 공급되면 PCR이 수행될 수 있으며, 각 유전자는 분석되어 원인균의 종류 및 항생제 내성유전자의 유무를 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디;
    상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디;
    상기 제2바디의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 상측으로 연장되어 형성된 제3 바디; 및
    상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단;
    를 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다수개의 사이드 챔버는;
    샘플 튜브가 결합되는 주입 챔버;
    균 포집용 용액이 적재되어 있는 포집시약 챔버;
    자성 비드 빛 버퍼용액이 적재된 자성 비드 챔버;
    세척용액이 적재된 세척 챔버;
    핵산 용출용 버퍼가 적재된 핵산 추출 챔버; 및
    상부에 PCR채널이 연결된 연결 챔버;
    를 포함하는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1바디의 일측에는 PCR 채널의 일측이 연결되며,
    상기 PCR 채널의 일측 하단은 연결 챔버와 연통되는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 바디의 상부에는 상기 중앙 챔버의 상부를 폐쇄하는 뚜껑이 결합되며,
    상기 뚜껑의 중앙에는 상기 중앙챔버 내부를 가압 또는 감압할 수 있는 펌프가 연결되는 펌프 연결부가 형성되어 있는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 하부 시약 이동수단은 내부에 이동채널을 포함하며,
    상기 이동채널은 일측이 상기 중앙 챔버의 중앙에 고정되며, 상기 하부 시약이동 수단의 회전에 따라 타측이 상기 다수개의 사이드 챔버와 선택적으로 연결되는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 하부 시약 이동수단은,
    상기 중앙 챔버가 가압 또는 감압 되는 압력을 통하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버 사이에 샘플, 시약 및 자성 비드를 이동시키는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제2 바디의 하부에는 제3 바디가 결합되며,
    상기 제3 바디는,
    상기 제2바디의 상기 사이드 챔버 하부와 대응되는 위치에 형성되는 이송홀; 및
    상기 제3 바디가 상기 제2 바디와 독립적으로 회전가능하게 연결하는 연결부;
    를 포함하며,
    상기 이송홀은 하부에 상기 하부 시약 이동수단의 타측이 고정되는 것인 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 하부 시약 이송수단은 상기 제3 바디와 일체화되어 회전하며,
    상기 제3 바디의 회전에 의하여 상기 이송홀의 상부에 연결된 챔버와 상기 중앙 챔버가 상기 하부 시약 이동수단을 통하여 연통되는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1 바디와 상기 제2 바디의 사이에 위치하는 제1 패킹고무; 및
    상기 제2 바디와 상기 제3 바디의 사이에 위치하는 제2 패킹고무;
    를 포함하며,
    상기 제2 패킹 고무는 상기 제3 바디의 회전 시에도 상기 제2 바디에 밀착되어 상기 사이드 챔버 내부의 적재물이 유출되지 않도록 하는 것인 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2 패킹 고무는,
    상기 사이드 챔버의 중앙 위치에 유출홀이 형성되어 있으며,
    상기 사이드 챔버는 상기 유출홀 및 상기 이송홀을 통하여 상기 하부 시약 이동수단과 연결되는 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 중앙 챔버는 일부 또는 전부가 하부로 갈수록 직경이 좁아지는 형상을 가지는 것인 감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치.
  12. 상부가 폐쇄된 다수의 사이드 챔버가 중앙챔버의 외측에 배열된 제1 바디; 상기 제1 바디의 하부에 결합되어 상기 사이드 챔버의 하부를 형성하는 제2 바디; 상기 제2바디의 하부에 결합되며, 중앙에는 상기 제1 바디의 중앙을 관통하는 중앙챔버가 형성된 제3 바디; 상기 중앙 챔버의 하단에서 회전하여 상기 중앙 챔버와 상기 사이드 챔버를 연결하는 하부 시약 이동수단; 및 상기 중앙 챔버의 상부에 연결되어 상기 중앙 챔버의 내부를 가압 또는 감압하는 펌프를 포함하는 유감염원 분리 및 농축기능을 포함하는 핵산분석장치를 사용한 핵산분석방법이며,
    (a) 샘플을 포함하는 샘플튜브를 상기 카트리지의 사이드 챔버 중 하나와 연결하는 단계;
    (b) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 상기 사이드 챔버 중 하나 이상을 상기 중앙 챔버와 연결한 다음, 상기 중앙 챔버를 감압하여 상기 사이드 챔버 내의 샘플, 시약 또는 자성 비드를 중앙 챔버로 이송하여 반응시키고, 반응이 완료된 이후 중앙 챔버를 가압하여 여분의 시약을 사이드 챔버로 배출시키는 단계;
    (c) 상기 (b)단계를 반복하여 유전자를 추출하는 단계; 및
    (d) 상기 중앙 챔버를 가압하여 상기 추출된 유전자를 PCR 채널로 이송하는 단계;
    를 포함하는 핵산분석방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    (i) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 균 포집용 시약을 상기 중앙 챔버로 이동시키는 단계;
    (ii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 자성 비드 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 상기 자성 비드를 상기 중앙 챔버로 이송시키는 단계;
    (iii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 샘플 튜브와 연결된 주입 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 샘플 튜브 내의 샘플을 상기 중앙 챔버로 이동시키는 단계;
    (iv) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 포집시약 챔버와 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압 및 가압하여 상기 중앙 챔버 내의 상기 샘플, 상기 시약 및 상기 자성 비드를 혼합하는 단계;
    (v) 상기 카트리지의 하부에 자성체를 접촉시켜 상기 자성비드를 고정하고, 상기 중앙 챔버를 가압하여 여분의 시약을 배출시키는 단계;
    (vi) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 세척 챔버에 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압 및 가압 하여 상기 자성 비드를 세척하는 단계; 및
    (vii) 상기 하부 시약 이동 수단을 회전시켜 핵산 용출 챔버에 연결하고 상기 중앙 챔버를 감압하여 핵산 용출용 버퍼를 상기 하부 시약 이동수단으로 이동시켜 유전자를 추출하는 단계;
    를 포함하는 핵산분석방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (v) 단계 및 (vi)단계에서 상기 자성 비드는 상기 자성체에 의하여 상기 하부 시약 이동수단의 내부에 고정되는 핵산분석방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 (vi)단계는 2~10회 반복하여 수행되는 단계인 핵산분석방법.
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